專利名稱：糖基化譜分析的制作方法
糖基化譜分析 本發(fā)明涉及重組蛋白及其產(chǎn)生的領域。更具體地，本發(fā)明涉及用于測定重組產(chǎn)生 的多肽(如抗體)的糖基化譜(glycosylation profile)的方法，以及用于產(chǎn)生糖基化多 肽的方法，其中在發(fā)酵過程中測定糖基化譜。
背景技術：
多肽的糖基化譜對于許多重組產(chǎn)生的治療性多肽而言是一個重要的特征。糖基化 多肽(也稱為糖蛋白)在真核生物(如人)和一些原核生物中介導許多重要功能，包括催 化、信號發(fā)放、細胞間通信、激活免疫系統(tǒng)以及分子識別和聯(lián)合。它們組成了真核生物中的 大部分非胞質(zhì)蛋白(Lis，H.等，Eur. J.BiOChem.218(1993)l-27)。糖蛋白上寡糖的形成/ 附著是翻譯中及翻譯后的修飾，因此不受遺傳控制。寡糖的生物合成是多步驟過程，涉及彼 此競爭底物的多種酶。因此，糖基化多肽包含寡糖的微不均一性的排列，產(chǎn)生含有相同氨基 酸骨架的一組不同的糖形。 共價結合的寡糖確實影響相應多肽的物理穩(wěn)定性、折疊、對蛋白酶攻擊的抗性、 與免疫系統(tǒng)的相互作用、生物活性和藥代動力學情況。此外，一些糖形具有抗原性，促使 監(jiān)管機構需要對重組糖基化多肽的寡糖結構進行分析(參閱如Paulson, J.C. ， Trends Biochem. Sci. 14(1989)272-276 ;Jenkins, N.等，Nature Biotech. 14(1998)975-981)。例 如，已經(jīng)報道，糖基化多肽的末端唾液酸化提高了治療劑的血清半衰期，而包含具有末端半 乳糖殘基之寡糖結構的糖基化多肽顯示從循環(huán)中的清除被提高(Smith, P.L.等，J.Biol. Chem. 268(1993)795-802)。因此，在治療性多肽(如免疫球蛋白)的生物技術產(chǎn)生中，對寡 糖微不均一性性及其批次間一致性的評估是一個重要的任務。 單克隆抗體(mAb)是增長最迅速的一類蛋白質(zhì)治療劑。在2005年，共有31中基 于mAb的產(chǎn)品被批準用于人類治療，例如用于治療癌癥、自身免疫和炎性疾病，或用于體內(nèi) 診斷，還有許多正在進行臨床試驗(Walsh，G. ， Trends Biotechnol. 23 (2005) 553-558)?？?體在其糖基化模式上與其他重組多肽具有顯著差異。例如，免疫球蛋白G(IgG)是對稱的多 功能糖基化多肽，分子量約150kDa，由負責抗原結合的兩個相同的Fab部分和用于效應子 功能的Fc部分組成。在IgG分子中糖基化通常在297位Asn處高度保守，其位于Fc重鏈的 CH2結構域之間，與CH2中的氨基酸殘基形成廣泛接觸(Sutton和Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132) 。 297位Asn連接的寡糖結構被不均一地加工，使得IgG存在多種 糖形。變異存在于297位Asn位點的位點占據(jù)(宏觀不均一性)或糖基化位點寡糖結構的變 化中(微不均一性性)，參閱如Jenkins,N.等，Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981 。 一 般而言，IgG mAb中更豐富的寡糖基團是脫唾液酸的雙觸角復合型聚糖，主要是未半乳糖基 化(agalactosylated，GO)、單半乳糖基化(Gl)或二半乳糖基化(G2)型(Jefferis，R.等， Immunol. Lett. 68(1998)47-52)。 與Fc區(qū)結合的寡糖不僅影響物理化學特性(例如結構完整性)并使蛋白酶 抗性消除或最小化，而且還是效應子功能(如補體結合、與噬菌體Fc受體結合、迅速從 循環(huán)中清除抗原-抗體復合體以及誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC))所必須的(Cox，K.M.