專利名稱：κ-卡拉膠酶和包含κ-卡拉膠酶的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了包含至少一種卡拉膠酶的清潔組合物，在宿主細胞中生產(chǎn)卡拉膠酶
的方法，包含編碼至少一種卡拉膠酶的重組多核苷酸的宿主細胞，和編碼卡拉膠酶的重組 多核苷酸。
背景技術(shù)：
清洗劑和其他清潔組合物通常包括活性成份的復(fù)雜組合。例如，大多數(shù)洗滌產(chǎn)品 包括表面活性劑系統(tǒng)，用于洗滌的酶，漂白劑，助洗劑，抑泡劑，懸污劑，去污劑，熒光增白 劑，軟化劑，分散劑，抗染料轉(zhuǎn)移劑，摩擦劑，殺細菌劑和香料。當(dāng)前的清洗劑雖有復(fù)雜性，仍 有很多難于完全去除的污漬，這是由于污漬混合物的復(fù)雜性，尤其那些包括纖維材料的污 漬混合物，尤其是那些包含碳水化合物和/或碳水化合物衍生物，纖維，細胞壁成分(例如， 植物材料，木材，基于泥/粘土的污物，和水果)，和食品添加劑(例如，食物組織處理和穩(wěn)定 添加劑例如卡拉膠)的污漬混合物。因此，本領(lǐng)域依然需要有效除去這些纖維材料的清洗 組分。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了包含至少一種卡拉膠酶的清潔組合物，在宿主細胞中生產(chǎn)卡拉膠酶 的方法，包含編碼至少一種卡拉膠酶的重組多核苷酸的宿主細胞，和編碼卡拉膠酶的重組 多核苷酸。 本發(fā)明涉及編碼卡拉膠酶多肽的多核苷酸和已經(jīng)被基因操縱以產(chǎn)生卡拉膠酶的 宿主細胞。本發(fā)明尤其涉及具有引入其中的編碼至少一種卡拉膠酶的外源核酸序列的革蘭 氏陽性微生物，和在這樣的宿主細胞中生產(chǎn)卡拉膠酶蛋白的方法。在一些實施方式中，革蘭 氏陽性微生物是芽孢桿菌屬的成員。在一些實施方式中，本發(fā)明提供用芽孢桿菌宿主細胞 生產(chǎn)k-卡拉膠酶的方法和組合物。 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的包含編碼k -卡拉膠酶的序列的重 組多核苷酸，其中，分離的多核苷酸有效連接于編碼分泌信號肽的多核苷酸序列。在一些實 施方式中，編碼分泌信號肽的序列來自革蘭氏陽性微生物。在一些實施方式中，分泌信號肽 是SEQ ID N0:10的AprE信號肽。在一些實施方式中，編碼卡拉膠酶的序列包含一種序列， 這種序列優(yōu)化自編碼野生型卡拉膠酶(例如，獲自交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)的野 生型k-卡拉膠酶)的多核苷酸。在一些實施方式中，編碼卡拉膠酶的序列包含一種序列， 這種序列優(yōu)化自編碼獲自食鹿角菜交替單胞菌(Alteromonas carrageenovora)的野生型 卡拉膠酶的多核苷酸。在一些實施方式中，優(yōu)化的多核苷酸序列與SEQ ID N0:1或SEQ ID 冊3有至少約70%同一性。在其它的實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與SEQ ID N0:1或 SEQ ID NO :3有至少約75X同一性，或與SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3至少有至少約80%， 至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至少約98 % ，或至少約99 %同一性。
在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種表達載體，其含有包含編碼k-卡拉膠酶 的分離的重組多核苷酸的表達盒。編碼k-卡拉膠酶的分離的多核苷酸有效連接于編碼分
4泌信號肽的多核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼分泌信號肽的序列來自革蘭氏陽性微 生物。在一些實施方式中，分泌信號肽是SEQ ID N0:10的AprE信號肽。在一些實施方式 中，編碼卡拉膠酶的序列包含一種序列，這種序列優(yōu)化自編碼野生型卡拉膠酶(例如，獲自 交替單胞菌屬的野生型k-卡拉膠酶)的多核苷酸。在一些實施方式中，編碼卡拉膠酶的 序列包含一種序列，這種序列優(yōu)化自編碼獲自食鹿角菜交替單胞菌的野生型卡拉膠酶的多 核苷酸。在一些實施方式中，優(yōu)化的多核苷酸序列與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3有至少 約70%同一性。在其它的實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3 有至少約75%同一性，或與SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3有至少約80% ，至少約85% ，至 少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至少約98 % ，或至少約99 %同一性。在一些實施方式 中，表達載體含有具有選自SEQ IDNO :14和15的多核苷酸序列的表達盒。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的表達載體的宿主細胞。該表達載體含有包含編碼 k-卡拉膠酶的分離的重組多核苷酸的表達盒。編碼k-卡拉膠酶的分離的多核苷酸有效 連接于編碼分泌信號肽的多核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼分泌信號肽的序列來自 革蘭氏陽性微生物。在一些實施方式中，分泌信號肽是SEQ ID N0:10的AprE信號肽。在 一些實施方式中，編碼卡拉膠酶的序列包含一種序列，這種序列優(yōu)化自編碼野生型卡拉膠 酶(例如，獲自交替單胞菌屬的野生型k-卡拉膠酶)的多核苷酸。在一些實施方式中，編 碼卡拉膠酶的序列包含一種序列，這種序列優(yōu)化自編碼獲自食鹿角菜交替單胞菌的野生型 卡拉膠酶的多核苷酸。在一些實施方式中，優(yōu)化的多核苷酸序列與SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3有至少約70%同一性。在其它的實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與SEQ ID NO :1或 SEQ IDNO :3有至少約75X同一性，或與SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3有至少約80% ，至少 約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至少約98 % ，或至少約99 %同一性。在一 些實施方式中，表達載體含有具有選自SEQ IDNO :14和15的多核苷酸序列的表達盒。
在一些實施方式中，本發(fā)明提供了芽孢桿菌宿主細胞，其包含編碼含有信號序列 和卡拉膠酶蛋白的融合蛋白的重組多核苷酸，其中宿主細胞從細胞分泌卡拉膠酶蛋白且其 中宿主細胞具有失活的蛋白酶基因。在一些實施方式中，卡拉膠酶蛋白是k -卡拉膠酶。在 一些實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞分泌具有與SEQ ID NO :4有至少約70%同一性的氨基 酸序列的卡拉膠酶蛋白。在一些實施方式中，k-卡拉膠酶具有與SEQ ID N0:4有至少約 75 % ，至少約80 % ，至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，或至少約99 %的同一性。在一 些實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞具有至少一種選自nprE，即rE，印r， ispA， bpr， vpr， wprA， mpr-yb jF和nprB的失活蛋白酶基因。在其它的實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞具有至少 一種選自即rE，即rE，印r， ispA和/或bpr蛋白酶基因的失活蛋白酶基因。在又一些其它 的實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞具有至少一種選自nprE和即rE蛋白酶基因的失活蛋白 酶基因(參見，例如，美國專利5，387，521，其完整并入本文作為參考)。在其它的實施方式 中，宿主細胞包含由枯草芽孢桿菌的aprE基因編碼的信號序列。包含在宿主細胞內(nèi)的重組 多核苷酸在一些實施方式中有效連接于啟動子和終止子以形成表達盒。在一些其它實施方 式中，重組核酸存在于宿主細胞基因組內(nèi)，而在其它的實施方式中，其存在于在宿主細胞內(nèi) 自主復(fù)制的載體內(nèi)。在一些實施方式中，重組核酸是密碼子優(yōu)化的，用于在芽孢桿菌宿主細 胞中表達卡拉膠酶融合蛋白。 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物，包含大量上述芽孢桿菌宿主細胞，
5也提供了培養(yǎng)基。 一些實施方式中的細胞培養(yǎng)物包含k-卡拉膠酶蛋白。在一些實施方式
中，培養(yǎng)中的細胞包含k-卡拉膠酶蛋白。在其它的實施方式中，培養(yǎng)基包含k-卡拉膠酶 蛋白。在其它的實施方式中，培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基包含k-卡拉膠酶蛋白。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)k-卡拉膠酶蛋白的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)上述芽
孢桿菌宿主細胞，以提供表達的k _卡拉膠酶蛋白向用于培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞的培養(yǎng)基 中的分泌。在一些實施方式中，該方法可以進一步包括從所述培養(yǎng)基中回收k-卡拉膠酶 蛋白的步驟。使用任何適宜的回收方法都被考慮應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。用于根據(jù)本發(fā)明 的方法生產(chǎn)k -卡拉膠酶的芽孢桿菌宿主細胞，包含編碼含有信號序列和卡拉膠酶蛋白的 融合蛋白的重組多核苷酸，其中宿主細胞從細胞分泌k-卡拉膠酶蛋白且其中宿主細胞具 有失活的蛋白酶基因。在一些實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞分泌卡拉膠酶蛋白，其具有與
SEQ ID冊4有至少約70%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，k-卡拉膠酶具有 與SEQ ID NO :4至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%或至少約 99%的同一性。在一些實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞具有至少一種選自nprE，即rE，印r， ispA， bpr， vpr， wprA， mpr-ybjF和nprB的失活的蛋白酶基因。在其它實施方式中，芽孢桿 菌宿主細胞具有至少一種選自即rE，即rE，印r， ispA和/或bpr蛋白酶基因的失活蛋白酶 基因。在其它的實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞具有至少一種選自nprE和aprE蛋白酶基 因的失活蛋白酶基因(參見，例如，美國專利5，387，521，其完整并入本文作為參考)。在其 它的實施方式中，宿主細胞包含由枯草芽孢桿菌的aprE基因編碼的信號序列。包含在宿主 細胞內(nèi)的重組多核苷酸在有些實施方式中有效連接于啟動子和終止子以形成表達盒。在一 些其它實施方式中，重組核酸存在于宿主細胞基因組內(nèi)，而在其它的實施方式中，其存在于 宿主細胞內(nèi)自主復(fù)制的載體內(nèi)。在一些實施方式中，重組核酸是密碼子優(yōu)化的，用于在芽孢 桿菌宿主細胞中表達卡拉膠酶融合蛋白。 本發(fā)明也提供了包含卡拉膠酶活性的清潔組合物。在一些實施方式中，清潔組合 物包含有效量的分離的k -卡拉膠酶，其包含與SEQ ID NO :4中描述的k -卡拉膠酶有至 少約70%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，k -卡拉膠酶具有與SEQ ID NO :4有 至少約75 % ，至少約80 % ，至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 %和至少約99 %的同一性。 在一些實施方式中，清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方式中，這些洗滌劑清潔組合物進 一步包括至少一種其它酶(例如，蛋白酶，淀粉酶，甘露聚糖酶，過氧化物酶，氧化還原酶， 纖維素酶，脂肪酶，角質(zhì)酶，果膠酶，果膠裂解酶，木聚糖酶，和/或內(nèi)切糖苷酶)，酶衍生物， 以及助洗劑和穩(wěn)定劑。在一些實施方式中，另外的酶或酶衍生物選自半纖維素酶，過氧化物 酶，蛋白酶，纖維素酶，木聚糖酶，脂肪酶，磷脂酶，酯酶，角質(zhì)酶，果膠酶，角蛋白酶，還原酶， 氧化酶，氧化還原酶，酚氧化酶，脂加氧酶，木質(zhì)素酶，支鏈淀粉酶，鞣酸酶，戊聚糖酶，甘露 聚糖酶，P _葡聚糖酶，阿拉伯糖苷酶，透明質(zhì)酸酶，軟骨素酶，漆酶，和淀粉酶，或其混合物。
