專利名稱：：共價(jià)雙抗體及其用途的制作方法共價(jià)雙抗體及其用途本申請(qǐng)要求美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/019，051(2008年1月4日提交)和60/945，523(2007年6月21日提交)的權(quán)益，這兩項(xiàng)申請(qǐng)通過引用全文并入本申請(qǐng)。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及雙抗體分子和其在治療多種疾病和病癥中的用途，所述疾病和病癥包括免疫病癥和癌癥。本發(fā)明的雙抗體分子包含至少兩條多肽鏈，其締合形成可識(shí)別相同或不同表位的至少兩個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)。另外，表位可來自相同或不同分子，或位于相同或不同細(xì)胞上。雙抗體分子的單獨(dú)多肽鏈可經(jīng)由非肽鍵的共價(jià)鍵共價(jià)結(jié)合，諸如但不限于位于各多肽鏈中的半胱氨酸殘基的二硫鍵。在具體實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子進(jìn)一步包含F(xiàn)c區(qū)，這允許抗體樣的功能性被加工到分子中。2.
背景技術(shù)：
：共價(jià)雙抗體的設(shè)計(jì)是基于單1鏈Fv構(gòu)建體(scFv)(HoiIiger等人(1993)“iDiabodies'SmallBivalentAndBispecificAntibodyFragments(‘雙抗體，小的二價(jià)和雙特異性抗體片段)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA90=6444-6448；通過引用全文并入本文)。在完整的未修飾IgG中，VL和VH結(jié)構(gòu)域位于不同多肽鏈即分別是輕鏈和重鏈上?？贵w輕鏈與抗體重鏈的相互作用，尤其是VL與VH結(jié)構(gòu)域的相互作用形成抗體的表位結(jié)合位點(diǎn)之一。相反，scFv構(gòu)建體包括單條多肽鏈中包含的抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域，其中各結(jié)構(gòu)域間隔長(zhǎng)度足以允許自組裝兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)楣δ苄员砦唤Y(jié)合位點(diǎn)的柔性接頭。當(dāng)由于接頭長(zhǎng)度不足(少于約12氨基酸殘基)而不能自組裝時(shí)，兩個(gè)scFv構(gòu)建體彼此相互作用來形成二價(jià)的分子，一條鏈的VL與另一條鏈的VH聯(lián)合(綜述于Marvin等人(2005)“RecombinantApproachesToIgG-LikeBispecificAntibodies(IgG-樣雙特異性抗體的重組方法)”ActaPharmacol.Sin.26:649_658)。而且，已顯示向構(gòu)建體C-末端加入半胱氨酸殘基允許形成多肽鏈的二硫鍵，穩(wěn)定所得的二聚體而不干擾二價(jià)分子的結(jié)合特征(參見例如，Olafsen等人(2004)"CovalentDisulfide-LinkedAnti-CEADiabodyAllowsSite-SpecificConjugationAndRadiolabelingForTumorTargetingApplications(共價(jià)二硫鍵連接的抗CEA雙抗體允許用于腫瘤靶向應(yīng)用的位點(diǎn)特異性軛合和放射性標(biāo)記)”Prot.Engr.Des.Sel.17:21_27)。進(jìn)一步地，當(dāng)選擇具有不同特異性的VL和VH結(jié)構(gòu)域時(shí)，可構(gòu)建不僅二價(jià)而且雙特異性的分子。二價(jià)雙抗體具有廣泛的應(yīng)用，包括治療和免疫診斷。雙效價(jià)允許在各種應(yīng)用中設(shè)計(jì)和構(gòu)造雙抗體的極大靈活性、對(duì)多聚抗原提供增強(qiáng)的親和力、交聯(lián)不同抗原、并取決于兩種靶抗原的存在而定向靶向特定細(xì)胞類型。由于效價(jià)增加、低解離速率和從循環(huán)快速清除(對(duì)于在或低于50kDa的小尺寸的雙抗體)，本領(lǐng)域已知的雙抗體分子還已顯示在腫瘤成像領(lǐng)域中的特別應(yīng)用(Fitzgerald等人(1997)“ImprovedTumourTargetingByDisulphideStabilizedDiabodiesExpressedInPichiapastoris(ffl過在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的二硫化物穩(wěn)定的雙抗體改進(jìn)腫瘤靶向)”ProteinEng.101221)。特別重要的是交聯(lián)不同細(xì)胞，例如交聯(lián)細(xì)胞毒性T細(xì)胞于腫瘤細(xì)胞(Staerz等人(1985)"HybridAntibodiesCanTargetSitesForAttackByTCells(雜合抗體可革巴向被T細(xì)胞攻擊的位點(diǎn))"Nature314:628_631，和Holliger等人(1996)"SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody(雙特異性雙抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性殺傷淋巴瘤細(xì)胞)"ProteinEng.9299-305)。雙抗體表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可能針對(duì)任何免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面決定簇，諸如T淋巴細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或其他單核細(xì)胞上表達(dá)的⑶3、⑶16、⑶32或⑶64。許多研究中，還發(fā)現(xiàn)結(jié)合于效應(yīng)細(xì)胞決定簇如Fcγ受體(FcyR)的雙抗體活化效應(yīng)細(xì)胞(Holliger等人(1996)"SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody(雙特異性雙抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性殺傷淋巴瘤細(xì)胞)”ProteinEng.9:299_305；Holliger等人(1999)“CarcinoembryonicAntigen(CEA)-SpecificT-cellActivationInColonCarcinomaInducedByAnti_CD3χAnti-CEABispecificDiabodiesAndB7xAnti-CEABispecificFusionProteins(結(jié)腸癌中抗CD3χ抗CEA雙特異性雙抗體和Β7χ抗CEA雙特異性融合蛋白誘導(dǎo)癌胚抗原(CEA)-特異性T-細(xì)胞活化)”CancerRes.592909-2916)。通常，效應(yīng)細(xì)胞活化被結(jié)合抗原的抗體對(duì)效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)由Fc-FcyR相互作用的結(jié)合而觸發(fā)；因此，在這方面，本發(fā)明的雙抗體分子可以展現(xiàn)Ig-樣功能性，而不論它們是否包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(如，在本領(lǐng)域已知的或本文示例的任何效應(yīng)物功能測(cè)定(如，ADCC測(cè)定)中所檢測(cè)的)。通過交聯(lián)腫瘤與效應(yīng)細(xì)胞，雙抗體不僅將效應(yīng)細(xì)胞帶到腫瘤細(xì)胞附近，而且導(dǎo)致有效的腫瘤殺傷(參見例如，Cao等人(2003)"BispecificAntibodyConjugatesInTherapeutics(治療學(xué)中的雙特異性抗體軛合物)”Adv.Drug.Deliv.Rev.55171-197,在此通過引用全文并入本文)。2.1效應(yīng)細(xì)胞受體和它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)中的作用在傳統(tǒng)免疫功能中，抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用引起廣泛的系列反應(yīng)，范圍從效應(yīng)物功能，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性、肥大細(xì)胞脫粒和吞噬作用到免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，例如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用都是通過抗體或免疫復(fù)合物的Fc結(jié)構(gòu)域與造血細(xì)胞上特化的細(xì)胞表面受體的結(jié)合來啟動(dòng)的。由抗體和免疫復(fù)合物觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的多樣性是由Fc受體的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性引起的。Fc受體共有結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可能介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。蛋白質(zhì)的免疫球蛋白基因超家族的成員FcY受體，是可以結(jié)合免疫球蛋白分子的Fcy部分的表面糖蛋白。家族的每個(gè)成員通過FCY受體的α鏈上的識(shí)別結(jié)構(gòu)域來識(shí)別一種或多種同種型的免疫球蛋白。fcy受體是由它們對(duì)免疫球蛋白亞型的特異性定義的。IgG的Fcγ受體被稱為FcyR，IgE的稱為FcεR，IgA的稱為FcaR。不同的輔助細(xì)胞帶有不同同種型抗體的Fcγ受體，抗體的同種型確定了哪個(gè)輔助細(xì)胞將參與給定的反應(yīng)(由RavetchJ.V.等人(1991)"FeReceptors(Fe受體)，，Annu.Rev.Immunol.9457-92；GerberJ.S.等人(2001)"StimulatoryAndInhibitorySignalsOriginatingFromTheMacrophageFcgammaRec印tors(來源于巨噬細(xì)胞Fcγ受體的刺激性和抑制性信號(hào))"MicrobesandInfection,3131-139；BilladeauD.D.等人(2002)，‘‘ITAMsVersusITIMsStrikingABalanceDuringCellRegulation(ITAM相比于ITIM細(xì)胞調(diào)節(jié)期間破壞平衡)”TheJournalofClinicalInvestigation，2(109)161-1681；RavetchJ.V.等人(2000)"ImmuneInhibitoryRec印tors(免疫抑制性受體)"Science，29084-89；RavetchJ.V.等人(2001)"IgGFcReceptors(IgGFc受體)”Annu.Rev.Immunol.19275-90；RavetchJ.V.(1994)“FeReceptors=RuborRedux(Fe受體RuborRedux)"Cell,78(4):553_60綜述)。在表1中概述不同的Fcγ受體、表達(dá)它們的細(xì)胞和它們的同種型特異性(改編自Immunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease(免疫生物學(xué)健康和疾病中的免疫系統(tǒng))，第4版.1999，ElsevierScienceLtd/GarlandPublishing,NewYork)。FcY受體這個(gè)家族的每個(gè)成員都是整合的膜糖蛋白，具有與免疫球蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域的C2組有關(guān)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和長(zhǎng)度可變的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域。存在三種已知的FcyR,稱為FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。這三種受體由不同的基因編碼；然而，在三個(gè)家族成員之間的廣泛同源性表明它們可能由于基因重復(fù)而起源于共同的祖先。FcyRII(CD32)FcyRII蛋白是40kDa整合的膜糖蛋白，由于與單體Ig的低親和性(10，其僅結(jié)合復(fù)合的IgG。這個(gè)受體是最廣泛表達(dá)的FcyR，存在于所有造血細(xì)胞上，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血小板。FcyRII在其免疫球蛋白結(jié)合鏈中僅具有兩個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域，因而相比FcγRI與IgG的親和性低得多。存在三種人類FcγRII基因(FeyRII-A,FcyRII-B、FcyRII-C)，所有的都結(jié)合聚集物或免疫復(fù)合物中的IgG。FcγRII-A和FcγRII-B的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的明顯不同產(chǎn)生了對(duì)受體連接的兩種功能上異型的反應(yīng)(heterogenousresponse)0基本的差異是A同種型啟動(dòng)引起細(xì)胞活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，例如吞噬作用和呼吸爆發(fā)，而B同種型啟動(dòng)抑制性信號(hào)，例如抑制B細(xì)胞活化。FcyRIII(CD16)由于這一類中的異質(zhì)性，在小鼠和人類中FcYRIII的尺寸從40到SOkDa變化。兩種人類基因編碼兩種轉(zhuǎn)錄物，F(xiàn)cYRIIIA是整合的膜糖蛋白，F(xiàn)cYRIIIB是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-連接的形式。一種小鼠基因編碼與跨膜人類FcγRIIIA同源的FcγRIII。FcγRIII與其他兩種FcγR的每種共有結(jié)構(gòu)特征。與FcγRII相似，F(xiàn)cyRIII以低親和性結(jié)合IgG，并含有相應(yīng)的兩個(gè)細(xì)胞外Ig-樣結(jié)構(gòu)域。FcγRIIIA在巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞中表達(dá)，并是NK細(xì)胞中僅有的FcyR0目前已知GPI-連接的FcYRIIIB僅在人類嗜中性白細(xì)胞中表達(dá)。通過FcYR的信號(hào)傳導(dǎo)活化和抑制性信號(hào)都在連接之后通過FcYR轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些截然不同的功能是由不同的受體同種型之間的結(jié)構(gòu)差異引起的。在受體的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域內(nèi)、稱為基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)的兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，是所述不同的反應(yīng)的原因。不同的細(xì)胞質(zhì)酶對(duì)這些結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充決定了FcYR介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)果。含有ITAM的Fc^1復(fù)合物包括？(^11、？(^11認(rèn)、？(^111認(rèn)，而含有ITIM的復(fù)合物僅包括FcγRIIB。人類嗜中性白細(xì)胞表達(dá)FcγRIIA基因。FcγRIIA經(jīng)由免疫復(fù)合物或特異性抗體交聯(lián)的群集用來聚集ITAM和受體相關(guān)的激酶，所述激酶促進(jìn)ITAM的磷酸化。ITAM的磷酸化充當(dāng)了Syk激酶的停泊位點(diǎn)，所述Syk激酶的活化引起下游底物(例如，PI3K)的活化。細(xì)胞活化引起促炎性介質(zhì)的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)；它的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與FcγRIIA96%相同，并以不可區(qū)別的方式結(jié)合IgG復(fù)合物。在FcγRIIB的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中ITIM的存在決定了FcyR的這種抑制性亞類。近來，確定了這種抑制作用的分子基礎(chǔ)。當(dāng)與活化FCYR捆綁時(shí)，F(xiàn)cyRIIB中的ITIM變?yōu)榱姿峄?，并吸引肌醇多磷?，-磷酸酶(SHIP)的SH2結(jié)構(gòu)域，所述肌醇多磷酸5’-磷酸酶(SHIP)水解磷酸肌醇信使，從而防止細(xì)胞內(nèi)Ca++的流入，所述磷酸肌醇信使是作為含ITAM的FcγR介導(dǎo)的酪氨酸激酶活化的結(jié)果而釋放的。因而，F(xiàn)cyRIIB的交聯(lián)阻抑了對(duì)FcγR連接的活化反應(yīng)，并抑制細(xì)胞應(yīng)答。因而中止了B細(xì)胞活化、B細(xì)胞增殖和抗體分泌。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及共價(jià)雙抗體和/或共價(jià)雙抗體分子和共在治療多種疾病和病癥包括癌癥、自身免疫病癥、變應(yīng)性病癥和細(xì)菌、真菌或病毒引起的傳染病中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明的雙抗體可結(jié)合于兩個(gè)不同細(xì)胞上的兩個(gè)不同表位，其中第一表位與第二表位在不同細(xì)胞類型上表達(dá)，以使雙抗體可將兩種細(xì)胞帶到一起。在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種共價(jià)雙特異性雙抗體，所述共價(jià)雙特異性雙抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和任選地(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和任選地(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種共價(jià)雙特異性雙抗體，所述雙抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第三結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。在某些方面，本發(fā)明涉及一種雙抗體分子，所述分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種共價(jià)雙特異性雙抗體，所述雙抗體是雙抗體分子的二聚體，每個(gè)雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，()包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，()包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中各雙抗體分子的所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中各雙抗體分子的所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中各雙抗體分子的所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。在其他的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種共價(jià)四特異性雙抗體，所述雙抗體是雙抗體分子的二聚體，第一雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，()包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，()包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)；且第二雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第三表位特異性的第三免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL3)的結(jié)合區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第四表位特異性的第四免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH4)的結(jié)合區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第四免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL4)的結(jié)合區(qū)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第三免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH3)的結(jié)合區(qū)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第三表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VL3)(VH3)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第四表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL4)(VH4)。在本發(fā)明某些方面，第一表位、第二表位以及當(dāng)適用時(shí)第三表位和第四表位可以相同。在其他方面，第一表位、第二表位以及當(dāng)適用時(shí)第三表位和第四表位可以各自彼此不同。在本發(fā)明包含第三表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的某些方面，第一表位和第三表位可以相同。在本發(fā)明包含第四表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的某些方面，第一表位和第四表位可以相同。在本發(fā)明包含第三表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的某些方面，第二表位和第三表位可以相同。在本發(fā)明包含第四表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的某些方面，第二表位和第四表位可以相同。在本發(fā)明優(yōu)選方面，第一表位和第二表位不同。在本發(fā)明包含第三表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第四表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其他方面，第三表位和第四表位可以不同。應(yīng)理解的是，上述的任意組合包含在本發(fā)明中。在本發(fā)明具體方面，雙抗體或雙抗體分子的第一結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域可來源于相同免疫球蛋白。在另一方面，雙抗體或雙抗體分子的第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域可來源于相同免疫球蛋白。在另一方面，雙抗體或雙抗體分子的第一結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域可來源于不同免疫球蛋白。在另一方面，雙抗體或雙抗體分子的第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域可來源于不同免疫球蛋白。應(yīng)理解的是，上述的任意組合包含在本發(fā)明中。在本發(fā)明某些方面，雙抗體或雙抗體分子的第一(多肽鏈和第二多肽鏈之間的共價(jià)連接可經(jīng)由第一多肽鏈上的至少一個(gè)半胱氨酸殘基與第二多肽鏈上的至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。第一或第二多肽鏈上負(fù)責(zé)形成二硫鍵的半胱氨酸殘基可見于多肽鏈上任何地方，包括第一、第二、第三、第四、第五和第六結(jié)構(gòu)域中。在特定實(shí)施方案，第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基見于第一結(jié)構(gòu)域中，第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基見于第五結(jié)構(gòu)域中。第一、第二、第四和第五結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于負(fù)責(zé)結(jié)合的可變區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方案，負(fù)責(zé)在第一和第二多肽鏈之間形成二硫鍵的半胱氨酸殘基分別位于第三和第六結(jié)構(gòu)域中。在該實(shí)施方案的特定方面，第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO:23)，其可被氨基酸序列(SEQIDNO:17)編碼。在該實(shí)施方案的另一方面，第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO:23)，其可被氨基酸序列(SEQIDNO17)編碼。在該實(shí)施方案的另一方面，第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含來源于人類IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO:79)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO80)編碼。在該實(shí)施方案的另一方面，第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含來源于人類IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO:79)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO80)編碼。在該實(shí)施方案的某些方面，第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO:79)。在該實(shí)施方案的其他方面，第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO:79)。在該實(shí)施方案的其他方面，第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在該實(shí)施方案的其他方面，第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在該實(shí)施方案的其他方面，第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第一多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分。在該實(shí)施方案的其他方面，第二多肽鏈的第六結(jié)構(gòu)域包含人類κ輕鏈的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)；第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分。在其他實(shí)施方案，在第一或第二多肽上負(fù)責(zé)形成二硫鍵的半胱氨酸殘基可位于第一多肽鏈上第一、第二或第三結(jié)構(gòu)域之外和第二多肽鏈上第四、第五和第六結(jié)構(gòu)域之外。特別是，第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第一結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第一結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第二結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第二結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第三結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第三結(jié)構(gòu)域的C-末端。進(jìn)一步地，第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第四結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第四結(jié)構(gòu)域的C-末端。第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第五結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。相應(yīng)地，第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基可位于第六結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第六結(jié)構(gòu)域的C-末端。在特定方面，二硫鍵可在第一多肽鏈上至少兩個(gè)半胱氨酸殘基與第二多肽鏈上至少兩個(gè)半胱氨酸殘基之間。在特定方面，其中第三結(jié)構(gòu)域和第六結(jié)構(gòu)域不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分，半胱氨酸殘基可位于第一多肽鏈的C-末端和第二多肽鏈的C-末端。應(yīng)理解的是，上述的任意組合包含在本發(fā)明中。在上述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的共價(jià)雙抗體包括雙抗體分子的二聚體，其中各雙抗體分子包括第一和第二多肽鏈。在該實(shí)施方案的某些方面，雙抗體分子可共價(jià)連接以形成二聚體，條件是該共價(jià)連接不是肽鍵。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，該共價(jià)連接是二聚體的各雙抗體分子的第一多肽鏈上至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。在本發(fā)明的更優(yōu)選方面，該共價(jià)連接是形成二聚體的各雙抗體分子的第一多肽鏈上至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，其中所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基位于各第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域中。在本發(fā)明某些方面，第一多肽鏈上的第一結(jié)構(gòu)域可位于第二結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第二結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一多肽鏈上的第一結(jié)構(gòu)域可位于第三結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第三結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一多肽鏈上的第二結(jié)構(gòu)域可位于第一結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第一結(jié)構(gòu)域的C-末端。進(jìn)一步地，第一多肽鏈上的第二結(jié)構(gòu)域可位于第三結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第三結(jié)構(gòu)域的C-末端。相應(yīng)地，第一多肽鏈上的第三結(jié)構(gòu)域可位于第一結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第一結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一多肽鏈上的第三結(jié)構(gòu)域可位于第二結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第二結(jié)構(gòu)域的C-末端。對(duì)于第二多肽鏈，第四結(jié)構(gòu)域可位于第五結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。第四結(jié)構(gòu)域可位于第六結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第六結(jié)構(gòu)域的C-末端。第二多肽鏈上的第五結(jié)構(gòu)域可位于第四結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第四結(jié)構(gòu)域的C-末端。第二多肽鏈上的第五結(jié)構(gòu)域可位于第六結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第六結(jié)構(gòu)域的C-末端。相應(yīng)地，第二多肽鏈上的第六結(jié)構(gòu)域可位于第四結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第四結(jié)構(gòu)域的C-末端。第二多肽鏈上的第六結(jié)構(gòu)域可位于第五結(jié)構(gòu)域的N-末端或可位于第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。應(yīng)理解的是，上述的任意組合包含在本發(fā)明中。在某些實(shí)施方案，第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域可位于第一多肽鏈上第三結(jié)構(gòu)域的C-末端；或第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域可位于第一多肽鏈上第三結(jié)構(gòu)域的N-末端。對(duì)于第二多肽鏈，第四結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域可位于第六結(jié)構(gòu)域的C-末端；或第四結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域可位于第六結(jié)構(gòu)域的N-末端。在該實(shí)施方案的某些方面，本發(fā)明涉及一種共價(jià)雙特異性雙抗體，所述雙抗體是雙抗體分子的二聚體，每個(gè)雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)且其中所述第三結(jié)構(gòu)域位于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域兩者的N-末端；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中各雙抗體分子的所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中各雙抗體分子的所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中各雙抗體分子的所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種共價(jià)四特異性雙抗體，所述雙抗體是雙抗體分子的二聚體，第一雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，()包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)且其中所述第三結(jié)構(gòu)域位于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域兩者的N-末端；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)；且第二雙抗體分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第三表位特異性的第三免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL3)的結(jié)合區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域，()包含對(duì)第四表位特異性的第四免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH4)的結(jié)合區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)且其中所述第三結(jié)構(gòu)域位于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域兩者的N-末端；且所述第二多肽鏈包括(i)包含第四免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL4)的結(jié)合區(qū)的第四結(jié)構(gòu)域，()包含第三免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH3)的結(jié)合區(qū)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；且其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈共價(jià)連接，條件是所述共價(jià)連接不是肽鍵；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第三表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VL3)(VH3)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合第四表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL4)(VH4)。如上討論的，單獨(dú)多肽鏈上的結(jié)構(gòu)域是共價(jià)連接的。在具體方面，第一和第二結(jié)構(gòu)域之間、第一和第三結(jié)構(gòu)域之間、第二和第三結(jié)構(gòu)域之間、第四和第五結(jié)構(gòu)域之間、第四和第六結(jié)構(gòu)域之間、和/或第五和第六結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接可為肽鍵。特別是，第一和第二結(jié)構(gòu)域、第四和第五結(jié)構(gòu)域可分別被第三結(jié)構(gòu)域和第六結(jié)構(gòu)域間隔或被另外的氨基酸殘基間隔，只要第一和第二、第四和第五結(jié)構(gòu)域不締合形成結(jié)合位點(diǎn)。氨基酸殘基的數(shù)目可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選方面，結(jié)構(gòu)域之間氨基酸殘基的數(shù)目是8。在本發(fā)明某些方面，第一和第二多肽鏈的結(jié)構(gòu)域包括Fc結(jié)構(gòu)域，即任選地第三和第六結(jié)構(gòu)域分別可進(jìn)一步包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域以使該結(jié)構(gòu)域包含鉸鏈-Fc區(qū)。在替代實(shí)施方案，第一多肽鏈或第二多肽鏈可包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域而不還包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。用于本發(fā)明的重鏈、輕鏈、鉸鏈區(qū)、Fc結(jié)構(gòu)域和/或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域可來源于任何免疫球蛋白類型，包括IgA,IgD,IgE,IgG或IgM。在優(yōu)選方面，該免疫球蛋白類型是IgG或其任何亞型，即IgG1.IgG2,IgG3或IgG4。在其他方面，輕鏈和重鏈所來源于的免疫球蛋白是人源化或嵌合的。進(jìn)一步地，雙抗體或雙抗體分子對(duì)其結(jié)合的第一表位和第二表位以及當(dāng)適用時(shí)第三表位和第四表位可以是來自相同抗原的不同表位或可以是來自不同抗原的不同表位。抗原可以是可對(duì)其產(chǎn)生抗體的任何分子。例如，蛋白、核酸、細(xì)菌毒素、細(xì)胞表面標(biāo)記、自身免疫標(biāo)記、病毒蛋白、藥物等。在具體方面，雙抗體的至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)特定細(xì)胞上的抗原特異性的，諸如B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或樹突細(xì)胞。在本實(shí)施方案的某些方面，雙抗體或雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)Fc受體特異性的，該Fc受體可為活化性Fc受體或抑制性Fc受體。在具體方面，該Fc受體是Fcy受體，該Fcγ受體是FcγRI、FcYRII或FcYRIII受體。在更優(yōu)選方面，該FcγRIII受體是FcyRIIIA(CD16A)受體或FcγRIIIB(CD16B)受體，更優(yōu)選地，該FcγRIII受體是FcyRIIIA(CD16A)受體。在另一優(yōu)選方面，該FcγRII受體是FcγRIIA(CD32A)受體或FcyRIIB(CD32B)受體，更優(yōu)選地是FcγRIIB(CD32B)受體。在特別優(yōu)選方面，雙抗體的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的，另一結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。在本發(fā)明特定實(shí)施方案，雙抗體或雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)活化性Fc受體特異性的，至少一個(gè)其他位點(diǎn)是對(duì)抑制性Fc受體特異性的。在該實(shí)施方案的某些方面，該活化性Fc受體是CD32A，該抑制性Fc受體是CD32B。在該實(shí)施方案的其他方面，該活化性Fc受體是BCR，該抑制性Fc受體是CD32B。在該實(shí)施方案的其他方面，該活化性Fc受體是IgERI，該抑制性Fc受體是CD32B。在一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)⑶16A特異性的情形，VL和VH結(jié)構(gòu)域可與小鼠抗體3G8的VL和VH結(jié)構(gòu)域相同或相似，小鼠抗體3G8的序列已被克隆并列在本文。在一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32A特異性的其他情形，VL和VH結(jié)構(gòu)域可與小鼠抗體IV.3的VL和VH結(jié)構(gòu)域相同或相似。在一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的其他情形，VL和VH結(jié)構(gòu)域可與小鼠抗體2B6的VL和VH結(jié)構(gòu)域相同或相似，小鼠抗體2B6的序列已被克隆并列在本文。應(yīng)理解的是，3G8、2B6和IV.3抗體的任何VL或VH結(jié)構(gòu)域可以任何組合使用。本發(fā)明還涉及雙特異性雙抗體或雙抗體分子，其中第一表位是對(duì)CD32B特異性的，第二表位是對(duì)CD16A特異性的。在其他方面，表位結(jié)合位點(diǎn)可為對(duì)致病抗原特異性的。如在此使用的，致病抗原是具體病原性疾病包括癌癥、感染和自身免疫疾病中牽涉的抗原。因此，致病抗原可為腫瘤抗原、細(xì)菌抗原、病毒抗原或自身免疫抗原。示例性致病抗原包括但不限于脂多糖、選自人類免疫缺陷病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncitialVirus)、西尼羅病毒(如E16和/或E53抗原)和肝炎病毒的病毒抗原組成的組的病毒抗原、核酸(DNA和RNA)和膠原。優(yōu)選地，該致病抗原是中和抗原。在優(yōu)選方面，當(dāng)一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)對(duì)CD16A或CD32A是特異性時(shí)，另一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)自身免疫抗原以外的致病抗原特異性的。在另一優(yōu)選方面，當(dāng)一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的時(shí)，另一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)任何致病抗原特異性的。在特定實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子結(jié)合于相同細(xì)胞上的兩個(gè)不同抗原，例如，一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)活化性Fc受體特異性的，而另一個(gè)是對(duì)抑制性Fc受體特異性的。在其他實(shí)施方案，雙抗體分子結(jié)合于兩個(gè)不同的病毒中和表位，例如但不限于，西尼羅病毒的E16和E53。在本發(fā)明另一實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體可用于治療多種疾病和病癥。因此，本發(fā)明涉及治療疾病或病癥的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本發(fā)明共價(jià)雙抗體或雙抗體分子，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)致病抗原特異性的，所述致病抗原諸如癌癥細(xì)胞表面上或細(xì)菌或病毒粒子表面上表達(dá)的抗原，且至少一個(gè)其他結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)Fc受體如CD16A特異性的。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及治療疾病或病癥的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本發(fā)明雙抗體或雙抗體分子，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的，至少一個(gè)其他結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)對(duì)致病抗原免疫耐受的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本發(fā)明共價(jià)雙抗體或共價(jià)雙抗體分子，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的，至少一個(gè)其他結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)所述致病抗原特異性的。在該實(shí)施方案的方面，該致病抗原可為期望對(duì)其免疫耐受的變應(yīng)原或另一分子，諸如移植組織上表達(dá)的蛋白。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及解毒方法，包括向需要其的患者施用有效量的本發(fā)明共價(jià)雙抗體或雙抗體分子，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記特異性的，至少一個(gè)其他結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)毒素特異性的。在具體方面，施用的本發(fā)明雙抗體是其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記諸如Fc特異性的，另一結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)細(xì)菌毒素或?qū)λ幬锾禺愋缘碾p抗體。一方面，該細(xì)胞表面標(biāo)記未見于紅細(xì)胞上。3.1定義除非另外指明，否則本文所用的所有領(lǐng)域術(shù)語、表示法和其他科學(xué)術(shù)語或命名法意為具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。在一些情形，為了清楚和/或便于參考，具有通常理解的含義的術(shù)語在本文定義，本文并入這些定義不必被解釋為代表具有超出本領(lǐng)域通常理解的顯著差別。除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些在本領(lǐng)域技術(shù)中。這些技術(shù)充分描述于文獻(xiàn)，諸如，CurrentProtocolsinImmunology(免疫學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案)(J.E.Coligan等人編輯，1999，包括到2001年的增刊)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案)(F.Μ.Ausubel等人編輯，1987，包括到2001年的增刊)；MolecularCloning=ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第三版(Sambrook和Russel，2001)；PCRThePolymeraseChainReaction(PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，(Mullis等人編輯，1994)；TheImmunoassayHandbook(免疫測(cè)定手冊(cè))(D.Wild編輯，StocktonPressNY,1994)；BioconjugateTechniques(生物輒合技術(shù))(GregΤ·Hermanson編輯，AcademicPress,1996)；MethodsofImmunologicalAnalysis^fe)(R-Masseyeff>ff.H.Albert禾口N.A.Staines編輯，Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH,1993)，Harlow禾口LaneUsingAntibodies:ALaboratoryManual(使用抗體的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1999；禾口Beaucage等人編輯，CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(核酸化學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案)JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork,2000)。如在此使用的，術(shù)語“抗體”和“多個(gè)抗體”是指單克隆抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv(SCFV)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab，)片段、二硫化物連接的雙特異性Fv(sdFv)、內(nèi)抗體(intrabodies)和抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括，例如，針對(duì)本發(fā)明的抗體的抗Id和抗-抗Id抗體)和任何上述抗體的表位結(jié)合片段。特別是，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如，IgG1,IgG2,IgG3、IgG4,IgA1和IgA2)或亞類。如在此使用的，術(shù)語“免疫特異性地結(jié)合”、“免疫特異性地識(shí)別”、“特性地結(jié)合”、“特異性地識(shí)別”和類似術(shù)語是指特異性地結(jié)合于抗原(如，表位或免疫復(fù)合物)而不特異性地結(jié)合于另一分子的分子。特異性地結(jié)合于抗原的分子可以較低親和性結(jié)合于其他肽或多肽，如以免疫測(cè)定、BIAcore或本領(lǐng)域已知的其他測(cè)定確定的。優(yōu)選地，特異性地結(jié)合抗原的分子不與其他蛋白交叉反應(yīng)?？设b定特異性地結(jié)合抗原的分子，例如通過免疫測(cè)定、BIAcore或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)。如在此使用的，“免疫復(fù)合物”是指當(dāng)至少一個(gè)靶分子和至少一個(gè)含有異源FcY區(qū)的多肽彼此結(jié)合，形成更大分子量的復(fù)合物時(shí)形成的結(jié)構(gòu)。免疫復(fù)合物的實(shí)例是抗原-抗體復(fù)合物，其可以是可溶的或是顆粒(如，細(xì)胞表面上的抗原/抗體復(fù)合物)。如在此使用的，術(shù)語“重鏈，，、“輕鏈，，、“可變區(qū)，，、“框架區(qū)，，、“恒定結(jié)構(gòu)域，，和類似術(shù)語具有免疫學(xué)領(lǐng)域中的通常含義，是指天然存在的免疫球蛋白中的結(jié)構(gòu)域和合成(如，重組)結(jié)合蛋白(如，人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體等)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域。天然存在的免疫球蛋白(如，IgG)的基本結(jié)構(gòu)單元是四聚體，具有兩條輕鏈和兩條重鏈，通常表達(dá)為約150，OOODa的糖蛋白。各鏈的氨基末端(“N”)部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110或更多氨基酸的可變區(qū)。各鏈的羧基-末端(“C”)部分界定恒定區(qū)，輕鏈具有單個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，重鏈通常具有三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)。因此，IgG分子輕鏈的結(jié)構(gòu)是n-VfC^C，IgG重鏈的結(jié)構(gòu)是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-C(其中H是鉸鏈區(qū))。IgG分子的可變區(qū)由互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)組成，互補(bǔ)決定區(qū)包含接觸抗原和非-CDR區(qū)段(稱為框架區(qū)段)的殘基，通常保持結(jié)構(gòu)并決定CDR環(huán)的位置(盡管某些框架殘基可能還接觸抗原)。因此，VL和VH結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)n-FRl、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-C。當(dāng)提到結(jié)合蛋白或抗體(如本文寬泛定義的)時(shí)，將氨基酸分配到各結(jié)構(gòu)域是根據(jù)Kabat,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)上重要蛋白的序列)(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991)的定義。免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸由鏈中氨基酸的位置指定。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑒定了各亞組的氨基酸共有序列，并對(duì)各氨基酸指定了殘基號(hào)。Kabat的編號(hào)方案可延伸到不包括在其綱要中的抗體，通過參考保守氨基酸比對(duì)該抗體與Kabat的共有序列之一。指定殘基號(hào)的這種方法已經(jīng)變成在本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法，容易地鑒定包括嵌合或人源化變體的不同抗體中相應(yīng)位置的氨基酸。例如，人類抗體輕鏈位置50的氨基酸占據(jù)與小鼠抗體輕鏈位置50的氨基酸相應(yīng)的位置。如在此使用的，術(shù)語“重鏈”用于定義IgG抗體的重鏈。在完整的天然IgG中，重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH、CH1、鉸鏈、CH2和CH3。本說明書中，IgG重鏈中殘基的編號(hào)是根據(jù)Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunoloRicalInterest(免疫學(xué)上重要蛋白的序列)，第5版.PublicHealthService,NHl,MD(1991)中所述的EU索引，該文獻(xiàn)通過引用明確并入本文?！癒abat的EU索引”是指人類IgGlEU抗體的編號(hào)。包含人類IgGl鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的實(shí)例顯示在下述的圖IA和1B。圖IA和IB還列出了IgG2、IgG3和IgG4重鏈的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。將IgG2、IgG3和IgG4同種型的氨基酸序列與IgGl序列比對(duì)，通過將各自鉸鏈區(qū)的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基(其形成重鏈內(nèi)S-S鍵)放置到相同位置。對(duì)于IgG2和IgG3鉸鏈區(qū)，不是所有殘基都被EU索引編號(hào)?！般q鏈區(qū)”或“鉸鏈結(jié)構(gòu)域”通常界定為從人類IgGl的Glu216延伸到Pro230。人類IgGl鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的實(shí)例顯示在圖1A(圖IA中的氨基酸殘基根據(jù)Kabat系統(tǒng)編號(hào))?？蓪⑵渌鸌gG同種型的鉸鏈區(qū)與IgGl序列比對(duì)，通過將第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基(其形成重鏈內(nèi)S-S鍵)放置到相同位置，如圖IA所示。如在此使用的，使用術(shù)語“Fe區(qū)”、“Fe結(jié)構(gòu)域”或類似術(shù)語來定義IgG重鏈的C-末端區(qū)域。含有人類IgGl的氨基酸序列實(shí)例示于圖1B。盡管根據(jù)Kabat系統(tǒng)編號(hào)，邊界可以稍微地不同，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域從氨基酸231延伸到氨基酸447(圖IB中氨基酸殘基根據(jù)Kabat系統(tǒng)編號(hào))。圖IB還提供IgG同種型IgG2、IgG3和IgG4的Fc區(qū)的氨基酸序列實(shí)例。IgG的Fc區(qū)包含兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CH2和CH3。人類IgGFc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域通常從根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸231延伸到氨基酸341(圖1B)。人類IgGFc區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域通常從根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸342延伸到447(圖1B)。人類IgGFc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域(還稱為“Cγ2”結(jié)構(gòu)域)是獨(dú)特的，因?yàn)槠洳慌c另一結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。而是，兩條N-連接的分支的糖類鏈介于完整天然IgG的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。如在此使用的，術(shù)語“FeγR結(jié)合蛋白”、"FcyR抗體”和“抗FcγR抗體”可交換地使用，并指多種免疫球蛋白-樣或免疫球蛋白_衍生的蛋白。“FcyR結(jié)合蛋白”經(jīng)由與VL和/或VH結(jié)構(gòu)域的相互作用而結(jié)合FcγR(不同于Fcγ-介導(dǎo)的結(jié)合)。FcyR結(jié)合蛋白的實(shí)例包括完全人類、多克隆、嵌合和人源化抗體(如，包含2重鏈和2輕鏈)、其片段(如，F(xiàn)ab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段)、雙功能或多功能抗體(參見例如，Lanzavecchia等人(1987)"TheUseOfHybridHybridomasToTargetHumanCytotoxicTLymphocytes(使用雜合的雜交瘤來靶向人類細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)”Eur.J.Immunol.17:105_111)、單鏈抗體(參見例如，Bird等人(1988)"Single-ChainAntigen-BindingProteins(單鏈抗原-結(jié)合蛋白)"Science242:423_26)、融合蛋白(如，噬菌體展示融合蛋白)、“微型抗體(minibodies)”(參見例如，美國(guó)專利第5，837，821號(hào))和包含Vl和/或Vh結(jié)構(gòu)域或其片段的其他抗原結(jié)合蛋白。一方面，F(xiàn)cγRIIIA結(jié)合蛋白是“四聚抗體”，即通常具有天然存在的IgG的結(jié)構(gòu)，包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域，即，包含\結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的兩條輕鏈和包含Vh結(jié)構(gòu)域、重鏈鉸鏈和恒定結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈。如在此使用的，術(shù)語“FeγR拮抗劑”和類似術(shù)語是指蛋白和非_蛋白性物質(zhì)，包括拮抗FcγR至少一種生物活性如，封閉信號(hào)傳導(dǎo)的小分子。例如，本發(fā)明的分子通過封閉IgG對(duì)FcγR的結(jié)合而封閉信號(hào)傳導(dǎo)。如在此使用的，在多肽或蛋白質(zhì)的上下文中術(shù)語“衍生物”是指包含已經(jīng)通過引入氨基酸殘基取代、缺失或添加而改變的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。如在此使用的術(shù)語“衍生物”還指一種多肽或蛋白質(zhì)，其已經(jīng)被修飾，即，通過將任何類型的分子共價(jià)附著到多肽或蛋白質(zhì)上。例如，而不是限制，抗體可以被修飾，例如，通過糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解性裂解、連接到細(xì)胞抗原或其他蛋白，等等?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行化學(xué)修飾，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲酰化、衣霉素的代謝合成，等等，來產(chǎn)生衍生多肽或蛋白。進(jìn)一步地，衍生的多肽或蛋白衍生物具有與衍生它們的多肽或蛋白類似的或相同的功能。如在此使用的，在非蛋白類衍生物的上下文中術(shù)語“衍生物”是指基于第一有機(jī)或無機(jī)分子的結(jié)構(gòu)形成的第二有機(jī)或無機(jī)分子。有機(jī)分子的衍生物包括但不限于，例如通過添加或缺失羥基、甲基、乙基、羧基或胺基而修飾的分子。有機(jī)分子也可以被酯化、烷基化和/或磷酸化。如在此使用的，術(shù)語“雙抗體分子”是指兩個(gè)或多個(gè)多肽鏈或蛋白的復(fù)合物，所述多肽鏈或蛋白各包含至少一個(gè)VL和一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域或其片段，其中兩種結(jié)構(gòu)域包含在單條多肽鏈中。在某些實(shí)施方案，“雙抗體分子”包括包含F(xiàn)c或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域的分子。復(fù)合物中的所述多肽鏈可以相同或不同，即，雙抗體分子可以是同多聚體或異多聚體。在具體方面，“雙抗體分子”包括二聚體或四聚體或包含VL和VH結(jié)構(gòu)域兩者的所述多肽鏈。構(gòu)成多聚蛋白的單個(gè)多肽鏈可由鏈間二硫鍵共價(jià)連接于多聚體的至少一個(gè)其他肽。如在此使用的，術(shù)語“病癥”和“疾病”可互換地使用來指受治療者中的狀況。特別地，術(shù)語“自身免疫疾病”與術(shù)語“自身免疫病癥”可互換地使用，來指在受治療者中以由受治療者對(duì)他自己的細(xì)胞、組織和/或器官的免疫反應(yīng)引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的狀況。術(shù)語“炎癥疾病”與術(shù)語“炎癥病癥”可互換地使用，來指在受治療者中以炎癥、優(yōu)選地慢性炎癥為特征的狀況。自身免疫病癥可能或可能不伴隨炎癥。此外，炎癥可能或可能不由自身免疫病癥引起。因而，某些病癥可能以自身免疫和炎性病癥為特征。如在此使用的，“相同多肽鏈”還指具有幾乎相同氨基酸序列的多肽鏈，例如，包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸差異，優(yōu)選地保守氨基酸取代的鏈，以使兩條多肽鏈的活性不顯著地不同。如在此使用的，術(shù)語“癌癥”是指由異常的不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)引起的贅生物或腫瘤。如在此使用的，癌癥明確地包括白血病和淋巴瘤。在某些實(shí)施方案中，癌癥是指良性腫瘤，其是保持局部化的。在其他實(shí)施方案中，癌癥是指惡性腫瘤，其侵入和破壞了鄰近的身體結(jié)構(gòu)并擴(kuò)散到遠(yuǎn)處位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，癌癥與特異性癌抗原有關(guān)。如在此使用的，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”和其變體是指調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)的藥劑。在某些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑是免疫抑制劑。在某些其他實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑是免疫刺激劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗體、無機(jī)分子、模擬劑和有機(jī)分子。如在此使用的，術(shù)語“表位”是指在動(dòng)物中、優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物中、和最優(yōu)選地在人類中具有抗原性或免疫原性的活性的多肽或蛋白或非蛋白分子的片段。具有免疫原性活性的表位是在動(dòng)物中引發(fā)抗體反應(yīng)的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法，例如通過免疫測(cè)定來確定的抗體免疫特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的片段?？乖员砦徊槐匾欢ㄊ敲庖咴缘摹Ｈ缭诖耸褂玫?，術(shù)語“片段”是指肽或多肽，其包含另一個(gè)多肽的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)80個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)90個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)100個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)125個(gè)氨基酸殘基、至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)175個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)200個(gè)氨基酸殘基或至少連續(xù)250個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。在特定實(shí)施方案，多肽的片段保持所述多肽的至少一種功能。如在此使用的，術(shù)語“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA),RNA分子(例如，mRNA),DNA和RNA分子的組合或雜交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的類似物。可以使用例如核苷酸類似物來產(chǎn)生這種類似物，所述核苷酸類似物包括但不限于肌苷或三甲基化堿基。這種類似物也可以包括DNA或RNA分子，其包含給分子帶來有益特質(zhì)的修飾的框架，所述特質(zhì)例如核酸酶抗性或提高的跨細(xì)胞膜能力。所述核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，可以含有單鏈和雙鏈的部分，可以含有三鏈的部分，但優(yōu)選的是雙鏈DNA。如在此使用的，“治療有效量”是指足以治療或控制疾病或病癥的治療劑的量。治療有效量可以指足夠延遲或最小化疾病的發(fā)作，例如延遲或最小化癌癥的擴(kuò)散的治療劑的量。治療有效量也可以指在疾病的治療或控制中提供治療益處的治療劑的量。進(jìn)一步地，對(duì)于本發(fā)明的治療劑，治療有效量意思是在疾病的治療或控制中提供治療益處的、單獨(dú)的或與其他治療組合的治療劑的量。如在此使用的，術(shù)語“預(yù)防劑”或“多種預(yù)防劑”是指可用于預(yù)防病癥或防止病癥復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的任何藥劑。預(yù)防有效量可以指足以在患者，包括但不限于易感染高增殖性疾病的那些患者，例如遺傳地易感染癌癥或早先暴露于致癌物質(zhì)的那些患者中，防止高增殖性疾病、特別是癌癥的復(fù)發(fā)或擴(kuò)散、或這種疾病的發(fā)生的預(yù)防劑的量。預(yù)防有效量也可以指在疾病的預(yù)防中提供預(yù)防性益處的預(yù)防劑的量。進(jìn)一步地，對(duì)于本發(fā)明的預(yù)防劑，預(yù)防有效量意思是在疾病的預(yù)防中提供預(yù)防益處的、單獨(dú)的或與其他藥劑組合的預(yù)防劑的量。如在此使用的，術(shù)語“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(preventing)”和“預(yù)防(prevention)”)”是指作為施用預(yù)防劑或治療劑的結(jié)果在受治療者中防止病癥的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)或發(fā)作。如在此使用的，術(shù)語“組合”是指使用多于一種預(yù)防和/或治療劑。使用術(shù)語“組合”不限制向患有病癥的受治療者施用預(yù)防劑和/或治療劑的順序。第一預(yù)防劑或治療劑可以在向患有病癥的受治療者施用第二預(yù)防劑或治療劑之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)、伴隨地、或隨后(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后)施用。如在此使用的“效應(yīng)物功能”是指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或抗原的相互作用引起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)物功能包括但不限于抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。效應(yīng)物功能包括在抗原的結(jié)合之后作用的那些以及獨(dú)立于抗原結(jié)合作用的那些。如在此使用的“效應(yīng)細(xì)胞”是指表達(dá)一種或多種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)物功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞，可以來自任何有機(jī)體，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、兔和猴。如在此使用的，術(shù)語“特異性地結(jié)合免疫復(fù)合物”和類似術(shù)語是指特異性地結(jié)合于免疫復(fù)合物而不特異性地結(jié)合于另一分子的分子。特異性地結(jié)合于免疫復(fù)合物的分子可以較低親和性結(jié)合于其他肽或多肽，如以免疫測(cè)定、BIAcore或本領(lǐng)域已知的其他測(cè)定確定的。優(yōu)選地，特異性地結(jié)合免疫復(fù)合物的分子不與其他蛋白交叉反應(yīng)。可鑒定特異性地結(jié)合免疫復(fù)合物的分子，例如通過免疫測(cè)定、BIAcore或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)。如在此使用的，“穩(wěn)定融合蛋白”是指一種融合蛋白，其在制備和/或儲(chǔ)存期間經(jīng)歷最小到不可測(cè)水平的降解，如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用生化和功能測(cè)定評(píng)估的，并可長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存而不喪失生物活性，如，結(jié)合于FcyR04.附圖簡(jiǎn)述圖IA-B人類IgGCH1、鉸鏈和Fc區(qū)的氨基酸序列圖1提供人類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4鉸鏈㈧和Fc⑶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。(IgGl鉸鏈結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO1)；IgG2鉸鏈結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO2)；IgG3鉸鏈結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO3)；IgG4鉸鏈結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO4)；IgGlFc結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO5)；IgG2Fc結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO6)；IgG3Fc結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO7)；IgGlFc結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:8))。圖IA和IB所示的氨基酸殘基根據(jù)KabatEU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)。將同種型序列與IgGl序列比對(duì)，通過將各自鉸鏈區(qū)的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基(其形成重鏈內(nèi)S-S鍵)放置到相同位置。對(duì)于圖1B，CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基標(biāo)為+，而CH3結(jié)構(gòu)域中的殘基標(biāo)為。圖2共價(jià)雙功能雙抗體的多肽鏈的示意表示共價(jià)、雙功能雙抗體的多肽由被短肽接頭分開的抗體VL和抗體VH結(jié)構(gòu)域組成。8氨基酸殘基的接頭阻止單個(gè)多肽鏈自組裝為scFv構(gòu)建體，相反，不同多肽鏈的VL和VH結(jié)構(gòu)域之間的相互作用占優(yōu)勢(shì)。產(chǎn)生4種構(gòu)建體(各構(gòu)建體以從構(gòu)建體左側(cè)的氨基末端(“η”)到圖右側(cè)的羧基末端(“C”)來描述)構(gòu)建體(1)(SEQIDNO9)包含n-Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))_Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端序列(LGGC)-C；構(gòu)建體(2)(SEQIDNO11)包含n_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO:10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端序列(LGGC)_c；構(gòu)建體(3)(SEQIDNO12)包含n-Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))_Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端序列(LGGC)-C；構(gòu)建體(4)(SEQIDNO13)包含n_Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端序列(LGGC)-C。圖3親和純化的雙抗體的SDS-PAGE分析對(duì)親和純化的雙抗體進(jìn)行還原(泳道1-3)或非還原(泳道4-6)條件下的SDS-PAGE分析。標(biāo)出了標(biāo)準(zhǔn)品的近似分子量(泳道3和4之間)。泳道1和4，h3G8CMD；泳道2禾口5，h2B6CMD；泳道3禾口6，h2B6_h3G8CBD。圖4A-B親和純化的雙抗體的SEC分析對(duì)親和純化的雙抗體進(jìn)行SEC分析。(A)已知標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖全長(zhǎng)IgG(150kDa)、IgG的Fab片段(50kDa)禾ΠscFv(30kDa)；(B)h2b6CMD、h3G8CMD禾口h2B6-h3G8CBD的洗脫圖。圖5h2B6-h3G8CBD對(duì)sCD32B和sCD16A的結(jié)合h2B6-h3G8CBD對(duì)sCD32B和sCD16A的結(jié)合在三明治ELISA中測(cè)定。sCD32B用作靶蛋白。第二探針是HRP軛合的s⑶16A。結(jié)合⑶16A的h3G8CMD用作對(duì)照。圖6A-CBIAC0RE分析雙抗體對(duì)sCD16A、SCD32B和sCD32B的結(jié)合由SPR分析測(cè)定h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD禾Πh3G8CMD對(duì)sCD16A、sCD32B和s⑶32A(陰性對(duì)照)的結(jié)合。還檢測(cè)h3G8scFv作為對(duì)照。(A)對(duì)s⑶16的結(jié)合；(B)對(duì)SCD32B的結(jié)合和(C)對(duì)SCD32A的結(jié)合。以100NM的濃度注射雙抗體，以200nM的濃度注射scFv到受體表面上，以50ml/min的流速持續(xù)60sec。圖7A-CBIAC0RE分析雙抗體對(duì)sCD16A和SCD32B的結(jié)合由SPR分析測(cè)定h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD和h3G8CMD對(duì)sCD16A和sCD32B的結(jié)合。還檢測(cè)h3G8scFv作為對(duì)照。(A)h3G8CMD對(duì)sCD16A的結(jié)合；⑶h2B6_h3G8CBD對(duì)sCD16A的結(jié)合；(C)h3G8scFv對(duì)sCD16A的結(jié)合；(D)h2B6CMD對(duì)sCD32B的結(jié)合；和(E)h2B6-h3G8CBD對(duì)sCD32B的結(jié)合。以6.25_200nM的濃度注射雙抗體到受體表面上，以70ml/min的流速持續(xù)180sec。圖8描繪包含VL和VH結(jié)構(gòu)域的多肽鏈相互作用以形成共價(jià)雙特異性雙抗體分子的示意圖NH2和COOH分別表示各多肽鏈的氨基-末端和羧基末端。S表示各多肽鏈上的C-末端半胱氨酸殘基。VL和VH分別表示可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和可變重鏈結(jié)構(gòu)域。點(diǎn)線和短劃線是為了區(qū)別兩條多肽鏈，特別是，表示所述鏈的接頭部分。h2B6Fv和h3G8Fv分別表示對(duì)⑶32B和⑶16特異性的表位結(jié)合位點(diǎn)。圖9包含共價(jià)雙特異性雙抗體的Fc結(jié)構(gòu)域的多肽鏈的示意表示表示本發(fā)明雙抗體分子的多肽構(gòu)建體(各構(gòu)建體以從構(gòu)建體左側(cè)的氨基末端(“η”)到圖右側(cè)的羧基末端(“c”)來描述)。構(gòu)建體(5)(SEQIDNO14)包含n-Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域-第一接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO:10))_Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-第二接頭(LGGC)-和人類IgGl-c的C-末端Fc結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建體(6)(SEQIDNO:15)包含n_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO:10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-和第二接頭(LGGC)-和人類IgGl-c的C-末端Fc結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建體(7)(SEQIDNO16)包含n-Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域-第一接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))_Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端序列(LGGCFNRGEC)(SEQIDNO:17)-c；構(gòu)建體(8)(SEQIDNO18)包含n_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-和第二接頭(LGGC)-和人類IgGl(具有氨基酸取代A215V)-c的C-末端鉸鏈/Fe結(jié)構(gòu)域。