專利名稱：用于檢測(cè)耐藥微生物的方法
用于檢測(cè)耐藥微生物的方法相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用本專利申請(qǐng)要求提交于2007年8月13日的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/964，499的 優(yōu)先權(quán)，該專利申請(qǐng)以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
腸球菌屬細(xì)菌是存在于自然界、動(dòng)物和人類體內(nèi)的革蘭氏陽性球菌。腸球菌是人 類正常胃腸道和生殖道細(xì)菌群落的一部分。在已知的菌種中，人體內(nèi)最主要的是糞腸球菌 (80-90% )和屎腸球菌(5%至10% )。腸球菌通常不是人體內(nèi)的病原體；但它們顯示出增 加的多種藥物抗性水平(Kaufhold and Klein, 1995,Zentralblatt. Fuer. Bakterilogie., 282(4) 507-518 ；Svec et al.,1996, Epidemiologie Mikrobiologielmunologie,45 153-157) (Kaufhold 和 Klein,《細(xì)菌學(xué)文摘》1995 年第 282 (4)期第 507-518 頁；Svec 等人， 《流行病學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)》1996年第45期第153-157頁)，并且已經(jīng)被越來越多地看作 導(dǎo)致醫(yī)院感染的重要原因。糞腸球菌感染包括尿路感染(UTI)、菌血癥、心內(nèi)膜炎、以及傷口 和腹盆部感染，占所有尿路感染的16%和所有菌血癥的8%。耐萬古霉素腸球菌(VRE)已經(jīng)被看作導(dǎo)致醫(yī)院感染的第二大常見原因，僅次于大 腸桿菌。耐藥性可通過染色體介導(dǎo)(內(nèi)在)或質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)(獲得)。VRE的特征在 于對(duì)幾乎全部現(xiàn)有的抗生素具有耐藥性，其中包括萬古霉素，而萬古霉素被看作是有效抵 抗革蘭氏陽性菌的“終極”抗生素。內(nèi)科醫(yī)生可以選擇的治療方案是有限的，其中包括抗菌 劑的組合使用或使用新的未經(jīng)證實(shí)療效的化合物?；颊呖赡茉跊]有癥狀的情況下移植和攜 帶VRE，主要移植部位為肛門、腋窩、糞便、會(huì)陰、肚臍、傷口、導(dǎo)尿管、以及結(jié)腸造口術(shù)部位。糞腸球菌質(zhì)粒介導(dǎo)的vanA是賦予高水平萬古霉素耐藥性的基因，它可以體外轉(zhuǎn) 移至若干革蘭氏陽性微生物，例如金黃色葡萄球菌(Leclercq et al. , 1989, Antimicrob. Agents Chemother. 33 10-15 ；Noble etal. ,1992, FEMS Microbiology Letters,72 195-198) (Leclercq等人，《抗微生物制劑和化學(xué)治療》1989年第33期第10_15頁；Noble等 人，《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)》1992年第72期第195-198頁)。據(jù)報(bào)道，萬古霉 素在臨床分離金黃色釀膿葡萄球菌、鏈球菌屬、遲緩埃格特菌和無害梭菌時(shí)表現(xiàn)出耐藥性， 并且萬古霉素耐藥性最有可能從耐萬古霉素腸球菌獲得(Centers for Disease Control andPrevention. 2002. Morb. Mortal.ffkly.Rep. ,51 :565_567 ；Centers forDisease Control and Prevention. 2002, Morb. Mortal, ffkly. Rep. 51 902 ；Weigel et al. ,2003, Science,302 1569-1571 ;Weigel et al. ,2007, Antimicrob. Agents Chemother. , 51 231-238 ；Mevius et al. ,1998, J. Antimicrob.Chemother. ,42 275-276 ；Poyart et al.， 1997, Antimicrob. Agents Chemother. ,41 :24_29 ；Stinear et al.,2001, Lancet,357 855-856)(疾病預(yù)防控制中心，《發(fā)病率與死亡率周報(bào)》2002年第51期第565-567頁；疾病 預(yù)防控制中心，《發(fā)病率與死亡率周報(bào)》2002年第51期第902頁；Weigel等人，《科學(xué)》2003 年第302期第1569-1571頁；Weigel等人，《抗微生物制劑和化學(xué)治療》2007年第51期第 231-238頁；Mevius等人，《抗微生物和化學(xué)療法雜志》1998年第42期第275-276頁；Poyart等人，《抗微生物制劑和化學(xué)治療》1997年第41期第24-29頁；Stinear等人，《柳葉刀》2001 年第357期第855-856頁)。

發(fā)明內(nèi)容
人們對(duì)于涉及耐藥微生物早期鑒別和治療性介入的診斷工具有著持續(xù)的需求。本發(fā)明包括用于檢測(cè)生物樣品中的耐藥微生物的方法。例如，該方法可以包括擴(kuò) 增生物樣品中存在的靶多核苷酸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中靶多核苷酸與微生物對(duì)萬古霉素的 耐藥性相關(guān)。擴(kuò)增可以包括至少一個(gè)循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括在合適條件下使第一引 物和第二引物接觸生物樣品以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，并且在合適條件下使探針接觸擴(kuò)增產(chǎn)物以使 得探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。探針的Tm可以比第一引物和第二引物的Tm高至少8°C。檢測(cè)擴(kuò) 增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明生物樣品中存在耐藥微生物。靶多核苷酸可以為vanA多核苷酸，例如，包含SEQ ID NO 7或其一部分的多核苷 酸。可用來擴(kuò)增此類多核苷酸的引物的例子包括(例如)具有與SEQ ID NO :1的同一性 至少約80%的核苷酸序列的第一引物和具有與SEQ ID NO :2的同一性至少約80%的核苷 酸序列的第二引物，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO: 7的一部分，優(yōu)選地?cái)U(kuò)增SEQ IDNO 7 的核苷酸648-751。該方法可用的探針包括核苷酸序列與SEQ IDNO :3的同一性至少為約 80%和/或核苷酸序列基本上與SEQ ID NO :7互補(bǔ)的探針。靶多核苷酸可以為vanB多核苷酸，例如，包含SEQ ID NO 8或其一部分的多核苷 酸?？捎脕頂U(kuò)增此類多核苷酸的引物的例子包括(例如)具有與SEQ ID NO :4的同一性 至少約80%的核苷酸序列的第一引物和具有與SEQ ID NO :5的同一性至少約80%的核苷 酸序列的第二引物，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO :8的一部分，優(yōu)選地?cái)U(kuò)增SEQ IDNO 8 的核苷酸492-630。該方法可用的探針包括核苷酸序列與SEQ IDNO :6的同一性至少為約 80%和/或核苷酸序列基本上與SEQ ID NO 8互補(bǔ)的探針。該方法可以包括用探針、第一引物和第二引物接觸生物樣品以形成混合物，其中 引物能夠擴(kuò)增與微生物中萬古霉素的耐藥性相關(guān)的靶多核苷酸，并且其中探針將與靶多核 苷酸雜交。探針的Tm可以比第一引物和第二引物的Tm高至少8°C。如果生物樣品中存在 與耐藥性相關(guān)的多核苷酸，則將混合物暴露在適合形成擴(kuò)增產(chǎn)物的條件下。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物， 其中擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明生物樣品中存在耐藥微生物。該方法可以包括擴(kuò)增生物樣品中存在的靶多核苷酸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中生物樣 品在合適的條件下接觸第一 VanA引物和第二 vanA引物、第一 vanB引物和第二 vanB引物、 或它們的組合，以生成擴(kuò)增產(chǎn)物。第一 vanA引物可以包含與SEQ ID NO 1的同一性至少約 80%的核苷酸序列，第二 vanA引物可以包含與SEQ ID NO 2的同一性至少約80%的核苷 酸序列，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO 7的核苷酸648-751。第一 vanB引物可以包含與 SEQ ID NO :4的同一性至少約80%的核苷酸序列，第二 vanB引物可以包含與SEQ ID NO 5 的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO :8的核苷酸492-630。 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明生物樣品中存在耐藥微生物。該方法可以包括使生物樣品接觸第一 vanA引物和第二 vanA引物以形成混合物， 接觸第一 vanB引物和第二 vanB引物以形成混合物，或它們的組合。第一 vanA引物可以 包含與SEQ ID NO 1的同一性至少約80%的核苷酸序列，第二 vanA引物可以包含與SEQID NO 2的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO 7的核苷酸 648-751。第一 vanB引物可以包含與SEQ ID NO :4的同一性至少約80%的核苷酸序列，第 二 vanB引物可以包含與SEQ ID NO 5的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中該引物對(duì) 可擴(kuò)增SEQ ID NO :8的核苷酸492-630。如果生物樣品中存在vanA多核苷酸或vanB多核 苷酸，則將混合物暴露在適合形成擴(kuò)增產(chǎn)物的條件下，并且檢測(cè)到不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，其中不 存在擴(kuò)增產(chǎn)物表明生物樣品中不存在耐藥微生物。在一些方面，該方法還可以包括使探針接觸生物樣品，其中探針的Tm比第一引物 和第二引物的Tm高至少8°C。探針可以包含熒光團(tuán)和淬滅物。該方法還可以包括使用第二 探針，其中第二探針的Tm比該方法中使用的引物的Tm高至少8°C。當(dāng)使用兩個(gè)探針時(shí)，一 個(gè)探針可以包含供體熒光團(tuán)，第二探針可以包含受體熒光團(tuán)。耐藥微生物可以為革蘭氏陽性微生物，例如葡萄球菌屬(例如金黃色釀膿葡萄球 菌)或腸球菌屬(例如糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌、雞腸球菌、或堅(jiān)忍腸球菌)的細(xì)菌。 本發(fā)明的方法還可以包括獲得生物樣品。生物樣品可來自疑似感染耐藥微生物的個(gè)體，并 且生物樣品可得自糞便物。可以在每個(gè)循環(huán)步驟后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在。本發(fā)明還提供用于分離多核苷酸的方法。該方法可以包括提供單鏈多核苷酸的混 合物，在適合使寡核苷酸與單鏈多核苷酸特異性雜交的條件下，將該混合物暴露于寡核苷 酸中以生成雜交體。寡核苷酸包括選自下列的核苷酸序列與SEQ ID NO :1的同一性至少 約80%的核苷酸序列、與SEQ ID NO 2的同一性至少約80%的核苷酸序列、與SEQID NO 3 的同一性至少約80%的核苷酸序列、與SEQ ID NO 4的同一性至少約80%的核苷酸序列、 與SEQ ID NO :5的同一性至少約80%的核苷酸序列、或與SEQ ID NO :6的同一性至少約 80%的核苷酸序列。接著可以洗滌雜交體以移除污染物。寡核苷酸可以包括親和標(biāo)記，并 且可以在暴露前后將寡核苷酸連接至固相材料?；旌衔锟梢缘米陨飿悠?