專利名稱：：改良的用于二硫鍵形成的方法改良的用于二硫鍵形成的方法本說明書通篇引用了許多文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用其整體在此并入。
背景技術(shù)：
：1985年，Smith首次證實(shí)絲狀噬菌體耐受外源蛋白質(zhì)片段插入到它們的基因III蛋白(pIII)，且能夠顯示出，該蛋白質(zhì)片段存在于噬菌體表面(Smith,1985)。Ladner將這一概念延伸至噬菌體顆粒的表面上展示的(多)肽庫(kù)和/或蛋白質(zhì)庫(kù)的篩選(WO88/06630;WO90/02809)。自此，噬菌體展示經(jīng)歷了顯著地進(jìn)步，并獲得大量的成果。已開發(fā)了多種形式以構(gòu)建和篩選(多)肽/蛋白質(zhì)噬菌體展示文庫(kù)，并且許多綜述型文章和專論涵蓋并總結(jié)了這些發(fā)展(例如Kay等人，1996;Dunn，1996;McGregor，1996)。最常見地是，已經(jīng)使用基于絲狀噬菌體的系統(tǒng)。最初提供為單鏈Fv(scFv)片段的展示(WO88/06630;還參見W092/01047)，該方法已經(jīng)迅速延伸至其他(多)肽/蛋白質(zhì)的展示，包括諸如Fab片段(WO91/17271;WO92/01047)的多亞基蛋白的展示，所述其他(多)肽/蛋白質(zhì)諸如牛胰胰蛋白酶抑制劑(BPTI)(WO90/02809)、肽文庫(kù)(WO91/19818)、人類生長(zhǎng)激素(WO92/09690)和多種其他蛋白質(zhì)。為了將(多)肽/蛋白質(zhì)錨定于絲狀噬菌體表面，主要使用噬菌體的外殼蛋白的基因融合物。優(yōu)選的是與基因III蛋白(Parmley&Smith,1988)或其片段(Bass等人，1990)，以及基因VIII蛋白(Greenwood等人，1991)的融合物。在一種情況下，使用了基因VI(Jespers等人，1995)，且在一種情況下，已將基因VII和基因IX的組合用于Fv片段的展示(Gao等人，1999)。此外，還在噬菌體A上實(shí)現(xiàn)噬菌體展示。在此情況下，使用了基因V蛋白(Maruyama等人，1994)、基因J蛋白和基因D蛋白(Sternberg&Hoess，1995;Mikawa等人，1996)。除了使用基因融合物之外，外源肽或蛋白質(zhì)已經(jīng)由相關(guān)結(jié)構(gòu)域連接于噬菌體表面。在WO91/17271中，其建議使用噬菌體上展示的標(biāo)簽和融合于待展示的(多)肽/蛋白質(zhì)的標(biāo)簽結(jié)合的配體以實(shí)現(xiàn)非共價(jià)展示。實(shí)行類似的概念用于cDNA文庫(kù)的展示(Crameri&Suter，1993)。其中，jun/fos相互作用用于調(diào)節(jié)cDNA片段的展示。在它們的構(gòu)建體中，位于j皿以及fos的全部末端的側(cè)翼的額外半胱氨酸殘基通過形成兩個(gè)二硫鍵而進(jìn)一步穩(wěn)定該相互作用。過去，一個(gè)問題是如何最佳地恢復(fù)已經(jīng)結(jié)合于所需靶的噬菌體。通常，這是通過用合適的緩沖液洗脫，無論通過使用PH或鹽梯度，或通過使用可溶的靶的特定洗脫來實(shí)現(xiàn)。然而，以高親和力結(jié)合于耙的最感興趣的結(jié)合子通過該方法可能脫去。已描述了幾種可選的方法，其試圖克服該問題，其通過在所展示的(多)肽/蛋白質(zhì)和其融合配偶體之間，或在感興趣的靶和將該靶錨定于固體表面的它的載體之間提供切割信號(hào)。此外，上文涉及的方法中的大多數(shù)需要使用包括至少部分的噬菌體外殼蛋白和外源(多)肽/蛋白質(zhì)的融合蛋白。在W001/05909中，描述了完全不同的系統(tǒng)，其不需要融合蛋白，且因此解決了這些問題中的許多問題。描述于W001/05909的稱為"CysDisplay"的系統(tǒng)是基于噬菌體外殼蛋白和免疫球蛋白或其功能片段之間的共價(jià)二硫鍵的形成。免疫球蛋白或其功能片段展示于噬菌體顆粒的表面上。隨后，在W003/060065中公開了相似的技術(shù)。WO03/060065不同于WO01/05909的是，加Cys標(biāo)簽的pIII多肽是經(jīng)改良的輔助噬菌體而非噬菌粒來提供。此外，WO03/060065還提到了可用于在噬菌體顆粒上展示(多)肽/蛋白質(zhì)的其他適配子，諸如同源多亞基蛋白(PDGF、Max、RelA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白)和異源多亞基蛋白(蛋白質(zhì)k激酶復(fù)合體、含SH2_結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(SH2-domainconatingprotein)、aPal/Max、Hox/Pbx)。盡管CysDisplay系統(tǒng)具有良好的功能，但在噬菌體顆粒上展示出較高量的(多)肽/蛋白質(zhì)的系統(tǒng)在某些情況下可能是有利的，例如，這種具有提高的展示速率，特別是提高的功能展示速率的改良的系統(tǒng)，將確定是有益的，且能夠更加方便地、可靠地和特定地分離結(jié)合子，特別是以高親和力結(jié)合于它們的靶的結(jié)合子。Snyder等人，1981通過用2_硝基苯甲酸處理來研究天然存在的蛋白質(zhì)的肽的活性半胱氨酸殘基的局部環(huán)境，并觀察到由帶正電的氨基酸包圍的半胱氨酸殘基顯示出較高反應(yīng)性。在繼續(xù)研究中，Snyder等人，1983研究了二硫鍵形成的動(dòng)力學(xué)，并得出基本相同的結(jié)論。Bulaj等人，1998研究了16種模型肽與不同的非蛋白質(zhì)分子形成二硫鍵的能力的動(dòng)力學(xué)。它們觀察到肽和非蛋白質(zhì)試劑上存在靜電荷對(duì)反應(yīng)性具有影響。Britto等人，2002研究了微管蛋白中分子內(nèi)二硫鍵的靜電環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)最具活性的半胱氨酸殘基在6.5埃帶正電的殘基中，可能促進(jìn)硫醇解離成硫醇鹽陰離子。Hansen等人，2005研究了工程YFP的分子內(nèi)二硫鍵，并發(fā)現(xiàn)如果帶正電的氨基酸存在于活性半胱氨酸殘基的附近，則反應(yīng)性增加。Albrecht等人，2006報(bào)道了經(jīng)半胱氨酸殘基連接于PEG的單一特異性多價(jià)Fab的產(chǎn)生。然而，以上的研究中沒有描述其中在第一(多)肽/蛋白質(zhì)和不同的第二(多)肽/蛋白質(zhì)之間形成分子間二硫鍵的系統(tǒng)。特別地，在這些研究中，沒有在宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中形成這種二硫鍵。此外，在引用的研究中，沒有展示于噬菌體顆粒的表面上的(多)肽/蛋白質(zhì)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了用于在包含于第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基和包含于第二(多)肽/蛋白質(zhì)(優(yōu)選不同的(多)肽/蛋白質(zhì))中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵的改良的方法。所述改良應(yīng)該優(yōu)選引起所述半胱氨酸殘基的較高反應(yīng)性，由此提供提高的展示速率，特別是提高的功能展示速率。通過提供在權(quán)利要求中表征的實(shí)施方案，實(shí)現(xiàn)對(duì)這一技術(shù)問題的解決方法。該技術(shù)解決方法解決根本的問題，并形成本發(fā)明的基礎(chǔ)，即在空間背景中將帶正電的氨基酸引入活性半胱氨酸殘基，該解決方法在現(xiàn)有技術(shù)中即未提供，也未建議。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于(多)肽/蛋白質(zhì)在噬菌體顆粒的表面上展示，且不需要使用與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白的改良的系統(tǒng)。所述半胱氨酸殘基的較高反應(yīng)性因此引起較高的展示速率，特別是較高的功能展示速率。因此，本發(fā)明特別提供了篩選在噬菌體顆粒的表面上展示的(多)肽/蛋白質(zhì)的巨大文庫(kù)的改良的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成二硫鍵的方法，其包括引起或使得第一7(多)肽/蛋白質(zhì)連接于第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其中所述連接是通過在包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基和包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。所述具有大于8的pl的氨基酸可包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中。所述具有大于8的pl的氨基酸可能不存在于所述野生型(多)肽/蛋白質(zhì)中對(duì)應(yīng)的氨基酸位置。所述具有大于8的pl的氨基酸可能已被人工地引入。所述具有大于8的pl的氨基酸可被包含在相同(多)肽/蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基鄰接的10個(gè)氨基酸內(nèi)，優(yōu)選地在相同(多)肽/蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基鄰接的5個(gè)氨基酸內(nèi)。所述第一半胱氨酸殘基可存在于或鄰近所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。所述第一半胱氨酸殘基還可以是N-末端半胱氨酸殘基或C-末端半胱氨酸殘基。所述第二半胱氨酸殘基可存在于或鄰近所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。所述第二半胱氨酸殘基還可以是N-末端半胱氨酸殘基或C-末端半胱氨酸殘基。所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可展示于噬菌體顆粒的表面上。所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。所述二硫鍵可在宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中形成。所述二硫鍵可以是分子間二硫鍵。所述具有大于8的pl的氨基酸可選自賴氨酸和精氨酸，優(yōu)選賴氨酸。所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可能是不同的。所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)可能是噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員。所述蛋白質(zhì)外殼的成員可能是噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體，其中所述截短的變體包括至少引起所述外殼蛋白并入噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的所述野生型外殼蛋白的那一部分。所述蛋白質(zhì)外殼的成員可以是噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體，其中所述修飾的變體能夠并入到噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼。包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第一半胱氨酸殘基可存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第一半胱氨酸殘基可不存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。所述第一半胱氨酸殘基可能已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白。所述第一半胱氨酸殘基可能已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體。所述第一半胱氨酸殘基可能已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體。所述噬菌體顆?？梢允墙z狀噬菌體的噬菌體顆粒。所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員可以是野生型外殼蛋白pIII，或可以衍生自野生型外殼蛋白pIII。所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員可以是野生型外殼蛋白pIX，或可以衍生自野生型外殼蛋白pIX。包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第二半胱氨酸殘基可不存在于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。所述第二半胱氨酸殘基可能已被人工地引入所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)。所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可包括免疫球蛋白或其功能片段。所述功能片段可以是scFv或Fab片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在噬菌體顆粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括引起或使得所述(多)肽/蛋白質(zhì)在表達(dá)后連接于蛋白質(zhì)外殼的成員，其中所述連接是通過在包含于所述蛋白質(zhì)外殼的成員中的第一半胱氨酸殘基和包含于所述(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)外殼的成員包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。8在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體的核酸序列，其中所述修飾的變體包括(a)所述噬菌體的野生型外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外殼蛋白并入噬菌體外殼的那一部分。(b)第一半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pi的氨基酸，其積極地影響所述第一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼修飾的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修飾的免疫球蛋白或功能片段包括(a)免疫球蛋白或其功能片段，(b)半胱氨酸殘基，以及具有大于8的pi的氨基酸，其積極地影響所述半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。