圖10包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)s⑶32B和s⑶16A的結(jié)合在三明治ELISA中測(cè)定包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)s⑶32B和s⑶16A的結(jié)合。測(cè)定的雙抗體由3個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染PMGX669和pMGX674，分別表達(dá)構(gòu)建體1和6；共轉(zhuǎn)染pMGX667和pMGX676，分別表達(dá)構(gòu)建體2和5；和共轉(zhuǎn)染pMGX674和pMGX676，分別表達(dá)構(gòu)建體5和6。s⑶32B用作靶蛋白。第二探針是HRP軛合的s⑶16A。圖11描繪各包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的兩條多肽鏈相互作用以形成二價(jià)的共價(jià)雙抗體的示意圖NH2和COOH分別表示各多肽鏈的氨基-末端和羧基末端。S表示各多肽鏈第二接頭序列中半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵。VL和VH分別表示可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和可變重鏈結(jié)構(gòu)域。點(diǎn)線和短劃線是為了區(qū)別兩條多肽鏈，特別是，表示所述鏈的第一接頭部分。CH2和CH3表示Fc結(jié)構(gòu)域的CH2和CH3恒定結(jié)構(gòu)域。h2B6Fv和h3G8Fv分別表示對(duì)CD32B和CD16特異性的表位結(jié)合位點(diǎn)。圖12包含鉸鏈/Fe結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)s⑶32B和s⑶16A的結(jié)合在三明治ELISA中測(cè)定包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)s⑶32B和s⑶16A的結(jié)合。測(cè)定的雙抗體由4個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染pMGX669+pMGX674，分別表達(dá)構(gòu)建體1和6；共轉(zhuǎn)染pMGX669+pMGX678，分別表達(dá)構(gòu)建體2和8；共轉(zhuǎn)染pMGX677+pMGX674，分別表達(dá)構(gòu)建體7和6；和共轉(zhuǎn)染pMGX677+pMGX678，分別表達(dá)構(gòu)建體7和8。s⑶32B用作靶蛋白。第二探針是HRP軛合的s⑶16A。圖13描繪多肽鏈相互作用以形成四聚雙抗體分子的示意圖NH2和COOH分別表示各多肽鏈的氨基-末端和羧基末端。S表示帶有Fc的‘較重’多肽鏈的第二接頭序列中的半胱氨酸殘基與不帶有Fc的‘較輕’多肽鏈C-末端序列中半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵。VL和VH分別表示可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和可變重鏈結(jié)構(gòu)域。點(diǎn)線和短劃線是為了區(qū)別兩條多肽鏈，特別是，表示所述較重鏈的第一接頭部分或所述較輕鏈的接頭。CH2和CH3表示Fc結(jié)構(gòu)域的CH2和CH3恒定結(jié)構(gòu)域。h2B6Fv和h3G8Fv分別表示對(duì)CD32B和CD16特異性的表位結(jié)合位點(diǎn)。圖14包含形成共價(jià)雙特異性雙抗體的Fc結(jié)構(gòu)域的多肽鏈的示意表示表示形成本發(fā)明雙抗體分子的多肽構(gòu)建體(各構(gòu)建體以從構(gòu)建體左側(cè)的氨基末端(“η，，)到圖右側(cè)的羧基末端(“C”)來描述)。構(gòu)建體(9)(SEQIDNO19)包含η-人類IgGl的鉸鏈/Fe結(jié)構(gòu)域-Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-和C-末端LGGC序列-c；構(gòu)建體(10)(SEQIDNO20)包含η-人類IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-和C-末端LGGC序列_c；構(gòu)建體(11)(SEQIDNO21)包含n_Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域(G105C)-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO:10))-Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和具有氨基酸取代A215V的人類IgGl的C-末端鉸鏈/Fe結(jié)構(gòu)域-C；構(gòu)建體(12)(SEQIDNO22)包含n_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO:10))-Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域(G44C)-禾口C-末端FNRGEC(SEQIDNO23)序列-C。圖15A-B親和四聚雙抗體的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)以表達(dá)構(gòu)建體10和1、構(gòu)建體9和1、以及構(gòu)建體11和12的載體共轉(zhuǎn)染的重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的雙抗體進(jìn)行非還原條件的SDS-PAGE分析(A)和蛋白質(zhì)印跡分析，使用山羊抗-人類IgGlH+L作為探針(B)。使用SimplyBlueSafestain(Invitrogen)使SDS-PAGE凝膠中的蛋白可見。對(duì)于圖A和B兩者，包含構(gòu)建體10和1、構(gòu)建體9和1、以及構(gòu)建體11和12A的雙抗體分子分別在泳道1、2和3。圖16包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域和工程化的鏈間二硫鍵的雙抗體分子對(duì)s⑶32B和s⑶16A的社a？口η在三明治ELISA中測(cè)定包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域和‘較輕’與‘較重’多肽鏈之間工程化的二硫鍵的雙抗體分子對(duì)s⑶32Β和s⑶16Α的結(jié)合。由3個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生測(cè)定的雙抗體分別表達(dá)構(gòu)建體1和10、表達(dá)構(gòu)建體1和9、表達(dá)構(gòu)建體11和12。s⑶32Β用作靶蛋白。第二探針是HRP軛合的s⑶16Α。h3G8的結(jié)合用作對(duì)照。圖17雙抗體分子多蛋白前體的示意表示和包含λ輕鏈和/或鉸鏈結(jié)構(gòu)域的多肽鏈的示意表示表示包括本發(fā)明雙抗體分子的多肽構(gòu)建體(各構(gòu)建體以從構(gòu)建體左側(cè)的氨基末端(“η，，)到圖右側(cè)的羧基末端(“C”)來描述)。構(gòu)建體(13)(SEQIDNO97)包含n-3G8的VL結(jié)構(gòu)域-第一接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-2.4G2VH的VH結(jié)構(gòu)域-第二接頭(LGGC)-弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(RAKR(SEQIDNO:95))-2.4G2的VL結(jié)構(gòu)域-第三接頭(GGGSGGG(SEQIDNO10)-3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端LGGC結(jié)構(gòu)域；(編碼SEQIDNO97的核苷酸序列提供在SEQIDNO98)。構(gòu)建體(14)(SEQIDNO99)包含n_3G8的VL結(jié)構(gòu)域-第一接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))-2.4G2VH的VH結(jié)構(gòu)域-第二接頭(LGGC)-弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(RAKR(SEQIDNO:95))_FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位點(diǎn)-2.4G2的VL結(jié)構(gòu)域_第三接頭(GGGSGGG(SEQIDNO10)-3G8的VH結(jié)構(gòu)域-和C-末端LGGC結(jié)構(gòu)域；(編碼SEQIDNO99的核苷酸序列提供在SEQIDNO100)。構(gòu)建體(15)(SEQIDNO101)包含n-Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域-接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))_Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域-禾口C-末FNRGEC(SEQIDNO23)結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建體(16)(SEQIDNO103)包含n_Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域_接頭(GGGSGGGG(SEQIDNO10))_Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域(G44C)-和C-末端VEPKSC(SEQIDNO79)結(jié)構(gòu)域；(編碼SEQIDNO103的核苷酸序列提供在SEQIDNO104)。圖18來源于多蛋白前體分子的雙抗體分子對(duì)mCD32B和S⑶16A的結(jié)合在三明治ELISA中測(cè)定來源于多蛋白前體分子構(gòu)建體13(SEQIDNO:97)的雙抗體分子對(duì)鼠⑶32B(mCD32B)和可溶的⑶16A(s⑶16A)的結(jié)合。mCD32B用作靶蛋白。第二探針是生物素軛合的s⑶16A。圖19包含λ鏈和/或鉸鏈結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)s⑶32Β和S⑶16Α的結(jié)合在三明治ELISA中測(cè)定包含來源于IgG的人類λ輕鏈和/或鉸鏈結(jié)構(gòu)域C-末端的結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子對(duì)SCD32B和SCD16A的結(jié)合并與包含構(gòu)建體1和2的雙抗體(圖5)比較。測(cè)定的雙抗體由表達(dá)構(gòu)建體15和16(分別是SEQIDΝ0:101和SEQIDNO103)的重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。s⑶32Β用作靶蛋白。第二探針是HRP軛合的s⑶16Α。帶有小方塊的柱表示構(gòu)建體15/16組合，而帶有大方塊的柱表示構(gòu)建體1/2組合。圖20結(jié)合于位于細(xì)胞表面的⑶32Β和熒光素-軛合的分子的2Β6/4420DART的不意表不該圖顯示DART的“通用適體”抗熒光素臂的柔性以及代替2Β6臂的其他特異性的可能。V-區(qū)顯示為方塊，GGGSGGGG接頭顯示為線，顯示二硫鍵連接兩條鏈。一條鏈的組成部分顯示為藍(lán)色，而另一條鏈的組成部分顯示為粉色。N，氨基末端；C，羧基末端；FL，熒光素，VL，輕鏈可變區(qū)；VH，重鏈可變區(qū)。圖21(圖A和B)2B6/4420DART特異性地結(jié)合于熒光素-軛合的分子并可同時(shí)結(jié)合CD32B。(A)2B6/4420或2B6/3G8結(jié)合到包被有FITC-S蛋白的ELISA板。通過與可溶⑶32B、然后是對(duì)⑶32B特異性地抗體以及與HRP軛合的第二檢測(cè)抗體連接而檢測(cè)2B6臂的結(jié)合和功能。(B)2B6/4420或2B6/3G8結(jié)合到包被有HuIgG或FITC-HuIgG(熒光素-軛合的)的ELISA板。通過與對(duì)2B6Fv特異性的多克隆血清、然后是HRP-軛合的第二抗體連接而檢測(cè)結(jié)合。圖22(圖A和B)使用抗人類⑶79B抗體活化純化的B細(xì)胞。使用增加濃度的FITC-軛合的抗人類CD79b抗體CB3.I-FITC(A)或CB3.2-FITC(B)以及50μg/mlGAMIgGFc特異性F(ab，)2片段(χ軸)活化純化的B細(xì)胞。在PBS(白色柱)或5μg/mlαFITCαCD32BDART(黑色柱)或αCD16αCD32BDART(灰色柱)存在下B細(xì)胞被活化。反應(yīng)進(jìn)行三份，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖23(圖A和B)活化純化的B細(xì)胞來自第二健康供者的純化B細(xì)胞如圖22的圖B所述地活化。測(cè)量在抗⑶79b抗體FITC-軛合的CB3.2-FITC存在下活化的細(xì)胞中的增殖指數(shù)(A)并與在未標(biāo)記的CB3.2抗體存在下活化的細(xì)胞中的增殖指數(shù)(B)比較。圖24(上圖和下圖)使用MGD261在HCD16A/B轉(zhuǎn)基因小鼠中體內(nèi)清除小鼠B細(xì)胞向來自MacroGenics繁殖群的mCD32_/_hCD16A+C57B1/6、mCD32-/-hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/_hCD16A+hCD32B+C57Bl/6小鼠在第0、3、7、10、14禾口17天IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)、或無關(guān)抗體(hE1610mg/kg)。在第_19(放血前)、4、11、18、25和32天收集血液用于FACS分析。每周三次記錄動(dòng)物健康和活動(dòng)性。上圖h2B6-3G8和WNVmAb;下圖h2B6_3G8_hCD16A或_hCD32B小鼠和WNVmAb_hCD16A或-hCD32B小鼠。圖25使用2.4G2-3G8DB在HCD16A/B轉(zhuǎn)基因小鼠中體內(nèi)清除小鼠B細(xì)胞向來自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/_hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/_hCD16A+hCD16B+小鼠在第0、2、4、7、9、11、14、16禾Π18天IP注射2.4G2-3G8DB(75ug/小鼠)、或PBS。在第-10(放血前)、4、11和18天收集血液用于FACS分析。每周三次記錄動(dòng)物健康和活動(dòng)性。圖26使用人類腫瘤細(xì)胞系RAJI的靜脈內(nèi)(IV)模型證實(shí)MGD261的抗腫瘤活性。向來自MacroGenics繁殖群的十二-二十周大的mCD16_/-、hCD16A+、RAG1-/-C57B1/6小鼠在第O天IV注射5xl06Raji細(xì)胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天還向小鼠腹膜內(nèi)(IP)施用250、25或2.5ugMGD261或PBS(陰性對(duì)照)。隨后每天觀察小鼠，每周兩次記錄體重。處死發(fā)展后腿麻痹的小鼠。圖27在非哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DART將BL21DE3細(xì)胞(Novagen)以pET25b(+)T7_lac+3G8/3G8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，氨芐抗性的集落用于接種肉湯培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到0.50D600單位時(shí)，加入0.5mMIPTG來誘導(dǎo)表達(dá)。在30°C生長(zhǎng)培養(yǎng)物2小時(shí)，收集無細(xì)胞的培養(yǎng)基。圖28DARTELISA使用96-孔Maxisorp板進(jìn)行h3G8_h3G8DART結(jié)合ELISA。反應(yīng)后，用PBS-T洗滌板三次并以80μ1/孔的TMB底物顯色。培養(yǎng)5分鐘后，以40μ1/孔的1%H2SO4終止反應(yīng)。使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件在0D450nm讀數(shù)。使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)讀出值繪圖。圖29DART-引起的人類B-細(xì)胞死亡將人類PBMC與所示分子培養(yǎng)過夜。由FACS分析測(cè)定凋亡，表示為PI+膜聯(lián)蛋白-V+B細(xì)胞群(⑶20+細(xì)胞)對(duì)總FSC/SSC未門控群的百分比。圖308B5-CB3.1DART構(gòu)建體產(chǎn)生多種8B5-CB3.1DART構(gòu)建體以闡釋本發(fā)明。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，將編碼構(gòu)建體5和6、或6和7、或8和9、或9和10的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞以表達(dá)帶有或不帶有抗flag標(biāo)簽的8B5-CB3.1DART。每三天收集條件培養(yǎng)基，收集三次。隨后使用CD32B親和柱純化條件培養(yǎng)基。圖318B5-CB3.1DARTELISA使用96-孔Maxisorp板進(jìn)行8B5-CB3.1DART/ch8B5競(jìng)爭(zhēng)ELISA。反應(yīng)后，用PBS-T洗滌板三次并以80μ1/孔的TMB底物顯色。培養(yǎng)5分鐘后，以40μ1/孔的1%H2SO4終止反應(yīng)。使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件在0D450nm讀數(shù)。使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)讀出值繪圖。圖32四價(jià)DART結(jié)構(gòu)的示意圖示說明經(jīng)由組裝四條多肽鏈產(chǎn)生的DART物類的一般結(jié)構(gòu)。Ig-樣DART的四個(gè)抗原_結(jié)合結(jié)構(gòu)域顯示為帶條紋和暗灰色橢圓。圖33Ig-樣四價(jià)DART提供Ig-樣四價(jià)DART的表位結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。圖34mCD32-hCD16A結(jié)合ELISA提供ELISA的結(jié)果，證實(shí)實(shí)施例6.10的Ig-樣四價(jià)DART物類比對(duì)照(ch-mCD32mAb)抗體或其他DART物類以更大親和性結(jié)合抗原。圖35IgDART分子的示意圖示提供IgDART分子的示意圖。特異性以陰影、花紋或白色區(qū)表示，恒定區(qū)顯示為黑色，二硫鍵以黑色點(diǎn)線表示。所有蛋白鏈的N-末端向圖的上端定向，而所有蛋白鏈的C-末端向圖的下端定向。圖示A-E是雙特異性，圖示F-J是三特異性的。圖示A和E是四價(jià)的。圖示B、C、F、I和J是六價(jià)的。圖示D、G和H是八價(jià)的。參考圖1、2、9、14和17以及第3.1節(jié)對(duì)單獨(dú)結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)描述。5.優(yōu)選實(shí)施方案的描述雙抗體分子的每條多肽鏈包括VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域，它們共價(jià)連接以使結(jié)構(gòu)域不發(fā)生自組裝。兩條多肽鏈的相互作用將產(chǎn)生兩種VL-VH配對(duì)，形成兩個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)，艮口，二價(jià)分子。VH或VL結(jié)構(gòu)域不會(huì)被限制在多肽鏈中的任何位置，S卩，限制在氨基(N)或羧基(C)末端，也不會(huì)限制在彼此的相對(duì)位置，即，VL結(jié)構(gòu)域可在VH結(jié)構(gòu)域的N-末端，反之亦然。唯一的限制是可獲得互補(bǔ)(complimentary)多肽鏈以形成功能雙抗體。當(dāng)VL和VH結(jié)構(gòu)域來源于相同抗體時(shí)，兩條互補(bǔ)(complimentary)多肽鏈可以相同。例如，當(dāng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于對(duì)表位A特異性的抗體時(shí)(S卩，結(jié)合結(jié)構(gòu)域從VLa-VHa相互作用而形成)，每條多肽將包含VHa和VLa。抗體兩條多肽鏈的同二聚化將導(dǎo)致形成兩個(gè)VLa-VHa結(jié)合位點(diǎn)，形成二價(jià)的單特異性抗體。當(dāng)VL和VH結(jié)構(gòu)域來源于對(duì)不同抗原特異性的抗體時(shí)，形成功能性雙特異性雙抗體要求兩條不同多肽鏈相互作用，即，形成異二聚體。例如，對(duì)于雙特異性雙抗體，一條多肽鏈將包含VLa和VLb；所述鏈的同二聚化將導(dǎo)致形成兩個(gè)VLa-VHb結(jié)合位點(diǎn)，或不結(jié)合或不可預(yù)測(cè)地結(jié)合。相反，當(dāng)兩條不同多肽鏈自由地相互作用時(shí)，如，在重組表達(dá)系統(tǒng)中，一條包含VLa和VHb，另一條包含VLb和VHa時(shí)，將形成兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)=VLa-VHa和VLb-VHb。對(duì)于所有雙抗體多肽鏈對(duì)，可能兩條鏈錯(cuò)比對(duì)或錯(cuò)結(jié)合是可能的事，即，VL-VL或VH-VH結(jié)構(gòu)域相互作用；然而，基于適當(dāng)二聚化的結(jié)合位點(diǎn)的免疫特異性，使用本領(lǐng)域已知的或本文示例的任何基于親和性的方法如親和色譜，純化功能性雙抗體是易于操縱的。在其他實(shí)施方案，雙抗體的一條或多條多肽鏈包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。雙抗體分子多肽鏈中的Fc結(jié)構(gòu)域優(yōu)先二聚化，導(dǎo)致形成表現(xiàn)免疫球蛋白-樣特征如，F(xiàn)c-FcYR相互作用的雙抗體分子。包含F(xiàn)c的雙抗體可為二聚體，如，包括兩條多肽鏈，各包含VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域。所述多肽鏈的二聚化形成包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的二價(jià)雙抗體，盡管具有不同于未修飾的二價(jià)的抗體的結(jié)構(gòu)(圖11)。這種雙抗體分子將表現(xiàn)相對(duì)于野生型免疫球蛋白改變的表型，如，改變的血清半衰期、結(jié)合性質(zhì)等等。在其他實(shí)施方案，包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的雙抗體分子可為四聚體。這種四聚體(tertramer)包括兩條‘較重’多肽鏈，即，包含VL、VH和Fc結(jié)構(gòu)域的多肽鏈，和兩條‘較輕’多肽鏈，即，包含VL和VH的多肽鏈。所述較輕鏈與較重鏈相互作用以形成單體，所述單體經(jīng)由其未配對(duì)的Fc結(jié)構(gòu)域相互作用以形成Ig-樣分子。這種Ig-樣雙抗體是四價(jià)的，可為單特異性、雙特異性或四特異性。雙抗體分子的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可識(shí)別相同或不同表位。不同表位可來自相同抗原或來自不同抗原的表位。在一個(gè)實(shí)施方案，表位來自不同細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案，表位是相同細(xì)胞或病毒上的細(xì)胞表面抗原。表位結(jié)合位點(diǎn)可識(shí)別可對(duì)其產(chǎn)生抗體的任何抗原。例如，蛋白、核酸、細(xì)菌毒素、細(xì)胞表面標(biāo)記、自身免疫標(biāo)記、病毒蛋白、藥物等等。在具體方面，雙抗體的至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)特定細(xì)胞上的抗原特異性的，諸如B-細(xì)胞或T-細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或樹突細(xì)胞。雙抗體多肽鏈的各結(jié)構(gòu)域即，VL、VH和FC結(jié)構(gòu)域可由肽接頭分開。肽接頭可為0、1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案，氨基酸接頭序列是核酸序列(SEQIDNO76)編碼的GGGSGGGG(SEQIDNO10)。在某些實(shí)施方案，雙抗體分子的各條多肽鏈工程化為包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基，其將與本發(fā)明的第二多肽鏈上的相應(yīng)至少一個(gè)半胱氨酸殘基相互作用以形成鏈間二硫鍵。所述鏈間二硫鍵用于穩(wěn)定雙抗體分子，改進(jìn)重組系統(tǒng)中的表達(dá)和回收，形成穩(wěn)定和一致的制劑以及改進(jìn)分離和/或純化產(chǎn)物的體內(nèi)穩(wěn)定性。所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基可作為單個(gè)氨基酸或作為更大氨基酸序列如鉸鏈結(jié)構(gòu)域的一部分引入多肽鏈的任何部分。在特定實(shí)施方案，所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基工程化為出現(xiàn)在多肽鏈C-末端。在一些實(shí)施方案，所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基引入多肽鏈的氨基酸序列LGGC中。在特定實(shí)施方案，包含多肽鏈C-末端的本發(fā)明的雙抗體分子包括氨基酸序列LGGC。在另一個(gè)實(shí)施方案，所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基引入多肽中包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如，SEQIDNO:1或SEQIDNO:4。在特定實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子多肽鏈的C-末端包含IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如，SEQIDNO:1。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子多肽鏈的C-末端包含氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO:79)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO80)編碼。在其他實(shí)施方案，所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基引入多肽鏈的氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQIDN0:17)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO78)編碼。在特定實(shí)施方案，包含多肽鏈C-末端的本發(fā)明的雙抗體包括氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQIDNO17)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO78)編碼。在其他的實(shí)施方案，所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基引入多肽鏈的氨基酸序列FNRGEC(SEQIDNO:23)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO77)編碼。在特定實(shí)施方案，包含多肽鏈C-末端的本發(fā)明的雙抗體包括氨基酸序列FNRGEC(SEQIDNO:23)，其可被核苷酸序列(SEQIDNO77)編碼。在某些實(shí)施方案，雙抗體分子包括至少兩條多肽鏈，其各包括氨基酸序列LGGC并由所述LGGC序列中半胱氨酸殘基之間的二硫鍵共價(jià)連接。在另一特定實(shí)施方案，雙抗體分子包括至少兩條多肽鏈，其中一條包括序列FNRGEC(SEQIDNO:23)，而另一條包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域(包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基)，其中所述至少兩條多肽鏈由FNRGEC(SEQIDNO23)中的半胱氨酸殘基與鉸鏈結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵共價(jià)連接。在具體方面，位于鉸鏈結(jié)構(gòu)域中負(fù)責(zé)二硫鍵的半胱氨酸殘基是Cys-128(根據(jù)KabatEU編號(hào)；位于未修飾的完整IgG重鏈的鉸鏈結(jié)構(gòu)域中)，SEQIDNO23中相應(yīng)的半胱氨酸殘基是Cys-214(根據(jù)KabatEU編號(hào)；位于未修飾的完整IgG輕鏈的C-末端)(Elkabetz等人(2005)“CysteinesInCHlUnderlieRetentionOfUnassembledIgHeavyChains(CHI中的半胱氨酸引起保持未組裝的Ig重鏈)”J.Bi0l.Chem.28014402-14412；在此通過引用全文并入本文)。在其他的實(shí)施方案，至少一個(gè)半胱氨酸殘基工程化為出現(xiàn)在氨基酸鏈N-末端。在其他實(shí)施方案，至少一個(gè)半胱氨酸殘基工程化為出現(xiàn)在雙抗體分子多肽鏈的接頭部分。在進(jìn)一步實(shí)施方案，VH或VL結(jié)構(gòu)域工程化為相對(duì)于親本VH或VL結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)氨基酸修飾，以使所述氨基酸修飾包括以半胱氨酸取代親本氨基酸。本發(fā)明包括包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分(如，CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域)的雙抗體分子。Fc結(jié)構(gòu)域或其部分可來源于任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括但不限于IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在優(yōu)選實(shí)施方案，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)來源于IgG。在特定實(shí)施方案，IgG同種型是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型。在一個(gè)實(shí)施方案，雙抗體分子包括Fc結(jié)構(gòu)域，該Fc結(jié)構(gòu)域包括獨(dú)立選自任何免疫球蛋白同種型的CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域(即，包含來源于IgG的CH2結(jié)構(gòu)域和來源于IgE的CH3結(jié)構(gòu)域、或來源于IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域和來源于IgG2的CH3結(jié)構(gòu)域等等的Fc結(jié)構(gòu)域)。所述Fc結(jié)構(gòu)域可被工程化到包含本發(fā)明的雙抗體分子的多肽鏈中相對(duì)于所述多肽鏈其他結(jié)構(gòu)域或部分的任何位置(如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分可位于鏈的多肽的VL和VH結(jié)構(gòu)域C-末端；可位于VL和VH結(jié)構(gòu)域的η-末端；或可位于一個(gè)結(jié)構(gòu)域的N-末端和另一結(jié)構(gòu)域的C-末端(即，在多肽鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間))。本發(fā)明還包括包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域的分子。鉸鏈結(jié)構(gòu)域來源于任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在優(yōu)選實(shí)施方案，鉸鏈結(jié)構(gòu)域來源于IgG，其中IgG同種型是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4、或其同種異型(allotpye)。所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域可與Fc結(jié)構(gòu)域一起工程化到包含雙抗體分子的多肽鏈中以使雙抗體分子包括鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案，鉸鏈和Fc結(jié)構(gòu)域獨(dú)立選自本領(lǐng)域已知的或本文示例的任何免疫球蛋白同種型。在其他實(shí)施方案，鉸鏈和Fc結(jié)構(gòu)域間隔多肽鏈的至少一個(gè)其他結(jié)構(gòu)域，如，VL結(jié)構(gòu)域。鉸鏈結(jié)構(gòu)域或任選地鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域可工程化到本發(fā)明的多肽中相對(duì)于所述多肽鏈的其他結(jié)構(gòu)域或部分的任何位置。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽鏈包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域，該鉸鏈結(jié)構(gòu)域是在多肽鏈的C-末端，其中所述多肽鏈不包括Fc結(jié)構(gòu)域。在其他的實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽鏈包括鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域，該鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域是在多肽鏈的C-末端。在進(jìn)一步實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽鏈包括鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域，該鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域是在多肽鏈的N-末端。如上討論的，本發(fā)明包括多肽鏈的多聚體，其中每條多肽鏈包括VH和VL結(jié)構(gòu)域。在某些方面，所述多聚體中的多肽鏈進(jìn)一步包括Fc結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)構(gòu)域的二聚化導(dǎo)致形成表現(xiàn)免疫球蛋白-樣功能即，F(xiàn)c介導(dǎo)的功能(如，F(xiàn)c-FcYR相互作用、補(bǔ)體結(jié)合等等)的雙抗體分子。在某些實(shí)施方案，包含VL和VH結(jié)構(gòu)域的各多肽鏈具有相同特異性，所述雙抗體分子是二價(jià)和單特異性的。在其他實(shí)施方案，包含VL和VH結(jié)構(gòu)域的各多肽鏈具有不同特異性，雙抗體是二價(jià)和雙特異性的。在其他的實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子包括多肽鏈的四聚體，其中每條多肽鏈包括VH和VL結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案，四聚體的兩條多肽鏈進(jìn)一步包括Fc結(jié)構(gòu)域。因此四聚體包括兩條‘較重’多肽鏈和兩條‘較輕’多肽鏈，每條‘較重’多肽鏈包含VL、VH和Fc結(jié)構(gòu)域，每條‘較輕’多肽鏈包含VL和VH結(jié)構(gòu)域。較重鏈與較輕鏈相互作用為二價(jià)的單體以及所述單體經(jīng)由較重鏈Fc結(jié)構(gòu)域的二聚化將導(dǎo)致形成四價(jià)的免疫球蛋白-樣分子(示例在實(shí)施例6.2和實(shí)施例6.3)。在某些方面，單體是相同的，四價(jià)的雙抗體分子是單特異性或雙特異性。在其他方面，單體是不同的，四價(jià)的分子是雙特異性或四特異性。形成上述四特異性雙抗體分子要求四條不同多肽鏈相互作用。這種相互作用在單細(xì)胞重組生產(chǎn)系統(tǒng)中難以有效實(shí)現(xiàn)，由于許多可能的鏈錯(cuò)配變體。對(duì)增加錯(cuò)配概率的一個(gè)解決方案是工程化“knobs-into-holes”型突變到期望的多肽鏈對(duì)中。這種突變有利于異二聚化而不是同二聚化。例如，關(guān)于Fc-Fc-相互作用，氨基酸取代(優(yōu)選地以包含形成‘knob’的堆積側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3結(jié)構(gòu)域以使位阻將阻止與類似地突變的結(jié)構(gòu)域相互作用并迫使突變的結(jié)構(gòu)域與一種結(jié)構(gòu)域配對(duì)，該結(jié)構(gòu)域中已經(jīng)工程化了互補(bǔ)或適應(yīng)的突變，即，‘hole’(如，以甘氨酸取代)。這種突變組可工程化到包含雙抗體分子的任何多肽對(duì)中，且進(jìn)一步工程化到任何所述對(duì)的多肽鏈的任何部分。有利于異二聚化而不是同二聚化的蛋白工程化方法是本領(lǐng)域熟知的，特別是關(guān)于工程化免疫球蛋白-樣分子，并包括在本文中(參見例如，Ridgway等人(1996)“iKnobs-Into-Holes'EngineeringOfAntibodyCH3DomainsForHeavyChainHeterodimerization(為了重鏈異二聚化‘Knobs-Into-Holes，工程化抗體CH3結(jié)構(gòu)域)”ProteinEngr.9:617_621，Atwell等人(1997)"StableHeterodimersFromRemodelingTheDomainInterfaceOfAHomodimerUsingAPhageDisplayLibrary(使用噬菌體展示文庫對(duì)同二聚體結(jié)構(gòu)域界面再次建模獲得的穩(wěn)定異二聚體)”J.Mol.Biol.270:26-35，和Xie等人(2005)"ANewFormatOfBispecificAntibody:HighlyEfficientHeterodimerization,ExpressionAndTumorCellLysis(—種新型雙特異性抗體高效異二聚化、表達(dá)和腫瘤細(xì)胞裂解)”J.Immunol.Methods296:95-101；所有這些通過引用全文并入本文)。本發(fā)明還包括包含變體Fc或變體鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的雙抗體分子，該變體Fc結(jié)構(gòu)域相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)包括至少一個(gè)氨基酸修飾(如，取代、添加、缺失)。包含變體Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子(如，抗體)相對(duì)于包含野生型Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域或其部分的分子通常具有改變的表型。變體表型可表現(xiàn)為改變的血清半衰期、改變的穩(wěn)定性、改變的對(duì)細(xì)胞酶的敏感性或改變的效應(yīng)物功能，如在NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性測(cè)定中測(cè)定的。鑒定為改變的效應(yīng)物功能的Fc結(jié)構(gòu)域變體公開在國(guó)際申請(qǐng)W004/063351、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/626，510,2004年11月15日提交的60/636，663、和2006年3月10日提交的60/781，564、以及2005年11月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)11/271，140、2005年11月15日提交的11/305，787，這些是本發(fā)明人的同時(shí)申請(qǐng)，所有這些通過引用全文并入本文。本發(fā)明的雙特異性雙抗體可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)分開的和不同的表位。在某些實(shí)施方案，這些表位來自相同抗原。在其他實(shí)施方案，這些表位來自不同抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案，至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的決定簇特異性的(如，⑶3、⑶16、⑶32、CD64等等)，其在T淋巴細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或其他單核細(xì)胞上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案，雙抗體分子結(jié)合于效應(yīng)細(xì)胞決定簇并還活化所述效應(yīng)細(xì)胞。在這方面，本發(fā)明的雙抗體分子可表現(xiàn)Ig-樣功能，而不論其是否進(jìn)一步包括Fc結(jié)構(gòu)域(如，在本領(lǐng)域已知的或本文示例的任何效應(yīng)物功能測(cè)定(如，ADCC測(cè)定)中測(cè)定的。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的雙特異性雙抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的癌抗原和效應(yīng)細(xì)胞決定簇兩者并活化所述細(xì)胞。在替代實(shí)施方案，本發(fā)明的雙特異性雙抗體或雙抗體分子可通過同時(shí)結(jié)合并因此連接相同細(xì)胞上的活化和抑制性受體(如，結(jié)合⑶32A和⑶32B兩者、BCR和⑶32B兩者、或IgERI和⑶32B兩者)而抑制靶如效應(yīng)物、細(xì)胞的活化，如上述(參見發(fā)明背景部分)。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步方面，雙特異性雙抗體可表現(xiàn)抗病毒性質(zhì)，通過同時(shí)結(jié)合病毒上的兩個(gè)中和表位(如，RSV表位；WNV表位諸如E16和E53)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的雙特異性雙抗體分子提供靶向特定細(xì)胞類型的獨(dú)特機(jī)會(huì)。例如，雙特異性雙抗體或雙抗體分子可工程化為包括識(shí)別對(duì)靶細(xì)胞或組織類型獨(dú)特的一組抗原的表位結(jié)合位點(diǎn)組合。另外，當(dāng)單獨(dú)抗原之一或兩者分別在其他組織和/或細(xì)胞類型中相當(dāng)常見時(shí)，低親和性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于構(gòu)建雙抗體或雙抗體分子。這種低親和性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒛軌蛞宰阋杂糜谥委熌康牡挠H和力結(jié)合于單獨(dú)表位或抗原。然而，當(dāng)兩種表位或抗原都存在于單獨(dú)靶細(xì)胞或組織上時(shí)，雙抗體或雙抗體分子對(duì)細(xì)胞或組織的親和力相對(duì)于僅表達(dá)抗原之一的細(xì)胞或組織將增加以使所述細(xì)胞或組織可被本發(fā)明有效地靶向。相對(duì)于單特異性雙抗體或僅對(duì)抗原之一具有特異性的抗體，這種雙特異性分子可表現(xiàn)對(duì)表達(dá)靶抗原兩者的細(xì)胞上其所述抗原之一或兩者增強(qiáng)的結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明雙抗體的結(jié)合性質(zhì)由體外功能性測(cè)定表征以確定結(jié)合活性和/或一或多種FcγR介質(zhì)效應(yīng)細(xì)胞功能(經(jīng)由Fc-FcγR相互作用或由免疫特異性結(jié)合雙抗體分子于FcγR而介導(dǎo))(參見5.4.2和5.4.3節(jié))。本發(fā)明的分子如，雙抗體對(duì)FcγR的親和性和結(jié)合性質(zhì)可使用用于確定結(jié)合結(jié)構(gòu)域_抗原或Fc-FcyR相互作用，即，分別是抗原對(duì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合或Fc區(qū)對(duì)FcγR的特異性結(jié)合的本領(lǐng)域已知的體外測(cè)定(基于生化或免疫學(xué)的測(cè)定)來確定，包括但不限于ELISA測(cè)定、表面等離子共振測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定(參見5.4.2節(jié))。在最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的分子在體內(nèi)模型中(諸如本文描述和公開的)具有與基于體外的測(cè)定類似的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的測(cè)定中不表現(xiàn)期望表型但在體內(nèi)表現(xiàn)期望表型的本發(fā)明的分子。在一些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子被工程化以包括相對(duì)于模板分子的相應(yīng)部分改變的糖基化模式或改變的糖形。工程化的糖形可用于多種目的，包括但不限于增強(qiáng)效應(yīng)物功能。工程化的糖形可由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，例如通過使用工程化的或變體表達(dá)株，通過與一或多種酶例如DIN-乙?；咸烟前被D(zhuǎn)移酶III(GnTIII)共表達(dá)，通過在各種生物體或來自各種生物體的細(xì)胞系表達(dá)本發(fā)明的雙抗體，或通過在已經(jīng)表達(dá)和純化雙抗體之后修飾糖類。產(chǎn)生工程化的糖形的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于在Umana等人(1999)"EngineeredGlycoformsOfAnAntineuroblastomaIgGlWithOptimizedAntibody-DependentCellularCytotoxicActivity(具有優(yōu)化的抗體依賴性細(xì)胞毒活性的抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤IgGl的工程化的糖形)”Nat.Biotechnol17176-180；Davies等人(2001)"ExpressionOfGnTIIIInARecombinantAnti_CD20CHOProductionCellLineExpressionOfAntibodiesWithAlteredGlycoformsLeadsToAnIncreaseInAdccThroughHigherAffinityForFcGammaRIII(GnTIII在重組抗CD20CH0產(chǎn)生細(xì)胞系中的表達(dá)表達(dá)具有改變的糖形的抗體經(jīng)由對(duì)FcyRIII更高親和性而導(dǎo)致Adcc增力口)，，BiotechnolBioeng74288-294；Shields等人(2002)"LackOfFucoseOnHumanIgGlN-LinkedOligosaccharideImprovesBindingToHumanFcgammaRIIIAndAntibody-DependentCellularToxicity(在人類IgGlN-連接的寡糖上缺乏巖藻糖改進(jìn)對(duì)人類FcYRIII的結(jié)合和抗體依賴性細(xì)胞毒性)，，JBiolChem277=26733-26740；Shinkawa等人(2003)"TheAbsenceOfFucoseButNotThePresenceOfGalactoseOrBisectingN-AcetylglucosamineOfHumanIgGlComplex-TypeOligosaccharidesShowsTheCriticalRoleOfEnhancingAntibody-DependentCellularCytotoxicity(人類IgGl復(fù)合物_型寡糖中巖藻糖的不存在而不是半乳糖或平分的N-乙酰氨基葡糖的存在顯示增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性的重要作用)”JBiolChem278=3466-3473)；美國(guó)專利6，602，684；USSN10/277,370；USSN10/113,929；PCTWO00/61739A1；PCTW001/292246A1；PCTWO02/311140A1；PCTWO02/30954A1；Potillegent技術(shù)(Biowa,Inc.Princeton,NJ)；GlycoMAb糖基化工程化技術(shù)(GLYCARTbiotechnologyAG,Zurich,Switzerland)中描述的那些；所有這些通過引用全文并入本文。參見例如，WO00061739；EA01229125；美國(guó)專利20030115614;0kazaki等人(2004)‘‘FucoseDepletionFromHumanIgGlOligosaccharideEnhancesBindingEnthalpyAndAssociationRateBetweenIgGlAndFcGammaRIIIA(從人類IgGl寡糖清除巖藻糖增強(qiáng)IgGl與FcγRIIIA之間的結(jié)合焓和締合速率)”JMB，3361239-49，所有這些通過引用全文并入本文。本發(fā)明進(jìn)一步包括摻入非天然氨基酸以產(chǎn)生本發(fā)明的雙抗體。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，諸如使用天然生物合成機(jī)制以允許摻入非天然氨基酸到蛋白中的方法，參見例如，Wang等人(2002)"ExpandingTheGeneticCode(擴(kuò)展遺傳密碼)”Chem.Comm.1:1_11；Wang等人(2001)"ExpandingTheGeneticCodeOfEscherichiacoli(擴(kuò)展大腸桿菌的遺傳密碼)”Science，292498-500；vanHest等人(2001)"Protein-BasedMaterials,TowardANewLevelOfStructuralControl(基于蛋白的材料，朝向新水平的結(jié)構(gòu)控制)”Chem.C0mm.191897-1904，所有這些通過引用全文并入本文。替代策略關(guān)注負(fù)責(zé)生物合成氨基酰基-tRNA的酶，參見例如，Tang等人(2001)"BiosynthesisOfAHighlyStableCoiled—CoilProteinContainingHexafluoroleucineInAηEngineeredBacterialHost(在工程化的細(xì)菌宿主中生物合成含有六氟亮氨酸的高度穩(wěn)定的卷曲螺旋蛋白)”J.Am.Chem.Soc.123(44):11089_11090;Kiick等人(2001)"IdentificationOfAnExpandedSetOfTranslationallyActiveMethionineAnaloguesInEscherichiacoli(在大腸桿菌中鑒定翻譯活化的甲硫氨酸類似物的擴(kuò)展組)”FEBSLett.502(1-2)25-30；所有這些通過引用全文并入本文。在一些實(shí)施方案，本發(fā)明包括通過添加或缺失糖基化位點(diǎn)而修飾本發(fā)明分子的VL、VH或Fc結(jié)構(gòu)域的方法。修飾蛋白的糖類的方法是本領(lǐng)域熟知的并包括在本發(fā)明中，參見例如，美國(guó)專利第6，218，149號(hào)；EPO359096Bi;美國(guó)專利公布US2002/0028486；WO03/035835；美國(guó)專利公布2003/0115614；美國(guó)專利第6,218,149號(hào)；美國(guó)專利第6，472，511號(hào)；所有這些通過引用全文并入本文。5.1雙抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域本發(fā)明的雙抗體包括通常來源于免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明方法中使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域所來源的抗體可以來自任何動(dòng)物來源，包括禽類和哺乳動(dòng)物(如，人類、非人類靈長(zhǎng)類、鼠、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞)。優(yōu)選地，所述抗體是人類或人源化的單克隆抗體。如在此使用的，“人類”抗體包括具有人類免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，還包括從人類免疫球蛋白文庫、或合成的人類免疫球蛋白編碼序列文庫、或者從表達(dá)人類基因的抗體的小鼠中分離的抗體。本發(fā)明涵蓋使用本領(lǐng)域已知用于治療和/或預(yù)防癌癥、自身免疫疾病、炎性疾病或傳染病的任何抗體作為本發(fā)明的雙抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的來源。已知癌抗體的非限制性實(shí)例提供在5.7.1節(jié)，以及對(duì)所列靶抗原特異性的其他抗體和針對(duì)癌抗原的抗體列在5.6.1節(jié)；用于治療和/或預(yù)防自身免疫疾病和炎性疾病的已知抗體的非限制性實(shí)例提供在5.7.2節(jié)，以及針對(duì)所列靶抗原的抗體和針對(duì)抗原的抗體列在5.6.2節(jié)；在其他實(shí)施方案，可使用針對(duì)傳染病相關(guān)表位的抗體，如列在5.6.3節(jié)的。在某些實(shí)施方案，抗體包括包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的變體Fc區(qū)，所述抗體已經(jīng)被本發(fā)明的方法鑒定為相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的相應(yīng)分子具有賦予的效應(yīng)物功能和/或?qū)cyRIIB增強(qiáng)的親和性和對(duì)FcYRIIIA減少的親和性?？筛鶕?jù)本發(fā)明工程化的用于治療或預(yù)防炎性病癥的抗體的非限制性實(shí)例示于表9，用于治療或預(yù)防自身免疫病癥的抗體的非限制性實(shí)例示于表10。對(duì)于一些用途，包括在人體內(nèi)使用抗體和體外的檢測(cè)測(cè)定，可優(yōu)選使用具有來源于人類、嵌合的或人源化抗體的可變結(jié)構(gòu)域的雙抗體。來自完全的人類抗體的可變結(jié)構(gòu)域?qū)θ祟愂苤委熣叩闹委熜蕴幚硎翘貏e理想的。通過本領(lǐng)域公知的多種方法可制備人類抗體，包括上文所述的利用來自人類免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法。也參見美國(guó)專利第4，444，887和4，716，111號(hào)；以及國(guó)際公布第WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893,WO98/16654,WO96/34096,WO96/33735和WO91/10741號(hào)；所有這些通過引用全文并入本文。人源化抗體為能夠結(jié)合預(yù)先確定的抗原并包含基本上具有人類免疫球蛋白氨基酸序列的框架區(qū)和基本上具有非人類免疫球蛋白氨基酸序列的CDR的抗體、其變體或片段。人源化抗體可包含基本全部的至少一個(gè)和典型的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)域?qū)?yīng)于非人類免疫球蛋白(即，供者抗體)的CDR區(qū)域，全部或基本上全部的框架區(qū)是人類免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。人源化抗體的框架區(qū)和CDR區(qū)不必與親本序列精確對(duì)應(yīng)，例如，供者CDR或共有框架區(qū)可通過至少一個(gè)殘基的取代、添加或缺失而被誘變從而使該CDR或框架在該位點(diǎn)處的殘基與該共有抗體或供者抗體不對(duì)應(yīng)。然而這種突變優(yōu)選地范圍不廣泛。通常，至少75%的人源化抗體殘基與其親本框架區(qū)(FR)和CDR序列的殘基對(duì)應(yīng)、更常見地是90%、并最優(yōu)選超過95%對(duì)應(yīng)。人源化抗體可利用本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來產(chǎn)生，包括但不限于CDR-嫁接(歐洲專利EP239，400；國(guó)際公布第WO91/09967號(hào)；和美國(guó)專利第5，225，539,5,530，101和5，585，089號(hào))，貼合(veneering)或表面重建(resurfacing)(歐洲專利EP592，106禾口EP519，596；Padlan(1991)"APossibleProcedureForReducingTheImmunogenicityOfAntibodyVariableDomainsWhilePreservingTheirLigand-BindingProperties(用于減少抗體可變結(jié)構(gòu)域的免疫原性并保留其配體-結(jié)合性質(zhì)的可能方案)"MolecularImmunology28(4/5)489-498；Studnicka等人(1994)"Human-EngineeredMonoclonalAntibodiesRetainFullSpecificBindingActivityByPreservingNon-CDRComplementarity-ModulatingResidues(人類-工程化的單克隆抗體通過保留非-CDR互補(bǔ)性調(diào)節(jié)殘基保持完全的特異性結(jié)合活性)"ProteinEngineering7(6)805-814；禾口Roguska等人(1994)"HumanizationOfMurineMonoclonalAntibodiesThroughVariableDomainResurfacing(經(jīng)由可變結(jié)構(gòu)域表面重建將鼠單克隆抗體人源化)”ProcNatlAcadSciUSA91:969-973)、鏈改組(美國(guó)專利第5，565，332號(hào))、和以下公開的技術(shù)，如，美國(guó)專利第6，407，213、5，766，886、5，585，089號(hào)、國(guó)際公布第WO9317105號(hào)、Tan等人(2002)‘‘‘Superhumanized'Antibodoes=ReductionOfImmunogenicPotentialByComplementarity-DeterminingRegionGraftingWithHumanGermlineSequences!ApplicationToAnAnti_CD28(’超級(jí)人源化’抗體通過互補(bǔ)決定區(qū)與人類種系序列嫁接而減少免疫原性可能應(yīng)用于抗-CD28)”J.Immunol.1691119-25，Caldas等人(2000)"DesignAndSynthesisOfGermline-BasedHemi-HumanizedSingle-ChainFvAgainstTheCD18SurfaceAntigen(設(shè)計(jì)和合成針對(duì)⑶18表面抗原的基于種系的半-人源化單鏈Fv)”ProteinEng.13:353_60,Morea等人(2000)“AntibodyModelingimplicationsForEngineeringAndDesign(抗體建模與工程化和設(shè)計(jì)的關(guān)聯(lián))，，Methods20=267-79,Baca等人(1997)"AntibodyHumanizationUsingMonovalentPhageDisplay(jiffi展示的抗體人源化)，，J.Biol.Chem.272:10678-84，Roguska等人(1996)“AComparisonOfTwoMurineMonoclonalAntibodiesHumanizedByCDR-GraftingAndVariableDomainResurfacing(比較⑶R-嫁接和可變結(jié)構(gòu)域表面重建人源化的兩種鼠單克隆^L#)"ProteinEng.9895-904,Coutoφ人(1995)"DesigningHumanConsensusAntibodiesWithMinimalPositionalTemplates(以最小位置模板設(shè)計(jì)人類共有抗體)，，CancerRes.55(23Supp):5973s_5977s，Couto等人(1995)‘‘Anti_BA46MonoclonalAntibodyMc3HumaniζationUsingANovelPositionalConsensusAndInVivoAndInVitroCharacterization(抗-BA46單克隆抗體Mc3使用新型位置共有序列人源化和體內(nèi)及體外表征)，，CancerRes.551717-22，Sandhu(1994)"ARapidProcedureForTheHumanizationOfMonoclonalAntibodies(人源化單克隆抗體的快速方案)，，Gene150409-10,Pedersen等人(1994)“ComparisonOfSurfaceAccessibleResiduesInHumanAndMurineImmunoglobulinFvDomains.ImplicationForHumanizationOfMurineAntibodies(比較人類和鼠免疫球蛋白Fv結(jié)構(gòu)域中的表面可得殘基。涉及鼠抗體的人源化)”J.Mol.Biol.235=959-973,Jones等人(1986)"ReplacingTheComplementarity-DeterminingRegionsInAHumanAntibodyWithThoseFromAMouse(以來自小鼠的互補(bǔ)決定區(qū)代替人類抗體的互補(bǔ)決定區(qū))”Nature321=522-525,Riechmann等人(1988)“ReshapingHumanAntibodiesForTherapy(為了治療重塑人類抗體)"Nature332:323_327，和Presta(1992)“AntibodyEngineering(抗體工程化)，，Cure.Op.Biotech.3(4):394_398。通常，在框架區(qū)內(nèi)的框架殘基被CDR供者抗體的對(duì)應(yīng)殘基取代以改變，優(yōu)選改善抗原結(jié)合?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法鑒定這些框架取代，例如，通過模擬所述CDR與框架殘基的相互作用來鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基，和通過序列比較來鑒定在特定位置的不常見框架殘基(參見例如，Queen等人，美國(guó)專利第5，585，089號(hào)；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0049014和2003/0229208號(hào)；美國(guó)專利第6，350，861；6，180，370；5，693，762；5，693，761；5,585，089；和5，530，101以及Riechmann等人(1988)"ReshapingHumanAntibodiesForTherapy(為了治療重塑人類抗體)"Nature332:323_327，所有這些都通過引用全文并入本文)。在最優(yōu)選實(shí)施方案，所述人源化結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合與供者鼠抗體相同的表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明通常涵蓋抗體的CDR嫁接。因此，所述供者和受者抗體可衍生自相同物種的動(dòng)物甚至相同抗體類型或亞型。然而更常見的供者和受者抗體衍生自不同物種的動(dòng)物。典型地所述供者抗體為非人類抗體，例如嚙齒類mAb，而受者抗體為人類抗體。在一些實(shí)施方案中，將供者抗體的至少一個(gè)⑶R嫁接至人類抗體。在其他的實(shí)施方案中，將每一重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的至少兩種，優(yōu)選所有的三個(gè)CDR嫁接至人類抗體。所述⑶R可包括Kabat⑶R、結(jié)構(gòu)環(huán)⑶R或其組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括人源化FcyRIIB抗體，其包含至少一個(gè)⑶R嫁接的重鏈和至少一個(gè)⑶R嫁接的輕鏈。用于本發(fā)明方法的雙抗體包括被修飾的衍生物，所述修飾即，通過共價(jià)附著任何類型的分子到雙抗體。例如但不限于，雙抗體衍生物包括已被修飾的雙抗體，如，通過糖基化、乙?；?、PEG化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解性裂解、連接到細(xì)胞配體或其他蛋白，等等。可以通過已知的技術(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾的任何一種，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、衣霉素的代謝合成，等等。此外，衍生物可包含一種或多種非經(jīng)典氨基酸。嵌合抗體是該抗體的不同部分來自不同的免疫球蛋白分子的分子，例如具有來自非類人抗體的可變區(qū)和人類免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如，Morrison(1985)“TransfectomasProvideNovelChimericAntibodies(轉(zhuǎn)染瘤提供新型嵌合抗體)”Science229=1202-1207；Oi等人(1986)"ChimericAntibodies(嵌合抗體)”BioTechniques4:214_221;Gillies等人(1989)“High-LevelExpressionOfChimericAntibodiesUsingAdaptedcDNAVariableRegionCassettes(使用修飾的cDNA可變區(qū)盒高水平表達(dá)嵌合抗體)”J.Immunol.Methods125191-202；和美國(guó)專利第6，311，415,5,807，715,4,816，567和4，816，397號(hào)，通過引用全文并入本文。通常，在框架區(qū)內(nèi)的框架殘基被CDR供者抗體的對(duì)應(yīng)殘基取代以改變，優(yōu)選改善抗原結(jié)合。可用本領(lǐng)域公知的方法鑒定這些框架取代，例如，通過模擬所述CDR與框架殘基的相互作用來鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基，和通過序列比較來鑒定在特定位置的不常見框架殘基(參見例如，美國(guó)專利第5，585，089號(hào)；和Riechmann等人(1988)"ReshapingHumanAntibodiesForTherapy(為了治療重塑人類抗體)"Nature332:323_327，通過引用全文并入本文)。本發(fā)明的雙抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域所來自的單克隆抗體可使用本領(lǐng)域已知的大量技術(shù)制備，包括使用雜交瘤、重組體和噬菌體展示技術(shù)或其組合。例如，單克隆抗體可使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生，包括本領(lǐng)域已知和教導(dǎo)在例如Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版·1988)；Hammerling等人:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas(單克降抗體和T細(xì)胞雜交瘤)，PP.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(兩者通過引用全文并入本文)的那些。如在此使用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于由雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”是指來源于包括任何真核、原核或噬菌體克隆的單個(gè)克隆的抗體，而不是其產(chǎn)生方法。使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特異性抗體的方法是常規(guī)的和本領(lǐng)域公知的。在非限制性實(shí)例，可以用目標(biāo)抗原或表達(dá)這種抗原的細(xì)胞免疫小鼠。檢測(cè)到免疫應(yīng)答后，如，在小鼠血清中檢測(cè)到對(duì)抗原特異性的抗體后，收集小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞。隨后由已知技術(shù)將脾細(xì)胞融合到任何適合的骨髓瘤細(xì)胞。選擇雜交瘤并由有限稀釋克隆。隨后由本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定雜交瘤克隆中分泌能夠結(jié)合抗原的抗體的細(xì)胞。通常含有高水平抗體的腹水可通過以陽性雜交瘤克隆腹膜內(nèi)接種小鼠產(chǎn)生。目標(biāo)抗原包括但不限于，5.8.1節(jié)提供的癌癥相關(guān)抗原、5.8.2節(jié)提供的與自身免疫疾病和炎性疾病相關(guān)的抗原、5.8.3節(jié)提供的與傳染病相關(guān)的抗原、和5.8.4節(jié)提供的毒素?？贵w還可使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)域展示在攜帶編碼功能性抗體結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面上。在具體實(shí)施方案，這種噬菌體可用于展示從整套或組合抗體文庫(如，人類或鼠)表達(dá)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv。表達(dá)結(jié)合目標(biāo)抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可用抗原選擇或鑒定，如，使用標(biāo)記的抗原或結(jié)合或捕獲到固相表面或珠的抗原。用于這些方法的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白的重組融合蛋白?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示方法的實(shí)例包括描述在以下的方法=Brinkmarm等人(1995)"PhageDisplayOfDisulfide-StabilizedFvFragments(噬菌體展示二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段)，，J.Immunol.Methods,18241-50；Ames^A(1995)"ConversionOfMurineFabsIsolatedFromACombinatorialPhageDisplayLibraryToFullLengthImmunoglobulins(將從組合噬菌體展示文庫分離的鼠Fab轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)免疫球蛋白)”J.Immunol.Methods,184177-186；Kettleborough等人(1994)“IsolationOfTumorCell-SpecificSingle-ChainFvFromImmunizedMiceUsingPhage-AntibodyLibrariesAndTheRe-ConstructionOfWholeAntibodiesFromTheseAntibodyFragments(使用噬菌體-抗體文庫從免疫的小鼠分離腫瘤細(xì)胞特異性單鏈Fv并從這些抗體片段重新構(gòu)建完全抗體)，，Eur.J.Immunol，24:952-958;Persic等人(1997)"AnIntegratedVectorSystemForTheEukaryoticExpressionOfAntibodiesOrTheirFragmentsAfterSelectionFromPhageDisplayLibraries(從噬菌體展示文庫選擇后用于真核表達(dá)抗體或其片段的整合的載體系統(tǒng))，，Gene，187:9_18；Burton等人(1994)"HumanAntibodiesFromCombinatorialLibraries(來自組合文庫的人類抗體)"Advancesinlmmunology,57:191_280；PCT申請(qǐng)第PCT/GB91/01134號(hào)；PCT公布W090/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美國(guó)專利第5，698，426；5，223，409；5，403，484；5，580，717；5，427，908；5，750，753；5，821，047；5，571，698；5，427，908；5，516，637；5，780，225；5,658，727；5,733，743和5，969，108號(hào)；所有這些通過引用全文并入本文?？捎檬删w展示技術(shù)來增加抗體對(duì)其抗原的親和性。此技術(shù)可用于獲得高親和性抗體。該技術(shù)稱作親和力成熟，其采用誘變或CDR步移和再選擇，利用同源抗原來鑒定與初始抗體或親本抗體相比以更高親和性與所述抗原結(jié)合的抗體(參見例如，Glaser等人(1992)"DissectionOfTheCombiningSiteInAHumanizedAnti-TacAntibody(剖析人源化抗-Tac抗體中的組合位點(diǎn))”J.Immunology149=2607-2614)。誘變?nèi)棵艽a子而非單一核苷酸產(chǎn)生半隨機(jī)的整套氨基酸突變?？蓪⑽膸鞓?gòu)建成包含一組變體克隆，每一克隆的單個(gè)CDR中的單個(gè)氨基酸改變都不同，且該克隆含有代表各個(gè)CDR殘基的各個(gè)可能氨基酸取代的變體。對(duì)所述抗原的結(jié)合親和性增加的突變體可通過將固定的突變體與標(biāo)記的抗原接觸來篩選?？刹捎萌魏伪绢I(lǐng)域公知的篩選方法來鑒定對(duì)所述抗原的親和力增加的突變抗體(例如ELISA)(參見Wu等人(1998)“St印wiseInVitroAffinityMaturationOfVitaxin,AnAlphavBeta3-SpecificHumanizedmAb(—種αvβ3_特異性人源化mAbVitaxin的逐步體外親和力成熟)”ProcNatl.AcadSci.USA956037-6042；Yelton等人(1995)"AffinityMaturationOfTheBr96Anti-CarcinomaAntibodyByCodon-BasedMutagenesis(通過基于密碼子的誘變Br96抗-癌抗體的親和力成熟)”J.Immunology1551994-2004)。也可使用使輕鏈隨機(jī)化的CDR步移(參見Schier等人(1996)"IsolationOfPicomolarAffinityAnti-C-ErbB-2Single-ChainFvByMolecularEvolutionOfTheComplementarityDeterminingRegionsInTheCenterOfTheAntibodyBindingSite(通過抗體結(jié)合位點(diǎn)中心中的互補(bǔ)決定區(qū)的分子進(jìn)化分離皮摩爾親和性抗-C-ErbB-2單鏈)”J.Mol.Bio.263:551_567)。本發(fā)明還涵蓋包含本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、在框架或⑶R區(qū)中帶有突變(如，一種或多種氨基酸取代)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途。優(yōu)選地，這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的突變保持或增強(qiáng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿庖咛禺愋缘亟Y(jié)合的FcyRIIB的親和力和/或親和性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，免疫測(cè)定)可用于測(cè)定抗體對(duì)特定抗原的親和性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于在編碼抗體或其片段的核苷酸序列中引入突變，包括如，定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變，其造成氨基酸取代。優(yōu)選地，衍生物相對(duì)于原始抗體或其片段包含少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代或少于2氨基酸取代。在優(yōu)選實(shí)施方案，衍生物在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基中具有保守氨基酸取代。5.1.1包含免疫特異性地結(jié)合FcyRIIB的表位結(jié)合位點(diǎn)的雙抗體在具體實(shí)施方案，本發(fā)明雙抗體的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域激動(dòng)FcγRIIB的至少一種活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述活性是抑制B細(xì)胞受體-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制B細(xì)胞的活化、B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生、B細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣流入、細(xì)胞周期進(jìn)程、或FcγRIIB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一種或多種下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的活性。在另一實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)FcyRIIB磷酸化或SHIP募集。在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制MAP激酶活性或B細(xì)胞受體-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中Akt募集。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域激動(dòng)FcyRIIB-介導(dǎo)的FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)抑制。在具體實(shí)施方案，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制FcεRI-誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化、鈣動(dòng)員、脫粒、細(xì)胞因子產(chǎn)生、或5-羥色胺釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域刺激FcyRIIB磷酸化，刺激SHIP募集，刺激SHIP磷酸化和與Shc締合，或抑制MAP激酶家族成員(如，Erkl、Erk2、JNK、p38等等)活化。在另一實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)p62dok的酪氨酸磷酸化和其與SHIP和rasGAP締合。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中FcγR-介導(dǎo)的吞噬作用。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域拮抗FcγRIIB的至少一種活性。在一個(gè)實(shí)施方案，所述活性是活化B細(xì)胞受體-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在具體實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)B細(xì)胞活性、B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣流入、或FcyRIIB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一種或多種下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的活性。在另一具體實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域減少FcYRIIB磷酸化或SHIP募集。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)MAP激酶活性或B細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中Akt募集。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域拮抗FcyRIIB-介導(dǎo)的抑制FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)。在具體實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)FcεRI-誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化、鈣動(dòng)員、脫粒、細(xì)胞因子產(chǎn)生、或5-羥色胺釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制FcyRIIB磷酸化，抑制SHIP募集，抑制SHIP磷酸化和其與Shc的締合，增強(qiáng)MAP激酶家族成員(如，ErkUErk2、JNK、p38等等)的活化。在另一實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制p62dok的酪氨酸磷酸化和其與SHIP和rasGAP的締合。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中FcγR-介導(dǎo)的吞噬作用。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域阻止吞噬作用、由脾臟巨噬細(xì)胞清除調(diào)理的粒子。