本發(fā)明也提供了洗滌方法，包括將硬表面和/或物品(例如，材料，如織物)與包 含卡拉膠酶活性的清潔組合物接觸。在一些實施方式中，清潔組合物包含有效量的分離的 k -卡拉膠酶，其包含與SEQ ID NO :4中描述的k -卡拉膠酶有至少約70%同一性的氨基 酸序列。在一些實施方式中，k-卡拉膠酶具有與SEQ ID冊4至少約75%，至少約80%， 至少約85%，至少約90%，至少約95%和至少約99%的同一性。在一些實施方式中，清潔 組合物是洗滌劑。在一些實施方式中，這些洗滌劑清潔組合物進一步包括至少一種其它酶(例如，蛋白酶，淀粉酶，甘露聚糖酶，過氧化物酶，氧化還原酶，纖維素酶，脂肪酶，角質(zhì)酶， 果膠酶，果膠裂解酶，木聚糖酶，和/或內(nèi)切糖苷酶)，酶衍生物，以及助洗劑和穩(wěn)定劑。在 一些實施方式中，另外的酶或酶衍生物選自半纖維素酶，過氧化物酶，蛋白酶，纖維素酶，木 聚糖酶，脂肪酶，磷脂酶，酯酶，角質(zhì)酶，果膠酶，角蛋白酶，還原酶，氧化酶，氧化還原酶，酚 氧化酶，脂加氧酶，木質(zhì)素酶，支鏈淀粉酶，鞣酸酶，戊聚糖酶，甘露聚糖酶，P _葡聚糖酶，阿 拉伯糖苷酶，透明質(zhì)酸酶，軟骨素酶，漆酶，和淀粉酶，或其混合物。在一些實施方式中，洗滌 方法進一步包括表面或物品接觸清潔組合物后漂洗該表面或物品的步驟。在一些備選實施 方式中，本文提供的任何適宜的組合物在該洗滌方法中得到應(yīng)用。在一些實施方式中，該表 面和/或物品包括被k-卡拉膠污染的織物。在其它的實施方式中，該織物被沙拉醬，沙茶 醬，和/或果醬污染。


圖l顯示了來自食鹿角菜交替單胞菌的野生型CgkA k-卡拉膠酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO :6) (Potin等，Eur. J. Biochem. 228 :971-5 (1995))。固有的信號序列被加下劃 線；成熟編碼區(qū)為粗體；C-末端前序列為斜體。 圖2顯示了編碼k-卡拉膠酶成熟部分和前體區(qū)的合成的密碼子優(yōu)化的基因的多 核苷酸序列(SEQ ID N0:7)，當(dāng)克隆入DNA2.0載體，產(chǎn)生載體pJ31-7585。 k -卡拉膠酶的 成熟和前體部分以粗體顯示；成熟部分也被加下劃線。編碼AprE信號序列的末端的DNA序 列(GCGCGCAGGCA ;SEQ ID NO :8)和終止序列(TAAAAGCTT ;SEQ IDN0 :9)以斜體顯示。
圖3顯示了包含編碼k _卡拉膠酶的密碼子優(yōu)化的多核苷酸的p2JM-cgkA整合載 體圖。 圖4顯示了柱形圖，其描述三種類型洗滌劑中k _卡拉膠酶對三種類型卡拉膠的 水解活性。圖4A-C顯示了柱形圖，分別描述AATCC HDL洗滌劑中k-卡拉膠酶對k-(類型 I) ， i _(類型II)，和k (類型III)卡拉膠的水解活性。圖4D和4E分別描述HDD和ADW 洗滌劑中k -卡拉膠酶對k -卡拉膠(類型I)的活性。 圖5A和5B顯示了柱形圖，分別描述AATCC HDL洗滌劑中k -卡拉膠酶對沙拉醬
和沙茶醬污漬的活性。利用實施例3中描述的小樣品方法確定去除污物的活性。 圖6顯示了柱狀圖，描述AATCC HDL洗滌劑中k -卡拉膠酶對番茄汁，tikka，草，
果醬，蕃茄醬，芥末醬，沙茶醬和巧克力大豆污漬的活性。利用實施例4中描述的震蕩式滌
垢儀方法確定去除污物的活性。 發(fā)明描述 本發(fā)明提供了包含至少一種卡拉膠酶的清潔組合物，在宿主細胞中生產(chǎn)卡拉膠酶 的方法，包含編碼至少一種卡拉膠酶的重組多核苷酸的宿主細胞，和編碼卡拉膠酶的重組 多核苷酸。
定義 除非本文另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與該發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。各種包括本文包含的術(shù)語的科學(xué)詞典對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員是公知的和可獲得的。盡管與本文描述相似或等同的任何方法和材料可用于實施或 測試本發(fā)明，但是描述這些方法和材料。相應(yīng)地，下面隨即定義的術(shù)語通過參考說明書作為
7一個整體而被更充分地描述。另外，本文使用的單數(shù)詞"a"， "an"和"the"包括復(fù)數(shù)指代， 除非文中另有清楚指示。除非另有指明，核苷酸和氨基酸序列分別以5'到3'方向和氨基 到羧基方向從左向右書寫?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明并不限于描述的特定方法，方案和試劑， 因為這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用它們的環(huán)境而變化。 本文提到的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有序列，通過 引用的方式明確地并入，其引用程度如同將每個獨立出版物或?qū)＠暾埫鞔_地且分別地以 引用的方式并入。所有引用的文獻，在相關(guān)部分，通過引用并入本文。任何文獻的引用并不 能理解為承認其是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。 數(shù)值范圍包含定義該范圍的數(shù)字。本說明書各處給出的每個數(shù)值上限意味包括每 個低于此限的數(shù)值，如同這些低于此限的數(shù)值明確地記載在本文中。本說明書各處給出的 每個數(shù)值下限包括每個高于此限的數(shù)值，如同這些高于此限的數(shù)值明確記載在本文中。本 說明書各處給出的數(shù)值范圍包括落在此較寬數(shù)值范圍內(nèi)每個較窄數(shù)值范圍，如同這些較窄 數(shù)值范圍全部明確記載在本文中。 本文提供的標題并不是對本發(fā)明各方面或?qū)嵤┓绞降南拗?，可以通過參考說明書 將其做為一個整體。相應(yīng)地，如上所述，下面隨即定義的術(shù)語通過參考說明書作為一個整體 而被更充分地定義。 術(shù)語"啟動子"在本文定義為指導(dǎo)下游多核苷酸在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的一種核酸。在某 些情況下，多核苷酸包含一個編碼序列且啟動子指導(dǎo)該編碼序列轉(zhuǎn)錄為可翻譯的RNA。術(shù) 語"aprE啟動子"在本文指的是在枯草芽孢桿菌中天然驅(qū)動枯草桿菌蛋白酶表達的多核苷 酸啟動子序列(Ferrari等，JBacteriol. 170 :289-295[1988])。 術(shù)語"編碼序列"在本文定義為一種核酸，當(dāng)其置于合適的控制序列，包括啟動子 的控制下時，被轉(zhuǎn)錄為能夠翻譯成多肽的mRNA。在一些實施方式中，編碼序列包含單個可讀 框，而在其它的實施方式中，編碼序列包含幾個由例如內(nèi)含子分開的可讀框。編碼序列可以 是，例如，cDNA，基因組DNA，合成的DNA或重組DNA。編碼序列通常從起始密碼子(如，ATG) 開始，于終止密碼子(如，UAA， UAG和UGA)結(jié)束。 術(shù)語"重組"指不是在宿主細胞內(nèi)自然發(fā)生的多核苷酸或多肽。在一些實施方式 中，重組分子包含以非自然發(fā)生的方式連接在一起的兩個或更多的自然發(fā)生序列。在一些 實例中，重組多核苷酸包含自然發(fā)生的序列和合成的序列。 在本文中所使用的術(shù)語"卡拉膠酶"和"卡拉膠酶蛋白"指的是糖基水解酶家族 16(GH16)的絲氨酸糖苷水解酶。依照IUMBM酶命名法，卡拉膠酶蛋白具有如EC3. 2. 1. 83 描述的活性。示例的卡拉膠酶蛋白的活性在Michel等，Appl Microbiol Biotechnol 71:23-33(2006)中一般性描述。在一些實施方式中，本發(fā)明的卡拉膠酶是k -卡拉膠酶 ("k-卡拉膠酶"或"CgkA")。 除非另有指明，卡拉膠酶蛋白內(nèi)所有的氨基酸位置與SEQ ID N0:2中闡明的氨 基酸序列對應(yīng)。在一些實施方式中，通過在默認條件下，使用可獲自美國國立生物技術(shù) 信息中心(NCBI)萬維網(wǎng)的BLASTP程序(參見，例如，Altschul， Nucl. Acids Res. ，25 : 3389-3402[1997];和Schaffer， Bioinformatics 15 :1000-1011 [1999])，比對卡拉膠酶蛋 白和SEQ ID N0:2，而進行卡拉膠酶蛋白的比較。在一些實施方式中，通過使用BLASTP程 序比對卡拉膠酶蛋白和SEQ ID N0:4來進行卡拉膠酶蛋白的比較。SEQ IDN0:1編碼未加
8工的成熟形式的卡拉膠酶，其包含成熟部分和前體部分(SEQ ID NO :2) ;SEQ ID N0:3編碼 成熟的有活性形式的卡拉膠酶(SEQID NO :4)。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的是成熟的有活性 形式，且其包括在本發(fā)明的清潔組合物中。"全長"的卡拉膠酶包含分泌信號肽，成熟部分和 c-末端前體部分。"自然發(fā)生"或"野生型"指卡拉膠酶蛋白或編碼卡拉膠酶蛋白的多核苷酸，所述卡 拉膠酶蛋白具有與自然界發(fā)現(xiàn)的相同的未修飾的氨基酸序列。自然發(fā)生的酶包括天然酶， 例如那些在特定微生物中天然表達或被發(fā)現(xiàn)的酶。野生型或自然發(fā)生的序列是指這樣的序 列，變異的或合成的序列衍生自該序列。野生型序列可以編碼或者同源或者異源的蛋白。
在本文中所使用的"合成的"是指通過體外化學(xué)或酶促合成生產(chǎn)的分子。其包括， 但不限于，應(yīng)用宿主生物，例如，但不限于芽孢桿菌的優(yōu)化密碼子選擇制備的卡拉膠酶變體 核酸。 術(shù)語"信號序列"，"信號肽"和"分泌的信號肽"指可以參與蛋白成熟或前體形式 的分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信號序列的該種定義是功能性定義，意味著包括 所有由該蛋白基因N-末端部分編碼的所有那些氨基酸序列，其參與該蛋白質(zhì)分泌的完成。
術(shù)語"前體序列"和"前體區(qū)"指位于卡拉膠酶成熟形式的C-末端的氨基酸序列， 其對于卡拉膠酶的分泌/生產(chǎn)是必需的。前體序列的切割產(chǎn)生成熟的有活性的卡拉膠酶。 舉例說明，本發(fā)明的卡拉膠酶的前體區(qū)包括與SEQ ID NO :2從氨基酸277到氨基酸372的 N-末端殘基相同的氨基酸序列(即，
AKNKGTATITVKTKNKGKIDKLTIAVN ;SEQ ID NO :5)。 術(shù)語"成熟形式"，"成熟的有活性形式"和"成熟區(qū)"是指蛋白質(zhì)最終的功能部分。 舉例說明，本發(fā)明的卡拉膠酶的成熟形式至少包括與SEQ IDNO :2和SEQ ID NO :4的1-277 殘基相同的氨基酸序列。就此而論，"成熟形式"是全長卡拉膠酶的"加工形式"，其中全長 卡拉膠酶的加工包括去除信號肽和去除前體區(qū)。"成熟形式"也是從"未加工成熟形式"被 加工，其中未加工成熟形式的加工包括去除前體區(qū)。 在本文中所使用的"表達載體"指的是DNA構(gòu)建體，其包含有效連接于能夠在合適 宿主內(nèi)實現(xiàn)DNA表達的合適控制序列的DNA序列。這樣的控制序列包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子， 控制該轉(zhuǎn)錄的任選的操縱基因序列，編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄 和翻譯終止的序列。所述載體可以是質(zhì)粒，噬菌體顆粒，或者僅是可能的基因組插入序列。 一旦轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，該載體可以不依賴宿主基因組而復(fù)制和起作用，或者可以，在一 些情況下，整合到基因組自身。由于質(zhì)粒是目前載體最普通的應(yīng)用形式，在本說明書中，"質(zhì) 粒"，"表達質(zhì)粒"和"載體"經(jīng)?？苫Q使用。但是，本發(fā)明意欲包括那些發(fā)揮同樣的功能的 其它形式的表達載體，其在本領(lǐng)域是已知的或正變?yōu)橐阎摹?載體"包括克隆載體，表達載 體，穿梭載體，質(zhì)粒，噬菌體或病毒顆粒，DNA構(gòu)建體，表達盒等等。表達載體可以包括調(diào)節(jié) 序列，例如啟動子，信號序列，編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子。 術(shù)語"有效連接"是指元件的排列，其允許元件被功能性關(guān)聯(lián)。例如，啟動子有效 連接于編碼序列，如果其控制該序列的轉(zhuǎn)錄，信號序列有效連接于蛋白，如果該信號序列指 導(dǎo)該蛋白通過宿主細胞的分泌系統(tǒng)。 術(shù)語"啟動子/增強子"表示DNA區(qū)段，其包含能夠提供啟動子和增強子兩種功能的序列(例如，包含啟動子和增強子兩種功能的逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù))。增強子/啟動 子可以是"內(nèi)源的"或"外源的"(或"異源的")。內(nèi)源的增強子/啟動子是與基因組中給 定的基因天然連接的增強子/啟動子。外源的(異源的)增強子/啟動子是通過基因操作 手段(即，分子生物學(xué)技術(shù))與基因并列放置。 術(shù)語"核酸"包括單鏈的或雙鏈的DNA， RNA，和其修飾形式。術(shù)語"核酸"和"多核 苷酸"在本文中可以互換使用。 本文中應(yīng)用的術(shù)語"DNA構(gòu)建體"表示包含至少兩個DNA多核苷酸片段的核酸序 列。 在本文中應(yīng)用的術(shù)語"表達盒"是指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，具有允許特定 的核酸在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定的核酸元件。重組表達盒可以被整合入質(zhì)粒，染色體， 線粒體DNA，質(zhì)體DNA，病毒或核酸片段。通常，除了其它的序列，表達載體的重組表達盒部 分包括被轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子。 涉及卡拉膠酶的術(shù)語"生產(chǎn)"，包括全長卡拉膠酶的兩個加工步驟，包括去除信號 肽，已知其發(fā)生于蛋白分泌期間；去除前體區(qū)，其產(chǎn)生該酶有活性的成熟形式，已知其發(fā)生 于成熟過程中(Wang等，Biochemistry, 37 :3165-3171 [1998] ;Power等，Proc Natl Acad Sci USA83 :3096-3100[1986])。在一些實施方式中，表達的蛋白被限制在表達其的細胞的 細胞內(nèi)環(huán)境，而在其它的實施方式中，表達的蛋白被分泌到細胞外環(huán)境。這樣，在一些實施 方式中，目標蛋白的生產(chǎn)包括蛋白表達和其分泌到細胞外基質(zhì)的細胞過程。