所述修飾的免疫球蛋白的功能片段可以是scFv或Fab片段。任何以上提到的核酸序列還可編碼用于純化和/或檢測(cè)目的的一種或多種肽序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含任何以上提到的核酸序列的載體。所述載體還可包括編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的一種或多種核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括第二半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含任何以上提到的核酸序列或載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可包括第二載體，所述第二載體包括編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的一種或多種核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括第二半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由任何以上提到的核酸序列編碼的(多)肽/蛋白質(zhì)、由任何以上提到的載體編碼的(多)肽/蛋白質(zhì)或由任何以上提到的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的(多)肽/蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以上提到的方法可獲得的在其表面上展示(多)肽/蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒。在所述噬菌體顆粒上展示的所述(多)肽/蛋白質(zhì)可以是免疫球蛋白或其功能片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上文提到的噬菌體顆粒的不同集合，其中所述噬菌體顆粒中的每一個(gè)展示出第二(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合中的第二(多)肽/蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得具有所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)提供如上文描述的噬菌體顆粒的不同集合，以及(b)篩選所述不同集合和/或從所述不同集合中選擇以獲得至少一種展示具有所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒。所述方法的步驟(b)還可包括(ba)使所述噬菌體顆粒的不同集合與感興趣的靶接觸；(bb)洗脫沒有結(jié)合于所感興趣的耙的噬菌體顆粒；以及(bc)通過在還原條件下處理在步驟(ba)下形成的感興趣的靶與結(jié)合于所述感興趣的靶的噬菌體的復(fù)合體，來洗脫結(jié)合于感興趣的靶的噬菌體顆粒。所述所需的性質(zhì)可以是對(duì)感興趣的耙的結(jié)合、抑制感興趣的耙、阻斷感興趣的耙、活化耙介導(dǎo)的反應(yīng)或酶促活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種復(fù)合體，其包括第一(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第一半胱氨酸殘基，以及第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第二半胱氨酸殘基，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一還包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性，且其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)經(jīng)所述半胱氨酸殘基形成二硫鍵。所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可以是展示于多個(gè)噬菌體顆粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合的成員。所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)可以是噬菌體外殼蛋白。所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)可包括免疫球蛋白或其功能片段。所述功能片段可以是scFv或Fab片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含任何以上提到的復(fù)合體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成二硫鍵的方法，其包括引起或使得第一(多)肽/蛋白質(zhì)連接于第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其中所述連接是通過在包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基與包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一包括具有大于8的pI的氨基酸。所述具有大于8的pl的氨基酸可積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。發(fā)明詳述"二硫鍵"是由兩個(gè)硫醇基的反應(yīng)形成的共價(jià)鍵。二硫鍵在(多)肽和蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性中起重要作用。分泌了許多具有二硫鍵的蛋白質(zhì)。許多細(xì)胞區(qū)室是還原環(huán)境，且二硫鍵在胞質(zhì)溶膠中一般是不穩(wěn)定的。(多)肽和蛋白質(zhì)中的二硫鍵通常在半胱氨酸殘基的硫醇基之間形成，其中兩個(gè)半胱氨酸殘基的氧化形成共價(jià)二硫鍵。二硫鍵可以是分子內(nèi)或分子之間的鍵。在原核生物中，二硫鍵優(yōu)選地在周質(zhì)的氧化環(huán)境中形成。在真核細(xì)胞中，二硫鍵通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境中形成，而不是在胞質(zhì)溶膠的還原環(huán)境中(除了具有起氧化傳感器作用的半胱氨酸殘基的一些胞質(zhì)溶膠蛋白之外)。二硫鍵最常見于分泌蛋白、溶酶體蛋白和膜蛋白的外質(zhì)結(jié)構(gòu)域。二硫鍵還在橡膠的硫化中起重要作用。"pI"或"等電點(diǎn)"是分子或表面不帶靜電荷的pH。為了具有明顯的等電點(diǎn)，分子(或表面)必須是兩性的，即其必須具有酸性和堿性官能團(tuán)。蛋白質(zhì)和氨基酸是滿足這一需要的分子。二十種天然存在的氨基酸的pl列于表l。然而，非天然存在的氨基酸也可用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。表1:二十種天然存在的氨基酸的等電點(diǎn)(pl)(以pl增加為序)。氨基酸等電點(diǎn)(pl)天冬氨酸2.77谷氨酸3.22半胱氨酸5.0210<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對(duì)于僅具有一個(gè)氨基基團(tuán)和一個(gè)羧基基團(tuán)的氨基酸，可由該分子的pKa計(jì)算pl。對(duì)于具有多于兩個(gè)可離子化的基團(tuán)的氨基酸，諸如賴氨酸，那兩個(gè)pKa用于計(jì)算pI，其從氨基酸的中性形式失去或獲得電荷。各種計(jì)算為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且可參見任何生物化學(xué)教科書[例如NelsonDL，Cox匪(2004)丄ehningerPrinciplesofBiochemistry(生物化學(xué)的Lehninger原理).W.H.Freeman;第4版]。蛋白質(zhì)可根據(jù)它們的pl，經(jīng)等電點(diǎn)聚焦分離。在低于pl的pH下，蛋白質(zhì)帶靜正電荷。在pl之上，蛋白質(zhì)帶靜負(fù)電荷。電泳凝膠的pH通過用于此凝膠的緩沖液確定。如果緩沖液的pH是在運(yùn)行的蛋白質(zhì)的pI之上，則該蛋白質(zhì)將遷移至正極(負(fù)電荷被吸引至正極)。如果緩沖液的pH是在運(yùn)行的蛋白質(zhì)的pi之下，則該蛋白質(zhì)將遷移至凝膠的負(fù)極(正電荷被吸引至負(fù)極)。如果蛋白質(zhì)用pH等于pI的緩沖液運(yùn)行，其將根本不遷移。這對(duì)個(gè)體氨基酸也是事實(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括具有大于8的pl的氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括具有大于9、大于10或大于11的pl的氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8、大于9、大于IO或大于11的pl的氨基酸存在于第一(多)肽/蛋白質(zhì)。在可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8、大于9、大于10或大于ll的pl的氨基酸存在于第二(多)肽/蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸選自賴氨酸和精氨酸。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是賴氨酸。在可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是精氨酸。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)包括多于一個(gè)具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。在可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括多于一個(gè)具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。在一些實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)或至少5個(gè)具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，直接鄰接于所述具有大于8的pl的氨基酸的氨基酸殘基是組氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，直接至所述具有大于8的pl的氨基酸的N-末端的氨基酸殘基是組氨酸殘基。在其他的實(shí)施方案中，直接至所述具有大于8的pl的氨基酸的C-末端的氨基酸殘基是組氨酸殘基。在另外其他的實(shí)施方案中，直接至所述具有大于8的pl的氨基酸的N-末端的氨基酸殘基和直接至所述具有大于8的pl的氨基酸的C-末端的氨基酸殘基兩者都是組氨酸殘基。進(jìn)一步優(yōu)選的直接鄰接于所述具有大于8的pl的氨基酸的多肽的一段序列是長(zhǎng)度為3、4、5、6、7或8個(gè)組氨酸殘基的多肽，其中至少一個(gè)組氨酸殘基用具有大于8的pl的氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)代替。最優(yōu)選的直接鄰接于所述具有大于8的pl的氨基酸的多肽的一段序列是長(zhǎng)度為6個(gè)組氨酸殘基的多肽，其中1、2或3個(gè)組氨酸殘基用具有大于8的pl的氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)代替。特別優(yōu)選直接鄰接于所述具有大于8的pl的氨基酸的以下多肽HHHHHH、HHHKHH、HHHHHK、HKHKHK(所有氨基酸是以單字母密碼，即H二組氨酸，K二賴氨酸)。在某一實(shí)施方案中，包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基和/或第二半胱氨酸殘基直接至組氨酸殘基的這段序列的C-末端，其中至少一個(gè)組氨酸殘基用具有大于8的pl的氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)代替。在其他的實(shí)施方案中，包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基和/或第二半胱氨酸殘基直接至3、4、5、6、7或8個(gè)組氨酸殘基的一段序列的C-末端，且直接至具有大于8的pl的氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)的N-末端。任選地，直接至包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和/或第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基和/或第二半胱氨酸殘基的N-末端的組氨酸殘基之一用具有大于8的pl的氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)額外地代替。如本發(fā)明的上下文中所用，術(shù)語"積極地影響反應(yīng)性"指如下情況其中兩個(gè)硫醇基反應(yīng)以形成二硫鍵的反應(yīng)的平衡被移動(dòng)至產(chǎn)物一側(cè)，即與已知系統(tǒng)，諸如例如WO01/05909中描述的"CysDisplay"系統(tǒng)比較，形成較大量的二硫鍵。按照WO01/05909和本發(fā)明所描述，可容易地檢測(cè)和測(cè)量各個(gè)硫醇基的反應(yīng)性。如下文所描述，相對(duì)展示速率或功能展示速率可以是合適的測(cè)試系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，這種平衡的移動(dòng)經(jīng)存在于反應(yīng)物之一(即第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì))的具有大于8的pi的氨基酸實(shí)現(xiàn)。