在其他實(shí)施方案，至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于靶向本發(fā)明的雙抗體于表達(dá)FcyRIIB的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一來源于分別具有ATCC登記號(hào)PTA-4591和PTA-4592的克隆2B6或3H7產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體。產(chǎn)生抗體2B6和3H7的雜交瘤已經(jīng)按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在2002年8月13日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBlvd.，Manassas,VA.20110-2209)，指定登記號(hào)分別為PTA-4591(產(chǎn)生2B6的雜交瘤)和PTA-4592(產(chǎn)生3H7的雜交瘤)，通過引用并入本文。在優(yōu)選實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人類或已被人源化的，優(yōu)選地來源于由克隆3H7或2B6產(chǎn)生的抗體的人源化形式。本發(fā)明還涵蓋具有來自特異性地結(jié)合FcyRIIB、優(yōu)選地人類FcyRIIB、更優(yōu)選地天然人類FcyRIIB的其他抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙抗體，所述其他抗體來源于包括但不限于分別具有ATCC登記號(hào)ΡΤΑ-5958、ΡΤΑ-5961、ΡΤΑ-5962、ΡΤΑ-5960和ΡΤΑ-5959的1D5、2E1、2H9、2D11和1F2的克隆。產(chǎn)生以上鑒定克隆的雜交瘤按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在2004年5月7日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBlvd.，Manassas,VA.20110-2209)，通過引用并入本文。在優(yōu)選實(shí)施方案，來自上述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人源化的。在特定實(shí)施方案，用在本發(fā)明雙抗體中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是來自由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的抗體的抗體或其抗原-結(jié)合片段(如，包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，優(yōu)選地所有6個(gè)⑶R)。在另一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別與克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體結(jié)合于相同表位，和/或與克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)，如，在ELISA測(cè)定或其他合適的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定確定的，還比結(jié)合FcyRIIA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以更大親和性結(jié)合FcyRIIB。本發(fā)明還涵蓋具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙抗體，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的可變重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙抗體，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域比結(jié)合FcγRIIA的所述抗體或其片段以更大親和性特異性地結(jié)合FCγRIIB，并包含與由克隆2B6、3H7、lD5、2El、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)⑶R的氨基酸序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列。確定兩條氨基酸序列的同一性百分比可由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法確定，包括BIAST蛋白檢索。本發(fā)明還涵蓋包含比結(jié)合FcγRIIA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以更大親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙抗體的用途，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域由與克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列編碼。在優(yōu)選實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域以比對(duì)FcyRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB,并包含與克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的可變輕鏈和/或可變重鏈的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列編碼的可變輕鏈和/或可變重鏈。在另一優(yōu)選實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域以比對(duì)FcyRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB,并包含在嚴(yán)格條件下與克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的一個(gè)或多個(gè)CDR。嚴(yán)格雜交條件包括但不限于，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C與濾器結(jié)合的DNA雜交，隨后在0.2XSSC/0.SDS中在約50-65°C—次或多次洗滌，高度嚴(yán)格條件諸如在6XSSC中在約45°C與濾器結(jié)合的DNA雜交，隨后在0.IXSSC/0.2%303中在約601—次或多次洗滌，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他嚴(yán)格雜交條件(參見例如，Ausubel,F.M.等人編輯，1989，CurrentProtocolsinMolecularBioloRy(分子生物學(xué)最新方案)，第1卷，GreenPublishingAssociates,Inc.和JohnWileyandSons,Inc.，NY中第6·3.1到6·3.6頁和第2·10.3頁，通過引用并入本文)。本發(fā)明還涵蓋包含上述的任何結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、在框架或CDR區(qū)中帶有突變(如，一種或多種氨基酸取代)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途。優(yōu)選地，這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的突變保持或增強(qiáng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿庖咛禺愋缘亟Y(jié)合的FcyRIIB的親和力和/或親和性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，免疫測(cè)定)可用于測(cè)定抗體對(duì)特定抗原的親和性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于在編碼抗體或其片段的核苷酸序列中引入突變，包括如，定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變，其造成氨基酸取代。優(yōu)選地，衍生物相對(duì)于原始抗體或其片段包含少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代或少于2氨基酸取代。在優(yōu)選實(shí)施方案，衍生物在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基中具有保守氨基酸取代。在優(yōu)選實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于人源化抗體。人源化FcγRIIB特異性抗體可包括基本上所有的至少一個(gè)、典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有⑶R區(qū)對(duì)應(yīng)于非-人類免疫球蛋白(即，供者抗體)的CDR區(qū)且所有或基本上所有框架區(qū)是人類免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。本發(fā)明的雙抗體包括對(duì)FcγRIIB特異性的人源化可變結(jié)構(gòu)域，其中人類抗體(受者抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)CDR的一個(gè)或多個(gè)區(qū)已被供者單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的相似部分取代，所述供者單克隆抗體以比對(duì)FcγRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcγRIIB，如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的單克隆抗體。在其他實(shí)施方案，人源化抗體分別與2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2結(jié)合于相同表位。在優(yōu)選實(shí)施方案，人源化FcγRIIB結(jié)合結(jié)構(gòu)域的⑶R區(qū)來源于對(duì)FcyRIIB特異性的鼠抗體。在一些實(shí)施方案，本文所述的人源化抗體包括改變，包括但不限于受者抗體即人類抗體的重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)對(duì)于保持供者單克隆抗體的結(jié)合特異性必需的氨基酸缺失、添加、修飾。在一些實(shí)施方案，本文所述的人源化抗體的框架區(qū)不必由天然存在的人類抗體可變區(qū)的框架區(qū)的準(zhǔn)確氨基酸序列組成，但包含各種改變，包括但不限于改變?nèi)嗽椿贵w特征例如改進(jìn)與鼠FcyRIIB特異性抗體對(duì)相同靶特異性的人源化抗體區(qū)的結(jié)合性質(zhì)的氨基酸缺失、添加、修飾。在最優(yōu)選的實(shí)施方案，對(duì)框架區(qū)進(jìn)行最少數(shù)目的改變以避免大規(guī)模引入非-人類框架殘基并確保人源化抗體在人類中的免疫原性最小。供者單克隆抗體優(yōu)選地是克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的單克隆抗體。在特定實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域涵蓋以比所述抗體結(jié)合FcγRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB的⑶R-嫁接的抗體的可變結(jié)構(gòu)域，其中⑶R-嫁接的抗體包括包含受者抗體的框架殘基和來自供者單克隆抗體的殘基的重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，該單克隆抗體以比所述抗體結(jié)合FcyRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB,如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的單克隆抗體。在另一特定實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體包括來自CDR-嫁接的抗體的可變結(jié)構(gòu)域，所述抗體以比所述抗體結(jié)合FcγRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcyRIIB，其中⑶R-嫁接的抗體包括包含受者抗體的框架殘基和來自供者單克隆抗體的殘基的輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，該單克隆抗體以比所述抗體結(jié)合FcyRIIA更大的親和性特異性地結(jié)合FcγRIIB，如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2產(chǎn)生的單克隆抗體。用于本發(fā)明的人源化抗-FcγRIIB可變結(jié)構(gòu)域可具有包含CDRl(SEQIDNO24或SEQIDNO25)和/或CDR2(SEQIDNO26或SEQIDNO27)和/或CDR3(SEQIDNO28或SEQIDNO29)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和/或包含CDRl(SEQIDNO32或SEQIDNO33)和/或CDR2(SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO36或SEQIDNO37)和/或CDR3(SEQIDNO38或SEQIDNO39)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)特定實(shí)施方案，雙抗體包括來自人源化2B6抗體的可變結(jié)構(gòu)域，其中VH區(qū)由來自人類種系VH區(qū)段VH1-18(Matsuda等人(1998)"TheCompleteNucleotideSequenceOfTheHumanImmunoglobulinHeavyChainVariableRegionLocus(人類免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座的完全核苷酸序列)”J.Exp.Med.188:2151_2162)和JH6的FR區(qū)段(Ravetch等人(1981)"StructureOfTheHumanImmunoglobulinMuLocusCharacterizationOfEmbryonicAndRearrangedJAndDGenes(人類免疫球蛋白Mu基因座的結(jié)構(gòu)表征胚胎的和重排的J和D基因)”Cell27(3Pt.2):583_91)、以及2B6VH的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)組成，具有氨基酸序列SEDIDNO:24、SEQIDNO26或SEQIDNO:28。在一個(gè)實(shí)施方案，2B6VH具有氨基酸序列SEQIDNO:40。在另一個(gè)實(shí)施方案，2B6VH結(jié)構(gòu)域具有Hu2B6VH的氨基酸序列SEQIDNO:87，并可被核苷酸序列SEQIDN0:88編碼。在另一特定實(shí)施方案，雙抗體進(jìn)一步包括VL區(qū)，其由人類種系VL區(qū)段VK-A26(Lautner-Rieske等人(1992)"TheHumanImmunoglobulinKappaLocus.CharacterizationOfTheDuplicatedARegions(人類免疫球蛋白κ基因座。表征雙重A區(qū))，，Eur.J.Immunol.221023-1029)禾口JK4的FR區(qū)段(Hieter等人(1982)"EvolutionOfHumanImmunoglobulinKappaJRegionGenes(人類免疫球蛋白κJ區(qū)基因的進(jìn)化)”J.Biol.Chem.257:1516_22)、以及2B6VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)組成，具有氨基酸序列SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDN0:35,SEQIDN0:36和SEQIDNO:38。在一個(gè)實(shí)施方案，2B6VL具有氨基酸序列SEQIDN0:41；SEQIDNO42或SEQIDNO:43。在特定實(shí)施方案，2B6VL具有Hu2B6VL的氨基酸序列SEQIDNO:89，并可被SEQIDNO:90提供的核苷酸序列編碼。在另一特定實(shí)施方案，雙抗體具有來自人源化3H7抗體的可變結(jié)構(gòu)域，其中VH區(qū)由來自人類種系VH區(qū)段的FR區(qū)段和3H7VH的⑶R區(qū)組成，具有氨基酸序列SEDIDN037。在另一特定實(shí)施方案，人源化3H7抗體進(jìn)一步包括VL區(qū)，其由人類種系VL區(qū)段的FR區(qū)段和3H7VL的⑶R區(qū)組成，具有氨基酸序列SEQIDNO:44。特別是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫特異性地結(jié)合于天然人類FcγRIIB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，并包括2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2的CDR序列(或可選地由其組成)，以以下的任何組合:VHCDRl與VLCDRl；VHCDRl與VLCDR2；VHCDRl與VLCDR3；VHCDR2與VLCDRl；VHCDR2與VLCDR2；VHCDR2與VLCDR3；VHCDR3與VHCDRl；VHCDR3與VLCDR2；VHCDR3與VLCDR3；VHlCDRl、VHCDR2與VLCDRl；VHCDRl、VHCDR2與VLCDR2；VHCDRl、VHCDR2與VLCDR3；VHCDR2、VHCDR3與VLCDRUVHCDR2、VHCDR3與VLCDR2；VHCDR2、VHCDR2與VLCDR3；VHCDRUVLCDRl與VLCDR2；VHCDRUVLCDRl與VLCDR3；VHCDR2、VLCDRl與VLCDR2；VHCDR2、VLCDRl與VLCDR3；VHCDR3、VLCDRl與VLCDR2；VHCDR3、VLCDRl與VLCDR3；VHCDRl、VHCDR2、VHCDR3與VLCDRl；VHCDRl、VHCDR2、VHCDR3與VLCDR2；VHCDRUVHCDR2、VHCDR3與VLCDR3；VHCDRUVHCDR2、VLCDRl與VLCDR2、VHCDRUVHCDR2、VLCDRl與VLCDR3；VHCDRUVHCDR3、VLCDRl與VLCDR2；VHCDRUVHCDR3、VLCDRl與VLCDR3；VHCDR2、VHCDR3、VLCDRl與VLCDR2；VHCDR2、VHCDR3、VLCDRl與VLCDR3；VHCDR2、VHCDR3、VLCDR2與VLCDR3；VHCDRUVHCDR2、VHCDR3、VLCDRl與VLCDR2；VHCDRUVHCDR2、VHCDR3、VLCDRl與VLCDR3；VHCDRUVHCDR2、VLCDRl、VLCDR2與VLCDR3；VHCDRl、VHCDR3、VLCDRl、VLCDR2與VLCDR3；VHCDR2、VHCDR3、VLCDRl、VLCDR2與VLCDR3；或本文公開的VHCDR與VLCDR的其任何組合。用于衍生將包括在本發(fā)明的雙抗體中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體可進(jìn)一步由表位作圖表征，從而可選擇與FcyRIIA相比對(duì)FcyRIIB具有最大特異性的抗體。抗體的表位作圖方法是本領(lǐng)域公知的并涵蓋在本發(fā)明的方法中。在某些實(shí)施方案，包含F(xiàn)cγRIIB的一個(gè)或多個(gè)區(qū)的融合蛋白可用于對(duì)本發(fā)明的抗體的表位作圖。在特定實(shí)施方案，融合蛋白包含與人類IgG2的Fc部分融合的FcγRIIB區(qū)的氨基酸序列。各融合蛋白可進(jìn)一步包括以來自同系受體如，F(xiàn)cyRIIA的相應(yīng)區(qū)氨基酸取代和/或代替某些受體區(qū)，如下表2所示。pMGX125和PMGX132含有FcyRIIB受體的IgG結(jié)合位點(diǎn)，pMGX125帶有FcyRIIB的C-末端，pMGX132帶有FcγRIIA的C-末端，可用于區(qū)別C-末端結(jié)合。其他的在IgG結(jié)合位點(diǎn)中具有FcyRIIA取代和FcγIIA或FcγIIBN-末端。這些分子可幫助確定受體分子中結(jié)合抗體的部分。表2.可用于研究單克隆抗-FcγRIIB抗體的表位的融合蛋白列表。殘基172至180屬于FcYRIIA和B的IgG結(jié)合位點(diǎn)。來自FcγRIIA序列的特定氨基酸以粗體表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>融合蛋白可用在任何生化測(cè)定如ELISA以確定結(jié)合于本發(fā)明的抗-FcγRIIB抗體。在其他實(shí)施方案，進(jìn)一步證實(shí)表位特異性可以使用具有以來自FcYRIIA序列的殘基代替的特定殘基的肽來進(jìn)行?？贵w可使用用于鑒定本發(fā)明的抗體的功能、特別是調(diào)節(jié)FcYRIIB信號(hào)傳導(dǎo)的活性的測(cè)定來表征。例如，本發(fā)明的表征測(cè)定可測(cè)量FcγRIIB的ITIM基序中酪氨酸殘基的磷酸化，或測(cè)量B細(xì)胞受體-產(chǎn)生的鈣動(dòng)員的抑制。本發(fā)明的表征測(cè)定可以是基于細(xì)胞的測(cè)定或無細(xì)胞測(cè)定。本領(lǐng)域已經(jīng)確定，肥大細(xì)胞中FcyRIIB與高親和性IgE受體FcεRI共聚集導(dǎo)致抑制抗原-誘導(dǎo)的脫粒、鈣動(dòng)員和細(xì)胞因子產(chǎn)生(MetcalfeD.D.等人(1997)"MastCells(肥大細(xì)Ifi)"Physiol.Rev.771033-1079；LongΕ.0.(1999)"RegulationOfImmuneResponsesThroughInhibitoryReceptors(經(jīng)由抑制性受體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答)”Armu.Rev.Immunol.17:875_904)。該信號(hào)傳導(dǎo)途徑的分子細(xì)節(jié)最近已經(jīng)解釋(OttV.L.(2002)"DownstreamOfKinase,p62(dok),IsAMediatorOfFcgammaIIBInhibitionOfFcEpsilonRISignaling(激酶p62(dok)的下游是FcγIIB抑制FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)的介質(zhì))”J.Immunol.162(9)=4430-4439)0與FcεRI共聚集后，F(xiàn)cγRIIBITIM基序中的酪氨酸被快速磷酸化，隨后募集含有Src同源性-2的肌醇-5-磷酸酯酶(SHIP)(一種包含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酯5-磷酸酯酶)，其反過來被磷酸化并與Shc和p62dok締合(p62dok是適體分子家族的原型，包括信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域諸如氨基末端普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域(PH結(jié)構(gòu)域)、PTB結(jié)構(gòu)域和包含PXXP基序的羧基末端區(qū)和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Carpino等人(1997)"p62(dok):AConstitutivelyTyrosine-PhosphoryIated,GAP-AssociatedProteinInChronicMyelogenousLeukemiaProgenitorCells(p62(dok)個(gè)曼個(gè)生髓個(gè)生白血病祖細(xì)胞中一種組成型酪氨酸-磷酸化的、GAP-相關(guān)蛋白)”Cell，88197-204；Yamanshi等)κ(1997)“IdentificationOfTheAbl-AndrasGAP-Associated62kDaProteinAsADockingProtein,Dok(鑒定Abl-和rasGAP-相關(guān)的62kDa蛋白為停靠蛋白Dok)”Cell，88205-211)。用于本發(fā)明的抗-FcYRIIB抗體可類似地由調(diào)節(jié)一種或多種IgE介導(dǎo)的響應(yīng)的能力而表征。優(yōu)選地，共表達(dá)對(duì)IgE高親和性的受體和對(duì)FcγRIIB低親和性的受體的細(xì)胞系將用于表征抗-FcYRIIB抗體調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的響應(yīng)。在特定實(shí)施方案，將使用來自大鼠嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系(RBL-H23；BarsumianE.L.等人(1981)"IgE-InducedHistamineReleaseFromRatBasophilicLeukemiaCellLines!IsolationOfReleasingAndNonreleasingClonesdgE-誘導(dǎo)的從大鼠嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系釋放組胺分離釋放性和非釋放性克隆)"Eur.J.Immunol.11=317-323,其通過引用全文并入本文)、轉(zhuǎn)染了全長(zhǎng)人類FcγRIIB的細(xì)胞。RBL-2H3是一種充分表征的大鼠細(xì)胞系，已經(jīng)廣泛用于研究IgE-介導(dǎo)的細(xì)胞活化后的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理。當(dāng)在RBL-2H3細(xì)胞中表達(dá)并與FcεRI共聚集時(shí)，F(xiàn)cγRIIB抑制FcεRI-誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員、脫粒和細(xì)胞因子產(chǎn)生(Malbec等人(1998)"FeEpsilonReceptorI-AssociatedLyn-DependentPhosphorylationOfFcGammaReceptorHBDuringNegativeRegulationOfMastCellActivation(在月巴大細(xì)胞活化負(fù)調(diào)節(jié)期間Fcε受體I-相關(guān)的Lyn-依賴性磷酸化Fcγ受體HB)”J.Immunol.1601647-1658；Daeron等)κ(1995)"RegulationOfHigh-AffinityIgEReceptor-MediatedMastCellActivationByMurineLow-AffinityIgGRec印tors(由鼠低一親禾口性IgG受體調(diào)節(jié)高-親和性IgE受體-介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化)”J.Clin.Invest.95577；OttV.L.(2002)"DownstreamOfKinase,p62(dok)，IsAMediatorOfFcgammaIIBInhibitionOfFcEpsilonRISignaling(激酶p62(dok)的下游是FcγIIB抑制FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)的介質(zhì))”J.Immunol.162(9)4430-4439)。用于本發(fā)明的抗體還可由抑制FcεRI誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化而表征。例如，將來自大鼠嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系(RBL-H23；BarsumianE.L.等人(1981)"IgE-InducedHistamineReleaseFromRatBasophilicLeukemiaCellLines!IsolationOfReleasingAndNonreleasingClones(IgE-誘導(dǎo)的從大鼠嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系釋放組胺分離釋放性和非釋放性克隆)"Eur.J.Immunol.11=317-323)、已經(jīng)轉(zhuǎn)染FcyRIIB的細(xì)胞用IgE敏化并用兔抗_小鼠IgG的F(ab’)2片段刺激以僅聚集FcεRI，或用全長(zhǎng)兔抗-小鼠IgG刺激以共聚集FcYRIIB和FcεRI0該系統(tǒng)中，加入本發(fā)明的抗體到被敏化和刺激的細(xì)胞后可測(cè)定對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的間接調(diào)節(jié)。例如，可測(cè)定FcyRIIB的酪氨酸磷酸化和SHIP的募集與磷酸化、MAP激酶家族成員，包括但不限于Erkl、Erk2、JNK或p38的活化；和p62dok的酪氨酸磷酸化以及其與SHIP和RasGAP的締合。用于確定本發(fā)明的抗體對(duì)FcεRI誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化的抑制的一種示例性測(cè)定可包括以下用人類FcyRIIB轉(zhuǎn)染RBL-H23細(xì)胞；用IgE敏化RBL-H23細(xì)胞；用兔抗-小鼠IgG的F(ab，)2刺激RBL-H23細(xì)胞(以僅聚集FcεRI并引發(fā)FcεRI-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，作為對(duì)照)，或用全長(zhǎng)兔抗_小鼠IgG刺激RBL-H23細(xì)胞(以共聚集FcyRIIB和FcεRI，導(dǎo)致抑制FcεRI-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo))。已用全長(zhǎng)兔抗_小鼠IgG抗體刺激的細(xì)胞可進(jìn)一步用本發(fā)明的抗體預(yù)培養(yǎng)。測(cè)量已用本發(fā)明的抗體預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞和未用本發(fā)明的抗體預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞的FcεRI-依賴性活性并比較這些細(xì)胞FcεRI-依賴性活性的水平將指示本發(fā)明的抗體對(duì)FcεRI-依賴性活性的調(diào)節(jié)。上述示例性測(cè)定可例如用于鑒定封閉配體(IgG)對(duì)FcγRIIB受體的結(jié)合并通過阻止FcγRIIB與FcεRI共聚集而拮抗FcγRIIB-介導(dǎo)的FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)抑制的抗體。該測(cè)定同樣地鑒定增強(qiáng)FcγRIIB與FcεRI共聚集并通過促進(jìn)FcγRIIB與FcεRI共聚集而激動(dòng)FcyRIIB-介導(dǎo)的FcεRI信號(hào)傳導(dǎo)抑制的抗體。在一些實(shí)施方案，通過優(yōu)選地在基于細(xì)胞的測(cè)定中監(jiān)控和/或測(cè)量肥大細(xì)胞或嗜堿白細(xì)胞的脫粒來表征包含本文所述鑒定的或本領(lǐng)域已知的抗-FcYRIIB抗體的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的抗-FcYRIIB雙抗體調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的響應(yīng)的能力。優(yōu)選地，用于這種測(cè)定中的肥大細(xì)胞或嗜堿白細(xì)胞已使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)重組方法被工程化為含有人類FcyRIIB。在特定實(shí)施方案，本發(fā)明的抗-FcγRIIB抗體在基于細(xì)胞的β-己糖胺酶(顆粒中含有的酶)釋放測(cè)定中被表征其調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的響應(yīng)的能力。β-己糖胺酶從肥大細(xì)胞和嗜堿白細(xì)胞釋放是急性變應(yīng)性和炎性情況的主要事件(Aketani等人(2001)“CorrelationBetweenCytosolicCalciumConcentrationAndDegranulationInRBL-2H3CellsInThePresenceOfVariousConcentrationsOfAntigen-SpecificIgEs(RBL-2H3細(xì)胞中在不同濃度的抗原-特異性IgE存在下細(xì)胞溶質(zhì)鈣濃度與脫粒之間的相關(guān)性)”Immunol.Lett.75185-189；Aketani等人(2000)"AScreeningMethodForAntigen-SpecificIgEUsingMastCellsBasedOnIntracellularCalciumSignaling(使用肥大細(xì)胞基于細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)抗原-特異性IgE的篩選方法)”Anal.Chem.72=2653-2658)?？蓽y(cè)定包括但不限于5-羥色胺和組胺的其他炎癥介質(zhì)的釋放以根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)量IgE介導(dǎo)的響應(yīng)。盡管不希望受特定作用機(jī)制的限制，從肥大細(xì)胞和嗜堿白細(xì)胞釋放顆粒諸如含有β-己糖胺酶的顆粒是細(xì)胞內(nèi)鈣濃度依賴性過程，其由FcyRI與多價(jià)抗原交聯(lián)而起始。研究人類肥大細(xì)胞的能力已經(jīng)受到不存在合適的長(zhǎng)期人類肥大細(xì)胞培養(yǎng)物的限制。最近從肥大細(xì)胞肉瘤/白血病患者的骨髓吸出物建立了兩種新型干細(xì)胞因子依賴性人類肥大細(xì)胞系，稱為L(zhǎng)AD1和LAD2(Kirshenbaum等人(2003)"CharacterizationOfNovelStemCellFactorResponsiveHumanMastCellLinesLADlAnd2EstablishedFromAPatientffithMastCellSarcoma/Leukemia；ActivationFollowingAggregationOfFcRIOrFcYRI(表征從肥大細(xì)胞肉瘤/白血病患者建立的新型干細(xì)胞因子響應(yīng)性人類肥大細(xì)胞系LAD1和2；聚集FcRI或FcγRI后活化)”Leukemiaresearch,27:677_82，其通過引用全文并入本文。)。這兩種細(xì)胞系都被描述為表達(dá)FcεRI和多種人類肥大細(xì)胞標(biāo)記物。LAD1和2細(xì)胞可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的抗體對(duì)IgE介導(dǎo)的響應(yīng)的效應(yīng)。在特定實(shí)施方案，基于細(xì)胞的β“己糖胺酶釋放測(cè)定諸如上述測(cè)定可用于LAD細(xì)胞以確定本發(fā)明的抗-FcyRIIB抗體對(duì)IgE-介導(dǎo)的響應(yīng)的任何調(diào)節(jié)。在示例性測(cè)定中，人類肥大細(xì)胞如，LADl被嵌合人類IgE抗-硝基苯酚(NP)引發(fā)，并用多價(jià)抗原BSA-NP攻擊，通過測(cè)量上清液中釋放的β-己糖胺酶監(jiān)控細(xì)胞脫粒(Kirshenbaum等人(2003)“CharacterizationOfNovelStemCellFactorResponsiveHumanMastCellLinesLAD1And2EstablishedFromAPatientffithMastCellSarcoma/Leukemia；ActivationFollowingAggregationOfFcRIOrFcYRI(表征從肥大細(xì)胞肉瘤/白血病患者建立的新型干細(xì)胞因子響應(yīng)性人類肥大細(xì)胞系LAD1和2；聚集FcRI或FcγRI后活化)”Leukemiaresearch,27:677_82，其通過引用全文并入本文。)。在一些實(shí)施方案，如果人類肥大細(xì)胞具有低表達(dá)的內(nèi)源FcγRIIB，如使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法如FACS染色確定的，可能難以監(jiān)控和/或檢測(cè)本發(fā)明的抗-FcyRIIB雙抗體介導(dǎo)的抑制性途徑的活化的差異。因此本發(fā)明涵蓋替代方法，藉以FcγRIIB表達(dá)可使用細(xì)胞因子和特定生長(zhǎng)條件而被上調(diào)。已描述FcyRIIB在人類單核細(xì)胞細(xì)胞系如THPl禾口U937(Tridandapani等人(2002)“RegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCells(人類單核細(xì)胞中FcγRIIB的調(diào)節(jié)的表達(dá)和抑制性功能)”J.Biol.Chem·，277(7)=5082-5089)和原代人類單核細(xì)胞(Pricop等人(2001)"DifferentialModulationOfStimulatoryAndInhibitoryFcGammaReceptorsOnHumanMonocytesByThlAndTh2Cytokines(Thl和Th2細(xì)胞因子對(duì)人類單核細(xì)胞上刺激性和抑制性Fcγ受體的差異性調(diào)節(jié))”J.ofImmunol,166:531_537)中被IL4高度上調(diào)。已經(jīng)描述以聯(lián)丁?；h(huán)AMP分化U937細(xì)胞增加FcyRII的表達(dá)(Cameron等人(2002)"DifferentiationOfTheHumanMonocyteCellLine,U937,WithDibutyrylCyclicAMPInducesTheExpressionOfTheInhibitoryFcReceptor,FcgammaRIIB(以聯(lián)丁?；h(huán)AMP分化人類單核細(xì)胞細(xì)胞系U937誘導(dǎo)抑制性Fc受體FcyRIIB的表達(dá))”ImmunologyLetters83，171-179)。因此用于本發(fā)明方法的人類肥大細(xì)胞中的內(nèi)源FcγRIIB表達(dá)可使用細(xì)胞因子如IL-4、IL-13上調(diào)以增強(qiáng)檢測(cè)敏感性。還可測(cè)定抗-FcγRIIB雙抗體對(duì)B-細(xì)胞受體(BCR)-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。BCR-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可包括至少一種或多種下游生物學(xué)響應(yīng)，諸如活化并增殖B細(xì)胞、抗體產(chǎn)生等等。FcγRIIB與BCR共聚集導(dǎo)致抑制細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活。進(jìn)一步地，F(xiàn)cγRIIB與BCR共聚集導(dǎo)致抑制BCR-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。具體地，BCR-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)包括以下的至少一種或多種調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子(如，F(xiàn)cγRIIB的磷酸化狀態(tài)、SHIP募集、Btk和/或PLCγ的定位、MAP激酶活性、募集Akt(抗-凋亡信號(hào))、鈣動(dòng)員、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。盡管FcγRIIB-介導(dǎo)的抑制BCR信號(hào)傳導(dǎo)的許多效應(yīng)物功能是經(jīng)SHIP介導(dǎo)的，最近已證實(shí)，脂多糖(LPS)-活化的來自SHIP缺陷型小鼠的B細(xì)胞展示顯著的FcyRIIB-介導(dǎo)的抑制鈣動(dòng)員、Ins(1，4，5)P3產(chǎn)生和Erk以及Akt磷酸化(Brauweiler等人(2001)"PartiallyDistinctMolecularMechanismsMediateInhibitoryFcgammaRIIBSignalingInRestingAndActivatedBCells(在靜止和活化的B細(xì)胞中部分地不同的分子機(jī)制介導(dǎo)抑制性FcγRIIB信號(hào)傳導(dǎo))"JournalofImmunology,167(1):204_211)。因此，來自SHIP缺陷型小鼠的活體外B細(xì)胞可被用于表征本發(fā)明的抗體。一種用于確定本發(fā)明抗體的FcγRIIB-介導(dǎo)的抑制BCR信號(hào)傳導(dǎo)的示例性測(cè)定可包括以下從SHIP缺陷型小鼠分離脾B細(xì)胞，以脂多糖活化所述細(xì)胞，并用F(ab’)2抗-IgM刺激所述細(xì)胞以聚集BCR或以抗-IgM刺激以共聚集BCR與FcγRIIB。已被完整抗-IgM刺激以共聚集BCR與FcγRIIB的細(xì)胞可進(jìn)一步用本發(fā)明的抗體預(yù)培養(yǎng)。細(xì)胞的FcγRIIB-依賴性活性可由本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量。比較已經(jīng)與抗體一起預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞與未預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞的FcyRIIB-依賴性活性水平，比較水平將表示抗體對(duì)FcyRIIB-依賴性活性的調(diào)節(jié)。測(cè)量FcγRIIB-依賴性活性可包括，例如由流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員，測(cè)量Akt和/或Erk的磷酸化，測(cè)量BCR-介導(dǎo)的PI(3,4,5)P3累積，或測(cè)量FcyRIIB-介導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。測(cè)定可用于例如鑒定用于本發(fā)明的雙抗體或抗-FcγRIIB抗體，其通過封閉對(duì)FcYRIIB受體的配體(IgG)結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)節(jié)FcγRIIB-介導(dǎo)的抑制BCR信號(hào)傳導(dǎo)并通過阻止FcγRIIB與BCR共聚集而拮抗FcyRIIB-介導(dǎo)的抑制BCR信號(hào)傳導(dǎo)。測(cè)定還可用于鑒定增強(qiáng)FcγRIIB與BCR共聚集并激動(dòng)FcyRIIB-介導(dǎo)的BCR信號(hào)傳導(dǎo)抑制的抗體。還可測(cè)定抗-FcγRIIB抗體在人類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中FcyRII-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。FcγRIIB與帶有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的受體共聚集作用以下調(diào)FcγR-介導(dǎo)的吞噬作用，使用SHIP作為其效應(yīng)物(Tridandapani等人(2002)"RegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCells(人類單核細(xì)胞中FcyRIIB的調(diào)節(jié)的表達(dá)和抑制性功能)”J.Biol.Chem.,277(7)=5082-5089)。FcγRIIA與FcγRIIB共聚集造成FcyRIIB的ITIM基序上的酪氨酸殘基快速磷酸化，導(dǎo)致SHIP磷酸化增強(qiáng)，SHIP與Shc締合，和具有分子量120和60_65kDa的蛋白磷酸化。此外，F(xiàn)cγRIIA與FcγRIIB共聚集造成Akt磷酸化下調(diào)，Akt是牽涉在細(xì)胞調(diào)節(jié)中并作用以抑制凋亡的絲氨酸-蘇氨酸激酶。還可測(cè)定抗-FcγRIIB雙抗體在人類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中對(duì)FcyR-介導(dǎo)的吞噬作用的抑制。例如，來自人類單核細(xì)胞系THP-I的細(xì)胞可被針對(duì)FCYRII的小鼠單克隆抗體IV.3和山羊抗-小鼠抗體的Fab片段刺激(以僅聚集FcyRIΙΑ)，或被完全I(xiàn)V.3小鼠單克隆抗體和山羊抗-小鼠抗體刺激(以共聚集FcγRIIA與FCYRIIB)。該系統(tǒng)中，通過加入本發(fā)明的分子到刺激后的細(xì)胞可測(cè)定下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的調(diào)節(jié)，諸如FcγRIIB的酪氨酸磷酸化、SHIP磷酸化、SHIP與Shc締合、Akt磷酸化、和具有分子量120和60_65kDa的蛋白磷酸化。此外，單核細(xì)胞細(xì)胞系的FcYRIIB-依賴性吞噬效力可在本發(fā)明的抗體存在和不存在下直接測(cè)量。用于確定本發(fā)明的抗體在人類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中對(duì)FcYR-介導(dǎo)的吞噬作用的抑制的另一種示例性測(cè)定可包括以下以IV.3小鼠抗-FcyRII抗體與山羊抗-小鼠抗體的Fab刺激THP-I細(xì)胞(以僅聚集FcYRIIA并引發(fā)FcYRIIA-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo))；或以小鼠抗-FcyRII抗體和山羊抗-小鼠抗體刺激THP-I細(xì)胞(以共聚集FcγRIIA與FcγRIIB并抑制FcyRIIA-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo))。已被小鼠抗-FcyRII抗體和山羊抗-小鼠抗體刺激的細(xì)胞可進(jìn)一步與本發(fā)明的分子預(yù)培養(yǎng)。測(cè)量已用本發(fā)明的分子預(yù)培養(yǎng)的刺激后的細(xì)胞和未用本發(fā)明的抗體預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞的FcγRIIA-依賴性活性并比較這些細(xì)胞FcγRIIA-依賴性活性的水平將指示本發(fā)明的抗體對(duì)FcyRIIA-依賴性活性的調(diào)節(jié)。上述示例性測(cè)定可例如用于鑒定封閉配體(IgG)對(duì)FcγRIIB受體的結(jié)合并通過阻止FcγRIIB與FcγRIIA共聚集而拮抗FcyRIIB-介導(dǎo)的FcyRIIA信號(hào)傳導(dǎo)抑制的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該測(cè)定同樣地鑒定增強(qiáng)FcγRIIB與FcγRIIA共聚集并激動(dòng)FcyRIIB-介導(dǎo)的FcyRIIA信號(hào)傳導(dǎo)抑制的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？蓽y(cè)定包含在I抗體中的目標(biāo)FcγRIIB結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過以前述方法測(cè)量THP-I細(xì)胞吞噬熒光素化的IgG-調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的能力(Tridandapani等人(2000)"TheAdapterProteinLATEnhancesFcgammaReceptor-MediatedSignalTransductionInMyeloidCells(在髓樣細(xì)胞中適體蛋白LAT增強(qiáng)Fcγ受體-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))”J.Biol.Chem.27520480-7)。例如，用于測(cè)量吞噬作用的示例性測(cè)定包括以本發(fā)明的抗體或不結(jié)合于FcYRII的對(duì)照抗體處理THP-I細(xì)胞，比較所述細(xì)胞的活性水平，其中細(xì)胞活性(如，玫瑰花結(jié)活性(結(jié)合IgG-包被的SRBC的THP-I細(xì)胞數(shù))、粘附活性(結(jié)合THP-I細(xì)胞的SRBC總數(shù))、和吞噬率)的差異將指示本發(fā)明的抗體對(duì)FcyRIIA-依賴性活性的調(diào)節(jié)。例如，該測(cè)定可用于鑒定封閉FcyRIIB受體的配體結(jié)合并拮抗FcyRIIB-介導(dǎo)的抑制吞噬作用的抗體。該測(cè)定還可鑒定增強(qiáng)FcyRIIB-介導(dǎo)的抑制FcyRIIA信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案，人類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中結(jié)合結(jié)構(gòu)域以至少一種或多種以下方式調(diào)節(jié)FcγRIIB-依賴性活性調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子(如，調(diào)節(jié)FcγRIIB磷酸化狀態(tài)，調(diào)節(jié)SHIP磷酸化，調(diào)節(jié)SHIP與Shc締合，調(diào)節(jié)Akt磷酸化，調(diào)節(jié)大約120和60_65kDa的另外蛋白的磷酸化)并調(diào)節(jié)吞噬作用。5.1.2CD16A結(jié)合結(jié)構(gòu)域以下部分討論可用作產(chǎn)生共價(jià)雙抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的來源的CD16A結(jié)合蛋白。本發(fā)明中⑶16A結(jié)合蛋白包括包含抗-⑶16A抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的分子，該VH和VL結(jié)構(gòu)域用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙抗體。多種⑶16A結(jié)合蛋白可用于本發(fā)明。合適的⑶16A結(jié)合蛋白包括人類或人源化單克隆抗體以及CD16A結(jié)合抗體片段(如，scFv或單鏈抗體、Fab片段、微型抗體)和另一種經(jīng)由與輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、或兩者相互作用結(jié)合于CD16A的抗體-樣蛋白。在一些實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明使用的⑶16A結(jié)合蛋白包括VL和/或VH結(jié)構(gòu)域，其具有序列來源于非_人類抗-CD16A抗體諸如小鼠抗-CD16A抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR和來源于一種或多種人類免疫球蛋白的框架序列的一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)。大量可從其獲得CDR和其他序列的非-人類抗-CD16A單克隆抗體是已知的(參見例如，Tamm等人(1996)“TheBindingEpitopesOfHumanCD16(FegammaRIII)MonoclonalAntibodies.ImplicationsForLigandBinding(人類CD16(FeγRIII)單克隆抗體的結(jié)合表位。牽涉配體結(jié)合)”J.Imm.1571576-81；Fleit等人(1989)ρ·159；LEUKOCYTETYPINGIIHUMANMYELOIDANDHEMAT0P0IETICCELLS(白細(xì)胞分型II:人類骨髓和造血細(xì)胞)，Reinherz等人編輯·NewYork=Springer-Verlag；(1986)；LEUCOCYTETYPINGIII=WHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENS(白細(xì)胞分型III白細(xì)胞分化抗原)McMichaelAJ編輯，OxfordOxfordUniversityPress,1986)；LEUKOCYTETYPINGIV=WHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENS(白細(xì)胞分型IV白細(xì)胞分化抗原)，Kapp等人編輯.OxfordUniv.Press,Oxford；LEUKOCYTETYPINGV=WHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENS(白細(xì)胞分型V:白細(xì)胞分化抗原)，Schlossman等人編輯.OxfordUniv.Press,Oxford；LEUKOCYTETYPINGVI=WHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENS(白細(xì)胞分型VI白細(xì)胞分化抗原)，Kishimoto編輯.Taylor&FranciSo此外，如實(shí)施例所示，識(shí)別細(xì)胞上表達(dá)的人類CD16A的新CD16A結(jié)合蛋白可使用產(chǎn)生和選擇單克隆抗體或相關(guān)結(jié)合蛋白的公知方法(如，雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示和類似技術(shù))獲得。參見例如，O'Cormell等人(2002)"PhageVersusPhagemidLibrariesForGenerationOfHumanMonoclonalAntibodies(噬菌體相對(duì)于噬菌粒文庫用于產(chǎn)生人類單克隆抗體)”J.Mol.Biol.32149-56；Hoogenboom等人(2000)"NaturalAndDesignerBindingSitesMadeByPhageDisplayTechnology(天然結(jié)合位點(diǎn)和由噬菌體展示技術(shù)設(shè)計(jì)的結(jié)合位點(diǎn))”Imm.Today21=371078；Rrebs等人(2001)"High-ThroughputGenerationAndEngineeringOfRecombinantHumanAntibodies(高通量產(chǎn)生和工程化重組人類抗體)”J.Imm.Methods254:67_84；和本文引用的其他參考文獻(xiàn)。使用本領(lǐng)域已知的抗體人源化技術(shù)，來自非-人類物種的單克隆抗體可被嵌合化或人源化。可選地，針對(duì)⑶16A的完全人類抗體可如下產(chǎn)生使用具有人類免疫系統(tǒng)元件的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(參見例如，美國(guó)專利第5，569，825和5，545，806號(hào))，使用人類外周血細(xì)胞(Casali等人(1986)"HumanMonoclonalsFromAntigen-SpecificSeletionOfBLymphocytesAndTransformationByEBV(從抗原-特異性選擇B淋巴細(xì)胞并以EBV轉(zhuǎn)化的人類單克隆)”Science234:476_479)，通過根據(jù)Huse等人(1989)"GenerationOfALargeCombinatorialLibraryOfTheImmunoglobulinRepertoireInPhageLambda(^噬菌體λ中產(chǎn)生免疫球蛋白整套的大的組合文庫)”Science2461275-1281列出的一般方案從人類B細(xì)胞篩選DNA文庫，和通過其他方法。在優(yōu)選實(shí)施方案，結(jié)合供者是來自3G8抗體或其人源化形式，如，諸如美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0010124公開的，其以引用的方式全文并入本文。為了某些目的，預(yù)期使用結(jié)合⑶16A受體被3G8結(jié)合的相同表位、或至少足以靠近此表位以封閉3G8結(jié)合的⑶16A結(jié)合蛋白可能是有益的。鑒定具有期望結(jié)合性質(zhì)的結(jié)合蛋白的表位作圖和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法是實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，以上引用的Harlow和Lane；Stahli等人(1983)"DistinctionOfEpitopesByMonoclonalAntibodies(由單克隆抗體區(qū)分表位)"MethodsinEnzymology92:242_253;Kirkland等人(1986)“AnalysOfTheFineSpecificityAndCross-ReactivityOfMonoclonalAnti-LipidAAntibodies(分析單克隆抗_脂質(zhì)A抗體的精細(xì)特異性和交叉反應(yīng)性)”J.Immunol.137=3614-3619；Morel等人(1988)"MonoclonalAntibodiesToBovineSerumAlbumin:AffinityAndSpecificityDeterminations(針對(duì)牛血清白蛋白的單克隆抗體確定親和性和特異性)”Molec.Immunol.257~15；Cheung等人(1990)“Epitope-SpecificAntibodyResponseToTheSurfaceAntigenOfDuckHepatitisBVirusInInfectedDucks(表位-特異性抗體對(duì)受感染的鴨中鴨乙型肝炎病毒表面抗原的響應(yīng))”Virologyl76:546_552；和Moldenhauer^A(1990)"IdentityOfHML-IAntigenOnIntestinalIntraepithelialTCellsAndOfB_ly7AntigenOnHairyCellLeukaemia(腸上皮內(nèi)T細(xì)胞上HML-1抗原和毛細(xì)胞性白血病上B-ly7抗原的鑒定)”Scand.J.Immunol.32:77_82。例如，可能確定兩種抗體是否結(jié)合于相同位點(diǎn)，通過使用抗體之一來將抗原捕獲到ELISA板上，并隨后測(cè)量第二抗體結(jié)合于捕獲的抗原的能力。表位比較還可實(shí)現(xiàn)，通過直接或間接地以酶、放射性核素或熒光團(tuán)標(biāo)記第一抗體，并測(cè)量未標(biāo)記的第二抗體抑制第一抗體對(duì)細(xì)胞上、溶液中或固相上抗原結(jié)合的能力。還可能測(cè)量抗體封閉⑶16A受體對(duì)ELISA板上形成的免疫復(fù)合物結(jié)合的能力。這種免疫復(fù)合物通過首先以抗原諸如熒光素包被板，然后向板施加特異性抗_熒光素抗體而形成。隨后該免疫復(fù)合物作為可溶性Fc受體諸如sFcRIIIa的配體?？蛇x地，可形成可溶性免疫復(fù)合物，并直接或間接地以酶、放射性核素或熒光團(tuán)標(biāo)記。隨后可測(cè)量抗體抑制這些標(biāo)記的免疫復(fù)合物對(duì)細(xì)胞上、溶液中或固相上Fc受體的結(jié)合的能力。本發(fā)明的⑶16A結(jié)合蛋白可包括或可不包括人類免疫球蛋白Fc區(qū)。Fc區(qū)不存在于例如scFv結(jié)合蛋白中。Fc區(qū)存在于例如人類或人源化四聚單克隆IgG抗體中。如上所述，在本發(fā)明一些實(shí)施方案，CD16A結(jié)合蛋白包括具有改變的效應(yīng)物功能，如，與未改變的Fc區(qū)(如，天然存在的IgGl、蛋白的Fe)相比對(duì)效應(yīng)物配體諸如Fc受體或補(bǔ)體的Cl成分親和性減少的Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案，該Fc區(qū)在對(duì)應(yīng)于位置297的Fc區(qū)氨基酸未糖基化。這種抗體缺少Fc效應(yīng)物功能。因此，由于結(jié)合蛋白中不存在Fc結(jié)構(gòu)域，⑶16A結(jié)合蛋白可能不展示Fc-介導(dǎo)的結(jié)合于效應(yīng)物配體諸如Fc受體或補(bǔ)體的Cl成分，而在其他情形，缺少結(jié)合或效應(yīng)物功能是由于抗體恒定區(qū)中的改變。5.1.2.1包含類似于mAb3G8⑶R序列的⑶R序列的⑶16A結(jié)合蛋白。可用于實(shí)踐本發(fā)明的CD16A結(jié)合蛋白包括包含來源于(即，具有相同或類似序列)小鼠單克隆抗體3G8的CDR的CDR序列的蛋白。編碼小鼠3G8單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)、包括⑶R編碼序列的互補(bǔ)cDNA如所述地克隆并測(cè)序。3G8的核酸和蛋白序列提供如下。使用小鼠可變區(qū)和CDR序列，產(chǎn)生大量包含來源于3G8CDR的互補(bǔ)決定區(qū)的嵌合和人源化單克隆抗體并分析其性質(zhì)。為了鑒定以高親和性結(jié)合CD16A并具有其他期望性質(zhì)的人源化抗體，產(chǎn)生包含具有來源于3G8的CDR的VH區(qū)的抗體重鏈并與包含具有來源于3G8的CDR的VL區(qū)的抗體輕鏈組合(通過共表達(dá))以產(chǎn)生用于分析的四聚抗體。如下述地確定所得四聚抗體的性質(zhì)。如下述地，包含3G8CDR的CD16A結(jié)合蛋白，諸如本文所述的人源化抗體蛋白可根據(jù)本發(fā)明使用。5.1.2.1.1VH區(qū)一方面，本發(fā)明的⑶16A結(jié)合蛋白可包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)⑶R(通常是三個(gè)⑶R)具有小鼠單克隆抗體3G8重鏈的⑶R(更通常是所有三個(gè)⑶R)的序列，且結(jié)合蛋白的其余部分基本上是人類的(來源于且基本上類似于人類抗體的重鏈可變區(qū))。一方面，本發(fā)明提供包含以基本上人類框架來源于3G8抗體的⑶R的人源化3G8抗體或抗體片段，但其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR的序列不同于相應(yīng)的小鼠抗體3G8重鏈⑶R。例如，在一個(gè)實(shí)施方案，⑶R至少通過具有本領(lǐng)域已知的顯示影響3G8對(duì)CD16A結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)CDR取代而不同于3G8CDR序列，所述取代是本領(lǐng)域已知的或公開在表3和4A-H。合適的⑶16結(jié)合蛋白可包括0、1、2、3或4或更多的這些取代(通常具有這些取代的1到4個(gè))，且任選地也可具有另外的取代。表3.Vh結(jié)構(gòu)域取代<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*表4A中的字母是指表4B-H中的序列。表4BFRl<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表4CCDRl<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表4DFR2<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>在一個(gè)實(shí)施方案，⑶16A結(jié)合蛋白可包括與HU3G8VH-1構(gòu)建體的VH結(jié)構(gòu)域相同或類似的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，后者的序列提供在SEQIDNO700例如，本發(fā)明提供一種⑶16A結(jié)合蛋白，包含的VH結(jié)構(gòu)域具有(1)由表1所列的0、一個(gè)或多于一個(gè)⑶R取代而不同于Hu3G8VH-l的VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO70)；(2)由表1所列的0、一個(gè)或多于一個(gè)框架取代而不同于Hu3G8VH-l的VH結(jié)構(gòu)域和(3)在剩余位置與Hu3G8VH_lVH序列至少約80%相同、通常至少約90%和有時(shí)至少約95%相同、或甚至至少約98%相同的序列。本發(fā)明的CD16結(jié)合蛋白的示例性VH結(jié)構(gòu)域具有3G8VH、Hu3G8VH_5和Hu3G8VH_22的序列(分別是SEQIDN0:81、SEQIDNO:71禾口SEQIDNO:72)。編碼3G8VH和Hu3G8VH_5的序列(分別是SEQIDN0:81和SEQIDNO71)的示例性核苷酸序列分別提供在SEQIDNO82禾口SEQIDNO:83。VH結(jié)構(gòu)域可具有由至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、或至少六個(gè)表3所示的取代而不同于Hu3G8VH-l(SEQIDNO70)的序列。相信這些取代導(dǎo)致對(duì)⑶16A的親和性增加和/或減少CD16A結(jié)合蛋白當(dāng)施用于人類時(shí)的免疫原性。在某些實(shí)施方案，在剩余位置與Hu3G8VH-lVH結(jié)構(gòu)域序列同一性的程度是至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%。為了闡釋而不是限制，大量⑶16A構(gòu)建蛋白VH結(jié)構(gòu)域的序列顯示在表4。包含這些序列融合于人類(^1恒定區(qū)的重鏈與1!11368￥1^1輕鏈(下述)共表達(dá)以形成四聚抗體，測(cè)量抗體對(duì)CD16A的結(jié)合以評(píng)價(jià)與hu3G8VH-lVH結(jié)構(gòu)域相比氨基酸取代的效應(yīng)。其中VH結(jié)構(gòu)域具有hu3G8VH-l、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44和45的序列的構(gòu)建體顯示高親和性結(jié)合，而hu3G8VH_6和-40VH結(jié)構(gòu)域顯示中級(jí)結(jié)合。認(rèn)為包含hu3G8VH-5和hu3G8VH_22的VH結(jié)構(gòu)域(分別是SEQIDN0:71和SEQIDNO72)的CD16A結(jié)合蛋白具有特別有利的結(jié)合性質(zhì)。5.1.2.2VL區(qū)進(jìn)行類似研究以鑒定具有有利的結(jié)合性質(zhì)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。一方面，本發(fā)明提供包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶16A結(jié)合蛋白，其中至少一個(gè)⑶R(通常是三個(gè)OTR)具有小鼠單克隆抗體3G8輕鏈的CDR(更通常是所有三個(gè)CDR)的序列，且結(jié)合蛋白的其余部分基本上是人類的(來源于且基本上類似于人類抗體的輕鏈可變區(qū))。一方面，本發(fā)明提供包含以基本上人類框架來源于3G8抗體的⑶R的人源化3G8抗體的片段，但其中輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR的序列不同于小鼠抗體3G8輕鏈CDR。在一個(gè)實(shí)施方案，⑶R至少通過具有⑶R中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代而不同于3G8序列，所述取代諸如表2中所示的一個(gè)或多個(gè)取代(如，⑶Rl中位置24的精氨酸；⑶Rl中位置25的絲氨酸；⑶Rl中位置32的酪氨酸；⑶Rl中位置33的亮氨酸；⑶R2中位置50的天冬氨酸、色氨酸或絲氨酸；⑶R2中位置53的絲氨酸；⑶R2中位置55的丙氨酸或谷氨酸；⑶R2中位置56的蘇氨酸；⑶R3中位置93的絲氨酸；和/或⑶R3中位置94的蘇氨酸)。在各實(shí)施方案，可變結(jié)構(gòu)域可具有0、1、2、3、4或5或更多的這些取代(通常具有這些取代的1到4個(gè))，且任選地也可具有另外的取代。在一個(gè)實(shí)施方案，合適的⑶16A結(jié)合蛋白可包括與HU3G8VL-1構(gòu)建體的VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:73)相同或類似的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，后者的序列提供在表6。例如，本發(fā)明提供一種CD16A結(jié)合蛋白，包含的VL結(jié)構(gòu)域具有(1)由表5所列的0、一個(gè)或多個(gè)CDR取代而不同于Hu3G8VL-l的VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO73)；(2)由表5所列的0、一個(gè)或多個(gè)框架取代而不同于Hu3G8VL-l的VL結(jié)構(gòu)域；和(3)在剩余位置與Hu3G8VL_lVL序列(SEQIDNO73)至少約80%相同、通常至少約90%和有時(shí)至少約95%相同、或甚至至少約98%相同的序列。表5.3G8Vl結(jié)構(gòu)域取代No.KabatE取代位置~24CDRlAri—225CDRlSct<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表6.來源于3G8VL的VL序列*<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>*表6A中的字母是指表6B-H中的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表6CCDRl<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表6ECDR2<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表6FFR3<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表6GCDR3<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表6HFR4<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>本發(fā)明的CD16結(jié)合蛋白的示例性VL結(jié)構(gòu)域具有3G8VL、Hu3G8VL_l或Hu3G8VL_43的序歹丨J(分別是SEQIDNO:84、SEQIDNO73和SEQIDNO74)，如表5和表6所示。編碼3G8VL(SEQIDNO84)和Hu3G8VL_l(SEQIDNO73)的示例性核苷酸序列分別提供在SEQIDNO85和SEQIDNO:86。VL結(jié)構(gòu)域可具有由零、一個(gè)、至少兩個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)或至少9個(gè)表2所示的取代而不同于Hu3G8VL-l(SEQIDNO73)的序列。相信這些取代導(dǎo)致對(duì)CD16A的親和性增加和/或減少CD16A結(jié)合蛋白當(dāng)施用于人類時(shí)的免疫原性。在某些實(shí)施方案，在剩余位置的序列同一性程度是至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%。為了闡釋而不是限制，大量⑶16A構(gòu)建蛋白VL結(jié)構(gòu)域的序列顯示在表6。包含這些序列融合于人類Ck恒定區(qū)的輕鏈與HU3G8VH重鏈(上述)共表達(dá)以形成四聚抗體，測(cè)量該抗體對(duì)CD16A的結(jié)合以評(píng)價(jià)與Hu3G8VL-lVL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:73)相比氨基酸取代的效應(yīng)。其中VL結(jié)構(gòu)域具有hu3G8VL-l、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37和42的序列的構(gòu)建體顯示高親和性結(jié)合，而hu3G8VL_15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40和41顯示中級(jí)結(jié)合。認(rèn)為包含hu3G8VL_l、hu3G8VL_22和hu3G8VL_43的VL結(jié)構(gòu)域(分別是SEQIDNO:73、SEQIDNO75和SEQIDNO74)的CD16A結(jié)合蛋白具有特別有利的結(jié)合性質(zhì)。5.1.2.2.1VL和/或VH結(jié)構(gòu)域的組合如本領(lǐng)域已知和本文別處描述的，免疫球蛋白輕鏈和重鏈可在其中締合以產(chǎn)生雙抗體的條件下重組表達(dá)，或可體外如此組合。因此應(yīng)理解，本文所述的3G8-衍生的VL-結(jié)構(gòu)域可組合本文所述的3G8-衍生的VH-結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生⑶16A結(jié)合雙抗體，且涵蓋所有這種組合。為了闡釋而不是限制，可用的⑶16A雙抗體的實(shí)例是包含至少一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的CD16A雙抗體，其中VH結(jié)構(gòu)域來自hu3G8VH_l、hu3G8VH_22或hu3G8VH-5(分別是SEQIDNO70、SEQIDNO72禾口SEQIDNO:71)，VL結(jié)構(gòu)域來自hu3G8VL-l、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43(分別是SEQIDNO73、SEQIDN0:75禾口SEQIDNO:43)。特別是，包括hu3G8VH-22(SEQIDNO22)與hu3G8VL_l、hu3G8VL_22或hu3G8VL_43(分別是SEQIDN0:73、SEQIDNO72禾PSEQIDNO:74)、或hu3G8VH_5(SEQIDNO:71)禾口hu3G8VL-l(SEQIDNO73)的人源化抗體具有有利的性質(zhì)。將由本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，本文描述的VL和VH結(jié)構(gòu)域的序列可由公知方法進(jìn)一步修飾，諸如親和力成熟(參見Schier等人(1996)"IsolationOfPicomolarAffinityAnti-C-ErbB-2Single-ChainFvByMolecularEvolutionOfTheComplementarityDeterminingRegionsInTheCenterOfTheAntibodyBindingSite(通過抗體結(jié)合位點(diǎn)中心中的互補(bǔ)決定區(qū)的分子進(jìn)化分離皮摩爾親和性抗-C-ErbB-2單鏈)，，J.Mol.Biol.263:551_567;Daugherty等人(1998)"AntibodyAffinityMaturationUsingBacterialSurfaceDisplay(^M^ffl^^fflM^Wiil^H和力成熟)”ProteinEng.11:825-832;Boder等人(1997)"YeastSurfaceDisplayForScreeningCombinatorialPolypeptideLibraries(用于篩選組合多肽文庫的酵母表面展示)"Nat.Biotechnol.15:553_557；Boder等人(2000)"DirectedEvolutionOfAntibodyFragmentsWithMonovalentFemtomolarAntigen-BindingAffinity(定向進(jìn)化具有單價(jià)的飛摩爾抗原-結(jié)合親和性的抗體片段)”Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A9710701-10705；Hudson等人(2003)"EngineeredAntibodies(工程化的抗體)”NatureMedicine9129-39)。例如，可使用親和力成熟技術(shù)修飾CD16A結(jié)合蛋白以鑒定對(duì)CD16A具有增加的親和性和/或?qū)D16B具有減少的親和性的蛋白。一種示例性⑶16結(jié)合蛋白是小鼠3G8抗體。包含人源化3G8的VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列描述在圖2、9、14，并列在SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDN0:21、SEQIDNO22,SEQIDNO70,SEQIDN0:71、SEQIDNO72,SEQIDNO73和SEQIDNO:74。5.2包含F(xiàn)c區(qū)或其部分的雙抗體本發(fā)明涵蓋包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分(如，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域)的雙抗體分子。在某些實(shí)施方案，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分包括IgG2、IgG3或IgG4的Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(如，CH2或CH3)。在其他實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域或其部分包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc結(jié)構(gòu)域或其部分的至少一個(gè)氨基酸修飾(如，取代)。變體Fc結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的，主要用于改變包含所述變體Fc結(jié)構(gòu)域的抗體的表型，如在本領(lǐng)域公知的任何結(jié)合活性或效應(yīng)物功能測(cè)定如，ELISA、SI3R分析或ADCC中測(cè)定的。這種變體Fc結(jié)構(gòu)域或其部分通過賦予或修飾由包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的雙抗體分子展示的效應(yīng)物功能而在本發(fā)明中有用，如功能性地測(cè)定的，如，在NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性測(cè)定中。鑒定為改變效應(yīng)物功能的Fc結(jié)構(gòu)域變體公開于國(guó)際申請(qǐng)W004/063351、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/626，510,2004年12月15日提交的60/636，663、和2006年3月10日提交的60/781，564,2005年11月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)11/271，140,2005年12月15日提交的11/305，787，這些是本發(fā)明人的同時(shí)申請(qǐng)，所有這些通過引用全文并入本文。在其他實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋使用本領(lǐng)域已知的任何Fc變體，諸如以下公開的Duncan等人(1988)"LocalizationOfTheBindingSiteForTheHumanHigh-AffinityFcReceptorOnIgG(定位IgG上對(duì)人類高-親和性Fc受體的結(jié)合位點(diǎn))“Nature332:563_564;Lund等人(1991)"HumanFcGammaRIAndFcGammaRIIInteractWithDistinctButOverlappingSitesOnHumanIgG(人類FcyRI和FcyRII與人類IgG上不同但重疊的位點(diǎn)相互作用)”J.Immunol.147=2657-2662；Lund等人(1992)"MultipleBindingSitesOnTheCH2DomainOfIgGForMouseFcGammaRII(IgG的CH2結(jié)構(gòu)域上對(duì)小鼠FcγRII的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn))”Mol.Immunol.2953-59；Alegre等人(1994)"ANon-Activating“Humanized“Anti-CD3MonoclonalAntibodyRetainsImmunosuppressivePropertiesInVivo(非-活化性“人源化，，抗-CD3單克隆抗體在體內(nèi)保持免疫抑制性質(zhì))”Transplantation571537-1543；Hutchins等人(1995)“ImprovedBiodistribution,TumorTargeting,AndReducedImmunogenicityInMiceWithAGamma4VariantOfCampath-lH(Campath_lH的y4變體改善生物分布、腫瘤靶向和減少小鼠中的免疫原性)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11980-11984Jefferis等人(1995)"RecognitionSitesOnHumanIgGForFcGammaReceptors:TheRoleOfGlycosylation(人類IgG上對(duì)Fcγ受體的識(shí)別位點(diǎn)糖基化的作用)”Immunol.Lett.44111-117；Lund等人(1995)"Oligosaccharide-ProteinlnteractionsInIgGCanModulateRecognitionByFcGammaReceptors(IgG中寡糖-蛋白相互作用可調(diào)節(jié)Fcy受體的識(shí)別)”FASEBJ.9:115-119Jefferis等人(1996)“ModulationOfFc(Gamma)RAndHumanComplementActivationByIgG3_CoreOligosaccharideInteractions(由IgG3_核寡糖相互作用調(diào)節(jié)Fc(γ)R與人類補(bǔ)體活化)"Immunol.Lett.54:101-104;Lund等人(1996)“MultipleInteractionsOfIggWithItsCoreOligosaccharideCanModulateRecognitionByComplementAndHumanFcGammaReceptorIAndInfluenceTheSynthesisOfItsOligosaccharideChains(IgG與其核寡糖的多種相互作用可調(diào)節(jié)被補(bǔ)體和人類Fcγ受體I的識(shí)別并影響其寡糖鏈合成)”J.Immunol.157:4963_4969；Armour等人(1999)"RecombinantHumanIgGMoleculesLackingFcgammaReceptorIBindingAndMonocyteTriggeringActivities(缺少Fcγ受體I結(jié)合和單核細(xì)胞觸發(fā)活性的重組人類IgG分子)”Eur.J.Immunol.29=2613-2624；Idusogie等人(2000)"MappingOfTheClQBindingSiteOnRituxan,AChimericAntibodyWithAHumanIgGlGc(—種與人類IgGlFc的嵌合抗體Rituxan上ClQ結(jié)合位點(diǎn)的作圖)”J.Immunol.164:4178-4184;Reddy等人(2000)"EliminationOfFcReceptor-DependentEffectorFunctionsOfAModifiedIgG4MonoclonalAntibodyToHuman⑶4(消除修飾的IgG4單克隆抗體對(duì)人類⑶4的Fc受體-依賴性效應(yīng)物功能)”J.Immunol.1641925-1933;Xu等人(2000)“InVitroCharacterizationOfFiveHumanizedOKTSEffectorFunctionVariantAntibodies(體夕卜表征五種人源化OKTS效應(yīng)物功能變體抗體)”Cell.Immunol.20016-26；Idusogie等人(2001)"EngineeredAntibodiesWithIncreasedActivityToRecruitComplement(具有增力口的活性來募集補(bǔ)體的工程化的抗體)，，J.Immunol.166:2571_2575；Shields等人(2001)"HighResolutionMappingOfTheBindingSiteOnHumanIgGlForFcgammaRI,FcgammaRII,FcgammaRI11,AndFcRnAndDesignOfIgGlVariantsWithImprovedBindingToTheFcgammaR(人類IgGl上對(duì)FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)的高分辨率作圖并設(shè)計(jì)對(duì)FcyR的結(jié)合改進(jìn)的IgGl變體)”J.Biol.Chem.276=6591-6604Jefferis等人(2002)“InteractionSitesOnHumanIgG-FcForFcgammaRCurrentModels(人類IgG-Fc上對(duì)FcYR的相互作用位點(diǎn)最新模型)”Immunol.Lett.82:57_65；Presta等人(2002)"EngineeringTherapeuticAntibodiesForImprovedFunction(為了改善功能工程化治療性抗體)”Biochem.Soc.Trans.30:487_490)；美國(guó)專利5，624，821；美國(guó)專利5，885，573；美國(guó)專利6，194，551；PCTWO00/42072；PCTWO99/58572；所有這些通過引用全文并入本文。