等，Nature Biotechnol. 24(2006) 1591-1597 ;Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。由于不同的糖形可與不同的生物學特性相關， 因此，富集特定糖形的能力可用于例如闡明特定糖形與特定生物功能之間的關系。因 此，非常需要產(chǎn)生富含特定糖形的糖基化多肽組合物。已進行了許多研究來了解環(huán)境 因素和培養(yǎng)條件對蛋白質(zhì)糖基化及蛋白質(zhì)糖基化譜的影響。已經(jīng)報道，培養(yǎng)變量例 如溶解氧濃度(Kunkel， J. p.等，J. Biotechnol. 62(1998)55-71)、單糖可用性的變化 (Tachibana， H.等，Cytotechnology 16 (1994) 151-157)、胞內(nèi)核苷酸糖的可用性(Hills, A.E.等，Biotech. Bioeng. 75(2001)239-251)、銨濃度(Gawlitzek， M.等，Biotech. Bioeng. 68(2000)637-646)、血清濃度(Parekh， R. B.等，Biochem. J. 285 (1992)839-845 ; Serrato， J. A.等，Biotechnol. A加l. Biochem. 47 (2007) 113-124)和生長速率(Robinson, D. K.等，Biotech. Bioeng. 44 (1994) 727-735)導致糖基化譜的差異。 產(chǎn)生治療用途的糖基化多肽時最常用的是中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)。這些細 胞產(chǎn)生確定的糖基化譜，并允許產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的高生產(chǎn)力細胞系。此外，它們可以高細胞密 度在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以產(chǎn)生安全且可再現(xiàn)的生物過程。在鏈烷酸存在下，CHO細胞中 所表達的糖基化多肽的N-乙酰葡糖胺含量和類型受溫度和摩爾滲透壓濃度的影響(參閱 如US 5， 705， 364)。在美國專利申請2003/0190710中還報道，僅對溫度和摩爾滲透壓濃度 進行調(diào)整就可改變CH0細胞培養(yǎng)物中IgG糖基化重鏈變體的水平。 已經(jīng)使用高效陰離子交換層析-脈沖安培檢測法(HPAEC)和襯質(zhì)輔助激光解吸與 電離-飛行時間質(zhì)譜術(MALDI-T0F MS)來分析糖基化多肽的糖類部分(參閱如Fukuda， M.(編 著)Glycobiology :A PracticalApproach， IRL Press, Oxford ;Morelle， W. 禾口 Michalsky， J. C. ， Curr. Pharmaceut. Design 11(2005)2615-2645)。 Hoffstetter-Kuhn， S.等(Electrophoresis 17(1996)418-422)使用毛細管電泳和MALDI-T0F MS分析在用 N-糖苷酶F(PNGase F)使抗體去糖基化后分析單克隆抗體寡糖介導的不均一性譜。
鑒于糖基化對重組糖基化多肽功能特性的重要性以及對充分限定且一致的產(chǎn)品 生產(chǎn)過程的需要，非常需要在發(fā)酵過程中對重組產(chǎn)生的糖基化多肽的糖基化譜進行在線或 離線(ad-line)分析。P即ac， D.I.等(Glycobiol. 8 (1998) 445-454)報道了這樣的方法， 其包括將糖基化多肽固定在聚偏氟乙烯膜上、酶消化以及糖基化譜的MALDI-T0F MS分析。 Bailey，M.等，J. Chromat. 826(2005) 177-187報道了對重組產(chǎn)生mAb的分析和分子表征，其