本文中應(yīng)用的"多肽"和"蛋白"可互換使用，包括涉及任意數(shù)目的氨基酸殘基的 聚合物。上述術(shù)語應(yīng)用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)自然發(fā)生氨基酸的人工化學(xué)類 似物的氨基酸聚合體；也應(yīng)用于自然發(fā)生的氨基酸聚合體。上述術(shù)語也應(yīng)用于包含使得多 肽保持功能性的保守氨基酸替換的聚合體。"肽"是具有少于50個氨基酸殘基的多肽。
"宿主細胞"是這樣的細胞，其在其基因組中包含重組核酸(即，重組核酸是整合 體)和/或在染色體外載體中包含重組核酸，所述載體脫離宿主細胞基因組自主復(fù)制。任 何合適的細胞類型在本發(fā)明中用做宿主細胞。本文中應(yīng)用的"宿主細胞"通常是原核的或 真核的宿主，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體。轉(zhuǎn)化的宿主細 胞能夠復(fù)制編碼蛋白變體的載體或者表達期望的蛋白變體。至于編碼蛋白變體的前體或前 蛋白原形式的載體，這樣的變體，被表達時，通常從宿主細胞被分泌到培養(yǎng)基中。
"轉(zhuǎn)化"表示引入DNA到細胞內(nèi)，使得DNA或者做為染色體外元件或者是染色體整 合體存在于細胞內(nèi)。在插入核酸序列到細胞內(nèi)的情況下，術(shù)語"引入"包括包含轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo) 或轉(zhuǎn)染的方法。轉(zhuǎn)化方法包括，但不限于，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，氯化鈣沉淀，電穿孔，裸DNA和本 領(lǐng)域已知的類似方法(參見，Chang和Cohen，Mol. Gen. Genet. ，168 :111_115[1979] ;Smith 等，Appl.Env. Microbiol. ，51 :634[1986]，禾口 Ferrari等的綜述文章，Harwood， Bacillus, Plenum Publishing Corporation, pp57_72[1989])。"失活基因"是在失活前可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因組座位(即，能夠被轉(zhuǎn)錄為可以翻 譯產(chǎn)生全長的有催化活性多肽的RNA)。當(dāng)其沒有轉(zhuǎn)錄和翻譯為全長的有催化活性的蛋白 時，基因被失活。基因可以通過改變其轉(zhuǎn)錄需要的序列，改變RNA加工需要的序列(例如， 多聚A尾巴的添加)，和/或通過改變翻譯需要的序列進行失活。缺失的基因，包含缺失區(qū) 的基因，包含重排區(qū)的基因，具有失活點突變或移碼的基因，和包含插入的基因是失活基因
10的類型?；蛞部梢允褂梅戳x，RNA干擾或任何其它消除該基因表達的方法進行失活。
本文應(yīng)用的術(shù)語"回收的"，"分離的"，"分開的"指的是從至少一種其天然結(jié)合的 組分中移除的蛋白質(zhì)，細胞，核酸或氨基酸。 本文中使用的"培養(yǎng)"指在合適的條件下，在液體，固體或半固體培養(yǎng)基中使微生 物細胞群生長。在一些實施方式中，"培養(yǎng)"指發(fā)酵重組生產(chǎn)目標外源蛋白和/或其它期望 的終產(chǎn)物。有代表性地，發(fā)酵發(fā)生于容器或反應(yīng)器中。 本文中術(shù)語"卡拉膠"指來自紅藻(紅藻科)細胞壁的1，3-a-l，4-l3半乳聚糖， 每個二糖單體中由一個(K-)，兩個G -)，或三個(A-卡拉膠)硫酸基取代。
除非另有指明，本文中應(yīng)用的"清潔組合物"和"清潔制劑"指的是應(yīng)用于從待洗物 品，例如紡織品，盤子，隱形眼鏡，其它固體基材，頭發(fā)(洗發(fā)劑)，皮膚(肥皂和乳膏)，牙齒 (漱口液，牙膏)等中清除不不想要的化合物的組合物。所述術(shù)語包括為期望的清潔組合物 的特定類型和產(chǎn)品形式(例如，液體，凝膠，顆粒，或噴涂組合物)而挑選的任何材料/組合 物，只要該組合物與組合物中使用的卡拉膠酶和其它酶相容。通過考慮要清洗的表面，物品 或紡織品，和使用中的清洗條件所需要的組合物形式，容易地進行清潔組合物材料的具體 選擇。這些術(shù)語進一步指適于清洗，漂白，消毒，和/或滅菌任何物品和/或表面的任何組 合物。上述術(shù)語旨在包括，但不限于清潔組合物(例如，液體和/或固體洗衣洗滌劑和精細 織物洗滌劑；硬表面清洗制劑，例如玻璃，木材，陶瓷和金屬洗面臺和窗戶；地毯清潔劑，烤 箱清潔劑；織品清香劑；織品柔軟劑；和紡織品和待洗衣物污漬清潔劑，以及餐具洗滌劑)。
事實上，本文應(yīng)用的術(shù)語"清潔組合物"，除非另有說明，包括，顆粒的或粉末形式 的多用途或重負荷洗滌劑，尤其洗衣洗滌劑。液體，凝膠或糊劑形式的多用途洗滌劑，尤其 所謂的重負荷液體(HDL)類型；液體精細織物洗滌劑；手用洗碗劑或輕型洗碗劑，尤其那 些高發(fā)泡類型；機用洗碗劑，包括供家庭和機構(gòu)使用的各種片劑，粒狀的，液體的和沖洗輔 助類型。液體洗滌和消毒劑，包括抗菌洗手類型，清潔條，漱口液，義齒清潔劑，汽車或地毯 香波，浴室清潔劑，洗發(fā)水和染發(fā)液；沐浴露和泡沫沐浴露和金屬清潔劑；以及清洗助劑例 如，漂白添加劑和"去污棒"或預(yù)處理類型。 本文中應(yīng)用的術(shù)語"洗滌組合物"和"洗滌制劑"是用于指混合物，其被打算用于洗 滌弄臟物品的清洗基質(zhì)中。在一些實施方式中，上述術(shù)語用于指洗滌織物和/或衣服(例 如，"洗衣洗滌劑")。在備選實施方式中，上述術(shù)語指其它的洗滌劑，例如用于洗滌碟盤，刀 叉等的洗滌劑(例如，"餐具洗滌劑")。本發(fā)明不打算限定于任何特定的清洗制劑或組合 物。事實上，除了卡拉膠酶之外，所述術(shù)語旨在包括包含表面活性劑，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，氧化 還原酶，助洗劑，漂白齊U，漂白活化劑，染藍劑和熒光染料，結(jié)塊抑制劑，遮蔽劑，酶活化劑， 抗氧化劑，和增溶劑的洗滌劑。 本文使用的術(shù)語"表面清潔組合物"，指的是用于洗滌硬表面，例如地板，墻壁，瓷 磚，浴室和廚房固定裝置等等的清洗組合物。這樣的組合物以任意形式提供，包括但不限于 固體，液體，乳劑等。 本文中應(yīng)用的"餐具清潔組合物"指的是所有形式的洗滌餐具的組合物，包括但不 限于顆粒的和液體形式。 本文中應(yīng)用的"織物清潔組合物"指的是用于洗滌織物的所有形式的清洗組合物， 包括但不限于顆粒，液體和條塊形式。
本文中應(yīng)用的"織物"包括任何紡織品材料。這樣，該術(shù)語旨在包括衣服，以及布 料，紗，纖維，無紡布材料，天然材料，合成材料和任何其它紡織品材料。 本文中應(yīng)用的"紡織品"指的是適于轉(zhuǎn)化為或用做紗，機織布，針織物，和無紡布的 機織布料，以及切段纖維和絲線。該術(shù)語包括由天然以及合成(例如，制造的)纖維制造的 紗。 本文中使用的"紡織材料"是對纖維，紗紡半制品，細紗，織物和由織物制成的產(chǎn)品 (例如，衣服和其它物品)的泛稱。 本文中使用的"有效量的酶"指的是在特定應(yīng)用(例如，個人護理產(chǎn)品，清潔組合 物等)中達到要求的酶活性所必需的酶量。這樣的有效量由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易 的確定，并且基于很多的因素，例如使用的特定的酶變體，洗滌用途，清潔組合物的具體成 分，和是否要求是液體或干燥(例如，顆粒的，條狀的)的組合物，諸如此類。
本文中應(yīng)用的術(shù)語"純化的"和"分離的"指的是從樣本中去除雜質(zhì)。例如，卡拉膠 酶通過去除雜質(zhì)蛋白和溶液或制劑中不是卡拉膠酶的其它化合物而被純化。在一些實施方 式中，重組的卡拉膠酶在細菌或真菌宿主細胞內(nèi)表達，并且這些重組的卡拉膠酶通過去除 其它宿主細胞組分被純化；樣品中重組卡拉膠酶多肽的百分比由此增加。在一些特定實施 方式中，本發(fā)明的卡拉膠酶被大幅度純化到至少約99%水平的該蛋白成分，通過SDS-PAGE 或本領(lǐng)域已知的其它標準方法確定。在一些備選實施方式中，本發(fā)明的卡拉膠酶包含該組 合物的至少約99%的卡拉膠酶組分。在又一些備選實施方式中，卡拉膠酶以總蛋白和/或 卡拉膠酶組分約至少90_95%的范圍存在。 如本文中所用，功能上和/或結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì)被認為是"相關(guān)蛋白"。在一些 實施方式中，這些蛋白衍生自不同屬和/或種，包括生物類群之間的差別(例如，細菌蛋白 和真菌蛋白)。在一些實施方式中，這些蛋白衍生自不同屬和/或物，包括生物類群之間的 差別(例如，細菌酶和真菌酶)。在另外的實施方式中，相關(guān)蛋白由相同的物種提供。事實 上，本發(fā)明不打算被限定于來自任何特定來源的相關(guān)蛋白。另外，術(shù)語"相關(guān)蛋白"包括三 級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如，本發(fā)明的卡拉膠酶)。另外，術(shù)語"相關(guān)蛋白"包括 三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如，本發(fā)明的卡拉膠酶)。例如，本發(fā)明涉及這樣的 同源物，其包括但不限于這樣的酶，如Zobellia galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌和紫色球 海膽，禾口 Alginomonas terrestralginica的卡拉膠酶。 相關(guān)的(和衍生的)蛋白包含"變體蛋白"。在一些實施方式中，變體蛋白與親本 蛋白以及變體蛋白相互之間在少量的氨基酸殘基上不同。不同的氨基酸殘基的數(shù)量可以 為1，2，3，4，5，10，15，20，30，40，50，或更多的氨基酸殘基。在一些實施方式中，變體間不同 氨基酸的數(shù)量在l和IO之間。在一些實施方式中，相關(guān)蛋白和特定的變體蛋白包含至少 70 % ，至少約75 % ，至少約80 % ，至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至少 約98%或至少約99%的氨基酸序列同一性。 在本發(fā)明的一些實施方式中，卡拉膠酶基因被連接到合適的表達質(zhì)粒中?？寺〉?卡拉膠酶基因于是用于在一定條件下轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，從而卡拉膠酶基因被表達。該 質(zhì)?？梢栽谒拗髦袕?fù)制，因為其包含質(zhì)粒復(fù)制必需的公知的元件，或者該質(zhì)粒可以被設(shè)計 成整合到宿主染色體中。必需的元件被提供用于有效的基因表達(例如，有效連接于目的 基因的啟動子)。在一些實施方式中，如果被識別，這些必需元件被提供用作該基因自己的同源啟動子(即，由宿主轉(zhuǎn)錄)，外源的或由卡拉膠酶基因的內(nèi)源終止子區(qū)提供的轉(zhuǎn)錄終止 子(例如，真核宿主細胞的多聚腺苷酸化區(qū)域)。在一些實施方式中，也包括了選擇基因，例 如抗微生物抗性基因，其能夠通過在包含抗微生物的培養(yǎng)基中生長而連續(xù)培養(yǎng)保持質(zhì)粒感 染的宿主細胞。 術(shù)語"編碼...的核酸分子"，"編碼...的核酸序列"，"編碼...的DNA序列"，"編 碼...的DNA"和"編碼...的多核苷酸"指的是沿脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順 序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序確定了沿多肽(蛋白質(zhì))鏈的氨基酸順序。這樣， DNA序列編碼氨基酸序列。 本文中應(yīng)用的"同源蛋白"指的是具有相似作用和/或結(jié)構(gòu)的蛋白(例如，卡拉膠 酶)，如K-卡拉膠酶(例如，來自其它來源的卡拉膠酶)。同源不是意味必須在進化上相 關(guān)聯(lián)。這樣，該術(shù)語旨在公開獲自不同物種的相同或相似酶(即，在結(jié)構(gòu)和功能方面)。在 一些實施方式中，鑒定具有與目的蛋白相似的四級，三級和/或一級結(jié)構(gòu)的同源物是合乎 需要的。 本文中應(yīng)用的"同源基因"指的是來自不同物種的至少一對基因，這些基因互相對 應(yīng)并且相互同一或非常相似。該術(shù)語包括由物種形成(即，新物種發(fā)展)分開的基因(例 如，直向同源基因)，以及由基因復(fù)制分開的基因(例如，旁系同源基因)。這些基因編碼 "同源蛋白"。 本文中應(yīng)用的"直向同源物"和"直向同源基因"指的是通過物種形成從一個共同 的祖先基因進化而來的不同物種中的基因(即，同源基因)。有代表性地，直向同源物在進 化過程中保持相同的功能。直向同源物鑒定在新近測序的基因組中可靠預(yù)測基因功能上得 到應(yīng)用。 本文中應(yīng)用的"旁系同源物"和"旁系同源基因"指基因組內(nèi)通過復(fù)制相關(guān)的基因。 盡管直向同源物在進化過程中保留相同的功能，但是旁系同源物進化新功能，盡管一些功 能通常與最初一個基因相關(guān)。旁系同源基因的實例包括，但不限于編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋 白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，其都是絲氨酸蛋白酶并且在同一物種中一起發(fā)生。