在某些實(shí)施方案，對(duì)Fc區(qū)氨基酸的所述一種或多種修飾減少Fc區(qū)的親和性和親和力以及本發(fā)明的雙抗體分子對(duì)一種或多種FcγR受體親和性和親和力。在特定實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)或其部分的雙抗體，其中所述變體Fc區(qū)包括相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，該變體Fc區(qū)僅結(jié)合一個(gè)FcyR，其中所述FcγR是FcγRIIIA。在另一特定實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)或其部分的雙抗體，其中所述變體Fc區(qū)包括相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，該變體Fc區(qū)僅結(jié)合一個(gè)FcyR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在另一特定實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)或其部分的雙抗體，其中所述變體Fc區(qū)包括相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，該變體Fc區(qū)僅結(jié)合一個(gè)FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc結(jié)構(gòu)域的分子，其中所述變體賦予或介導(dǎo)相對(duì)于不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或包含野生型Fc結(jié)構(gòu)域的分子增加的ADCC活性和/或增加的對(duì)FcyRIIA(⑶32A)結(jié)合，如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文所述的方法測(cè)量的。在替代實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc結(jié)構(gòu)域的分子，其中所述變體賦予或介導(dǎo)相對(duì)于不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或包含野生型Fc結(jié)構(gòu)域的分子減少的ADCC活性(或其他效應(yīng)物功能)和/或增加的對(duì)FcyRIIB(CD32B)結(jié)合，如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文所述的方法測(cè)量的。本發(fā)明還涵蓋包含來自兩種或多種IgG同種型的結(jié)構(gòu)域或區(qū)的Fc結(jié)構(gòu)域的用途。如本領(lǐng)域已知的，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸修飾可深深地影響Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)物功能和/或結(jié)合活性。然而，當(dāng)在選擇的IgG同種型環(huán)境中實(shí)施時(shí)，功能性特征的這些改變可進(jìn)一步被完善和/或操縱。類似地，同種型Fc的天然特征可被一種或多種氨基酸修飾操縱。由于鉸鏈和/或Fc結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異，多種IgG同種型(即，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)展示不同的物理性質(zhì)和功能性性質(zhì)，包括血清半衰期、補(bǔ)體固定、FcγR結(jié)合親和性和效應(yīng)物功能活性(如，ADCC、CDC)。在某些實(shí)施方案，氨基酸修飾和IgGFc區(qū)基于其各自的、分別的結(jié)合和/或效應(yīng)物功能活性獨(dú)立地選擇，以工程化具有期望性質(zhì)的雙抗體。在大多數(shù)實(shí)施方案，所述氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fe區(qū)已經(jīng)被分別測(cè)定結(jié)合和/或效應(yīng)物功能活性，如本文所述的或本領(lǐng)域已知的在IgGl環(huán)境中。在某些實(shí)施方案，當(dāng)在雙抗體分子或其他含F(xiàn)c的分子(如，免疫球蛋白)環(huán)境中分別測(cè)定FcγR結(jié)合或效應(yīng)物功能時(shí)，所述氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fe區(qū)展示類似功能，如，對(duì)FcγRIIA增加的親和性。隨后所述氨基酸修飾與選擇的IgGFc區(qū)的組合加和地或優(yōu)選地協(xié)同地作用以相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的本發(fā)明的雙抗體分子改變?cè)诒景l(fā)明的雙抗體分子中的所述功能。在其他實(shí)施方案，當(dāng)在本文所述的或本領(lǐng)域已知的包含野生型Fc區(qū)的雙抗體分子或其他含F(xiàn)c的分子(如，免疫球蛋白)環(huán)境中分別測(cè)定FcγR結(jié)合和/或效應(yīng)物功能時(shí)，所述氨基酸修飾和IgGFc區(qū)展示相反功能，如，增加和減少分別對(duì)FcγRIIA的親和性；隨后所述“相反”氨基酸修飾與選擇的IgG區(qū)的組合作用以選擇性地緩和或減少本發(fā)明的雙抗體中相對(duì)于不包含F(xiàn)c區(qū)或包含相同同種型野生型Fc區(qū)的本發(fā)明的雙抗體的特定功能?？蛇x地，本發(fā)明涵蓋包含本領(lǐng)域已知的氨基酸修飾與選擇的IgG區(qū)的組合、展示新性質(zhì)的變體Fc區(qū)，當(dāng)所述修飾和/或區(qū)如本文所述的獨(dú)立測(cè)定時(shí)，該性質(zhì)是不可檢測(cè)的。多種IgG同種型和其結(jié)構(gòu)域的功能性特征是本領(lǐng)域公知的。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列列在圖1A-1B。選擇和/或組合來自特定IgG同種型的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域以用于本發(fā)明的方法可基于親本同種型的任何已知參數(shù)，包括對(duì)FcyR的親和性(表7；Flesch等人(2000)"FunctionsOfTheFcReceptorsForImmunoglobulinG(免疫球蛋白G的Fc受體功能)”J.Clin.Lab.Anal.14141-156；Chappel等人(1993)"IdentificationOfASecondaryFcGammaRIBindingSiteWithinAGeneticallyEngineeredHumanIgGAntibody(鑒定遺傳工程化的人類IgG抗體中第二FcγRI結(jié)合位點(diǎn))”J.Biol.Chem.3325124-25131;Chappel等人(1991)"IdentificationOfTheFcGammaReceptorClassIBindingSiteInHumanIgGThroughTheUseOfRecombinantIgGl/IgG2HybridAndPoint-MutatedAntibodies(通過使用重組IgGl/IgG2雜合和點(diǎn)突變抗體鑒定人類IgG中Fcγ受體I類結(jié)合位點(diǎn))”Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9036_9040，通過引用將它們每一個(gè)并入本文)。例如，使用來自展示有限結(jié)合或不結(jié)合于FcγRIIB的IgG同種型如，IgG2或IgG4的區(qū)或結(jié)構(gòu)域，可特別用于當(dāng)期望雙抗體被工程化以使對(duì)活化性受體的結(jié)合最大和對(duì)抑制性受體的結(jié)合最小時(shí)。類似地，使用來自已知優(yōu)先結(jié)合Clq或FcγRIIIAIgG同種型如，IgG3的Fc區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Bruggemann等人(1987)"ComparisonOfTheEffectorFunctionsOfHumanlmmunoglobulinsUsingAMatchedSetOfChimericAntibodies(使用匹配組的嵌合抗體比較人類免疫球蛋白的效應(yīng)物功能)”J.Exp.Med.166:1351_1361)可聯(lián)合本領(lǐng)域已知增強(qiáng)ADCC的Fc氨基酸修飾來工程化雙抗體分子以使效應(yīng)物功能活性如補(bǔ)體活化或ADCC最大化。表7.IgG結(jié)合FcYR的一般特征，從Flesch和N印pert，1999，J.Clin.Lab.Anal.14:141-156修改對(duì)IgG估計(jì)的親和力相對(duì)親和力(M-1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>A僅結(jié)合復(fù)合的IgG5.3分子軛合物本發(fā)明的雙抗體分子可以重組地融合或化學(xué)地軛合(包括共價(jià)和非共價(jià)軛合)到異源多肽(即，無關(guān)的多肽；或其部分，優(yōu)選所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸來產(chǎn)生融合蛋白。融合不必是直接的，可以通過接頭序列來進(jìn)行。進(jìn)一步地，本發(fā)明的雙抗體分子(S卩，多肽)可以軛合到修飾給定的生物反應(yīng)的治療劑或藥物部分。作為直接軛合的替代，由于本發(fā)明的多價(jià)如，四價(jià)雙抗體分子上有多個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)，雙抗體的至少一個(gè)結(jié)合區(qū)可被設(shè)計(jì)以結(jié)合治療劑或期望的藥物部分而不影響雙抗體結(jié)合。治療劑或藥物部分不應(yīng)被解釋為限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可以包括，例如，毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、蓖麻毒素、白樹毒素和美洲商陸抗病毒蛋白，蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子、干擾素，包括但不限于α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、細(xì)胞凋亡劑(例如TNF-α、TNF-β、AIMI，如PCT公布第WO97/33899號(hào)中公開的)、AIMII(參見，PCT公布第WO97/34911號(hào))、Fas配體和VEGI(PCT公布第WO99/23105號(hào))、血栓形成劑或抗血管生成劑(例如，血管他丁或內(nèi)皮他丁)，或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物，例如，淋巴因子(例如，白細(xì)胞介素_1(“IL-1”)、白細(xì)胞介素-2(“IL-2”)、白細(xì)胞介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生長(zhǎng)因子(例如，生長(zhǎng)激素(“GH”)；蛋白酶或核糖核酸酶。本發(fā)明的雙抗體分子(即，多肽)可以融合到標(biāo)記物序列例如肽來便于純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案，標(biāo)記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如PQE載體(QIAGEN，Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)及其他中提供的標(biāo)簽，它們的許多是商業(yè)上可獲得的。例如，如Gentz等人(1989)"BioassayForTrans-ActivationUsingPurifiedHumanImmunodeficiencyVirusTAT-EncodedProteinTrans-ActivationRequiresmRNASynthesis(用于使用純化的人類免疫缺陷病毒TAT-編碼的蛋白的反式活化的生物測(cè)定反式活化要求mRNA合成)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86=821-824中描述的，六組氨酸提供了純化融合蛋白的便利。對(duì)純化有用的其他肽標(biāo)簽包括但不限于，血凝素"HA"標(biāo)簽，其相應(yīng)于來自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人(1984)"TheStructureOfAnAntigenicDeterminantInAProtein(蛋白中抗原決定簇的結(jié)構(gòu))”Cell，37:767_778)，和“flag，，標(biāo)簽(Knappik等人(1994)"AnImprovedAffinityTagBasedOnTheFLAGP印tideForTheDetectionAndPurificationOfRecombinantAntibodyFragments(用于檢測(cè)禾口純化重組抗體片段的基于FLAG肽的改進(jìn)的親和性標(biāo)簽)”Biotechniques，17(4):754_761)。通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統(tǒng)稱為“DNA改組”)的技術(shù)，可以產(chǎn)生其他的融合蛋白?？梢圆捎肈NA改組來改變本發(fā)明的分子的活性(例如，具有更高親和性和更低解離速率的表位結(jié)合位點(diǎn))。參見，一般地，美國(guó)專利第5，605，793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5，837，458號(hào)，和Patten等人(1997)“ApplicationsOfDNAShufflingToPharmaceuticalsAndVaccines(DNA改組在藥物和疫苗中的應(yīng)用)，，Curr.OpinionBiotechnol.8724-733；Harayama(1998)"ArtificialEvolutionByDNAShuffling(由DNA改組的人工進(jìn)化)"TrendsBiotechnol.16:76_82；Hansson等人(1999)"EvolutionOfDifferentialSubstrateSpecificitiesInMuClassGlutathioneTransferasesProbedByDNAShuffling(由DNA改組探測(cè)的Mu類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶不同底物特異性的進(jìn)化)”J.Mol.Biol.287265-276；和Lorenzo等人(1"8)“PCR-BasedMethodForTheIntroductionOfMutationsInGenesClonedAndExpressedInVacciniaVirus(在牛痘疫苗中克隆和表達(dá)的基因中引入突變的基于PCR的方法KBioTechniques24:308-313(通過引用將專利和出版物的每一個(gè)全文并入本文)。本發(fā)明的雙抗體分子或編碼本發(fā)明的分子的核酸，可以通過易錯(cuò)PCR、隨機(jī)核苷酸添加或其他先于重組的方法經(jīng)歷隨機(jī)誘變來進(jìn)一步改變。編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)部分可以與一種或多種異源分子的一個(gè)或多個(gè)成分、基序、段、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等等重組。本發(fā)明還涵蓋軛合于或免疫特異性地識(shí)別期望增加/減少血清半衰期和/或靶向特定細(xì)胞子集的診斷劑或治療劑或任何其他分子的本發(fā)明的雙抗體分子。本發(fā)明的分子可以診斷性地使用，例如，作為例如確定給定治療方式效力的臨床試驗(yàn)過程的部分來監(jiān)控疾病、病癥或感染的發(fā)展或進(jìn)展。通過將本發(fā)明的分子與可檢測(cè)物質(zhì)聯(lián)結(jié)或通過免疫特異性地識(shí)別可檢測(cè)物質(zhì)的分子可以使檢測(cè)便利化?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬和非放射性的順磁性金屬離子?？蓹z測(cè)物質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)直接地或通過中間體(例如，本領(lǐng)域已知的接頭)間接地聯(lián)結(jié)或軛合到本發(fā)明的分子，或分子可免疫特異性地識(shí)別可檢測(cè)物質(zhì)免疫特異性地結(jié)合所述物質(zhì)。參見例如，美國(guó)專利第4，741，900號(hào)關(guān)于可以軛合到抗體用作根據(jù)本發(fā)明的診斷劑的金屬離子。這種診斷和檢測(cè)可以通過設(shè)計(jì)分子以免疫特異性地識(shí)別可檢測(cè)物質(zhì)或?qū)⒈景l(fā)明的分子聯(lián)結(jié)到可檢測(cè)物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，所述可檢測(cè)物質(zhì)包括但不限于各種酶，酶包括但不限于，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基復(fù)合物，例如但不限于，鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料，例如但不限于，傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光材料，例如但不限于，魯米諾；生物發(fā)光材料，例如但不限于，熒光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；放射性物質(zhì)，例如但不限于，鉍(213Bi)、碳(14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓(153GcU159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、鈥(166Ho)、銦(115In、113In、112In、mIn)、碘(1311、1251、1231、1211)、鑭(140La)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、钷(149Pm)、錸(196Re、188Re)、銠(105Rh)、釕(ruthemium)(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鍶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、鉈(201Ti)、錫(113Sru117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb)、釔(9°Y)、鋅(65Zn)；利用各種正電子發(fā)射成像的正電子發(fā)射金屬，和非放射性的順磁性金屬離子。本發(fā)明的雙抗體分子可以免疫特異性地識(shí)別或軛合到治療部分，例如細(xì)胞毒素(例如，抑制細(xì)胞的或殺細(xì)胞的試劑)、治療劑或放射性元素(例如，α發(fā)射體、Υ發(fā)射體，等等)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、阿霉素、紅比霉素、二羥炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素，和它們的類似物或同系物。治療劑包括但不限于，抗代謝物(例如，氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、thio印a苯丁酸氮芥(thio印achlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順式二氯二胺鉬(II)(DDP)順鉬)、蒽環(huán)類抗生素(例如，紅比霉素(以前的道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素(以前的納霉素)、博來霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC)、和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)。此外，本發(fā)明的雙抗體分子可以軛合到治療部分或設(shè)計(jì)為免疫特異性地識(shí)別治療部分，例如放射性物質(zhì)或?qū)椇戏派浣饘匐x子(例如參見上述的放射性物質(zhì))有用的大環(huán)的螯合劑。在某些實(shí)施方案，大環(huán)的螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可以經(jīng)由接頭分子附著到多肽上。這種接頭分子是本領(lǐng)域一般已知的并描述在Denardo等人(1998)"ComparisonOf1，4，7，lO-Tetraazacyclododecane-N，N',N",N"'-TetraaceticAcid(DOTA)-Peptide-ChL6,ANovelImmunoconjugateWithCatabolizableLinker,To2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-D0TA~ChL6InBreastCancerXenografts(在乳腺癌異種移植物中比較具有可降解代謝的接頭的新型免疫軛合物1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N”，-四乙酸(DOTA)-肽_ChL6與2-亞氨硫醇-2-[ρ-(溴乙酰胺基)芐基]-D0TA-ChL6)”Clin.CancerRes.42483-2490；Peterson等人(1999)"EnzymaticCleavageOfPeptide-LinkedRadiolabelsFromImmunoconjugates(肽-連接的放射性標(biāo)記從免疫軛合物的酶促裂解)，，Bioconjug.Chem.10:553_；禾口Zimmerman等人，(1999)"ATriglycineLinkerImprovesTumorUptakeAndBiodistributionsOf67-Cu-LabeledAnti-NeuroblastomamAbchCE7F(ab)'2Fragments(三甘氨酸接頭改進(jìn)67_Cu_標(biāo)記的抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤mAbchCE7F(ab)，2片段的腫瘤攝取和生物分布)”Nucl.Med.Biol.26:943_950，通過引用將它們每一個(gè)并入本文。將這種治療部分軛合到包含如Fc結(jié)構(gòu)域的多肽的技術(shù)是公知的；參見例如，Arnon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy(用于免疫靶向癌癥療法中藥物的單克隆抗體)”，在MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy(單克降抗體與癌癥療法),Reisfeld等人(編輯)，1985，pp.243-56，AlanR.Liss,Inc.)；Hellstr6m等人，"AntibodiesForDrugDelivery(用于遞送藥物的抗體)”，在ControlledDrimDelivery(受控的藥物遞送)(第2版)，Robinson等人(H車t)，1987,pp.623-53,MarcelDekker,Inc.)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview(癌癥療法中細(xì)胞毒性劑的抗體載體綜述)”，在MonoclonalAntibodies'84:BioloRicalAndClinicalApplications(單克隆抗體'84生物學(xué)和臨床應(yīng)用)，Pinchera等人(編輯)，1985，pp.475-506)；"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy(放射標(biāo)記的抗體在癌癥治療的治療應(yīng)用的分析、結(jié)果和未來展望)”，在MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy(用于癌癥檢111禾口治療的單克隆抗體)，Baldwin等人(編輯)，1985，pp.303-16，AcademicPress；和Thorpe等人(1982)"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates(抗體-毒素軛合物的制備和細(xì)胞毒性)”Immunol.Rev.,62:119_158。本發(fā)明的雙抗體分子可以在有或沒有軛合到其上的治療部分的情況下施用、單獨(dú)地施用、或與用于治療性治療的細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子共同施用。當(dāng)單獨(dú)地施用時(shí)，多價(jià)如四價(jià)雙抗體分子的至少一個(gè)表位可被設(shè)計(jì)以免疫特異性地識(shí)別治療劑，如細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子，其可與本發(fā)明的分子同時(shí)施用或隨后施用。以這種方式，雙抗體分子可以類似于直接軛合的方式特異性地靶向治療劑。作為選擇，本發(fā)明的分子可以軛合到抗體來形成如Segal在美國(guó)專利第4，676，980號(hào)中描述的抗體異軛合物，通過引用將其整體并入本文。本發(fā)明的雙抗體分子也可以附著于固相支持物，其對(duì)于免疫測(cè)定或純化目標(biāo)抗原是特別有用的。這種固相支持物包括但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。5.4表征雙抗體分子的結(jié)合可以以各種方法表征本發(fā)明的雙抗體分子。特別地，可以測(cè)定本發(fā)明的分子與抗原，例如FcRIIIA或FcRIIB免疫特異性結(jié)合的能力，或當(dāng)分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)時(shí)測(cè)定其顯示Fc-FcγR相互作用，S卩，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)對(duì)FcγR特異性結(jié)合的能力。這種測(cè)定可以在溶液中(例如，Houghten(1992)"TheUseOfSyntheticPeptideCombinatorialLibrariesForTheIdentificationOfBioactivePeptides(使用☆成肽組合文庫來鑒定生物活性肽)”Bi0Techniques，13:412_421)、在珠子上(Lam(1991)"ANewTypeOfSyntheticPeptideLibraryForIdentifyingLigand-BindingActivity(用于鑒定配體-結(jié)合活性的新型合成肽文庫)”Nature，354:82_84)、在芯片上(Fodor(1993)"MultiplexedBiochemicalAssaysWithBiologicalChips(以生物芯片進(jìn)行多路生化測(cè)定)”Nature，364:555_556)、在細(xì)菌上(美國(guó)專利第5，223，409號(hào))、在孢子上(美國(guó)專利第5，571，698；5,403，484；和5，223，409號(hào))、在質(zhì)粒上(Cull等人(1992)"ScreeningForReceptorLigandsUsingLargeLibrariesOfPeptidesLinkedToTheCTerminusOfTheLacR印ressor(使用連接到Lac阻遏子的C末端的肽的大文庫篩選受體配體)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,891865-1869)、或在噬菌體上(Scott等人(1990)"SearchingForPeptideLigandsWithAnEpitopeLibrary(以表位文庫搜尋肽配體)”Science，249:386-390;Devlin(1990)"RandomP印tideLibraries:ASourceOfSpecificProteinBindingMolecules(隨機(jī)肽文庫特異性蛋白結(jié)合分子的來源)”Science，249:404-406;Cwirla等人(1990)"P印tidesOnPhage:AVastLibraryOfPeptidesForIdentifyingLigands(噬菌體上的肽用于鑒定配體的肽的巨大文)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378_6382；和Felici(1991)‘‘SelectionOfAntibodyLigandsFromALargeLibraryOfOligopeptidesExpressedOnAMultivalentExpositionVector(從多價(jià)展示載體上表達(dá)的寡肽的大文庫篩選抗體配體)”J.Mol.Biol,222301-310)進(jìn)行(通過引用將這些參考文獻(xiàn)的每一個(gè)全文并入本文)。已經(jīng)被鑒定與抗原例如FcYRIIIA免疫特異性結(jié)合的分子然后可以測(cè)定它們對(duì)該抗原的特異性和親和性。已經(jīng)被工程化以包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子，可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定與一種或多種抗原(例如，癌抗原和與其他抗原(如，F(xiàn)cyR)的交叉反應(yīng)性)的免疫特異性結(jié)合，或當(dāng)分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)時(shí)，測(cè)定Fc-FcγR相互作用?？捎糜诜治雒庖咛禺愋越Y(jié)合、交叉反應(yīng)性和Fc-FcγR相互作用的免疫測(cè)定包括但不限于使用如下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)蛋白質(zhì)點(diǎn)雜交、放射性免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“三明治”免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體_固定測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定、僅舉幾個(gè)例子。這些測(cè)定是常規(guī)的和本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Ausubel等人編輯，1994，CurrentProtocolsinMolecularBioIory(分子生物學(xué)最新方案)，第1版，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork中描述的技術(shù)，通過引用將其全文并入本文)?？梢酝ㄟ^競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定來確定抗原_結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用或Fc-FcYR相互作用的結(jié)合親和性和解離速率。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的一個(gè)實(shí)例是放射免疫分析，包括在增加數(shù)量的未標(biāo)記表位例如FcγR(參見5.4.1節(jié))的存在下，孵育標(biāo)記的抗原例如四聚FcγR(例如，3H或1251，參見5.4.1節(jié))與目標(biāo)分子(例如，包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明分子)，并檢測(cè)與標(biāo)記的抗原結(jié)合的分子。通過Scatchard分析根據(jù)飽和數(shù)據(jù)，可以確定本發(fā)明的分子與抗原的親和性和結(jié)合解離速率。本發(fā)明的分子對(duì)抗原或FcYR的親和性和結(jié)合性質(zhì)可使用本領(lǐng)域已知用于抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fc-FcγR相互作用的體外測(cè)定(基于生化或免疫學(xué)的測(cè)定)來最初確定，包括但不限于ELISA測(cè)定、表面等離子共振測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定。優(yōu)選地，本發(fā)明的分子的結(jié)合性質(zhì)還由確定一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能性測(cè)定表征，如5.4.2節(jié)所述。在最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的分子在體內(nèi)模型中(諸如本文描述和公開的)具有與基于體外的測(cè)定類似的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的測(cè)定中不表現(xiàn)期望表型但在體內(nèi)表現(xiàn)期望表型的本發(fā)明的分子。在一些實(shí)施方案，篩選和鑒定包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子由基于功能性的測(cè)定進(jìn)行，優(yōu)選地以高通量方式?；诠δ苄缘臏y(cè)定可為本領(lǐng)域已知的用于表征一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的任何測(cè)定，諸如在5.4.2和5.4.3節(jié)所述的。可根據(jù)本發(fā)明的方法使用的效應(yīng)細(xì)胞功能的非限制性實(shí)例包括但不限于，抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體-依賴性吞噬作用、吞噬作用、調(diào)理作用、調(diào)理吞噬作用、細(xì)胞結(jié)合、玫瑰花結(jié)、Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在優(yōu)選的實(shí)施方案，使用BIAcore動(dòng)力學(xué)分析來確定本發(fā)明的分子與抗原或FcyR的結(jié)合和解離速率。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析包括分析抗原或FcγR從芯片的結(jié)合和解離，所述芯片在它們的表面上具有固定化的分子(例如，分別包含表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子)。BIAcore分析描述在5.4.3節(jié)。優(yōu)選地，運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)的熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)被用于基于免疫學(xué)或功能性的測(cè)定來表征本發(fā)明的分子。流式分選機(jī)能夠快速地檢查大量的已被本發(fā)明的分子結(jié)合，如調(diào)理的單獨(dú)的細(xì)胞(例如，每小時(shí)1000-10000萬個(gè)細(xì)胞)(Shapiro等人(1995)PracticalFlowCytometry)0此外，用于優(yōu)化雙抗體行為的特定參數(shù)包括但不限于，抗原濃度(即，F(xiàn)cγR四聚復(fù)合物，參見5.4.1節(jié))、動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間或FACS嚴(yán)格度，這些都可以變化，以選擇包含展示了特定結(jié)合性質(zhì)的本發(fā)明的分子的雙抗體分子，所述特定結(jié)合性質(zhì)例如同時(shí)結(jié)合于多個(gè)表位。用于分選和檢查生物細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)是本領(lǐng)域公知的。例如，在美國(guó)專利第4，347，935；5，464，581；5,483,469；5,602,039；5，643，796；和6，211，477號(hào)中描述已知的流式細(xì)胞計(jì)；通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚摹Ｆ渌阎牧魇郊?xì)胞計(jì)是BectonDickinsonandCompany制造的FACSVantage系統(tǒng)，和UnionBiometrica制造的C0PAS系統(tǒng)。靶抗原結(jié)合親和性或Fc-FcYR結(jié)合親和性的表征，和評(píng)價(jià)細(xì)胞表面上的靶抗原或FcyR密度可通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，諸如Scatchard分析或通過如制造商的說明使用試劑盒，諸如QuantumSimplyCellular(BangsLaboratories,Inc.,Fishers,IN)。一種或多種功能性測(cè)定可以是本領(lǐng)域已知用于表征一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的任何測(cè)定，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文描述的。在特定的實(shí)施方案，在ELISA測(cè)定中測(cè)定包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子與一種或多種靶抗原或一種或多種FcYR，例如，F(xiàn)cyRIIIA、FcyRIIA、FcyRIIA的結(jié)合；繼之以一種或多種ADCC測(cè)定。在某些實(shí)施方案，進(jìn)一步使用基于表面等離子共振的測(cè)定例如BIAcore來測(cè)定本發(fā)明的分子?；诒砻娴入x子共振的測(cè)定是本領(lǐng)域公知的，在5.4.3節(jié)中進(jìn)一步討論，在實(shí)施例6.1中在本文例示。在最優(yōu)選的實(shí)施方案，進(jìn)一步在動(dòng)物模型中表征包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明分子與靶抗原(如，F(xiàn)cYR)的相互作用或Fc-FcYR相互作用。當(dāng)評(píng)價(jià)Fc-FcyR相互作用時(shí)，用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的動(dòng)物模型是，例如，表達(dá)人類FcγR的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如，在美國(guó)專利第5，877，397和6，676，927號(hào)中描述的任何小鼠模型，通過引用將它們整體并入本文。在本發(fā)明的方法中進(jìn)一步使用的轉(zhuǎn)基因小鼠包括但不限于，攜帶人類FcYRIIIA的裸敲除FcyRIIIA小鼠；攜帶人類FcyRIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcyRIIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcyRIIA的裸敲除FcyRIIIA小鼠；攜帶人類FcyRIIIA和FcyRIIA的裸敲除FcYRIIIA和FcyRIIA小鼠以及攜帶人類FcyRIIΙΑ、FcyRIIA和FcyRIIB的裸敲除FcyRIIΙΑ、FcyRIIA和FcyRIIB小鼠。5.4.1包含F(xiàn)cγR的結(jié)合測(cè)定可以使用任何FcYR，包括但不限于FcYR的多態(tài)性變體來進(jìn)行包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)和/或包含對(duì)FcγR特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子對(duì)FcγR結(jié)合的表征。在某些實(shí)施方案，使用在位置158含有苯丙氨酸的FcγRIIIA的多態(tài)性變體。在其他實(shí)施方案，使用在位置158含有纈氨酸的FcYRIIIA的多態(tài)性變體來進(jìn)行表征。FcyRIIIA158V顯示了比158F更高的IgGl親和性和提高的ADCC活性(參見，例如Koene等人(1997)"FcgammaRIIIa-158V/FPolymorphismInfluencesTheBindingOfIgGByNaturalKillerCellFcgammaRIIIa,IndependentlyOfTheFcgammaRIIIa-48L/R/HPhenotype(FeγRIIIa_158V/F多態(tài)性影響天然殺傷細(xì)胞FcγRIIIa對(duì)IgG的結(jié)合，而不論FcYRIIIa-48L/R/H表型)”Blood，90:1109-14;Wu等人(1997)"ANovelPolymorphismOfFcgammaRIIIa(CD16)AltersReceptorFunctionAndPredisposesToAutoimmuneDisease(FeγRIIIa(⑶16)的新多態(tài)性改變受體功能和對(duì)自身免疫疾病的傾向)”J.clin.Invest.100:1059_70，通過引用將兩者整體并入本文)；根據(jù)近來由IgGl-FcγRIIIA共結(jié)晶研究顯示的，這個(gè)殘基實(shí)際上與IgGl的較低的鉸鏈區(qū)直接相互作用，參見，例如Sondermann等人(2000)"The3.2_ACrystalStructureOfTheHumanIgGlFcFragment-FcgammaRI11complex(人類IgGlFc片段-FcγRIII復(fù)合物的3.2-Α晶體結(jié)構(gòu))”Nature，406(6793):267_273，通過引用將它整體并入本文。研究顯示，在某些情況下治療性抗體在FcyRIIIA-158V純合的患者中具有改善的效力。例如，與FcγRIIIA158F純合的患者相比，在FcγRIIIA158V純合的患者中人源化抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗治療上更有效(參見，例如，Cartron等人(2002)"TherapeuticActivityOfHumanizedAnti-CD20MonoclonalAntibodyAndPolymorphismInIgGFcReceptorFcgammaRIIIAGene(人源化抗-CD20單克隆抗體的治療活性與IgGFc受體FcγRIIIA基因的多態(tài)性)”Blood，99(3):754_758)。在其他實(shí)施方案，包含該區(qū)的治療性分子對(duì)FcyRIIIA-158V和FcyRIIIA-158F雜合的患者和帶有FcyRIIA-131H的患者可能也更有效。盡管不希望受特定作用機(jī)制的限制，用替代的同種型來選擇本發(fā)明的分子能夠提供這樣的變體，所述變體一旦被工程化為治療性雙抗體，將在臨床上對(duì)所述同種型純合的患者更有效。開發(fā)了FcγR結(jié)合測(cè)定用于確定本發(fā)明的分子與FcγR的結(jié)合，特別是用于確定Fc結(jié)構(gòu)域?qū)cγR的結(jié)合。該測(cè)定容許Fc-FcyR相互作用的檢測(cè)和定量，不論受體對(duì)它的配體的固有地弱的親和性，例如，對(duì)于FcyRIIB和FcYRIIIA在微摩爾的范圍內(nèi)。該方法詳細(xì)描述在國(guó)際申請(qǐng)W004/063351和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0037000和2005/0064514，所有文獻(xiàn)都通過引用全文并入本文。簡(jiǎn)言之，所述方法包括形成可用于本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定如，F(xiàn)ACS、ELISA、表面等離子共振等等的FcγR復(fù)合物。此外，相對(duì)于未復(fù)合的FcγR，該FcγR復(fù)合物具有對(duì)Fc區(qū)的改善的親和力。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的分子復(fù)合物是四聚的免疫復(fù)合物，包括(a)FcYR的可溶區(qū)域(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIA或FcYRIIB的可溶區(qū))；(b)與FcγR的可溶區(qū)域(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIA或FcYRIIB的可溶區(qū)域)的C-末端可操作連接的生物素化的15氨基酸AVITAG序列(AVITAG)；和(c)鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素(SA-PE)；以一定摩爾比來形成四聚FcyR復(fù)合物(優(yōu)選的以51的摩爾比)。所述融合蛋白以酶學(xué)手段生物素化，使用例如，大腸桿菌BirA酶，一種特異地將15氨基酸AVITAG序列中的賴氨酸殘基生物素化的生物素連接酶。隨后以IXSA-PE5X生物素化可溶FcγR的摩爾比將生物素化的可溶FcγR蛋白與SA-PE混合，來形成四聚FcγR復(fù)合物。包含F(xiàn)c區(qū)的多肽已顯示以比單體未復(fù)合的FcγR高至少8倍的親和性結(jié)合根據(jù)四聚FcγR復(fù)合物。包含F(xiàn)c區(qū)的多肽與四聚FcγR復(fù)合物的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定，實(shí)例例如，熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)、放射性免疫測(cè)定、ELISA測(cè)定，等等。本發(fā)明涵蓋使用根據(jù)如上所述的方法形成的包含本發(fā)明分子的免疫復(fù)合物來在基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的測(cè)定中確定包含F(xiàn)c區(qū)的分子的功能。為了方便，可以以測(cè)定試劑盒來提供試劑，S卩，用于測(cè)定包含F(xiàn)c區(qū)的分子結(jié)合FcYR四聚復(fù)合物的能力的試劑的封裝組合。用于確定Fc-FcγR相互作用的其他形式的分子復(fù)合物也預(yù)期用于本發(fā)明的方法中，例如，如2003年1月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/439，709中描述所形成的融合蛋白；通過引用將它整體并入本文。5.4.2具有變體重鏈的分子的功能性測(cè)定本發(fā)明涵蓋使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于鑒定分子的效應(yīng)細(xì)胞功能的測(cè)定來表征包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子。特別地，本發(fā)明涵蓋表征本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能。另外，當(dāng)本發(fā)明的雙抗體分子的至少一個(gè)靶抗原是FcγR時(shí)，F(xiàn)cγR被雙抗體分子的結(jié)合可用作活化FcyR-介導(dǎo)的途徑，類似于被FcγR-Fc結(jié)合活化的途徑。因此，當(dāng)雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別FcγR時(shí)，雙抗體分子可能展現(xiàn)FcyR-介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能而不含有Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)，或沒有相伴的Fc-FcyR結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明可以測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞功能的實(shí)例包括但不限于，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、吞噬作用、調(diào)理作用、調(diào)理吞噬作用(opsonophagocytosis)、Clq結(jié)合以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知用于確定效應(yīng)細(xì)胞功能活性的任何基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的分析(對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定，參見，Perussia等人(2000)"AssaysForAntibody-DependentCell-MediatedCytotoxicity(ADCC)AndReverseADCC(RedirectedCytotoxicity)InHumanNaturalKillesCells(用于人類天然殺傷細(xì)胞中抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和反向ADCC(重定向的細(xì)胞毒性)的測(cè)定)”MethodsMolBiol.121179-92；Baggiolini等人(1988)“CellularModelsForTheDetectionAndEvaluationOfDrugsThatModulateHumanPhagocyteActivity(檢測(cè)和評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)人類吞噬活性的藥物的細(xì)胞模型)，^xperientia,44(10):841_848；Lehmann等人(2000)“Phagocytosis=MeasurementByFlowCytometry(吞噬作用由流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量)”J.Immunol.Methods，243(l-2)229-42；Brown(1994)“InVitroAssaysOfPhagocyticFunctionOfHumanPeripheralBloodLeukocytes:ReceptorModulationAndSignalTransduction(人類夕卜周血白細(xì)胞的吞噬功能的體外測(cè)定受體調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo))"MethodsCellBiol.,45147-64；Munn等人(1990)"PhagocytosisOfTumorCellsByHumanMonocytesCulturedInRecombinantMacrophageColony-StimulatingFactor(重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子中培養(yǎng)的人類單核細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用)”J.Exp.Med.，172=231-237,Abdul-Majid等人(2002)"FeReceptorsAreCriticalForAutoimmuneInflammatoryDamageToTheCentralNervousSystemInExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis(在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎中Fc受體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫炎性損傷是關(guān)鍵的)”Scand.J.Immunol.5570-81；Ding等人(1998)‘‘TwoHumanTCellReceptorsBindInASimilarDiagonalModeToTheHLA-A2/TaxPeptideComplexUsingDifferentTCRAminoAcids(使用不同TCR氨基酸，兩種人類T細(xì)胞受體以類似的對(duì)角線方式結(jié)合于HLA-A2/Tax肽復(fù)合物)"Immunity8:403-411，所有文獻(xiàn)都通過引用全文并入本文)。在一個(gè)實(shí)施方案，可以在人類單核細(xì)胞中測(cè)定本發(fā)明的分子的FcYR介導(dǎo)的吞噬作用。作為選擇，本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的吞噬作用可以在其他吞噬細(xì)胞中測(cè)定，例如嗜中性白細(xì)胞(多形核白細(xì)胞；PMN)；人類外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞，其可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)過程來獲得(例如，參見Br0wn(1994)"InVitroAssaysOfPhagocyticFunctionOfHumanPeripheralBloodLeukocytesReceptorModulationAndSignalTransduction(人類外周血白細(xì)胞的吞噬功能的體外測(cè)定受體調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))，，MethodsCellBiol.,45147-164)。在一個(gè)實(shí)施方案，通過早先描述的方法(Tridandapani等人(2000)‘‘TheAdapterProteinLATEnhancesFcgammaReceptor-MediatedSignalTransductionInMyeloidCells(適體蛋白LAT在脊髓細(xì)胞中增強(qiáng)Fcγ受體-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))，，J.Biol.Chem.275=20480-20487)，通過測(cè)量THP-I細(xì)胞吞噬熒光化的IgG調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的能力，來表征本發(fā)明的分子的功能。用于確定本發(fā)明的分子的吞噬作用的另一個(gè)示范性的測(cè)定是抗體依賴性調(diào)理吞噬作用測(cè)定(ADCP)，其可以包括以下用⑴針對(duì)熒光素的抗體，野生型4-4-20抗體(參見Bedzyk等人(1989)“ComparisonOfVariableRegionPrimaryStructuresWithinAnAnti-FluoresceinIdiotypeFamily(比較抗-熒光素獨(dú)特型家族中的可變區(qū)基本結(jié)構(gòu))”J.Biol.Chem,264(3)1565-1569，通過引用將它全文并入本文)，作為FcγR依賴性ADCP的對(duì)照抗體；或(ii)攜帶敲出了對(duì)FcγRIII的結(jié)合的D265A突變的4_4_20抗體，作為FcγR依賴性ADCP的背景對(duì)照，(iii)包含4-4-20的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域和/或?qū)cγRIII特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙抗體包被目標(biāo)生物粒子，例如大腸桿菌標(biāo)記的FITC(MolecularProbes)或金黃色葡萄球菌-FITC；并形成調(diào)理的粒子；以11、101、301、601、751或1001的比例將任何所描述的調(diào)理的粒子(i_iii)添加到THP-I效應(yīng)細(xì)胞(可從ATCC獲得的單核細(xì)胞系)以容許FcγR介導(dǎo)的吞噬作用發(fā)生；優(yōu)選地在37°C培養(yǎng)細(xì)胞和大腸桿菌-FITC/抗體1.5小時(shí)；培養(yǎng)(優(yōu)選地在室溫下2-3分鐘)之后向細(xì)胞添加臺(tái)盼藍(lán)，來猝滅附著于細(xì)胞表面之外沒有被內(nèi)在化的細(xì)菌的熒光；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到FACS緩沖液(例如，PBS中的0.1%BSA、0.1%疊氮化鈉)中，使用FACS(例如，BDFACSCalibur)分析THPl細(xì)胞的熒光。優(yōu)選地，通過FACS來分析在測(cè)定中使用的THP-I細(xì)胞的細(xì)胞表面FcYR的表達(dá)。THP-I細(xì)胞表達(dá)⑶32A和⑶64。⑶64是高親和性FcγR，其在根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行ADCP測(cè)定時(shí)被封閉。優(yōu)選地用100μg/mL可溶性IgGl或10%人類血清封閉THP-I細(xì)胞。為了分析ADCP的程度，優(yōu)選地將門設(shè)置在THP-I細(xì)胞上，測(cè)量中值熒光強(qiáng)度。計(jì)算單個(gè)突變體的ADCP活性，作為相對(duì)于獲得的野生型chMab4_4_20的標(biāo)準(zhǔn)值來報(bào)道。將調(diào)理的粒子添加到THP-I細(xì)胞，從而調(diào)理的粒子與THP-I細(xì)胞的比例是301或601。在最優(yōu)選的實(shí)施方案，使用對(duì)照例如培養(yǎng)基中的大腸桿菌-FITC、大腸桿菌-FITC和THP-I細(xì)胞(作為FcγR非依賴性ADCP活性)、大腸桿菌_FITC、THP_1細(xì)胞和野生型4-4-20抗體(作為FcγR依賴性ADCP活性)、大腸桿菌_FITC、THP_1細(xì)胞、4_4_20D265A(作為FcγR依賴性ADCP活性的背景對(duì)照)，進(jìn)行ADCP測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法，在效應(yīng)細(xì)胞例如天然殺傷細(xì)胞中測(cè)定本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的ADCC活性(參見例如，Perussia等)κ(2000)"AssaysForAntibody-DependentCell-MediatedCytotoxicity(ADCC)AndReverseADCC(RedirectedCytotoxicity)InHumanNaturalKillerCells(MTA^I^然殺傷細(xì)胞中抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和反向ADCC(重定向的細(xì)胞毒性)的測(cè)定)"MethodsMol.Biol.121179-92；Weng等人(2003)"TwolmmunoglobulinGFragmentCReceptorPolymorphismsIndependentlyPredictResponseToRituximabInPatientsWithFollicularLymphoma(兩種免疫球蛋白G片段C受體多態(tài)性獨(dú)立地預(yù)測(cè)濾泡性淋巴瘤患者對(duì)利妥昔單抗的響應(yīng))”J.Clin.Oncol.21=3940-3947；Ding等人(1998)"TwoHumanTCellReceptorsBindInASimilarDiagonalModeToTheHLA-A2/TaxPeptideComplexUsingDifferentTCRAminoAcids(使用不同TCR氨基酸，兩種人類T細(xì)胞受體以類似的對(duì)角線方式結(jié)合于HLA-A2/Tax肽復(fù)合物)”Immimity8:403_411)。確定本發(fā)明的分子的ADCC活性的示范性的測(cè)定是基于51Cr釋放分析，包括用[51Cr]Na2CrO4(這種細(xì)胞膜可透過的分子一般被用于標(biāo)記，因?yàn)樗Y(jié)合胞漿蛋白，雖然以緩慢動(dòng)力學(xué)從細(xì)胞自發(fā)釋放，在靶細(xì)胞壞死之后大量地釋放)標(biāo)記靶細(xì)胞；用包含變體重鏈的本發(fā)明的分子調(diào)理靶細(xì)胞；在微量滴定板上以合適的靶細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞比例來組合調(diào)理的放射性標(biāo)記的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞；在37°C培養(yǎng)細(xì)胞的混合物16-18小時(shí)；收集上清液；并分析放射性。隨后可以確定本發(fā)明的分子的細(xì)胞毒性，例如，使用以下公式裂解％=(實(shí)驗(yàn)的cpm-靶滲漏cpm)/(洗滌劑裂解cpm-靶滲漏cpm)X100%。作為選擇，裂解％=(ADCC-AICC)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。特異性裂解可以使用以下公式計(jì)算特異性裂解=本發(fā)明的分子的裂解％-不存在本發(fā)明分子時(shí)的裂解％。通過改變靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例或抗體濃度，可以產(chǎn)生圖表。優(yōu)選地，在本發(fā)明的ADCC測(cè)定中使用的效應(yīng)細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞(PBMC)，其優(yōu)選地是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用Ficoll-Paque密度梯度離心從正常人類血液純化的。在本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選的效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)不同的FcγR活化性受體。本發(fā)明涵蓋表達(dá)FcγRI、FcγRIIA和FcYRIIB的效應(yīng)細(xì)胞THP-1，以及來自全人類血液、表達(dá)FcYRIIIA和FcyRIIB的單核細(xì)胞衍生的原代巨噬細(xì)胞，來確定重鏈抗體突變體是否相對(duì)于野生型IgGl抗體顯示增加的ADCC活性和吞噬作用。人類單核細(xì)胞系THP-I通過高親和性受體FcYRI和低親和性受體FcγRIIA的表達(dá)來活化吞噬作用(Fleit等人(1991)"TheHumanMonocyte-LikeCellLineTHP-IExpressesFcGammaRIAndFcGammaRII(人類單核細(xì)胞-樣細(xì)胞系THP-1表達(dá)FcγRI和FcγRII)”J.Leuk.Biol.49:556_565)。THP-I細(xì)胞不組成性地表達(dá)FcγRIIA或FcγRIIB。用細(xì)胞因子刺激這些細(xì)胞影響FcR表達(dá)模式(Pricop等人(2001)"DifierentialModulationOfStimulatoryAndInhibitoryFcGammaReceptotsOnHumanMonocytesByTHlAndTh2Cytokines(Thl禾口Th2細(xì)胞因子不同地調(diào)節(jié)人類單核細(xì)胞上的刺激性和抑制性Fcγ受體)”J.ofImmunol.，166:531_537)。在細(xì)胞因子IL4的存在下TRP-I細(xì)胞的生長(zhǎng)誘導(dǎo)FcyRIIB表達(dá)并引起FCYRIIA和FcyRI表達(dá)的減少。FcγRIIB表達(dá)也可以通過增加細(xì)胞密度來增強(qiáng)(Tridandapani等人(2002)"RegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCells(人類單核細(xì)胞中FcyRIIB的調(diào)節(jié)的表達(dá)和抑制性功能)”J.Biol.Chem.，277(7)=5082-5089)相比之下，已經(jīng)報(bào)道IFNγ可以引起FcγRIIIA的表達(dá)(Pearse等人(1993)“InterferonGamma-InducedTranscriptionOfTheHigh-AffinityFcReceptorForIgGRequiresAssemblyOfAComplexThatIncludesThe91-kDaSubunitOfTranscriptionFactorISGF3(干擾素Y-誘導(dǎo)的對(duì)IgG高親和性的Fc受體的轉(zhuǎn)錄需要組裝包括轉(zhuǎn)錄因子ISGF3的91-kDa亞基的復(fù)合物)"Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:4314-4318)。細(xì)胞表面上受體的存在或缺乏可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法通過FACS來確定。在細(xì)胞表面上細(xì)胞因子誘導(dǎo)的FcγR表達(dá)提供了在FcyRIIB存在下測(cè)試活化作用和抑制作用的系統(tǒng)。如果THP-I細(xì)胞不能表達(dá)FcyRIIB，本發(fā)明還涵蓋另一種人類單核細(xì)胞系U937。這些細(xì)胞已經(jīng)顯示了在IFNy和TNF存在下末期分化成巨噬細(xì)胞(Koren^A(1979)"InVitroActivationOfAHumanMacrophage-LikeCellLine(#外活化人類巨噬細(xì)胞-樣細(xì)胞系)”Nature279328-331)。在小鼠腫瘤模型中FcγR依賴性腫瘤細(xì)胞殺傷是由巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的(Clynes等人(1998)"FeReceptorsAreRequiredInPassiveAndActiveImmunityToMelanoma(在對(duì)黑素瘤的被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫中需要Fc受體)”Proc.Nat.Acad.Sci.USA95652-656)。本發(fā)明涵蓋使用來自供者的淘析的單核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞來分析Fc突變體在吞噬作用和ADCC測(cè)定中觸發(fā)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效力。FcyRI.FcYRIIIA和FcyRIIB的表達(dá)模式受不同生長(zhǎng)條件的影響。冷凍淘析的單核細(xì)胞、新鮮淘析的單核細(xì)胞、維持在10%FBS中的單核細(xì)胞和培養(yǎng)在FBS+GM-CSF和/或在人類血清中的單核細(xì)胞的FcγR表達(dá)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來測(cè)定。例如，細(xì)胞可以用FcγR特異性抗體染色并通過FACS分析以確定FcR分布型。然后將最好地模擬巨噬細(xì)胞體內(nèi)FcγR表達(dá)的條件用于本發(fā)明的方法。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋使用小鼠細(xì)胞，特別是在不能獲得具有正確FcYR分布型的人類細(xì)胞時(shí)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC)，其可以使用本領(lǐng)域已知的方法用人類FcγRIIIA轉(zhuǎn)染并分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，參見，例如，Ralph等人(1977)"Antibody-DependentKillingOfErythrocyteAndTumorTargetsByMacrophage-RelatedCellLines=EnhancementByPPDAndLPS(由巨噬細(xì)胞-相關(guān)細(xì)胞系抗體_依賴性地殺傷紅細(xì)胞和腫瘤靶被PPD和LPS增強(qiáng))”J.Immunol.119:950_4)。使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)通過FACS分析可以定量轉(zhuǎn)染子的FcγRIIIA表達(dá)，高表達(dá)體可以用于本發(fā)明的ADCC測(cè)定。在其他實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋從敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如本文公開的那些小鼠分離表達(dá)人類FcγR的脾腹膜巨噬細(xì)胞。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)可從供者的外周血(PBM)收獲淋巴細(xì)胞。在分離的單核的細(xì)胞群體中，大多數(shù)ADCC活性經(jīng)由在其表面含有FcγRIIIA而沒有FcyRIIB的天然殺傷細(xì)胞(NK)發(fā)生。這些細(xì)胞的結(jié)果表明了突變體觸發(fā)NK細(xì)胞ADCC的效力，并確定了用淘析的單核細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試的試劑。用于本發(fā)明的ADCC測(cè)定的靶細(xì)胞包括但不限于，乳腺癌細(xì)胞系，例如，具有ATCC登記號(hào)ΗΤΒ-30的SK-BR-3(參見，例如Tremp等人(1976)"HumanBreastCancerInCulture(培養(yǎng)的人類乳腺癌)”RecentResultsCancerRes.33-41)；B-淋巴細(xì)胞；來自伯基特淋巴瘤的細(xì)胞，例如具有ATCC登記號(hào)CCL-86的Raji細(xì)胞(參見，例如Epstein等人(1965)"CharacteristicsAndModeOfGrowthOfTissueCultureStrain(EBl)OfHumanLymphoblastsFromBurkitt'sLymphoma(來自伯基特淋巴瘤的人類成淋巴細(xì)胞的組織培養(yǎng)株(EBl)的生長(zhǎng)特征和模式)”J.Natl.CancerInst.34231-240)，和具有ATCC登記號(hào)CCL-213的Daudi細(xì)胞(參見，例如，Klein等人(1968)"SurfaceIgM-KappaSpecificityOnABurkittLymphomaCellInVivoAndInDerivedCultureLines(體內(nèi)伯基特淋巴瘤細(xì)胞和伯基特淋巴瘤細(xì)胞衍生的培養(yǎng)系的表面IgM-κ特異性)”CancerRes.281300-1310)。靶細(xì)胞必須被待測(cè)定的雙抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。ADCC測(cè)定是基于NK細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。NK細(xì)胞部分地通過FcyRIIIA識(shí)別結(jié)合到細(xì)胞表面上抗原的IgGFc結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)細(xì)胞死亡。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的ADCC測(cè)定可以是基于放射性的分析或基于熒光的分析。用于表征包含變體Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的ADCC測(cè)定包括，標(biāo)記靶細(xì)胞，例如SK-BR-3、MCF-7、0VCAR3、Raji,Daudi細(xì)胞，用抗體調(diào)理靶細(xì)胞，所述抗體經(jīng)由其抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體；以合適的比例組合標(biāo)記的調(diào)理的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，所述比例可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定；收獲細(xì)胞；根據(jù)所使用的標(biāo)記使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方案，檢測(cè)裂解的靶細(xì)胞的上清液中的標(biāo)記?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來標(biāo)記靶細(xì)胞。例如，標(biāo)記包括但不限于，[51CrJNa2CrO4；和熒光增強(qiáng)配體2，2’:6’，2”-四吡啶_6_6〃二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲基酯。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，時(shí)間分辨熒光測(cè)定被用于測(cè)量針對(duì)靶細(xì)胞的ADCC活性，所述靶細(xì)胞已經(jīng)用熒光增強(qiáng)配體2，2’:6’，2”_四吡啶-6-6〃二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲基酯標(biāo)記。這種熒光測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，例如，參見Blomberg等人(1996)“Time-ReS0lVedFluorometricAssayForNaturalKillerActivityUsingTargetCellsLabelledWithAFluorescenceEnhancingLigand(使用以熒光增強(qiáng)配體標(biāo)記的靶細(xì)胞對(duì)自然殺傷活性的時(shí)間分辨熒光測(cè)定)"JournalofImmunologicalMethods，193199-206；通過引用將它全文并入本文。簡(jiǎn)要地說，用TDA的膜可透性乙酰氧基甲基二酯(二(乙酰氧基甲基)2，2’6’，2”_四吡啶-6-6”二羧酸(BATDA)來標(biāo)記靶細(xì)胞，其快速地?cái)U(kuò)散跨越活細(xì)胞的細(xì)胞膜。細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解酯基，再生的膜不透性TDA分子被捕獲在細(xì)胞內(nèi)部。在37°C、5%0)2下孵育效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，例如，至少兩個(gè)小時(shí)、多至3.5小時(shí)之后，用Eu3+螯合從裂解的靶細(xì)胞釋放的TDA，在時(shí)間分辨熒光計(jì)(例如，Victor1420，PerkinElmer/Wallace)中定量所形成的銪-TDA螯合物的熒光。在另一個(gè)特定實(shí)施方案，用于表征包含多個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子的ADCC測(cè)定包括以下步驟優(yōu)選地用二(乙酰氧基甲基)2，2’6，，2”_四吡啶-t-6”二羧酸酯(DELFIABATDA試劑，PerkinElmer/ffallac)標(biāo)記4_5xl06靶細(xì)胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、0VCAR3、Raji細(xì)胞)。對(duì)于最佳的標(biāo)記效力，用于ADCC測(cè)定的靶細(xì)胞數(shù)目應(yīng)優(yōu)選地不超過5xl06個(gè)。將BATDA試劑添加到細(xì)胞，在37°C、優(yōu)選地在5%CO2下培養(yǎng)混合物至少30分鐘。然后用生理緩沖液，例如，帶有0.125mM亞磺吡唑的PBS，和含有0.125mM亞磺吡唑的介質(zhì)洗滌細(xì)胞。然后用包含對(duì)FcyRIIA特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子來調(diào)理(包被)標(biāo)記的靶細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案，在ADCC測(cè)定中使用的分子還對(duì)細(xì)胞表面受體、腫瘤抗原或癌抗原是特異性的。本發(fā)明的雙抗體分子可以特異性結(jié)合任何癌癥或腫瘤抗原，諸如5.6.1節(jié)列出的那些。根據(jù)工程化入本發(fā)明的雙抗體的表位結(jié)合位點(diǎn)選擇ADCC測(cè)定中的靶細(xì)胞，從而雙抗體特異性地結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面受體。將靶細(xì)胞添加到效應(yīng)細(xì)胞例如PBMC，來產(chǎn)生約1UlO1、301、501、751、或1001的效應(yīng)物靶比例。在37°C、在5%CO2下，培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞至少兩小時(shí)、多至3.5小時(shí)。收獲細(xì)胞上清液并添加到酸性銪溶液(例如，DELFIA銪溶液，PerkinElmer/ffallac)在時(shí)間分辨的熒光計(jì)(例如，Victor1420，PerkinElmer/ffallac)中定量形成的銪-TDA螯合物的熒光。通過分別與TX-100和單獨(dú)的培養(yǎng)基培養(yǎng)靶細(xì)胞，確定最大釋放(MR)和自發(fā)的釋放(SR)。通過在不存在測(cè)試分子如，本發(fā)明的雙抗體的情況下培養(yǎng)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，測(cè)量抗體依賴性細(xì)胞毒性(AICC)。每個(gè)分析優(yōu)選進(jìn)行三份。將特異性裂解平均百分比計(jì)算為實(shí)驗(yàn)釋放(ADCC)-AICC)/(MR-SR)xlOO。本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域已知和本文示例的測(cè)定，來表征包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子的結(jié)合Clq和介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。為了確定Clq結(jié)合，可以進(jìn)行Clq結(jié)合ELISA。示范性的測(cè)定可以包含以下用包含本發(fā)明的分子的多肽或起始多肽(對(duì)照)在包被緩沖液中包被測(cè)定平板在4°C過夜。然后可以洗滌和封閉平板。在洗滌之后，將等分量的人類Clq添加到每個(gè)孔，在室溫下孵育2小時(shí)。進(jìn)一步的洗滌之后，可以將IOOuL綿羊抗補(bǔ)體Clq過氧化物酶軛合的抗體添加到每個(gè)孔，在室溫下孵育1小時(shí)。可以再次用洗滌緩沖液洗滌平板，將含有OPD(0-苯二胺二氫氯化物(Sigma))的IOOul底物緩沖液添加到每個(gè)孔中。通過黃色的出現(xiàn)觀察到的氧化反應(yīng)可以容許進(jìn)行30分鐘，通過添加IOOul4.5NH2SO4來停止。然后可以在(492-405)nm讀取吸光度。為了評(píng)估補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)分析，例如Gazzano-Santoro等人(1997)"ANon-RadioactiveComplement-DependentCytotoxicityAssayForAnti_CD20MonoclonalAntibody(對(duì)抗-CD20單克隆抗體的非放射活性補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定)”J.Immunol.MethodS202:163_171中所描述的，通過引用將其全文并入本文。簡(jiǎn)要地說，可以用緩沖液稀釋各種濃度的包含(變體)Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子和人類補(bǔ)體。表達(dá)被雙抗體分子所結(jié)合的抗原的細(xì)胞可以被稀釋到約IxlO6細(xì)胞/ml的密度。包含(變體)Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的雙抗體分子、稀釋的人類補(bǔ)體和表達(dá)抗原的細(xì)胞的混合物可以添加到平底組織培養(yǎng)96孔平板上，容許在37°C、5%CO2下孵育2小時(shí)以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。然后可以向每個(gè)孔添加50uL的阿爾瑪藍(lán)(AccumedInternational)，并在37°C孵育過夜。用530nm的激發(fā)和590nm的發(fā)射，使用96孔熒光計(jì)測(cè)量吸光度。結(jié)果可以相對(duì)熒光單位(RFU)表示?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，報(bào)告每個(gè)感興趣變體與非變體分子，即，不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或包含非_變體Fc結(jié)構(gòu)域的分子相比的活性百分比。5.4.3其他測(cè)定包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子可以使用本領(lǐng)域已知用于表征抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fc-FcγR結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的任何基于表面等離子共振的測(cè)定來測(cè)定。包括但不限于可從BiacoreAB(Uppsala，Sweden)獲得的BIAcore儀器；可從AffinitySensors(Franklin,ΜΑ.)獲得的IAsys儀器；可從WindsorScientificLimited(Berks,UK)IBISnj^NipponLaserandElectronicsLab(Hokkaido,Japan)獲得的SPR-CELLIA系統(tǒng)以及可從TexasInstruments(Dallas,TX)獲得的SPRDetectorSpreeta的任何商業(yè)上可獲得的SI3R儀器可以用于本發(fā)明?