包括若干層析步驟。
發(fā)明概述 本發(fā)明的一個目的是提供在發(fā)酵過程中對重組產(chǎn)生的糖基化多肽的糖基化譜進
行在線分析，以獲得具有所需糖基化譜的所述重組產(chǎn)生多肽的方法。 本發(fā)明的一個方面是重組產(chǎn)生糖基化異源多肽的方法，其包括以下步驟 (A)提供含有編碼所述異源多肽之核酸的細胞， (B)在適于表達所述異源多肽的確定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)(A)的細胞， (C)從培養(yǎng)基中獲得樣品， (D)使所述樣品與磁性親和珠在適于所述異源多肽與該珠結合的條件下接觸，
(E)從與該磁性親和珠結合的異源多肽中釋放聚糖，而不釋放所述異源多肽，
(F)純化(E)中釋放的聚糖，
(G)通過分析(F)釋放和純化聚糖來測定所述異源多肽的糖基化譜， (H)將所測定的糖基化譜與參照糖基化譜進行比較， (I)根據(jù)步驟(H)所得結果調(diào)整培養(yǎng)條件，任選地繼續(xù)培養(yǎng)，禾口 (J)重復步驟(C)至(H)，以獲得糖基化的異源多肽， (K)從所述培養(yǎng)基或細胞中回收糖基化多肽。 在一個實施方案中，所述糖基化異源多肽是免疫球蛋白，優(yōu)選是單克隆免疫球蛋 白。在另一實施方案中，在步驟(D)中使用與磁性親和珠結合的A蛋白、G蛋白或L蛋白作 為選擇性結合免疫球蛋白的親和配體。根據(jù)另一實施方案，在步驟(E)中以酶促或化學方 式(如肼解)釋放聚糖。在一個實施方案中，通過用N-糖苷酶處理來釋放聚糖。在另一實 施方案中，在步驟(F)中通過反相層析或陽離子交換或其組合來純化聚糖。在另一實施方 案中，在步驟(G)中，通過MALDI-TOF MS分析或定量HPLC分離來測定步驟(E)中所得純化 聚糖的糖基化譜。在另一實施方案中，步驟(D)至(G)使用微量滴定板以高通量方式進行。 在另一實施方案中，步驟(I)中的培養(yǎng)條件調(diào)整包括改變(i)養(yǎng)分、糖類、添加劑、緩沖化合 物、銨或溶解氧中一種或多種的濃度，或(ii)摩爾滲透壓濃度、pH值、溫度或細胞密度，或 (iii)生長狀態(tài)。在一個實施方案中，在步驟(K)后對所述異源多肽進行純化該異源多肽的 步驟(U。在另一實施方案中，所述異源多肽分泌到培養(yǎng)基中。 本發(fā)明的第二方面是提供適于測定和/或定量糖基化標志物的方法，其包括以下 步驟 (A)使含有糖基化多肽的樣品接觸磁性親和珠， (B)從親和結合的糖基化多肽中釋放聚糖，而不釋放該糖基化多肽， (C)純化所釋放的聚糖， (D)測定所述糖基化標志物的量，禾口 (E)將該糖基化標志物的量與參照量進行比較。 在一個實施方案中，所述樣品是受試者(優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人，更優(yōu)選患者) 的樣品。在另一實施方案中，該方法在步驟(A)之前包括步驟(A-l)通過應用一種或多種 層析柱并回收糖基化異源多肽來處理得自受試者的樣品。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了重組產(chǎn)生具有期望的糖基化譜的糖基化異源免疫球蛋白的方法，其 包括以下步驟 (A)提供轉(zhuǎn)染有核酸的哺乳動物細胞，所述核酸包含編碼所述異源免疫球蛋白的 另一核酸， (B)在適于以糖基化形式表達所述另一核酸編碼的異源免疫球蛋白的條件下培養(yǎng) 步驟(A)的哺乳動物細胞， (C)從含有糖基化異源免疫球蛋白的培養(yǎng)物中獲得樣品， (D)使步驟(C)的樣品與磁性親和珠在適于所述糖基化異源免疫球蛋白與該珠結 合的條件下相接觸，所述磁性親和珠結合有A蛋白、G蛋白或L蛋白， (E)從結合的異源免疫球蛋白中獲得聚糖，而不從所述磁性親和珠上釋放異源免 疫球蛋白， (F)純化步驟(E)中獲得的聚糖，