，并且該方法還 可以包括使生物樣品中存在的多核苷酸變性，以生成單鏈多核苷酸。本發(fā)明還包括試劑盒。試劑盒可以包括包裝材料、第一 vanA引物、第二 vanA引物 和探針，并且其中探針的Tm比第一和第二 vanA引物的Tm高至少8°C。探針可以包含與SEQ ID NO :3的同一性至少約80%的核苷酸序列，并且可以與SEQ ID NO :7雜交。第一引物可 以包含與SEQID NO :1的同一性至少約80%的核苷酸序列，第二引物可以包含與SEQID NO: 2的同一性至少約80 %的核苷酸序列，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQID NO 7的核苷酸648-751。試劑盒可以包括包裝材料、第一 vanB引物、第二 vanB引物和探針，并且其中探針 的Tm比第一和第二 vanB引物的Tm高至少8°C。探針可以包含與SEQ ID NO :6的同一性至 少約80%的核苷酸序列，并且可以與SEQ ID N0:8雜交。第一引物可以包含與SEQ ID NO: 4的同一性至少約80%的核苷酸序列，第二引物可以包含與SEQ ID NO :5的同一性至少約 80%的核苷酸序列，其中該引物對(duì)可擴(kuò)增SEQ ID NO 8的核苷酸492-630。探針可以包含熒光團(tuán)和淬滅物。本發(fā)明還包括分離的多核苷酸，包括(例如)與SEQ ID NO 1的同一性至少約 80%的核苷酸序列，其中多核苷酸在與SEQ ID NO :2—起使用時(shí)可以擴(kuò)增包含SEQ ID NO 7的核苷酸648-751的多核苷酸；與SEQ ID NO 2的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中 多核苷酸在與SEQ ID NO :1—起使用時(shí)可以擴(kuò)增包含SEQ ID NO :7的核苷酸648-751的 多核苷酸；與SEQ ID NO :4的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中多核苷酸在與SEQ IDNO 5 一起使用時(shí)可以擴(kuò)增包含SEQID NO 8的核苷酸492-630的多核苷酸，以生成約139 個(gè)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物；以及與SEQ ID NO :5的同一性至少約80%的核苷酸序列，其中多核 苷酸在與SEQ ID NO :4—起使用時(shí)可以擴(kuò)增包含SEQ ID NO :8的核苷酸492-630的多核苷 酸。
如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”是指任何長度的核苷酸的聚合物形式(核糖核苷 酸、脫氧核苷酸、或肽核酸(PNA))，并且包括雙鏈和單鏈RNA、DNA和PNA。多核苷酸可以包 含具有不同功能的核苷酸序列，這些功能包括(例如)編碼區(qū)和非編碼區(qū)(例如調(diào)控區(qū))。 多核苷酸可以直接從天然來源獲得，或者可以利用重組、酶或化學(xué)技術(shù)制備。多核苷酸可以 具有直鏈或環(huán)狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。多核苷酸可以為(例如)載體的一部分(例如表達(dá)或克隆載 體)或片段?！肮押塑账帷笔侵副景l(fā)明的多核苷酸，通常為引物和/或探針。如本文所用，“靶多核苷酸”包含需要擴(kuò)增的所關(guān)注的多核苷酸序列。就其實(shí)際序 列而言，靶序列可以為已知或未知?！熬幋a區(qū)”是指這樣的核苷酸序列該核苷酸序列對(duì)多肽進(jìn)行編碼，并且在合適的 調(diào)控序列控制下表達(dá)所編碼的多肽。編碼區(qū)的邊界通常取決于其5'端的翻譯起始密碼子 和3'端的翻譯終止密碼子?！罢{(diào)控序列”是指用于調(diào)控編碼序列(與調(diào)控序列可操作地連 接)的表達(dá)的核苷酸序列。調(diào)控序列的非限制性例子包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、翻 譯起始點(diǎn)、翻譯終止點(diǎn)、以及轉(zhuǎn)錄終止子。術(shù)語“可操作地連接”是指成分的并列，使得各成 分處于使其按預(yù)期方式發(fā)揮作用的關(guān)系。當(dāng)調(diào)控序列與編碼區(qū)的連接方式使得編碼區(qū)在與 調(diào)控序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)表達(dá)，此時(shí)則稱調(diào)控序列“可操作地連接”到編碼區(qū)。如本文所用，“引物”是與靶多核苷酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸，其在與靶多核苷 酸雜交之后，可以作為擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物合成的起點(diǎn)?！耙飳?duì)”是指可以共同用于擴(kuò)增 反應(yīng)的兩種引物?！皏anA引物”和“vanB引物”是指分別與vanA或vanB多核苷酸雜交，并 且可以在適當(dāng)條件下引發(fā)擴(kuò)增的引物對(duì)。如本文所用，“探針”是與使用兩種引物形成的擴(kuò) 增產(chǎn)物的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。“vanA探針”和“vanB探針”分別是指與使用vanA 引物或vanB引物形成的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的探針。如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)”和“互補(bǔ)的”是指兩種單鏈多核苷酸(例如，引物和靶多 核苷酸)相互形成堿基對(duì)的能力，其中多核苷酸一個(gè)鏈上的腺嘌呤與第二多核苷酸鏈上的 胸腺嘧啶或尿嘧啶形成堿基對(duì)，并且多核苷酸一個(gè)鏈上的胞核嘧啶與第二多核苷酸鏈上的 鳥嘌呤形成堿基對(duì)。當(dāng)一種多核苷酸內(nèi)的核苷酸序列與第二多核苷酸內(nèi)的核苷酸序列可以 形成堿基對(duì)時(shí)，這兩種多核苷酸彼此互補(bǔ)。例如，5' -ATGC與5' -GCAT互補(bǔ)。如本文所 用，術(shù)語“基本上互補(bǔ)”、“基本互補(bǔ)的”和“基本互補(bǔ)性”是指在嚴(yán)格雜交條件下能夠選擇性 地雜交至指定多核苷酸的多核苷酸。嚴(yán)格雜交可以在多種PH值、鹽和溫度條件下進(jìn)行。pH 值可以為6至9，優(yōu)選地為6. 8至8. 5。鹽濃度可以為0. 15M鈉至0. 9M鈉，并且只要離子強(qiáng) 度與鈉的指定離子強(qiáng)度相當(dāng)，就可以使用其他陽離子。雜交反應(yīng)溫度可以為30°C至80°C， 優(yōu)選地為45°C至70°C。另外，可以在雜交反應(yīng)中添加其他化合物，以便在較低溫度(例如 室溫或接近室溫)下促進(jìn)特異性雜交?？捎糜谶_(dá)到降低溫度要求的化合物包括甲酰胺。因 此，如果在多核苷酸和第二多核苷酸之間發(fā)生雜交，則多核苷酸通常與第二多核苷酸是“基 本上互補(bǔ)的”。如本文所用，“特異性雜交”是指兩種多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下的雜交。
“同一性”是指寡核苷酸(例如引物或探針)與靶多核苷酸或擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一 部分之間的序列相似性。相似性通過比對(duì)兩種多核苷酸的殘基(即，引物或探針的核苷酸 序列和參考核苷酸序列)，從而優(yōu)化沿其序列長度的相同核苷酸的數(shù)量來確定；進(jìn)行比對(duì) 時(shí)允許兩個(gè)序列或其中一個(gè)序列內(nèi)有空位，以優(yōu)化共用核苷酸的數(shù)目，但每個(gè)序列內(nèi)的核 苷酸必須仍然保持其正確順序。序列相似性通常為至少約80%的同一性、至少約85%的 同一性、至少約90%的同一性、或至少約95%的同一性。序列相似性可以(例如)使用序 列技術(shù)(例如 GCG FastA(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) > MacVector 4. 5(Kodak/IBI軟件包))或本領(lǐng)域已知的其他合適的序列分析程序或方法進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選 地，引物和靶多核苷酸之間或探針和擴(kuò)增產(chǎn)物之間的序列相似性使用BLAST 2搜索算法的 Blastn 程序確定，如 Tatusova 等人(1999，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.，174 247-250)(《歐洲 微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)》1999年第174期第247-250頁)所述，并且序列相似性 可以從萬維網(wǎng)上獲取，例如從美國國家衛(wèi)生研究院國家生物技術(shù)信息中心的互聯(lián)網(wǎng)站上獲 取。優(yōu)選的是，使用所有BLAST 2搜索參數(shù)的默認(rèn)值，包括匹配得分(reward for match) =1、失配罰分(penalty formismatch) = _2、空位開方文罰分(open gap penalty) = 5、空 位延 串罰分(extension gap penalty) = 2、空位 x_ 下P華(gap x_dropoff) = 50、其月望值 (expect) = 10、字長(wordsize) = 11，并且可選地過濾器(filter)開啟。在使用BLAST 搜索算法比較兩個(gè)核苷酸序列過程中，序列相似性稱為“同一性”?！皹?biāo)記”是指(共價(jià)地或非共價(jià)地)連接或能夠被連接到寡核苷酸的部分，其提供 或能夠提供有關(guān)該寡核苷酸的信息(如有關(guān)該寡核苷酸的描述或識(shí)別信息)或有關(guān)與被標(biāo) 記寡核苷酸相互作用(如雜交)的另一個(gè)多核苷酸的信息。標(biāo)記可用來提供可檢測(cè)(并且 可任選地可定量)的信號(hào)。標(biāo)記還可以用來將寡核苷酸連接到表面?！盁晒鈭F(tuán)”是指在吸收較短波長的光之后能夠發(fā)出特定波長的光的部分。特定熒光 團(tuán)發(fā)出的光的波長是該熒光團(tuán)特有的。因此，用較短波長的光激發(fā)熒光團(tuán)，然后檢測(cè)適當(dāng)波 長的光，就可以檢測(cè)出特定熒光團(tuán)。如本文所用，術(shù)語“淬滅物”是指吸收熒光團(tuán)發(fā)出的能量或以其他方式影響熒光染 料發(fā)光能力的部分。淬滅物可以在該淬滅物的信號(hào)特性中重新發(fā)出從熒光團(tuán)中吸收的能 量，因此淬滅物也可以充當(dāng)熒光團(tuán)(熒光淬滅物)。該現(xiàn)象通常被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)。作為另外一種選擇，淬滅物能夠?qū)臒晒鈭F(tuán)吸收的能量以熱量形式耗散(非熒光 淬滅物)。“生物樣品”是指可以從真核或原核源獲得的樣品。真核源的例子包括哺乳動(dòng)物， 例如人類或鼠科生物(諸如大鼠或小鼠之類的鼠科動(dòng)物)。原核源的例子包括腸球菌。生 物樣品可以為(例如)單細(xì)胞形式、組織形式或流體形式。細(xì)胞或組織可以通過體外培養(yǎng)獲得。“允許”事件發(fā)生的條件或“適合”事件(例如雜交、鏈延伸等)發(fā)生的條件或“適 當(dāng)?shù)摹睏l件是指不會(huì)妨礙這類事件發(fā)生的條件。因此，這些條件允許、促進(jìn)、推動(dòng)和/或有利 于事件。本領(lǐng)域已知和本文所述的這些條件可以取決于(例如)核苷酸序列的性質(zhì)、溫度 和緩沖條件。這些條件也可以取決于所需事件的類型，例如雜交、裂解或鏈延伸?！胺蛛x的”多核苷酸是指已經(jīng)從其自然環(huán)境中移除的多核苷酸?！凹兓摹倍嗪塑?酸是指至少約60%不含有、優(yōu)選地至少約75%不含有、并且最優(yōu)選地至少約90%不含有自然相關(guān)聯(lián)的其他組分的多核苷酸。詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下可以提供某些有益效果的本發(fā)明的 實(shí)施例。然而，在相同情況下或在其他情況下，其他實(shí)施例也可能是優(yōu)選的。此外，一個(gè)或 多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的表述并不意味著其他實(shí)施例不可用，并且并非意圖將其他實(shí)施例排除在 本發(fā)明的范圍外。術(shù)語“包含”及其變型形式當(dāng)出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求中時(shí)不具有限制性含義。除非另作說明，否則“一種”、“一個(gè)”、“該”和“至少一個(gè)”可交替使用并且意思是 一個(gè)或更多個(gè)。另外在本文中，通過端點(diǎn)表述的數(shù)值范圍包括包括在該范圍內(nèi)的所有數(shù)值(如，1 至 5 包括 1,1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。術(shù)語“和/或”表示所列元素中的一者或全部或任意兩個(gè)或多個(gè)所列元素的組合。本發(fā)明的以上概述并非意圖描述本發(fā)明每個(gè)公開的實(shí)施例或每種實(shí)施方式。以下 描述更具體地舉例說明了示例性實(shí)施例。在貫穿本專利申請(qǐng)的若干處，通過實(shí)例列表來提 供指導(dǎo)，這些實(shí)例可以不同的組合使用。在每種情況下，所列舉的列表僅作為代表性的組， 而不應(yīng)該被解釋為排他性的列表。