；赟PR的技術(shù)的綜述參見Mullet等人(2000)"SurfacePlasmonResonance-BasedImmunoassays(基于表面等離子共振的免疫測(cè)定)”Methods2277-91；Dong等人(2002)"Somenewaspectsinbiosensors(生物傳感器的一些新方面)"ReviewsinMol.Biotech.82:303_23；Fivash等人(1998)“BIAcoreForMacromolecularInteraction(用于大分子相互作用的BIAcore)"CurrentOpinioninBiotechnology9:97_101；Rich等人(2000)"AdvancesInSurfacePlasmonResonanceBiosensorAnalysis(表面等離子共振生物傳感器分析進(jìn)展)"CurrentOpinioninBiotechnology11:54-61，通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚摹４送?，在美?guó)專利第6，373，577；6,289，286；5，322，798；5,341，215；6,268，125號(hào)中描述用于測(cè)量蛋白_蛋白相互作用的任何SI3R儀器和基于SPR的方法涵蓋在本發(fā)明的方法中，通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚?。?jiǎn)要地說，基于SPR的測(cè)定包括將結(jié)合對(duì)的成員之一固定在表面上，在溶液中實(shí)時(shí)地監(jiān)視它與結(jié)合對(duì)的另一個(gè)成員的相互作用。SI^R基于測(cè)量在發(fā)生復(fù)合物形成或解離的表面附近溶劑折射率的變化。在其上發(fā)生固定的表面是傳感器芯片，它是sra技術(shù)的核心；它由包被有金的薄層的玻璃表面組成，形成了一批專門化的表面的基礎(chǔ)，所述表面被設(shè)計(jì)以優(yōu)化分子與表面的結(jié)合。各種傳感器芯片是商業(yè)上可獲得的，特別是來自以上列出的公司，所有這些都可以用于本發(fā)明的方法中。傳感器芯片的實(shí)例包括可從BIAcoreAB,Inc.獲得的那些，例如，傳感器芯片CM5、SA、NTA和ΗΡΑ?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何固定方法和化學(xué)作用將本發(fā)明的分子固定在傳感器芯片的表面上，包括但不限于，經(jīng)由胺基的直接共價(jià)偶合、經(jīng)由硫氫基的直接共價(jià)偶合、生物素附著到抗生物素蛋白包被的表面、醛偶合到糖類基團(tuán)、以及通過組氨酸標(biāo)簽與NTA芯片附著。在某些實(shí)施方案，可以使用BIAcore儀器(例如，BIAcore儀器1000，BIAcoreInc.,Piscataway,NJ)來確定包含多個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)和任選地Fc結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子，對(duì)抗原或FcγR的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如上討論的，參見5.4.1節(jié)，任何FcγR可以用于評(píng)估其中雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)免疫特異性地識(shí)別FcYR和/或其中雙抗體分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明的分子的結(jié)合。在特定的實(shí)施方案，F(xiàn)cYR是FcyRIIIA，優(yōu)選可溶的單體FcγRIIΙΑ。例如，在一個(gè)實(shí)施方案，可溶的單體FcγRIIIA是連接到接頭-AVITAG序列的FcγRIIIA的細(xì)胞外區(qū)域(參見，2003年1月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/439,498號(hào)和2003年3月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/456，041號(hào)，通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚?。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案，所述FcγR是FcγRIIB,優(yōu)選的是可溶的二聚FcyRIIB。例如，在一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)在2003年1月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/439，709號(hào)中描述的方法制備可溶的二聚FcγRIIB蛋白，通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚摹?duì)于所有免疫學(xué)測(cè)定，本發(fā)明分子的FcYR識(shí)別/結(jié)合可由多個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子經(jīng)由多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一免疫特異性地識(shí)別FcYR;在其中本發(fā)明的分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)的其他的實(shí)施方案，雙抗體分子可經(jīng)由Fc-FcyR相互作用免疫特異性地識(shí)別FcγR；在其中本發(fā)明的分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)和免疫特異性地識(shí)別FcγR的表位結(jié)合位點(diǎn)兩者的又進(jìn)一步的實(shí)施方案，雙抗體分子可經(jīng)由表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)之一或兩者識(shí)別FcyR0使用BIAcore儀器測(cè)定包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子對(duì)抗原和/或FcYR的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的示范性的測(cè)定包括以下將第一抗原固定在傳感器芯片表面的四個(gè)流動(dòng)小室之一上，優(yōu)選的通過胺偶合化學(xué)作用，從而所述第一抗原的約5000個(gè)應(yīng)答單位(RU)被固定在表面上。制備了合適表面之后，使免疫特異性地識(shí)別所述第一抗原的本發(fā)明的分子通過所述表面，優(yōu)選的通過以5μL/mL的流速、20μg/mL溶液的一分鐘注射。這一階段結(jié)合到表面的本發(fā)明的分子的水平通常在400至700RU之間。然后，將HBS-P緩沖液(20mMHEPESU50mMNaCl、3mMEDTA,ρΗ7.5)中第二抗原(如，F(xiàn)cyR)或FcγR受體的系列稀釋以lOOyL/min注射到表面上。不同的第二抗原或受體稀釋之間的分子再生優(yōu)選通過IOOmMNaHCO3PH9.4；3MNaCl的單次5秒注射來進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的任何再生技術(shù)涵蓋在本發(fā)明的方法內(nèi)。收集到完整的數(shù)據(jù)集之后，使用由SPR儀器廠家，例如BIAcore，Inc.(Piscataway,NJ)提供的計(jì)算機(jī)算法將產(chǎn)生的結(jié)合曲線全局?jǐn)M合。這些算法計(jì)算K。n*K。ff，從中推出作為兩個(gè)速率常數(shù)的比例(S卩，K。ff/K。n)的表觀平衡結(jié)合常數(shù)Kd。如何產(chǎn)生單獨(dú)的速率常數(shù)的更詳細(xì)的處理可以在BIAevaluaion軟件手冊(cè)(BIAcore，Inc.,Piscataway,NJ)中找到。使用本領(lǐng)域已知的任何方法可以對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。解釋所產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的各種方法的綜述，參見MySZka(1997)"KineticAnalysisOfMacromolecularInteractionsUsingSurfacePlasmonResonanceBiosensors(使用表面等離子共振生物傳感器動(dòng)力學(xué)分析大分子相互作用)”CUrrentOpinioninBiotechnology8:50_7;Fisher等人(1994)"SurfacePlasmonResonanceBasedMethodsForMeasuringTheKineticsAndBindingAffinitiesOfBiomolecularInteractions(為了測(cè)量大分子相互作用的動(dòng)力學(xué)和結(jié)合親和性的基于表面等離子共振的方法)”CurrentOpinioninBiotechnology5:389_95Shannessy(1994)“DeterminationOfKineticRateAndEquilibriumBindingConstantsForMacromolecularInteractions:ACritiqueOfTheSurfacePlasmonResonanceLiterature(確定大分子相互作用的動(dòng)力學(xué)速率和平衡結(jié)合常數(shù)對(duì)表面等離子共振文獻(xiàn)的評(píng)論)”CurrentOpinioninBiotechnology,565-71；Chaiken等人(1992)"AnalysisOfMacromolecularInteractionsUsingImmobilizedLigands(使用固定的配體分析大分子相互作用)”AnalyticalBiochemistry,201197-210;Morton等人(1995)“InterpretingComplexBindingKineticsFromOpticalBiosensors:AComparisonOfAnalysisByLinearization,TheIntegratedRateEquation,AndNumericalIntegration(從光學(xué)生物傳感器解釋復(fù)合物結(jié)合動(dòng)力學(xué)比較由線性化、積分的速率方程和數(shù)字積分分析)"AnalyticalBiochemistry227176-85；0'Shannessy等人，1996，AnalyticalBiochemistry236:275_83；所有文獻(xiàn)都通過引用全文并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方案，使用SI3R分析例如BIAcore確定的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以用作本發(fā)明的分子在功能測(cè)定例如ADCC中如何起作用的預(yù)示性量度。根據(jù)從sra分析獲得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)本發(fā)明的分子的效力的示例性的方法可以包括以下確定本發(fā)明的分子對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIB的結(jié)合(經(jīng)由表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分))的1(。值；相對(duì)ADCC數(shù)據(jù)繪制⑴FcYRIIIA&K。ff(Wt)/K。ff(mut)；(2)FcγRIIB的K。ff(mut)/Koff(wt)。比1高的數(shù)字顯示了相對(duì)于野生型、對(duì)FcYRIIIA降低的解離速率和對(duì)FcYRIIB升高的解離速率；并具有增強(qiáng)的ADCC功能。5.5產(chǎn)生本發(fā)明雙抗體分子的方法本發(fā)明雙抗體分子可使用本領(lǐng)域公知的多種方法產(chǎn)生，包括從頭合成蛋白和重組表達(dá)編碼結(jié)合蛋白的核酸。期望的核酸序列可通過重組方法(如，PCR誘變之前制備的期望多核苷酸的變體)或通過固相合成DNA而產(chǎn)生。通常使用重組表達(dá)方法。一方面，本發(fā)明提供包含編碼⑶16AVH和/或VL的序列的多核苷酸；在另一方面，本發(fā)明提供包含編碼CD32BVH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種核酸序列編碼每種免疫球蛋白氨基酸序列，本發(fā)明包括編碼本文所述結(jié)合蛋白的所有核酸。5.5.1編碼本發(fā)明分子的多核苷酸.本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸，所述分子包括多肽和抗體。通過本領(lǐng)域已知的任何方法可以獲得編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸，確定所述多核苷酸的核苷酸序列。確定了通過本發(fā)明的方法鑒定的分子的核苷酸序列之后，可以使用本領(lǐng)域公知的方法操作該核苷酸序列，例如，重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等等(參見，例如，在Sambrook等人，2001，MolecularCloninR,ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第3版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY禾口Ausubel等人編輯，1998,CurrentProtocolsinMolecularBioloRy(分子生物學(xué)Jlii方案),JohnWiley&Sons,NY中描述的技術(shù)，通過引用將它們?nèi)牟⑷氡疚?，通過例如產(chǎn)生氨基酸取代、缺失和/或添加來產(chǎn)生，例如，具有不同氨基酸序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案，本領(lǐng)域中可用的人類文庫或任何其他文庫可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來篩選，以克隆編碼本發(fā)明的分子的核酸。5.5.2重組表達(dá)本發(fā)明的分子獲得了編碼本發(fā)明的分子(例如，抗體)的核酸序列之后，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生用于生產(chǎn)該分子的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明的分子的編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成的技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。(參見，例如在Sambrook等人，1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY禾口Ausubel等人編輯，1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子牛物學(xué)最新方案)，TohnWiley&Sons,NY中描述的技術(shù))。包含通過本發(fā)明的方法鑒定的分子的核苷酸序列的表達(dá)載體，可以通過常規(guī)技術(shù)(例如，電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和磷酸鈣沉淀)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的分子。在特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的分子的表達(dá)受到組成型、誘導(dǎo)型、或組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。用于表達(dá)通過本發(fā)明的方法鑒定的分子的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，或優(yōu)選地真核細(xì)胞，特別是對(duì)于完全重組免疫球蛋白分子的表達(dá)。特別地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)，以及載體，例如來自人類巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動(dòng)子元件，是免疫球蛋白的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人(1986)"PowerfulAndVersatileEnhancer-PromoterUnitForMammalianExpressionVectors(用于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的有效和通用增強(qiáng)子-啟動(dòng)子單元)”Gene45101-106；Cockett等人(1990)"HighLevelExpressionOfTissueInhibitorOfMetalloproteinasesInChineseHamsterOvaryCellsUsingGlutamineSynthetaseGeneAmplification(使用谷氨酰胺合成酶基因擴(kuò)增在中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞中高水平表達(dá)金屬蛋白酶的組織抑制劑)”Biotechnology8:662_667)?？梢岳酶鞣N宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)通過本發(fā)明的方法鑒定的分子。這種宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表載體，通過所述載體可以產(chǎn)生和隨后純化本發(fā)明的分子的編碼序列，還代表細(xì)胞，當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，所述細(xì)胞可以原位表達(dá)本發(fā)明的分子。這些包括但不限于，用含有通過本發(fā)明的方法鑒定的分子的編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，畢赤酵母)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)和煙草花葉病毒(TMV)感染的，或重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，C0S、CH0、BHK、293、293T、3T3細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(參見美國(guó)專利第5，807，715號(hào)),PerC.6細(xì)胞(由Crucell開發(fā)的人類視網(wǎng)膜細(xì)胞)，所述構(gòu)建體含有來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)。在細(xì)菌系統(tǒng)中，取決于要表達(dá)的分子的預(yù)定用途，可以有利地選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)要產(chǎn)生大量的這種蛋白，用于抗體的藥物組合物的生產(chǎn)時(shí)，指導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的高水平表達(dá)的載體是期望的。這種載體包括但不限于，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(RUther等人(1983)“EasyIdentificationOfcDNAClones(容易地鑒定cDNA克隆)”EMB0J.2:1791-1794)，其中抗體編碼序列可以與lacZ編碼區(qū)符合讀框地單獨(dú)連接到載體中，從而產(chǎn)生融合蛋白；PlN載體(Inouye等人(1985)"Up-PromoterMutationsInTheIppGeneOfEscherichiaColi(大腸桿菌Ipp基因中啟動(dòng)子上游的突變)"NucleicAcidsRes.13:3101_3110；VanHeeke等人(1989)"ExpressionOfHumanAsparagineSynthetaseInEscherichiaColi(在大腸桿菌中表達(dá)人類天冬酰胺合成酶)”J.Biol.Chem.24=5503-5509)；等等。pGEX載體也可以用于將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般地，這種融合蛋白是可溶的，通過吸附和結(jié)合到基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠，隨后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫，可以容易地從裂解的細(xì)胞純化。PGEX載體被設(shè)計(jì)以包括凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶裂解位點(diǎn)，從而克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物可以從GST部分釋放。在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒(AcNPV)被用作載體來表達(dá)外源基因。病毒在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)?？贵w編碼序列可以單獨(dú)地克隆到病毒的非關(guān)鍵區(qū)(例如，多角體蛋白基因)并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如，多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制之下。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，感興趣的抗體編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)的前導(dǎo)序列。然后可以通過體外或體內(nèi)重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組。在病毒基因組的非關(guān)鍵區(qū)(例如，區(qū)域El或E3)中的插入將產(chǎn)生存活的和能在感染的宿主中表達(dá)免疫球蛋白分子的重組病毒(例如參見，Logan等人(1984)"AdenovirusTripartiteLeaderSequenceEnhancesTranslationOfmRNAsLateAfterInfection(腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列在感染后晚期增強(qiáng)mRNA的翻譯)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3655-3659)。特定的起始信號(hào)也可能是插入的抗體編碼序列的有效翻譯所需的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。此外，起始密碼子必須與期望的編碼序列的閱讀框相符以確保翻譯完整的插入物。這些外源的翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來源的，天然的和合成的。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子，等等，可以增強(qiáng)表達(dá)的效力(參見，Bitter等人(1987)"ExpressionAndSecretionVectorsForYeast(用于酵母的表達(dá)和分泌載體)”MethodsinEnzymo1.153:516_544)。此外，可以選擇宿主細(xì)胞株，其調(diào)節(jié)插入的序列的表達(dá)，或以期望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。例如，在某些實(shí)施方案，包含本發(fā)明的雙抗體分子的多肽可能表達(dá)為單基因產(chǎn)物(如，作為單個(gè)多肽鏈，即，作為多蛋白前體)，要求由天然或重組細(xì)胞機(jī)制的蛋白水解性裂解以形成本發(fā)明雙抗體分子的單獨(dú)多肽。因此，本發(fā)明涵蓋工程化核酸序列以編碼包含本發(fā)明的多肽的多蛋白前體分子，所述核酸序列包括能夠指導(dǎo)所述多蛋白前體的翻譯后裂解的編碼序列。多蛋白前體的翻譯后裂解形成本發(fā)明的多肽。包含本發(fā)明的多肽的前體分子的翻譯后裂解可在體內(nèi)發(fā)生(即，在宿主細(xì)胞中由天然或重組細(xì)胞系統(tǒng)/機(jī)制，如，弗林蛋白酶在合適的位點(diǎn)裂解)或在體外發(fā)生(如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的組合物和/或包含已知促進(jìn)期望的蛋白水解作用的條件或試劑的組合物中培養(yǎng)所述多肽鏈)。重組蛋白的純化和修飾是本領(lǐng)域公知的，以使多蛋白前體的設(shè)計(jì)可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的許多實(shí)施方案。本領(lǐng)域已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用于前體分子的期望修飾，如，凝血酶(其識(shí)別氨基酸序列LVPR~GS(SEQIDNO:91))、或凝血因子Xa(其識(shí)別氨基酸序歹IjI(E/D)GR"(SEQIDNO92)(Nagai等人(1985)"OxygenBindingPropertiesOfHumanMutantHemoglobinsSynthesizedInEscherichiaColi(大腸桿菌中合成的人類突變血紅蛋白的氧結(jié)合性質(zhì))”Proc.Nat.Acad.Sci.USA82=7252-7255,并綜述于Jenny等人(2003)"ACriticalReviewOfTheMethodsForCleavageOfFusionProteinsWithThrombinAndFactorXa(用凝血酶和凝血因子Xa裂解融合蛋白的方法的重要綜述)"ProteinExpr.Purif.311-11，全部通過引用全文并入本文))、腸激酶(其識(shí)別氨基酸序列DDDDK"(SEQIDNO93)(Collins-Racie等人(1995)"ProductionOfRecombinantBovineEnterokinaseCatalyticSubunitInEscherichiaColiUsingTheNovelSecretoryFusionPartnerDsbA(使用新型分泌融合伴侶DsbA在大腸桿菌中產(chǎn)生重組牛腸激酶催化亞基)”Biotechnology13:982_987，在此通過引用全文并入本文))、弗林蛋白酶(其識(shí)別氨基酸序列RXXR~，優(yōu)先識(shí)別RX(K/R)R~(分別是SEQIDN0:94和SEQIDNO95)(P6位置另外的R表現(xiàn)為增強(qiáng)裂解))、和AcTEV(其識(shí)別氨基酸序列ENLYFQ~G(SEQIDNO96)(Parks^A(1994)"ReleaseOfProteinsAndPeptidesFromFusionProteinsUsingARecombinantPlantVirusProteinase(使用重組植物病毒蛋白酶從融合蛋白釋放蛋白和肽)”Anal.Biochem.216:413_417，在此通過引用全文并入本文))和口蹄疫病毒蛋白酶C3。參見例如上述6.4節(jié)。不同的宿主細(xì)胞對(duì)于翻譯后加工和蛋白與基因產(chǎn)物的修飾具有特征性和特定的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來確保所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可以使用真核的宿主細(xì)胞，其具有用于原始轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器。這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa,COS、MDCK,293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。對(duì)于長(zhǎng)期的、高產(chǎn)量的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以工程化穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以用由適合的表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點(diǎn)，等等)控制的DNA和選擇標(biāo)記來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA之后，可以容許工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予了對(duì)選擇的抗性，容許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到它們的染色體中，并生長(zhǎng)形成聚集(foci)，其隨后可被克隆和擴(kuò)大成細(xì)胞系。這種方法可以有利地用于工程化表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系。這種工程化的細(xì)胞系在篩選和評(píng)估與本發(fā)明的分子直接或間接作用的化合物中是特別有用的?？梢允褂迷S多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純性皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)“TransferOfPurifiedHerpesVirusThymidineKinaseGeneToCulturedMouseCells(轉(zhuǎn)移純化的單純性皰疹病毒胸苷激酶基因到培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞中)”Cell11:223-232)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska等人(1992)"UseOfTheHPRTGeneAndTheHATSelectionTechniqueInDNA-MediatedTransformationOfMammalianCells:FirstStepsTowardDevelopingHybridomaTechniquesAndGeneTherapy(在DNA-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用HPRT基因和HAT篩選技術(shù)朝向開發(fā)雜交瘤技術(shù)和基因治療的第一步)”Bioessays14:495-500)、和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人(1980)"IsolationOfTransformingDNA:CloningTheHamsteraprtGene(分離轉(zhuǎn)化DNA克隆倉鼠aprt基因)”Cell22:817_823)基因，可以分別應(yīng)用于tk_細(xì)胞、hgprt-細(xì)胞或aprt-細(xì)胞。并且，抗代謝物抗性可以用作以下基因的篩選的基礎(chǔ)dhfr，其賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性(Wigler等人(1980)"TransformationOfMammalianCellsWithAnAmplifiableDominant-ActingGene(以可擴(kuò)增的顯性作用基因轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)Ifi)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA773567-3570；O‘Hare等人(1981)"TransformationOfMouseFibroblastsToMethotrexateResistanceByARecombinantPlasmidExpressingAProkaryoticDihydrofolateReductase(由表達(dá)原核細(xì)胞二氧葉酸還原酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)氨甲喋呤的抗性)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527-1531)；gpt，其賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan等人(1981)"SelectionForAnimalCellsThatExpressTheEscherichiacoliGeneCodingForXanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase(篩選表達(dá)編碼黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌基因的動(dòng)物細(xì)胞)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA78=2072-2076)；neo，其賦予對(duì)氨基糖苷類G-418的抗性(Tolstoshev(1993)"GeneTherapy,Concepts,CurrentTrialsAndFutureDirections(基因治療的概念、目前的試驗(yàn)和未來方向)”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan(1993)"TheBasicScienceOfGeneTherapy(基因治療的基本原理)”Science260:926_932；和Morgan等人(1993)“HumanGeneTherapy(人類基因治療)”Ann.Rev.Biochem.62191-217)、和hygro，其賦予對(duì)潮霉素的抗性(Santerre等人(1984)"ExpressionOfProkaryoticGenesForHygromycinBAndG418ResistanceAsDominant-SelectionMarkersInMouseLCells(表達(dá)潮霉素B和G418抗性的原核細(xì)胞基因作為小鼠L細(xì)胞中的顯性篩選標(biāo)記)”Gene30147-156)?？梢允褂玫闹亟MDNA
技術(shù)領(lǐng)域：
通常已知的方法是Ausubel等人(編輯)，1993,CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子牛物學(xué)最新方案)，TohnWiley&Sons,NYKriegler,1990,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual(基因轉(zhuǎn)移禾口表達(dá)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，StocktonPress,NY；和Dracopoli等人(編輯)，1994,CurrentProtocolsinHumanGenetics(人類遺傳學(xué)最新方案)的第12和13章，JohnWiley&Sons,NY.；Colberre-Garapin等人(1981)"ANewDominantHybridSelectiveMarkerForHigherEukaryoticCells(用于更高等真核細(xì)胞的新的顯性雜合篩選標(biāo)記)”J.Mol.Biol.1501-14中描述的。通過載體擴(kuò)增(對(duì)于綜述，參見Bebbington和Hentschel，TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAclonim(在DNA克隆中，使用基于基因擴(kuò)增的載體以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)克隆的基因).第3卷(AcademicPreSS，NewYork，1987)，可以增加本發(fā)明的分子的表達(dá)水平。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物是可擴(kuò)增的時(shí)，宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中存在的抑制物水平的增加將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增的區(qū)域與雙抗體分子的多肽的核苷酸序列相連，多肽的產(chǎn)生也將增加(Crouse等人(1983)"ExpressionAndAmplificationOfEngineeredMouseDihydrofolateReductaseMinigenes(表達(dá)禾口擴(kuò)增工禾呈化的小鼠二氧葉酸還原酶小基因)”Mol.Cell.Biol.3:257_266)。可以用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一載體編碼雙抗體分子的第一多肽，第二載體編碼雙抗體分子的第二多肽。兩種載體可以含有相同的選擇標(biāo)記，其允許兩種多肽的等量表達(dá)。作為選擇，可以使用編碼兩種多肽的單個(gè)載體。本發(fā)明的分子的多肽的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。重組表達(dá)了本發(fā)明的分子(即，雙抗體)之后，它可以通過本領(lǐng)域已知用于純化多肽、多蛋白或雙抗體的任何方法(如，類似于基于抗原選擇性的抗體純化方案)來純化，例如，通過色譜(例如，離子交換、親和性、特別是通過對(duì)特定抗原的親和性(任選地當(dāng)雙抗體分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)時(shí)在蛋白A篩選后)，和尺寸柱色譜)、離心、差異溶解，或通過用于純化多肽、多蛋白或雙抗體的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。5.6預(yù)防和治療方法本發(fā)明的分子特別有用于治療和/或預(yù)防其中期望FcYR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能(如，ADCC)的疾病、病癥或感染(如，癌癥、傳染病)。如上討論的，本發(fā)明的雙抗體在引發(fā)效應(yīng)物功能方面可展現(xiàn)抗體-樣功能，盡管雙抗體分子不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。通過包含至少一個(gè)免疫特異性地識(shí)別FcγR的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，雙抗體分子可展現(xiàn)類似于Fc-FcyR相互作用的FcγR結(jié)合和活性。例如，本發(fā)明的分子可能結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞(如，NK細(xì)胞)上的細(xì)胞表面抗原和FcγR(如，F(xiàn)cγRIIIA)，刺激針對(duì)所述細(xì)胞的效應(yīng)物功能(如，ADCC、⑶C、吞噬作用、調(diào)理作用等等)。在其他實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)。在這種實(shí)施方案，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包含相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的至少一個(gè)氨基酸修飾和/或可包括來自一種或多種IgG同種型(如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的包含變體Fc結(jié)構(gòu)域的分子相對(duì)于包含野生型Fc結(jié)構(gòu)域的分子可展現(xiàn)賦予的或改變的表型，諸如改變的或賦予的效應(yīng)物功能活性(如，在NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性測(cè)定中測(cè)定的)。在所述實(shí)施方案，本發(fā)明的具有賦予的或改變的效應(yīng)物功能活性的分子可用于治療和/或預(yù)防其中期望增強(qiáng)效力的效應(yīng)物功能活性的疾病、病癥或感染。在某些實(shí)施方案，包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(或其部分)的本發(fā)明雙抗體分子介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性級(jí)聯(lián)。鑒定為改變效應(yīng)物功能的Fc結(jié)構(gòu)域變體公開于國(guó)際申請(qǐng)W004/063351、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/626，510、2004年12月15日提交的60/636，663、和2006年3月10日提交的60/781，564、2005年11月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)11/271，140、2005年12月15日提交的11/305，787，這些是本發(fā)明人的同時(shí)申請(qǐng)，所有這些通過引用全文并入本文。本發(fā)明涵蓋在受治療者治療、預(yù)防或控制癌癥的方法和組合物，包括向受治療者施用治療有效量的包含一種或多種表位結(jié)合位點(diǎn)和任選地根據(jù)本發(fā)明工程化的Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的一種或多種分子，該分子進(jìn)一步結(jié)合癌抗原。本發(fā)明的分子特別有用于預(yù)防、抑制、減少生長(zhǎng)或消退原代腫瘤、癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶和傳染病。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，本發(fā)明的分子介導(dǎo)效應(yīng)物功能，導(dǎo)致清除腫瘤、減少腫瘤或其組合。在替代實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體通過交聯(lián)細(xì)胞表面抗原和/或受體和增強(qiáng)凋亡或負(fù)生長(zhǎng)調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)而介導(dǎo)治療活性。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，本發(fā)明的雙抗體分子相對(duì)于本領(lǐng)域已知的治療性抗體展現(xiàn)增強(qiáng)的治療效力，部分地由于雙抗體免疫特異性地結(jié)合以減少的水平表達(dá)特定抗原(如，F(xiàn)cyR)的靶細(xì)胞的能力，例如借助由于雙抗體-表位相互作用的改進(jìn)的親和力，雙抗體保持在靶細(xì)胞上時(shí)間更長(zhǎng)的能力。具有對(duì)抗原(如，F(xiàn)cYR)增強(qiáng)的親和性和親和力的本發(fā)明的雙抗體特別有用于在受治療者治療、預(yù)防或控制癌癥或另一種疾病或病癥，其中FcγR在靶細(xì)胞群中以低水平表達(dá)。如在此使用的，F(xiàn)cγR在細(xì)胞中的表達(dá)定義為如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用方法測(cè)量的關(guān)于這種分子在每細(xì)胞中的密度。包含多個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)和任選地FcγR(或其部分)的本發(fā)明的分子優(yōu)選地在以30，000至20，000分子/細(xì)胞的密度、以20，000至10，000分子/細(xì)胞的密度、以10，000分子/細(xì)胞或更少的密度、以5000分子/細(xì)胞或更少的密度、或以1000分子/細(xì)胞或更少的密度表達(dá)靶抗原(如，癌抗原)的細(xì)胞中還具有賦予的或增強(qiáng)的親和力和親和性和/或效應(yīng)物功能。本發(fā)明的分子在治療、預(yù)防或控制亞群中的疾病或病癥諸如癌癥中有特別的效用，其中靶抗原在靶細(xì)胞群中以低水平表達(dá)。本發(fā)明的分子也可以有利地與本領(lǐng)域已知用于疾病諸如癌癥、自身免疫疾病、炎性病癥或傳染病的治療或預(yù)防的其他治療劑一同使用。在特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的分子可以與單克隆或嵌合抗體、淋巴因子或造血生長(zhǎng)因子(例如，IL-2、IL-3和IL-7)組合使用，它們例如被用來提高與所述分子相互作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目或活性，和提高免疫應(yīng)答。本發(fā)明的分子也可以有利地與用于治療疾病、病癥或感染的藥物組合使用，例如抗癌劑、抗炎劑或抗病毒劑，例如以下的5.7節(jié)中詳述的。5.6.1癌癥本發(fā)明涵蓋用于在受治療者中治療或預(yù)防癌癥的方法和組合物，包括向受治療者施用治療有效量的包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一種或多種分子。在一些實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋在具有FcγR多態(tài)性的受治療者，例如對(duì)fYRIIIA-158V或FcγRIIIA-158F等位基因純合的那些受治療者中治療或預(yù)防癌癥的方法和組合物。在一些實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋工程化雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域以免疫特異性地結(jié)合FcyRIIIA(158F)。在其他實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋工程化雙抗體分子的至少一個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域以免疫特異性地結(jié)合FcyRIIIA(158V)。標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體療法的效力取決于受治療者的FcYR多態(tài)性(Cartron等人(2002)"TherapeuticActivityOfHumanizedAnti-CD20MonoclonalAntibodyAndPolymorphismInIgGFcReceptorFcRIIIaGene(人源化抗CD20單克隆抗體的治療活性與IgGFc受體FcRIIIa基因的多態(tài)性)”Blood99:754-758;Weng等人(2003)"TwoImmunoglobulinGFragmentCReceptorPolymorphismsIndependentlyPredictResponseToRituximabInPatientsWithFollicularLymphoma(兩禾中免疫球蛋白G片段C受體多態(tài)性獨(dú)立地預(yù)測(cè)在濾泡性淋巴瘤患者對(duì)利妥昔單抗的響應(yīng))”JClinOncol.21(21):3940_3947，通過引用將這兩篇全文并入本文)。這些受體在效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)并介導(dǎo)ADCC。低親和性活化受體的高親和性等位基因改善效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力。不同于依賴于Fc-FcγR相互作用來引起效應(yīng)物功能，本發(fā)明的方法涵蓋工程化分子以免疫特異性地識(shí)別低親和性活化受體，容許為了特定多態(tài)性來設(shè)計(jì)分子?？蛇x地或另外地，本發(fā)明的分子可被工程化為包含對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上的FcγR展現(xiàn)增強(qiáng)的親和性的變體Fc結(jié)構(gòu)域(相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明的工程化的分子為患者提供了更好的免疫治療劑，而不論患者的FcγR多態(tài)性。使用培養(yǎng)的細(xì)胞系或來源于患者的PMBC細(xì)胞通過ADCC測(cè)試根據(jù)本發(fā)明工程化的雙抗體分子，來確定Fc突變?cè)鰪?qiáng)ADCC的能力。使用本文公開的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)從外周血收集淋巴細(xì)胞。用銪(PerkinElmer)加載靶細(xì)胞即，培養(yǎng)的細(xì)胞系或來源于患者的細(xì)胞，在37°C與效應(yīng)物孵育4h。使用熒光板讀數(shù)器(Wallac)檢測(cè)釋放的銪。產(chǎn)生的ADCC數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的分子觸發(fā)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效力，并確定了哪些分子可以用患者樣品和淘析的單核細(xì)胞來測(cè)試。然后使用來自患者的PBMC在ADCC測(cè)定中測(cè)試顯示了引發(fā)ADCC活性的最大可能性的雙抗體分子。來自健康供者的PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療以癌抗原為特征的癌癥的方法，通過根據(jù)本發(fā)明工程化雙抗體分子以免疫特異性地識(shí)別所述癌抗原以使雙抗體分子本身是細(xì)胞毒性的(如，經(jīng)由交聯(lián)表面受體，導(dǎo)致凋亡增加或下調(diào)增殖信號(hào))和/或包括Fc結(jié)構(gòu)域、和/或介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)物功能(如，ADCC、吞噬作用)。已根據(jù)本發(fā)明工程化的雙抗體可用于預(yù)防或治療癌癥，因?yàn)槠渚哂屑?xì)胞毒性活性(如，增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷和/或增強(qiáng)的例如ADCC活性或⑶C活性)。與癌抗原相關(guān)的癌癥可以通過施用雙抗體來治療或預(yù)防，所述雙抗體結(jié)合癌抗原并且是細(xì)胞毒性的，和/或已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法工程化以展現(xiàn)效應(yīng)物功能。例如而不是為了限制，與以下癌抗原相關(guān)的癌癥可以通過本發(fā)明的方法和組合物來治療或預(yù)防KS1/4泛癌抗原(Perez等人(1989)"IsolationAndCharacterizationOfACdnaEncodingTheKsl/4EpithelialCarcinomaMarker(分離和表征編碼Ks1/4上皮癌標(biāo)記物的cDNA)”J.Immunol.1423662-3667；Moller^Λ(1991)"Bispecific-Monoclonal-Antibody-DirectedLysisOfOvarianCarcinomaCellsByActivatedHumanTLymphocytes(雙特異性單克隆抗體指導(dǎo)由活化的人類T淋巴細(xì)胞裂解卵巢癌細(xì)胞)”CancerImmunol.Immunother.33(4):210_216)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等人(1991)"CoexpressionOfDifferentAntigenicMarkersOnMoietiesThatBearCA125Determinants(^攜帶CA125決定簇的部分上共表達(dá)不同抗原性標(biāo)記物)”CancerRes.51(2):468_475)、前列腺酸磷酸鹽(Tailor等人(1990)"NucleotideSequenceOfHumanProstaticAcidPhosphataseDeterminedFromAFull-LengthcDNAClone(從全長(zhǎng)cDNA克隆確定的人類前列腺酸磷酸酶的核苷酸序列)”Nucl.AcidsRes.18(16):4928)、前列腺特異性抗原(Henttu等人(1989)“cDNACodingForTheEntireHumanProstateSpecificAntigenShowsHighHomologiesToTheHumanTissueKallikreinGenes(編碼完全人類前列腺特異性抗原的cDNA顯示對(duì)人類組織血管舒緩素基因的高度同源性)"Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)903-910；IsraeliφΛ(1993)"MolecularCloningOfAComplementaryDNAEncodingAProstate-SpecificMembraneAntigen(H54III^lJ#^II^LHCW互補(bǔ)DNA的分子克隆)”CancerRes.53=227-230)、黑素瘤相關(guān)抗原p97(Estin等人(1989)“TransfectedMouseMelanomaLinesThatExpressVariousLevelsOfHumanMelanoma-AssociatedAntigenp97(表達(dá)不同水平的人類黑素瘤相關(guān)抗原p97的轉(zhuǎn)染的小鼠黑素瘤系)”J.Natl.CancerInstit.81(6):445_454)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人(1990)“TheMelanomaAntigenGp75IsTheHumanHomologueOfTheMouseB(Brown)LocusGeneProduct(黑素瘤抗原Gp75是小鼠B(Brown)基因座基因產(chǎn)物的人類同系物)”J.Exp.Med.171(4)1375-1380)、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等人(1987)"ImmunohistochemicalDetectionOfAntigenInHumanPrimaryAndMetastaticMelanomasByTheMonoclonalAntibody140.240AndItsPossiblePrognosticSignificance(由單克隆抗體140.240免疫組化檢測(cè)人類原代和轉(zhuǎn)移的黑素瘤中的抗原和其可能的預(yù)后重要性)”Cancer59:55_63；Mittelman等人(1990)"ActiveSpesificImmunotherapyInPatientsWithMelanoma.AClinicalTrialWithMouseAntiidiotypicMonoclonalAntibodiesElicitedWithSyngeneicAnti-High-Molecular-ffeight-Melanoma-AssociatedAntigenMonoclonalAntibodies(在黑素瘤患者中的活性特異性免疫療法。以小鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體的臨床試驗(yàn)引發(fā)同基因的抗高分子量-黑素瘤_相關(guān)抗原單克隆抗體)，，J.Clin.Invest.86:2136_2144))、前列腺特異性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等人(1995)“ImmuneResponseToTheCarcinoembryonicAntigenInPatientsTreatedWithAnAnti-IdiotypeAntibodyVaccine(IiLiK^l^fMiKW疫苗治療的患者中對(duì)癌胚抗原的免疫應(yīng)答)，，J.Clin.Invest.96(1):334_42)、多態(tài)性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原諸如CEA、TAG-72(Y0k0ta等人(1992)"RapidTimorPenetrationOfASingle-ChainFvAndComparisonWithOtherImmunoglobulinForms(單鏈Fv的快速腫瘤滲透并與其他免疫球蛋白形式比較)”CancerRes.52:3402-3408)、C017-lA(Ragnhammar等人(1993)"EffectOfMonoclonalAntibody17-1AAndGM-CSFInPatientsWithAdvancedColorectalCarcinoma-Long-Lasting,CompleteRemissionsCanBeInduced(單克隆抗體17-1A和GM-CSF在患有晚期結(jié)腸直腸癌的患者中的效應(yīng)-可誘導(dǎo)長(zhǎng)期、完全的緩解)”Int.J.Cancer53:751-758)；GICA19-9(Herlyn等人(1982)"MonoclonalAntibodyDetectionOfACirculatingTumor-AssociatedAntigen.I.PresenceOfAntigenInSeraOfPatientsWithColorectal,Gastric,AndPancreaticCarcinoma(循環(huán)腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體檢測(cè)。I.結(jié)腸直腸癌、胃癌和胰腺癌患者的血清中抗原的存在)”J.Clin.Immunol.2135-140)、CTA-I和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie等人(1994)"Anti-CD19InhibitsTheGrowthOfHumanB-CellTumorLinesInVitroAndOfDaudiCellsInSCIDMiceByInducingCellCycleArrest(抗CD19通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而體外抑制人類B-細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)和SCID小鼠中Daudi細(xì)胞的生長(zhǎng))”Blood831329-1336)、人類B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等人(1994)"DepletionOfBCellsInVivoByAChimericMouseHumanMonoclonalAntibodyToCD20(與CD20的嵌合小鼠人類單克隆抗體體內(nèi)清除B細(xì)胞)”Blood83:435-445)、CD33(Sgouros等人(1993)"ModelingAndDosimetryOfMonoclonalAntibodyM195(Anti_CD33)InAcuteMyelogenousLeukemia(在急性骨髓性白血病中建模和放射量測(cè)定單克隆抗體M195(抗⑶33))”J.Nucl.Med.34:422-430)、黑素瘤特異性抗原例如神經(jīng)節(jié)苷脂⑶2(Saleh等人(1993)“GenerationOfAHumanAnti-IdiotypicAntibodyThatMimicsTheGD2Antigen(Γ^RMGD2原的人類抗獨(dú)特型抗體)”Τ.Immunol.，151，3390-3398)、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3(Shitara等人(1993)"AMouse/HumanChimericAnti-(GangliosideGD3)AntibodyWithEnhancedAntitumorActivities(具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的一種小鼠/人類嵌合抗(神經(jīng)節(jié)苷脂GD3)抗體)”CancerImmunol.Immunother.36373-380)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2(Livingston等人(1994)"ImprovedSurvivalInStageIIIMelanomaPatientsWithGM2AntibodiesARandomizedTrialOfAdjuvantVaccinationWithGM2Ganglioside(VXGM2#改善III期黑素瘤患者的存活以GM2神經(jīng)節(jié)苷脂佐劑接種的隨機(jī)化試驗(yàn))”J.Clin.Oncol.121036-1044)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(Hoon等人(1993)“MolecularCloningOfAHumanMonoclonalAntibodyReactiveToGangliosideGM3AntigenOnHumanCancers(對(duì)人類癌癥上的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3抗原反應(yīng)性的人類單克隆抗體的分子克隆)”CancerRes.535244-5250)、細(xì)胞表面抗原的腫瘤特異性移植類型(TSTA)諸如病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括T抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如結(jié)腸的CEA、膀胱腫瘤癌胚抗原(Hellstrom等人(1985)"MonoclonalAntibodiesToCellSurfaceAntigensSharedByChemicallyInducedMouseBladderCarcinomas(針對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠膀胱癌共有的細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體)，，Cancer.Res.45=2210-2188)、分化抗原，例如人類肺癌抗原1^6丄20(:1^118仕0111等人(1986)“]\10110(；10皿1MouseAntibodiesRaisedAgainstHumanLungCarcinoma(針對(duì)人類肺癌產(chǎn)生的單克隆小鼠抗體)”CancerRes.463917-3923)、纖維肉瘤的抗原、人類白血病T細(xì)胞抗原_Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等人(1988)“IdiotypeVaccinesAgainstHumanTCellLeukemia.II.GenerationAndCharacterizationOfAMonoclonalIdiotypeCascade(Abl,Ab2,andAb3)(針對(duì)人類T細(xì)胞白血病的獨(dú)特型疫苗。II.產(chǎn)生和表征單克隆獨(dú)特型級(jí)聯(lián)(Abl、Ab2和Ab3))”J.Immunol.141:1398_1403)、新糖蛋白、鞘脂類、乳癌抗原例如EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)、HER2抗原(pl85HEK2)、多態(tài)上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等人(1992)"CellMembrane-AssociatedMucinsAndTheirAdhesion-ModulatingProperty(細(xì)胞膜相關(guān)的粘蛋白和其粘附調(diào)節(jié)性)”TrendsinBiochem.Sci.17:359_363)、惡性人類淋巴細(xì)胞^LHC-APO-I(TrauthφA(1989)"MonoclonalAntibody-MediatedTumorRegressionByInductionOfApoptosis(單克隆抗體-介導(dǎo)的由凋亡引起的腫瘤消退)”Science245301-304),itin,JM(Feizi(1985)"DemonstrationByMonoclonalAntibodiesThatCarbohydrateStructuresOfGlycoproteinsAndGlycolipidsAreOnco—DevelopmentalAntigens(單克隆抗體證實(shí)，糖蛋白和糖脂的糖類結(jié)構(gòu)是腫瘤發(fā)育抗原)"Nature31453-57)諸如胎兒紅細(xì)胞和原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I抗原、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)、乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的M18和M39、髓樣細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-I、結(jié)腸直腸癌癥中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、MyUVIM-D5和0^6-2231^-1-85(血型H)、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的C14、肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3、胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6、Y半抗原、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Ley、TL5(血型A)、A431細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EGF受體、胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)、胚胎癌細(xì)胞、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的FC10.2、腺癌中發(fā)現(xiàn)的C0-514(血型Lea)、腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10、C0_43(血型Leb)、G49、EGF受體、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的(血型ALe1VLeO、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9、胃癌粘蛋白、髓樣細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的T5A7、黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、GD3、D1.1、OFA-I、Gm2、OFA-2、Gd2、Ml22258和4-8細(xì)胞分裂期胚中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3、SSEA-4。在另一個(gè)實(shí)施方案，抗原是來自皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體衍生的肽(參見Edelson(1998)"CutaneousT-CellLymphomaAModelForSelectiveImmunotherapy(皮膚T細(xì)胞淋巴瘤選擇性免疫治療的模型)”CancerJSciAm.462-71)。可以通過本發(fā)明的方法和組合物治療或預(yù)防的癌癥和相關(guān)的病癥包括但不限于以下白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病，例如成髓細(xì)胞性、前髓細(xì)胞性、骨髓單核細(xì)胞性、單核細(xì)胞性、紅白血病白血病和脊髓發(fā)育不良綜合征，慢性白血病，例如但不限于，慢性的髓細(xì)胞的(粒細(xì)胞性)白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞白血病；真性紅細(xì)胞增多；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多發(fā)性骨髓瘤，例如但不限于郁積多發(fā)性骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、骨硬化的骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、孤立性漿細(xì)胞瘤和髓外漿細(xì)胞瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；未確定顯著性的單克隆的丙種球蛋白??；良性的單克隆丙種球蛋白病；重鏈??；骨骼和結(jié)締組織肉瘤，例如但不限于，骨骼肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管內(nèi)皮瘤)、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦腫瘤，包括但不限于，膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、寡枝神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、非膠質(zhì)細(xì)胞瘤(nonglialtumor)、聽神經(jīng)瘤、顱咽管瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、松果體瘤、成松果體細(xì)胞瘤、原發(fā)腦淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于，腺癌、小葉(小細(xì)胞)癌、管內(nèi)癌、髓質(zhì)乳腺癌、粘質(zhì)乳腺癌、管性乳腺癌、乳頭乳腺癌、佩吉特病和炎性的乳腺癌；腎上腺癌癥，包括但不限于，嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytom)和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，例如但不限于，乳頭狀的或?yàn)V泡性甲狀腺癌、髓質(zhì)甲狀腺癌和退行的甲狀腺癌；胰腺癌，包括但不限于，胰島瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、舒血管腸肽瘤、促生長(zhǎng)素釋放抑制因子分泌腫瘤、和類癌瘤或胰島細(xì)胞瘤；垂體癌癥，包括但不限于，庫興氏病、分泌促黃體分泌素的腫瘤、肢端肥大癥和尿崩癥(diabetesinsipius)；眼癌癥，包括但不限于，眼黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脈絡(luò)膜黑素瘤和睫狀體黑素瘤(cilliarybodymelanoma)，和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；陰道的癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和黑素瘤；陰部癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、腺癌、基底細(xì)胞癌、肉瘤和佩吉特病；子宮頸癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌和腺癌；子宮癌，包括但不限于，子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌癥，包括但不限于，卵巢上皮癌、交界瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和基質(zhì)腫瘤；食管癌癥，包括但不限于，鱗狀癌癥、腺癌、腺樣囊性癌(adenoidcycticcarcinoma)、粘液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑素瘤、漿細(xì)胞瘤、疣狀癌和燕麥形細(xì)胞(小細(xì)胞)癌；胃癌，包括但不限于，腺癌、真菌樣生長(zhǎng)(息肉樣)、潰爛、淺表散布、廣泛地散布、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，包括但不限于肝細(xì)胞癌和肝胚細(xì)胞瘤，膽囊癌癥，包括但不限于腺癌；膽管細(xì)胞癌，包括但不限于，乳頭狀(pappillary)、結(jié)節(jié)的和彌散的；肺癌，包括但不限于，非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌；睪丸癌癥，包括但不限于，生殖腫瘤、精原細(xì)胞瘤、退性發(fā)育的、經(jīng)典的(典型的)、精細(xì)胞的、非精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、惡性合胞體瘤(卵黃囊腫瘤)、前列腺癌癥，包括但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤；penal癌癥(penalcancer)；口腔癌，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌；基底癌癥；唾液腺癌癥，包括但不限于，腺癌、粘液表皮樣癌和腺樣囊性癌；咽癌，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌癥和疣；皮膚癌，包括但不限于，基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑素瘤，淺表散布黑素瘤、結(jié)節(jié)的黑素瘤、斑點(diǎn)惡性黑色素瘤、肢端的斑點(diǎn)的黑素瘤；腎癌，包括但不限于，腎細(xì)胞癌癥、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細(xì)胞癌(腎盂和/或輸尿管(Uterer))；維爾姆斯腫瘤；膀胱癌，包括但不限于，移行細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌癥包括粘液肉瘤、骨肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細(xì)胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(這些疾病的綜述，參見Fishman等人(1985)Medicine(藥物學(xué))，第2版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia；和Murphy等人(1997)InformedDecisions:TheCompleteBookofCancerDiagnosis,Treatment,andRecovery(知情決定癌癥診斷、治療和恢復(fù)大全)，VikingPenguin,PenguinBooksU.S.Α.，Inc.，UnitedStatesofAmerica)。因此，本發(fā)明的方法和組合物在各種癌癥或其他異常增殖性疾病的治療或預(yù)防中也是有用的，包括(但不限于)以下癌，包括膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、宮頸、甲狀腺和皮膚的癌；包括鱗狀細(xì)胞癌；淋巴譜系的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkettslymphoma)；骨髓譜系的造血腫瘤，包括急性和慢性粒性白血病和早幼粒細(xì)胞性白血??；間質(zhì)來源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌(tetratocarcinoma)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和許旺氏細(xì)胞瘤；間質(zhì)來源的腫瘤，包括纖維肉瘤(fibrosafcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyoscarama)和骨肉瘤；和其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病(xenodermapegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺濾泡性癌癥和畸胎癌。還預(yù)期的是由細(xì)胞凋亡中的畸變引起的癌癥也將通過本發(fā)明的方法和組合物來治療。這些癌癥可以包括但不限于，濾泡性淋巴瘤、具有P53突變的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依賴性腫瘤，和癌前期病變，例如家族性腺瘤息肉病，和脊髓發(fā)育不良綜合征。在特定的實(shí)施方案，卵巢、膀胱、乳腺、結(jié)腸、肺、皮膚、胰腺或子宮中的惡性腫瘤或異常增殖變化(例如組織化生和發(fā)育異常)，或過度增殖性病癥，通過本發(fā)明的方法和組合物來治療或預(yù)防。在其他特定實(shí)施方案，肉瘤、黑素瘤或白血病通過本發(fā)明的方法和組合物來治療或預(yù)防。在特定的實(shí)施方案，相對(duì)于不存在本發(fā)明的所述分子的情況下癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，本發(fā)明的分子(例如，包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的雙抗體)抑制或減少癌細(xì)胞的生長(zhǎng)至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%。在特定實(shí)施方案，本發(fā)明的分子(如，包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的雙抗體)比母體分子在殺傷細(xì)胞或抑制或減少癌細(xì)胞的生長(zhǎng)方面好至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。5.6.2自身免疫疾病和炎性疾病在一些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子包含根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的對(duì)FcγRIIB特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或變體Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)，所述Fc結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)對(duì)FcyRIIB更大的親和性和對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA減少的親和性。帶有這種結(jié)合特征的本發(fā)明的分子可用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，如，抑制與自身免疫疾病或炎性疾病相關(guān)的免疫應(yīng)答。雖然不希望受任何作用機(jī)制的限制，具有對(duì)FcγRIIB的親和性和/或包含具有對(duì)FcyRIIB增加的親和性和對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA減少的親和性的Fc結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子可引起對(duì)FcγR的活化應(yīng)答的阻抑并抑制細(xì)胞響應(yīng)性，并因此具有治療和/或預(yù)防自身免疫病癥的治療效力。本發(fā)明還提供了在受治療者中預(yù)防、治療或控制與炎性病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，進(jìn)一步包括向所述受治療者施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種抗炎劑。本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或控制與自身免疫疾病相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，進(jìn)一步包括向所述受治療者施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。5.7節(jié)提供了抗炎劑和免疫調(diào)節(jié)劑的非限制性實(shí)例?？梢酝ㄟ^施用本發(fā)明的分子治療的自身免疫病癥的實(shí)例包括但不限于，斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自體免疫阿狄森病、腎上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫肝炎、自身免疫卵巢炎和睪丸炎、自身免疫血小板減少、貝切特病、大皰性類天皰瘡、心肌炎、腹口炎性皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病、丘-施二氏綜合征、疤痕性類天皰瘡、CREST綜合征、冷凝集素病、克隆氏病、盤狀狼瘡、基本混合的冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、血管球性腎炎、格雷夫斯病、格-巴二氏病、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫瘢(ITP)、IgA神經(jīng)病、少年關(guān)節(jié)炎、扁平苔癬、紅斑狼瘡、梅尼爾氏病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、1型或免疫介導(dǎo)的糖尿病、重癥肌無力、尋常天皰瘡、惡性貧血、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、多軟骨炎(polychrondritis)、多腺綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)丙種球蛋白缺乏癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、萊特爾綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮癥、斯耶格倫綜合征、全身肌強(qiáng)直綜合征、全身性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎(temporalarteristis)/巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎例如皰疹樣皮炎、脈管炎、白斑病和韋格納肉芽腫病。炎性病癥的實(shí)例包括但不限于，哮喘、腦炎(encephilitis)、炎性腸病、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性病癥、膿毒性休克、肺纖維化、未分化的脊椎關(guān)節(jié)病、未分化的關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解和由長(zhǎng)期的病毒或細(xì)菌感染引起的慢性炎癥。如在本文的2.2.2節(jié)中描述的，某些自身免疫病癥與炎性狀況相關(guān)。因而，存在著被認(rèn)為是自身免疫病癥和炎性病癥的重疊。因此，某些自身免疫病癥也可能被表征為炎性病癥。可以根據(jù)本發(fā)明的方法預(yù)防、治療或控制的炎性病癥的實(shí)例包括但不限于，哮喘、腦炎(encephilitis)、炎性腸病、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性病癥、膿毒性休克、肺纖維化、未分化的脊椎關(guān)節(jié)病、未分化的關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解和由慢性的病毒或細(xì)菌感染引起的慢性炎癥。