(G)通過測定步驟(F)中純化聚糖的結構和組成來測定所述異源免疫球蛋白的糖 基化譜， (H)將步驟(G)測得的糖基化譜與參照糖基化譜進行比較，
(I)根據(jù)步驟(H)所得結果調(diào)整培養(yǎng)條件，禾口
(J)如果繼續(xù)培養(yǎng)，則重復步驟(C)至(H)，或 (K)從細胞或培養(yǎng)基中回收具有期望的糖基化譜的糖基化異源多肽。
意想不到地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法能夠?qū)ι锛庸卧?bioprocess unit)操作進 行在線跟蹤和調(diào)整，以影響在獲得樣品的同一培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的異源多肽的糖基化譜。這 是很重要的，例如對于重組產(chǎn)生免疫球蛋白的產(chǎn)品一致性、療效和/或耐受性而言。在一個 實施方案中，包括從所述異源多肽中切割聚糖并回收切下的聚糖而不從磁性親和珠上釋放 異源多肽的步驟(E)，這通過除去帶有結合異源免疫球蛋白的磁性親和珠來實現(xiàn)。
本發(fā)明的實施將利用分子生物學、微生物學、重組DNA技術及免疫學的常規(guī)技 術，它們在本領域技術人員的能力之內(nèi)。這些技術在文獻中報道。參閱如Sambrook， Fritsch&Maniatis， Molecular Cloning "Laboratory Manual(1989) ;DNA Cloning, I禾口 II巻(D.N. Glover編著，1985) -Oligonucleotide Synthesis (Gait， M. J.編 著，1984) ;Nucleic acidHybridization (Hames， B. D. &Higgins， S. J編著，1984); Transcription andtranslation (Harnes， B. D. &Higgins， S.J.編著，1984) ;Animal cell culture (Freshney， R丄編 著，1986) ;Immobilized cells and enzymes(IRL Press, 1986) ;Perbal， B. ， A practical guide to molecular cloning(1984) ;Methodsin Enzymology 叢 書 (Academic Press, Inc. ) ;Gene transfer vectors formammalian cells (J. H. Miller和M. P. Calos編著，1987， Cold Spring HarbotLaboratory) ， (Wu， R.和 Grossman, L. ， Methods in Enzymology 154(1987)以及Wu， R， Methods in Enzymology 155(1987) ;Imm皿ochemicalmethods in cell and molecular biology (Mayer禾口 Walker 編 著，1987， Academic Press, London), Scopes, Protein purification-Principles andpractice， 第二片反(1987， Springer-Verlag， N. Y.);禾口 Handbook ofexperimental immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir和C. C. Blackwell編著，1986)。