圖1A. vanA編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)。圖IB. vanB編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 8)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括用于檢測(cè)耐藥原核微生物特有的多核苷酸的方法。該微生物具有vanA 或vanB編碼區(qū)，因而具有耐藥性。優(yōu)選地，原核微生物為腸球菌屬的微生物(本文中稱為 腸球菌屬或腸球菌)，例如，糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌、雞腸球菌或堅(jiān)韌腸球菌，更優(yōu)選 的是糞腸球菌或屎腸球菌，最優(yōu)選的是糞腸球菌。耐藥微生物的其他例子包括(但不限于) 葡萄球菌屬(例如，金黃色釀膿葡萄球菌)和鏈球菌屬。例如，本發(fā)明包括這樣的方法該 方法涉及使用擴(kuò)增技術(shù)和寡核苷酸(例如引物和探針)檢測(cè)耐萬古霉素腸球菌中存在的 vanA和/或vanB編碼區(qū)的一部分。采用本發(fā)明的方法，可以確定生物樣品中耐藥微生物的 存在。在一些方面，擴(kuò)增技術(shù)包括使用實(shí)時(shí)分析。本發(fā)明還包括本文所述的寡核苷酸。寡核苷酸本發(fā)明的寡核苷酸包括可用于擴(kuò)增vanA編碼區(qū)的一部分的引物。vanA編碼區(qū)的 例子在SEQ ID N0:7(基因庫登錄號(hào)AB247327，參見圖1A)有所公開?？捎糜跀U(kuò)增vanA編 碼區(qū)的一部分的引物可以擴(kuò)增SEQID NO :7的區(qū)域，優(yōu)選的是包括SEQ ID NO :7的從約648 至約751的核苷酸的區(qū)域。因此，引物的核苷酸序列可以對(duì)應(yīng)于從約648至約670的核苷 酸，優(yōu)選的是核苷酸648至670 (本文中稱為SEQ ID N0:1)。同樣，引物的核苷酸序列可以 對(duì)應(yīng)于從約726至約751的核苷酸互補(bǔ)序列，優(yōu)選的是726至751的核苷酸互補(bǔ)序列(本 文中稱為SEQ IDNO 2)?？捎糜跀U(kuò)增vanA編碼區(qū)的一部分的引物對(duì)的例子包括(但不限 于)下列幾禾中:SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；與SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2具有序列相 似性的引物；SEQ ID NO :1和與SEQ ID NO :2具有序列相似性的引物；以及與SEQ ID NO1具有序列相似性的引物和與SEQ ID NO :2具有序列相似性的引物。本發(fā)明的寡核苷酸包括可用于擴(kuò)增vanB編碼區(qū)的一部分的引物。vanB編碼區(qū)的 例子在SEQ ID N0:8(基因庫登錄號(hào)AY665551，參見圖1B)有所公開?？捎糜跀U(kuò)增vanB編 碼區(qū)的一部分的引物可以擴(kuò)增SEQID NO :8的區(qū)域，優(yōu)選的是包括SEQ ID NO :8的從約492 至約630的核苷酸的區(qū)域。因此，引物的核苷酸序列可以對(duì)應(yīng)于從約492至約516的核苷 酸，優(yōu)選的是核苷酸492至516 (本文中稱為SEQ ID NO :4)。同樣，引物的核苷酸序列可以 對(duì)應(yīng)于從約608至約630的核苷酸互補(bǔ)序列，優(yōu)選的是608至630的核苷酸互補(bǔ)序列(本 文中稱為SEQ IDNO 5)。可用于擴(kuò)增vanA編碼區(qū)的一部分的引物對(duì)的例子包括(但不限 于)下列幾種SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO :5;與 SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO :5 具有序列相 似性的引物；SEQ ID NO :4和與SEQ ID NO :5具有序列相似性的引物；以及與SEQ ID NO: 4具有序列相似性的引物和與SEQ ID NO :5具有序列相似性的引物。擴(kuò)增vanA或vanB編碼區(qū)的引物可以使用易得的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行設(shè)計(jì)，例 如，Primer Express (Applied Biosystems, Foser City, CA)禾口 IDT OligoAnalyzer 3. 0(lntegrated DNA Technologies, Coralville, IA)。設(shè)計(jì)引物時(shí)可以考慮的因素包括 (但不限于)熔融溫度、引物長度、擴(kuò)增產(chǎn)物的尺寸、以及特異性。本文所述擴(kuò)增方法中可 用的引物通常具有大于至少56°C、至少57°C、至少58°C或至少59°C的熔融溫度(Tm)。引物 的 Tm 可通過華萊士定律(Wallace Rule) (Wallace et al.，1979，Nucleic Acids Res.，6 3543-3557 (Wallace等人，《核酸研究》1979年第6期第3543-3557頁))或易得的計(jì)算機(jī) 程序(例如IDT Oligo Analyzer3. 0)進(jìn)行測(cè)定。通常，引物對(duì)的各引物將具有變化不大于 4°C、不大于3°C、不大于2°C、或不大于1°C的TM。通常兩種引物都足夠長，可以與靶多核苷 酸雜交，而不與微生物(優(yōu)選的是腸球菌)內(nèi)存在的其他非靶多核苷酸以及擴(kuò)增反應(yīng)中存 在的其他多核苷酸雜交。引物長度通常在約15和約30個(gè)核苷酸之間(例如，15、16、18、20、 22、24、26、28或30個(gè)核苷酸)。本發(fā)明中可用的引物可以與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :4、或 SEQ ID NO 5具有序列相似性。該具有序列相似性的引物內(nèi)的非互補(bǔ)核苷酸可以位于整個(gè)引物上 的幾乎任何位置。在一些方面，優(yōu)選的是保留胞核嘧啶或鳥嘌呤殘基。例如，在與SEQ ID NO :1具有序列相似性的引物中，更優(yōu)選的是改變SEQ ID NO :1中的一個(gè)或多個(gè)腺嘌呤或胸 腺嘧啶殘基，并且保留胞核嘧啶和鳥嘌呤殘基。優(yōu)選地，具有序列相似性的引物的3'端上 的第一核苷酸與 SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :2、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO 5 中對(duì)應(yīng)的第一 核苷酸相同。與SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO 5 具有序列相似性的 引物在適當(dāng)條件下具有擴(kuò)增靶多核苷酸的活性。具有序列相似性的該候選引物(即，與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO :4、或SEQ ID NO 5相對(duì)比的引物)是否具有擴(kuò)增靶多 核苷酸的活性，可以使用具有下列參數(shù)設(shè)置的Lightcycler 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Real-Time PCR System) (Roche, Indianapolis, IN)進(jìn)行測(cè)試95°C下持續(xù)30秒，然后95°C下持續(xù)0秒的 45次循環(huán)(20°C /s的斜率)，60°C下持續(xù)30秒(20°C /s的斜率)。擴(kuò)增可以在包含5微 升(μ L)樣品和5 μ L下列混合物的10 μ L總體積內(nèi)進(jìn)行兩種引物(均為10微摩爾/升 (μ Μ) ,0. 5 μ L) ,MgCl2 (25mM,2 μ L)和 LightCycler DNA Master 雜交探針(LightCycler DNA Master Hybridization Probe) (1 μ L 10x, Roche)。用于評(píng)價(jià)與 SEQ ID NO :1 或 SEQID NO :2具有序列相似性的候選引物的靶多核苷酸是包括SEQ ID NO :7的648至751核苷 酸的靶多核苷酸。該核苷酸序列存在于可得自商品名為ATCC 700221 的屎腸球菌的全細(xì) 胞DNA。用于評(píng)價(jià)與SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5具有序列相似性的候選引物的靶多核苷 酸是包括SEQ ID NO 8的492至630核苷酸的靶多核苷酸。該核苷酸序列存在于可得自商 品名為ATCC 700802 的糞腸球菌的全細(xì)胞DNA。當(dāng)測(cè)定與SEQ ID NO :1具有序列相似性 的候選引物時(shí)，所用第二引物為SEQ ID NO :2。當(dāng)測(cè)定與SEQ ID NO :2具有序列相似性的 候選引物時(shí)，所用第二引物為SEQ ID NO :1。當(dāng)測(cè)定與SEQ ID NO :4具有序列相似性的候 選引物時(shí)，所用第二引物為SEQ IDNO :5。當(dāng)測(cè)定與SEQ ID NO :5具有序列相似性的候選引 物時(shí)，所用第二引物為SEQ ID NO :4。本發(fā)明的引物還可以包含其他核苷酸。通常，此類其他核苷酸存在于引物的5 ‘端 并且包括(例如)含有限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的核苷酸、形成發(fā)夾環(huán)的核苷酸、以及可以使引物 用作(例如)蝎形引物(參見(例如)Whitcombe等人的美國專利6，326，145和Whitcombe et al.，1999，Nat. Biotechnol.，17 804-817 (Whitcombe 等人，《自然生物技術(shù)》1999 年第 17 期第 804-817 頁))或 amplifluor 引物(參見(例如)Nazarenko etal.，1997，Nucl. Acids Res.，25 :2516_2521 (Nazarenko 等人，《核酸研究》1997 年第 25 期第 2516-2521 頁)) 的其他核苷酸。如果引物包含此類其他核苷酸，在確定引物是否與SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :4、或SEQ ID NO 5具有序列相似性時(shí)，不包括其他核苷酸。同樣，在確定 引物長度(通常在約10至約50個(gè)核苷酸之間)時(shí)，也不包括其他核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸包括可用于與使用vanA引物或vanB引物所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的 至少一部分進(jìn)行雜交的探針。本文可用的此類vanA探針可以與包含SEQ ID NO :7的從約 671至約725 (優(yōu)選地為SEQ IDNO 7的從684至712)的核苷酸的區(qū)域進(jìn)行雜交。本文可 用的此類vanB探針可以與包含SEQ ID NO 8的從約517至約607 (優(yōu)選地為SEQ IDNO 8 的從549至573)的核苷酸的區(qū)域進(jìn)行雜交。