包含至少一個(gè)對(duì)FcγRIIB特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或具有對(duì)FcyRIIB增強(qiáng)的親和性和對(duì)FcγRIIIA減少的親和性的變體Fc結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子也可以用于減少患有炎性病癥的動(dòng)物、特別是哺乳動(dòng)物所經(jīng)歷的炎癥。在特定的實(shí)施方案，相對(duì)于沒有施用本發(fā)明的分子的動(dòng)物中的炎癥，本發(fā)明的分子減少動(dòng)物中的炎癥99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%。包含至少一個(gè)對(duì)FcγRIIB特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或具有對(duì)FcyRIIB增強(qiáng)的親和性和對(duì)FcYRIIIA減少的親和性的變體Fc結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子也可以用于預(yù)防移植物排斥。5.6.3傳染病本發(fā)明還涵蓋在受治療者中治療或預(yù)防傳染病的方法，包括施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種包含至少一個(gè)對(duì)與所述傳染病相關(guān)的傳染原特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子對(duì)傳染原有毒，相對(duì)于所述分子不存在時(shí)的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)針對(duì)所述傳染原的免疫應(yīng)答或增強(qiáng)針對(duì)所述傳染原的效應(yīng)物功能?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的分子治療或預(yù)防的傳染病是由傳染原，包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒引起的?？梢允褂帽景l(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的病毒疾病包括但不限于，由甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、單純性皰疹I(lǐng)型(HSV-I)、單純性皰疹I(lǐng)I型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、組病毒、巨細(xì)胞病毒、echino病毒(echinovirus)、蟲媒病毒、漢坦病毒(huntavirus)、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、骨髓灰質(zhì)炎病毒、天花、EpsteinBarr病毒、人類免疫缺陷性病毒I型(HIV-I)、人類免疫缺陷性病毒II型(HIV-II)，和病毒疾病例如病毒腦膜炎(miningitis)、腦炎、登革熱或天花的病原體引起的那些。可以使用本發(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于細(xì)菌的細(xì)菌疾病包括但不限于，分支桿菌立克次氏體、支原體、奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、博氏疏螺旋體(萊姆病)、炭疽桿菌(Bacillusantracis)(炭疽)、破傷風(fēng)、鏈球菌、葡萄球菌、分枝桿菌、破傷風(fēng)、百日咳(pertissus)、霍亂、鼠疫、白喉(diptheria)、衣原體、黃色葡萄球菌和軍團(tuán)桿菌?？梢允褂帽景l(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于原生動(dòng)物的原生動(dòng)物疾病包括但不限于，利什曼蟲、kokzidioa、錐蟲或瘧疾?？梢允褂帽景l(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于寄生蟲的寄生蟲疾病包括但不限于，衣原體和立克次氏體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，包含至少一個(gè)對(duì)傳染原特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子表現(xiàn)針對(duì)所述傳染原例如病原性蛋白的抗體效應(yīng)物功能。傳染原的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌(如，大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、!^腸球菌(Enterococcusfaecials)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、綠色葡求胃(Staphylococcusviridans)禾口參錄月農(nóng){[ΜHfilii(Pseudomonasaeruginosa))、_原體(例如B-親淋巴性的乳多空病毒(LPV)；百日咳桿菌(Bordatellapertussis)；波爾納病病毒(BDV)；牛冠狀病毒；脈絡(luò)叢腦膜炎病毒；登革熱病毒；病毒，大腸桿菌；埃博拉病毒；艾柯病毒1；艾柯病毒-11(EV)；內(nèi)毒素(LPS)；腸細(xì)菌；腸孤病毒；腸道病毒；貓白血病病毒；口蹄疫病毒；長(zhǎng)臂猿猿白血病病毒(GALV)；革蘭氏陰性細(xì)菌；幽門螺桿菌；乙型肝炎病毒(HBV)；單純性皰疹病毒；HIV-I；人類巨細(xì)胞病毒；人類冠狀病毒；流感A、B&C；軍團(tuán)菌；墨西哥利什曼原蟲；單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌；麻疹病毒；腦膜炎球菌；麻疹病毒；小鼠肝炎病毒；鼠白血病病毒；鼠Y皰疹病毒；鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒；鼠冠狀病毒小鼠肝炎病毒；鳥分枝桿菌-M；淋病奈瑟氏菌；新城疫病毒；細(xì)小病毒B19；惡性瘧原蟲；痘病毒；假單胞菌；輪狀病毒；鼠傷寒沙門氏菌(Samonellatyphiurium)；志賀氏菌；鏈球菌；T細(xì)胞親淋巴性病毒1；牛痘病毒)。5.6.4解毒本發(fā)明還涵蓋在暴露于毒素(如，毒性藥物分子)的受治療者解毒的方法，包括施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種包含至少一個(gè)對(duì)毒性藥物分子特異性的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的分子。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子對(duì)毒素的結(jié)合減少或消除所述毒素的不利生理效應(yīng)。在其他的實(shí)施方案，相對(duì)于所述雙抗體不存在時(shí)的排除、降解或中和，本發(fā)明的雙抗體對(duì)毒素的結(jié)合增加或增強(qiáng)對(duì)毒素的排除、降解或中和。根據(jù)本發(fā)明的方法的免疫毒性療法可用于治療過量或暴露于以下藥物，所述藥物包括但不限于地高辛(digixin)、PCP、可卡因、秋水仙堿和三環(huán)的抗抑郁藥。5.7組合治療本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋施用本發(fā)明的分子連同本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于癌癥、自身免疫疾病、傳染病或中毒的治療或預(yù)防的其他治療，包括但不限于，當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的和實(shí)驗(yàn)的化學(xué)療法、激素治療、生物學(xué)治療、免疫治療、放射治療或手術(shù)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子可以連同治療或預(yù)防有效量的一種或多種藥劑、治療性抗體或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于癌癥、自身免疫疾病、傳染病或中毒的治療和/或預(yù)防的其他藥劑來施用。在某些實(shí)施方案，同時(shí)地隨同一種或多種對(duì)癌癥的治療有用的其他治療劑向哺乳動(dòng)物、優(yōu)選地人類施用一種或多種本發(fā)明的分子。術(shù)語“同時(shí)地”不限于在完全相同的時(shí)間施用預(yù)防劑或治療劑，而是意味著，按順序和在一定時(shí)間間隔內(nèi)向哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的分子和另一種藥劑，從而本發(fā)明的分子可以與另一種藥劑一同起作用，來提供與以其他方式施用它們相比增加的益處。例如，每種預(yù)防劑或治療劑(例如，化學(xué)療法、放射療法、激素治療或生物學(xué)療法)可以同時(shí)地施用或者以任何順序在不同時(shí)間點(diǎn)順序地施用；然而，如果不是同時(shí)施用的，它們應(yīng)當(dāng)在時(shí)間上足夠接近地施用以便提供期望的治療或預(yù)防效果。每種治療劑可以單獨(dú)地、以任何合適的形式和通過任何適合的途徑來施用。在各種實(shí)施方案，以低于1小時(shí)的間隔、約1小時(shí)的間隔、約1小時(shí)到約2小時(shí)的間隔、約2小時(shí)到約3小時(shí)的間隔、約3小時(shí)到約4小時(shí)的間隔、約4小時(shí)到約5小時(shí)的間隔、約5小時(shí)到約6小時(shí)的間隔、約6小時(shí)到約7小時(shí)的間隔、約7小時(shí)到約8小時(shí)的間隔、約8小時(shí)到約9小時(shí)的間隔、約9小時(shí)到約10小時(shí)的間隔、約10小時(shí)到約11小時(shí)的間隔、約11小時(shí)到約12小時(shí)的間隔、不超過24小時(shí)的間隔或不超過48小時(shí)的間隔，來施用預(yù)防劑或治療劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案，在患者同一次就診時(shí)施用兩種或多種成分。在其他實(shí)施方案，預(yù)防劑或治療劑以約2到4天的間隔、約4到6天的間隔、約1周的間隔、約1到2周的間隔、或超過2周的間隔施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案，在預(yù)防劑或治療劑都仍然有效的時(shí)間框內(nèi)施用兩種藥劑。通過確定施用的藥劑的半衰期，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能確定這種時(shí)間框。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑循環(huán)地施用給受治療者。循環(huán)治療包括施用第一藥劑一段時(shí)間，隨后施用第二藥劑和/或第三藥劑一段時(shí)間，并重復(fù)這種順序的施用。循環(huán)治療可以減少對(duì)一種或多種治療的抗性的發(fā)展，避免或減少治療之一的副作用，和/或改善治療的效力。在某些實(shí)施方案，以不超過約3周的循環(huán)、每?jī)芍芗s1次、每10天約1次或每周約1次施用預(yù)防劑或治療劑。一個(gè)循環(huán)可以包括，通過每個(gè)循環(huán)約90分鐘、每個(gè)循環(huán)約1小時(shí)、每個(gè)循環(huán)約45分鐘的輸注來施用治療劑或預(yù)防劑。每個(gè)循環(huán)可以包括至少1周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息。所施用的循環(huán)的數(shù)目從約1到約12個(gè)循環(huán)、更一般地從約2到約10個(gè)循環(huán)、更一般地從約2到約8個(gè)循環(huán)。在其他的實(shí)施方案，本發(fā)明的治療劑和預(yù)防劑以節(jié)奏給藥方式施用，通過沒有延伸的休息期的連續(xù)輸注或頻繁施用。這種節(jié)奏施用可以包括以沒有休息期的固定間隔給藥。一般地，治療劑、特別是細(xì)胞毒性劑以較低的劑量使用。這種給藥方式涵蓋相對(duì)低劑量的長(zhǎng)期每天施用持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)段。在優(yōu)選的實(shí)施方案，較低劑量的使用可以最小化毒性副作用并消除休息期。在某些實(shí)施方案，通過從約24小時(shí)到約2天、到約1周、到約2周、到約3周、到約1個(gè)月、到約2個(gè)月、到約3個(gè)月、到約4個(gè)月、到約5個(gè)月、到約6個(gè)月的長(zhǎng)期低劑量或連續(xù)輸注，來遞送治療劑和預(yù)防劑。這種給藥方式的時(shí)間安排可以由熟練的腫瘤學(xué)家來優(yōu)化。在其他實(shí)施方案，同時(shí)地向哺乳動(dòng)物施用治療的進(jìn)程，即，分別地但又在一定時(shí)間間隔之內(nèi)施用單獨(dú)的治療劑的劑量，從而本發(fā)明的分子可以與其他藥劑一同起作用。例如，一種成分可以每周施用一次，結(jié)合其他成分每?jī)芍苁┯靡淮位蛎咳苁┯靡淮?。換言之，即使治療劑不被同時(shí)地施用或在患者同一次就診時(shí)施用，也同時(shí)地進(jìn)行治療劑的給藥方案。當(dāng)與其他預(yù)防劑和/或治療劑組合使用時(shí)，本發(fā)明的分子和所述預(yù)防劑和/或治療劑可以附加地、或更優(yōu)選的協(xié)同地起作用。在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的分子與一種或多種治療劑在相同的藥物組合物中同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的分子與一種或多種其他治療劑在獨(dú)立的藥物組合物中同時(shí)施用。在又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的分子在另一種預(yù)防劑或治療劑的施用之前或之后施用。本發(fā)明預(yù)期通過相同或不同的施用途徑，例如口服和胃腸外途徑，與其他預(yù)防劑或治療劑組合施用本發(fā)明的分子。在某些實(shí)施方案，當(dāng)與可能產(chǎn)生不良副作用，包括但不限于毒性的另一種預(yù)防劑或治療劑同時(shí)地施用本發(fā)明的分子時(shí)，可以有利地以低于引發(fā)不良副作用的閾值的劑量施用所述預(yù)防劑或治療劑。本文提供的給藥劑量和施用頻率被術(shù)語治療有效的和預(yù)防有效的涵蓋。根據(jù)特異于每個(gè)患者的因素，取決于所施用的特定治療劑或預(yù)防劑、癌癥的嚴(yán)重度和類型、給藥途徑、以及患者的年齡、體重、反應(yīng)和的以往病史，劑量和頻率進(jìn)一步地一般將不同。通過考慮這些因素，并通過遵循，例如，在文獻(xiàn)中報(bào)道的以及在Physician'sDeskReference(醫(yī)師案頭參考)(第56版，2002)中推薦的劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適合的服法。5.7.1抗癌劑在特定實(shí)施方案，本發(fā)明的方法涵蓋施用一種或多種本發(fā)明的分子和用于癌癥的治療和/或預(yù)防的一種或多種治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案，血管生成抑制物可以與本發(fā)明的分子組合施用?？捎糜诒景l(fā)明的方法和組合物的血管生成抑制物包括但不限于血管他丁(血纖維蛋白溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay12-9566；氟草胺(Benefin)；貝伐單抗；BMS-275291；軟骨衍生的抑制物(CDI)；CAI；CD59補(bǔ)體片段；CEP-7055；Col3；考布他汀A_4；內(nèi)皮他丁(膠原XVIII片段)；纖連蛋白片段；Gro-β；溴氯哌喹酮(Halofuginone)；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人類絨毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862;干擾素α/β/γ；干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-IO)；白細(xì)胞介素_12;Kringle5(血纖維蛋白溶酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制物(TIMP)；2-甲氧雌甾二醇；MMI270(CGS27023Α)；MoAbIMC-1C11；新伐司他；ΝΜ-3;Panzem;ΡΙ_88；胎盤核糖核酸酶抑制物；纖溶酶原激活物抑制物；血小板因子_4(PF4)；普啉司他；促黃體分泌素16kDa片段；增殖蛋白相關(guān)蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594；類視黃醇；索利司他；角鯊胺;SS3304；SU5416；Su6668；SU11248；四氫皮質(zhì)醇-S；四硫鉬酸鹽；沙利度胺；血小板反應(yīng)蛋白-I(TSP-I)；TNP-470；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-b)；Vasculostatin;Vasostatin(鈣網(wǎng)膜蛋白片段)；ZD6126;ZD6474；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制物(FTI)；和雙膦酸鹽類?？梢栽诒景l(fā)明的各種實(shí)施方案中與本發(fā)明的分子，包括本發(fā)明的藥物組合物和劑型和藥盒組合使用的抗癌劑包括但不限于阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿考達(dá)唑；阿克羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨魯米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；鹽酸比生群；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；硫酸博來霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C；二甲睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉬；卡莫司?。畸}酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西羅霉素；順鉬；克拉屈濱；甲磺酸克立那托；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯唑胺；放線菌素；鹽酸柔紅霉素；地西他濱；右奧馬鉬；地扎胍寧；甲磺酸地扎胍寧；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；重氮霉素；依達(dá)曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉬；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；5-氟脫氧尿苷；磷酸氟達(dá)拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸依達(dá)比星；異環(huán)磷酰胺；依莫福新；白細(xì)胞介素II(包括重組白細(xì)胞介素II或rIL2)，干擾素a_2a；干擾素α-2b；干擾素a_nl；干擾素a_n3；干擾素β-Ia；干擾素Y-Ib；異丙鉬；鹽酸依立替康；醋酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；苯丙氨酸氮芥；美諾立爾；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤鈉；氯苯氨啶；米得派；米丁度胺；米托克星；絲裂紅素；絲裂吉霉素；絲裂馬菌素；絲裂霉素；米托司培；米托坦；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；諾考達(dá)唑；諾加霉素；奧馬鉬；亞磺酰吡啶；紫杉醇；天門冬酰胺酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；雙溴丙基哌嗪；哌泊舒凡；鹽酸吡羅蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆鈉；甲基絲裂霉素；松龍苯芥；鹽酸甲基芐胼；曙呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；羅谷亞胺；沙芬戈；鹽酸沙芬戈；甲基環(huán)己亞硝脲；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸鈉；稀疏霉素；鹽酸螺旋鍺；螺莫司??；螺鉬；鏈黑菌素；鏈脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加蘭鈉；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔??；睪丸內(nèi)脂；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤；硫替派；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亞胺；伐普肽；維替泊芬；硫酸長(zhǎng)春堿；硫酸長(zhǎng)春新堿；去乙酸長(zhǎng)春酰胺；硫酸去乙酸長(zhǎng)春酰胺；硫酸長(zhǎng)春匹定；硫酸長(zhǎng)春甘酯；硫酸環(huán)氧長(zhǎng)春堿；酒石酸長(zhǎng)春瑞濱；硫酸長(zhǎng)春羅定；硫酸長(zhǎng)春利定；伏氯唑；折尼鉬；凈司他?。畸}酸佐柔比星。其他抗癌藥物包括但不限于20_表_1，25二羥維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍；阿柔比星；?；幌籥decypenol；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司??；amidox；氨磷??；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯；血管發(fā)生抑制劑；拮抗劑D；拮抗劑G；安雷利克斯；抗背部化形態(tài)發(fā)生蛋白-1；抗雄激素物質(zhì)，前列腺癌；抗雌激素物質(zhì)；抗腫瘤物質(zhì)；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)物；細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物；脫嘌呤核酸；ara-⑶P-DL-PTBA；精氨酸脫MSBS；asulacrine；Hftk^ii.；H^ifJtT；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司瓊；阿扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；balanol；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；苯并二氫卟吩；苯甲?；宙邏A；β內(nèi)酰胺衍生物；β-alethine；β-克拉霉素WbetaclamycinB)；白樺脂酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；比生群；雙氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；雙奈法德；雙枸櫞酸環(huán)己噻卓酯A(bistrateneΑ)；比折來新；breflate；溴匹立明；布度鈦；丁硫氨酸亞礬胺；卡泊三醇；鈣感光蛋白C；喜樹堿衍生物；雀痘IL-2；卡培他濱；羧酰胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRestM3；CARN700;軟骨衍生的抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)；澳粟精胺；天蠶素B;西曲瑞克；chlorlns；磺胺氯喹喔啉；西卡前列素；順式_卟琳；克拉曲濱；氯米芬類似物；克霉唑；collismycinA；collismycinB；考布他汀A4；考布他汀類似物；conagenin；crambescidin816；克立那托；collismycins;cryptophycinA衍生物；curacinA；環(huán)戊惠酉昆(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；胞^f十VVg基粦酸內(nèi)(cytarabineocfosfate)；溶細(xì)胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；達(dá)昔單抗；地西他濱；dehydrodidemninB；地洛瑞林；地塞米松；右異環(huán)磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右維拉帕米；地吖醌；代代寧B;didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氫-5-阿扎胞苷；9-二氫紫杉醇；dioxamycin；聯(lián)苯螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycinSA；依布硒；依考莫司??；依地福新；依決洛單抗；依氟鳥氨酸；欖烯；乙嘧替氟；表柔比星；愛普列特；雌莫司汀類似物；雌激素激動(dòng)劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；flimsterone；氟達(dá)拉濱；fluorodaunorunicinhydrochloride；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；釓替沙林(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制物；吉西他濱；谷胱甘肽抑制物；h印sulfan^heregulin；環(huán)己二乙酰胺；金絲桃素；伊班膦酸；依達(dá)比星；艾多昔芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；咪唑并吖啶酮類；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體抑制劑；干擾素激動(dòng)劑；干擾素類；白介素；碘芐胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司瓊；jasplakinolide；kahalalideF；lamelIarin-Ntriacetate；蘭瑞妝；Ieinamycin；來格司亭；硫酸香菇多糖；Ieptolstatin；來曲唑；白血病抑制因子；白血病α干擾素；亮丙瑞林+雌激素+黃體酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性鉬化合物；lissoclinamide7；洛鉬；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼達(dá)明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立賓；勒托替康；lutetiumtexaphyrin；Iysofylline；溶胞肽；美坦新；mannostatinA；馬立馬司他；馬索羅酚；maspin；基質(zhì)溶解因子抑制劑；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾；美巴龍；美替瑞林；甲硫氨基丁酸酶；滅吐靈；MIF抑制劑；米非司酮；米替福新；米立司亭；錯(cuò)配的雙鏈RNA；米托孤腙；二溴衛(wèi)矛醇；絲裂霉素類似物；米托萘胺；米托毒素；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-皂草素；米托蒽醌；莫法羅?。荒就?；單克隆抗體，人類絨毛膜促性腺激素；單磷酸基脂質(zhì)A+分枝桿菌(myobacterium)細(xì)胞壁sk；莫派達(dá)醇；多藥物抗性基因抑制劑；基于多腫瘤抑制劑1的治療；芥子抗癌劑；mycaperoxideB；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈達(dá)鉬；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性內(nèi)肽酶；尼魯米特；nisamycin；氮氧化物調(diào)節(jié)物；硝基氧抗氧化劑；nitrullyn；06-苯甲基鳥嘌呤；奧曲肽；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮；昂丹司瓊；昂丹司瓊；oracin；口細(xì)胞因子誘導(dǎo)物；奧馬鉬；奧沙特隆；奧沙利鉬；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；中白米粦酸;Λ#ΗΙ|；中白i若米芬；parabactin；帕折普??；天門冬酰胺酶；培得星；戊聚糖多硫酸鈉；噴司他??；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫蘇醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸脂酶抑制劑；溶鏈菌；鹽酸匹魯卡品；批柔比星；吡曲克辛；placetinA；placetinB；血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑；鉬復(fù)合物；鉬化合物；鉬-三胺復(fù)合物；卟菲爾鈉；甲基絲裂霉素；強(qiáng)的松；丙基二_吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制物；基于蛋白A的免疫調(diào)節(jié)物；蛋白激酶C抑制物；蛋白激酶C抑制物，microalgal；蛋白酪氨酸磷酸酯酶抑制物；嘌呤核苷磷酸化酶抑制物；羥基茜草素；批唑啉吖啶；吡醇羥乙化血紅蛋白聚氧乙烯軛合物；raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司瓊；ras法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；ras抑制物；ras-GAP抑制物；脫甲基的瑞替普汀；錸Re186依替膦酸；根霉素；核酶；RH維甲酰胺(retinamide)；羅谷亞胺；rohitukine；羅莫肽；羅喹美克；rubiginoneBl；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytolA；沙格司亭；Sdi1模擬信號(hào)物；司莫司??；衰老衍生的抑制物1；有義寡核苷酸；信號(hào)傳導(dǎo)抑制物；轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物；單鏈抗原結(jié)合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡鈉；乙酸苯酯鈉；solverol；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白；索納明；膦門冬酸；spicamycinD；螺莫司??；splenopentin；spongistatin1；角鯊胺；干細(xì)胞抑制物；干細(xì)胞分化抑制物；stipiamide；基質(zhì)降解酶抑制物；sulfinosine；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista；蘇拉明；苦馬豆堿；合成糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；?；悄就。凰_汀；替可加蘭鈉(tecogalansodium)；替加氟；tellurapyrylium；端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制物；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成素受體激動(dòng)劑；胸腺曲南；甲狀腺刺激激素；錫乙基初紫紅素(tinethyletiopurpurin)；替拉扎明；二氯鈦?。籺opsentin；托瑞米芬；全能性干細(xì)胞因子；翻譯抑制物；維甲酸；三乙酰基尿嘧啶；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制物；tyrph0StinS(酪氨酸磷酸化抑制劑)；UBC抑制物；烏苯美司；泌尿生殖竇衍生的生長(zhǎng)抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolinB；載體系統(tǒng)，紅細(xì)胞基因治療；維拉雷瑣；藜蘆明^erdins；維替泊芬；長(zhǎng)春瑞濱；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎諾特??；折尼鉬；zilascorb；和凈司他丁激動(dòng)劑。優(yōu)選的其他抗癌藥物是5-氟尿嘧啶和亞葉酸?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的治療性抗體的實(shí)例包括但不限于ZENAPAX(達(dá)克珠單抗)(RochePharmaceuticals,Switzerland)，其是用于防止急性的腎臟同種異體移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25單克隆抗體；PAN0REX，其是鼠抗17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(Glaxoffellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗獨(dú)特型(GD3表位)IgG抗體(ImCloneSystem)；IMC-C225，其是嵌合的抗EGFRIgG抗體(ImCloneSystem)；VITAXIN，其是人源化的抗-ανβ3整聯(lián)蛋白抗體(AppliedMolecularEvolution/Medlmmune)；SmartM195，胃i入iHU的^[-CD33(ProteinDesignLab/Kanebo)；LYMPHOCIDE,其是人源化的抗_CD22IgG抗體(Immunomedics)；ICM3是人源化抗-ICAM3抗體(ICOSPharm)；IDEC-114是靈長(zhǎng)類化的抗-CD80抗體(IDECPharm/Mitsubishi)；IDEC-131是人源化抗-CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151是靈長(zhǎng)類化的抗-CD4抗體(IDEC)；IDEC-152是靈長(zhǎng)類化的抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3IgG(ProteinDesignLab)；5G1.1是人源化的抗-補(bǔ)體因子5(C5)抗體(AlexionPharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗體(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151是靈長(zhǎng)類化的抗-CD4IgGl抗體(IDECPharm/SmithKlineBeecham)；MDX-CD4是人類抗-CD4IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗體(Leukosite/Genentech)；OrthoClone0KT4A是人源化的抗-CD4IgG抗體(orthoBiotech)；ANT0VA是人源化的抗-CD40LIgG抗體(Biogen)；ANTEGREN是人源化的抗-VLA-4IgG抗體(Elan)；和〇41~-152是人類抗16-02抗體(CambridgeAbTech)。可根據(jù)本發(fā)明使用的治療性抗體的其他實(shí)例在表8中列出。表8抗癌治療性抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>5.7.2免疫調(diào)節(jié)劑和抗炎劑本發(fā)明提供了治療自身免疫疾病和炎性疾病的方法，包括連同其他治療劑一起施用本發(fā)明的分子。免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于，氨甲喋呤(methothrexate)、ENBREL、REMICADE、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A和大環(huán)內(nèi)酯抗生素(例如，Π(506(他克莫司))、甲基強(qiáng)的松龍(MP)、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素(西羅莫司)、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、malononitriloamindes(例如，lenunamide)、T細(xì)胞調(diào)節(jié)物和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)物?？寡讋┮呀?jīng)在炎性和自身免疫病癥的治療中展現(xiàn)了成功，現(xiàn)在是這些病癥的常規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的療法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何抗炎劑都可以用于本發(fā)明的方法?？寡讋┑姆窍拗菩詫?shí)例包括非留族抗炎藥物(NSAID)、留族的抗炎藥物、激動(dòng)劑、抗膽堿藥(anticholingericagent)和甲基黃嘌呤。NSAID的實(shí)例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞來考昔(CELEBREX)、雙氯芬酸(VOLTAREN)、依托度酸(L0DINE)、非諾洛芬(NALF0N)、茚甲新(IND0CIN)、酮咯酸(ketoralac)(T0RAD0L)、奧沙普秦(DAYPR0)、萘丁美酮(nabumentone)(RELAFEN)、舒林酸(CLIN0RIL)、托美丁(tolmentin)(T0LECTIN)、羅非考昔(VI0XX)、萘普生(ALEVE，NAPROSYN)、酮洛芬(ACTR0N)和萘丁美酮(RELAFEN)。這些NSAID通過抑制環(huán)氧合酶(例如，C0X-1和/或C0X-2)來起作用。留族抗炎藥物的實(shí)例包括但不限于，糖皮質(zhì)激素、地塞米松(DECADR0N)、可的松、氫化可的松、潑尼松(DELTASONE)、氫化潑尼松、氟羥脫氫皮質(zhì)醇、柳氮磺胺吡啶和類花生酸(eicosanoids)例如前列腺素、凝血烷和白細(xì)胞三烯?？陕?lián)合本發(fā)明的分子用于治療或預(yù)防炎性病癥的抗體的非限制性實(shí)例在表9中呈現(xiàn)，可用于治療或預(yù)防自身免疫病癥的抗體的非限制性實(shí)例在表10中呈現(xiàn)。表9用于治療炎性疾病的治療性抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>5.7.3用于治療傳染病的藥劑在一些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療和/或預(yù)防傳染病的、治療或預(yù)防有效量的一種或另外的治療劑組合施用。本發(fā)明涵蓋使用本發(fā)明的分子與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療和/或預(yù)防傳染病的抗生素組合?？捎糜谂c本發(fā)明的分子組合的抗生素包括但不限于，大環(huán)內(nèi)酯(例如，托普霉素((Tobi))、頭孢菌素(例如，頭孢氨芐(Keflex)、頭孢霉定(Velosef)、頭孢呋辛(Ceftin)、頭孢羅齊(Cefzil)、頭孢克洛(Ceclor)、頭孢克肟(Suprax)或頭孢羥氨芐(Duricef)、克拉霉素(例如，克拉霉素(Biaxin))、紅霉素(例如，紅霉素(EMycin))、青霉素(例如，青霉素V(V-Ci11inκ或PenVeeK))或喹諾酮(例如，氧氟沙星(Floxin)、環(huán)丙沙星(Cipro)或諾氟沙星(Noroxin))、氨基糖苷類抗生素(例如，安普霉素、阿貝卡星、班貝霉素、丁胺菌素、地貝卡星、新霉素、新霉素、十一碳烯酸酯、奈替米星、巴龍霉素、核糖霉素、紫蘇霉素和奇霉素)，酰胺醇抗生素(例如，疊氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素)、安沙霉素抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳頭孢烯類(例如，氯碳頭孢)、碳青霉素烯類(例如，比阿培南和亞胺培南)、頭孢菌素類(例如，頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢羥唑、頭孢曲秦、頭孢西酮、頭孢唑蘭、頭孢咪唑、頭孢匹胺和頭孢匹羅)、頭霉素類(例如，頭孢拉宗、頭孢美唑、和頭孢米諾)，單環(huán)內(nèi)酰胺類(例如，氨曲南、卡蘆莫南和替吉莫南)、氧頭孢烯類(例如，氟氧頭孢和拉氧頭孢)、青霉素類(例如氮卓西林、匹伏基氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、芐青霉素酸、芐青霉素鈉、依匹西林、芬貝西林、氟氯西林、培那西林(penamccillin)、氫碘酸噴沙西林、青霉素苯乙芐胺、青霉素0、青霉素V、芐星青霉素V、哈胺青霉素V、青哌四環(huán)素和苯氧乙基青霉素鉀(phencihicillinpotassium))、林肯酰胺類(例如，氯林肯霉素、和林肯霉素)、安福霉素、桿菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久殺霉素、恩維霉素、四環(huán)素類(例如，阿哌環(huán)素、氯四環(huán)素、氯莫環(huán)素、和地美環(huán)素)、2，4_二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃類(例如，呋喃它酮和呋噻咪唑氯)、喹諾酮類和其類似物(例如西諾沙星、克林沙星、氟甲喹和格帕沙星(gr印agloxacin))、磺胺類(例如，乙?；前芳籽踹拎骸⑵S磺胺、諾丙磺胺、鄰苯二甲?；前反柞?、磺胺柯定和磺胺西汀)、砜(例如，地百里砜、葡糖砜鈉和苯丙砜)、環(huán)絲氨酸、莫匹羅星和抗結(jié)核菌素。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子可以與治療或預(yù)防有效量的一種或多種抗真菌劑組合施用?？捎糜谂c本發(fā)明的分子組合的抗真菌劑包括但不限于兩性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、氟康唑、鞘內(nèi)的(intrathecal)、氟胞嘧啶、咪康唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、環(huán)吡酮、益康唑、鹵普羅近(haloprogrin)、萘替芬、特比萘芬、i^一烯酸酯和灰黃霉素(griseofuldin)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的分子可以與治療或預(yù)防有效量的一種或多種抗病毒劑組合施用?？捎糜谂c本發(fā)明的分子組合的有用的抗病毒劑包括但不限于，蛋白酶抑制劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和核苷類似物?？共《緞┑膶?shí)例包括但不限于，齊多夫定、無環(huán)鳥苷、更昔洛韋(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷和病毒唑，以及膦甲酸、金剛烷胺、金剛烷乙胺、沙奎那韋、茚地那韋、安潑那韋、洛匹那韋、利托那韋、α干擾素；阿德福韋、克來夫定(clevadine)、恩替卡韋、普來可那立。5.8疫苗治療本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋使用本發(fā)明的組合物來誘導(dǎo)針對(duì)抗原或免疫原性劑的免疫應(yīng)答，所述抗原或免疫原性劑包括但不限于，癌抗原和傳染病抗原(其實(shí)例在下文公開)。本發(fā)明的疫苗組合物包含一種或多種抗原或免疫原性劑，針對(duì)它們的免疫應(yīng)答是期望的，其中所述一種或多種抗原或免疫原性劑包被有具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親和性的、本發(fā)明的變體抗體。本發(fā)明的疫苗組合物在引發(fā)免疫應(yīng)答、優(yōu)選針對(duì)抗原或免疫原性劑的保護(hù)性免疫應(yīng)答方面是特別有效的。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原或免疫原性劑包括病毒，針對(duì)所述病毒的免疫應(yīng)答是期望的。病毒可以是重組或嵌合的，優(yōu)選地是減毒的。重組、嵌合和減毒的病毒的生產(chǎn)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行。本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明配制的活重組病毒疫苗或滅活重組病毒疫苗?；钜呙缈梢允莾?yōu)選的，因?yàn)樵谒拗髦械脑鲋钞a(chǎn)生與自然感染中發(fā)生的相類似的種類和數(shù)量的延長(zhǎng)的刺激，因而賦予了相當(dāng)?shù)摹⒊志玫拿庖咝?。這種活重組病毒疫苗制劑的生產(chǎn)可以使用常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，包括在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚的尿囊中增殖病毒隨后純化。在特定實(shí)施方案，重組病毒對(duì)于施用它的受治療者是非致病的。在這點(diǎn)上，使用為疫苗目的遺傳工程化的病毒需要這些毒株中減毒特征的存在。向用于轉(zhuǎn)染的模板中導(dǎo)入合適的突變(例如，缺失)可以提供具有減毒特征的新的病毒。例如，可以使與溫度敏感性或冷適應(yīng)相關(guān)的特定錯(cuò)義突變成為缺失突變。這些突變應(yīng)當(dāng)比與冷或溫度敏感突變體相關(guān)的點(diǎn)突變更穩(wěn)定，并且回復(fù)頻率應(yīng)當(dāng)極其低。用于工程化重組病毒的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并涵蓋在本發(fā)明中。例如，修飾負(fù)鏈RNA病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如，美國(guó)專利第5，166，057號(hào)，通過引用將它全文并入本文。替代地，可以構(gòu)建具有“自殺”特征的嵌合病毒用于本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑。這種病毒在宿主內(nèi)將經(jīng)歷僅一輪或幾輪復(fù)制。當(dāng)用作疫苗時(shí)，重組病毒將經(jīng)歷有限的復(fù)制循環(huán)，并誘導(dǎo)足夠水平的免疫應(yīng)答，但它不會(huì)在人類宿主中走得更遠(yuǎn)和引起疾病。作為選擇，根據(jù)本發(fā)明可以配制滅活的(殺死的)病毒。使用常規(guī)技術(shù)來“殺死”嵌合病毒可以制備滅活疫苗制劑。在它們的傳染性被破壞的意義上，滅活疫苗是“死的”。理想地，病毒的傳染性被破壞而不影響它的免疫原性。為了制備滅活疫苗，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚的尿囊中生長(zhǎng)嵌合病毒，通過區(qū)域超速離心法純化、通過甲醛或β-丙內(nèi)酯來滅活，并收集。在某些實(shí)施方案，完全外源的表位，包括來自其他病毒或非病毒病原體的抗原，可以被工程化到病毒中用于本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑。例如，非相關(guān)病毒例如HIV的抗原(gpl60、gpl20、gp41)、寄生蟲抗原(例如，瘧疾)、細(xì)菌或真菌抗原或腫瘤抗原可以被工程化到減毒的毒株中。實(shí)際上任何異源基因序列都可以被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合病毒用于皮內(nèi)疫苗制劑。優(yōu)選地，異源基因序列是作用為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物的部分和肽。優(yōu)選地，誘導(dǎo)針對(duì)任何各種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位、或結(jié)合中和抗體的抗原，可以被嵌合病毒或作為嵌合病毒的部分表達(dá)。例如，可以被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合病毒的異源基因序列包括但不限于，流感和副流感血球凝集素神經(jīng)氨糖酸苷酶和融合糖蛋白例如人類PIV3的HN和F基因。在又一個(gè)實(shí)施方案，可以被工程化入嵌合病毒的異源基因序列包括編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)的那些。免疫調(diào)節(jié)蛋白的實(shí)例包括但不限于，細(xì)胞因子、1型干擾素、Y干擾素、集落刺激因子、白細(xì)胞介素-1、_2、_3、-4、-5、-6、-12，和這些藥劑的拮抗劑。在其他的實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋病原性的細(xì)胞或病毒，優(yōu)選地減毒病毒，其在它們的表面表達(dá)變體抗體。在替代實(shí)施方案，本發(fā)明的疫苗組合物包含融合多肽，其中抗原或免疫原性劑可操作地連接到具有增強(qiáng)的FcYRIIIA親和性的本發(fā)明的變體抗體。使用常規(guī)DNA重組技術(shù)方法進(jìn)行用于本發(fā)明的疫苗組合物的融合多肽的工程化，處于普通技術(shù)人員的能力范圍中。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋通過施用本發(fā)明的組合物在受治療者中誘導(dǎo)耐受性的方法。優(yōu)選地，適合于在受治療者中誘導(dǎo)耐受性的組合物包含包被有本發(fā)明的變體抗體的抗原或免疫原性劑，其中所述變體抗體具有對(duì)FcγRIIB更高的親和性。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，通過活化FcyRIIB介導(dǎo)的抑制途徑，這種組合物在誘導(dǎo)耐受性方面是有效的。5.9組合物和施用方法本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分子(即，雙抗體)的方法和藥物組合物，所述分子包含多個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)。本發(fā)明還提供了通過向受治療者施用有效量的本發(fā)明的融合蛋白或軛合分子、或包含本發(fā)明的融合蛋白或軛合分子的藥物組合物來治療、預(yù)防和改善與疾病、病癥或感染相關(guān)的一種或多種癥狀的方法。在優(yōu)選的方面，抗體、融合蛋白或軛合分子是基本上純的(即，基本上不含限制它的效果或產(chǎn)生不期望的副作用的物質(zhì))。在特定的實(shí)施方案，受治療者是動(dòng)物，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，例如非靈長(zhǎng)類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠，等等)和靈長(zhǎng)類(例如，猴，如食蟹猴(cynomolgousmonkey)和人類)。在優(yōu)選的實(shí)施方案，受治療者是人。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體來自與受治療者相同的物種。各種遞送系統(tǒng)是已知的，可以用于施用包含本發(fā)明分子的組合物，例如，封裝在脂質(zhì)體、微粒、微囊、能表達(dá)抗體或融合蛋白的重組細(xì)胞中，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見，例如Wu等人(1987)"Receptor-MediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystem(受體介導(dǎo)的由可溶性DNA載體系統(tǒng)的體外基因轉(zhuǎn)化)”J.Biol.Chem.2624429-4432)，構(gòu)建核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的部分，等等。施用本發(fā)明的分子的方法包括但不限于，腸胃外施用(例如，皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外的和粘膜的(例如，鼻內(nèi)和口腔途徑)。在特定實(shí)施方案，肌肉內(nèi)地、靜脈內(nèi)地或皮下地施用本發(fā)明的分子?？梢酝ㄟ^任何便利的途徑施用組合物，例如，通過輸注或彈丸注射，通過上皮或粘膜皮膚內(nèi)層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜，等等)的吸收，并且可以與其他生物活性劑一同施用。施用可以是全身性或局部的。此外，也可以采用肺部施用，例如，通過使用吸入器或噴霧器，和具有霧化劑的制劑。參見例如，美國(guó)專利第6，019，968；5，985，320；5，985，309；5，934，272；5，874，064；5，855，913；5，290，540；和4，880，078號(hào)；和PCT公布第WO92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346;和WO99/66903號(hào)，所有這些通過引用全文并入本文。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的分子被封裝在標(biāo)明了抗體量的密閉容器例如安瓿瓶或小袋中。在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的分子作為密閉容器中的干燥滅菌凍干粉劑或無水濃縮物來提供，并可以用例如水或鹽水重構(gòu)成合適的濃度用于向受治療者施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的分子以至少5mg、更優(yōu)選地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、或至少75mg的單位劑量在密閉容器中作為干燥的無菌凍干粉劑來提供。凍干的本發(fā)明分子應(yīng)在它們的原始容器中存儲(chǔ)在2到8°C之間，分子應(yīng)當(dāng)在重構(gòu)后12小時(shí)、優(yōu)選地6小時(shí)、5小時(shí)、3小時(shí)、或1小時(shí)之內(nèi)施用。在可選擇的實(shí)施方案，本發(fā)明的分子在標(biāo)明所述分子、融合蛋白或軛合分子的量和濃度的密閉容器中以液體形式提供。優(yōu)選地，本發(fā)明分子的液體形式以至少lmg/ml、更優(yōu)選地至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml所述分子在密閉容器中提供。在治療、預(yù)防或改善與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀中有效的本發(fā)明組合物的量可以通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來確定。在制劑中采用的準(zhǔn)確劑量也將取決于給藥途徑、狀況的嚴(yán)重度，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個(gè)患者的情況來決定。有效的劑量可以從來源于體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量響應(yīng)曲線推斷。對(duì)于本發(fā)明涵蓋的雙抗體，向患者施用的劑量一般是0.0001mg/kg到100mg/kg患者體重。優(yōu)選地，向患者施用的劑量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和IOmg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和lmg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.OOOlmg/kg禾口0.5mg/kg、0.OOOlmg/kg至Ij0.25mg/kg、0.0001至Ij0.15mg/kg、0.0001至Ij0.10mg/kg、0.001到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或0.01到0.lOmg/kg患者體重之間。通過修飾例如脂質(zhì)化來增強(qiáng)雙抗體的攝取和組織穿透，可以減少或改變本發(fā)明的雙抗體的施用劑量和頻率。在一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)用作單藥劑治療時(shí)，向患者施用的本發(fā)明的分子的劑量是0.Olmg到IOOOmg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的分子用于與其他治療組合物組合，向患者施用的劑量比所述分子用作單藥劑治療時(shí)的更低。在特定實(shí)施方案，期望的是局部地向需要治療的區(qū)域施用本發(fā)明的藥物組合物；這可以通過，例如但不是限制，局部輸注、通過注射、或通過植入物的方式來實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、無孔的或凝膠狀材料，包括膜，例如硅橡膠膜(sialasticmembrane)，或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的分子時(shí)，必須小心使用不吸附所述分子的材料。在另一個(gè)實(shí)施方案，組合物可以在媒介物、特別是脂質(zhì)體中遞送(參見Langer(1990)"NewMethodsOfDrugDelivery(^^MM§i7j)"Science2491527-1533)；Treat等人，在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer(傳染病和癌癥治療中的脂質(zhì)體),Lopez-Berestein和Fidler(編輯)，Liss,NewYork,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同前，pp.317-327；一般地參見同上)。在又一個(gè)實(shí)施方案，組合物可以在控釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)中遞送。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)可以用于生產(chǎn)包含一種或多種本發(fā)明的分子的持續(xù)釋放制劑。參見例如，美國(guó)專利第4，526，938號(hào)；PCT公布W091/05548；PCT公布WO96/20698；Ning等人(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel(使用持續(xù)釋放凝膠腫瘤內(nèi)地放射免疫治療人類結(jié)腸癌異種移植物)”Radiotherapy&Oncology39179-189，Song等人(1995)"AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions(抗體介導(dǎo)的長(zhǎng)循環(huán)的乳齊[J革巴向月市)"PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50372-397；Cleek^A(1997)"BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication(用于心血管應(yīng)用bFGF抗體的生物可降解的聚合載體)”Pro.Int'1.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853_854；和Lam等人(1997)"MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery(用于局部遞送的重組人源化單克隆抗體的微囊化)”Proc.Int‘1.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24759-760，所有這些通過引用全文并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案，泵可以用于控釋系統(tǒng)(參見上述Langer；Sefton，(1987)“ImplantablePumps(可植入的泵)”CRCCrit.Rev.Biomed.Eng.14:201_240；Buchwald等人(1980)“Long-Term,ContinuousIntravenousHeparinAdministrationByAnImplantableInfusionPumpInAmbulatoryPatientsWithRecurrentVenousThrombosis(患有復(fù)發(fā)性靜脈血栓形成的可走動(dòng)的患者中由可植入的輸注泵長(zhǎng)期、持續(xù)地靜脈施用肝素)”Surgery88:507_516；和Saudek等人(1989)"APreliminaryTrialOfTheProgrammableImplantableMedicationSystemForInsulinDelivery(用于胰島素遞送的可編程的可植入藥物系統(tǒng)的初步試驗(yàn))”N.Engl.J.Med.321574-579)。在另一個(gè)實(shí)施方案，聚合材料可以用于實(shí)現(xiàn)抗體的控釋(參見例如，MedicalApplicationsofControlledRelease(控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用)，Langer和Wise(編輯)，CRCPres.，BocaRaton,Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesiRnandPerformance(控釋藥物的生物利用率、藥物產(chǎn)品設(shè)計(jì)和表現(xiàn))，Smolen和Ball(編輯)，Wiley，NewYork(1984)；Levy等人(1985)"InhibitionOfCalcificationOfBioprostheticHeartValvesByLocalControlled-ReleaseDiphosphonate(通過局部控釋二膦酸鹽抑制人造生物瓣的鈣化)”Science228190-192；During等人(1989)“ControlledReleaseOfDopamineFromAPolymericBrainImplant:InVivoCharacterization(多巴胺從聚合腦植入物的控釋體內(nèi)表征)”Ann.Neural.25:351_356；Howard等人(1989)“IntracerebralDrugDeliveryInRatsWithLesion-InducedMemoryDeficits(患有損傷引起的記憶缺陷的大鼠中腦內(nèi)藥物遞送)”J.Neurosurg.7(1)105-112)；美國(guó)專利第5，679，377號(hào)；美國(guó)專利第5，916，597號(hào)；美國(guó)專利第5，912，015號(hào)；美國(guó)專利第5，989，463號(hào)；美國(guó)專利第5，128，326號(hào)；PCT公布第WO99/15154號(hào)；和PCT公布第WO99/20253號(hào))。用于持續(xù)釋放制劑的聚合物的實(shí)例包括但不限于，聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)，和聚正酯。在另一實(shí)施方案，控釋系統(tǒng)可以置于治療目標(biāo)(例如，肺)附近，因而僅需要全身性劑量的一部分(參參見例如，Goodson,在MedicalApplicationsofControlledRelease(控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用)，上述，第2卷，pp.115-138(1984))。在另一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)Durm等人(參見美國(guó)專利5，945，155)使用作為控釋植入物有用的聚合組合物。這種特定方法是基于來自聚合物系統(tǒng)的生物活性材料的原位受控釋放的治療效果。植入一般可以在需要治療性治療的患者體內(nèi)任何位置進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案，使用非聚合的持續(xù)遞送系統(tǒng)，其中受治療者體內(nèi)的非聚合的植入物被用作藥物遞送系統(tǒng)。在植入體內(nèi)之后，植入物的有機(jī)溶劑將從組合物中消散、分散或浸出到周圍的組織液，非聚合材料將逐漸地凝結(jié)或沉淀來形成固體的、多微孔的基質(zhì)(參見美國(guó)專利5，888，533)。在Langer的綜述(1"0，“NewMethodsOfDrugDelivery(藥物遞送的新方法)”Science249:1527-1533)中討論了控釋系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)可以用于生產(chǎn)包含一種或多種本發(fā)明的治療劑的持續(xù)釋放制劑。參見例如，美國(guó)專利第4，526，938號(hào)；國(guó)際公布WO91/05548和W096/20698；Ning等人(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel(使用持續(xù)釋放凝膠腫瘤內(nèi)地放射免疫治療人類結(jié)腸癌異種移植物)”Radiotherapy&0ncology39179-189，Song等人(1995)"AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions(抗體介導(dǎo)的長(zhǎng)循環(huán)的乳劑靴向肺)”PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372_397;Cleek等人(1997)"BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication(用于心血管應(yīng)用bFGF抗體的生物可降解的聚合載體)”Pro.Int'1.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；禾口Lam等人(1997)‘‘MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery(用于局部遞送的重組人源化單克隆抗體的微囊化)”Proc.Int'1.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759_760，通過完全引用將它們每一個(gè)并入本文。在特定的實(shí)施方案，其中本發(fā)明的組合物是編碼本發(fā)明雙抗體的核酸，所述核酸可以體內(nèi)施用來促進(jìn)它編碼的雙抗體的表達(dá)，通過將所述核酸構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的部分并施用，使它成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見美國(guó)專利第4，980，286號(hào))，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過連接到已知進(jìn)入核內(nèi)的同源盒樣月太來施用它(參見例如，JoHot等人(1991)"AntennapediaHomeoboxPeptideRegulatesNeuralMorphogenesis(觸角足同源盒肽調(diào)節(jié)神經(jīng)的形態(tài)發(fā)生)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)等等。作為選擇，可以通過同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)地導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA中用于表達(dá)。用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的分子治療受治療者可以包括單次治療，或優(yōu)選地可包括一系列治療。在優(yōu)選的實(shí)例中，在約0.1到30mg/kg體重的范圍內(nèi)，每周一次地持續(xù)約1到10周之間、優(yōu)選地2到8周之間、更優(yōu)選地約3到7周之間、更優(yōu)選地約4、5或6周，用本發(fā)明的分子治療受治療者。在其他實(shí)施方案，每天一次、每天兩次、或每天三次地施用本發(fā)明的藥物組合物。在其他實(shí)施方案，每周一次、每周兩次、每?jī)芍芤淮巍⒚吭乱淮?、每六周一次、每?jī)稍乱淮?、每年兩次或每年一次地施用藥物組合物。還應(yīng)理解的是，用于治療的分子的有效劑量可以在特定治療的過程中增加或減少。5.9.1藥物組合物本發(fā)明的組合物包括在藥物組合物的制造中有用的散裝藥物組合物(例如，不純的或非無菌的組合物)和可用于單位劑型的制備的藥物組合物(即，適合于向受治療者或患者施用的組合物)。這種組合物包含預(yù)防或治療有效量的本文公開的預(yù)防劑和/或治療齊U，或這些藥劑與藥學(xué)上可接受的載體的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含預(yù)防或治療有效量的一種或多種本發(fā)明的分子和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明的雙抗體分子和對(duì)特定癌抗原特異性的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在特定的實(shí)施方案，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國(guó)藥典或其他一般公認(rèn)的藥典中列出的，用于動(dòng)物、更特別地用于人類。術(shù)語“載體”是指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全的和不完全的)、賦形劑或媒介物，伴隨它們施用治療劑。這種藥物載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的那些，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)靜脈內(nèi)地施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以被用作液體載體，特別是對(duì)于注射溶液。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及類似物。如果希望，組合物也可包含少量的濕潤(rùn)劑或乳化劑、或PH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、持續(xù)釋放的制劑及類似形式。一般地，在單位劑型中分別地或混合地提供本發(fā)明的組合物的成分，例如，在標(biāo)明了活性劑量的密閉容器例如安瓿瓶或者小袋中，作為干燥的凍干粉末或無水的濃縮物。當(dāng)通過輸注來施用組合物時(shí)，可以用含有無菌的藥物級(jí)水或鹽水的輸注瓶進(jìn)行分配。當(dāng)通過注射施用組合物時(shí)，可以提供無菌注射水或鹽水的安瓿瓶以便在施用前將各成分混合。本發(fā)明的組合物可以配制為中性的或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于，與例如來自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的陰離子形成的那些，和與例如來自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的陽離子形成的那些。5.9.2基因治療在特定的實(shí)施方案，施用包含編碼本發(fā)明的分子的序列的核酸，通過基因治療的方法來治療、預(yù)防或改善與疾病、病癥或感染相關(guān)的一種或多種癥狀?；蛑委熓侵竿ㄟ^向受治療者施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸來進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生它們編碼的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白介導(dǎo)治療或預(yù)防效果。本領(lǐng)域中可用的基因治療的任何方法都可以根據(jù)本發(fā)明使用。示范性的方法描述如下。對(duì)于基因治療方法的一般性綜述，參見Goldspiel等人(1993)"HumanGeneTherapy(人類基因治療)"ClinicalPharmacy12:488_505;Wu等人(1991)"DeliverySystemsForGeneTherapy(基因治療的遞送系統(tǒng))”Biotherapy387-95；Tolstoshev(1993)"GeneTherapy,Concepts,CurrentTrialsAndFutureDirections(基因治療的概念、目前的試驗(yàn)和未來方向)"Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573_596；Mulligan(1993)"TheBasicScienceOfGeneTherapy(基因治療的基本原理)，，Science260926-932；和Morgan等人(1993)"HumanGeneTherapy(人類基因治療)”Ann.Rev.Biochem.62:191-217。可使用的重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法描述于Ausubel等人(編輯)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案),JohnWiley&Sons,NY(1993)禾口KrieRler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，StocktonPress，NY(1990)。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的組合物包含編碼本發(fā)明的雙抗體的核酸，所述核酸是表達(dá)載體的部分，所述表達(dá)載體在適合的宿主中表達(dá)所述抗體。特別地，這種核酸具有可操作地與抗體編碼區(qū)連接的啟動(dòng)子、優(yōu)選地異源啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，任選地是組織特異性的。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案，使用核酸分子，在所述核酸分子中，抗體編碼序列和任何其他期望的序列側(cè)翼是促進(jìn)基因組中期望位點(diǎn)處同源重組的區(qū)域，因而提供了所述抗體編碼核酸的染色體內(nèi)的表達(dá)(Koller等人(1989)"InactivatingTheBeta2-MicroglobulinLocusInMouseEmbryonicStemCellsByHomologousRecombination(由同源重組失活小鼠胚胎干細(xì)胞中的β2-微球蛋白基因座)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932_8935；禾口Zijlstra等人(1989)"Germ-LineTransmissionOfADisruptedBeta2-MicroglobulinGeneProducedByHomologousRecombinationInEmbryonicStemCells(胚胎干細(xì)胞中由同源重組產(chǎn)生的破壞的β2-微球蛋白基因的種系傳遞)”Nature342:435_438)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的組合物包含編碼融合蛋白的核酸，所述核酸是表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體在適合的宿主中表達(dá)所述融合蛋白。特別地，這種核酸具有可操作地與融合蛋白的編碼區(qū)連接的啟動(dòng)子、優(yōu)選地異源啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，任選地是組織特異性的。在另一個(gè)特定實(shí)施方案，使用核酸分子，在所述核酸分子中，融合蛋白的編碼序列和任何其他期望的序列側(cè)翼是促進(jìn)基因組中期望位點(diǎn)處同源重組的區(qū)域，因而提供了所述融合蛋白的染色體內(nèi)的表達(dá)。遞送核酸到受治療者中可以是直接的，在這種情況下，受治療者直接暴露于所述核酸或攜帶核酸的載體；或者是間接的，在這種情況下，首先用所述核酸體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植到受治療者中。作為體內(nèi)或離體基因治療，這兩種方法分別是已知的。在特定的實(shí)施方案，所述核酸序列直接地體內(nèi)施用，其中它被表達(dá)以產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以本領(lǐng)域已知的許多方法的任一種實(shí)現(xiàn)，例如通過作為合適的核酸表達(dá)載體的部分來構(gòu)建它們并施用其以使它們成為細(xì)胞內(nèi)的，例如通過使用缺陷的或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體進(jìn)行感染(例如，美國(guó)專利第4，980，286號(hào))，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，DuPont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，封裝在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛抑?，或通過連接到已知進(jìn)入核內(nèi)的肽來施用它們，或通過連接到遭受受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的抗原來施用它(參見，例如，Wu等人(1987)"Receptor-MediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystem(受體介導(dǎo)的由可溶性DNA載體系統(tǒng)的體外基因轉(zhuǎn)化)”J.Biol.Chem.2624429-4432)(其可用于靶向特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)，等等。在另一個(gè)實(shí)施方案，可以形成核酸-抗原復(fù)合物，其中抗原包括融合病毒肽以破壞內(nèi)涵體，容許核酸避免溶酶體降解。在又一個(gè)實(shí)施方案，通過靶向特異性受體，核酸可以在體內(nèi)被靶向用于細(xì)胞特異性攝取和表達(dá)(參見，例如，PCT公布WO92/06180；WO92/22635；W092/20316；W093/14188；WO93/20221)。作為選擇，可以細(xì)胞內(nèi)地導(dǎo)入核酸并通過同源重組摻入用于表達(dá)的宿主細(xì)胞DNA內(nèi)(Koller等人(1989)"InactivatingTheBeta2-MicroglobulinLocusInMouseEmbryonicStemCellsByHomologousRecombination(由同源重組失活小鼠胚胎干細(xì)胞中的β2-微球蛋白基因座)"Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932_8935；和Zijlstra等人(1989)"Germ-LineTransmissionOfADisruptedBeta2-MicroglobulinGeneProducedByHomologousRecombinationInEmbryonicStemCells(胚胎干細(xì)胞中由同源重組產(chǎn)生的破壞的β2-微球蛋白基因的種系傳遞)”Nature342:435_438)。在特定實(shí)施方案，使用含有編碼本發(fā)明的分子(例如，雙抗體或融合蛋白)的核酸序列的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見，Miller等人(1993)"UseOfRetroviralVectorsForGeneTransferAndExpression(使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移和表達(dá))”Meth.Enzymol.217:581_599)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有病毒基因組的正確封裝和整合入宿主細(xì)胞DNA所必需的成分。用于基因治療、編碼抗體或融合蛋白的核酸序列被克隆到一種或多種載體中，其促進(jìn)所述核苷酸序列向受治療者中的遞送。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更多細(xì)節(jié)可以見于Boesen等人(1993)"CircumventionOfChemotherapy-InducedMyelosuppressionByTransferOfTheMdrlGene(通過轉(zhuǎn)移Mdrl基因規(guī)避化療引起的骨髓抑制)”Biotherapy6:291_302)，其描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來遞送mdrl基因到造血干細(xì)胞中以使所述干細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法更有抗性。說明在基因治療中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的其他參考文獻(xiàn)是=Clowes等人(1994)"Long-TermBiologicalResponseOfInjuredRatCarotidArterySeededWithSmoothMuscleCellsExpressingRetrovirallyIntroducedHumanGenes(接禾中表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒引入的人類基因的平滑肌細(xì)胞的受損大鼠頸動(dòng)脈的長(zhǎng)期生物響應(yīng))”J.Clin.Invest.93:644_651；Keim等人(1994)“Retrovirus-MediatedGeneTransductionIntoCaninePeripheralBloodRepopulatingCells(逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到犬外周血再注入的細(xì)胞)”Blood831467-1473；Salmons等人(1993)"TargetingOfRetroviralVectorsForGeneTherapy(靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因治療)”HumanGeneTherapy4:129-141;和Grossman等人(1993)“Retroviruses:DeliveryVehicleToTheLiver(逆轉(zhuǎn)錄病毒向肝臟遞送的載體)“Curr.Opin.GeneticsandDevel.3110-114。腺病毒是可用于基因治療的其他病毒載體。腺病毒是用于將基因遞送到呼吸上皮的特別有吸引力的媒介物。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其中它們引起輕微的疾病。