除非另外指明，否則以下術語應理解為具有以下含義 術語"多糖"表示由以糖苷鍵連接的單糖單元鏈構成的分子。"多糖"與"寡糖"之 間的區(qū)別是基于鏈中存在的單糖單元數(shù)。寡糖一般含有2至9個單糖單元，而多糖含有10 個或更多單糖單元。在本發(fā)明中，術語"多糖"包括由兩個或更多個單糖單元組成的分子， 特別是包括其中最長的單糖鏈為3至9個單糖單元的分子。術語"多糖"包括直鏈和支鏈 的分子，分離的以及與多肽結合的分子，唾液酸化的和非唾液酸化的分子。
術語"單糖"表示簡單糖。這樣的簡單糖可包含3至10個碳原子，優(yōu)選5至7個碳 原子，它可以是醛糖或酮糖，與D-或L-甘油醛相比可以為D-或L-構型。單糖為例如蘇糖、 赤蘚糖或赤蘚酮糖(4個碳原子)，或者阿拉伯糖、木糖、核糖、來蘇糖、核酮糖或木酮糖(5個 碳原子)，或者阿洛糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、古洛糖、艾杜糖、阿卓 糖、塔羅糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖(6個碳原子)，甘露庚酮糖或景天庚酮糖(7個碳原 子)或者唾液糖(sialose，9個碳原子)。優(yōu)選地，術語單糖表示核糖、葡萄糖、果糖、巖藻 糖、麥芽糖、半乳糖和甘露糖。
7
術語"聚糖"表示由單糖殘基組成的多聚體。聚糖可以是直鏈的或支鏈的。聚糖 可見與非糖部分(如脂質(zhì)或蛋白質(zhì))共價連接。與蛋白質(zhì)的結合通過N-或O-連接發(fā)生。 包含聚糖的共價綴合物稱為例如糖基化多肽、糖蛋白、糖肽、肽聚糖、蛋白聚糖、糖脂和脂多 糖。聚糖除了作為糖綴合物的一部分存在以外，聚糖也以游離形式存在(即，分離的形式， 而不與其他部分結合)。 術語"糖基化多肽"和"糖蛋白"在本申請中可互換使用，指具有多于IO個氨基酸 的多肽或蛋白質(zhì)，其中至少一個氨基酸具有共價附著的多糖。優(yōu)選地，所述多糖通過絲氨酸 或蘇氨酸的羥基(0-糖基化多肽)或通過天冬酰胺的酰胺基(NH2) (N-糖基化多肽)結合。 所述糖蛋白可以是宿主細胞同源的，或者優(yōu)選地與表達它的宿主細胞是異源的，即外來的 (例如CHO細胞產(chǎn)生的人蛋白)。 術語"糖基化"表示多糖附著到多肽上。優(yōu)選地，所述多糖由2至12個通過糖苷 鍵連接在一起的單糖組成。 術語"N-連接糖基化"指多糖附著到氨基酸鏈中的天冬酰胺殘基上。例如，本領域 技術人員會認識到，小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和 IgD的CH2結構域各在297位氨基酸處具有單個N-連接糖基化位點(根據(jù)Kabat，E.A.等， Sequences ofProteins of Immunological Interest, 1991進行編號)。
術語"O-連接糖基化"指糖類部分附著到氨基酸鏈中的絲氨酸或蘇氨酸殘基上。
術語"糖譜"或"糖基化譜"在本申請中可互換使用，指糖基化多肽中聚糖的特性。 這些特性優(yōu)選地為糖基化位點或糖基化位點的占據(jù)，或者多肽中聚糖和/或非糖部分的身 份、結構、組成或數(shù)量，或者特定糖形的身份和數(shù)量。 本申請中使用的術語"在適于結合的條件下"及在語法上等同的形式表示目的物 質(zhì)(如PEG化的紅細胞生成素或抗體)在與靜止相(例如離子交換材料)接觸時與其結 合。這不一定表示100%的目的物質(zhì)與靜止相結合，而是基本上100%的目的物質(zhì)與靜止相 結合，例如至少50 %的目的物質(zhì)與靜止相結合，優(yōu)選至少75 %的目的物質(zhì)與靜止相結合， 優(yōu)選至少85%的目的物質(zhì)與靜止相結合，優(yōu)選至少95%的目的物質(zhì)與靜止相結合。
術語"糖形"指附著有特定類型及分布的多糖的多肽類型，S卩，如果兩個多肽中包 含具有相同數(shù)目、類型和順序的單糖(即，具有相同的"糖基化譜")，則它們?yōu)橥惶切巍?