通常，vanA探針設(shè)計(jì)用于本發(fā)明采用特定一組vanA引物的方法中，而vanB探針 則設(shè)計(jì)用于本發(fā)明采用特定一組vanB引物的方法中。vanA和vanB探針可以采用類似于本 文所述的設(shè)計(jì)引物的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)本文所述方法中可用的探針時(shí)可以考慮的因素包 括(但不限于)熔融溫度、長度、探針相對(duì)于引物的位置。通常，探針的Tm高于與該探針一 起使用的引物的最高TM。優(yōu)選地，探針的Tm比與該探針一起使用的引物對(duì)的最高Tm高至少 約8°C、至少約8. 5°C、至少約9°C、至少約9. 5°C、或至少約10°C。通常，較高的Tm允許探針 在引物之前雜交，這有助于使具有探針的每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記最大化。通常，探針具有足夠的長度，可以與靶多核苷酸(和擴(kuò)增產(chǎn)物)雜交，而不與微生 物(優(yōu)選地為腸球菌)中存在的其他非靶多核苷酸和擴(kuò)增反應(yīng)中存在的其他多核苷酸雜 交。探針長度通常在約15個(gè)核苷酸和約30個(gè)核苷酸之間。優(yōu)選地，探針和與其一起使用 的引物不會(huì)與擴(kuò)增產(chǎn)物的相同核苷酸進(jìn)行雜交。探針會(huì)與擴(kuò)增產(chǎn)物的一個(gè)鏈雜交，并且通 常設(shè)計(jì)用于在雜交該鏈的引物之前與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交。在本發(fā)明的一些方面，探針在雜 交相同鏈的引物的1、2、3、4或5個(gè)核苷酸內(nèi)與擴(kuò)增產(chǎn)物的一個(gè)鏈雜交。在本發(fā)明涉及使用 兩個(gè)探針的一些方面，該兩個(gè)探針優(yōu)選地與擴(kuò)增產(chǎn)物的相同鏈雜交，并且該兩個(gè)探針可以 任選地在彼此的1、2、3、4或5個(gè)核苷酸內(nèi)與相同擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。本發(fā)明可用的探針可以與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6具有序列相似性。該具有序列相似性的探針內(nèi)的非互補(bǔ)核苷酸可以位于整個(gè)探針上的幾乎任何位置。在一些方面， 優(yōu)選的是保留胞核嘧啶或鳥嘌呤殘基。例如，與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6具有序列相 似性的探針具有在引物對(duì)的引物能夠雜交的相同條件下與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的活性。具有序列 相似性的該候選探針(即，與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6相對(duì)比的探針)是否具有該活 性，可以通過以下方式測(cè)定在與引物對(duì)的擴(kuò)增反應(yīng)中添加候選探針，并且確定該候選探針 在退火步驟中是否與擴(kuò)增產(chǎn)物形成雜交體。用于評(píng)價(jià)與SEQ ID NO :3具有序列相似性的候 選探針的靶多核苷酸是包含SEQ ID NO 7的648至751核苷酸的靶多核苷酸，并且用于評(píng) 價(jià)與SEQ ID NO :6具有序列相似性的候選探針的靶多核苷酸是包含SEQ ID NO :8的492至 630核苷酸的靶多核苷酸。在測(cè)試與SEQ ID NO :3具有序列相似性的候選探針時(shí)，使用SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2作為引物對(duì)。在測(cè)試與SEQ ID NO :6具有序列相似性的候選探針 時(shí)，使用SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 5作為引物對(duì)。本發(fā)明的探針還可以包含其他核苷酸。此類其他核苷酸可以存在于5'端和/或 3'端，并且包括(例如)形成發(fā)夾環(huán)的核苷酸以及使該探針可用作(例如)分子信標(biāo)的其 他核苷酸。如果探針包含此類其他核苷酸，在確定探針是否與SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 8具有序列相似性時(shí)，不包括其他核苷酸。同樣，在確定探針長度(通常在約15至約30個(gè) 核苷酸之間)時(shí)，也不包括其他核苷酸?？梢詫?duì)本發(fā)明的寡核苷酸的核苷酸進(jìn)行改性。這種改性可用來提高多核苷酸在 某些環(huán)境下的穩(wěn)定性。這些改性物可以包括核酸主鏈改性物、堿基改性物、糖改性物、或它 們的任何組合。改性物可以為合成的、天然存在的或非天然存在的。本發(fā)明的多核苷酸可 以包含在該多核苷酸內(nèi)存在的一個(gè)或多個(gè)核酸處的改性物。骨架改性物的例子包括(但 不限于)磷?；宜狨?、硫代磷酰基乙酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲 基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、以及肽核酸(Nielson等人，美國專利 No. 5，539，082 ；Egholm等人，《自然》1993年第365期第566-568頁)。核酸堿基改性物的 例子包括(但不限于)肌核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6_三 甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5_烷 基尿苷(如5-甲基尿苷)、5_鹵代尿苷(如5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶 (如6-甲基尿苷)、或丙炔改性物。核酸糖改性物的例子包括(但不限于)2'-糖改性物， 如2' -0-甲基核苷酸、2'-脫氧-2'-氟代核苷酸、2'-脫氧-2'-氟尿嘧啶核苷、 2' -0-甲氧基乙基核苷酸、2' -0-三氟甲基核苷酸、2' -0-乙基-三氟代甲氧基核苷酸、 2' -0-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或2'-脫氧核苷酸。寡核苷酸可以包含標(biāo)記。標(biāo)記的例子包括(但不限于)熒光團(tuán)標(biāo)記(包括(例 如)淬滅物或吸收基團(tuán))、非熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo) 記、整體改性基團(tuán)、親和標(biāo)記、磁粒子、抗原、酶(包括(例如)過氧化物酶、磷酸酶)、基質(zhì)等 等。標(biāo)記可以提供通過以下方法檢測(cè)的信號(hào)熒光、輻射、比色法、重量分析法、X射線衍射 或吸收、磁力、酶活性等等。親和標(biāo)記提供了與另一個(gè)分子的特定交互作用。親和標(biāo)記的例 子包括(例如)生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、二硝基苯基、地高辛、膽固醇、聚氧 乙烯、半抗原、以及肽(例如抗體)。在某些方面，標(biāo)記為熒光團(tuán)。熒光團(tuán)標(biāo)記包括(但不限于)熒光素類、羧基羅丹明 類、花青類和羅丹明類染料。可用于本發(fā)明的其他類別的染料包括(如)聚鹵代熒光素類染料、六氯熒光素類染料、香豆素類染料、噁嗪類染料、噻嗪類染料、方酸類染料、鑭螯合物類 染料、以商品名Alexa FluorJ得自Molecular Probes的系列染料、以及以商品名BodipyJ 得自Invitrogen(Carlsbad，CA)的系列染料。熒光素類染料包括(如)6_羧基熒光素 (FAM)、2'，4'，1，4，-四氯熒光素(TET)、2'，4'，5'，7'，1，4_ 六氯熒光素(HEX)、2'， 7' -二甲氧基-4'，5' -二氯-6-羧基羅丹明(JOE)、2'-氯-5'-氟-7'，8'-熔融 苯基-1，4-二氯-6-羧基熒光素(NED)、2'-氯-7'-苯基_1，4-二氯-6-羧基熒光素 (VIC)、6_羧基-X-羅丹明(ROX)、以及2'，4'，5'，7'-四氯_5_羧基-熒光素(ZOE)。 羧基羅丹明類染料包括四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、四丙醇-6-羧基羅丹明(ROX)、德 克薩斯紅、RllO和R6G?；ㄇ囝惾玖习?72丄73丄73.5丄75丄75.5和077。熒光團(tuán)易商購 自(例如)Perkin-Elmer (Foster City, Calif.) ^Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.) 禾口 Amersham GE Healthcare(Piscataway, N. J.)。標(biāo)記可以為淬滅物。淬滅物可以為熒光淬滅物或非熒光淬滅物。熒光淬滅物包括 (但不限于)TAMRA、R0X、DABCYL、DABSYL、包括硝基噻唑藍(lán)(NTB)在內(nèi)的花青染料、蒽醌、孔 雀石綠、硝基噻唑、以及硝基咪唑化合物?？梢院纳臒晒鈭F(tuán)吸收的能量的非熒光淬滅物的 例子包括可以商品名 Black HoleJ得自 Biosearch Technologies, Inc. (Novato，CA)的非 熒光淬滅物、可以商品名Eclipse DarkJ得自EpochBiosciences (Bothell，WA)的非熒光淬 滅物、可以商品名QxlJ得自Anaspec，Inc. (San Jose, CA)的非熒光淬滅物、以及可以商品 名 IowaBlackJ 得自 Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)的非熒光淬滅物。熒光團(tuán)和淬滅物通常一起使用，并且可以在相同或不同的寡核苷酸上。當(dāng)成對(duì) 使用時(shí)，熒光團(tuán)和熒光淬滅物可以分別稱為供體熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)。多個(gè)常見的熒 光團(tuán)/淬滅物對(duì)是本領(lǐng)域所已知的(參見(例如)Glazer et al，Current Opinion in Biotechnology, 1997 ；8 :94_102 (Glazer等人，《生物技術(shù)近期述評(píng)》1997年第8期第 94-102 頁)；Tyagi et al，1998，Nat. Biotechnol.，16 :49_53 (Tyagi 等人，《自然生物技術(shù)》 1998 年第 16 期第 49-54 頁))，并且易商購自(例如)MolecularProbes (Junction City, OR) 和Applied Biosystems (Foster City，CA)?？膳c多種受體熒光團(tuán)一起使用的供體熒光團(tuán)的 例子包括(但不限于)熒光素、螢光黃、B-藻紅蛋白、9-吖啶異硫氰酸酯、熒光黃VS、4-乙 酰氨基-4'-異硫氰酸芪_2，2' -二磺酸、7-二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸苯基)-4_甲基 香豆素、琥珀酰亞胺基1-吡啶酸、以及4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸芪_2，2' -二磺酸的 衍生物。受體熒光團(tuán)通常取決于所用的供體熒光團(tuán)。受體熒光團(tuán)的例子包括(但不限于) LCJ-Red 640、LCJ-Red 705、Cy5、Cy5. 5、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、四甲基羅丹明異硫氰酸 酯、羅丹明X異硫氰酸酯、赤蘚紅異硫氰酸酯、熒光素、二亞乙基三胺五醋酸酯或其他鑭離 子(如，銪或鋱)螯合物。供體和受體熒光團(tuán)易商購自(例如)MolecularProbes或Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)。使用供體和受體熒光團(tuán)的實(shí)時(shí)分析中可用的探針的例子包括(但不限于)相鄰 探針(Cardullo et al.，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85 :8790_8794 (Cardullo 等人， 《美國科學(xué)院學(xué)報(bào)》1988 年第 85 期第 8790-8794 頁)；Wittwer, 1997，BioTechniques, 22 130-131 (Wittwer，《生物技術(shù)》1997 年第 22 期第 130-131 頁))和 Taqman 探針(Hollandet al.，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :7276_7280 (Holland 等人，《美國科學(xué)院學(xué)報(bào)》1991 年第 88 期第 7276-7280 頁)；Livak et al.，1995，PCR Methods Appl. ,4 357-62 (Livak