所述具有大于8的pl的氨基酸以一種方式空間地位于包含在第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基或包含在第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基的附近，使得其可影響這種平衡的移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸位于直接鄰接所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的10個(gè)氨基酸內(nèi)，優(yōu)選8個(gè)氨基酸內(nèi)，更優(yōu)選6個(gè)氨基酸內(nèi)，且最優(yōu)選5個(gè)氨基酸內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述具有大于8的pi的氨基酸存在于所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的N-末端。在其他的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pi的氨基酸存在于所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的C-末端。在其他的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸位于距離包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基或第二半胱氨酸殘基超過10個(gè)氨基酸處，但所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)具有三維結(jié)構(gòu)，以致使得所述具有大于8的pl的氨基酸與所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基在空間上接近。具有大于8的pl的氨基酸和由所述氨基酸影響的半胱氨酸殘基可包含在相同的(多)肽/蛋白質(zhì)上，例如在相同(多)肽/蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域上?？蛇x地，具有大于8的pl的氨基酸和由所述氨基酸影響的半胱氨酸殘基可包含在不同的(多)肽/蛋白質(zhì)上，例如具有大于8的pl的氨基酸在第一(多)肽/蛋白質(zhì)上，且由所述氨基酸影響的半胱氨酸殘基在第二(多)肽/蛋白質(zhì)上，或反之亦然。在這種情況下，包含在一個(gè)(多)肽/蛋白質(zhì)上的具有大于8的pl的氨基酸積極地影響包含在其他(多)肽/蛋白質(zhì)上的第二半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，可選擇給定(多)肽/蛋白質(zhì)中的何種氨基酸位置以引入積極地影響半胱氨酸殘基的反應(yīng)性的具有大于8的pl的氨基酸。用于確定(多)肽/蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的多種技術(shù)是已知的，諸如X射線衍射晶體分析法或NMR技術(shù)。此外，許多(多)肽/蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已經(jīng)獲得的，使得容易選擇合適的氨基酸位置。特別地，多種免疫球蛋白或功能片段，諸如scFv或Fab片段的三維結(jié)構(gòu)是經(jīng)多禾中數(shù)據(jù)庫(kù)，諸如PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)或PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez7db=Structure)公眾可得的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"噬菌體"指細(xì)菌病毒，其形成由含有噬菌體復(fù)制所需的核酸的蛋白質(zhì)外殼組成的包裝。核酸可以是DNA或RNA，其為雙鏈或單鏈，線狀或環(huán)狀。諸如噬菌體A或絲狀噬菌體(諸如M13、fd或fl)的噬菌體為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選絲狀噬菌體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"噬菌體顆粒"指根據(jù)本發(fā)明的顆粒，即指經(jīng)二硫鍵展示(多)肽/蛋白質(zhì)的顆粒。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選絲狀噬菌體的噬菌體顆粒。在噬菌體的裝配期間，外殼蛋白可包裝不同的核酸序列，條件是它們包括包裝信號(hào)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語包含在噬菌體或噬菌體顆粒中的"核酸序列"指具有在噬菌體或噬菌體顆粒裝配期間被噬菌體外殼蛋白包裝的能力的核酸序列或載體。優(yōu)選地，所述核酸序列或載體衍生自天然存在的噬菌體的基因組，且例如在絲狀噬菌體的情況下，包括噬菌體和噬菌粒載體。后者是質(zhì)粒，其除了含有質(zhì)粒特征之外，還含有包裝信號(hào)和復(fù)制的噬菌體源。在某些實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)展示在噬菌體顆粒的表面上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)展示在噬菌體顆粒的表面上。在可選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)展示在噬菌體顆粒的表面上。優(yōu)選的是絲狀噬菌體顆粒。在某些實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員。在可選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員是野生型外殼蛋白plll，或衍生自野生型外殼蛋白plll。在其他的實(shí)施方案中，所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員是野生型外殼蛋白PIX，或衍生自野生型外殼蛋白pIX。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"衍生自"指修飾，其中修飾的蛋白質(zhì)能夠并入噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼。優(yōu)選地，修飾的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)野生型蛋白質(zhì)的那些部分表現(xiàn)出與對(duì)應(yīng)的野生型序列對(duì)比，超過約50%、約60%、約70%、優(yōu)選約80%和最優(yōu)選約90%的氨基酸同一性。在又進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述蛋白質(zhì)外殼的成員是噬菌體的野生型外殼蛋白。術(shù)語"野生型外殼蛋白"指形成天然存在的噬菌體的噬菌體外殼的那些蛋白質(zhì)。在絲狀噬菌體的情況中，所述野生型蛋白質(zhì)是基因III蛋白(pIII)、基因VI蛋白(pVI)、基因VII蛋白(pVII)、基因VIII蛋白(pVIII)和基因IX蛋白(pIX)。序列，包括絲狀噬菌體的緊密相關(guān)的成員，諸如fl、fd和M13之間的差異，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知(參見例如Kay等人，1996)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)外殼的成員是噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體，其中所述修飾的變體能夠并入噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼。術(shù)語"修飾的變體"指衍生自以上所指的野生型蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其與野生型序列對(duì)比，是被修飾的。這種修飾可包括與野生型序列相比的任何氨基酸置換、氨基酸缺失或并入額外的氨基酸。術(shù)語"修飾的變體"包括如下文定義的"截短的變體"。用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的野生型蛋白質(zhì)的修飾的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，且包括標(biāo)準(zhǔn)克隆和/或誘變技術(shù)。本領(lǐng)域中公知用于構(gòu)建核酸分子的方法，所述核酸分子編碼用于根據(jù)本發(fā)明的方法的野生型蛋白質(zhì)的修飾的變體；用于構(gòu)建包含所述核酸分子的載體的方法，包括構(gòu)建噬菌體和/或噬菌粒載體的方法；用于將所述載體引入適當(dāng)選擇的宿主細(xì)胞的方法；用于引起或使得所述修飾的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法(參見例如Sambrook等人，2001;Ausubel等人，1999;Kay等人，1996)。為了鑒別根據(jù)本發(fā)明的修飾的變體，可將檢測(cè)標(biāo)簽融合于變體，并可建立測(cè)定以確定變體是否能夠或被并入到變體存在時(shí)形成的噬菌體顆粒的噬菌體外殼中。14在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)外殼的成員是噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體，其中所述截短的變體包括至少引起所述外殼蛋白并入噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的所述野生型外殼蛋白的那一部分。術(shù)語"截短的變體"指衍生自以上所指的野生型蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其通過缺失至少一部分野生型序列來修飾。這包括變體，諸如截短的基因III蛋白變體，其已出現(xiàn)在噬菌體突變體中(Crissman&Smith,1984)或已在標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法的過程中產(chǎn)生(例如Bass等人，1990;Krebber，1996)。例如，所述截短的變體可由基因III蛋白的C_末端結(jié)構(gòu)域組成，或可包括基因III蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域。為了鑒別根據(jù)本發(fā)明的截短的變體，可將檢測(cè)標(biāo)簽融合于變體，并可建立測(cè)定以確定變體是否并入到變體存在時(shí)形成的噬菌體顆粒的噬菌體外殼中。通過由缺失一部分野生型蛋白質(zhì)來截短野生型蛋白質(zhì)，可獲得半胱氨酸殘基，其在野生型蛋白質(zhì)中與包含在缺失部分中的第二半胱氨酸形成二硫鍵。術(shù)語"(多)肽"指包括經(jīng)肽鍵連接的多個(gè)(即兩個(gè)或更多個(gè))氨基酸的一個(gè)或多個(gè)鏈的分子。術(shù)語"蛋白質(zhì)"指(多)肽，其中至少部分(多)肽通過在其(多)肽鏈的內(nèi)部和/或之間形成二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)而具有或能夠獲得確定的三維排列。這一定義包括諸如以下的蛋白質(zhì)，諸如天然存在的蛋白質(zhì)或至少部分人工地蛋白質(zhì)，以及全蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域，只要這些片段或結(jié)構(gòu)域能夠獲得如上描述的確定的三維排列。由單鏈組成的(多)肽/蛋白質(zhì)的實(shí)例是單鏈Fv抗體片段，且由多個(gè)鏈組成的(多)肽/蛋白質(zhì)的實(shí)例是Fab抗體片段。當(dāng)?shù)谝话腚装彼釟埢挥诘谝?多)肽/蛋白質(zhì)的C-末端時(shí)，展示形式對(duì)應(yīng)C-末端遺傳地融合于噬菌體外殼蛋白成員的常規(guī)展示結(jié)構(gòu)。然而，通過使用第一(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端，可恢復(fù)展示形式，如在以上所提到的Crameri&Suter的pJuF0系統(tǒng)中(Crameri&Suter，1993)。術(shù)語"噬菌體顆粒的表面"指與包含噬菌體顆粒的介質(zhì)接觸的，且可到達(dá)的噬菌體顆粒的部分。通過蛋白質(zhì)確定該表面，該蛋白質(zhì)是噬菌體外殼的一部分(顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員)，其在合適的宿主細(xì)胞中，在噬菌體產(chǎn)生期間裝配。術(shù)語"表達(dá)后"指以下情況編碼所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸在該第二(多)肽/蛋白質(zhì)連接至所述外殼前在宿主細(xì)胞中表達(dá)，該情況相對(duì)于其中表達(dá)編碼具有噬菌體外殼蛋白的融合蛋白的核酸的方法。編碼所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)，以及引起或使得連接的步驟可在不同的步驟和/或環(huán)境中進(jìn)行。然而，優(yōu)選地，表達(dá)和引起或使得連接的步驟在合適的宿主細(xì)胞中依次進(jìn)行。術(shù)語"其中所述連接通過形成二硫鍵而引起"指如下情況，其中二硫鍵負(fù)責(zé)連接，且其中沒有用于與存在于第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用結(jié)構(gòu)域被重組地融合于所述蛋白質(zhì)外殼的成員，如例如在pJuFo系統(tǒng)的情況下(Crameri&Suter，1993)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，展示第二(多)肽/蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒含有編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列。本領(lǐng)域公知用于構(gòu)建編碼根據(jù)本發(fā)明的(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸分子的方法，用于構(gòu)建包含所述核酸分子的載體的方法，用于將所述載體引入適當(dāng)?shù)剡x擇的宿主細(xì)胞的方法，用于引起或使得所述(多)肽/蛋白質(zhì)表達(dá)的方法(參見例如Sambrook等人，2001;Ausubel等人，1999;Ge等人，1995)。進(jìn)一步公知用于將產(chǎn)生子代噬菌體或噬菌體顆粒所需的遺傳物質(zhì)引入合適的宿主細(xì)胞的方法，和用于引起或使得所述子代噬菌體或噬菌體顆粒產(chǎn)生的方法(參見例如Kay等人，1996)。