序列間的同源性程度可以使用本領(lǐng)域已知的任何適宜的方法確定(參見，例如， Smith禾口 Waterman, Adv. Appl. Math. ，2 :482[1981] ;Needleman禾口 Wimsch， J.Mol. Bio.， 48 :433 [1970] ;Pearson禾口 Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444 [1988] ;Wisconsin Genetics軟件包中的程序，例如GAP, BESTFIT， FASTA禾P TFASTA (Genetics Computer Group, Madison， WI);和Devereux等，Nucl. Acid Res. ，12 :387-395 [1984])。
例如，PILEUP是確定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用漸進的，兩兩比對 產(chǎn)生來自一組相關(guān)序列的多序列比對。其也能夠繪制用于產(chǎn)生序列比對的顯示聚類關(guān)系的 進化樹。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進比對方法的簡化方法(Feng和Doolittle， J.Mol.Evol. ，35 :351-360[1987])。該方法與Higgins和Sharp描述的方法(Higgins和 Sharp, CABI0S 5 :151-153[1989])相似。有用的PILEUP參數(shù)包括默認的空位權(quán)重3. 00， 默認空位長度權(quán)重O. IO，和加權(quán)的末端空位。另一個有用的算法的例子是BLAST程序，由 Altschul等描述(Altschul等，J. Mol. Biol. ，215 :403-410[1990];和Karlin等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787 [1993])。 一個尤其有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程 序(參見，Altschul等，Meth. Enzymol. 266 :460-480 [1996])。參數(shù)"W"，"T"，禾口"X"決定比
13對的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認字長(W)11，BL0SUM62評分矩陣(參見，Henikoff 和Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915 [1989])比對(B)50，期望值(E)10，M'5， N' -4，和雙鏈比較做為默認值。 本文中應(yīng)用的"核酸序列同一性百分比"被定義為候選序列中與所述序列的核苷 酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。相似地，本文中"氨基酸序列同一性百分比"指的是候 選序列與所述序列氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。
卡拉膠和卡拉膠酶 卡拉膠代表食品工業(yè)中一種重要的增稠劑成分?？ɡz是通過從特定種類的海 洋紅藻(紅藻門)提取獲得的線狀的硫酸化半乳聚糖家族的通用名稱。其由通過交替 a (1 — 3)和13 (1 — 4)鍵連接的D-半乳糖殘基構(gòu)成。根據(jù)在a (1 — 4)-連接的半乳糖殘基 中的3，6-脫水橋的存在和硫酸取代基的位置，其被稱之為k ， t ，和A-卡拉膠(Kloareg 和Quatrano， Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. ， 26， 259—315 [1988])。除了這三種主要的卡 拉膠類型之外，兩種其它類型，稱為P-和v-卡拉膠，經(jīng)常在商品化的卡拉膠樣品中出 現(xiàn)，并分別是k-和t -卡拉膠的生物前體(Van de Velde等，Carbohydrate Res. 339 : 2309-2313[2004])。 卡拉膠的三種主要形式經(jīng)常被列在不同的加工食品，化妝品，和醫(yī)藥產(chǎn)品的成分 中。k-， t -，和A-卡拉膠或者單獨地，互相聯(lián)合，或者與其它類型的食用纖維聯(lián)合而被
應(yīng)用。卡拉膠用于乳制品，例如冰淇淋，酸奶，調(diào)味乳，植脂鮮奶油，布丁，奶酪和酸奶油。在 這些產(chǎn)品中，卡拉膠可以被用于控制融化，增稠，穩(wěn)定脂肪和蛋白，穩(wěn)定懸浮液和乳劑，凝膠 化，增稠，防止乳清分離和控制脫水收縮。在加工的家禽肉，火腿和紅肉產(chǎn)品中，卡拉膠通過 吸收肉中的水分增加產(chǎn)量。卡拉膠也已經(jīng)被用于開發(fā)基于卡拉膠的脂肪替代品。其它食品 工業(yè)應(yīng)用包括果汁中改進質(zhì)地功能，用于延展糖衣，果醬，果凍，沙拉醬，糖果，和做為用于 新鮮果汁加工控制的褐變抑制劑。 大多數(shù)食物產(chǎn)品包含k _卡拉膠，或者單獨地或者與其它類型的卡拉膠聯(lián)合(參 見，例如，Shah，和Huffman, Ecol. Food Nutrition42 :357-371 [2003])。
產(chǎn)生能夠水解t -禾P k -卡拉膠的酶的微生物已經(jīng)被分離(參見，例如，Bellion 等，Can. J.Microbiol. ，28 :874—80 [1982];禾P Yaphe禾P Baxter, Appl. Microbiol 3 : 380-383[1955])。交替假單胞菌菌株(也被稱為食鹿角菜交替單胞菌)被證明具有k-和 入-卡拉膠酶活性。另一組能夠分解卡拉膠的細菌已經(jīng)被表征(參見，例如，Sarwar等， J. Gen. Appl. Microbiol. ，29 :145-55 [1983])。這些橙色細菌被確定為噬纖維菌組的細菌， 并且這些細菌中的一部分具有水解瓊脂和卡拉膠兩者的特性。 已經(jīng)被克隆的編碼k-卡拉膠酶的基因包括來自交替假單胞菌的k卡拉膠酶基 因cgkA(Barbey皿等，Genel39 :105-109 [1994])禾口 Cytophagadrobachiensis的cgkA基 因(Barbeyron等，Mol. Biol， Evol. 15 :528-537 [1998])。 已經(jīng)描述過幾種k -卡拉膠酶，例如Cytophaga drobachiensis的k -卡拉膠酶 (Barbeyron等，Mol. Biol， Evol.在前)，食鹿角菜交替單胞菌的k-卡拉膠酶，來自zobelia galactcinovorans，環(huán)狀芽孢桿菌和紫色球海膽的k -卡拉膠酶的純化和表征(參見，例 如，Strohmeier等，ProteinSci. ，13 :3200-3213 [2004])，并且能夠獲得食鹿角菜交替單胞 菌的k —卡拉膠酶的詳細研究(參見，Potin等，Eur. J. Biochem. ， 228， 971-975 [1995])。
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本發(fā)明提供了一種分離的重組多核苷酸，其包含編碼K-卡拉膠酶的序列，該序 列有效連接于編碼分泌信號肽的異源序列。在一些實施方式中，編碼的K-卡拉膠酶屬于 糖基水解酶家族16(GH16)。在一些實施方式中，編碼K-卡拉膠酶成熟形式的序列是野生 型序列，例如來自海洋細菌種類的序列(例如，交替單胞菌種類)。在一些實施方式中，該 序列是食鹿角菜交替單胞菌的卡拉膠酶的野生型序列。在本發(fā)明中應(yīng)用的其它卡拉膠酶 序列包括，但不限于編碼來自zobellia galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌，紫色球海膽和 Cytophaga drobachiensis的卡拉膠酶的那些序列。本發(fā)明也涉及多核苷酸序列，或野生型 的或合成的，其衍生自與食鹿角菜交替單胞菌，Z. galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌和紫色 球海膽和Cytophagadrobachiensis的基因同源的基因。這樣，本發(fā)明涉及卡拉膠酶，其由 與食鹿角菜交替單胞菌的K-卡拉膠酶基因同源的基因編碼。如上所述，"同源基因"是互 相對應(yīng)和相互同一或非常相似的基因，但獲自不同的物種。該術(shù)語包括由物種形成(即，發(fā) 展新物種)分離的基因(例如，直向同源基因)，以及由基因復(fù)制分離的基因(例如，旁系同 源基因)。同源基因編碼同源蛋白。 本發(fā)明也包括多核苷酸，其編碼由結(jié)構(gòu)和/或功能相似而相關(guān)的卡拉膠酶蛋白。 在一些實施方式中，這些蛋白衍生自不同的屬和/或物種，包括生物類群之間的差別(例 如，細菌蛋白和真菌蛋白)。在一些實施方式中，這些蛋白衍生自不同的屬和/或物種。在 另外的實施方式中，相關(guān)蛋白提供自相同的物種。事實上，本發(fā)明不打算限定于來自任何 特定來源的相關(guān)蛋白。另外，術(shù)語"相關(guān)蛋白"公開三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例 如，本發(fā)明的卡拉膠酶)。例如，本發(fā)明涉及這樣的同源物，其包括但不限于這樣的酶，如 Z. galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌，紫色球海膽，禾口 Cytophaga drobachiensis的卡拉膠 酶。 如上所述，相關(guān)的(和衍生的)蛋白包含"變體蛋白"。在一些實施方式中，變體 蛋白與親本蛋白以及彼此在少量的氨基酸殘基上不同。差異氨基酸殘基的數(shù)量可以為1， 2， 3， 4， 5， 10， 15， 20， 30， 40， 50，或更多的氨基酸殘基。在一些實施方式中，變體間差異氨基 酸的數(shù)量在l和10之間。在一些特定實施方式中，相關(guān)蛋白和特定的變體蛋白包含至少約 70 % ，至少約75 % ，至少約80 % ，至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至少 約98%或至少約99%的氨基酸序列同一性。依照IUMBM酶命名法，某些目的卡拉膠酶具有 如EC3. 2. 1. 83描述的活性。本領(lǐng)域已知的適于產(chǎn)生本發(fā)明的酶的變體的幾種方法，包括但 不限于位點飽和誘變，掃描誘變，插入誘變，隨機誘變，定點誘變，和定向進化，以及各種其 它的重組方法。 野生型和突變蛋白的表征通過任何適合的方法并基于評價感興趣的性質(zhì)而完成。 例如，ra和/或溫度，以及洗滌劑和/或氧化穩(wěn)定性在本發(fā)明的一些實施方式中確定。事 實上，預(yù)期具有一個或更多個這些特征(PH，溫度，蛋白水解洗滌劑穩(wěn)定性，和/或氧化穩(wěn)定 性)的不同程度穩(wěn)定性的酶會得到應(yīng)用。 在某些實施方式中，本發(fā)明的重組多核苷酸包含可以被密碼子優(yōu)化以在使用的宿 主細胞內(nèi)表達卡拉膠酶融合蛋白的多核苷酸序列。由于列出了很多細胞中每個密碼子用法 的密碼子使用表在本領(lǐng)域是已知的(例如，Nakamura等，Nucl. Acids Res. ，28 :292 [2000]) 或輕易可導(dǎo)的，給出要表達的蛋白的氨基酸序列時，這樣的核酸能夠很容易設(shè)計。在一些實 施方式中，密碼子優(yōu)化的序列包含編碼卡拉膠酶成熟形式和N-末端前體區(qū)的多核苷酸。在一些實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與下面所示的SEQ ID冊1有至少約70%同一性。