15等人，((PCR方法應(yīng)用》1995年第4期第357-362))。使用熒光團(tuán)和非熒光淬滅物的實(shí)時(shí) 分析中可用的探針和引物的例子包括(但不限于)分子信標(biāo)(Tyagi et al.，1996，Nat. Biotechnol. ,14 303-308 (Tyagi等人，《自然生物技術(shù)》1996年第14期第303-308頁)； Johansson et al.，2002，J. Am. Chem. Soc.，124 :6950_6956 (Johansson 等人，《美國化學(xué)學(xué) 會(huì)期刊》2002年第124期第6950-6956頁))、蝎形引物(包括雙蝎形引物)(Whitcombe等人， 美國專利 6，326，145 ；Whitcombe et al.，1999，Nat. Biotechnol.，17 804-817 (Whitcombe 等人，《自然生物技術(shù)》1999年第17期第804-817頁))、amplifluor引物(Nazarenko et al.，1997，Nucl. Acids res. ,25 2516-2521 (Nazarenko 等人，《核酸研究》1997 年第 25 期第 2516-2521 頁))、以及 light-up 探針(Svanvik et al.，2000，Anal. Biochem.，287 179-182 (Svanvik等人，《生物化學(xué)年鑒》2000年第287期第179-182頁))。本發(fā)明的多核苷酸可存在于載體中。載體是復(fù)制的多核苷酸(例如，質(zhì)粒、噬 菌體或粘粒)，另一個(gè)多核苷酸可以連接到其上，以形成連接的多核苷酸的復(fù)制品。包含 本發(fā)明的多核苷酸的載體的構(gòu)造采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。參見例如Sambrook et al, MolecularCloning :A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (Sambrook 等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989年)。載體可以提供進(jìn)一步的克隆(擴(kuò)增多核苷酸)(即克隆載體)或表達(dá)多核 苷酸(即表達(dá)載體)。術(shù)語載體包括(但不限于)質(zhì)粒載體和病毒載體。病毒載體的例子 包括(例如)腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、以及皰疹病毒載 體。通常，載體能夠在細(xì)菌宿主(例如，大腸桿菌)內(nèi)復(fù)制。優(yōu)選地，載體為質(zhì)粒。載體也 可以包括vanA編碼區(qū)(例如SEQ IDNO 7或其一部分，優(yōu)選的是SEQ ID NO 7的從約648 至約751的核苷酸)或vanB編碼區(qū)(例如SEQ ID NO 8或其一部分，優(yōu)選的是SEQ IDNO 8的從約492至約630的核苷酸)。這種載體可以用作(例如)對(duì)照靶多核苷酸。載體的選擇取決于在所得構(gòu)造中的多種所需特性，例如，選擇標(biāo)記、載體復(fù)制速率 等。用于克隆和表達(dá)本文所述載體的合適的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞包括真 細(xì)菌，例如革蘭氏陰性菌(例如大腸桿菌)。可以采用技術(shù)人員已知和常用的方法將載體引 入宿主細(xì)胞。例如，磷酸鈣沉淀、電穿孔、熱休克、微脂粒感染、顯微注射和病毒介導(dǎo)的核酸 轉(zhuǎn)移都是用于將核酸引入宿主細(xì)胞的常用方法。此外，可以將裸DNA直接導(dǎo)入細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸可以體外制備或體內(nèi)制備。例如，用于體外合成的方法包括 (但不限于)采用常規(guī)DNA/RNA合成儀的化學(xué)合成。用于此類合成的合成多核苷酸和試劑 的供應(yīng)商是人們所熟知的。用于體外合成的方法還包括(例如)在無細(xì)胞體系內(nèi)使用環(huán)狀 或直鏈表達(dá)載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體也可用來在細(xì)胞內(nèi)制備本發(fā)明的多核苷酸，然后 將多核苷酸與細(xì)胞分離。與SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 中的一者或其片段 所含的核苷酸序列相同或基本相同的多核苷酸可用作核酸擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)的引物，以檢測(cè) 腸球菌屬的耐藥原核微生物(以及屬于腸球菌以外種屬的微生物的基因編碼同系物和直 系同源物，這些同系物和直系同源物與該靶多核苷酸序列的序列相似性很高)特有的靶多 核苷酸。通常，這些引物多核苷酸與SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4中所示的其中一種核苷酸序列具有至少約80%到至少約95%的同一性(如具有至 少約80%的序列同一性、至少約85%的序列同一性、至少約90%的序列同一性、或至少約
1695%的序列同一性)。與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :6中的一者或其片段所含的核苷酸序列相同或基本 相同的多核苷酸可用作核酸檢測(cè)反應(yīng)(如雜交)的探針，以檢測(cè)腸球菌屬的耐藥原核微生 物(以及屬于腸球菌以外種屬的微生物的基因編碼同系物和直系同源物，這些同系物和直 系同源物與該靶多核苷酸序列的序列相似性很高)特有的靶多核苷酸。通常，這些探針多 核苷酸與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6中所示的其中一種核苷酸序列具有至少約80%到 至少約95%的同一性(如具有至少約80%的序列同一性、至少約85%的序列同一性、至少 約90%的序列同一性、或至少約95%的序列同一性)。使用方法本發(fā)明包括用于檢測(cè)耐藥原核微生物特有的多核苷酸的方法，該耐藥原核微生物 優(yōu)選的是腸球菌屬的細(xì)菌，例如，糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌、雞腸球菌、或堅(jiān)韌腸球菌， 更優(yōu)選的是糞腸球菌或屎腸球菌，最優(yōu)選的是糞腸球菌。耐藥微生物的其他例子包括(但 不限于)葡萄球菌屬(例如，金黃色釀膿葡萄球菌)和鏈球菌屬。如果樣品來自于受試者， 可利用該方法確定受試者是否感染了該耐藥微生物。本發(fā)明此方面的方法通常包括用本發(fā) 明的引物對(duì)接觸靶多核苷酸，擴(kuò)增多核苷酸，以及檢測(cè)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法所用的靶多核苷酸可以在樣品中存在。樣品可以為食物樣品、飲料樣品、發(fā) 酵肉湯、法醫(yī)樣品、環(huán)境樣品(如污垢、灰塵、垃圾、污水或水)或生物樣品。優(yōu)選地，樣品為 生物樣品?！吧飿悠贰笔侵缚梢詮恼婧嘶蛟嗽传@得的樣品。真核源的例子包括哺乳動(dòng) 物，例如人類或鼠科生物(諸如大鼠或小鼠之類的鼠科動(dòng)物)。原核源的例子包括腸球菌以 及含有內(nèi)源或重組vanA或vanB編碼區(qū)的其他微生物。生物樣品可以為(例如)單細(xì)胞形式、組織形式或流體形式。細(xì)胞或組織可以通 過體外培養(yǎng)獲得。如果來自于動(dòng)物，則生物樣品可得自(例如)肛門拭子、直腸周圍拭子、 糞便樣品、血液和/或體液。在一些方面，生物樣品得自疑似感染腸球菌的受試者。樣品可 以為分離的多核苷酸(例如本文所述載體中存在的多核苷酸)或使用下文所述方法分離的 多核苷酸。樣品可以為溶解或分散在水或有機(jī)介質(zhì)中的固體樣品(如固體組織)，或者為從 中將多核苷酸提取到水中或有機(jī)介質(zhì)中的固體樣品。例如，樣品可以為器官均漿。因此，樣 品可以包括此前提取的多核苷酸。在一些方面，樣品可以用富集肉湯培養(yǎng)，以富集所存在的微生物(優(yōu)選的是腸球 菌)。通過在樣品制備之前增加富集培養(yǎng)過程以提取擴(kuò)增和檢測(cè)所需的多核苷酸，可以提高 樣品對(duì)此類微生物的敏感性。利用樣品材料(如生物樣品)培養(yǎng)補(bǔ)充了一定濃度抗生素的 適當(dāng)介質(zhì)/肉湯，這些抗生素可以殺死樣品內(nèi)的其他微生物，但又允許耐抗生素微生物增 殖，然后將培養(yǎng)物在合適的溫度(如37°C )下培養(yǎng)一段時(shí)間(例如，18至24小時(shí))。優(yōu)選 地，抗生素為可以在(例如)4毫克/毫升(mg/ml)和8mg/ml之間的濃度下使用的萬古霉 素。在富集培養(yǎng)過程結(jié)束時(shí)，通過離心、過濾或其他合適的方法從培養(yǎng)物的一部分中收集含 有所關(guān)注的微生物的樣品，然后將其用于本發(fā)明涉及擴(kuò)增和檢測(cè)的方法中。多核苷酸可以來自不純凈、部分純凈、或純凈的樣品。初始樣品的純度并不重要， 因?yàn)榧词箯募兌确浅５偷臉悠分幸部梢垣@得多核苷酸。例如，多核苷酸可以從生物流體 (例如血液、唾液、糞便、或組織)的不純凈樣品中獲得。如果需要更高純度樣品，可以在實(shí)施本發(fā)明的方法之前按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。多核苷 酸可以用下文所述的方法進(jìn)行分離。復(fù)雜的生物樣品(糞便、血液、食物、組織、唾液等)可以包含固體碎屑和/或擴(kuò)增 抑制劑。固體碎屑一般通過沉淀或離心(將上清液與固體分離)、過濾等方式移除。擴(kuò)增 抑制劑一般通過用蛋白質(zhì)變性劑或蛋白酶、稀釋液等處理來移除。通過選擇性裂解、差速離 心、過濾等方法可以減少無用的含多核苷酸的細(xì)胞。在擴(kuò)增腸球菌屬中存在的靶多核苷酸之前，可以從樣品中移除特定微生物(優(yōu)選 的是腸球菌)。例如，可以將生物樣品暴露在用介質(zhì)官能化的基質(zhì)中，該基質(zhì)將與腸球菌相 互作用，但不會(huì)與生物樣品中存在的其他組分相互作用。通過包括弱相互作用(例如，范德 瓦爾斯相互作用、靜電相互作用、親和結(jié)合或物理捕獲)在內(nèi)的多種機(jī)理可以可逆地保持 相互作用?？捎玫慕橘|(zhì)的例子包括(但不限于)特異性相互作用(例如通過耐腸球菌抗體 介導(dǎo)的相互作用)和非特異性相互作用?？捎脕斫閷?dǎo)與微生物的非特異性相互作用的試劑 的例子包括二氧化硅、氧化鋯、氧化鋁小珠、金屬膠體(例如金)和已經(jīng)通過巰基化學(xué)物質(zhì) (例如，Parthasarathy，提交于2007年4月25日的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/913，813，代理人 案卷號(hào)62470US002)官能化的鍍金薄板。與腸球菌相互作用的試劑可存在于任何固相材料中。這些材料的例子包括聚烯 烴、聚苯乙烯、尼龍、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多糖和氟化聚合物，以及樹脂(例如 瓊脂糖、乳膠、纖維素和葡聚糖)。固體材料可以為任何形式，優(yōu)選地為顆粒物質(zhì)形式(如粒 子、小珠、微珠、微球)或可以引入微流裝置的任何其他形式(如原絲)(Parthasarathy，提 交于2007年4月25日的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/913，813，代理人案卷號(hào)62470US002)。在用于擴(kuò)增反應(yīng)之前，可以為擴(kuò)增反應(yīng)而制備樣品(例如生物樣品)中存在的多 核苷酸。用于擴(kuò)增反應(yīng)的多核苷酸的制備方法是本領(lǐng)域所熟知的并且經(jīng)常使用。多核苷酸 可以從生物樣品中提取。提取過程通常包括裂解微生物以釋放多核苷酸。本文所述裂解 是指細(xì)胞膜的物理破壞。提取可通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和試劑來實(shí)現(xiàn)。提取的例子包括(例 如)煮制、蛋白酶水解、超聲波照射、清潔劑、強(qiáng)堿、或有機(jī)溶劑(例如酚氯仿)(Lin等人， 美國專利No. 5，620，852 ；Kellogg等人，美國專利No. 5，010，183)。多核苷酸可以在結(jié)合多 核苷酸的適當(dāng)條件下用粒子(例如磁性玻璃粒)制備，然后洗滌以除去雜質(zhì)，之后通過設(shè)計(jì) 用來移除結(jié)合的多核苷酸的洗滌步驟獲得提純的多核苷酸(MagNAPure，國際專利公開WO 01/37291A1)。在本發(fā)明的方法中用作靶的多核苷酸可以具有任何分子量，并且可以為單鏈形 式、雙鏈形式、環(huán)狀形式和質(zhì)粒形式等。多種類型的多核苷酸可以彼此分離(如RNA與DNA 分離，或雙鏈DNA與單鏈DNA分離)。例如，本發(fā)明的方法中可以使用長度至少約100個(gè)堿 基的多核苷酸，長度為1，000個(gè)堿基至10，000個(gè)堿基的較長分子多核苷酸，甚至多達(dá)約320 萬個(gè)堿基的高分子量核酸。多核苷酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))是用于多核苷酸特定鏈段酶擴(kuò)增的方 法。擴(kuò)增基于以下列基本步驟的反復(fù)循環(huán)使雙鏈多核苷酸變性，然后對(duì)靶多核苷酸進(jìn)行 引物退火，接著利用聚合酶進(jìn)行引物延伸(Mullis等人，美國專利4，683，195 ；Mullis，美國 專利4，683，202 ；以及Mullis等人，美國專利4，800, 159)。引物設(shè)計(jì)用于使DNA的反向鏈 退火，并且其所處位置使得一個(gè)引物的聚合酶催化的延伸產(chǎn)物可以用作另一個(gè)引物的模板