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述第一半胱氨酸殘基存在于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。更加優(yōu)選地，所述第一半胱氨酸殘基存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基沒有存在于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。甚至更加優(yōu)選地，所述第一半胱氨酸殘基沒有存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(多)肽/蛋白質(zhì)的"野生型型式"指具有天然存在的氨基酸序列的(多)肽/蛋白質(zhì)。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入第一(多)肽/蛋白質(zhì)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白。在其他的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體。在另外其他的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述第二半胱氨酸殘基存在于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。更加優(yōu)選地，所述第二半胱氨酸殘基存在于免疫球蛋白或其功能片段中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基沒有存在于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。甚至更加優(yōu)選地，所述第二半胱氨酸殘基沒有存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基已被人工地引入第二(多)肽/蛋白質(zhì)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基已被人工地引入免疫球蛋白或其功能片段。優(yōu)選地，所述功能片段是scFv或Fab片段。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸存在于第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。更加優(yōu)選地，所述具有大于8的pl的氨基酸存在于噬菌體的野生型外殼蛋白或免疫球蛋白或其功能片段(優(yōu)選scFv或Fab片段)中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸沒有存在于第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)不是野生型(多)肽/蛋白質(zhì)，且所述具有大于8的pl的氨基酸沒有存在于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)不是野生型(多)肽/蛋白質(zhì)，且所述具有大于8的pl的氨基酸沒有存在于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式中。甚至更加優(yōu)選地，所述具有大于8的pl的氨基酸沒有存在于噬菌體的野生型外殼蛋白或免疫球蛋白或其功能片段(優(yōu)選scFv或Fab片段)中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸已被人工地引入第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型型式。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pi的氨基酸已被人工地弓I入噬菌體的野生型外殼蛋白或免疫球蛋白或其功能片段，優(yōu)選scFv或Fab片段。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"人工地引入"指如下情況，其中(多)肽/蛋白質(zhì)已通過，例如重組方法被修飾。在本發(fā)明中，多種(多)肽/蛋白質(zhì)可以被修飾。例如，編碼第一(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)程序操作以引入半胱氨酸密碼子，產(chǎn)生編碼修飾的第一(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列，其中半胱氨酸殘基通過以下被人工地引入通過插入到所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)，或?qū)⑺霭腚装彼釟埢砑拥剿龅谝?多)肽/蛋白質(zhì)，或通過取代包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，或由所述半胱氨酸殘基修飾的蛋白質(zhì)，或通過將所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)與包含所述第二半胱氨酸殘基的第二(多)肽/蛋白質(zhì)融合，或通過所述插入、添加、取代或融合的任何組合。最優(yōu)選地，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體的野生型外殼蛋白，或其修飾的或截短的變體。類似地，編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)程序操作以便以與第一(多)肽/蛋白質(zhì)所描述的相同方式引入半胱氨酸密碼子。優(yōu)選的所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白或其功能片段。特別優(yōu)選的是scFv或Fab片段。類似地，編碼第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)程序操作以引入氨基酸密碼子，編碼具有大于8的pl的氨基酸。在其中第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體的野生型外殼蛋白的情況中，包括這種重組地引入的半胱氨酸密碼子的核酸的表達(dá)引起包含半胱氨酸殘基的野生型外殼蛋白的變體的形成。在一個(gè)進(jìn)一步最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體。在又進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體。用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的人工引入的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，且包括標(biāo)準(zhǔn)克隆和/或誘變技術(shù)。本領(lǐng)域中公知用于構(gòu)建核酸分子的方法，所述核酸分子編碼用于根據(jù)本發(fā)明的方法的野生型蛋白質(zhì)的修飾的變體；用于構(gòu)建包含所述核酸分子的載體的方法；用于將所述載體引入適當(dāng)選擇的宿主細(xì)胞的方法；用于引起或?qū)崿F(xiàn)所述融合蛋白表達(dá)的方法(參見例如Sambrook等人，2001;A腿bel等人，1999)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述第一半胱氨酸殘基存在于或鄰近所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的成員的C-末端或N-末端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基存在于或鄰近噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員的C-末端或N-末端。在某些實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基是N-末端半胱氨酸殘基。在其他的實(shí)施方案中，所述第一半胱氨酸殘基是c-末端半胱氨酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述第二半胱氨酸殘基存在于或鄰近所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的成員的C-末端或N-末端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基存在于或鄰近免疫球蛋白或其功能片段(優(yōu)選scFv或Fab片段)的C-末端或N-末端。在某些實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基是N-末端半胱氨酸殘基。在其他的實(shí)施方案中，所述第二半胱氨酸殘基是c-末端半胱氨酸殘基。術(shù)語"鄰近"指在從所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端起計(jì)算的兩種情況中，至多15，更優(yōu)選至多IO個(gè)氨基酸，且甚至更優(yōu)選至多5個(gè)氨基酸的一段序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)包括噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員，優(yōu)選pIII。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白或其功能片段，優(yōu)選scFv或Fab片段。在本文中，"免疫球蛋白"作為"抗體"的同義詞使用。術(shù)語"功能片段"指保留免疫球蛋白的抗原結(jié)合部分的免疫球蛋白的片段。根據(jù)本發(fā)明的功能免疫球蛋白片段可以是Fv(Skerra&Pliickthun，1988)、scFv(Bird等人，1988;Huston等人，1988)、二硫鍵連接的Fv(Glockshuber等人，1992;Brinkmann等人，1993)、Fab、F(ab')2片段或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他片段，其包括免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的可變結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的是scFv或Fab片段。在某些實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是不同的。在本文中，"不同的"指兩種(多)肽/蛋白質(zhì)不是完全相同的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)不是所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的修飾的變體或截短的變體。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一(多)肽/蛋白質(zhì)和第二(多)肽/蛋白質(zhì)編碼不同的功能(多)肽/蛋白質(zhì)，例如一種(多)肽/蛋白質(zhì)編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體，且另一種(多)肽編碼免疫球蛋白或其功能片段。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一(多)肽/蛋白質(zhì)和第二(多)肽/蛋白質(zhì)衍生自不同的種屬(例如一種(多)肽/蛋白質(zhì)衍生自噬菌體，且另一種(多)肽衍生自人類)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在噬菌體顆粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括引起或使得所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)在表達(dá)后連接于蛋白質(zhì)外殼的成員，其中所述連接是通過在包含于所述蛋白質(zhì)外殼的成員中的第一半胱氨酸殘基和包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述第一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)在合適的宿主細(xì)胞中被表達(dá)和裝配。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括以下步驟的方法(a)提供宿主細(xì)胞，其含有包含編碼第一(多)肽/蛋白質(zhì)的第一核酸序列的第一核酸序列，和含有包含編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的第二核酸序列的第二核酸序列，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)包含第一半胱氨酸殘基，且所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包含第二半胱氨酸殘基，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一包含具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性；(b)引起或使得所述第一核酸序列和所述第二核酸序列表達(dá)；且(c)引起或使得包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第一半胱氨酸殘基連接于包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第二半胱氨酸殘基。步驟(b)和(c)可以任何次序依次執(zhí)行，或同時(shí)執(zhí)行。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"引起或使得表達(dá)"描述在致使核酸序列被表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域公知用于構(gòu)建編碼根據(jù)本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)或第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸分子的方法，用于構(gòu)建包含所述核酸分子的載體的方法，用于將所述載體引入適當(dāng)?shù)剡x擇的宿主細(xì)胞的方法，用于引起或使得(多)肽/蛋白質(zhì)表達(dá)的方法(參見例如Sambrook等人，2001;Ausubel等人，1999)。