基于腺病毒的遞送系統(tǒng)的其他目標(biāo)是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky等人(1993，“GeneTherapyAdenovirusVectors(基因治療腺病毒載體)，，CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3:499-503)提出了基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等人(1994，“LungGeneTherapyInVivoAdenovirus-MediatedGeneTransferToRhesusMonkeyAirwayEpithelium(肺的基因治療體內(nèi)腺病毒介導(dǎo)向恒河猴氣道上皮的基因轉(zhuǎn)移)”HumanGeneTherapy,53-10)表明了腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到恒河猴的呼吸上皮的用途。在基因治療中使用腺病毒的其他例子可以在Rosenfeld等人(1991)“Adenovirus-MediatedTransferOfARecombinantAlpha!-AntitrypsinGeneToTheLungEpitheliumInVivo(腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)移重組αI-抗胰蛋白酶基因到肺上皮)”Science252:431_434;Rosenfeld等人(1992)“InVivoTransferOfTheHumanCysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulatorGeneToTheAirwayEpithelium(體內(nèi)轉(zhuǎn)移人類囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子基因到氣道上皮)”Cell68143-155;Mastrangeli等人(1993)"DiversityOfAirwayEpithelialCellTargetsForInVivoRecombinantAdenovirus-MediatedGeneTransfer(重組腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的氣道上皮細(xì)胞靶的多樣性)”J.Clin.Invest.91:225_234；PCT公布W094/12649；和Wang等人(1995)"APackagingCelllineForPropagationOfRecombinantAdenovirusVectorsContainingTwoLethalGene-RegionDeletions(用于繁殖含有兩種致死基因區(qū)缺失的重組腺病毒載體的包裝細(xì)胞系)”GeneTherapy2775-783中找到。在優(yōu)選的實(shí)施方案，使用腺病毒載體。腺病毒相關(guān)病毒(AAV)也被建議用于基因治療(參見例如，Walsh等人(1993)"GeneTherapyForHumanHemoglobinopathies(A.^XSSWS@^n療)”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289_300和美國(guó)專利第5，436，146號(hào))。基因治療的另一種方法包括通過如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染這些方法將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)中的細(xì)胞。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞置于選擇之下以分離已經(jīng)被吸收并表達(dá)轉(zhuǎn)移的基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞遞送給受治療者。在這個(gè)實(shí)施方案中，在體內(nèi)施用產(chǎn)生的重組細(xì)胞之前將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。這種導(dǎo)入可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行，包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合，等等。許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的用于將外源基因?qū)爰?xì)胞中(參見例如，Loeffler等人(1993)‘‘GeneTransferIntoPrimaryAndEstablishedMammalianCellLinesWithLipopolyamine-CoatedDNA(以脂多胺包被的DNA轉(zhuǎn)移基因到原代和確立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)”Meth.Enzymol.217:599~618，Cotten等人(1993)"Receptor-MediatedTransportOfDNAIntoEukaryoticCells(受體介導(dǎo)運(yùn)輸DNA到真核細(xì)胞中)”Meth.Enzymol.217:618_644)，并可以根據(jù)本發(fā)明來使用，條件是不破壞受者細(xì)胞的必需的發(fā)育和生理功能。所述技術(shù)應(yīng)當(dāng)提供核酸向細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，從而所述核酸是可由所述細(xì)胞表達(dá)的，優(yōu)選地可遺傳的和可由它的細(xì)胞子代表達(dá)。產(chǎn)生的重組細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法遞送給受治療者。優(yōu)選地靜脈內(nèi)地施用重組血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。預(yù)期使用的細(xì)胞量取決于期望的效果、患者狀態(tài)等等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。其中可以導(dǎo)入核酸用于基因治療目的的細(xì)胞涵蓋任何期望的、可獲得的細(xì)胞類型，包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟獲得的，等等。在優(yōu)選實(shí)施方案，用于基因治療的細(xì)胞對(duì)于受治療者是自體的。在重組細(xì)胞被用于基因治療的實(shí)施方案，將編碼抗體或融合蛋白的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而它們可被細(xì)胞或它們的子代表達(dá)，然后為了治療效果體內(nèi)施用重組細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？梢栽隗w外分離和維持的任何干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞潛在地可以根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案使用。(參見例如，參見例如，PCT公布WO94/08598;Stemple等人(1992)"IsolationOfAStemCellForNeuronsAndGliaFromTheMammalianNeuralCrest(從哺乳動(dòng)物神經(jīng)嵴分離神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的干細(xì)胞)”Cell71973-985；Rheinwald(1980)"SerialCultivationOfNormalHumanEpidermalKeratinocytes(正常人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的系列培養(yǎng))”Meth.CellBio.21A=229-254；禾口Pittelkow等人(1986)"NewTechniquesForTheInVitroCultureOfHumanSkinKeratinocytesAndPerspectivesOnTheirUseForGraftingOfPatientsWithExtensiveBurns(體外培養(yǎng)人類皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的新技術(shù)和其用于移植具有大范圍燒傷的患者的展望)”MayoClinicProc.61-.111-111)。在特定實(shí)施方案，為了基因治療的目的導(dǎo)入的核酸包括與編碼區(qū)可操作連接的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，從而通過控制合適的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在或缺乏，所述核酸的表達(dá)是可控制的。5.9.3藥盒本發(fā)明提供了藥物包裝或藥盒，其包含裝有本發(fā)明的分子的一個(gè)或多個(gè)容器。此夕卜，對(duì)疾病的治療有用的一種或多種其他預(yù)防劑或治療劑也可以被包括入藥物包裝或藥盒。本發(fā)明還提供了藥物包裝或藥盒，其包含裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器。任選地，這種容器帶有的可以是管理藥物或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的提示，所述提示反映機(jī)構(gòu)對(duì)用于人類施用的生產(chǎn)、使用或銷售的許可。本發(fā)明還提供了可在上述方法中使用的藥盒。在一個(gè)實(shí)施方案，藥盒包含一種或多種本發(fā)明的分子。在另一個(gè)實(shí)施方案，藥盒進(jìn)一步在一個(gè)或多個(gè)容器中包含對(duì)癌癥治療有用的一種或多種其他預(yù)防劑或治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案，藥盒進(jìn)一步包含結(jié)合與癌癥相關(guān)的一種或多種癌抗原的一種或多種細(xì)胞毒性抗體。在某些實(shí)施方案，所述其他預(yù)防劑或治療劑是化學(xué)治療劑。在其他實(shí)施方案，預(yù)防劑或治療劑是生物學(xué)的或激素治療劑。5.10治療效用的表征和證實(shí)本發(fā)明藥物組合物、預(yù)防劑或治療劑的幾個(gè)方面，優(yōu)選地在人類使用之前在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中、在動(dòng)物模型生物體例如嚙齒動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試期望的治療活性。例如，可用于確定特定藥物組合物的施用是否是期望的測(cè)定，包括細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，其中在培養(yǎng)中生長(zhǎng)患者組織樣品，并暴露于或以其他方式與本發(fā)明的藥物組合物接觸，并觀察這種組合物對(duì)組織樣品的影響?？梢酝ㄟ^患者的活組織檢查獲得組織樣品。這種測(cè)試允許鑒定對(duì)單個(gè)患者治療上最有效的預(yù)防或治療分子。在各種特定的實(shí)施方案，可以用涉及自身免疫或炎性病癥的細(xì)胞類型的代表性的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)進(jìn)行體外測(cè)定，來確定本發(fā)明的藥物組合物是否對(duì)這些細(xì)胞類型具有期望的效果?？梢栽谌祟愂褂弥霸谶m合的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試預(yù)防劑和/或治療劑的組合。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于，大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何動(dòng)物系統(tǒng)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在小鼠模型系統(tǒng)中測(cè)試預(yù)防劑和/或治療劑的組合。這種模型系統(tǒng)是廣泛使用的，并且是技術(shù)人員公知的?？梢灾貜?fù)地施用預(yù)防劑和/或治療劑。該過程的幾個(gè)方面可以不同。所述方面包括施用預(yù)防劑和/或治療劑的時(shí)間安排，以及這些藥劑是單獨(dú)地還是作為混合物施用。用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的動(dòng)物模型是，例如，在小鼠效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)人類FcYR的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如，在美國(guó)專利5，877，396中(通過引用將其全文并入本文)描述的任何小鼠模型，可以用于本發(fā)明。用于本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)基因小鼠包括但不限于，攜帶人類FcyRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIA的小鼠；攜帶人類FcyRIIB和人類FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcyRIIB和人類FcyRIIA的小鼠。優(yōu)選地，將測(cè)試在上述功能性測(cè)定中顯示最高水平活性的突變?cè)谌祟愂褂弥坝迷趧?dòng)物模型研究中。使用上述方法可制備用在動(dòng)物模型中的足量的抗體，例如使用本文公開和示例的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和純化方法。小鼠異種移植模型可以用于檢查小鼠抗體的效力，所述小鼠抗體是根據(jù)本發(fā)明的雙抗體分子的表位結(jié)合(bing)結(jié)構(gòu)域的親和性和特異性以及雙抗體引發(fā)免疫反應(yīng)的能力針對(duì)腫瘤特異性靶產(chǎn)生的(Wu等人(2001)"MouseModelsForMultistepTumorigenesis(多步腫瘤發(fā)生的小鼠模型)"TrendsCellBiol.11:S2_9)。在小鼠效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)人類FcγR的轉(zhuǎn)基因小鼠是獨(dú)特的，是定制的動(dòng)物模型，來測(cè)試人類Fc-FcyR相互作用的效力?？梢允褂迷贒r.JeffreyRavetch的實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生的FcγRIIIA、FcγRIIIB和FcγRIIA轉(zhuǎn)基因小鼠系的配對(duì)(經(jīng)過RockefellerU.和SloanKetteringCancercenter的許可)，如以下表11列出的那些。表11:小鼠品系<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>通過使用本領(lǐng)域已知的和在CroffordL.J.和WilderR.L.，"ArthritisandAutoimmunityinAnimals(動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎和自身免疫件)”,在ArthritisandAlliedConditions:ATextbookofRheumatology(關(guān)節(jié)炎和伴隨狀況風(fēng)濕病學(xué)教科書)，McCarty等人(編輯)，第30章(Lee和Febiger，1993)中描述的炎性關(guān)節(jié)炎的各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可以確定本發(fā)明的組合治療的抗炎活性。炎性關(guān)節(jié)炎和自身免疫風(fēng)濕疾病的實(shí)驗(yàn)的和天然的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明的組合治療的抗炎活性。以下是作為實(shí)例而不是為了限制而提供的一些測(cè)定。本領(lǐng)域已知和廣泛使用的關(guān)節(jié)炎或炎性疾病的基本動(dòng)物模型包括佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠和小鼠模型，和抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠、兔和倉鼠模型，所有的都在CroffordL.J.和WilderR.L.，“ArthritisandAutoimmunityinAnima1s(動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎和自身免疫)”，在ArthritisandAlliedConditions:ATextbookofRheumatology(關(guān)節(jié)炎和伴隨狀況風(fēng)濕病學(xué)教科書)，McCarty等人(編輯)，第30章(Lee和Febiger，1993)中描述，通過引用將其并入本文。本發(fā)明的組合治療的抗炎活性可以使用角叉菜聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型來評(píng)定。角叉菜聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎也已經(jīng)在慢性關(guān)節(jié)炎或炎癥的研究中用于兔、狗和豬。定量的組織形態(tài)評(píng)定用于確定治療效力。在HansraP.等人(2000)“Carrageenan-inducedArthritisInTheRat(大鼠中角叉菜聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)"Inflammation，24(2):141_155中描述了使用這種角叉菜聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的方法。通常還使用的是本領(lǐng)域已知和已描述的酵母多糖誘導(dǎo)的炎癥動(dòng)物模型。本發(fā)明組合治療的抗炎活性也可以通過使用WinterCΑ.等人(1962)"Carrageenan-inducedEdemaInHindPawOfTheRatAsAnAssayForAnti-InflammatoryDrugs(角叉菜聚糖誘導(dǎo)的大鼠后爪水腫作為用于抗炎藥物的測(cè)定)”Proc.Soc.Exp.BiolMed.111，544-547中描述的方法的修改、測(cè)量大鼠中對(duì)角叉菜聚糖誘導(dǎo)的爪水腫的抑制來評(píng)定。這種測(cè)定已經(jīng)用于大多數(shù)NSAID的抗炎活性的初步體內(nèi)篩選，并認(rèn)為是人類效力的預(yù)示。測(cè)試的預(yù)防劑或治療劑的抗炎活性表示為測(cè)試組相對(duì)于媒介物給藥的對(duì)照組在后爪重量增加方面的抑制百分比。另外，炎性腸病的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明組合治療的效力(Kim等人(1992)"ExperimentalColitisInAnimalModels(動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎)，，Scand.J.Gastroentrol.27529-537；Strober(1985)"AnimalModelsOfInflammatoryBowelDisease-AnOverview(炎性腸病的動(dòng)物模型-綜述)”Dig.Dis.Sci.30(12增刊)3S-10S)。潰瘍性的結(jié)腸炎(cholitis)和克隆氏病是可以在動(dòng)物中誘導(dǎo)的人類炎性腸病。可以向動(dòng)物口服施用硫酸化的多糖，包括但不限于，支鏈淀粉、角叉菜、硫酸支鏈淀粉和硫酸葡聚糖或化學(xué)刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸來誘導(dǎo)炎性腸病。自身免疫病癥的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明組合治療的效力。已經(jīng)開發(fā)了自身免疫病癥例如1型糖尿病、甲狀腺自身免疫、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和血管球性腎炎的動(dòng)物模型(Flanders等人(1999)"PreventionOfTypeIDiabetesFromLaboratoryToPublicHealth(從實(shí)驗(yàn)室到公眾健康預(yù)防1型糖尿病)”Autoimmunity29:235_246；Rasmussen等)κ(1999)"ModelsToStudyThePathogenesisOfThyroidAutoimmunity(ff^^狀腺自身免疫發(fā)病機(jī)理的模型)”Biochimie81511-515；Foster(1999)"RelevanceOfSystemicLupusErythematosusNephritisAnimalModelsToHumanDisease(系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型與人類疾病的關(guān)聯(lián))，，Semin.Nephrol.1912-24)。進(jìn)一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何測(cè)定可以用于評(píng)估本文公開的組合治療對(duì)于自身免疫和/或炎性疾病的預(yù)防和/或治療效用。本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效力可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)過程來測(cè)定，例如，測(cè)定LD5tl(對(duì)50%群體的致死劑量)和ED5tl(在50%的群體中治療有效的劑量)。在有毒與治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，它可以被表示為L(zhǎng)D5(i/ED5(i的比例。顯示大的治療指數(shù)的預(yù)防劑和/或治療劑是優(yōu)選的。當(dāng)可以使用展現(xiàn)了毒性副作用的預(yù)防劑和/或治療劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心地設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)將這些藥劑靶向受感染組織的位點(diǎn)以最小化對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害，從而降低副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人類的預(yù)防劑和/或治療劑的劑量范圍。這些藥劑的劑量?jī)?yōu)選地處在包括很小或沒有毒性的ED5tl的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于采用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何藥劑，可以最初地從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定來估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量來達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC5(I(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可用于更精確地測(cè)定人類中有用的劑量。可以通過例如高效液相色譜測(cè)定血漿中的水平。根據(jù)本發(fā)明使用的治療的抗癌活性也可以通過使用本領(lǐng)域已知和在RelevanceofTumorModelsforAnticancerDrugDevelopment(抗癌藥物開發(fā)的月中瘤模型的關(guān)聯(lián))(1999，F(xiàn)iebig和Buyer編輯)；ContributionstoOncology(對(duì)腫瘤學(xué)的貢獻(xiàn))(1999，Karger)；TheNudeMouseinOncologyResearch(月中瘤學(xué)研究中的裸小鼠)(1991，Boven和Winograd編輯)；和AnticancerDrugDevelopmentGuide(抗癌藥物開發(fā)指南)(1997Teicher編輯)中描述的各種用于癌癥研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，例如SCID小鼠模型或轉(zhuǎn)基因小鼠或帶有人類異種移植物的裸小鼠，動(dòng)物模型，例如倉鼠、兔等等來確定，通過引用將其全文并入本文。用于測(cè)定本發(fā)明分子的治療效力的優(yōu)選的動(dòng)物模型是小鼠異種移植模型?？梢杂米鳟惙N移植腫瘤來源的腫瘤細(xì)胞系包括但不限于SKBR3和MCF7細(xì)胞，其可以來自患有乳腺癌的患者。這些細(xì)胞具有erbB2和促乳素受體。已經(jīng)在本領(lǐng)域中常規(guī)地使用SKBR3細(xì)胞作為ADCC和異種移植腫瘤模型。作為選擇，來自人類卵巢腺癌的0VCAR3細(xì)胞可被用作異種移植腫瘤的來源。在人類使用前，優(yōu)選地在體外、然后在體內(nèi)測(cè)試本發(fā)明的方案和組合物的期望的治療或預(yù)防活性?？梢允褂媚[瘤或惡性細(xì)胞系的細(xì)胞篩選治療劑和方法。本領(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定可以用于評(píng)定這種存活率和/或生長(zhǎng)；例如，通過測(cè)量3H-胸苷摻入、通過直接細(xì)胞計(jì)數(shù)、通過檢測(cè)已知基因例如原癌基因(例如，foS、myc)或細(xì)胞周期標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄活性的變化可以測(cè)定細(xì)胞增殖；通過臺(tái)盼藍(lán)染色可以評(píng)定細(xì)胞生存力，根據(jù)形態(tài)學(xué)、降低的生長(zhǎng)和/或在軟瓊脂中的集落形成或在三維的基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)制備物中的管性網(wǎng)絡(luò)形成等等，可以視覺上地評(píng)定分化?？梢栽谌祟愔袦y(cè)試之前在適合的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試治療中使用的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔、倉鼠等等，例如，如上所述的動(dòng)物模型。然后可以在合適的臨床試驗(yàn)中使用化合物。進(jìn)一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何測(cè)定可以用于評(píng)估本文公開的組合治療對(duì)于癌癥、炎性病癥或自身免疫疾病的治療或預(yù)防的預(yù)防和/或治療效用。6.實(shí)施例6.1設(shè)計(jì)和表征共價(jià)雙特異性雙抗體構(gòu)建單特異性共價(jià)雙抗體和雙特異性共價(jià)雙抗體以評(píng)價(jià)每種的重組產(chǎn)生、純化和結(jié)合特征。通過SDS-PAGE和SEC分析發(fā)現(xiàn)本文所述的由重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的親和純化的雙抗體分子由單種二聚物質(zhì)組成。ELISA和SI^R分析進(jìn)一步揭示，共價(jià)雙特異性雙抗體對(duì)兩種靶抗原展示親和性并能同時(shí)結(jié)合兩種抗原。材料和方法構(gòu)津和設(shè)計(jì)多肽分子設(shè)計(jì)核酸表達(dá)載體以產(chǎn)生四種多肽構(gòu)建體，示意性地表示在圖2。構(gòu)建體1(SEQIDNO9)包括識(shí)別FcyRIIB的人源化2Β6抗體的VL結(jié)構(gòu)域，和識(shí)別FcyRIIIA的人源化3G8抗體的VH結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建體2(SEQIDNO11)包括Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域和Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建體3(SEQIDNO12)包括Hu3G8的VL結(jié)構(gòu)域和Hu3G8的VH結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建體4(SEQIDNO13)包括Hu2B6的VL結(jié)構(gòu)域和Hu2B6的VH結(jié)構(gòu)域。PCR和表汰載體構(gòu)津使用正向引物和反向引物從模板DNA擴(kuò)增VL或VH結(jié)構(gòu)域的編碼序列，所述引物設(shè)計(jì)為以使初始(intial)PCR產(chǎn)物將包含重疊序列，允許重疊PCR來產(chǎn)生期望的多肽構(gòu)建體的編碼序列。初始PCR擴(kuò)增樽板DNA大約35ng的模板DNA，如，目標(biāo)抗體的輕鏈和重鏈；1μ1的10μM正向引物和反向引物；2.5μ1的IOxpfuUltra緩沖液(Stratagene,Inc.)；1μ1的IOmMdNTP;1μ1的2.5單位/μ1pfuUltraDNA聚合酶(Stratagene，Inc.)；和蒸溜水到25μ1總體積在microfuge管中輕柔混合，并在微量離心機(jī)中快速旋轉(zhuǎn)以收集反應(yīng)混合物到管底。使用GeneAmpPCRSystem9700(ΡΕAppliedBiosystem)和以下設(shè)置進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C，2分鐘；94°C，每次15秒的25個(gè)循環(huán)；58°C，30秒；和72°C，1分鐘。分別使用正向引物和反向引物SEQIDN0:57和SEQIDNO:58從Hu2B6的輕鏈擴(kuò)增Hu2B6的VL0分別使用正向引物和反向引物SEQIDNO59和SEQIDNO60從Hu2B6的重鏈擴(kuò)增Hu2B6的VH。分別使用正向引物和反向引物SEQIDNO57和SEQIDNO:61從Hu3G8的輕鏈擴(kuò)增Hu3G8的VL。分別使用正向引物和反向引物SEQIDN0:62和SEQIDNO63從Hu3G8的重鏈擴(kuò)增Hu3G8的VH。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上在120伏電泳30分鐘。從凝膠切下PCR產(chǎn)物并使用MinEluteGEl提取試劑盒(Qiagen，Inc.)純化。重疊PCR如下述地組合初始(Intitial)PCR產(chǎn)物并使用初始擴(kuò)增模板DNA所述的相同PCR條件擴(kuò)增。重疊PCR的產(chǎn)物也如上述地純化。編碼構(gòu)建體1的核酸序列SEQIDNO9(示意性地顯示在圖2)，通過組合分別用正向引物和反向引物SEQIDN0:57禾口SEQIDN0:63擴(kuò)增VLHu2B6禾口VHHu3G8的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。編碼構(gòu)建體2的核酸序列SEQIDNO11(示意性地顯示在圖2)，通過組合分別用正向引物和反向引物SEQIDN0:57禾口SEQIDNO60擴(kuò)增VLHu3G8禾PVHHu2B6的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。編碼構(gòu)建體3的核酸序列SEQIDNO:12(示意性地顯示在圖2)，通過組合分別用正向引物和反向引物SEQIDN0:57禾口SEQIDNO63擴(kuò)增VLHu3G8和VHHu3G8的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。編碼構(gòu)建體4的核酸序列SEQIDNO13(示意性地顯示在圖2)，通過組合分別用正向引物和反向引物SEQIDN0:57和SEQIDN0:60擴(kuò)增VLHu2B6和VHHu2B6的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。VL結(jié)構(gòu)域的正向引物(SP，SEQIDNO57)和VH結(jié)構(gòu)域的反向引物(SP，SEQIDN0:60和SEQIDNO:63)包含獨(dú)特的限制性位點(diǎn)以允許克隆終產(chǎn)物到表達(dá)載體中。用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI消化純化的重疊PCR產(chǎn)物，克隆到pCIneo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Promega,Inc.)中。編碼構(gòu)建體的質(zhì)粒命名為如表12中鑒定的表12.質(zhì)粒構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>多肽/雙抗體表汰根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen)，使用Lipofectamine2000將編碼構(gòu)建體1的pMGX0669與編碼構(gòu)建體2的pMGX0667—起共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中。設(shè)計(jì)共轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒以導(dǎo)致表達(dá)對(duì)FcyRIIB和FcyRIIIA兩者免疫特異性的共價(jià)雙特異性雙抗體(CBD)(h2B6-h3G8雙抗體)。將分別編碼構(gòu)建體3和4的pMGX0666和pMGX0668分別轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞以分別表達(dá)對(duì)FcγRIIIA(h3G8雙抗體)和卩(^111801286雙抗體)免疫特異性的共價(jià)單特異性雙抗體(CMD)。培養(yǎng)三天后，從條件培養(yǎng)基純化分泌產(chǎn)物。mi使用偶合于CNBr活化的瓊脂糖凝膠4B的相關(guān)抗原從條件培養(yǎng)基捕獲雙抗體。在上樣之前在20mMTris/HCl,pH8.O中平衡親和瓊脂糖凝膠樹脂。上樣之后，洗脫之前用平衡緩沖液洗滌樹脂。使用50mM甘氨酸pH3.O從洗滌的樹脂洗脫雙抗體。立即用IMTris/HClpH8.O中和洗脫的雙抗體，并使用離心型濃縮器濃縮。使用PBS中平衡的Superdex200柱，由尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化濃縮的雙抗體。SEC.尺寸排阻色譜用于分析從柱洗脫的雙抗體的近似大小和異質(zhì)性。SEC分析在以PBS平衡的GEhealthcareSuperdex200HR10/30柱上進(jìn)行。比較全長(zhǎng)IgG(150kDa)、Fab片段(50kDa)和單鏈Fv(30kDa)的洗脫圖用作對(duì)照)。ELISA洗脫和純化的雙抗體的結(jié)合由ELISA測(cè)定表征，描述在5.4.2。將50μ1/孔的2μg/mlsCD32B-Ig溶液包被在碳酸鹽緩沖液中的96-孔Maxisorp板上，在4°C過夜。用PBS-T(PBS，0.Tween20)洗滌板三次并在室溫由PBS-T中的0.5%BSA封閉30分鐘。隨后，將h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD或h3G8CMD以一系列二倍稀釋而稀釋到封閉緩沖液以產(chǎn)生一定范圍的雙抗體濃度，從0.5μg/ml到0.001μg/ml。隨后在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，將50μ1/孔0.2μg/mls⑶16A-生物素加入各孔。再次在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，50μ1/孔15000稀釋的HRP軛合的鏈霉抗生素蛋白(AmershamPharmaciaBiotech)用于檢測(cè)。HRP-鏈霉抗生素蛋白允許在室溫孵育45分鐘。用PBS-T洗滌板三次并使用80μ1/孔的TMB底物顯色。孵育10分鐘后，通過加入40μ1/孔的1%H2SO4終止HRP-TMB反應(yīng)。通過使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件讀取0D450nm，使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)結(jié)果繪圖。BIAcore測(cè)定使用BIAcore測(cè)定(BIAcore儀器1000，BIAcoreInc.，Piscataway,N.J.)和相關(guān)軟件分析洗脫和純化的雙抗體的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如5.4.3節(jié)所述。經(jīng)由胺偶合化學(xué)(通過以NHS/EDC混合物修飾羧甲基)將s⑶16A、s⑶32B或s⑶32A(陰性對(duì)照)固定到傳感器芯片表面四個(gè)流動(dòng)池之一(流動(dòng)池2)上，以使約1000響應(yīng)單位(RU)的每種受體固定到表面上。隨后，將未反應(yīng)的活性酯通過注射IMEt-NH2而“脫帽”。制備合適的表面后，將共價(jià)雙特異性雙抗體(h2B6-h3G8CBD)或共價(jià)單特異性雙抗體(h2B6CMD或h3G8CMB)流經(jīng)表面，通過以70mL/min流速注射6.25-200nM溶液180秒。還測(cè)試h3G8scFV以比較。收集到完整的數(shù)據(jù)集之后，使用由廠家BIAcore，Inc.(Piscataway,NJ)提供的計(jì)算機(jī)算法將產(chǎn)生的結(jié)合曲線全局性地?cái)M合。這些算法計(jì)算1(和K。ff，從中推出作為兩個(gè)速率常數(shù)的比例(即，K。ff/K。n)的表觀平衡結(jié)合常數(shù)KD。如何產(chǎn)生單獨(dú)的速率常數(shù)的更詳細(xì)的處理可以在BIAevaluaion軟件手冊(cè)(BIAcore，Inc.，Piscataway,NJ)中找到。分別擬合締合和解離階段。對(duì)180秒的解離階段間隔32-34秒獲得解離速率常數(shù)；由11朗繆爾模型獲得締合階段擬合，基于對(duì)雙特異性雙抗體和scFv的Rmax和chi2標(biāo)準(zhǔn)選擇基礎(chǔ)擬合；二價(jià)的分析物擬合用于CMD結(jié)合。結(jié)果非還原條件下的SDS-PAGE分析揭示，h3G8CMD、h2B6CMD和h2B6_h3G8CBD表達(dá)系統(tǒng)的純化產(chǎn)物各是估計(jì)分子量為大約50kDa的單獨(dú)物質(zhì)(分別是圖3的泳道4、5和6)。在還原條件下，從CMD表達(dá)系統(tǒng)純化的產(chǎn)物電泳為單個(gè)條帶(泳道1和2)，而揭示從h2B6-h3G8CBD系統(tǒng)純化的產(chǎn)物是2種分別的蛋白(圖3，泳道3)。從表達(dá)系統(tǒng)純化并還原條件下通過SDS-PAGE可見的所有多肽遷移在大約28kDa。每種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物的SEC分析還揭示了單個(gè)分子物質(zhì)(圖4B)，其各在與IgG的Fab片段相同的大致時(shí)間洗脫(50kDa)(圖4A)。結(jié)果表示，親和純化的產(chǎn)物對(duì)于CMD表達(dá)系統(tǒng)是同源共價(jià)同二聚體，對(duì)于h2B6-h3G8CBD是同源共價(jià)異二聚體。ELISA三明治測(cè)定用于測(cè)試h2B6_h3G8CBD對(duì)CD32B和/或CD16A之一或兩者的結(jié)合特異性(圖5)。⑶32B用作靶抗原，⑶16A用作第二探針。ELIZA中的陽性信號(hào)揭示，異二聚h2B6-h3G8CBD具有對(duì)兩種抗原的特異性。對(duì)h3G8CMD(其不應(yīng)結(jié)合⑶32B)的類似測(cè)試顯示無信號(hào)。SPR分析表示，h3G8CMD免疫特異性地識(shí)別s⑶16而不是s⑶32B，h2B6CMD免疫特異性地識(shí)別s⑶32B而不是s⑶16，h2B6-h3G8CBD免疫特異性地識(shí)別s⑶16和s⑶32B兩者(圖6A-B)。測(cè)試的所有雙抗體都不結(jié)合對(duì)照受體sCD32A(圖6C)。SPR分析還用于估計(jì)CMD和h2B6_h3G8CBD對(duì)sCD16和/或sCD32B的動(dòng)力學(xué)和平衡常數(shù)。將結(jié)果與從h3G8scFV計(jì)算的相同常數(shù)比較。圖7A-E顯示Sra分析的圖示結(jié)果。從圖7描述的結(jié)果計(jì)算的動(dòng)力學(xué)締合速率和解離速率、以及平衡常數(shù)提供在表13。表13.從BIAcore數(shù)據(jù)計(jì)算的動(dòng)力學(xué)和平衡常數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>聯(lián)合ELISA分析結(jié)果，研究證實(shí)，h2B6_h3G8共價(jià)異二聚體保持對(duì)⑶32B和⑶16兩者的特異性，并能夠同時(shí)結(jié)合兩種抗原。分子示意性地描繪在圖8。6.2設(shè)計(jì)和表征包含F(xiàn)C結(jié)構(gòu)域的共價(jià)雙特異性雙抗體試圖產(chǎn)生IgG樣分子，即，包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的分子時(shí)，實(shí)施例6.1呈現(xiàn)的包含異二聚CBD分子的多肽之一被修飾以進(jìn)一步包括Fc結(jié)構(gòu)域(產(chǎn)生類似抗體重鏈和輕鏈的‘較重’和‘較輕’鏈)。隨后異二聚雙特異性分子將包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，該Fc結(jié)構(gòu)域?qū)⑴c同源分子二聚化形成具有四價(jià)的四聚IgG-樣分子(即，經(jīng)由異二聚雙特異性分子的Fc結(jié)構(gòu)域二聚化而形成)。有趣地，這種四聚分子在重組表達(dá)系統(tǒng)的條件培養(yǎng)基中使用功能性測(cè)定檢測(cè)不到，如，測(cè)試條件培養(yǎng)基對(duì)靶抗原的免疫特異性結(jié)合。相反，在這種功能性測(cè)定中只檢測(cè)到包含由VL、VH和Fc結(jié)構(gòu)域組成的單體的二聚分子。為了測(cè)試?yán)碚撍木劢Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是否有爭(zhēng)論，將包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的多肽工程化為進(jìn)一步包括鉸鏈區(qū)，而將包含‘較輕’鏈的多肽工程化為進(jìn)一步包括人類κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的6個(gè)C-末端氨基酸。當(dāng)這種重新工程化的‘較重’和‘較輕’鏈在重組表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)時(shí)，功能性測(cè)定檢測(cè)能夠免疫特異性地結(jié)合靶抗原和抗-Fc抗體兩者的雙抗體分子。材料和方法構(gòu)津和設(shè)計(jì)多肽分子將核酸表達(dá)載體設(shè)計(jì)為產(chǎn)生實(shí)施例6.1呈現(xiàn)的構(gòu)建體1和2的修飾形式。通過分別工程化構(gòu)建體1和2以進(jìn)一步包括Fc結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生構(gòu)建體5(SEQIDN0:14)和6(SEQIDN0:15)。通過工程化構(gòu)建體1以進(jìn)一步在其C-末端包括序列FNRGEC(SEQIDNO23)來產(chǎn)生構(gòu)建體7(SEQIDNO:16)。通過工程化構(gòu)建體2以進(jìn)一步包括鉸鏈區(qū)和Fc結(jié)構(gòu)域(包含V215A突變)來產(chǎn)生構(gòu)建體8(SEQIDNO18)。構(gòu)建體5_8的示意表示顯示在圖9。PCR和表汰載體構(gòu)津所有PCR和PCR產(chǎn)物純化方案如實(shí)施例6.1所沭。質(zhì)粒PMGX0669和pMGX0667分別作為構(gòu)建體1和2編碼序列的模板。HuIgGFc結(jié)構(gòu)域和/或鉸鏈結(jié)構(gòu)域的編碼序列分別是SEQIDNO:5或SEQIDNO:1和SEQIDNO:5。使用正向引物和反向引物擴(kuò)增模板DNA的編碼序列以使PCR產(chǎn)物將包含重疊序列，允許重疊PCR來產(chǎn)生期望的產(chǎn)物的編碼序列。分別使用正向引物和反向引物SEQIDNO57和SEQIDNO64從pMGX0669擴(kuò)增構(gòu)建體1的編碼序列。分別使用正向引物和反向引物SEQIDN0:57和SEQIDNO:65從PMGX0667擴(kuò)增構(gòu)建體2的編碼序列。分別使用正向引物和反向引物SEQIDNO:67和SEQIDNO:68擴(kuò)增HuIgG鉸鏈-Fe。使用正向引物和反向引物SEQIDNO57和SEQIDNO69從pMGX0669擴(kuò)增構(gòu)建體7(SEQIDNO16)。重疊PCR初始PCR產(chǎn)物如下述地組合，如實(shí)施例6.1所述的擴(kuò)增和純化。編碼構(gòu)建體5的核酸序列SEQIDNO14(示意性地顯示在圖9)，通過組合用正向引物和反向引物SEQIDNO57和SEQIDNO66分別擴(kuò)增構(gòu)建體1和HuIgGFc的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。編碼構(gòu)建體6的核酸序列SEQIDNO15(示意性地顯示在圖9)，通過組合用正向引物和反向引物SEQIDNO57和SEQIDNO66分別擴(kuò)增構(gòu)建體2和HuIgGFc的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。編碼構(gòu)建體8的核酸序列SEQIDNO18(示意性地顯示在圖9)，通過組合用正向引物和反向引物SEQIDN0:57和SEQIDNO:68分別擴(kuò)增構(gòu)建體2和HuIgG鉸鏈-Fc的PCR產(chǎn)物而擴(kuò)增。如前所述地將終產(chǎn)物克隆到pCIneo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Promega，Inc.)。編碼構(gòu)建體的質(zhì)粒命名為如表14中鑒定的表14.質(zhì)粒構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>多肽/雙抗體表汰如節(jié)6.1所述的使用Lipofectamine2000向HEK-293細(xì)胞進(jìn)行四次分別的共轉(zhuǎn)染分別編碼構(gòu)建體1和6的pMGX0669和pMGX0674；分別編碼構(gòu)建體2和5的pMGX0667和pMGX0676；以及分別編碼構(gòu)建體7和8的pMGX0677和pMGX0678。設(shè)計(jì)這些質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染以造成表達(dá)具有IgG-樣結(jié)構(gòu)、對(duì)FcyRIIB和FcyRIIIA兩者免疫特異性的四價(jià)雙特異性雙抗體(CBD)。還進(jìn)行另外的共轉(zhuǎn)染分別編碼構(gòu)建體6和5的pMGX0674和pMGX0676。培養(yǎng)三天后，收集條件培養(yǎng)基。使用純化的Fc作為標(biāo)準(zhǔn)，由抗IgGFcELISA定量條件培養(yǎng)基中分泌產(chǎn)物的量。隨后基于定量將樣品中產(chǎn)物的濃度標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化的樣品用于其余的測(cè)定。ELISA由上述三明治ELISA測(cè)定分泌到培養(yǎng)基中的雙抗體分子的結(jié)合。除非指明，否則⑶32Β用于包被板，即，作為靶蛋白，HRP-軛合的⑶16用作探針。結(jié)果ELISA測(cè)定用于測(cè)試來自包含構(gòu)建體1和6(pMGX669_pMGX674)、構(gòu)建體2和5(pMGX667-pNGX676)和構(gòu)建體5和6(pMGX674_pMGX676)的重組表達(dá)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化樣品中能夠同時(shí)結(jié)合CD32B和CD16A的雙抗體分子的表達(dá)(圖10)。ELISA數(shù)據(jù)表示，共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體1和6或共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體2和5未能產(chǎn)生能夠結(jié)合兩種抗原之一或兩者的產(chǎn)物(圖10，分別是□和▲)。然而，共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體5和6導(dǎo)致分泌能夠結(jié)合于⑶32B和⑶16抗原兩者的產(chǎn)物。后一種產(chǎn)物是構(gòu)建體5和6的二聚體，包含對(duì)每種抗原的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)示意性地表示在圖11。為了驅(qū)動(dòng)形成IgG樣異四聚結(jié)構(gòu)，將六個(gè)另外的氨基酸的編碼序列添加到構(gòu)建體1的C-末端，產(chǎn)生構(gòu)建體7(SEQIDNO:16并示意性地顯示在圖9)。六個(gè)另外的氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)來源于κ輕鏈的C-末端并通常與IgG分子中重鏈的上部鉸鏈結(jié)構(gòu)域相互作用。隨后將鉸鏈結(jié)構(gòu)域工程化到構(gòu)建體6中，產(chǎn)生構(gòu)建體8(SEQIDΝ0:18和圖9)。構(gòu)建體8另外包括上部鉸鏈區(qū)中的一個(gè)氨基酸突變A215V。隨后將分別編碼構(gòu)建體7和構(gòu)建體8的表達(dá)質(zhì)粒即pMGX677和pMGX678共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞并如所述地表達(dá)。將從包含構(gòu)建體7和8(pMGX0677+pMGX0678)的重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的雙抗體分子與從包含構(gòu)建體1和6(pMGX669+pMGX674)、構(gòu)建體2和8(pMGX669+pMGX678)、和構(gòu)建體6和7(pMGX677+pMGX674)的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的雙抗體分子在ELISA測(cè)定中比較對(duì)⑶32B和⑶16A的結(jié)合(圖12)。如前所述，證明從包含構(gòu)建體1和6(pMGX669+pMGX674)的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的分子不能結(jié)合⑶32A和⑶16A兩者(圖10和圖12)。相反，共表達(dá)構(gòu)建體7和6(pMGX0677+pMGX0674)或共表達(dá)構(gòu)建體7和8(pMGX0677_pMGX0678)的產(chǎn)物能夠結(jié)合⑶32B和⑶16兩者(圖12)。注意到構(gòu)建體7與構(gòu)建體1相似，除了構(gòu)建體7包括C-末端序列FNRGEC(SECIDNO23)；構(gòu)建體8與構(gòu)建體6相似，除了構(gòu)建體8包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域和突變A215V。數(shù)據(jù)表示，加入來自C-K輕鏈C-末端的6個(gè)另外的氨基酸(FNRGEC;SEQIDNO23)到不帶有Fc的‘較輕’鏈幫助穩(wěn)定四聚IgG-樣雙抗體分子的形成，而不論相應(yīng)的較重鏈?zhǔn)欠癜ㄣq鏈結(jié)構(gòu)域(即，pMGX0677+pMGX0674和pMGX0677-pMGX0678，圖12)。加入鉸鏈結(jié)構(gòu)域到帶有Fc的‘較重，多肽而不加入FNRGEC(SEQIDNO:23)C-末端序列到相應(yīng)的‘較輕’鏈，顯然不能實(shí)現(xiàn)類似的穩(wěn)定(即，缺乏被共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體2和8(pMGX669+pMGX678)產(chǎn)物結(jié)合)。四聚雙抗體分子的結(jié)構(gòu)示意性地表示在圖13。6.3結(jié)構(gòu)域順序和另外的二硫鍵對(duì)四聚IgG-樣雙抗體形成的作用通過以半胱氨酸取代多肽鏈上選擇的殘基來研究四聚IgG-樣雙抗體分子‘較輕’和‘較重’多肽鏈之間另外穩(wěn)定化的作用。另外的半胱氨酸殘基提供‘較重’和‘較輕’鏈之間另外的二硫鍵。此外，通過將Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域從多肽鏈的C-末端移動(dòng)到N-末端研究結(jié)構(gòu)域順序?qū)Y(jié)合活性的作用。盡管包含另外的二硫鍵的分子的結(jié)合活性相對(duì)于帶有這種鍵的此前構(gòu)建的雙抗體分子未改變，轉(zhuǎn)移Fc或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域到構(gòu)成雙抗體的‘較重’多肽鏈的N-末端令人驚訝地改進(jìn)雙特異性分子對(duì)其靶抗原之一或兩者的結(jié)合親和性和/或親和力。材料和方法構(gòu)津和設(shè)計(jì)多肽分子將核酸表達(dá)載體設(shè)計(jì)為產(chǎn)生實(shí)施例6.2所示的構(gòu)建體5、6和8的修飾形式。構(gòu)建體9(SEQIDNO19)和構(gòu)建體10(SEQIDNO20)(都示意性地顯示在圖13)與構(gòu)建體8和6相似，除了Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域分別從多肽的C-末端轉(zhuǎn)移到N-末端。另外，使用的所有Fc結(jié)構(gòu)域是野生型IgGlFc結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建體11即SEQIDNO21(示意性地顯示在圖14)與實(shí)施例6.1的構(gòu)建體2相似，除了將C-末端設(shè)計(jì)為進(jìn)一步包括序列FNRGEC(SEQIDNO23)。構(gòu)建體12即SEQIDNO:22(示意性地顯示在圖14)與實(shí)施例6.2的構(gòu)建體5相似，除了Fc結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括鉸鏈區(qū)。同樣，對(duì)于構(gòu)建體11和12，2B6VL結(jié)構(gòu)域和2B6VH結(jié)構(gòu)域包括單個(gè)氨基酸修飾(分別是G105C和G44C)以使各結(jié)構(gòu)域中的甘氨酸被半胱氨酸代替。PCR和表汰載體構(gòu)津所有PCR和PCR產(chǎn)物純化方案如實(shí)施例6.1和6.2所述。重疊PCR使用實(shí)施例6.1和實(shí)施例6.2所述的方法構(gòu)建、擴(kuò)增和純化終產(chǎn)物。如前所述地將終產(chǎn)物克隆到pCIneo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Promega，Inc.)。編碼構(gòu)建體的質(zhì)粒命名為如表15中鑒定的表15.質(zhì)粒構(gòu)建體編碼構(gòu)建體質(zhì)粒名稱插入片段~~9pMGX0719Hu鉸鏈/Fc_hu3G8VL-hu2B6VH~10pMGX0718HuFc_hu2B6VL-hu3G8VH~ΠpMGX0716Hu2B6VL(G/C)-hu3G8VH-hu鉸鏈FC~12pMGX0717Hu3G8VL-hu2B6VH(G/C)-FNRGEC多肽/雙抗體表汰如節(jié)6.1所述的使用Lipofectamine2000向HEK-293細(xì)胞進(jìn)行三次分別的共轉(zhuǎn)染分別編碼構(gòu)建體1和9的pMGX0669和pMGX0719；分別編碼構(gòu)建體1禾口10的pMGX0669和pMGX0718；以及分別編碼構(gòu)建體11和12的pMGX0617和pMGX0717。設(shè)計(jì)這些質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染以造成表達(dá)具有IgG-樣結(jié)構(gòu)、對(duì)FcγRIIB和FcyRIIIA兩者免疫特異性的四價(jià)雙特異性雙抗體(CBD)。培養(yǎng)三天后，收集條件培養(yǎng)基。使用純化的Fc作為標(biāo)準(zhǔn)，由抗IgGFcELISA定量條件培養(yǎng)基中分泌產(chǎn)物的量。隨后基于定量將樣品中產(chǎn)物的濃度標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化的樣品用于其余的測(cè)定。ELISA由上述三明治ELISA測(cè)定分泌到培養(yǎng)基中的雙抗體分子的結(jié)合。除非指明，否則⑶32B用于包被板，即，作為靶蛋白，HRP-軛合的⑶16用作探針。蛋白質(zhì)印跡.在非還原條件下由SDS-PAGE分析來自三次上述共轉(zhuǎn)染的大約15ml條件培養(yǎng)基。用SimplyBlueSafestain(Invitrogen)染色一塊凝膠，并使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移方法將相同凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen)。轉(zhuǎn)移后，用IXPBS中的5%脫脂奶粉封閉膜。隨后將膜在IOml的2%脫脂奶粉1XPBS/0.1%Tween20中18，000稀釋的HRP軛合的山羊抗人類IgGlH+L中室溫培養(yǎng)lh，伴隨輕柔攪動(dòng)。用IXPBS/0.3%Tween20各洗滌2X5min,隨后在室溫20min后，將膜根據(jù)制造商的說明書用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)(AmershamBiosciences)顯色。膜在X-射線處理器中顯色。結(jié)果來自包含構(gòu)建體1和9；構(gòu)建體1和10；以及構(gòu)建體11和12的重組表達(dá)系統(tǒng)的條件培養(yǎng)基由SDS-PAGE(在非還原條件下)分析和蛋白質(zhì)印跡(使用抗-IgG作為探針)分析。蛋白質(zhì)印跡揭示，來自包含構(gòu)建體11和12或包含構(gòu)建體9和1的系統(tǒng)的產(chǎn)物主要形成大約150kDa的單種物質(zhì)分子(圖14，分別是泳道3和2)。這些產(chǎn)物兩者在構(gòu)成雙抗體的‘較輕’和‘較重’鏈之間具有工程化的內(nèi)部二硫鍵。相反，‘較輕’和‘較重’鏈之間沒有工程化的內(nèi)部二硫鍵的分子形成構(gòu)建體10和1，形成至少兩種分子量是75和IOOkDa的分子物質(zhì)(圖14，泳道1)。盡管蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果如此，發(fā)現(xiàn)三種產(chǎn)物都能夠結(jié)合⑶32A和⑶16兩者(圖15)。令人驚訝地，相對(duì)于包含C-末端鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)物(由構(gòu)建體11和12形成)，來自其中Fc(或Fc-鉸鏈)結(jié)構(gòu)域位于包含F(xiàn)c的多肽鏈(S卩，‘較重’鏈)氨基末端的兩種系統(tǒng)的產(chǎn)物(構(gòu)建體9+1和構(gòu)建體10+1)證實(shí)對(duì)其靶肽之一或兩者(即，CD32B和/或CD16)增強(qiáng)的親和性和/或親和力。6.4內(nèi)部/外部裂解位點(diǎn)對(duì)加工多蛋白前體和表達(dá)共價(jià)雙特異性雙抗體的作用；設(shè)計(jì)和表征包含人類IgGX鏈和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的部分的雙特異性雙抗體如本文所述的，本發(fā)明的雙抗體或雙抗體分子的單獨(dú)多肽鏈可表達(dá)為單個(gè)多蛋白前體分子。測(cè)試實(shí)施例6.1-6.3所述的重組系統(tǒng)從這種多蛋白前體正確地加工和表達(dá)功能性CBD的能力，通過工程化核酸以編碼由內(nèi)部裂解位點(diǎn)特別是，弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)分隔的CBD的第一和第二多肽鏈兩者。從包含多蛋白前體分子的重組系統(tǒng)分離功能性CBD。如實(shí)施例6.3討論的，發(fā)現(xiàn)加入來自人類κ輕鏈的6個(gè)C-末端氨基酸FNRGEC(SEQIDNO23)會(huì)穩(wěn)定雙抗體形成-可能通過包含SEQIDNO23的結(jié)構(gòu)域與包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域的那些結(jié)構(gòu)域之間增強(qiáng)的鏈間相互作用。在CBD中測(cè)試該λ鏈/Fe樣相互作用的穩(wěn)定作用，其中多肽鏈都不包括Fc結(jié)構(gòu)域。雙抗體的一條多肽鏈被工程化為在其C-末端包括SEQIDNO:23;伴侶多肽鏈被工程化為包括來源于IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列VEPKSC(SEQIDNO79)。比較該CBD與包括構(gòu)建體1和2的CBD(來自實(shí)施例6.1)揭示，包含來源于鉸鏈結(jié)構(gòu)域和λ鏈的結(jié)構(gòu)域的CBD對(duì)其靶表位之一或兩者展示略微更大親和性。材料和方法·構(gòu)津和設(shè)計(jì)多肽分子多蛋白前體將核酸表汰載體設(shè)計(jì)為產(chǎn)牛2種多蛋白(poyprotein)前體分子，化學(xué)表示在圖17。構(gòu)建體13(SEQIDNO97)從多肽鏈N-末端起包括3G8的VL結(jié)構(gòu)域、2.4G2(其結(jié)合mCD32B)的VH結(jié)構(gòu)域、弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)、2.4G2的VL結(jié)構(gòu)域和3G8的VH結(jié)構(gòu)域。編碼構(gòu)建體13的核苷酸序列提供在SEQIDNO:98。構(gòu)建體14(SEQIDNO99)(圖17)從多肽鏈的N-末端包括3G8的VL結(jié)構(gòu)域、2.4G2(其結(jié)合mCD32B)的VH結(jié)構(gòu)域、弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)、FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位點(diǎn)、2.4G2的VL結(jié)構(gòu)域和3G8的VH結(jié)構(gòu)域。編碼構(gòu)建體14的核苷酸序列提供在SEQIDNO:100。將核酸表達(dá)載體設(shè)計(jì)為產(chǎn)生實(shí)施例6.1所示構(gòu)建體1和2的修飾形式。構(gòu)建體15(SEQIDNO101)(圖17)與實(shí)施例6.1所示的構(gòu)建體1(SEQIDNO9)相似，除了構(gòu)建體15的C-末端包括氨基酸序列FNRGEC(SEQIDNO23)。編碼構(gòu)建體15的核酸序列提供在SEQIDNO:102。構(gòu)建體16(SEQIDNO103)(圖17)與實(shí)施例6.1所示的構(gòu)建體2相似，除了構(gòu)建體16的C-末端包括氨基酸序列VEPSK(SEQIDNO:79)。編碼構(gòu)建體16的核酸序列提供在SEQIDNO:104oPCR和表汰載體構(gòu)津所有PCR和PCR產(chǎn)物純化方案如實(shí)施例6.1和6.2所述。重疊PCR以合適的引物，使用實(shí)施例6.1和實(shí)施例6.2所述的方法構(gòu)建、擴(kuò)增和純化終產(chǎn)物。如前所述地將終產(chǎn)物克隆到pCIneo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Promega，Inc.)。編碼構(gòu)建體的質(zhì)粒命名為如表16中鑒定的表16.質(zhì)粒構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table>多肽/雙抗體表汰如節(jié)6.1所述的使用Lipofectamine2000向HEK-293細(xì)胞進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染和一次共轉(zhuǎn)染單獨(dú)轉(zhuǎn)染編碼構(gòu)建體13的pMGX0750；共轉(zhuǎn)染分別編碼構(gòu)建體15和16的pMGX0752和pMGX0753。培養(yǎng)三天后，收集條件培養(yǎng)基，如所述地親和純化分泌產(chǎn)物。ELISA由上述三明治ELISA測(cè)定分泌到培養(yǎng)基中的雙抗體分子的結(jié)合。鼠⑶32B用于包被板，即作為靶蛋白，HRP-軛合的CD16用作共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體15和16的產(chǎn)物的，探針。對(duì)于包含構(gòu)建體13的重組系統(tǒng)，mCD32B用作靶抗原，生物素-軛合的⑶16A用作探針。結(jié)果由三明治ELISA分析來自包含構(gòu)建體13的重組表達(dá)系統(tǒng)的條件培養(yǎng)基。ELISA測(cè)定測(cè)試了CBD對(duì)mCD32B和/或⑶16之一或兩者的結(jié)合特異性(圖18)。⑶32B作為靶抗原，CD16A用作第二探針。ELISA中的陽性信號(hào)揭示，從多蛋白前體產(chǎn)生的異二聚h2.4G2-h3G8CBD對(duì)兩種抗原都具有特異性。類似地，在ELISA測(cè)定中測(cè)試共轉(zhuǎn)染編碼構(gòu)建體15和16的載體產(chǎn)生的純化產(chǎn)物，并與包括構(gòu)建體1和2的產(chǎn)物比較(實(shí)施例6.1)。⑶32B作為靶抗原，⑶16A用作第二探針。如同包括構(gòu)建體1和2的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建體15和16的產(chǎn)物能夠同時(shí)結(jié)合⑶32B和⑶16A。事實(shí)上，構(gòu)建體15和16的產(chǎn)物顯示對(duì)靶抗原即，⑶32B或⑶16A之一或兩者略微增強(qiáng)的親和性。這可能是因?yàn)棣随渽^(qū)FNRGEC(SEQIDNO23)與鉸鏈區(qū)VEPKSC(SEQIDNO79)相互作用提供的鏈間締合的增加的穩(wěn)定性和/或保真性(fidelity)(相對(duì)于野生型VH-VL結(jié)構(gòu)域相互作用)，這在包括構(gòu)建體1和2的產(chǎn)物中不存在。6.5使用雙重親和性再靶向試劑(“DART”)來將多種親和性連在一起本發(fā)明的一個(gè)方面涉及新型雙重親和性再靶向試劑(“DART”)以及將多種親和性連在一起的新方式。“DART”可為單特異性、雙特異性、三特異性等等，從而能夠同時(shí)結(jié)合一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多不同表位(可為相同抗原或不同抗原的表位)?！癉ART”可另外為單價(jià)的、二價(jià)的、三價(jià)的、四價(jià)的、五價(jià)的、六價(jià)的等等，從而能夠同時(shí)結(jié)合一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多分子。如圖35所示，DART的這兩種特性可組合，例如產(chǎn)生為四價(jià)等等的雙特異性抗體。一個(gè)進(jìn)展是開發(fā)對(duì)原型免疫受體huCD32B具有親和性以及對(duì)半抗原熒光素具有親和性的DART。該DART稱為“2B6/4420”，作為通用適體，能夠共連接hu⑶32B和與熒光素-軛合的結(jié)合伴侶相互作用的分子。CD32B是一種Fc受體，具有借助與活化信號(hào)傳導(dǎo)免疫復(fù)合物成簇而猝滅活化性信號(hào)的能力。在最初實(shí)施時(shí)，該技術(shù)允許快速篩選多種生物靶以與huCD32B成簇而不需要產(chǎn)生新的DART構(gòu)建體。2B6/4420可僅僅與針對(duì)細(xì)胞表面受體的熒光素化的抗體混合并藉以模擬對(duì)該受體具有親和性的DART的作用(圖20)。進(jìn)一步地，該試劑允許有效連接不易表達(dá)或產(chǎn)生的親和性試劑，允許人們克服技術(shù)限制。包含2B6/4420的DART明顯地可用作研究工具并也作為臨床候選物。在ELISA測(cè)定中從HEK293細(xì)胞產(chǎn)生的2B6/4420可同時(shí)結(jié)合⑶32B和熒光素。另外，其可經(jīng)由與⑶79連接，通過募集⑶32B到BCR復(fù)合物而抑制細(xì)胞增殖。DART的2B6臂可被不同抗體序列或具有其他相關(guān)特異性的結(jié)合序列代替。材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建體2B6/4420來源于人源化2B6MAb(hu2B6、MGA321)和抗-熒光素MAb4420的嵌合小鼠Fv/人類Fc形式的序列。完全組裝的DART由兩條多肽組成，導(dǎo)致共價(jià)連接兩個(gè)Fv區(qū)。第一多肽由分泌信號(hào)序列、隨后是作為與4420VH的融合蛋白產(chǎn)生的hu2B6VL組成，該分泌信號(hào)序列與hu2B6VL被由氨基酸殘基GGGSGGGG組成的接頭間隔。序列FNRGEC來源于κ輕鏈的C-末端，附加到該多肽C-末端。其他多肽由信號(hào)序列-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH組成，來源于人類IgGlFd片段C-末端的序列VEPKSC附加到C-末端。兩條鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵，共價(jià)地將兩條多肽連接在一起(圖20)。從現(xiàn)有質(zhì)粒PCR擴(kuò)增編碼所述多肽的DNA序列，由重疊PCR組合并克隆到pCIneo(Promega)的NheI和EcoRI位點(diǎn)之間。最后，使用類似于上述的方法此前已經(jīng)構(gòu)建的對(duì)hu⑶32B和hu⑶16(2B6/3G8)具有親和性的DART用作對(duì)照?？贵w鼠單克隆抗體抗-人類CD79b、CB3.1和CB3.2(雜交瘤)從Dr.CooperMD，UniversityofAlabamaatBirmingham,BirminghamAL獲得。MfCB3.1和CB3.2*艮據(jù)制造商的說明書(Pierce，RockfordIL)用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記。Fc-片段-特異性山羊抗-小鼠(GAM)IgG的F(ab，)2片段從JacksonLaboratories(WestGrove,PA)獲得?？?hu⑶32B小鼠MAb即3H7由內(nèi)部產(chǎn)生和純化。通過用hu2B6完整抗體免疫山羊并針對(duì)hu2B6的Fv區(qū)親和純化而產(chǎn)生山羊抗-2B6Fv。HulgG、FITC-huIgG和HRP-抗-小鼠IgG從JacksonImmunoresearch獲得。HRP-抗-山羊從SouthernBiotech獲得。DART表達(dá)根據(jù)制造商的說明書使用Lipofectamine2000(Invitrogen)將編碼各鏈的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293H細(xì)胞(Invitrogen)。以三天的間隔收集分泌的蛋白3_4次，并由針對(duì)固定的⑶32B可溶性形式的液相色譜純化。ELISA將2B6/4420或2B6/3G8DART捕獲到包被有FITC-標(biāo)記的蛋白S(Novagen)、人類IgG或FITC-huIgG的MaxiSorp板上(NalgeNunc)。檢測(cè)通過結(jié)合可溶性CD32B外結(jié)構(gòu)域、隨后是3H7(一種對(duì)CD32B特異性的小鼠單克隆抗體)、最終是抗_小鼠-HRP而進(jìn)行?？蛇x地，檢測(cè)通過結(jié)合山羊抗-2B6Fv多克隆親和純化的抗血清、隨后是抗-山羊-HRP而進(jìn)行。使用比色TMB底物(BioFX)檢測(cè)HRP活性并在VersaMaxELISA讀板器上讀數(shù)。B細(xì)胞純化和增殖測(cè)定i^ffijfe自白勺H，F(xiàn)icoll/PaquePlus(AmershamPharmaciaBiotech,UK)梯度方法分離外周血單核細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明書使用DynalB細(xì)胞負(fù)分離試劑盒(DynalBiotechnologyInc.，NY)分離B淋巴細(xì)胞。分離的B細(xì)胞(CD20+)的純度大于90%，如由FACS分析估計(jì)的。對(duì)于增殖測(cè)定，將純化的B細(xì)胞接種到平底96-孔微滴定板中的完全RPMI1640培養(yǎng)基，以細(xì)胞密度IxlO5細(xì)胞/孔，終體積200μ1并在37°C、5%CO2中存在或不存在抗體和雙抗體下培養(yǎng)48h。隨后加入1μCi/孔的[3H]胸苷(PerkinElmer,ffellesley,MA)并繼續(xù)培養(yǎng)另外的16_18h，隨后收集。[3H]胸苷摻入由液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量。結(jié)果為了證實(shí)2B6/4420DART是活性和特異性的，進(jìn)行兩種ELISA實(shí)驗(yàn)。首先，將2B6/4420或2B6/3G8(作為陰性對(duì)照)結(jié)合到已包被到ELISA板上的熒光素-軛合的蛋白(S-蛋白)。然后，將DART的2B6臂與可溶性⑶32B連接。由針對(duì)⑶32B、帶有不與2B6的表位重疊的表位的另一種抗體而檢測(cè)結(jié)合，隨后是HRP-軛合的第二抗體。盡管2B6/4420DART能夠同時(shí)結(jié)合熒光素和⑶32B，2B6/3G8不能如此(圖21，圖A)。當(dāng)DART被捕獲到包被有可溶性CD32B的板，并由對(duì)hu2B6Fv特異性的抗體檢測(cè)結(jié)合時(shí)，兩種DART都顯示良好的結(jié)合。為了證實(shí)2B6/4420DART能夠結(jié)合軛合于人類IgG的熒光素(考慮到這是初始實(shí)施該試劑的環(huán)境)，將未用熒光素標(biāo)記或用熒光素標(biāo)記的HuIgG結(jié)合到ELISA板并用于捕獲2B6/4420。2B6/3G8再次用作陰性對(duì)照。使用對(duì)Hu2B6Fv特異性的抗體檢測(cè)結(jié)合。2B6/4420DART明顯地結(jié)合于FITC-HuIgG，但不結(jié)合未標(biāo)記的HulgG，證實(shí)該DART能夠結(jié)合軛合于抗體的熒光素，對(duì)單獨(dú)抗體沒有顯著的結(jié)合。如預(yù)期的，在這些環(huán)境中的任一種沒有檢測(cè)到被2B6/3G8DART纟口口。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)2B6/4420DART能夠作為雙重親和性試劑起作用，雙重親和性試劑在基于細(xì)胞的測(cè)定環(huán)境中能夠?qū)π盘?hào)傳導(dǎo)有作用。已經(jīng)顯示CD32B與BCR的共聚集抑制B細(xì)胞活化。探究了2B6/4420DART共連接⑶32B與包被有熒光素標(biāo)記的α⑶79b抗體的BCR和觸發(fā)抑制細(xì)胞增殖的能力。從人類血液負(fù)選擇B細(xì)胞并通過以增加濃度的小鼠抗-人類-⑶79bFITC-標(biāo)記的克隆CB3.1和CB3.2處理而活化，并加入Fc-特異性GAM的F(ab')2片段作為第二試劑來交聯(lián)BCR，以及固定濃度(5μg/mL)的2B6/4420DART或相當(dāng)量的2B6/3G8DART(—種不靶向熒光素的分子)用作對(duì)照。以[3H]-胸苷摻入測(cè)量的細(xì)胞增殖在不存在DART或在對(duì)照2B6/3G8DART存在下隨著增加濃度的單克隆抗-⑶79b_FITC活化物而增加。2B6/4420DART的存在導(dǎo)致在所有濃度的抗-人類CD79b_FITC下B-細(xì)胞增殖嚴(yán)重減少(圖22，圖A和B和圖23，圖A)。當(dāng)包被有未標(biāo)記的CB3.2并使用相同實(shí)驗(yàn)條件活化的B細(xì)胞用2B6/4420DART處理時(shí)未觀察到增殖的抑制，證明其靶-特異性(圖23，圖B)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，2B6/4420DART能夠交聯(lián)CD32B和BCR并遞送能夠封閉抗原_受體_誘導(dǎo)的細(xì)胞活化的抑制性信號(hào)。6.6對(duì)表達(dá)⑶32B的B細(xì)胞惡性腫瘤的DART免疫療法當(dāng)前，使用Rituxan抗-⑶20抗體治療B細(xì)胞惡性腫瘤。然而有些B細(xì)胞惡性腫瘤不表達(dá)CD20或變得對(duì)Rituxan耐受。本發(fā)明的DART提供替代的免疫療法，能夠克服Rituxan抗-CD20抗體相關(guān)的問題。MGD261是一種雙重-親和性再靶向(DART)分子，結(jié)合于h⑶32B(經(jīng)由h2B6抗體)和hCD16A和hCD16B(經(jīng)由h3G8抗體)。MGD261的效力(B細(xì)胞清除)和安全性在mCD32-/_hCD16A+C57BI/6、mCD32-/"hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/_hCD16A+hCD32B+C57Bl/6中測(cè)試。在該重復(fù)劑量實(shí)驗(yàn)，小鼠接受6次IV注射(每周兩次，3周)。B細(xì)胞清除由FACS監(jiān)控。安全性由籠側(cè)觀察監(jiān)控。數(shù)據(jù)表示，MGD261能夠在雙轉(zhuǎn)基因小鼠清除B細(xì)胞而不引起任何顯著的副作用。數(shù)據(jù)對(duì)來自MacroGenics繁殖群的mCD32_/_hCD16A+C57B1/6、mCD32-/-hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/_hCD16A+hCD32B+C57Bl/6小鼠在第0、3、7、10、14禾口17天IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)、或無關(guān)抗體(hE1610mg/kg)。在第_19(采血前)、4、11、18、25和32天收集血液用于FACS分析。每周三次記錄動(dòng)物健康和活動(dòng)性。設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>FACS分析方法在施用h2B6_h3G8之前18天和處理后4、11、18、25和32天收集全血樣品。分析血液樣品以由基于FACS的測(cè)定確定h2B6-h3G8對(duì)B細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。不-洗滌方案用于B細(xì)胞、T細(xì)胞和PMN計(jì)數(shù)，通過使用從BeckmanCoulter獲得的FlowCount珠。用于分析的抗體組是1A8-FITC用于P麗，CD3-PE用于T細(xì)胞，CD19-APC用于B細(xì)胞和CD45_PerCP用于總白細(xì)胞。結(jié)果用hE16或MGD261處理(以任何濃度)的小鼠在實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間的任何時(shí)間未顯示任何的不適跡象。在h⑶16A和h⑶32B雙轉(zhuǎn)基因小鼠觀察到B細(xì)胞清除。雙抗體h2B6_3G8連接表達(dá)h⑶16A的效應(yīng)細(xì)胞和表達(dá)h⑶32B的B細(xì)胞；該連接是B細(xì)胞殺傷所需的。在單轉(zhuǎn)基因小鼠(圖24)未觀察到B細(xì)胞清除。研究期間T細(xì)胞和PMN水平?jīng)]有顯著改變。作為本發(fā)明替代免疫療法的進(jìn)一步證實(shí)，構(gòu)建MGD261的替代品，稱為“2.4G2-3G8DB”。2.4G2-3G8DB是一種雙重-親和性再靶向(DART)分子，結(jié)合于mCD32B(經(jīng)由2.4G2抗體)和hCD16A以及hCD16B(經(jīng)由h3G8抗體)。在mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+禾口mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠測(cè)試2.4G2-3G8DB的效力(B細(xì)胞清除)和安全性。在該重復(fù)劑量實(shí)驗(yàn)，小鼠接受9次IP注射(每周三次，3周)。B細(xì)胞清除由FACS監(jiān)控。安全性由籠側(cè)觀察監(jiān)控。數(shù)據(jù)表示，2.4G2-3G8DB能夠在h⑶16轉(zhuǎn)基因小鼠清除B細(xì)胞而不引起任何顯著的副作用。數(shù)據(jù)對(duì)來自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/_hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/_hCD16A+hCD16B+小鼠在第0、2、4、7、9、11、14、16禾Π18天IP注射2.4G2-3G8DB(75yg/小鼠)、或PBS。在第-10(采血前)、4、11和18天收集血液用于FACS分析。每周三次記錄動(dòng)物健康和活動(dòng)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>FACS分析方法在施用2.462_368之前10天和開始處理后4、11和18天收集全血樣品。分析血液樣品以由基于FACS的測(cè)定確定2.4G2-3G8對(duì)B細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。不-洗滌方案用于B細(xì)胞、T細(xì)胞和PMN計(jì)數(shù)，通過使用從BDImmunocytometrySystem獲得的TruCOUNT管。用于分析的抗體組是1A8-FITC用于P麗，CD3-PE用于T細(xì)胞，CD19-APC用于B細(xì)胞和CD45_PerCP用于總白細(xì)胞。結(jié)果用hE16或2.4G2-3G8DB處理的小鼠在實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間的任何時(shí)間未顯示任何的不適跡象。在mCD16-/-hCD16A+或mCD16-/_hCD16A+hCD16B+小鼠觀察到B細(xì)胞清除，但在mCD16-/_小鼠未觀察到。這些數(shù)據(jù)表示，攜帶h⑶16A的效應(yīng)細(xì)胞是B細(xì)胞殺傷所需的(圖25)。研究期間T細(xì)胞和PMN水平?jīng)]有顯著改變。靜脈內(nèi)(IV)模型使用人類腫瘤細(xì)胞系Raji的靜脈內(nèi)(IV)模型測(cè)試MGD261的抗腫瘤活性。Raji是表達(dá)h⑶32B的人類伯基特淋巴瘤細(xì)胞系。當(dāng)靜脈內(nèi)注射到mCD16-/-、h⑶16A+、RAGl-/_小鼠時(shí)，腫瘤細(xì)胞定位于脊柱并造成后腿麻痹。數(shù)據(jù)表示，MGD261能夠封閉Raji腫瘤細(xì)胞在mCD16-/-、hCD16A+、RAGl-/-小鼠的體內(nèi)生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表示，MGD261可用于治療人類表達(dá)⑶32B的B細(xì)胞惡性腫瘤。數(shù)據(jù)對(duì)來自MacroGenics繁殖群的十二周-二十周大的mCD16_/-、hCD16A+、RAG1-/-C57B/6小鼠在第O天IV注射5xl06Raji細(xì)胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天，還用250,25或2·5μgM⑶261或PBS(陰性對(duì)照)腹膜內(nèi)(intraperitoneously)(IP)處理小鼠。隨后每天觀察小鼠，每周兩次記錄體重。處死發(fā)展后腿麻痹的小鼠。結(jié)果用PBS處理的小鼠在第25天和第50天之間死亡。