18鏈。擴(kuò)增過程可以導(dǎo)致由引物5'端限定長度的離散多核苷酸片段進(jìn)行指數(shù)增加?！銇碇v，這些步驟在循環(huán)步驟中實(shí)現(xiàn)。DNA擴(kuò)增中使用的典型循環(huán)步驟涉及兩 個(gè)目標(biāo)溫度，從而實(shí)現(xiàn)變性、退火和延伸。第一溫度是在預(yù)定目標(biāo)變性溫度基礎(chǔ)上的增加， 該溫度應(yīng)足夠高，以便將雙鏈靶多核苷酸分離為單鏈。一般來講，循環(huán)步驟的目標(biāo)變性溫度 為大約92°C至98°C (例如94°C至96°C )，并且反應(yīng)在該溫度下保持0秒至5分鐘。然后 使反應(yīng)混合物的溫度降至第二目標(biāo)溫度。第二目標(biāo)溫度使引物(以及探針(如果有))退 火或與單鏈DNA雜交，并且利用DNA聚合酶促進(jìn)延伸產(chǎn)物的合成。一般來講，循環(huán)步驟的第 二溫度為大約57°C至63°C (例如59°C至61°C )，并且反應(yīng)在該溫度下保持0秒至1分鐘。 第二溫度會(huì)根據(jù)所用的引物(以及探針(如果有))和靶多核苷酸而有很大不同。這樣就 完成了一個(gè)循環(huán)步驟。然后將反應(yīng)混合物的溫度升高至變性溫度，以進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。通 常，通過重復(fù)循環(huán)過程可以得到所需結(jié)果，該結(jié)果可以是制備一定量的DNA和/或檢測(cè)擴(kuò)增 產(chǎn)物。當(dāng)用于檢測(cè)時(shí)，循環(huán)步驟的次數(shù)將取決于樣品的性質(zhì)。例如，如果樣品為多核苷酸的 復(fù)雜混合物，可能需要更多的循環(huán)步驟，以將靶多核苷酸擴(kuò)增到足以進(jìn)行檢測(cè)。一般來講， 循環(huán)步驟重復(fù)至少約20次，但可以重復(fù)多達(dá)40、60或甚至100次。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以 上有關(guān)熱循環(huán)反應(yīng)的描述只是為了舉例說明，因此溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)可以根據(jù)熱循環(huán) 反應(yīng)和應(yīng)用的性質(zhì)而變化。可任選地，循環(huán)步驟中還可以使用第三溫度。使用三個(gè)目標(biāo)溫度也會(huì)導(dǎo)致變性、退 火和延伸，但變性、退火和延伸使用不同的目標(biāo)溫度。當(dāng)使用三個(gè)目標(biāo)溫度時(shí)，根據(jù)應(yīng)用情 況，退火溫度通常在從45°C至60°C的范圍內(nèi)。用于延伸的第三目標(biāo)溫度通常保持30秒至 10分鐘，并且處于退火溫度和變性溫度之間的溫度范圍。本發(fā)明的方法和組合物中使用的DNA聚合酶能夠按照本發(fā)明的方法影響引物的 延伸。因此，優(yōu)選的聚合酶是能夠沿靶多核苷酸延伸引物的聚合酶。優(yōu)選地，聚合酶具有熱 穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定聚合酶是在受熱情況下保持穩(wěn)定的聚合酶，即在足以使雙鏈模板核酸變性 的所需時(shí)間內(nèi)經(jīng)受高溫時(shí)，聚合酶能夠促進(jìn)與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的形成，并且不會(huì) 發(fā)生不可逆的變性。可用的熱穩(wěn)定聚合酶是熟知的并且經(jīng)常使用。人們已經(jīng)從黃棲熱菌、 紅色棲熱菌、嗜熱棲熱菌、水生棲熱菌、乳棲熱菌、淡紅棲熱菌、嗜熱酯肪芽孢桿菌和熾熱甲 烷嗜熱菌中分離出熱穩(wěn)定聚合酶。聚合酶通常在退火到靶多核苷酸的引物的3'端處引發(fā)合成，并且在5'方向沿 靶多核苷酸進(jìn)行合成。聚合酶可以具有5'至3'核酸外切酶活性，并且水解中間退火的探 針(如果有)，以便釋放探針的一部分，直至合成結(jié)束。具有5'至3'核酸外切酶活性的適 當(dāng)聚合酶的例子包括(例如)Tfi、Taq和FastStart Taq(Roche)。在其他方面，聚合酶具 有很少或不具有5'至3'核酸外切酶活性，從而使引物降解、終止或引物延伸多核苷酸最 小化。該核酸外切酶活性可以取決于多個(gè)因素，例如PH值、鹽濃度、靶是否為雙鏈或單鏈等 等，所有這些因素都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。具有很少或不具有5'至3'核酸外切酶活 性的適當(dāng)聚合酶的例子包括Klentaq (Sigma，St. Louis, MO)。通常，擴(kuò)增涉及將一種或多種靶多核苷酸混合，這些靶多核苷酸可以具有不同序 列，并且具有包含反應(yīng)組分的“主混合物”，以便進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并且使反應(yīng)混合物處于允 許靶多核苷酸擴(kuò)增的溫度條件下。主混合物內(nèi)的反應(yīng)組分可以包括用來調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物 PH值的緩沖液、鎂離子、用來提供擴(kuò)增產(chǎn)物合成所需能量和核苷的一種或多種天然核苷酸(與腺嘌呤、胞核嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶相對(duì)應(yīng)，常常以相同濃度存在)、與靶結(jié) 合以有利于引發(fā)多核苷酸合成的引物對(duì)、將核苷酸添加到被合成的互補(bǔ)鏈上的聚合酶、以 及可任選地一種或多種探針。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然本發(fā)明的方法不要求使 用靶多核苷酸，但在沒有靶多核苷酸的情況下，擴(kuò)增反應(yīng)無法順利進(jìn)行?？梢詸z測(cè)是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，并且可以測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的量。可以通過本領(lǐng)域已知 的常用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)可以在(例如)完成多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)之后進(jìn)行，或在每個(gè) 擴(kuò)增循環(huán)過程中(通常稱之為實(shí)時(shí))進(jìn)行。通過(例如)在凝膠上溶解擴(kuò)增產(chǎn)物并確定是 否存在所期望的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以很容易地在完成多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)之后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。為了有 利于實(shí)時(shí)檢測(cè)或量化擴(kuò)增產(chǎn)物，可以對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中使用的一種或多種引物和/或探針進(jìn)行 標(biāo)記，并且存在多種形式的標(biāo)記可用于生成能夠指示擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在的可檢測(cè)信號(hào)。最 方便的標(biāo)記通常為熒光標(biāo)記，該標(biāo)記可以通過多種形式使用，包括(但不限于)使用供體熒 光團(tuán)標(biāo)記、受體熒光團(tuán)標(biāo)記、熒光團(tuán)、淬滅物、以及它們的組合。使用多種形式的分析類型可 以包括使用被標(biāo)記的一種或多種引物(例如，蝎形引物、amplifluor引物)、被標(biāo)記的一種 或多種探針(例如，相鄰探針、Taqman探針、light-up探針、分子信標(biāo))、或它們的組合。技 術(shù)人員將會(huì)理解，除了這些已知形式外，通常也公開了新的標(biāo)記形式。本發(fā)明并不局限于用 于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法的類型或探針和/或引物的類型。通過使用合適的標(biāo)記(例如，不 同的熒光團(tuán))，可以將若干不同引物對(duì)(以及可任選的探針(如果有))在單個(gè)反應(yīng)中的結(jié) 果組合(疊加)在一起。作為使用被標(biāo)記的引物和/或探針進(jìn)行檢測(cè)的替代方法，可以使用多核苷酸結(jié)合 染料(例如熒光DNA結(jié)合染料)來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣的例子包括(例如)SYBRGreen或 SYBRGold (Molecular Probes) 0與雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物相互作用之后，這類多核苷酸結(jié)合染料在 用適當(dāng)波長的光激發(fā)后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。還可以使用諸如多核苷酸插入染料之類的多核苷 酸結(jié)合染料。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，可以添加對(duì)照物。使用(例如)對(duì)照引物和對(duì)照探針可以從陽 性對(duì)照樣品(如，除vanA或vanB之外的靶多核苷酸)擴(kuò)增對(duì)照靶多核苷酸。陽性對(duì)照樣 品還可以用于擴(kuò)增靶vanA或vanB多核苷酸。這類對(duì)照物可以內(nèi)部擴(kuò)增(例如，在每個(gè)擴(kuò) 增反應(yīng)內(nèi))或在與受試者樣品并排運(yùn)行的單獨(dú)樣品內(nèi)擴(kuò)增。每次運(yùn)行也可以包括(例如) 缺少靶vanA或vanB多核苷酸的陰性對(duì)照物。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于用來進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的裝置。例如，合適的 裝置可以包括常規(guī)擴(kuò)增裝置，例如Lightcycler _ 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Lightcycler Real-Time PCR System(Roche))(猶他大學(xué)研究基金會(huì)，國際專利公開No. WO 97/46707、WO 97/46714 和 W097/46712)、MX3005p (Stratagene, La Jolla, CA)、以及可得自 Bio-Rad 的擴(kuò)增裝 置。優(yōu)選地，本發(fā)明可以結(jié)合微流裝置進(jìn)行。“微流裝置”是指這樣的裝置該裝置的一 個(gè)或多個(gè)流體通道、室或?qū)Ч芫哂兄辽僖粋€(gè)小于500 μ m,并且通常在0. 1 μ m和500 μ m 之間的內(nèi)部橫截面尺寸(如深度、寬度、長度、直徑等)。通常，微流裝置包括多個(gè)室(如 擴(kuò)增反應(yīng)室、加料室等)，每個(gè)室都限定了用于容納樣品的一定體積?？赡苓m合的微流裝 置的一些例子在下列文獻(xiàn)中有所描述美國專利申請(qǐng)公開No. 2002/0064885 (Bedingham 等人)；US2002/0048533(Bedingham 等人)；US2002/0047003(Bedingham 等人)；禾口 US2003/138779 (Parthasarathy 等人)；以及美國專利 No. 6，627，159 (Bedingham 等人)；