術語"宿主細胞"涵蓋可改造成產(chǎn)生改變糖形的目的蛋白、蛋白質(zhì)片段或多肽(包 括免疫球蛋白和免疫球蛋白片段)的所有細胞系統(tǒng)類型。優(yōu)選地，宿主細胞為真核細胞。更 優(yōu)選地，所述真核細胞為哺乳動物細胞。最優(yōu)選地，所述宿主細胞為CH0、BHK、PER. C6衝細胞 或HEK293細胞。 術語"抗體"、"免疫球蛋白"、"IgG"和"IgG分子"在本申請中可互換使用。術語 "免疫球蛋白"包括不同形式的抗體結構，包括但不僅限于整個抗體、抗體片段或抗體綴合 物，還指包含基本或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼之一種或多種多肽 的蛋白質(zhì)。術語"抗體"用于表示完整抗體及其抗原結合片段。公認的免疫球蛋白基因包 括k 、 A 、 a 、 Y 、 S 、 e禾P ii恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為 k或A類。重鏈分為Y 、 ii 、 a 、 S或e類，它們進而分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(如抗體)結構單位是四聚體。每個四聚體由兩對多 肽鏈組成，每對具有一個"輕鏈"(約25KDa)和一個"重鏈"(約50-70KDa)。每個鏈的N端
8定義約100至120或更多個氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原結合。術語"輕鏈可變區(qū)(VL)" 和"重鏈可變區(qū)(VH)"分別指輕鏈和重鏈的可變結構域。 免疫球蛋白還包括單臂的復合單克隆抗體、單鏈抗體，包括單鏈Fv(scFv)抗體 (其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接在一起(直接連接或通過肽接頭連接)以形成連續(xù)多 肽)，以及雙抗體、三抗體和四抗體(Pack,P.等，J. Mol.Biol. 246(1995)28-34 ;Pack，P.等， Biotechnol. 11 (1993) 1271-1277 ;Pack， P.等，Biochemistry 31(1992) 1579-1584)。抗體 是例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段，F(xiàn)ab表達文庫 產(chǎn)生的片段等。優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段或抗體變體是單克隆抗體。
術語"單克隆抗體(mAb)"或"單克隆抗體組合物"在本文中指通過培養(yǎng)單個細胞 和/或其后代而產(chǎn)生的抗體分子制備物。 術語"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可互換使用，所有這些命名均包括后代。 因此，術語"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化細胞"包括原代受試細胞及來自于它們的培養(yǎng)物，與傳代數(shù)無 關。還應理解，由于故意或無意的突變，全部后代在DNA內(nèi)容上可能不完全相同。具有針對 最初轉(zhuǎn)化細胞所篩選的相同功能或生物活性的變體后代也包括在內(nèi)。 術語"表達"指在宿主細胞中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和翻譯。產(chǎn)物基因在宿主細胞中的表達 水平可基于該細胞中存在的相應mRNA的量或該細胞中表達的結構基因所編碼多肽的量來 術語"培養(yǎng)物"或"培養(yǎng)基"在本申請中表示進行宿主細胞發(fā)酵(即產(chǎn)生異源多肽) 的容器中的全部內(nèi)容物。除了所產(chǎn)生的異源多肽以外，還包括培養(yǎng)基中存在的其他蛋白質(zhì) 和蛋白質(zhì)片段(例如來自添加的營養(yǎng)物或來自死細胞、宿主細胞、細胞片段)，以及營養(yǎng)介 質(zhì)提供的和宿主細胞在培養(yǎng)中產(chǎn)生的所有組分。 在涉及如細胞、多核苷酸、載體、蛋白質(zhì)或多肽使用時，術語"重組"一般表示該細 胞、多核苷酸或載體通過引入異源(或外來的)核酸或通過改變天然核酸而進行了修飾，或 者該蛋白質(zhì)或多肽通過弓I入異源氨基酸而進行了修飾，或者該細胞來自通過引入異源核酸 而進行了修飾的細胞。重組細胞表達在天然(非重組)形式的該細胞中不可見的異源多肽 或核酸，或者表達在非重組情況下將異常表達、低表達或根本不表達的天然核酸序列。在涉 及細胞使用時，術語"重組"表示該細胞含有異源核酸和/或表達異源核酸所編碼的多肽。 重組細胞可含有在天然(非重組)形式的該細胞中不可見的編碼序列。重組細胞還可含有 可見于天然形式的該細胞中的編碼序列，其中所述編碼序列通過人工手段被修飾和/或重 新引入該細胞中。該術語還包括這樣的細胞，其含有該細胞的內(nèi)源核酸，所述內(nèi)源核酸被修 飾而未將該核酸從細胞中移出，這樣的修飾包括通過基因替換、位點特異性突變、重組及相 關技術獲得的修飾。 術語"添加劑"指培養(yǎng)基中的組分，它們對于細胞生長而言不是必需的，但被添加 到培養(yǎng)基中，從而例如增強細胞的生長或存活，或者改變在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)之重組細胞 所產(chǎn)生糖基化多肽的糖基化譜。 術語"營養(yǎng)物"指培養(yǎng)基中細胞生長和/或存活所必需的組分。