進(jìn)一步公知用于將產(chǎn)生子代噬菌體或噬菌體顆粒所需的遺傳物質(zhì)引入合適的宿主細(xì)胞的方法，和用于引起或使得所述子代噬菌體或噬菌體顆粒產(chǎn)生的方法(參見例如Kay等人，1996)。引起或使得噬菌體顆粒產(chǎn)生的步驟可能需要使用合適的輔助噬菌體，例如在用噬菌粒工作的情況中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體的核酸序列，其中所述修飾的變體包括或由以下組成(a)所述噬菌體的野生型外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外殼蛋白并入噬菌體外殼的那一部分。(b)第一半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述第一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響包含于第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是分離的核酸序列。在其他的實(shí)施方案中，所述核酸序列還編碼用于純化和/或檢測(cè)目的的一種或多種肽序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼修飾的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修飾的免疫球蛋白或功能片段由以下組成(a)免疫球蛋白或其功能片段，(b)半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。如本文所用，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語，免疫球蛋白或其功能片段等于第二(多)肽/蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響包含于另一(多)肽/蛋白質(zhì)中的另一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語，這一其他(多)肽/蛋白質(zhì)等于第一(多)肽/蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述修飾的免疫球蛋白的功能片段是scFv或Fab片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是分離的核酸序列。在其他的實(shí)施方案中，所述核酸序列還編碼用于純化和/或檢測(cè)目的的一種或多種肽序列。在本發(fā)明的上下文中，通過由半胱氨酸殘基取代野生型外殼蛋白序列中的氨基酸殘基獲得的修飾的變體，可認(rèn)定為包含通過額外的半胱氨酸殘基連接的兩部分所述野生型蛋白質(zhì)的變體。相應(yīng)地，與野生型序列相比，包括幾個(gè)突變的野生型外殼蛋白的變體可認(rèn)定為包含幾個(gè)野生型部分，其中各個(gè)部分通過突變的殘基連接。然而，所述變體還可得自將至多6個(gè)殘基，包括半胱氨酸殘基，添加到野生型外殼蛋白的C-末端和/或N-末端。類似地，通過取代野生型或母體免疫球蛋白蛋白質(zhì)序列或其功能片段中的氨基酸殘基獲得的免疫球蛋白或其功能片段的修飾的變體，可認(rèn)定為包含通過額外的半胱氨酸殘基連接的兩部分免疫球蛋白或功能片段的變體。以相同的方式，野生型外殼蛋白的修飾的變體，或免疫球蛋白或其功能片段的修飾的變體可認(rèn)定為包含通過額外的具有大于8的pi的氨基酸連接的兩部分的變體，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。當(dāng)半胱氨酸殘基和具有大于8的pl的氨基酸兩者都引入野生型外殼蛋白的修飾的變體，或免疫球蛋白或其功能片段的修飾的變體時(shí)，則所述蛋白質(zhì)可認(rèn)定為包含三個(gè)部分或甚至更多部分的變體，只要所述蛋白質(zhì)包括甚至更多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列還編碼用于純化和/或檢測(cè)目的的一種或多種肽序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列包含在宿主細(xì)胞中。特別優(yōu)選的是包括至少5個(gè)組氨酸殘基的肽(Hochuli等人，1988)，其能夠結(jié)合金屬離子，且因此可用于純化它們?nèi)诤现恋牡鞍踪|(zhì)(Lindner等人，1992)。本發(fā)明還提供了額外的部分，諸如通常使用的c-myc和FLAG標(biāo)簽(Ho卯等人，1988;Kn即pik&Pliickthun，1994)、Str印-標(biāo)簽(Schmidt&Skerra，1994;Schmidt等人，1996)或E-標(biāo)簽(GEHealthcare)。本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)和第二(多)肽/蛋白質(zhì)的修飾的變體還可包括克隆、表達(dá)或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)所需的氨基酸殘基?？寺∷璧陌被釟埢砂ㄓ砂拗菩詢?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列的核酸序列編碼的殘基，所述識(shí)別序列被并入，從而能夠?qū)⒑怂嵝蛄锌寺〉胶线m的載體。表達(dá)所需的氨基酸殘基可包括導(dǎo)致(多)肽/蛋白質(zhì)溶解性或穩(wěn)定性增加的殘基。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)所需的氨基酸殘基可包括負(fù)責(zé)將修飾的變體運(yùn)輸至大腸桿菌周質(zhì)的信號(hào)序列，和/或促進(jìn)所述信號(hào)序列有效切割的氨基酸殘基。此外，以上所指的克隆、表達(dá)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、純化和/或檢測(cè)目的所需的氨基酸殘基是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾個(gè)部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體的一種或多種核酸序列，或由所述一種或多種核酸序列組成，其中所述修飾的變體包括或由以下組成(a)所述噬菌體的野生型外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外殼蛋白并入噬菌體外殼的那一部分；(b)第一半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述第一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述載體還包括編碼修飾的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修飾的免疫球蛋白或功能片段由以下組成(a)免疫球蛋白或其功能片段，以及(b)第二半胱氨酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括編碼修飾的免疫球蛋白或其功能片段的一種或多種核酸序列，或由所述一種或多種核酸序列組成，其中所述修飾的免疫球蛋白或功能片段包括或由以下組成(a)免疫球蛋白或其功能片段，(b)半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述載體還包括編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體的核酸序列，其中所述修飾的變體包括或由以下組成20(a)所述噬菌體的野生型外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外殼蛋白并入噬菌體外殼的那一部分；以及(b)另一半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含在宿主細(xì)胞中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白或其功能片段。在上文所指的單鏈Fv抗體片段的情況中，載體包括編碼由(多)肽連接體連接的VH和VL結(jié)構(gòu)域的一種核酸序列，且在Fab抗體片段的情況中，載體包括編碼VH-CH和VL-CL鏈的兩種核酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸序列或根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)可由包含在與編碼本發(fā)明的第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸相同的載體上的核酸序列編碼。在這種情況下，宿主細(xì)胞可包括一種載體，該載體包含編碼兩種(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列?？蛇x地，本發(fā)明的第一(多)肽/蛋白質(zhì)可由包含在與編碼本發(fā)明的第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸不同的載體上的核酸序列編碼。在此情況下，宿主細(xì)胞可包括兩種不同的載體，一種包含編碼第一(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列，且一種包含編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"可以是生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)中許多通常使用的細(xì)胞中的任何一種，包括但不限于細(xì)菌，諸如大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)(Ge等人，1995)或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(Wu等人，1993);真菌，諸如酵母(Horwitz等人，1988;Ridder等人，1995)或絲狀真菌(Nyyss6nen等人，1993);植物細(xì)胞(Hiatt&Ma，1993;Whitelam等人，1994);昆蟲細(xì)胞(Potter等人，1993;Ward等人，1995)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Trill等人，1995)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞，更優(yōu)選革蘭氏陰性宿主細(xì)胞，且最優(yōu)選大腸埃希氏桿菌。在又進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由根據(jù)本發(fā)明的核酸序列編碼的、由根據(jù)本發(fā)明的載體編碼的，或由根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的野生型噬菌體外殼蛋白的修飾的變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過以下方法可獲得的噬菌體顆粒，其在其表面上展示(多)肽/蛋白質(zhì)，所述方法包括引起或使得所述(多)肽/蛋白質(zhì)在表達(dá)后連接至蛋白質(zhì)外殼的成員，其中所述連接通過在包含于所述蛋白質(zhì)外殼的成員中的第一半胱氨酸殘基與包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)外殼的成員包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。在某些實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸包含于所述(多)肽/蛋白質(zhì)中。在其他的實(shí)施方案中，所述具有大于8的pl的氨基酸包含于所述蛋白質(zhì)外殼的成員中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述(多)肽/蛋白質(zhì)是免疫球蛋白或其功能片段。在另外其他的實(shí)施方案中，具有大于8的pl的氨基酸包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)，優(yōu)選在蛋白質(zhì)外殼的成員中，且具有大于8的pl的氨基酸包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)，優(yōu)選免疫球蛋白或其功能片段中。在本發(fā)明的高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，噬菌體顆粒含有根據(jù)本發(fā)明的載體，其中所述載體含有包含編碼第一(多)肽/蛋白質(zhì)的第一核酸序列的第一核酸序列，和含有包含編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的第二核酸序列的第二核酸序列，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)包含第一半胱氨酸殘基，且所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包含第二半胱氨酸殘基，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一包含具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。更加優(yōu)選地，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)至少包含免疫球蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。已作必要的修正的上文所指的本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案應(yīng)用于本發(fā)明的噬菌體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的噬菌體顆粒的不同集合，其中所述噬菌體顆粒中的每一個(gè)展示出(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合中的第二(多)肽/蛋白質(zhì)。"噬菌體顆粒的不同集合"也可稱為"文庫(kù)"或"多個(gè)噬菌體顆粒"。這種文庫(kù)的每個(gè)成員展示文庫(kù)的不同成員。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"不同集合"指至少一部分它們的組成、性質(zhì)和/或序列不同的至少兩種顆?；蚍肿拥募稀＠?，(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合是一組(多)肽/蛋白質(zhì)，它們?cè)谒鼈兊男蛄械闹辽僖粋€(gè)氨基酸位置處不同。