206, 720, 187 (Bedingham 等人)；6，734, 401 (Bedingham 等人)；6，814, 935 (Harms 等人)； 6, 987, 253 (Bedingham 等人)；7，026, 168 (Bedingham 等人)；和 7，164, 107 (Bedingham 等 人)。本發(fā)明還包括用于分離(優(yōu)選地提純)多核苷酸的方法。本發(fā)明在這方面的方法 通常包括提供包含單鏈多核苷酸的混合物，在適于寡核苷酸特異性雜交至單鏈多核苷酸以 形成雜交體的條件下，將混合物暴露于本發(fā)明的寡核苷酸中，以及將雜交體與未雜交的單 鏈多核苷酸分離。在擴(kuò)增耐藥腸球菌中存在的靶多核苷酸之前，可以用該方法制備樣品?；旌衔锟梢缘米詷悠?，優(yōu)選地為生物樣品。通常，樣品可以包含耐藥微生物，優(yōu)選 地為腸球菌?？梢园凑丈鲜鎏崛》椒ㄖ苽湟蛛x的樣品?；旌衔飪?nèi)的多核苷酸可以不純凈 (例如，存在其他多孔材料和/或固體碎屑)、部分純凈或經(jīng)過提純?；旌衔飪?nèi)的多核苷酸 可以通過已知的常規(guī)方法變性。這類方法的例子包括(例如)加熱或暴露在堿性環(huán)境中。在適于寡核苷酸和互補(bǔ)的單鏈多核苷酸特異性雜交的條件下將單鏈多核苷酸的 混合物暴露在本發(fā)明的寡核苷酸中。寡核苷酸通常包含標(biāo)記，優(yōu)選的是親和標(biāo)記。尤其可 用的常規(guī)雜交形式包括將寡核苷酸固定在固體載體(固相雜交)上的形式和多核苷酸(單 鏈多核苷酸和寡核苷酸)均處于溶液中(溶液雜交)的形式。在固相雜交形式中，寡核苷酸通常在雜交前連接至固相材料上。在溶液雜交形式 中，寡核苷酸通常在雜交后連接至固相材料上。在兩種形式中，連接通過連接到寡核苷酸的 標(biāo)記(優(yōu)選地為親和標(biāo)記)介導(dǎo)。可用的固相材料的例子包括(例如)聚烯烴、聚苯乙烯、 尼龍、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多糖和氟化聚合物、以及樹脂(例如瓊脂糖、乳膠、 纖維素和葡聚糖)。固體材料可以為任何形式，優(yōu)選地為顆粒物質(zhì)形式(如粒子、小珠、微 珠、微球)或可以引入微流裝置的任何其他形式(如原絲)(Parthasarathy，提交于2007年 4月25日的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/913，813，代理人案卷號(hào)62470US002)。雜交在適當(dāng)?shù)臈l件下(如嚴(yán)格的雜交條件)進(jìn)行，在該條件下可以將被標(biāo)記的寡 核苷酸選擇性地結(jié)合到混合物中存在的基本上互補(bǔ)(優(yōu)選地為互補(bǔ))的單鏈多核苷酸上。 用于雜交反應(yīng)和探針合成的一般方法在T.Maniatis，Ε. F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring HarborLaboratory, 1982 (Τ. Maniatis、E. F. Fritsch禾口 J. Sambrook,分子克隆，Cold Spring Harbor Laboratory，1982年)中有所公開。優(yōu)選地，雜交條件包括使用雜交緩沖液 (例如，6x SSC、5x Denhardt 試劑，0· 5% (w/v) SDS)和封閉劑(例如 100 μ g/ml 鮭魚精)。 雜交可以在68°C下進(jìn)行至少2小時(shí)。雜交(以及連接被標(biāo)記的寡核苷酸(如果有))之后， 可以于室溫下在含有2x SSC和0. 5% SDS的溶液中洗滌多次，以除去未雜交的多核苷酸和 可能存在的任何其他材料?？扇芜x地，可以通過下列方式提純分離的多核苷酸使雜交體變 性以釋放分離的多肽，并且移除結(jié)合的寡核苷酸和固體載體。試劑盒本發(fā)明提供了試劑盒，該試劑盒可以包括本發(fā)明的寡核苷酸，例如引物對(duì)和(可 任選地)探針。本發(fā)明的試劑盒內(nèi)可以包括的其他組分包括常規(guī)試劑，例如，主混合物、固 相載體、雜交溶液、外部陽性或陰性對(duì)照物等。試劑盒通常包括包裝材料，即用來容納試劑盒的內(nèi)容物的一個(gè)或多個(gè)物理結(jié)構(gòu)。 包裝材料可以通過熟知的方法構(gòu)造，優(yōu)選地提供無菌、無污染物的環(huán)境。包裝材料可以具有 表明試劑盒內(nèi)容物的標(biāo)記。此外，試劑盒具有說明書，以描述試劑盒內(nèi)的材料的使用方法。
21如本文所用，術(shù)語“包裝”是指固體基體或材料，例如玻璃、塑料、紙張、包裝箔等?！罢f明書”通常具有明確的表述，說明本發(fā)明的多種方法，包括樣品制備條件、擴(kuò)增 條件等等。本發(fā)明通過以下實(shí)例進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解，具體的實(shí)例、材料、數(shù)量和步驟應(yīng)結(jié)合 本文所述的本發(fā)明的范圍和精神進(jìn)行廣義地解釋。SM實(shí)例1糊,雜剛■禾口滯·口口口vanA 禾口 vanB ■用于辨識(shí)耐糖肽基因的基于核酸的檢測(cè)方法可以在分析中使用，以判斷樣品是否 包含在用糖肽抗生素處理之后能夠存活的微生物。在該實(shí)例中，利用引物和探針檢測(cè)屎腸 球菌(ATCC 700221, Manassas VA)和糞腸球菌(ATCC 700802, Manassas VA)(也稱為耐萬 古霉素腸球菌(VRE))中的vanA和vanB基因。將VRE劃線培養(yǎng)在血液瓊脂介質(zhì)上，并且在37°C下培養(yǎng)20小時(shí)。通過在TE緩 沖液(IOmM Tris HCl, ImM EDTA, pH 8.0)內(nèi)稀釋新生物制備細(xì)胞懸浮液，懸浮液的濁度為 0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于大約IXlO8菌落形成單位/毫升(CFU/mL)。按照制造商說明， 使用 MagNA PureLC DNA 分離試劑盒 III (細(xì)菌、真菌)(MagNA Pure LC DNA IsolationKit III (Bacteria，F(xiàn)ungi))套裝在MagNA Pure LC系統(tǒng)上提取和分離一百微升該細(xì)胞懸浮液 (儀器和試劑可得自Roche, Indianapolis, IN)。引物和探針由 Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ)合成。分別使用 6_羧基-4' ,5' -二氯-2' ,7' -二甲氧基熒光素(JOE)和BHQ(黑洞淬滅物，Integrated DNA Technologies，Coralville，ΙΑ)在 5'-禾 -位置雙重標(biāo)記 vanA 探針序列 5 ‘ AC TGCAGCCTGATTTGGTCCACCTCGCCA (SEQ ID NO :3)。分別使用 6-羧基熒光素(FAM)和 BHQ 在 5'-禾口 3‘-位置雙重標(biāo)記 vanB 探針序列 5‘ TCCCATGACCGCGCAGCCGACCTCA(SEQ ID NO
6)。引物和探針序列在表1中列出。
權(quán)利要求
1.一種用于在生物樣品內(nèi)檢測(cè)耐藥微生物的方法，包括擴(kuò)增生物樣品內(nèi)存在的靶多核苷酸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述靶多核苷酸與所述耐藥 微生物對(duì)萬古霉素的耐藥性相關(guān)，其中擴(kuò)增包括至少一個(gè)循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括在 合適條件下使所述生物樣品與第一引物和第二引物接觸以生成所述擴(kuò)增產(chǎn)物，并且在合適 條件下使所述擴(kuò)增產(chǎn)物與探針接觸，以使所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并且其中所述探 針的Tm比所述第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C ；以及檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述生物樣品內(nèi)存在耐藥微生物。
2.一種用于在生物樣品內(nèi)檢測(cè)耐藥微生物的方法，包括擴(kuò)增生物樣品內(nèi)存在的靶多核苷酸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中使所述生物樣品在合適條件 下與第一 vanA引物和第二 vanA引物接觸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述第一引物包含與SEQ ID NO :1具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO 2具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :7的核苷酸 648-751 ；以及檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述生物樣品內(nèi)存在耐藥微生物。
3.一種用于在生物樣品內(nèi)檢測(cè)耐藥微生物的方法，包括擴(kuò)增生物樣品內(nèi)存在的靶多核苷酸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中使所述生物樣品在合適條件 下與第一 vanB引物和第二 vanB引物接觸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述第一引物包含與SEQ ID NO :4具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO 5具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :8的核苷酸 492-630 ；以及檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述生物樣品內(nèi)存在耐藥微生物。
4.一種用于檢測(cè)生物樣品內(nèi)不存在耐藥微生物的方法，包括使生物樣品與探針、第一引物和第二引物接觸以形成混合物，其中所述引物能夠擴(kuò)增 與微生物對(duì)萬古霉素的耐藥性相關(guān)的靶多核苷酸，其中所述探針將與所述靶多核苷酸雜 交，并且其中所述探針的Tm比所述第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C ；如果所述生物樣品內(nèi)存在與耐藥性相關(guān)的所述靶多核苷酸，則將所述混合物暴露于適 于形成擴(kuò)增產(chǎn)物的條件下；以及檢測(cè)不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物表明所述生物樣品內(nèi)不存在耐藥 微生物。
5.一種用于檢測(cè)生物樣品內(nèi)不存在耐藥微生物的方法，包括使生物樣品與第一 vanA引物和第二 vanA引物接觸以形成混合物，其中所述第一引物 包含與SEQ ID NO :1具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與 SEQ ID NO :2具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO 7 的核苷酸648-751 ；如果所述生物樣品內(nèi)存在vanA多核苷酸，則將所述混合物暴露于適于形成擴(kuò)增產(chǎn)物 的條件下；以及檢測(cè)不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物表明所述生物樣品內(nèi)不存在耐藥 微生物。