AACAAAAAACAAAGGAAAAATCGATAAACTTACAATCGCAGTAAAC(SEQ ID NO:l) 在其它的實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與SEQ ID冊1有至少約75%同一性， 或與SEQ ID NO : 1有至少約80 % ，至少約85 % ，至少約90 % ，至少約95 % ，至少約97 % ，至 少約98 % ，或至少約99 %同一性。 在一些其它實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列包含編碼卡拉膠酶成熟形式的多核苷 酸。在一些實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與下面提供的SEQID NO :3有至少約70%同一 性 在一些其它實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列與SEQ ID冊3有至少約75%同一 性，或與SEQ ID NO :3有至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%， 至少約98 % ，或至少約99 %同一性。 在一些實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列有效連接于編碼分泌信號肽的多核苷酸序 列，以編碼卡拉膠酶融合蛋白。如上面提到的，在某些實施方式中，使用芽孢桿菌宿主細胞，
16并且信號序列可以是能夠指導(dǎo)融和蛋白進入芽孢桿菌宿主細胞的分泌途徑的任何氨基酸 序列。在某些情況下，可以使用的信號序列包括從野生芽孢桿菌細胞中分泌的蛋白的信號 序列。這樣的信號序列包括由a-淀粉酶，蛋白酶(例如，aprE或枯草桿菌蛋白酶E)，或
P-內(nèi)酰胺酶基因編碼的信號序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的重組多核苷酸包含編碼 AprE信號肽的多核苷酸。其它的示例性信號序列包括，但不限于，由來自任何適宜的芽孢 桿菌種類，包括，但不限于，嗜熱脂肪芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，枯草芽孢桿 菌，和解淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶基因，枯草桿菌蛋白酶基因，P-內(nèi)酰胺酶基因，中性蛋
白酶基因(例如，nprT，nprS，nprM)，或prsA基因編碼的信號序列。在一些實施方式中，信 號序列由枯草芽孢桿菌的即rE基因編碼(參見，例如，Olmos-Soto和Contreras-Flores， Appl. Microbiol. Biotechnol. ， 62 :369-73 [2003])。在一些實施方式中，編碼AprE信號序 列的多核苷酸具有序列
AACATGAGCGCGCAGGCA(SEQ ID NO :11)。在一些實施方式中，AprE信號肽具有氨基酸序列V RSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA(SEQ ID NO :10)。更多的信號肽在本發(fā)明中得到應(yīng)用(參 見，例如，Simonen和Palva， Micro. Rev. ，57 :109-137 [1993];等)。 在某些實施方式中，本發(fā)明的重組多核苷酸包含在表達盒中，以在宿主細胞中表 達卡拉膠酶。像這樣，在一些特定的實施方式中，表達盒包含有效連接的啟動子，編碼卡拉 膠酶蛋白(其卡拉膠酶蛋白可以包含在包括信號序列和所述卡拉膠酶蛋白的融合蛋白內(nèi)) 的編碼序列，和終止子序列。 在一些實施方式中，包含野生型或合成的卡拉膠酶基因的表達盒被連接到合適的 表達質(zhì)粒中?？ɡz酶基因于是用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，以便表達卡拉膠酶基因。在一 些實施方式中，該質(zhì)粒在宿主細胞中復(fù)制，因為其包含質(zhì)粒復(fù)制必需的公知元件，而在其它 的實施方式中，該質(zhì)粒被設(shè)計整合到宿主染色體中。必需元件被提供用于有效的基因表達 (例如，有效連接于目的基因的啟動子)。在一些實施方式中，如果能被識別，這些必需元件 被提供用作該基因自己的同源啟動子(即，由宿主轉(zhuǎn)錄)、轉(zhuǎn)錄終止子(真核宿主細胞的多 聚腺苷酸化區(qū)域)，其是外源的或由卡拉膠酶基因的內(nèi)源終止子區(qū)提供。在一些實施方式 中，也包括了選擇基因，例如抗生素抗性基因，其能夠通過在包含抗微生物的培養(yǎng)基中生長 而連續(xù)培養(yǎng)保持質(zhì)粒感染的宿主細胞。 包含在本發(fā)明的表達載體中的信號序列，啟動子和終止子的選擇很大程度上依賴 于使用的宿主細胞。如上面提到的，在某些實施方式中，使用芽孢桿菌宿主細胞，并且信號 序列可以是能夠指導(dǎo)融和蛋白進入芽孢桿菌宿主細胞的分泌途徑的任何氨基酸序列。在某 些情況下，可以使用的信號序列包括從野生型芽孢桿菌細胞中分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。 這樣的信號序列包括由a-淀粉酶，蛋白酶(例如，aprE或枯草桿菌蛋白酶E)，或P _內(nèi)酰 胺酶基因編碼的信號序列。示例性信號序列包括，但不限于，由來自任何適宜的芽孢桿菌種 類，包括，但不限于，嗜熱脂肪芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，和解 淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶基因，枯草桿菌蛋白酶基因，P-內(nèi)酰胺酶基因，中性蛋白酶基 因(例如，nprT，nprS，nprM)，或prsA基因編碼的信號序列。在一些實施方式中，信號序列 由枯草芽抱桿菌的aprE基因編碼(參見，例如，01mos—Soto禾口 Contreras—Flores， Appl. Microbiol. Biotechnol. ，62 :369-73[2003])。在一些實施方式中，編碼AprE信號序列的多核苷酸具有序列
AACATGAGCGCGCAGGCA(SEQ ID NO :11)。在一些實施方式中，AprE信號肽具有氨基酸序列VR SKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA(SEQ ID NO : 10)。更多信號肽在本發(fā)明中得到應(yīng)用(參見， 例如，Simonen和Palva， Micro. Rev. ，57 :109-137 [1993];等)。 芽孢桿菌細胞內(nèi)使用的合適啟動子和終止子是已知的，并且包括，但不限于 apr (堿性蛋白酶)，npr (中性蛋白酶)，amy ( a -淀粉酶)和P _內(nèi)酰胺酶基因，以及枯草芽 孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿 菌生麥淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢桿菌a _淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢桿菌青霉素 酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌xy/A和xy/B基因的啟動子和終止子，所述啟動子和終止子在 W093/10249，W098/07846，和W099/43835中描述。在一些實施方式中，表達卡拉膠酶蛋白的 表達盒包括SEQ ID NO :12的arpE啟動子(Ferrari等，J Bacteriol. 170 :289-295[1988])。
ID NO :12) 禾口 a -淀粉酶基因的LAT終止子序列CGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTA(SEQ ID NO :13) (Y皿ki等，J. Biochem. 98 :1147-1156 [1985])。 在一些實施方式中，表達盒包含AprE啟動子序列(SEQ ID NO : 12)，其有效連接于 編碼SEQ ID NO:lO的AprE信號肽，例如SEQ ID NO :11的多核苷酸，編碼未加工的成熟形式 的卡拉膠酶，例如SEQ ID N0:2的k-卡拉膠酶的多核苷酸，或者編碼成熟形式卡拉膠酶， 例如SEQ ID NO :4的k -卡拉膠酶的多核苷酸，和a -淀粉酶基因的LAT終止子序列(SEQ IDN0:13)。在有些實施方式中，包含編碼卡拉膠酶的多核苷酸的表達盒具有SEQ ID NO :14 的序列。 CTCGAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTTAATTAA(SEQ IDN0 :15).
在一些特定的實施方式中，重組核酸進一步包含選擇標志，其用于從不包含重組核酸的其它細胞中選取包含重組核酸的細胞。示例性的選擇標志在先前段落中引用的文
獻中描述，包括，但不限于，提供抗微生物抗性的選擇標志，(例如對潮霉素，博來霉素，氯霉
素，腐草霉素，卡那霉素，鏈霉素，氨芐青霉素，四環(huán)素，硫鏈絲菌肽等的抗性)。 在一些實施方式中，編碼序列是密碼子優(yōu)化的，用于在使用的宿主細胞中表達融
合蛋白。由于列出了很多細胞中每個密碼子的用法的密碼子使用表在本領(lǐng)域是已知的(例
如，Nakamura等，Nucl. Acids Res. ，28 :292[2000])或輕易可導(dǎo)的，給出要表達的蛋白的氨
基酸序列時，這樣的核酸能夠很容易設(shè)計。 本發(fā)明的重組多核苷酸可以出現(xiàn)(例如，整合)在宿主細胞的基因組(例如，核基 因組)，或可以出現(xiàn)在載體中(例如噬菌體，質(zhì)粒，病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)中，所述載體宿 主細胞內(nèi)自主復(fù)制。在一些確定的實施方式中，載體是在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)的表達載 體。載體和用于在芽孢桿菌宿主細胞中表達重組蛋白的系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。
芽孢桿菌合適的復(fù)制和整合質(zhì)粒在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如，Harwood和 Cutting(eds)，Molecular Biological Method for Bacillus,John Wiley & Sons[1990]， 尤其是，第3章，枯草芽孢桿菌合適的復(fù)制質(zhì)粒包括列在92頁的那些)。
宿主細胞 本發(fā)明也提供了包含編碼至少一種卡拉膠酶的重組多核苷酸的宿主細胞。如上 所述，在一些實施方式中，本發(fā)明的重組多核苷酸包含在表達盒內(nèi)，該表達盒包含合適啟 動子，信號序列，編碼卡拉膠酶的多核苷酸和終止子序列。在一些實施方式中，編碼卡拉 膠酶的多核苷酸序列是食鹿角菜交替單胞菌的卡拉膠酶的野生型序列(如，SEQ ID NO: 7)。本發(fā)明也提供了表達盒，其包含野生型卡拉膠酶序列，該序列包括，但不限于編碼來自 Z. galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌，紫色球海膽和C. drobachiensis的卡拉膠酶的序列。 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含編碼K-卡拉膠酶(例如，SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :3)的密碼子優(yōu)化序列的表達盒。在一些實施方式中，密碼子優(yōu)化序列包含編碼卡拉膠 酶成熟形式和N-末端前體區(qū)的多核苷酸。在一些實施方式中，編碼卡拉膠酶成熟形式和 N-末端前體區(qū)的密碼子優(yōu)化序列與SEQ ID冊1有至少約70%同一性。在一些實施方式 中，編碼卡拉膠酶成熟形式和N-末端前體區(qū)的密碼子優(yōu)化序列與SEQ ID NO:l有至少約 75X同一性，或與SEQ ID NO :1至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少 約97% ，至少約98% ，或至少約99%同一性。在一些其它實施方式中，密碼子優(yōu)化序列包含 編碼卡拉膠酶成熟形式的多核苷酸。在另外一些實施方式中，編碼卡拉膠酶成熟形式的密 碼子優(yōu)化序列與SEQ ID冊3有至少約70%同一性。在又進一步的實施方式中，編碼卡拉 膠酶成熟形式的密碼子優(yōu)化序列與SEQ ID N0:3有至少約75X同一性，或于SEQ ID NO :3 有至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%，至少約98%，或至少 約99%同一性。 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了能夠表達本發(fā)明的重組多核苷酸的革蘭氏陽性 宿主細胞。在一些實施方式中，革蘭氏陽性宿主細胞包含編碼蛋白酶的部分或全部基因的 突變和/或缺失，其導(dǎo)致該蛋白酶蛋白水解活性的失活，其或者單獨存在或者與其它蛋白 酶內(nèi)的突變聯(lián)合，例如apr，npr，印r，mpr，bpf或isp，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白 酶。在本發(fā)明的一些實施方式中，革蘭氏陽性微生物是芽孢桿菌屬的成員。芽孢桿菌屬的 任何適宜的成員應(yīng)用于本發(fā)明，包括，但不限于，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿
20菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，克勞氏芽孢桿菌，耐 鹽芽孢桿菌(B. halodurans)，巨大芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌 和蘇云金芽孢桿菌。在一些實施方式中，芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。在一些實施方式中，宿 主細胞包含具有在GRAS狀態(tài)下(即，F(xiàn)DA通常認為是安全的)生產(chǎn)蛋白的使用史的菌株。
如上所述，在一些特定的實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞包含兩種或更多的失活 的蛋白酶基因。在一些實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞包含兩種失活的蛋白酶基因(參見， 例如，美國專利5， 387， 521)，而在其它的實施方式中，芽孢桿菌宿主細胞包含5種失活的蛋 白酶基因即rE，即rE，印r， ispA和bpr基因(參見，例如，US20050202535)。由于全部枯 草芽孢桿菌基因組的序列是以公眾名義可以獲得的和注解的(參見，例如，Moszer， FEBS Lett. ，430 :28-36[1998])，枯草芽孢桿菌的蛋白酶已經(jīng)被鑒定和詳細評述(參見，例如，He 等，Res. Microbiol. ，142 :797-803[1991])。另外，芽孢桿菌細胞的基因破壞方法在本領(lǐng) 域通常是公知的(參見，例如，Lee等，Appl. Environ. Microbiol. ，66 :476-480[2000] ;Ye 等，Proc. Internatl. Symp. Rec. Adv. Bioindustry， Seoul, Korea :The KoreanSociety for Applied Microbiology,pp. 160-169[1996] ;Wu等，J. Bacteriol. ，173 :4952-49[1991];和 Sloma等，J. Bacteriol. ，173 :6889-6895 [1991])。這樣，這些菌株的構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人 員能力范圍內(nèi)的。 在一些實施方式中，由本發(fā)明的宿主細胞表達的卡拉膠酶蛋白包含k-卡拉膠酶 氨基酸序列，其具有與下面闡明的SEQ ID NO :2的k -卡拉膠酶至少約70%的同一性。
WDGCNQQQVANYPLYYTSGVAKSRATGNYGYYEARIKGASTFPGVSPAF麗YSTIDRSLTKEGDVQYSEIDVVELTQ KSAVRESDHDLHNIVVKNGKPT麗RPGSFPQTNHNGYHLPFDPRNDFHTYGVNVTKDKITWYVDGEIVGEKDNLYWH
ID NO :2) 在一些其它實施方式中，由本發(fā)明的宿主細胞表達的卡拉膠酶蛋白與SEQ ID NO : 2有至少約75%同一性，或與SEQ ID冊2有至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少 約95 % ，至少約97 % ，至少約98 % ，或至少約99 %同一性。 在一些實施方式中，由本發(fā)明的宿主細胞表達和生產(chǎn)的卡拉膠酶蛋白包含k-卡 拉膠酶的氨基酸序列，其具有與下面闡明的SEQ ID N0:4的k-卡拉膠酶至少70X的同一 性。
WDGCNQQQVANYPLYYTSGVAKSRATGNYGYYEARIKGASTFPGVSPAF麗YSTIDRSLTKEGDVQYSEIDVVELTQ
KSAVRESDHDLHNIVVKNGKPT麗RPGSFPQTNHNGYHLPFDPRNDFHTYGVNVTKDKITWYVDGEIVGEKDNLYWH
RQMNLTLSQGLRAPHTQWKCNQFYPSANKSAEGFPTSMEVDYVRTWVKVGNNN(SEQ ID NO :4) 在其它實施方式中，由本發(fā)明的宿主細胞表達的卡拉膠酶蛋白與SEQID N0:4有
至少約75%同一性，與SEQ ID N0:4有至少約80X，至少約85X，至少約90X，至少約
95 % ，至少約97 % ，至少約98 % ，或至少約99 %同一性。 本發(fā)明也包括由于結(jié)構(gòu)和/或功能相似而相關(guān)的卡拉膠酶蛋白。在一些實施方式 中，這些蛋白來自不同的屬和/或物種，包括生物類群之間的差別(例如，細菌蛋白和真菌蛋白)。在另外的實施方式中，相關(guān)蛋白由相同的物種提供。事實上，本發(fā)明不打算限定于來自任何特定來源的相關(guān)蛋白。另外，術(shù)語"相關(guān)蛋白"包括三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如，本發(fā)明的卡拉膠酶)。例如，本發(fā)明涉及這樣的同源物，其包括但不限于這樣的酶，如Zobellia galactanivorans，環(huán)狀芽孢桿菌，紫色球海膽，禾口 C. drobachiensis的卡拉膠酶。事實上，如上所述，本發(fā)明涉及變體蛋白(例如，相關(guān)的和衍生的蛋白)，尤其，依照IUMBM酶命名法，那些卡拉膠酶具有如EC3. 2. 1. 83描述的活性。另外，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物。在一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物包括如上描述的大量芽孢桿菌宿主細胞和培養(yǎng)基。
蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法 本發(fā)明也提供了使用上述細胞的方法。在一些實施方式中，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞以產(chǎn)生卡拉膠酶蛋白。在另外一些實施方式中和如上所述，蛋白分泌到培養(yǎng)基中。在又進一步的實施方式中，該方法包括從培養(yǎng)基中回收蛋白的步驟。 一些實施方式提供了SEQ ID N0:4中闡明的K-卡拉膠酶蛋白的成熟形式的生產(chǎn)(g卩，分泌)。本發(fā)明也包括SEQ ID N0:4的卡拉膠酶的變體和如本文列舉的相關(guān)卡拉膠酶蛋白。
在一些實施方式中，使用任何方便的方法(例如，通過沉淀，離心，親和力，過濾)或本領(lǐng)域已知的任何其它適合的方法從生長培養(yǎng)基中回收卡拉膠酶蛋白。例如，親和層析(Tilbeurgh等，F(xiàn)EBS Lett. 16 :215[1984]);離子交換層析法(Goyal等，Biores. Technol.，36 :37[1991] ;Fliess等，Eur. J.Appl. Microbiol. Biotechnol. 17 :314[1983] ;Bhikhabhai等，J. Appl. Biochem. ，6 :336 [1984]和Ellouz等，Chromatogr即hy396 :307 [1987])，包括使用高分辨能力的材料的離子交換(Medve等，J. Chromatography A 808 :153[1998]);疏水相互作用層析(Tomaz和Queiroz， J Chromatography A 865 :123 [1999]);兩相分配(B進bauer等，Bios印aration 7 :287[1999]);乙醇沉淀；反相HPLC ;在二氧化硅或陽離子交換樹脂上的層析，例如DEAE ;層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沉淀法；和凝膠過濾(例如，使用SEPHADEX G-75)，在本發(fā)明中獲得應(yīng)用。在一些特定的實施方式中，添加洗滌劑的蛋白未經(jīng)從培養(yǎng)基中其它的成分中純化而被應(yīng)用。在一些實施方式中，培養(yǎng)基中的成分被簡單地濃縮，未經(jīng)從生長培養(yǎng)基中的其它成分進一步純化卡拉膠酶蛋白，即用于生產(chǎn)洗滌劑和/或其它組合物。 在一些實施方式中，宿主細胞在分批，補料分批或持續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)。經(jīng)典的分批發(fā)酵方法使用封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基先于發(fā)酵運行開始而制備。以期望的生物接種培養(yǎng)基，不后續(xù)添加任何成分到培養(yǎng)基中的情況下，發(fā)生發(fā)酵。在某些情況下，生長培養(yǎng)基的PH值和氧含量，而不是碳源含量，在分批方法中改變。分批系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物和細胞生物量不斷變化，直至發(fā)酵終止的時間。在分批系統(tǒng)中，細胞通常從靜態(tài)延遲期進展到高速生長對數(shù)期，最后到生長速率下降或停止的穩(wěn)定期。如果不處理，穩(wěn)定期的細胞最終死亡。在總體層面上，對數(shù)期的細胞產(chǎn)生多數(shù)蛋白。 標準分批系統(tǒng)的變型是"補料分批發(fā)酵"系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，養(yǎng)分(例如，碳源，氮源，02，或其它養(yǎng)分)只在培養(yǎng)物中其濃度下降到閾值以下才加入。當(dāng)分解代謝阻遏有抑制細胞代謝的傾向和期望在培養(yǎng)基中含有有限量的養(yǎng)分時，補料分批系統(tǒng)是有用的。補料分批系統(tǒng)中的實際養(yǎng)分濃度的檢測是基于可測量因素，例如PH，溶解氧，和例如C02的廢氣的分壓的變化而估計的。分批和補料分批發(fā)酵在本領(lǐng)域是常見的和已知的。
連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中確定的培養(yǎng)基被連續(xù)加到生物反應(yīng)器中，等量的條件培養(yǎng)基被同時移除用于處理。連續(xù)發(fā)酵通常保持恒定高密度的培養(yǎng)物，其中細胞主要處于對數(shù)期生長。 連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任意數(shù)量的因素。例如，在一些實施方式中，限制養(yǎng)分，例如碳源或氮源被保持在固定比率，所有其它的參數(shù)允許適度。在其它的系統(tǒng)，許多影響生長的因素被持續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)態(tài)的生長條件。這樣，由于抽取培養(yǎng)基造成的細胞損失可以與發(fā)酵中的細胞生長速率平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵工藝的養(yǎng)分和生長因子的方法，以及最大化產(chǎn)物形成率的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并應(yīng)用于本發(fā)明的卡拉膠酶生產(chǎn)。
使用方法 使用上述方法生產(chǎn)的卡拉膠酶蛋白應(yīng)用于任何包含卡拉膠酶的產(chǎn)品，包括，但不限于洗滌劑組合物(例如，織物清洗組合物，如洗衣洗滌劑，表面清洗組合物，餐具清洗組合物和自動洗碗機清洗組合物；參見，例如W00001826，其通過引用而納入本文)。在一些實施方式中，清潔組合物是不含硼砂的組合物。 在一些特定的實施方式中，卡拉膠酶蛋白用于包含卡拉膠酶的洗衣洗滌劑，其包含從約1%到約80%的，例如，約5%到約50% (以重量計)的表面活性劑，其可以是非離子型表面活性劑，陽離子表面活性劑，陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，或其任意混合物(例如，陰離子和非離子型表面活性劑的混合物)。示例性表面活性劑包括烷基苯磺酸鹽(ABS)(包括線性烷基苯磺酸鹽)和線性烷基磺酸鈉、烷基苯氧基聚乙氧乙醇(例如，壬基苯氧基乙氧基化物或壬基苯酚)、二乙醇胺、三乙醇胺和單乙醇胺?？捎糜谙匆孪礈靹┲械氖纠员砻婊钚詣┦潜绢I(lǐng)域公知的(參見，例如，美國專利號3， 664， 961， 3， 919， 678，4， 222， 905和4， 239， 659)。 洗衣洗滌劑可以是固體的，液體的，凝膠的或條塊狀形式，可以進一步包含緩沖劑，例如碳酸鈉，碳酸氫鈉，或洗滌劑助劑，漂白劑，漂白活化劑，各種酶，酶穩(wěn)定劑，泡沫增加劑，抑制劑，防晦暗劑，防腐劑，懸污劑，釋污劑，殺菌劑，pH調(diào)節(jié)劑，非助劑堿源，螯合劑，有機或無機填充劑，溶劑，助水溶劑，熒光增白劑，染料或香料。在一些實施方式中，洗衣洗滌劑除了本發(fā)明的卡拉膠酶之外，進一步包含至少一種酶(例如，半纖維素酶，過氧化物酶，蛋白酶，纖維素酶，木聚糖酶，脂肪酶，磷脂酶，酯酶，角質(zhì)酶，果膠酶，角蛋白酶，還原酶，氧化酶，酚氧化酶，脂加氧酶，木質(zhì)素酶，支鏈淀粉酶，鞣酸酶，戊聚糖酶，甘露聚糖酶，P _葡聚糖酶，阿拉伯糖苷酶，透明質(zhì)酸酶，軟骨素酶，漆酶，和淀粉酶，或其混合物)。