這種(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合可以多種方式獲得，例如通過隨機(jī)誘變編碼起始(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列的至少一個(gè)密碼子，通過使用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增編碼起始(多)肽/蛋白質(zhì)的核酸序列，或通過使用增變株作為在根據(jù)本發(fā)明的方法中的宿主細(xì)胞。產(chǎn)生(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合的這些和其他的或可選的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。"噬菌體顆粒的不同集合"可稱為文庫(kù)或多個(gè)噬菌體顆粒。這種文庫(kù)的每個(gè)成員展示文庫(kù)的不同成員。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及獲得具有所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)提供根據(jù)本發(fā)明的噬菌體顆粒的不同集合，以及(b)篩選所述不同集合和/或從所述不同集合中選擇以獲得至少一種展示具有所述所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"所需性質(zhì)"指(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合中的(多)肽/蛋白質(zhì)之一應(yīng)該具有的，以及形成篩選和/或選擇不同集合的基礎(chǔ)的預(yù)先確定的性質(zhì)。這種所需性質(zhì)包括以下性質(zhì)，諸如對(duì)靶的結(jié)合、阻斷靶、活化靶介導(dǎo)的反應(yīng)、酶促活性和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的其他性質(zhì)。依據(jù)所需性質(zhì)的類型，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠識(shí)別執(zhí)行篩選和/或選擇的形式和必要步驟。最優(yōu)選其中所述期望特性是結(jié)合于感興趣的靶的方法。所述感興趣的靶可以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方式呈遞于所述噬菌體顆粒的不同集合，所述方式諸如包裹在表面上以便固相生物淘選，連接至諸如磁珠的顆粒以便在溶液中生物淘選，或展示在細(xì)胞表面上以便全細(xì)胞生物淘選或在組織切片上生物淘選。已結(jié)合至所述靶的噬菌體顆?？赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方法來恢復(fù)，所述方法諸如通過用合適的緩沖液洗脫，無論是使用pH梯度或鹽梯度，或通過使用可溶性靶特異性洗脫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲得(多)肽/蛋白質(zhì)的方法還包括22(ba)使所述噬菌體顆粒的不同集合與感興趣的靶接觸；(bb)洗脫沒有結(jié)合于所感興趣的靶的噬菌體顆粒；(be)通過在還原條件下處理在步驟(ba)中形成的感興趣的耙與結(jié)合于所述感興趣的靶的噬菌體的復(fù)合體，來洗脫結(jié)合于感興趣的靶的噬菌體顆粒。在還原條件下，諸如通過用DTT孵育，二硫鍵被切割，因此使得具體噬菌體顆?；謴?fù)，用于下一輪生物淘選，和/或用于鑒別特異性結(jié)合于所述靶的(多)肽/蛋白質(zhì)。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善半胱氨酸展示系統(tǒng)的方法，其通過將具有大于8的pi的氨基酸引入第一或第二(多)肽/，以致包含在所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基與包含在第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基比在沒有引入這種具有大于8的pi的氨基酸的同等半胱氨酸展示系統(tǒng)中更加優(yōu)選地形成二硫鍵。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種復(fù)合體，其包括(a)第一(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第一半胱氨酸殘基，以及[O169](b)第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第二半胱氨酸殘基，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一還包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性，且其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)經(jīng)所述半胱氨酸殘基形成二硫鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是展示于多個(gè)噬菌體顆粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合的成員。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體外殼蛋白。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白或其功能片段，更優(yōu)選scFv或Fab片段。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含任何上文描述的復(fù)合體的宿主細(xì)胞。實(shí)施例實(shí)施例l:新載體的構(gòu)建載體是基于WO01/05909中描述的已知表達(dá)載體。Fab片段的重鏈和輕鏈?zhǔn)菑脑趌ac啟動(dòng)子/操縱子區(qū)控制下的雙順反子噬菌粒表達(dá)的。第一表達(dá)盒包括信號(hào)序列ompA和輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域。第二表達(dá)盒包括信號(hào)序列phoA和重鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈未經(jīng)二硫鍵連接?；騃II也在相同的載體上編碼。形成二硫鍵的半胱氨酸殘基位于pIII的N-末端和重鏈Fd-片段的C-末端。典型的CysDisplay載體的主要特征顯示于圖1。已基于pM0RPH25載體構(gòu)建新展示載體變體(pM0RPH25型式A、B、C和E)，所述pM0RPH25載體是pM0RPH23的衍生物(描述于W004/013276)。含有雌二醇-BSA特異性HuCALFab片段的pM0RPH23和pM0RPH25的序列和載體圖顯示于圖5、6、7和8。pM0RPH23和pM0RPH25的半胱氨酸-標(biāo)簽序列是相同的。對(duì)于用修飾的半胱氨酸_標(biāo)簽構(gòu)建載體變體，pM0RPH25由EcoRI和HindIII消化以除去C-末端野生型序列(pM0RPH25—WT標(biāo)簽)。通過將具有相容突出端的退火雙鏈(ds)寡核苷酸連接至EcoRI和HindIII消化的展示載體pM0RPH25，插入型式A、B、C和E的新C-末端標(biāo)簽。各個(gè)寡核苷酸的序列歸納于表2。根據(jù)以下程序，將雙鏈寡核苷酸退火。200ng各個(gè)寡核苷酸組合的每一個(gè)(例如pM0RPH25型式A的SeqIDNol和SeqIDNo2)在99。C下孵育20分鐘，隨后冷卻至室溫，使得互補(bǔ)序列退火。退火dsDNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)連接至消化的pM0RPH25(參見例如Sambrook等人，2001;Ausubel等人，1999;Kay等人，1996)，并轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)ToplOF細(xì)胞(Invitrogen)。表2:用于展示標(biāo)簽盒構(gòu)建的寡核苷酸_<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對(duì)照構(gòu)建體pM0RPH25的重鏈片段的C_末端的氨基酸序列顯示于表3。在表3中，四種這種衍生物被標(biāo)記為"pM0RPH25型式A"、"pM0RPH25型式B"、"pM0RPH25型式C"和"pM0RPH25型式E"。一個(gè)變體恰好在C-末端攜帶額外的賴氨酸殘基(變體A)。在變體B和C中，組氨酸殘基，分別是至活性半胱氨酸殘基的N-末端的第三個(gè)和第一個(gè)氨基酸，被交換為賴氨酸殘基。在變體E中，直接至活性半胱氨酸殘基的N-末端的5個(gè)組氨酸殘基中的3個(gè)被交換為賴氨酸殘基。表3:本發(fā)明中使用的重鏈片段的C末端的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例2:結(jié)合至Ni-NTA板的噬菌體pM0RPH25中的直接至活性半胱氨酸殘基的N-末端的6個(gè)組氨酸殘基為噬菌體顆粒賦予了結(jié)合至Ni-NTA板的能力。在型式A中，將賴氨酸殘基引入活性半胱氨酸殘基的C-末端。在pM0RPH25的型式B、C和E中，通過將至少一個(gè)賴氨酸殘基引入所述六組氨酸序列段的每一個(gè)的方式來破壞這一六個(gè)組氨酸殘基的序列段。據(jù)推測(cè)，這應(yīng)該導(dǎo)致展示Fab片段的噬菌體顆粒結(jié)合至Ni-NTA板的能力喪失。展示Fab片段的噬菌體顆粒經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生(參見例如Kay等人，1996和W001/05909的實(shí)施例2.2)。如簡(jiǎn)單地描述，來確定噬菌體顆粒對(duì)Ni-NTA板的結(jié)合。噬菌體顆粒(8xl08/孔)用封閉溶液(用TBS，O.1%Tween20稀釋的Chemiblock)預(yù)孵育2小時(shí)，將其加入以預(yù)封閉的HIS-選擇iLAPHC鎳包被的96孔板(Sigma-AldrichCo)。用PBST和PBS洗滌后，剩余的噬菌體用抗M13-HRP偶聯(lián)物(AmershamPharmaciaBiotech)和可溶性BM藍(lán)(BMbluesoluble)(BoehringerMannheim)顯示。結(jié)果描述于圖2中。如圖2所示，pM0RPH25的型式B和E有效地破壞了組氨酸標(biāo)簽。原始構(gòu)建體仍然結(jié)合于Ni-NTA板。這種結(jié)合對(duì)型式A以及型式C仍然適用，型式A仍然攜帶六組氨酸標(biāo)簽，型式C仍然攜帶五組氨酸標(biāo)簽，其似乎足以能夠?qū)⑹删w顆粒結(jié)合至Ni-NTA板。實(shí)施例3:相對(duì)展示速率按照以下所描述，確定多種載體構(gòu)建體的噬菌體顆粒的相對(duì)展示速率(型式A-型式E，如實(shí)施例l所描述)。通過標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生噬菌體顆粒(參見例如Kay等人，1996和W001/05909的實(shí)施例2.2)。在兩個(gè)獨(dú)立的ELISA實(shí)驗(yàn)中，確定未知噬菌體顆粒溶液的噬菌體顆粒數(shù)量和抗體展示速率。噬菌體制品的噬菌體顆粒效價(jià)經(jīng)抗pill捕獲ELISA確定，且噬菌體制品的抗體展示速率經(jīng)抗Fd捕獲ELISA確定。相對(duì)展示速率定義為抗Fd信號(hào)除以抗pill捕獲ELISA信號(hào)。MaxisorpNunc-I匪no微量滴定板用100u12.5ug/ml抗pill捕獲抗體溶液(MoBiTech，G6ttingen，Germany)包被，且第二板用1000.5yg/ml抗Fd捕獲抗體溶液包被，這在4t:下持續(xù)12小時(shí)，且在室溫下用在TPBS中以1:2稀釋的Chemiblock溶液(Chemichon，International)封閉2小時(shí)。將噬菌體顆粒的一系列稀釋液加入到板中，持續(xù)2小時(shí)。用TBST洗滌5次后，經(jīng)抗M13-HRP抗體(抗g8p特異性，Amersham)，隨后熒光檢測(cè)(QuantaBlue，Pierce)來檢測(cè)捕獲的噬菌體顆粒。噬菌體顆粒效價(jià)可由具有已知顆粒濃度的參照噬菌體溶液的校準(zhǔn)曲線來計(jì)算。展示速率由確定的具有已知抗體片段展示速率的參照噬菌體顆粒制品來計(jì)算。已根據(jù)Johansen，L.K.等人(1995)確定這一參照噬菌體制品的展示速率。相對(duì)展示速率歸納于表4。原始pM0RPH25構(gòu)建體的展示速率設(shè)置為100%。表4:這一研究的構(gòu)建體的相對(duì)展示速率<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如其所示，pM0RPH25的所有四種衍生物與pM0RPH25自身相比，顯示出較高的相對(duì)展示速率。pM0RPH25型式E顯示出最高展示速率，其表現(xiàn)出超出原始構(gòu)建體pM0RPH252.57倍的增加的展示速率。這一實(shí)驗(yàn)顯示出令人驚訝的結(jié)果，經(jīng)引入帶正電的氨基酸賴氨酸實(shí)現(xiàn)的六組氨酸標(biāo)簽的破壞產(chǎn)生噬菌體顆粒上的增加的展示速率。實(shí)施例4:功能展示速率在抗原結(jié)合ELISA測(cè)定中測(cè)量功能展示速率，所述測(cè)定對(duì)在這一研究中使用的具體結(jié)合子具有特異性。4。C下，將lyg重組蛋白包被在MaxisorpNunc-lmmuno微量滴定板上，持續(xù)12小時(shí)，并用含有5%脫脂奶粉的？85(工16&1316『SaliterGmbH&CoKG)在室溫下封閉2小時(shí)。在存在或缺少20mMDTT時(shí)，在PBS、5X脫脂奶粉和0.05%吐溫20中預(yù)孵育來自各種標(biāo)簽構(gòu)建體的噬菌體制品。將預(yù)封閉的噬菌體顆粒的一系列稀釋液加入到包被的Maxisorp孔中，并孵育2小時(shí)。用PBST和PBS洗滌后，剩余的噬菌體用抗M13-HRP偶聯(lián)物(AmershamPh;armEiciEiBiotech)禾口可溶性BM藍(lán)(BoehringerM;a皿heim)顯示。在第一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，額外地將25mMDTT加入到孔中。在第二組對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，板僅用BSA包被。pM0RPH25型式A、B和C的結(jié)果顯示于圖3，且pM0RPH25型式E的結(jié)果在圖4中。鑒別測(cè)試的所有構(gòu)建體的功能噬菌體顆粒。pM0RPH25型式A略微好于標(biāo)準(zhǔn)pM0RPH25。