6.一種用于檢測(cè)生物樣品內(nèi)不存在耐藥微生物的方法，包括使生物樣品與第一 vanB引物和第二 vanB引物接觸以形成混合物，其中所述第一引物 包含與SEQ ID NO :4具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述 第二引物包含與 SEQ ID NO :5具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO 8 的核苷酸492-630 ；如果所述生物樣品內(nèi)存在vanA多核苷酸，則將所述混合物暴露于適于形成擴(kuò)增產(chǎn)物 的條件下；以及檢測(cè)不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中不存在所述擴(kuò)增產(chǎn)物表明所述生物樣品內(nèi)不存在耐藥 微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述微生物為腸球菌屬 (Enterococcus)的成員。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述腸球菌屬的所述成員為糞腸球菌 (E. faecalis) 0
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸為vanA多核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一引物包含與SEQIDNO :1具有至少約 80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO :2具有至少約80%的同 一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :7的核苷酸648-751。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第一引物包含SEQIDN0:1，并且所述第二 引物包含SEQ ID NO :2ο
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述探針包含與SEQIDNO :3具有至少約80%的 同一性的核苷酸序列，并且雜交至SEQ IDNO :7。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸為vanB多核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一引物包含與SEQIDNO :4具有至少約 80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO :5具有至少約80%的同 一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :8的核苷酸492-630。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一引物包含SEQIDNO :4，并且所述第二 引物包含SEQ ID NO :5ο
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述探針包含與SEQIDNO :6具有至少約80% 的同一性的核苷酸序列，并且雜交至SEQ IDNO :8。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，還包括第二探針，其中所述第二探針的Tm比所述 第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中一個(gè)探針包含供體熒光團(tuán)，所述第二探針包含 受體熒光團(tuán)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述生物樣品來自疑似感染耐藥微 生物的個(gè)體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述生物樣品包括糞便物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，還包括獲得所述生物樣品。
22.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述檢測(cè)是在每個(gè)循環(huán)步驟之后進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求2、4或10所述的方法，其中所述第一vanA引物包含SEQ ID NO!,并且所述第二 vanA引物包含SEQ ID NO :2。
24.根據(jù)權(quán)利要求3、6或14所述的方法，其中所述第一vanB引物包含SEQ ID NO :4， 并且所述第二 vanB引物包含SEQ ID NO :5。
25.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述擴(kuò)增還包括使所述生物樣品與探針接 觸，其中所述探針的Tm比所述第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C。
26.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述擴(kuò)增還包括使所述生物樣品與探針接觸以 形成混合物，所述混合物包含所述第一 vanA引物、所述第二 vanA引物和所述探針，其中所 述探針的Tm比所述第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C。
27.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述擴(kuò)增還包括使所述生物樣品與探針接觸以 形成混合物，所述混合物包含所述第一 vanB引物、所述第二 vanB引物和所述探針，其中所 述探針的Tm比所述第一引物和所述第二引物的Tm高至少8°C。
28.根據(jù)權(quán)利要求1、4、25、26或27所述的方法，其中所述探針包含熒光團(tuán)和淬滅物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述檢測(cè)包括檢測(cè)熒光團(tuán)。
30.根據(jù)權(quán)利要求1、4、25、26或27所述的方法，其中所述擴(kuò)增包括含有5'至3'核酸 外切酶活性的DNA聚合酶。
31.一種分離多核苷酸的方法，包括 提供包含單鏈多核苷酸的混合物；在適于使所述寡核苷酸特異性雜交至單鏈多核苷酸的條件下，將所述混合物暴露于寡 核苷酸，從而生成雜交體，其中所述寡核苷酸包含選自以下的核苷酸序列與SEQ ID NO 1 具有至少約80%的同一性的核苷酸序列、與SEQ ID NO :2具有至少約80%的同一性的核苷 酸序列、與SEQ ID NO 3具有至少約80%的同一性的核苷酸序列、與SEQ IDNO 4具有至少 約80%的同一性的核苷酸序列、與SEQ ID NO :5具有至少約80%的同一性的核苷酸序列、 或與SEQ ID NO :6具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且其中所述寡核苷酸包含親 和標(biāo)記；以及洗滌所述雜交體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，還包括在所述暴露后使所述寡核苷酸連接至固相材料。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中在所述暴露前使所述寡核苷酸連接至固相材料。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述混合物得自生物樣品。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述生物樣品包括糞便物。
36.一種試劑盒，包括包裝材料、第一 vanA引物、第二 vanA引物和探針，其中所述探針 的Tm比所述第一和第二 vanA引物的Tm高至少8°C。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述探針包含與SEQIDNO :3具有至少約 80%的同一性的核苷酸序列，并且雜交至SEQ IDNO :7。
38.一種試劑盒，包括包裝材料、第一 vanB引物、第二 vanB引物和探針，其中所述探針 的Tm比所述第一和第二 vanB引物的Tm高至少8°C。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述探針包含與SEQIDNO :6具有至少約 80%的同一性的核苷酸序列，并且雜交至SEQ IDNO :8。
40.根據(jù)權(quán)利要求36或38所述的試劑盒，其中所述探針包含熒光團(tuán)和淬滅物。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述第一引物包含SEQIDN0:1，并且所述第 二引物包含SEQ ID NO :2ο
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述第一引物包含SEQIDNO :4，并且所述第 二引物包含SEQ ID NO :5ο
43.一種試劑盒，包括包裝材料、第一vanA引物和第二vanA引物，其中所述第一引物包 含與SEQ ID NO :1具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO :2具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :7的核 苷酸 648-751。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述第一引物包含SEQIDN0:1，并且所述第 二引物包含SEQ ID NO :2ο
45.一種試劑盒，包括包裝材料、第一 vanB弓丨物和第二 vanB引物，其中所述第一弓I物包 含與SEQ ID NO :4具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含與SEQ ID NO :5具有至少約80%的同一性的核苷酸序列，其中所述引物對(duì)擴(kuò)增SEQ ID NO :8的核 苷酸 492-630。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的試劑盒，其中所述第一引物包含SEQIDNO :4，并且所述第 二引物包含SEQ ID NO :5ο
47.一種分離的多核苷酸，包含與SEQ ID NO :1具有至少約80%的同一性的核苷酸 序列，其中所述多核苷酸在與SEQ ID NO :2—起使用時(shí)擴(kuò)增包含SEQ ID NO :7的核苷酸 648-751的多核苷酸。
48.一種分離的多核苷酸，包含與SEQ ID NO :2具有至少約80%的同一性的核苷酸 序列，其中所述多核苷酸在與SEQ ID NO :1—起使用時(shí)擴(kuò)增包含SEQ ID NO :7的核苷酸 648-751的多核苷酸。
49.一種分離的多核苷酸，包含與SEQ ID NO :4具有至少約80%的同一性的核苷酸 序列，其中所述多核苷酸在與SEQ ID NO :5—起使用時(shí)擴(kuò)增包含SEQ ID NO :8的核苷酸 492-630的多核苷酸，從而生成約139個(gè)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
50.一種分離的多核苷酸，包含與SEQ ID NO :5具有至少約80%的同一性的核苷酸 序列，其中所述多核苷酸在與SEQ ID NO :4—起使用時(shí)擴(kuò)增包含SEQ ID NO :8的核苷酸 492-630的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在樣品中檢測(cè)耐藥微生物(例如耐萬古霉素腸球菌屬)的方法和寡核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102007222SQ200880103884
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2008年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月13日
發(fā)明者拉尼亞寧·V·帕塔薩拉蒂, 熙-周·C·劉, 耶西·D·米勒 申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司