本發(fā)明的卡拉膠酶蛋白應(yīng)用于任何用于清洗各種需要去除污漬的表面的適宜組合物。這樣的清潔組合物包括洗滌硬表面的清洗組合物，形式不限(例如，液體，凝膠，條塊狀和顆粒形式)；洗滌織物的清洗組合物，形式不限(例如，顆粒，液體，凝膠和條塊狀劑型)；餐具清潔組合物(形式不限)；口腔清潔組合物，形式不限(例如，潔齒劑，牙膏，凝膠和漱口劑型)；義齒清洗組合物，形式不限(例如，液體，凝膠或片劑)；和隱形眼鏡清洗組合物，形式不限(例如，液體，片劑)。 在一些實施方式中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種清洗酶，其提供洗滌效能和/或織物護理益處。合適酶的例子包括，但不限于，半纖維素酶，過氧化物酶，蛋白酶，纖維素酶，木聚糖酶，脂肪酶，磷脂酶，酯酶，角質(zhì)酶，果膠酶，角蛋白酶，還原酶，氧化酶，酚氧化酶，脂加氧酶，木質(zhì)素酶，支鏈淀粉酶，鞣酸酶，戊聚糖酶，甘露聚糖酶，P _葡聚糖酶，阿拉伯糖苷酶，透明質(zhì)酸酶，軟骨素酶，漆酶，和淀粉酶，或其混合物。在一些實施方式中，酶聯(lián)合應(yīng)用(B卩，混合物)，包含常規(guī)應(yīng)用的酶，如蛋白酶，脂肪酶，角質(zhì)酶和/或纖維素酶與卡拉膠酶聯(lián)合使用。 在一些實施方式中，除了此處描述的蛋白，清潔組合物也包含一種或多種與卡拉膠酶蛋白相容的清潔組合物材料。如本文描述，術(shù)語"清潔組合物材料"指為期望的清潔組合物的特定類型和產(chǎn)品形式(例如，液體，顆粒，條劑，噴霧劑，棍劑，膏劑，凝膠)而選擇的任何液體，固體或氣體材料，這些材料也與該組合物中使用的卡拉膠酶相容。通過考慮要清洗的表面材料，使用過程中洗滌條件的希望的組合物形式(例如，通過水洗滌劑使用)，清潔組合物材料的具體選擇很容易進行。如本文應(yīng)用的"非織物清潔組合物"包括硬表面清潔組合物，餐具清洗組合物，口腔清潔組合物，義齒清潔組合物和隱形眼鏡清洗組合物。
與各種常規(guī)成分一起，卡拉膠酶蛋白用于提供全配方硬表面洗滌劑，餐具清洗組合物，織物清潔組合物等等。這樣的組合物以液體，顆粒，條劑和類似的形式應(yīng)用。在一些實施方式中，這樣的組合物被配制為現(xiàn)代"濃縮"洗滌劑，其包含以重量計高達約30%到約60%的表面活性劑。 在一些實施方式中，本發(fā)明的清潔組合物包含各種陰離子的，非離子的，兩性離子的表面活性劑。這樣的表面活性劑通常以組合物中從約5%到約35%的水平存在。
很多在洗滌劑清潔組合物中有用的其它成分也在本文的組合物中應(yīng)用，包括其它活性成分，載體，助水溶物，加工助劑，染料或色素，液體劑型的溶劑，等。如果期望額外增加泡沫，例如C1Q-C16烷基酰胺的泡沫增加劑也在該組合物中得到應(yīng)用，有代表性地，約1 %到約10%的水平。 在一些實施方式中，清洗組合物包含水和/或其它溶劑做為載體。例如，在一些實施方式中，低分子量的伯醇和仲醇(例如，甲醇，乙醇，丙醇和異丙醇)是合適的。 一元醇被用于溶解表面活性劑，但多元醇，例如包含約2個到約6個碳原子和約2個到約6個羥基的那些多元醇(例如，l，3-丙二醇，乙二醇，甘油和1，2-丙二醇)也可應(yīng)用。在這些實施方式中，組合物通常包含從約5%到約90%，或通常從約10%到約50%的這樣的載體。
在一些實施方式中，本文提供的清洗組合物如此配制，使得在水性清洗操作的使用過程中，許多水將具有約6.8和約11.0之間的pH值。這樣成品通常被配制于此范圍?？刂芇H值于推薦用量水平的技術(shù)包括使用緩沖液，堿，酸，等，其對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。 各種漂白化合物，例如過碳酸鹽，過硼酸鹽等等，也應(yīng)用于這樣的組合物，通常以重量計在約1%到約15%的水平。在一些實施方式中，這樣的組合物也包含漂白活化劑例如，四乙酰乙二胺，壬酰氧基苯磺酸鹽，等等，其在本領(lǐng)域也是已知的。用量水平通常范圍為以重量計約1%到約10%。 各種釋污劑，尤其陰離子寡酯類型，各種螯合劑，尤其氨基磷酸鹽和乙二胺二琥珀酸鹽，各種粘土污物去除劑，尤其乙氧基化的四乙烯五胺，各種分散劑，尤其是聚丙烯酸酯和聚天冬氨酸，各種光亮劑，尤其陰離子光亮劑，各種抑泡劑，尤其聚硅氧烷和仲醇，各種織物柔軟劑，尤其蒙脫石等等，都在本發(fā)明組合物的各種實施方式中以按重量計約1%到約35%的水平應(yīng)用。標準配方手冊和公布的專利包含這些常規(guī)材料的多種詳細的描述。
酶穩(wěn)定劑也應(yīng)用于本發(fā)明的清潔組合物。這樣的穩(wěn)定劑包括，但不限于，丙二醇(從約1 %到約10 % )，甲酸鈉(從約0. 1 %到約1 % )，和甲酸f丐(從約0. 1 %到約1 % )。
本發(fā)明的清潔組合物被配制成任何適宜的形式并由配方設(shè)計師選擇的任何適宜的方法制備(參見，例如，U. S. 5， 879584， U. S. 5， 691， 297， U. S. 5， 574， 005， U. S. 5， 569， 645，U. S. 5， 565， 422， U. S. 5， 516， 448， U. S. 5， 489， 392， U. S. 5， 486， 303， U. S. 4， 515， 705，U. S. 4， 537， 706， U. S. 4， 515， 707， U. S. 4， 550， 862， U. S. 4， 561， 998， U. S. 4， 597， 898，U. S. 4， 968， 451， U. S. 5， 565， 145， U. S. 5， 929， 022， U. S. 6， 294， 514和U. S. 6， 376， 445，其都通過引用納入此文，作為非限制性的實例)。當(dāng)配制本發(fā)明的硬表面清潔組合物和織物清潔組合物時，配方設(shè)計師可能希望使用各種助洗劑，其水平為按重量計約5%到約50%。有代
表性的助洗劑包括i-io微米沸石，聚羧酸酯例如檸檬酸和氧基二琥珀酸，層狀硅酸鹽，磷酸鹽，等等。其它常規(guī)的助洗劑列在標準配方手冊中。 其它任選的成分包括螯合劑，粘土污物去除/抗再沉積劑，聚合物分散劑，漂白劑，光亮劑，抑泡劑，溶劑和美化劑。 在一些實施方式中，本發(fā)明的清潔組合物應(yīng)用于清洗表面和/或織物。在一些實施方式中，至少一部分表面和/或織物與本發(fā)明清潔組合物的至少一種實施方式接觸，以未摻水方式或在洗液中稀釋，然后表面和/或織物任意地被清洗和/或沖洗。根據(jù)本發(fā)明的目的，"清洗"包括，但不限于，擦洗和機械攪拌。在一些實施方式中，織物包括能在一般消費者使用條件下被洗滌的任何織物。在一些實施方式中，本發(fā)明的清潔組合物以溶液中從約500ppm到約15000ppm的濃度使用。在洗滌溶劑是水的一些實施方式中，水溫范圍通常從約5t:到約7(TC。在織物清潔的一些實施方式中，水與織物質(zhì)量比通常從約1 : l到約
30 : i。 為了進一步說明本發(fā)明和其益處，下面給出具體的實施例，應(yīng)理解它們被提供用于闡明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)以任何方式被認為是對其范圍的限制。
實施例 提供下面的實施例用于說明和進一步解釋本發(fā)明的某些實施方式和方面，并不被認為是對其范圍的限制。在下面的實驗公開中，使用下列縮寫°C (攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；1120(水)；
HC1(鹽酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；KD(千道爾頓)；gm(克)；i!g
和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；iil和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；iim和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；yM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特);麗(分子量);sec(秒);min(s)(分鐘);hr(s)(小時);MgCl2(氯化鎂)；NaCl (氯化鈉)；OD4。5(405nm處的光密度)；PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)；Tris(三(羥基甲基)
氨基甲烷)；MES(2-嗎啉代乙磺酸，一水合物)；卯m(百萬分之(幾))；gpg(格令每加侖水)；HDD(重負荷洗滌劑)；HDL(重負荷液體)；ADW(自動洗碗)；SRI(污漬去除指數(shù));AATCC(美國紡織和染色化學(xué)家協(xié)會);TOT(振蕩式滌垢儀);DNA2.0(DNA2.0， MenloPark， CA) ;Sigma (Sigma-Aldrich公司，St丄ouis， M0) ;Test Fabrics (TestFabrics， Inc.West Pittston， PA) ;Corning (Corning公司，Corning, NY) ;Pechiney (Pechiney PlasticPacking, Menasha， WI) ;Eppendorf (Eppendorf Scientific, Westbury， NY) ;VWR(VWRinternational, West Chester, PA) ;Molecular Devices(Molecular Devices公 司，
25Sunnyvale, CA) ;Warwick(Warwick Equest Limited, Durham, England) ;Minolta(柯尼卡美能達有限公司，東京，日本)；U.S.Testing(U.S. Testing有限公司，Hoboken， NJ);和Rockland(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville， PA)。 在這些實驗中，使用分光光度計測量反應(yīng)完成后形成的產(chǎn)品的吸光度。反射計用
于測量樣品的反射率。除非另有說明，蛋白濃度由CoomassiePlus (Pierce)估算，用BSA做
為標準品。 實施例1 在枯草芽孢桿菌中表達和分泌k _卡拉膠酶cgkA基因 來自食鹿角菜交替單胞菌的K-卡拉膠酶基因(cgkA基因)(無信號序列)(Potin等，Eur. J. Biochem. ，228 :971-975 [1995])以優(yōu)化的枯草芽孢桿菌密碼子(DNA2. 0)合成并克隆入載體pJ31-7585。密碼子優(yōu)化的基因序列(SEQ ID NO :1)被連入枯草芽孢桿菌整合載體p2JM，在即rE啟動子的DNA序列
ID NO :10) 接著aprE信號序列(SEQ ID NO :11)，和LAT終止子CGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTA(SEQ ID NO :12)之間，作為約1. Ikb的BssHII-Hindlll片段(參見，圖2)。獲得的載體，p2JM-cgkA(參見，圖3)被用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主細胞BG3594cK(美國專利5， 387， 521) ， BG3934cK(US20050202535)，和BG6006 (US20050202535)，其分別包含2個(nprE禾口 aprE) ， 5個(nprE， aprE，印r， ispA禾口 bpr)禾口 9個(nprE， aprE，印r， ispA， bpr，vpr，wprA，mpr-ybjF和nprB)蛋白酶基因缺失。挑選來自每個宿主菌株轉(zhuǎn)化的兩個克隆并在25mg/ml氯霉素存在下擴增。 克隆分別在具有25mg/ml氯霉素的30mlGrant' sll培養(yǎng)基中，于250ml搖瓶中，37t:和250rpm下生長約60小時。通過離心收集來自每個培養(yǎng)物的上清液并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析k-卡拉膠酶的酶活性。AACAAAAAACAAAGGAAAAATCGATAAACTTACAATCGCAGTAAAC(SEQ ID NO :1)
由三種培養(yǎng)物的每一種產(chǎn)生的20微升卡拉膠酶樣品，在MES緩沖液中，還原性條 件下，使用10% NuPAGE分析。分子量48. 9kDa的無關(guān)蛋白BCE-cAbBCIIl被用做陽性對照。
NuPAGE凝膠顯示，當(dāng)與BG3594cK培養(yǎng)物的克隆產(chǎn)生的水平比較時，BG3934cK培養(yǎng) 物的克隆A和B產(chǎn)生最高水平的k-卡拉膠酶(預(yù)測分子量31.7kDa)。使用該種檢測方 法，BG6006培養(yǎng)物沒有產(chǎn)生可檢測的k-卡拉膠酶。如在下面的實施例中所描述，在確定 BG3934cK培養(yǎng)物產(chǎn)生的k -卡拉膠酶的酶活性實驗中，來自BG6006培養(yǎng)物的上清液被用作
陰性對照。 實施例2 k -卡拉膠酶的酶活性和底物特異性 酶對于卡拉膠的水解活性使用還原糖測定來檢測，其使用PAHBAH(對羥基苯甲 酸酰肼)試劑(參見，Lever， Anal. Biochem. ，47 :273[1972])?？ɡz(類型I k-， CAS 9000-07-1，類型II i -， CAS 9062-07-1，和類型III k-， CAS 11114-20-8)購自Sigms，以 0. 25X的濃度溶解于50mM，PH7. 4的H印es緩沖液。對于一些實驗，AATCC標準重負荷液體洗 滌劑(AATCCHDL 2003，不含光亮劑(測試織物)以每升1. 5ml被加入(0. 15% ) 。 AATCCHDL 液體洗滌劑包含12%的直鏈烷基磺酸鹽，8%的脂肪醇乙氧基化物，8%的丙二醇，1.2%的 擰檬酸，4%的脂肪酸和4%的氫氧化鈉，余量為水。在HDD(lg/1， pH9. 5-10)和ADW(lg/1， pHlO. 0-10. 5)洗滌劑中，也檢測了 k -卡拉膠酶的活性的去除k _卡拉膠類型I污漬的能 力。每個產(chǎn)生k-卡拉膠酶的培養(yǎng)物的上清液通過離心回收，并且在AATCC HDL中分析等 分試樣的活性。為了檢測在HDD和ADW中的活性，上清液首先被濃縮12倍。