pM0RPH25的型式B和C明顯好于標(biāo)準(zhǔn)pM0RPH25。當(dāng)各個(gè)孔用至少5e+08個(gè)噬菌體顆粒/孔接種時(shí)，差異最顯著。pM0RPH25型式E的功能展示速率甚至比標(biāo)準(zhǔn)pM0RPH25的展示速率高約4倍(由圖4中的箭頭所示)。所有對(duì)照測(cè)量，即額外加入25rnMDTT的孔和用BSA包被的板中的孔，沒有給出超過背景的信號(hào)。這一實(shí)驗(yàn)顯示出令人驚訝的結(jié)果，經(jīng)引入帶正電的氨基酸賴氨酸實(shí)現(xiàn)的六組氨酸標(biāo)簽的破壞不僅產(chǎn)生噬菌體顆粒上的增加的展示速率，而且增加的展示速率同時(shí)伴隨著噬菌體顆粒的功能結(jié)合。事實(shí)上，功能展示速率的增加甚至高于在以上實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的相對(duì)展示速率的增加。實(shí)施例5:不同文庫(kù)的展示這一實(shí)施例顯示由修飾的標(biāo)簽型式(參見表4)引起的展示速率的增加不限于特異性Fab片段，但可一般地應(yīng)用于不同的Fab片段文庫(kù)。含有pM0RPH25型式E的重鏈片段(C-末端-HKHKHKC)的Fab文庫(kù)的相對(duì)展示速率對(duì)比含有原始pM0RPH23載體的重鏈片段(C-末端-HHHHHHC)的Fab文庫(kù)。對(duì)比參見表3(pM0RPH23和pM0RPH25的半胱氨酸-標(biāo)簽序列是相同的)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置與實(shí)施例3中所描述是相同的。結(jié)果顯示于圖9。如其所示，與常規(guī)載體(設(shè)置為1)相比，基本上包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的所有構(gòu)架顯示出明顯地提高的展示速率。此外，在A和k鏈片段兩者中觀察到增加的相對(duì)展示速率。附圖簡(jiǎn)述圖1:A型CysDisolay載體Fab片段的重鏈和輕鏈處在lac啟動(dòng)子/操縱子區(qū)的控制之下。第一表達(dá)盒包括信號(hào)序列ompA和輕鏈的可變(VL)結(jié)構(gòu)域和恒定(CL)結(jié)構(gòu)域，第二表達(dá)盒包括信號(hào)序列phoA和重鏈的可變(VH)結(jié)構(gòu)域和恒定(CH1)結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈未經(jīng)二硫鍵連接。基因III也在相同的載體(gill)上編碼。形成二硫鍵的半胱氨酸位于pIII的N-末端和重鏈Fd-片段的C-末端(由'C'表示)。AccI、AflII、Xbal、EcoRI和HindIII表示可方便地用于產(chǎn)生或修飾展示載體的限制位點(diǎn)。Ml:對(duì)Ni-NTA板的結(jié)合"pM25"代表原始"pM0RPH25"構(gòu)建體，且"pM25_A"至"pM25_E"分別代表構(gòu)建體"pM0RPH25型式A"至"pM0RPH25型式E"。"pM25w/oHIS標(biāo)簽"代表其中缺失組氨酸標(biāo)簽的構(gòu)建體。吸光度在370nm處測(cè)量。Ml:pMORPH型式A、B禾PC的功能展示速率"pM25"代表原始"pM0RPH25"構(gòu)建體，且"pM25_A"至"pM25_E"分別代表構(gòu)建體"pM0RPH25型式A"至"pM0RPH25型式E"。從左至右的每個(gè)構(gòu)建體的柱體如下每孔5.0e+10個(gè)噬菌體顆粒、每孔5.0e+9個(gè)噬菌體顆粒、每孔5.0e+8個(gè)噬菌體顆粒、每孔5.0e+7個(gè)噬菌體顆粒、每孔5.0e+10個(gè)噬菌體顆粒加25mMDTT和在用BSA包被的板中的每孔5.0e+10個(gè)噬菌體顆粒。Mi:pMORPH型式E的功能展示速率"pM25"代表原始"pMorph25"構(gòu)建體，且"pM25_E"代表構(gòu)建體"pM0RPH25型式E"。從左至右的每個(gè)構(gòu)建體的柱體如下每孔1.0e+10個(gè)噬菌體顆粒、每孔1.0e+9個(gè)噬菌體顆粒、每孔5.0e+8個(gè)噬菌體顆粒、每孔2.5e+8個(gè)噬菌體顆粒、每孔1.25e+8個(gè)噬菌體顆粒、每孔6.25e+7個(gè)噬菌體顆粒、在用BSA包被的板中的每孔1.0e+10個(gè)噬菌體顆粒和每孔1.Oe+10個(gè)噬菌體顆粒加25mMDTT。箭頭指示那些測(cè)量值，其中標(biāo)準(zhǔn)pM0RPH25和pM0RPH25型式E之間的差異是最顯著的。Ml顯示含有雌二醇-BSA特異性HuCALFab片段的pM0RPH23衍生物的序列。,顯示含有雌二醇-BSA特異性HuCALFab片段的pM0RPH23衍生物的載體圖。Ml顯示含有雌二醇-BSA特異性HuCALFab片段的pM0RPH23衍生物的序列。顯示含有雌二醇-BSA特異性HuCALFab片段的pM0RPH25衍生物的載體圖。Ml顯示與常規(guī)構(gòu)建體的文庫(kù)相比的基于本發(fā)明的Fab片段文庫(kù)的相對(duì)展示速率。每一單個(gè)構(gòu)建體的常規(guī)構(gòu)建體(pM0RPH23)的展示速率設(shè)置為1(即100%)。顯示了與pM0RPH23構(gòu)建體的展示速率相比，由pM0RPH25-型式E示例的改善的構(gòu)建體的相對(duì)展示速率。在x軸上指示測(cè)試的不同構(gòu)架。白柱指示A鏈片段，且黑柱指示k鏈片段。參考文獻(xiàn)Albrecht，H.，DeNardo，G丄&DeNardo，S.J.(2006)MonospecificbivalentscFv—SH:Effectsoflinkerlengthandlocationofanengineeredcysteineonproduction,antigenbindingactivityandfreeSHaccessibility(單特異性二價(jià)scFv-SH:工程半胱氨酸的連接體長(zhǎng)度和位置對(duì)生產(chǎn)、抗原結(jié)合活性和游離SH可接近性的影響).JournalofImmunologicalMethods,310，100-116.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston,R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G.，Smith,J.A.&Struhl，K編輯(1999).CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編).NewYork:JohnWileyandSons.Bass，S.，Greene,R.&Wells，J.A.(1990)Hormonephage:anenrichmentmethodforvariantproteinswithalteredbindingproperties(激素噬菌體具有改變的結(jié)合性質(zhì)的變體蛋白質(zhì)的富集方法).Proteins:St潔ture，F(xiàn)皿ctio薩dGenetics8，309-314.Bird,R.E.，Hardman，K.D.，Jacobson，J.W.，Joh固n，S.，Kaufman,B.M.，LeeS.M.，LeeT.，PopeS.H.，RiordanG.S.&WhitlowM.(1988).Single-chainantigen-bindingproteins(單鏈抗原結(jié)合蛋白)[出版勘誤出現(xiàn)在(1989)Science244，409].Science242,423-6.Brinkma皿，U.，Reiter，Y.，J皿g，S.，Lee，B.&Pastan，I.(1993).Arecombinantimmunotoxincontainingadisulfide_stabilizedFvfragment(含有二石充鍵禾急定的Fv片段的重組免疫毒素).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，7538-7542.Britto，P.J.，Knipling，L.&Wolff，J.(2002)TheLocalElectrostaticEnvironmentDeterminesCysteineReactivityinTubulin(局部靜電環(huán)境決定微管蛋白中半胱氨酸的反應(yīng)性).JournalofBiologicalChemistry,2002，29018-29027.Buija，G.，Korte騰，T.&Goldenberg，D.P.(1998)Ionization-ReactivityRelationshipsforcysteineThiolsinPolyp印tides(多肽中半胱氨酸硫醇的離子化_反應(yīng)性關(guān)系).Biochemistry37，8965-8972.Crameri，R.，&Suter，M.(1993).Displayofbiologicallyactiveproteinsonthesurfaceoffilamentousphages:acDNAcloningsystemforselectionoff皿ctionalgeneproductslinkedtothegeneticinformationresponsiblefortheirproduction(生物活性蛋白質(zhì)在絲狀噬菌體的表面上的展示選擇與負(fù)責(zé)它們產(chǎn)生的遺傳信息相關(guān)的功能基因產(chǎn)物的cDNA克隆系統(tǒng)).Gene137，69-75.28Crissman，J.W.&Smith，G.P.(1984).Gene_IIIproteinoffilamentousphages:evidenceforacarboxy-terminaldomainwitharoleinmorphogenesis(絲狀噬菌體的基因III蛋白羧基末端結(jié)構(gòu)域具有形態(tài)發(fā)生作用的證據(jù)).Virology132,445-455.Dunn，I.S.1996.Phagedisplayofproteins(蛋白質(zhì)的噬菌體展示).Curr.Opin.Biotechnol.7:547_553.Gao，C.，Mao，S.，Lo，C._H.L.，Wirsching，P.，Lerner，R.A.，&Janda，K.D.(1999).Makingartificialantibodies:Aformatforphagedisplayofcombinatorialheterodimericarrays(制備人工抗體組合的異二聚陣列的噬菌體展示的形式).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，6025-6030.Ge，L，K卿pik，A.，Pack,P.，F(xiàn)re皿d，C.&Pliickth皿，A.(1995).ExpressingantibodiesinEscherichiacoli.AntibodyEngineering.APracticalApproach(大腸埃希桿菌中的表達(dá)抗體?？贵w技術(shù)。一種實(shí)踐方法)(C.A.K.Borrebaeck編輯).IRLPress,Oxford,第229-266頁.Glockshuber，R.，Malia，M.，Pfitzinger，I.&Pliickth皿，A.(1992).AcomparisonofstrategiestostabilizeimmunoglobulinFv—fragments(禾急定免疫5求蛋白Fv—片段的策略的對(duì)比)Biochemistry29，1362-1366.GreenwoodJ.，WillisA.E.&PerhamR.N.(1991)Multipledisplayofforeignpeptidesonafilamentousbacteriophage.PeptidesfromPlasmodiumfalciparumcirc墜porozoiteproteinasantigens(夕卜源肽在絲狀噬菌體上的多展示。來自惡性癥原蟲環(huán)孢子蛋白的肽作為抗原).J.Mol.Biol.220,821-827.Hansen,R.E:，0stergaard，H.&Winther，J.R.(2005)IncreasingtheReactivityofanArtificialDithiol-DisulfidePairthroughModificationoftheElectrostaticMilieu(通過修飾靜電環(huán)境增加人工二硫醇-二硫化物對(duì)的反應(yīng)性)Biochemistry,44，5899-5906-Hiatt，A.&Ma，J.K.(1993).Characterizationandapplicationsofantibodiesproducedinplants(植物中產(chǎn)生的抗體的特征和應(yīng)用)Int.Rev.Immunol.10，139-152.Hochuli，E.，Ba麗arth，W.，D6beli，H.，Gentz，R.&StUber，D.(1988).Geneticapproachtofacilitatepurificationofrecombinantproteinswithanovelmetalchelateadsorbent(用新的金屬螫合物吸附劑促進(jìn)重組蛋白的純化的遺傳方法).Bio/Technology6，1321-1325.Hopp，T.P.，Prickett，K.S.，Price,V.L，Libby，R.T.，March,C.J.，Cerretti，D.P.，Urdal，D丄&Conlon，P.J.(1988).AshortpolyP印tidemarkersequenceusefulforrecombinantproteinidentificationandpurification(用于重組蛋白鑒另U禾口純4七的短多肽標(biāo)志物序列)Bio/Technology6，1204-1210.Horwitz，A.H.，Chang，C.P.，Better,M.，Hellstrom，K.E.&Robinson,R.R.(1988).SecretionoffunctionalantibodyandFabfragmentfromyeastcells(來自酵母細(xì)胞的功能抗體和Fab片段的分泌).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，8678-8682.Huston,J.S.，Levinson，D.，Mudgett—Hunter，M.，Tai，M.S.，Novotny，J.，Margolies，M.N.，Ridge，R.J.，Bruccoleri,R.E.，Haber，E.&Crea，R.(1988).Proteinengineeringofantibodybindingsites.Recoveryofspecificactivityinananti_digoxinsingle-chainFvanalogueproducedinEscherichiacoli(抗體結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。