用MGD261處理的小鼠存活到至少第90天(圖26)。增加的存活率是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。使用時(shí)序檢驗(yàn)(LogrankTest)比較存活曲線獲得96.46的χ2(df9；卩值<0.0001)。6.7DART在原核生物中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)在非哺乳動(dòng)物宿主產(chǎn)生DART的能力。因此，用表達(dá)DART的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并監(jiān)控DART表達(dá)。材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建3G8是一種針對(duì)Hu⑶16的人源化單克隆抗體。本文所述的DART由兩條共價(jià)連接的鏈組成，其中每一條具有VL、隨后是間隔區(qū)，然后是VH、隨后是良好背景的Cys以與相對(duì)鏈形成二硫鍵。編碼3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly-3G8VH-LeuGlyGlyCys的DART序列從現(xiàn)有的真核表達(dá)構(gòu)建體PCR擴(kuò)增，并用NcoI和EcoRI消化。靶載體是pET25b(+)(Novagen)，其包含pelB前導(dǎo)序列以在大腸桿菌中分泌。在插入3G8/3G8DART序列之前，載體被如下修飾首先，T7啟動(dòng)子被較低活性Iac啟動(dòng)子代替以有利于可溶性，雖然在其控制下蛋白表達(dá)水平較低。另外，引入兩個(gè)點(diǎn)突變以消除在多克隆位點(diǎn)(MCS)開始處存在的兩個(gè)內(nèi)部Met密碼子，以利于在pelB前導(dǎo)序列開始處存在的Met起始。該構(gòu)建體產(chǎn)生的DART由具有相同特異性的兩個(gè)V-區(qū)臂組成，即Hu⑶16。表達(dá)用pET25b(+)T7-1αC+3G8/3G8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21DE3細(xì)胞(Novagen)，氨芐抗性集落用于接種肉湯培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到0.50D600單位時(shí)，加入0.5mMIPTG以誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)物在30°C生長(zhǎng)2小時(shí)并收集無細(xì)胞培養(yǎng)基。純化利用親和色譜和尺寸排阻色譜在兩步驟方法中純化3G8/3G8DART。使用親和色譜從條件培養(yǎng)基捕獲DART。特異性地，CD16A偶合到CNBr活化的瓊脂糖凝膠4B(GEHealthcare)。上樣之前，CD16A-瓊脂糖凝膠樹脂在20mMTris/HCl,pH8.0中平衡。完成上樣后，用平衡緩沖液洗滌樹脂，隨后用50mM甘氨酸pH3.0洗脫結(jié)合的DART。洗脫的DART立即用lMTris/HClpH8.0中和并使用離心型濃縮器(Vivaspin20,IOkMWCOPES,VivaScienceInc.)濃縮。濃縮的DART被尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化，使用PBS中平衡的Superdex200柱(GEHealthcare)。結(jié)果1.7升的大腸桿菌培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基經(jīng)由⑶16A瓊脂糖凝膠柱處理。DART的產(chǎn)量是0.12mg。由SDS-PAGE和SEC分析純化的DART證實(shí)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CHO)表達(dá)的對(duì)照DART的可比性(圖27)。大腸桿菌表達(dá)的h3G8-h3G8DART結(jié)合ELISA使用ELISA測(cè)量大腸桿菌中h3G8-h3G8DART的表達(dá)。將50μ1孔的2μg/ml抗-h3G8Fv特異性抗體2C11包被在碳酸鹽緩沖液中的96-孔Maxisorp板上，在4°C過夜。用raS-T(PBS，0.1%Tween20)洗滌板三次，然后在室溫由PBS-T中的0.5%BSA封閉30分鐘，隨后加入測(cè)試DART。封閉期間，大腸桿菌表達(dá)的h3G8-h3G8DART、h2B6_h3G8DART和h2B6-h2B6DART(陰性對(duì)照)被稀釋到PBST/BSA中1μg/ml和0.3μg/ml。50μ1/孔稀釋的DART加入到各孔。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，將50μ1/孔0.1μg/ml生物素化的s⑶16-Fc融合蛋白加入板。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，50μ1/L15000稀釋的HRP軛合的鏈霉抗生素蛋白(AmershamPharmaciaBiotech)用于檢測(cè)，并在室溫孵育1小時(shí)。用PBS-T洗滌板三次并使用80μ1/孔的TMB底物顯色。孵育5分鐘后，由40μ1/孔的1%H2SO4終止反應(yīng)。通過使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件讀取0D450nm。使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)讀出值繪圖(圖28)。6.8DART誘導(dǎo)的人類B-細(xì)胞死亡將人類PBMC與以下培養(yǎng)過夜CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6(上述)；Ch2B6-aglyC-去糖基化嵌合2B6抗體(描述在共同待審的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/108,135，公布為US2005/0260213，通過引用并入本文)和CD16-CD79。CD16-CD79的DNA和編碼的蛋白序列如下H3G8VL-CB3.IVH核苷酸序列(SEQIDNO105)GACATCGTGATGACCCMTCTCCAGACTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGGAGAGGGCCACC60ATCMCTGCAAGGCCAGCCAMGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTTTATGMCTGGTAC120CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTACATCCMTCTAGMTCT180GGGGTCCCAGACAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAGC240AGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAMGTMTGAGGATCCGTAC300ACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTTGAGATCAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAG360GTCCMCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGMGCTGTCC420TGCMGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGMGCAGAGGCCT480GGACMGGCCTTGMTGGATTGGTATGGTTGATCCTTCAGACAGTGAMCTCACTACMT540CAMTGTTCAAGGACMGGCCACATTGACTGTTGACAMTCCTCCAGCACAGCCTACATG600CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCMGAGCTATGGGC660TACTGGGGTCMGGMCCTCAGTCACCGTCTCCTCAGTTGAGCCCAMTCTTGTTAG717氨基酸序列(SEQIDNO106)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEffIGMVDPSDSETHYNQMFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAMGYffGQGTSVTVSSVEPKSCCB3.lVL-h3G8VH核苷酸序列(SEQIDNO107)GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTAACATTGGACAACCAGCCTCC60ATCTCTTGTAAGTCMGTCAGAGCCTCTTAGATACTGATGGAMGACATATTTGMTTGG120TTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAMCCGCCTMTCTATCTGGTGTCTAMCTGGAC180TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAMTC240AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGMTTTATTATTGCTGGCMGGTACACATTTTCCG300CTCACGTTCGGTGCTGGGACCMGCTGGAGCTGAMGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGC360CAGGTTACCCTGAGAGAGTCTGGCCCTGCGCTGGTGMGCCCACACAGACCCTCACACTG420ACTTGTACCTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGT480CAGCCTCCCGGGMGGCTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACMGCGC540TATMTCCAGCCCTGMGAGCCGACTGACAATCTCCMGGATACCTCCMAMCCAGGTA600GTCCTCACMTGACCMCATGGACCCTGTGGATACTGCCACATACTACTGTGCTCAMTA660MCCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCMGGGACTCTGGTCACTGTGAGCTCATTCMC720AGGGGAGAGTGTTAG735氨基酸序列(SEQIDNO108)DVVMTQTPLTLSVNIGQPASISCKSSQSLLDTDGKTYLNWLLQRPGQSPNRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCffQGTHFPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGffIRQPPGKALEffLAHIffffDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAQINPAffFAYffGQGTLVTVSSFNRGEC由FACS分析測(cè)定凋亡，表示為B細(xì)胞的PI+膜聯(lián)蛋白-V+群(⑶20+細(xì)胞)相對(duì)總的FSC/SSC未門控的群的百分比(圖29)。6.98B5-CB3.1DART8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC使用H9和lgh630R作為引物，ch8B5Lc作為模板擴(kuò)增8B5VL。使用lgh628F和lgh629R作為引物，ch8B5Hc作為模板擴(kuò)增CB3.IVH0接頭序列摻入引物lgh630R和lgh628F。C-末端接頭和終止密碼子摻入lgh629R引物。凝膠純化PCR產(chǎn)物并以等摩爾比混合到一起，隨后使用H9和lgh629R作為引物擴(kuò)增。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化重疊的PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體。CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC使用在FR4與8B5VL共有相同序列的H9和lgh630R作為引物，chCB3.ILc作為模板擴(kuò)增CB3.IVL0使用lgh63IF和lgh640R作為引物，ch8B5Hc作為模板擴(kuò)增8B5VH。接頭序列摻入引物lgh630R和Igh63IF。c_末端接頭和終止密碼子摻入lgh640R引物。凝膠純化PCR產(chǎn)物并以等摩爾比混合到一起，隨后使用H9和lgh640R用作引物擴(kuò)增。隨后用NheI/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化重疊的PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體?？笷lag標(biāo)簽-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC由重疊PCR將抗-Flag標(biāo)簽插入到信號(hào)序列和8B5VL之間。使用H9和lgh647R作為引物和ch8B5Lc作為模板擴(kuò)增信號(hào)序列和Flag標(biāo)簽。使用lgh647F和lgh629R作為引物和8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC作為模板再次擴(kuò)增8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC。凝膠純化PCR產(chǎn)物并以等摩爾比混合到一起，隨后使用H9和lgh629R用作引物擴(kuò)增。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化重疊的PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體。8B5VL-CB3.IVH-LGGC為了在8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC構(gòu)建體中產(chǎn)生不同C-末端接頭，使用H9和lgh646R作為引物再次擴(kuò)增該構(gòu)建體。將C-末端LGGC接頭整合到lgh646R引物中。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體。CB3.1VL-8B5VH-LGGC相同策略用于產(chǎn)生CB3.1VL-8B5VH-LGGC。將C-末端LGGC接頭整合到lgh648R引物中，CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC用作模板。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體?？笷lag標(biāo)簽-8B5VL-CB3.IVH-LGGC相同策略還用于產(chǎn)生抗-Flag標(biāo)簽-8B5VL-CB3.1VH-LGGC。將C-末端LGGC接頭整合到lgh648R引物，抗-Flag標(biāo)簽-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC用作模板。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體。序列8B5-CB3.I-VEPKSC核苷酸序列(SEQIDNO109)GACATTCAGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTACTTGCGGCGCTGGGAGAMGAGTCAGT60CTCACTTGTCGGGCMGTCAGGAMTTAGTGGTTACTTMGCTGGCTTCAGCAGAMCCA120GATGGMCTATTAMCGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAM180AGGTTCAGTGGCAGTGAGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGTCTTGAGTCT240GMGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACMTATTTTAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCT300GGGACCMGCTGGAGCTGMAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTCCMCTGCAG360CAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCMGGCTTCT420GGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGMCTGGGTGMGCAGAGGCCTGGACMGGCCTT480GMTGGATTGGTATGGTTGATCCTTCAGACAGTGAMCTCACTACMTCAMTGTTCMG540GAMGGCCACATTGACTGTTGACAMTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCC600TGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCMGAGCTATGGGCTACTGGGGTCMG660GMCCTCAGTCACCGTCTCCTCAGTTGAGCCCAMTCTTGTTAG704氨基酸序列(SEQIDNO110)DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSffLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEffIGMVDPSDSETHYNQMFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAMGYffGQGTSVTVSSVEPKSCCB3.1-8B5-FNRGEC核苷酸序列(SEQIDNO111)GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTAACATTGGACAACCAGCCTCC60ATCTCTTGTAAGTCMGTCAGAGCCTCTTAGATACTGATGGAMGACATATTTGMTTGG120TTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAMCCGCCTMTCTATCTGGTGTCTAMCTGGAC180TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAMTC240AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGMTTTATTATTGCTGGCMGGTACACATTTTCCG300CTCACGTTCGGTGCTGGGACCMGCTGGAGCTGAMGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGC360GMGTGMGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCMCCTGGAGGATCCATGAMCTC420TCTTGTGMGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGTCAGTCT480CCAGAGMGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGMATTAGAMCAMGCTAAAMTCATGCMCA540TACTATGCTGAGTCTGTGATAGGGAGGTTCACCATCTCMGAGATGATTCCAAMGTAGT600GTCTACCTGCAMTGMCAGCTTMGAGCTGMGACACTGGCATTTATTACTGTGGGGCT660CTGGGCCTTGACTACTGGGGCCMGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCGTTCMCAGGGGA720GAGTGTTAG729氨基酸序列(SEQIDNO112)DVVMTQTPLTLSVNIGQPASISCKSSQSLLDTDGKTYLNWLLQRPGQSPNRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCffQGTHFPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDffVRQSPEKGLEffVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYffGQGTTLTVSSFNRGEC8B5VL-CB3.IVH-LGGC使用H9和lgh694R作為引物，ch8B5Lc作為模板擴(kuò)增8B5VL。使用lgh695F和lgh696R作為引物，ch8B5Hc作為模板擴(kuò)增8B5VH。接頭序列摻入引物lgh694R和lgh695F。使用lgh355F和lgh366R作為引物，ch8B5Hc作為模板擴(kuò)增HulgGlFc。凝膠純化PCR產(chǎn)物并以等摩爾比混合到一起，隨后使用H9和lgh366R用作引物擴(kuò)增。隨后用Nhel/EcoRI限制性內(nèi)切酶消化重疊的PCR產(chǎn)物，并克隆到pCIneo載體。核苷酸序歹Ij(SEQIDNO113)GACATTCAGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTACTTGCGGCGCTGGGAGAMGAGTCAGT60CTCACTTGTCGGGCMGTCAGGAMTTAGTGGTTACTTMGCTGGCTTCAGCAGAMCCA120GATGGMCTATTAMCGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAM180AGGTTCAGTGGCAGTGAGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGTCTTGAGTCT240GMGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACMTATTTTAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCT300GGGACCMGCTGGAGCTGMAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTCCMCTGCAG360CAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCMGGCTTCT420GGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGMCTGGGTGMGCAGAGGCCTGGACMGGCCTT480GMTGGATTGGTATGGTTGATCCTTCAGACAGTGAMCTCACTACMTCAMTGTTCMG540GACMGGCCACATTGACTGTTGACAMTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGC600CTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCMGAGCTATGGGCTACTGGGGTCM660GGMCCTCAGTCACCGTCTCCTCACTGGGAGGCTGCTAG699氨基酸序列(SEQIDNO114)DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSffLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEffIGMVDPSDSETHYNQMFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAMGYffGQGTSVTVSSLGGCCB3.1-8B5-LGGC核苷酸序歹Ij(SEQIDNO115)GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTAACATTGGACAACCAGCCTCC60ATCTCTTGTAAGTCMGTCAGAGCCTCTTAGATACTGATGGAMGACATATTTGMTTGG120TTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAMCCGCCTMTCTATCTGGTGTCTAMCTGGAC180TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAMTC240AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGMTTTATTATTGCTGGCMGGTACACATTTTCCG300CTCACGTTCGGTGCTGGGACCMGCTGGAGCTGAMGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGC360GMGTGMGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCMCCTGGAGGATCCATGAMCTC420TCTTGTGMGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGTCAGTCT480CCAGAGMGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGMATTAGAMCAMGCTAAAMTCATGCMCA540TACTATGCTGAGTCTGTGATAGGGAGGTTCACCATCTCMGAGATGATTCCAAMGTAGT600GTCTACCTGCAMTGMCAGCTTMGAGCTGMGACACTGGCATTTATTACTGTGGGGCT660CTGGGCCTTGACTACTGGGGCCMGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCGCTGGGAGGCTGC720TAG723氨基酸序列(SEQIDNO116)DVVMTQTPLTLSVNIGQPASISCKSSQSLLDTDGKTYLNWLLQRPGQSPNRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCffQGTHFPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDffVRQSPEKGLEffVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYffGQGTTLTVSSLGGC引物L(fēng)gh628F(SEQIDNO:117)GGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGLgh629R(SEQIDNO:118)TTTGAATTCTAACAAGATTTGGGCTCAACTGAGGAGACGGTGACTGAGGLgh630R(SEQIDNO:119)GCCTCCGCCTCCGGATCCGCCTCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCLgh631F(SEQIDNO:120)GGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGLgh640R(SEQIDNO121)TTTGAATTCTAACACTCTCCCCTGTTGAACGAGGAGACTGTGAGAGTGGLgh644R(SEQIDNO:122)TTTGTCGTCATCATCGTCTTTGTAGTCGGAGTGGACACCTGTGGAGAGLgh646R(SEQIDNO:123)TTTGAATTCTAGCAGCCTCCCAGTGAGGAGACGGTGACTGAGLgh647F(SEQIDNO:124)CAAAGACGATGATGACGACAAAGACATTCAGATGACACAGTCTCCLgh648R(SEQIDNO:125)TTTGAATTCTAGCAGCCTCCCAGCGAGGAGACTGTGAGAGTGG表達(dá)使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，將編碼構(gòu)建體5和6、或6和7、或8和9、或9和10的表達(dá)質(zhì)粒(圖30)共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞以表達(dá)帶有或不帶抗flag標(biāo)簽的8B5-CB3.1DART。每三天收集條件培養(yǎng)基，收集三次。隨后使用⑶32B親和柱純化條件培養(yǎng)基。ELISAELISA如下進(jìn)行將50μ1/孔的2μg/ml⑶32B_Fc包被在碳酸鹽緩沖液中的96-孔Maxisorp板上，在4°C過夜。用PBS-T(PBS，0.1%Tween20)洗滌板三次并在室溫由PBS-T中的0.5%BSA封閉30分鐘，隨后加入測(cè)試的單鏈Fc融合蛋白。封閉期間，從2μg/ml開始，將8B5-CB3.1DART稀釋到一系列兩倍稀釋液。將25μ1/孔的稀釋DART與25μ1/孔的50ng/mlch8B5混合，從稀釋板轉(zhuǎn)移到ELISA板。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，向板加入50μ1/孔110，000稀釋的HRP軛合的F(ab’)2山羊抗人類IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch)。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌板三次并使用80μ1/孔的TMB底物顯色。孵育5分鐘后，通過加入40μ1/孔的1%H2SO4終止反應(yīng)。通過使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件讀取0D450nm。使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)讀出值繪圖(圖31)。6.10設(shè)計(jì)和表征Ig-樣四價(jià)DART采用四條多肽鏈來產(chǎn)生具有四價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的Ig-樣DART物質(zhì)(圖32；圖33)。Ig-樣DART物質(zhì)具有獨(dú)特性質(zhì)，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)域可設(shè)計(jì)為結(jié)合于相同表位(從而形成能夠結(jié)合四種相同抗原分子的四價(jià)、單_表位特異性Ig-樣DART)，或結(jié)合于不同表位或抗原，例如，其結(jié)構(gòu)域可設(shè)計(jì)為結(jié)合于相同抗原的兩個(gè)表位(從而形成四價(jià)、單-抗原特異性、雙表位特異性Ig-樣DART)，或結(jié)合于不同抗原分子的表位從而形成具有對(duì)第一抗原特異性的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)第二抗原特異性的第二對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的四價(jià)的Ig-樣DART)。可易于產(chǎn)生具有這種特性組合的雜合分子。為了闡釋這種Ig-樣DART物質(zhì)的特征，產(chǎn)生具有對(duì)⑶32特異性的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)⑶16A特異性的第二對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的示例性四價(jià)的Ig-樣DART物質(zhì)。該Ig-樣DART物質(zhì)使用以下四條多肽鏈產(chǎn)生2.4G2-3G8-hK核苷酸序列(SEQIDNO126)GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAATCTTGCTGCCTCTCCTGGAGAAAGTGTTTCCATCAATTGCAAGGCAAGTGAGAGCATTAGCAAGTATTTAGCCTGGTATCTACAGAAACCTGGGAAAGCAAATAAGCTTCTTATGTACGATGGGTCAACTTTGCAATCTGGAATTCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGAAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGGACTCTATTACTGTCAACAGCATTATGAATATCCAGCCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTTACCCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAAATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCAAATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTGAGCTCACTGGGAGGCTGCGGCGGAGGGAGCCGTACGGTGGCTGCACCATCGGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG2.4G2-3G8-hK編碼的氨基酸序列(SEQIDNO127)DVQMTQSPSNLAASPGESVSINCKASESISKYLAffYLQKPGKANKLLMYDGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLEPEDFGLYYCQQHYEYPATFGSGTKLEIKGGGSGGGGQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSGMGVGffIRQPSGKGLEffLAHIffffDDDKRYNPALKSRLTISKDTSSNQVFLKIASVDTADTATYYCAQINPAffFAYffGQGTLVTVSSLGGCGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC3G8-2.4G2_hGl核苷酸序列(SEQIDNO128)GACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTACATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCGAGGTGGAGCTAGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCGTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGGCAGGCTCCAACGACGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTTATGATGGTGGTGACACTCACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTTACTATTTCCAGAGATAATGCAAAAAGCAGCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCAACAGAGACTACGGGAATACCTACAGGTGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAGTTTCAGTCACTGTCTCCTCACTGGGAGGCTGCGGCGGAGGGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA3G8-2.4G2-hGl編碼的氨基酸序列(SEQIDNO129)DTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVELVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYYMAffVRQAPTTGLEffVASISYDGGDTHYRDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCATETTGIPTGVMDAffGQGVSVTVSSLGGCGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK具有上述序列的Ig-樣DART分子制品從不同質(zhì)粒分離物獲得并命名為“IgDART1”和“IgDART2”。在ELISA中將這些Ig-樣DART物質(zhì)結(jié)合mCD32_hCD16A的能力與僅培養(yǎng)基、具有單個(gè)⑶32和單個(gè)⑶16A結(jié)合位點(diǎn)的DART(“DART”)、和對(duì)照抗-Ch_mCD32mAb的能力比較(圖34)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的Ig-樣DART比DART或?qū)φ湛贵w具有大得多的抗原結(jié)合親和性。6.11設(shè)計(jì)和表征CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2雙特異性雙抗體將編碼CD79VL-CD32BVH(序列1)、CD32BVL-CD79VH-1(序列2)禾口⑶32BVL-⑶79VH-2(序列3)的基因克隆到表達(dá)載體pEE13，分別獲得表達(dá)構(gòu)建體1、2和3。將構(gòu)建體1表達(dá)質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒2或3—起共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞以分別制備⑶32B-⑶79-1和⑶32B-⑶79-2雙特異性雙抗體。每三天收集條件培養(yǎng)基，收集三次。隨后使用⑶32B親和柱純化條件培養(yǎng)基。ELISA如下進(jìn)行將50μ1/孔的2μg/ml⑶32B_Fc包被在碳酸鹽緩沖液中的96-孔Maxisorp板上，在4°C過夜。用PBS-T(PBS，0.1%Tween20)洗滌板三次并在室溫由PBS-T中的0.5%BSA封閉30分鐘，隨后加入測(cè)試的單鏈Fc融合蛋白。封閉期間，從2μg/ml開始，將⑶32B-⑶79-1或⑶32B-⑶79_2雙特異性雙抗體以一系列兩倍稀釋而稀釋。將25μ1/孔的稀釋雙特異性雙抗體與25μ1/孔的50ng/ml抗-⑶32B抗體混合，并加入到ELISA板。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌三次后，向板加入50μ1/孔110，000稀釋的HRP軛合的F(ab，)2山羊抗人類IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch)。在室溫孵育板1小時(shí)。用PBS-T洗滌板三次并使用80μ1/孔的TMB底物顯色。孵育5分鐘后，通過加入40μ1/孔的1%H2SO4終止反應(yīng)。通過使用96-孔讀板器和SOFTmax軟件讀取0D450nm。使用GraphPadPrism3.03軟件對(duì)讀出值繪圖。實(shí)驗(yàn)揭示，CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2雙特異性雙抗體能夠免疫特異性地結(jié)合于CD32-Fc，親和性與抗-CD32B對(duì)照抗體的相當(dāng)。上述構(gòu)建體的核苷酸和編碼的氨基酸序列提供如下序列1-CD79VL-CD32BVH核苷酸序列(SEQIDNO:130)GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAACCGCCTAATTTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTTGAGATCAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGAAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGTCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAACAAAGCTAAAAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGATAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTGGGGCTCTGGGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCGCTGGGAGGCTGCTAG序列2-CD79-CD32BVH氨基酸序列(SEQIDNO:131)DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPNRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCffQGTHFPLTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDffVRQAPGKGLEffVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGALGLDYffGQGTLVTVSSLGGC序列3-CD32BVL-CD79VH-1核苷酸序列(SEQIDNO:132)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTGTGGGAGATAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAAGCTGGCTGCAGCAGAAACCAGGCAAGGCCCCTAGACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGAGTCTGGGACCGAGTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTTCAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGTCTACAATATTTTAGTTATCCGCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAATGATTGATCCTTCAGACAGTGAAACTCACTACAATCAAATGTTCAAGGACAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCTATGGGCTACTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACTGGGAGGCTGCTGA序列4-CD32BVL-CD79VH-1氨基酸序列(SEQIDNO:133)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSffLQQKPGKAPRRLIYAASTLDSGVPSRFSGSESGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYFSYPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEffIGMIDPSDSETHYNQMFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAMGYffGQGTTVTVSSLGGC序列5-CD32BVL-CD79VH-2核苷酸序列(SEQIDNO:134)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTGTGGGAGATAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAAGCTGGCTGCAGCAGAAACCAGGCAAGGCCCCTAGACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGAGTCTGGGACCGAGTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTTCAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGTCTACAATATTTTAGTTATCCGCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAAGGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAATGATTGATCCTTCAGACAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCTATGGGCTACTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACTGGGAGGCTGCTGAATTC序列6-CD32BVL-CD79VH-2氨基酸序列(SEQIDNO:135)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSffLQQKPGKAPRRLIYAASTLDSGVPSRFSGSESGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYFSYPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEffIGMIDPSDSETHYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAMGYffGQGTTVTVSSLGGC對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修飾和改變而不偏離其精神和范圍。本文所述的具體實(shí)施方案僅通過示例的方式提供，本發(fā)明僅由所附的權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求的等價(jià)物的全部范圍界定。這種修飾意為落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的專利和非專利的所有參考文獻(xiàn)通過引用為所有目的全文并入本文，達(dá)到如同每種單獨(dú)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)具體和單獨(dú)地通過引用為所有目的全文并入的程度。權(quán)利要求一種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL1)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH1)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VL1)(VH1)；且其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙抗體分子，其中所述第三結(jié)構(gòu)域還包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域。3.—種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含人類輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的至少C-末端2至8氨基酸殘基的氨基酸序列的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；且其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。4.一種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含人類輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的至少C-末端2至8氨基酸殘基的氨基酸序列的第六結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；且其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雙抗體分子，其中所述人類輕鏈?zhǔn)侨祟惁瘦p鏈。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雙抗體分子，其中所述人類輕鏈?zhǔn)铅溯p鏈。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙抗體分子，其中所述第六結(jié)構(gòu)域包含所述C-末端6氨基酸的氨基酸序列，所述序列為PheAsnArgGlyGluCys(SEQIDNO23)。8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈與所述第二多肽鏈經(jīng)由所述第一多肽鏈上所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基與所述第二多肽鏈上所述第四結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基在所述第三結(jié)構(gòu)域中，并且所述第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基在所述第六結(jié)構(gòu)域中。10.一種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的第三結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第四結(jié)構(gòu)域，和(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第五結(jié)構(gòu)域，所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第四結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第五結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)；且其中所述第三結(jié)構(gòu)域位于所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域兩者的N-末端。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的雙抗體分子，其中所述第三結(jié)構(gòu)域還包括鉸鏈區(qū)。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈與所述第二多肽鏈經(jīng)由所述第一多肽鏈上所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基與所述第二多肽鏈上所述第四結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈上的所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基在所述第一結(jié)構(gòu)域、第二結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域的C-末端，且所述第二多肽鏈上的所述至少一個(gè)半胱氨酸殘基在所述第四結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。14.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述分子包含相對(duì)于野生型第一結(jié)構(gòu)域的第一結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾和相對(duì)于野生型第五結(jié)構(gòu)域的第五結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域各自的所述至少一個(gè)氨基酸修飾包括以半胱氨酸取代，以使所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈經(jīng)由所述第一結(jié)構(gòu)域中所述取代的半胱氨酸殘基與所述第五結(jié)構(gòu)域中所述取代的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵共價(jià)連接。15.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域包含相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括在位置215以丙氨酸取代。16.根據(jù)權(quán)利要求3、10或11所述的雙抗體分子，所述分子包含兩個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈且其中所述單體經(jīng)由每個(gè)單體第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接。17.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第四結(jié)構(gòu)域分別位于所述第二結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域的N-末端。18.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第四結(jié)構(gòu)域分別位于所述第二結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。19.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙抗體分子，其中所述第六結(jié)構(gòu)域在所述第四結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域的C-末端。20.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或10所述的雙抗體分子，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接是肽鍵。21.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或10所述的雙抗體分子，其中所述第四結(jié)構(gòu)域和所述第五結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接是肽鍵。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙抗體分子，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸殘基。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的雙抗體分子，其中所述第四結(jié)構(gòu)域和第五結(jié)構(gòu)域間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸殘基。24.一種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括(i)包含對(duì)第一表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)的第一結(jié)構(gòu)域，和(ii)包含對(duì)第二表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)的第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述第二多肽鏈包括(i)包含第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)的第三結(jié)構(gòu)域，和(ii)包含第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)的第四結(jié)構(gòu)域，所述第三結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接以使所述第三結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第三結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第一表位的第一結(jié)合位點(diǎn)(VLl)(VHl)，該表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的；其中所述第二結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域締合形成結(jié)合所述第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)(VL2)(VH2)，該表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16特異性的；且其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈經(jīng)由所述第一多肽鏈上所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基與所述第二多肽鏈上所述第三結(jié)構(gòu)域和所述第四結(jié)構(gòu)域之外的至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵共價(jià)連接，所述第一多肽鏈上的半胱氨酸殘基不位于所述第一多肽鏈的C-末端，且所述第二多肽鏈上的半胱氨酸殘基不位于所述第二多肽鏈的C-末端。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接是肽鍵。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中所述第三結(jié)構(gòu)域與所述第四結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接是肽鍵。27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中二硫鍵在所述第一多肽鏈上的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基與所述第二多肽鏈上的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基之間。28.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4、10或24所述的雙抗體分子，其中所述第一表位與所述第二表位不同。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的雙抗體分子，其中所述第一表位與所述第二表位是來自相同分子的表位。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的雙抗體分子，其中所述第一表位與所述第二表位是來自不同分子的表位。31.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4、10或24所述的雙抗體分子，其中所述第一免疫球蛋白或所述第二免疫球蛋白是人類或人源化免疫球蛋白。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的雙抗體分子，其中所述第一免疫球蛋白或所述第二免疫球蛋白是人類免疫球蛋白，所述人類免疫球蛋白是IgA、IgE、IgD、IgG或IgM。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的雙抗體分子，其中所述人類免疫球蛋白是IgG，所述IgG選自IgG1,IgG2,IgG3和IgG4組成的列表。34.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域是人類Fc結(jié)構(gòu)域。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域是IgA、IgE、IgD、IgG或IgM的Fc結(jié)構(gòu)域。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域是IgG的Fc結(jié)構(gòu)域，所述IgG選自IgG^IgG2,IgG3或IgG4組成的列表。37.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或10所述的雙抗體分子，其中至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或樹突細(xì)胞特異性的。38.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或10所述的雙抗體分子，其中至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記特異性的。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的雙抗體分子，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記是Fc受體。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的雙抗體分子，其中所述Fc受體是活化性Fc受體。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的雙抗體分子，其中所述Fc受體是抑制性Fc受體。42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的雙抗體分子，其中所述Fc受體是Fcγ受體。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的雙抗體分子，其中所述Fcγ受體是FcγRI、FcyRII或FcyRIII受體。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的雙抗體分子，其中所述Fcγ受體是FcγRIII受體，所述FcYRIII受體是FcγRIIIA(CD16A)受體或FcγRIIIB(CD16B)受體。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的雙抗體分子，其中所述FcyRIII受體是FcγRIIIA(CDl6A)受體。46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)和VHl區(qū)包含來源于第一免疫球蛋白的第一表位結(jié)合位點(diǎn)，所述免疫球蛋白是抗體3G8。47.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)和VHl區(qū)包含來源于第二免疫球蛋白的第二表位結(jié)合位點(diǎn)，所述免疫球蛋白是抗體3G8。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的雙抗體分子，其中所述抗體3G8是人源化的。49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的雙抗體分子，其中所述抗體3G8是人源化的。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO73，且所述VHl區(qū)包含氨基酸序列SeqIDNO-Jl051.根據(jù)權(quán)利要求49所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO73，且所述VHl區(qū)包含氨基酸序列SeqIDNO-Jl052.根據(jù)權(quán)利要求43所述的雙抗體分子，其中所述Fcγ受體是FcγRII受體，所述FcyRII受體是FcyRIIA(CD32A)受體或FcyRIIB(CD32B)受體。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的雙抗體分子，其中所述FcγRII受體是FcyRIIA(⑶32Α)受體。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)和所述VHl區(qū)包含來源于第一免疫球蛋白的第一表位結(jié)合位點(diǎn)，所述免疫球蛋白是抗體IV.3。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的雙抗體分子，其中抗體IV.3.是人源化的。56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的雙抗體分子，其中所述FcγRII受體是FcyRIIB(⑶32Β)受體。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)和VHl區(qū)包含來源于第一免疫球蛋白的第一表位結(jié)合位點(diǎn)，所述免疫球蛋白是抗體2Β6。58.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)和VHl區(qū)包含來源于第一免疫球蛋白的第一表位結(jié)合位點(diǎn)，所述免疫球蛋白是抗體2Β6。59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的雙抗體分子，其中抗體2Β6是人源化的。60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的雙抗體分子，其中抗體2Β6是人源化的。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43且所述VHl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO:40。62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO41,SEQIDNO42,SEQIDNO:43且所述VHl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43且所述VHl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO:40。63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含相對(duì)于野生型2B6VLl區(qū)的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括在位置105以半胱氨酸取代；且其中所述VHl區(qū)包含相對(duì)于野生型2B6VHl區(qū)的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括在位置44以半胱氨酸取代。64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的雙抗體分子，其中所述VLl區(qū)包含相對(duì)于野生型2B6VLl區(qū)的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括在位置105以半胱氨酸取代；且其中所述VHl區(qū)包含相對(duì)于野生型2B6VHl區(qū)的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括在位置44以半胱氨酸取代。65.根據(jù)權(quán)利要求42所述的雙抗體分子，其中所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)致病抗原特異性的。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的雙抗體分子，其中所述致病抗原是腫瘤抗原、細(xì)菌抗原、病毒抗原或自身免疫抗原。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的雙抗體分子，其中所述致病抗原是細(xì)菌抗原。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的雙抗體分子，其中所述細(xì)菌抗原是脂多糖。69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的雙抗體分子，其中所述致病抗原是病毒抗原。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的雙抗體分子，其中所述病毒抗原選自由人類免疫缺陷病毒、腺病毒和肝炎病毒的抗原組成的組。71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的雙抗體分子，其中所述致病抗原是自身免疫抗原。72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的雙抗體分子，其中所述自身免疫抗原選自由DNA、RNA和膠原組成的組。73.根據(jù)權(quán)利要求38所述的雙抗體分子，其中所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)毒素特異性的。74.根據(jù)權(quán)利要求38所述的雙抗體分子，其中所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)藥物特異性的。75.根據(jù)權(quán)利要求39所述的雙抗體分子，其中所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)毒素特異性的。76.根據(jù)權(quán)利要求39所述的雙抗體分子，其中所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)藥物特異性的。77.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。78.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的。79.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的。80.根據(jù)權(quán)利要求10所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。81.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。82.根據(jù)權(quán)利要求24所述的雙抗體分子，其中所述第一表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD32B特異性的且所述第二表位結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)CD16A特異性的。83.根據(jù)權(quán)利要求77所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO14，且其中所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:15。84.根據(jù)權(quán)利要求78所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO18，且其中所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:16。85.根據(jù)權(quán)利要求81所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO19，且所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:9。86.根據(jù)權(quán)利要求80所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:20，且所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:9。87.根據(jù)權(quán)利要求82所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:9，且所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:11。88.根據(jù)權(quán)利要求82所述的雙抗體分子，其中所述第一多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO11，且所述第二多肽鏈包含氨基酸序列SEQIDNO:9。89.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或10所述的雙抗體分子，其中所述第三結(jié)構(gòu)域包含變體Fc區(qū)，所述變體Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾。90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的雙抗體分子，其中所述修飾造成所述Fc區(qū)與Fc受體之間改變的結(jié)合親和性。91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的雙抗體分子，其中所述修飾造成所述Fc區(qū)與Fc受體之間無結(jié)合。92.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1、3、4、10或24所述的雙抗體分子的第一多肽鏈或第二多肽鏈的核苷酸序列。93.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1、3、4、10或24所述的雙抗體分子的第一多肽鏈和第二多肽鏈的核苷酸序列。94.一種載體，其包含權(quán)利要求92所述的核酸。95.一種載體，其包含權(quán)利要求93所述的核酸。96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的載體，其是表達(dá)載體。97.根據(jù)權(quán)利要求95所述的載體，其是表達(dá)載體。98.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求94所述的核酸。99.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求95所述的核酸。100.一種重組地產(chǎn)生雙抗體分子的方法，所述方法包括a.在適于表達(dá)所述雙抗體分子的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求98所述的宿主細(xì)胞；并b.從所述培養(yǎng)基回收所述雙抗體分子。101.一種重組地產(chǎn)生雙抗體分子的方法，所述方法包括a.在適于表達(dá)所述雙抗體分子的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求98所述的宿主細(xì)胞；并b.從所述培養(yǎng)基回收所述雙抗體分子。102.一種治療特征為致病抗原的疾病或病癥的方法，所述方法包括向需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求66所述的雙抗體分子，所述雙抗體分子結(jié)合于所述致病抗原。103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥。104.根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中所述疾病或病癥是傳染病。105.一種誘導(dǎo)對(duì)致病抗原免疫耐受的方法，其包括向需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求66所述的雙抗體分子。106.一種解毒方法，其包括向需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求73所述的雙抗體分子。107.一種解毒方法，其包括向需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求74所述的雙抗體分子。108.根據(jù)權(quán)利要求28所述的雙抗體分子，其中所述第一表位和所述第二表位來自不同細(xì)胞。109.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域部分包含CH2缺失的部分。110.根據(jù)權(quán)利要求1、3或10所述的雙抗體分子，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域部分包含CH3缺失的部分。111.根據(jù)權(quán)利要求3、10或11所述的雙抗體分子，所述分子是二聚體，所述二聚體包含(a)第一單體，其包含一組所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈；和(b)第二單體，其包含一組所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈，其中所述第一單體和第二單體經(jīng)由每個(gè)單體的第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接。112.根據(jù)權(quán)利要求111所述的雙抗體分子，其中所述第一單體和所述第二單體相同。113.根據(jù)權(quán)利要求112所述的雙抗體分子，其中所述第一單體和所述第二單體不同。114.一種雙重親和性再靶向試劑(DART)。115.根據(jù)權(quán)利要求114所述的DART，其中所述DART將多種親和性連在一起。116.根據(jù)權(quán)利要求114所述的DART，其中所述DART具有對(duì)hu⑶32B、hu⑶16A、hu⑶16B、半抗原或熒光素的親和性。117.一種治療患者B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求114-116任一項(xiàng)所述的DART。118.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤的至少一些B細(xì)胞不表達(dá)⑶20或已變得對(duì)Rituxan抗⑶20抗體治療耐受。119.一種雙抗體分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中(A)所述第一多肽鏈包含(i)結(jié)構(gòu)域(A)，其包含對(duì)表位(1)特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)；()結(jié)構(gòu)域(B)，其包含對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)；和(iii)結(jié)構(gòu)域(C)，其包含輕鏈恒定區(qū)(CL)結(jié)構(gòu)域或其部分；(B)所述第二多肽鏈包含(i)結(jié)構(gòu)域(D)，其包含對(duì)所述表位(2)特異性的所述第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)；()結(jié)構(gòu)域(E)，其包含對(duì)所述表位(1)特異性的所述第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)；(iii)結(jié)構(gòu)域(F)，其包含重鏈恒定區(qū)I(CHl)結(jié)構(gòu)域或其部分，和(iv)鉸鏈區(qū)、重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3)；其中所述結(jié)構(gòu)域(A)和(B)不互相締合以形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(D)和(E)不互相締合以形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(A)和(E)締合以形成結(jié)合所述表位(1)的結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(B)和(D)締合以形成結(jié)合所述表位(2)的結(jié)合位點(diǎn)；且所述結(jié)構(gòu)域(C)和(F)經(jīng)由二硫鍵締合在一起以形成CHl結(jié)構(gòu)域或其部分。120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的雙抗體分子，其中所述分子另外包含第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中(A)所述第三多肽鏈包含(i)結(jié)構(gòu)域(G)，其包含對(duì)表位(3)特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VLl)；()結(jié)構(gòu)域(H)，其包含對(duì)表位(4)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VH2)；和iii)結(jié)構(gòu)域(I)，其包含輕鏈恒定區(qū)(CL)結(jié)構(gòu)域或其部分；(B)所述第四多肽鏈包含(i)結(jié)構(gòu)域(J)，其包含對(duì)所述表位(4)特異性的所述第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VL2)；()結(jié)構(gòu)域(K)，其包含對(duì)所述表位(3)特異性的所述第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)(VHl)；(iii)結(jié)構(gòu)域(L)，其包含重鏈恒定區(qū)I(CHl)結(jié)構(gòu)域或其部分；其中所述結(jié)構(gòu)域(G)和(H)不互相締合以形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(J)和(K)不互相締合以形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(G)和(K)締合以形成結(jié)合所述表位(3)的結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(H)和(J)締合以形成結(jié)合所述表位(4)的結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(I)和(L)經(jīng)由二硫鍵締合在一起以形成CHl結(jié)構(gòu)域或其部分；且所述第二多肽鏈與第四多肽鏈的所述鉸鏈區(qū)、重鏈恒定區(qū)2(CH2)和所述重鏈恒定區(qū)3(CH3)締合以形成Fc區(qū)。121.根據(jù)權(quán)利要求120所述的雙抗體分子，其中所述表位(1)和(3)都存在于抗原分子上。122.根據(jù)權(quán)利要求120所述的雙抗體分子，其中所述表位(1)和(3)相同。123.根據(jù)權(quán)利要求120所述的雙抗體分子，其中所述表位(2)和(4)都存在于抗原分子上。124.根據(jù)權(quán)利要求120所述的雙抗體分子，其中所述表位(2)和(4)相同。125.根據(jù)權(quán)利要求119或120所述的雙抗體分子，其中至少一個(gè)表位是以下的表位病原體的抗原、自身免疫抗原、毒素、藥物。126.根據(jù)權(quán)利要求119或120所述的雙抗體分子，其中至少一個(gè)表位是⑶32B且至少一個(gè)表位是⑶16A。127.編碼權(quán)利要求119所述的第一多肽鏈和第二多肽鏈的核酸分子。128.編碼權(quán)利要求120所述的第一、第二、第三和第四多肽鏈的核酸分子。129.—種治療特征為致病抗原的疾病或病癥的方法，所述方法包括向需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求119或120所述的雙抗體分子，所述雙抗體分子具有結(jié)合于所述致病抗原的表位結(jié)合位點(diǎn)。130.一種雙重親和性再靶向試劑(“DART”)，所述試劑包括多條多肽鏈并能夠同時(shí)結(jié)合于兩個(gè)、三個(gè)或更多表位。131.根據(jù)權(quán)利要求130所述的雙重親和性再靶向試劑(“DART”)，其中所述DART是二價(jià)的、四價(jià)的；六價(jià)的或八價(jià)的。全文摘要本發(fā)明涉及雙抗體分子和其在治療包括免疫病癥、傳染病、中毒和癌癥的多種疾病和病癥中的用途。本發(fā)明的雙抗體分子包含兩條多肽鏈，其締合形成可識(shí)別相同或不同抗原上的相同或不同表位的至少兩個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)。另外，抗原可來自相同或不同分子。雙抗體分子的單獨(dú)多肽鏈可經(jīng)由非肽鍵的共價(jià)鍵共價(jià)結(jié)合，諸如但不限于位于各多肽鏈中的半胱氨酸殘基的二硫鍵。在具體實(shí)施方案，本發(fā)明的雙抗體分子進(jìn)一步包含F(xiàn)c區(qū)，這允許抗體樣的功能性被加工到分子中。文檔編號(hào)C12P21/08GK101821288SQ200880103342公開日2010年9月1日申請(qǐng)日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日發(fā)明者萊斯利·S·約翰遜,黃菱申請(qǐng)人:宏觀基因有限公司