測定在24孔微孔板(COSTAR 3526 ;Corning)中進行如下1ml緩沖液(I)被加入 到孔1 (緩沖液)，1ml緩沖液加酶被加入孔2 (II)(樣品)，1ml緩沖液和底物加入孔3 (III) (底物)，和1ml緩沖液，加底物和酶(V)(酶加底物)加入到孔4。標記"樣品+底物"(IV) 的帶反映計算的對照值。為了統(tǒng)計目的，每個孔設(shè)置2到4次。要檢測的酶通常在反應(yīng)緩 沖液中稀釋1至10到1至1000倍。在所有試劑加入后，塑料蓋蓋住微孔板并且蓋和板的 交匯處用幾層封口膜(Pechiney)緊密纏繞以防止蒸發(fā)。反應(yīng)板在lOOrpm的搖床上37。C下 孵育1到16小時。 使用Eppendorf Mastercycler梯度熱循環(huán)儀和0. 2ml —次性PCR(聚合酶鏈反 應(yīng))條形管和帽(VWR)測定還原糖活性。還原糖試劑制備如下加O. 15g酒石酸鉀鈉四水 合物(Rochelle Salt ;Sigma)和0. 15g對羥基苯甲酸酰肼(H-9882 ;Sigma)到10ml 2%氫 氧化鈉蒸餾水溶液中。該溶液，稱為"PAHBAH試劑"，被旋動以溶解所有的成分并在暗處放 置冰上直到使用。該試劑每天新鮮配制。在樣品分析前即刻，向PCR條形管的每個管中加 入0. 160ml的PAHBAH試劑，接著加5到20 y 1的酶樣品和對照。所有管蓋嚴，置于熱循環(huán)儀內(nèi)，并在99t:孵育15分鐘，接著4t:冷卻至少15分鐘。冷卻之后，去除條形管蓋，每份樣品0. 15ml被放入96孔平底微孔板(C0STAR 9017 ;Corning)并由Spectra Max 250 PlateReader在405nm處讀數(shù)，以蒸餾水為空白對照。 每個酶樣品被分析如下對照樣品的光密度(0D)從緩沖液樣品的OD值中減去，并且該值被加到底物緩沖液對照。酶加底物反應(yīng)的0D與底物和樣品對照的總和做比較。
表明k -卡拉膠酶水解活性的結(jié)果顯示在圖4A-E。該數(shù)據(jù)表明，當(dāng)在AATCC HD液體洗滌劑中使用時，k -卡拉膠酶有效去除類型I k -卡拉膠污漬(圖4A)和類型III k -卡拉膠污漬(圖4C)。 圖4D和4E給出的結(jié)果表明，當(dāng)在HDD(重負荷洗滌劑)和ADW(自動洗碗機洗滌劑)中使用時，k -卡拉膠酶也去除k -卡拉膠類型I的污漬。
實施例3 使用小塊樣品篩選測定的Cgka的清潔活性 使用該實施例中描述的方法，測試CgkA的活性的洗滌被沙拉醬和沙茶醬污染的干凈樣布的能力。 含色素(STC CFT CS_6)的沙拉醬污染的棉布(測試織物)和沾有沙茶醬的圓形污跡的棉織物(Warwick)被用于這些實驗。 使用裝備5/8"沖刀的B型紡織品沖床，將用于微孔板測定的樣布切成15mm的圓形(圓平面)。單個樣布圓平面被置于24孔微孔板(Costar 3526)的每個孔中。對于沙拉醬污漬，lml清洗溶液(每升包含1. 5ml AATCCHDL， 50mM H印es緩沖液，和在50mM pH7. 4的H印es緩沖液中稀釋的1至50卯m的酶)被加入每孔。對于沙茶醬污漬，lml清洗溶液(每升包含1. 5ml AATCC HDL洗滌液，10mM pH 8. 2的H印es， 50mM氯化鈉，和2. 5mM氯化f丐)被加入每孔。對照孔不含酶。沙茶醬污漬實驗的對照是AATCC對照，和牛血清白蛋白(BSA)對照。微孔板用塑料蓋和鋁箔封住并在37°C， lOOrpm溫和轉(zhuǎn)動下，孵育3_16小時。該板從搖床上移開，通過抽吸移去洗滌劑溶液。每個微孔板孔用1.5ml pH7. 3的Dulbecco' sPBS洗滌3次，并用1.5ml的蒸餾水洗滌3次。每個圓平面從孔中移開，在幾張紙巾之間晾干過夜，不暴露于直接光源。圓平面用肉眼觀察并用Minolta反射儀CR-200分析，該反射儀在標準白色瓷磚上標定。每個對照和檢測樣品一般4個重復(fù)，計算數(shù)據(jù)的平均L值和標準差百分數(shù)。對于測量cgkA對沙茶醬污漬活性的實驗，根據(jù)下列公式從"L"值計算釋污指數(shù)百分數(shù)(％ SRI) : % SRI = L(最終)-L(初始)/L(白色瓷磚)-L(初始)X100X。
小塊樣品篩選測定的結(jié)果顯示在圖5A和5B中。如圖5A和5B所示，CgkA分別顯
示了對沙拉醬和沙茶醬污漬極好的清潔力。
實施例4 使用震蕩式滌垢儀的GgkA的清潔活性 震蕩式滌垢儀研究使用維持在30 °C的7243S型6容器震蕩式滌垢儀(U. S. Testing)。攪拌速度設(shè)置為100rpm。被圓形食物(Warwick)污染的棉布樣(每個震蕩式滌垢儀容器5塊)被加入到具有6gpg硬度(從包含1. 735M氯化鈣和0. 67M氯化鎂的1500gpg硬度的溶液稀釋而來)，和25mM pH7. 4的H印es緩沖液的1升0. 15% AATCCHDL洗滌劑中。30分鐘洗滌循環(huán)后，樣布在1. 5L冷自來水中被洗滌3次，在旋轉(zhuǎn)循環(huán)中被旋轉(zhuǎn)7分鐘以去除過量的水分，在室溫干燥過夜。由反射儀分析每個污漬之后，通過標準
28方法(參見，小塊樣品篩選方法)計算釋污百分數(shù)(％ SRI)。 15ppm K-卡拉膠酶(III)相對于無酶的對照樣品(I)的活性，與對照蛋白，牛血清白蛋白(II) (BSA-50， Fraction V，Immunoglobulin and ProteaseFree ;Rockland)相對于無酶的對照樣品(I)的活性做比較。 圖6顯示CgkA具有在震蕩式滌垢儀測定中顯著的清除果醬污漬的清潔活性。從5次重復(fù)實驗獲得的結(jié)果計算SRI百分數(shù)值。 上述實施例證明了 k _卡拉膠酶從沙拉醬，沙茶醬和果醬污漬污染的棉布上有效去除了污漬。 已經(jīng)描述了本發(fā)明的實施方式，據(jù)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員看來，可以對公開的實施方式進行各種修改，并且使這樣的修改在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明非常適合于實現(xiàn)目標和獲得提到的以及其中固有的結(jié)果和益處。本文描述的組合物和方法是實施方式的代表，是示例性的，并且無意作為對本發(fā)明范圍的限制?？梢詫Ρ疚墓_的發(fā)明進行不同的替換和修改而不脫離本發(fā)明的范圍和精神，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。 本文闡述性描述的本發(fā)明可以在缺少本文沒有具體公開的任何一種或多種要素、
一種或多種限制的情況下實施。使用的術(shù)語和表達僅用作為描述而非限制性的術(shù)語，并且
此類術(shù)語和表達的使用并不欲排除顯示和描述的特征的任何等同特征或其部分，而應(yīng)當(dāng)認
識到，多種修改在要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然已參考一些實施方式和
任選特征對本發(fā)明進行了具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可采取本文公開的概念的修改和
變化，此類修改和變化也被認為在所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。 本文已經(jīng)廣義地一般性描述了本發(fā)明。落在該一般性公開內(nèi)容中的每個更窄的種
類和次一般性的組別也是本發(fā)明的一部分。這包括用從該類中排除任一主題的前提或否定
性限制對本發(fā)明進行一般性描述，而不管排除的材料是否在本文中被特別提及。
權(quán)利要求
一種分離的重組多核苷酸，其包含編碼κ-卡拉膠酶多肽的序列，所述序列有效連接編碼分泌信號肽的多核苷酸。
2. 權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其中所述編碼分泌信號肽的多核苷酸來自革蘭氏陽 性微生物。
3. 權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述分泌信號肽是AprE信號肽。
4. 權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其中所述編碼所述卡拉膠酶的序列包含從編碼獲自 交替單胞菌的野生型卡拉膠酶的多核苷酸優(yōu)化的序列。
5. 權(quán)利要求4的分離的多核苷酸，其中所述野生型卡拉膠酶來源于食鹿角菜交替單胞菌。
6. 權(quán)利要求4的分離的多核苷酸，其中所述優(yōu)化的多核苷酸與SEQ IDN0:1或3有至 少約70%同一性。
7. —種表達載體，其含有包含權(quán)利要求l的分離的多核苷酸序列的表達盒。
8. 權(quán)利要求7的表達載體，其中所述分泌信號肽是AprE信號肽。
9. 權(quán)利要求7的表達載體，其中所述表達盒包含選自SEQ ID NO :14和15的多核苷酸 序列。
10. 用權(quán)利要求7的所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
11. 一種芽孢桿菌宿主細胞，其包含編碼融合蛋白的重組多核苷酸，所述融合蛋白包含a) 信號序列；禾口b) 卡拉膠酶蛋白；其中所述宿主細胞從所述細胞分泌所述卡拉膠酶蛋白并且其中所述宿主細胞具有至 少一種失活的蛋白酶基因。
12. 權(quán)利要求ll的芽孢桿菌宿主細胞，其中所述卡拉膠酶蛋白具有與SEQ ID N0:4有 至少約70%同一性的氨基酸序列。
13. 權(quán)利要求ll的芽孢桿菌宿主細胞，其中所述至少一種失活的蛋白酶基因選自 叩rE、 aprE、印r、 ispA、 bpr、 vpr、 wprA、 mpr-yb jF禾口叩rB。
14. 權(quán)利要求ll的芽孢桿菌宿主細胞，其中所述至少一種失活的蛋白酶基因選自 nprE、 aprE、印r、 ispA禾口 bpr基因。
15. 權(quán)利要求11的芽孢桿菌宿主細胞，其中所述失活的蛋白酶基因是nprE和即rE基因。
16. 權(quán)利要求ll的宿主細胞，其中所述信號序列是由枯草芽孢桿菌的即rE基因編碼的 信號序列。
17. 權(quán)利要求ll的宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主細胞。
18. 權(quán)利要求11的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸有效連接啟動子和終止子以形成 表達盒。
19. 權(quán)利要求11的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸存在于所述宿主細胞的基因組內(nèi) 或存在于在所述宿主細胞中自主復(fù)制的載體內(nèi)。
20. 權(quán)利要求11的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸是密碼子優(yōu)化的以在所述芽孢桿 菌宿主細胞中表達所述卡拉膠酶融合蛋白。
21. 細胞培養(yǎng)物，其包含 大量權(quán)利要求11的芽孢桿菌宿主細胞；禾口培養(yǎng)基。
22. —種生產(chǎn)卡拉膠酶蛋白質(zhì)的方法，包括(a) 培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主細胞；禾口(b) 產(chǎn)生所述卡拉膠酶蛋白質(zhì)。
23. 權(quán)利要求22的方法，其進一步包括收獲所述產(chǎn)生的卡拉膠酶的步驟。
24. 權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細胞是芽孢桿菌物種。
25. —種清潔組合物，其包含有效量的分離的k-卡拉膠酶，所述k-卡拉膠酶包含與 SEQ ID NO :4的k -卡拉膠酶有至少約70%同一性的氨基酸序列。
26. 權(quán)利要求25的清潔組合物，其中所述清潔組合物是洗滌劑。
27. 權(quán)利要求26的清潔組合物，其進一步包含至少一種額外的酶或酶衍生物。
28. 權(quán)利要求27的清潔組合物，其中所述至少一種額外的酶或酶衍生物選自半纖維素 酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋 白酶、還原酶、氧化酶、氧化還原酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊 聚糖酶、甘露聚糖酶、P-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶，漆酶、和淀粉酶， 或其混合物。
29. —種清潔方法，包括將硬表面和/或包含織物的物品與權(quán)利要求25的清潔組合物 接觸的步驟。
30. 權(quán)利要求29的方法，其進一步包括將所述表面或材料與所述清潔組合物接觸后漂 洗所述表面和/或物品的步驟。
31. 權(quán)利要求29的方法，其中所述表面和/或包含織物的物品被k -卡拉膠污染。
32. 權(quán)利要求29的方法，其中所述表面和/或所述包含織物的物品被沙拉醬、沙茶醬和 /或果醬污染。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含至少一種卡拉膠酶的清潔組合物，在宿主細胞中生產(chǎn)卡拉膠酶的方法，包含編碼至少一種卡拉膠酶的重組多核苷酸的宿主細胞，和編碼卡拉膠酶的重組多核苷酸。
文檔編號C12N15/62GK101784660SQ200880103130
公開日2010年7月21日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者B·施密特, H·C·麥克唐納 申請人:丹尼斯科美國公司