由大腸埃希桿菌產(chǎn)生的抗地高辛單鏈Fv類似物中的特異性活性的恢復(fù))Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，5879—5883.JespersL.S.，MessensJ.H.，DeKeyserA.，EeckhoutD.，Vand.B.，I，GansemansY.G.，LauwereysM.J.，VlasukG.P.&StanssensP.E.(1995).Surfaceexpressionandligand—basedselectionofcDNAsfusedtofilamentousphagegeneVI(融合于絲狀噬菌體基因VI的cDNA的表面表達(dá)和基于配體的選擇).Biotechnology(N.Y.)13,378-382.Kay，B.K.，Winter,J.&McCafferty，J.編輯(1996).Phagedisplayofp印tidesandproteins:alaboratoryma麗l(肽禾口蛋白質(zhì)的噬菌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1所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸沒有存在于所述野生型(多)肽/蛋白質(zhì)中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸已被人工地引入。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸包含在相同(多)肽/蛋白質(zhì)上的鄰接所述半胱氨酸殘基的10個(gè)氨基酸內(nèi)。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸包含在相同(多)肽/蛋白質(zhì)上的鄰接所述半胱氨酸殘基的5個(gè)氨基酸內(nèi)。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第一半胱氨酸殘基存在于或鄰近所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一半胱氨酸殘基是N-末端半胱氨酸殘基或c-末端半胱氨酸殘基。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二半胱氨酸殘基存在于或鄰近所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第二半胱氨酸殘基是N-末端半胱氨酸殘基或c-末端半胱氨酸殘基。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)展示在噬菌體顆粒的表面上。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述二硫鍵在宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中形成。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述二硫鍵是分子間二硫鍵。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸選自賴氨酸和精氨酸。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述氨基酸是賴氨酸。18.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是不同的。19.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)外殼的成員是噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體，其中所述截短的變體包括至少引起所述外殼蛋白并入所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的所述野生型外殼蛋白的那一部分。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)外殼的成員是噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體，其中所述修飾的變體能夠并入到所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第一半胱氨酸殘基存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第一半胱氨酸殘基沒有存在于噬菌體的野生型外殼蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白。25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的截短的變體。26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一半胱氨酸殘基已被人工地引入噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體。27.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述噬菌體顆粒是絲狀噬菌體的噬菌體顆粒。28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員是野生型外殼蛋白Plll，或衍生自野生型外殼蛋白pIII。29.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)外殼的成員是野生型外殼蛋白PIX，或衍生自野生型外殼蛋白pIX。30.如權(quán)利要求l所述的方法，其中包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的所述第二半胱氨酸殘基沒有存在于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)的野生型中的對(duì)應(yīng)氨基酸位置。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第二半胱氨酸殘基已被人工地引入所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)。32.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白或其功能片段。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述功能片段是scFv或Fab片段。34.—種在噬菌體顆粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括引起或使得所述(多)肽/蛋白質(zhì)在表達(dá)后連接于蛋白質(zhì)外殼的成員，其中所述連接是通過在包含于所述蛋白質(zhì)外殼的成員中的第一半胱氨酸殘基和包含于所述(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)外殼的成員包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述第一半胱氨酸殘基或所述第二半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。35.—種編碼噬菌體的野生型外殼蛋白的修飾的變體的核酸序列，其中所述修飾的變體包括(a)所述噬菌體的野生型外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外殼蛋白并入噬菌體外殼的那一部分，(b)第一半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述第一半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。36.—種編碼修飾的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修飾的免疫球蛋白或功能片段包括(a)免疫球蛋白或其功能片段，(b)半胱氨酸殘基，以及(c)具有大于8的pl的氨基酸，其積極地影響所述半胱氨酸殘基的反應(yīng)性。37.如權(quán)利要求36所述的核酸序列，其中修飾的免疫球蛋白的所述功能片段是scFv或Fab片段。38.如權(quán)利要求35至37中的任何一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述核酸序列還編碼用于純化和/或檢測(cè)目的的一種或多種肽序列。39.—種載體，其包含權(quán)利要求35至38中的任何一項(xiàng)所述的核酸。40.如權(quán)利要求39所述的載體，其還包括編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的一種或多種核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括第二半胱氨酸殘基。41.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求35至38中的任何一項(xiàng)所述的核酸序列，或權(quán)利要求39或40所述的載體。42.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求39所述的載體和第二載體，所述第二載體包括編碼第二(多)肽/蛋白質(zhì)的一種或多種核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括第二半胱氨酸殘基。43.—種(多)肽/蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求35至38中的任何一項(xiàng)所述的核酸序列編碼，由權(quán)利要求39或40所述的載體編碼，或由權(quán)利要求41或42所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。44.一種噬菌體顆粒，所述噬菌體顆粒在其表面上展示(多)肽/蛋白質(zhì)，所述噬菌體顆?？赏ㄟ^權(quán)利要求34所述的方法獲得。45.如權(quán)利要求44所述的噬菌體顆粒，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)是免疫球蛋白或其功能片段。46.—種權(quán)利要求44或45所述的噬菌體顆粒的不同集合，其中所述噬菌體顆粒中的每一個(gè)展示出第二(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合中的第二(多)肽/蛋白質(zhì)。47.—種獲得具有所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)提供權(quán)利要求46所述的噬菌體顆粒的不同集合，以及(b)篩選所述不同集合和/或從所述不同集合中選擇以獲得至少一種展示具有所需性質(zhì)的(多)肽/蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒。48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中步驟(b)還包括(ba)使所述噬菌體顆粒的不同集合與感興趣的靶接觸；(bb)洗脫沒有結(jié)合于所述感興趣的耙的噬菌體顆粒；以及(bc)通過在還原條件下處理在步驟(ba)下形成的所述感興趣的耙與結(jié)合于所述感興趣的靶的噬菌體的復(fù)合體，來洗脫結(jié)合于所述感興趣的靶的噬菌體顆粒。49.如權(quán)利要求47或48所述的方法，其中所述所需性質(zhì)是對(duì)感興趣的靶的結(jié)合、抑制感興趣的靶、阻斷感興趣的靶、活化靶介導(dǎo)的反應(yīng)、酶促活性。50.—種復(fù)合體，其包括(a)第一(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第一半胱氨酸殘基，以及(b)第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其包括第二半胱氨酸殘基，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一還包括具有大于8的pl的氨基酸，所述具有大于8的Pi的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性，且其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)和所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)經(jīng)所述半胱氨酸殘基形成二硫鍵。51.如權(quán)利要求49所述的復(fù)合體，其中所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)是展示于多個(gè)噬菌體顆粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白質(zhì)的不同集合的成員。52.如權(quán)利要求49所述的復(fù)合體，其中所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)是噬菌體外殼蛋白。53.如權(quán)利要求49所述的復(fù)合體，其中所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白或其功能片段。54.如權(quán)利要求53所述的復(fù)合體，其中所述功能片段是scFv或Fab片段。55.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求49至54中的任何一項(xiàng)所述的復(fù)合體。56.—種形成二硫鍵的方法，其包括引起或使得第一(多)肽/蛋白質(zhì)連接于第二(多)肽/蛋白質(zhì)，其中所述連接是通過在包含于所述第一(多)肽/蛋白質(zhì)中的第一半胱氨酸殘基與包含于所述第二(多)肽/蛋白質(zhì)中的第二半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而引起，其中所述(多)肽/蛋白質(zhì)之一包括具有大于8的pl的氨基酸。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述具有大于8的pl的氨基酸積極地影響所述半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)的反應(yīng)性。全文摘要本發(fā)明涉及分子間二硫鍵的形成方法，包括這些方法中使用的(多)肽/蛋白質(zhì)、核酸、載體、宿主細(xì)胞和噬菌體。此外，本發(fā)明涉及該方法用于改良(多)肽/蛋白質(zhì)在噬菌體顆粒的表面上的展示的用途。文檔編號(hào)C12N15/10GK101772574SQ200880101913公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年8月21日優(yōu)先權(quán)日2007年8月21日發(fā)明者喬瑟夫·普拉斯勒,伊溫妮·斯塔克申請(qǐng)人:莫佛塞斯公司