術語"受試者"指動物，更優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。 本發(fā)明的糖類部分將參照普遍用于描述寡糖的命名法進行描述。使用該命名法的 糖類化學綜述可見于Hubbard， S. C.和Ivatt， R. J. ， Ann. Rev. Biochem. 50(1981)555-583。
9
本發(fā)明的一個方面是在培養(yǎng)基中重組產(chǎn)生糖基化異源多肽的方法，其包括以下步 驟 (A)提供細胞，其包含編碼所述糖基化異源多肽的至少一種核酸，在一個實施方案 中，其包含編碼所述糖基化異源多肽的兩種核酸， (B)在預定的培養(yǎng)條件下將所述細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育，其中在所述培養(yǎng)基
中以糖基化形式獲得所述糖基化異源多肽， (C)從所述培養(yǎng)基中獲得樣品，優(yōu)選不包含細胞， (D)將所述樣品與磁性親和珠接觸，從而將所述糖基化異源多肽與所述磁性親和 珠結合， (E)從與磁性親和珠結合的糖基化異源多肽上釋放聚糖，而不從磁性親和珠上釋 放多肽， (F)通過液相層析純化(E)中釋放的聚糖，在一個實施方案中通過高效液相層析 在陽離子交換樹脂和/或反相進行純化， (G)通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜術(MALDI-TOF MS)分析(F)中所
得純化聚糖，從而測定所述糖基化多肽的糖基化譜， (H)將該糖基化譜與預先確定的參照糖基化譜進行比較， (I)如果(G)中測定的糖基化譜與預先確定的參照糖基化譜不同，則根據(jù)步驟(H) 所得結果改變培養(yǎng)條件，并重復步驟(C)至(H)，以獲得具有與參照糖基化譜一致的糖基化 譜的糖基化異源多肽，或者終止培養(yǎng)，
(K)回收所述糖基化異源多肽。 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，在步驟(A)中，所述細胞是能表達該異源多肽 的重組細胞。 目的異源多肽可如下產(chǎn)生(a)通過表達天然內(nèi)源基因，或(b)通過表達激活的內(nèi) 源基因，或(c)通過表達外源基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述糖基化異源多肽是重 組產(chǎn)生的。重組產(chǎn)生方法及技術為本領域技術人員所熟悉。例如，該方法包括產(chǎn)生/提供 編碼該異源多肽的核酸，將所述核酸引入一個(或多個)表達構建體中，以及用所述表達構 建體轉(zhuǎn)染宿主細胞。除了在宿主細胞中表達該異源多肽所需的一個或多個編碼核酸以外， 這樣的表達構建體(載體)還含有所有調(diào)節(jié)元件。"在適于表達該異源多肽的條件下"培養(yǎng) 宿主細胞，并從細胞或培養(yǎng)物上清/培養(yǎng)基中分離所述糖基化異源多肽。
本發(fā)明的方法適于在真核宿主細胞中產(chǎn)生任何糖基化異源多肽。本發(fā)明方法特別 適于產(chǎn)生可用于治療的多肽。例如，所述異源多肽可選自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免 疫球蛋白綴合物、抗融合肽(antifusogenicp印tide)、淋巴因子、細胞因子、激素(如EP0、 血小板生成素(TPO)) 、G-CSF、GM-CSF、白介素、干擾素、凝血因子和組織型纖溶酶原激活物。 在一個實施方案中，所述異源多肽選自包括免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白綴 合物。 可在本發(fā)明方法中用于產(chǎn)生糖基化異源多肽的細胞原則上可以是任何真核細胞， 例如酵母細胞或昆蟲細胞，只要該細胞向該異源多肽上附加聚糖而獲得糖基化異源多肽即 可。然而，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述真核細胞是哺乳動物細胞。優(yōu)選地，所述哺 乳動物細胞是CH0細胞系，或BHK細胞系，或HEK293細胞系，或人細胞系如PER. C6 。此外，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述真核細胞是動物或人起源的傳代細胞系，例如人細胞系HeLaS3 (Puck， T. T.等，J. Exp. Meth. 103(1956)273-284)、 Namalwa(Nadkarni， J. S.等，Cancer 23 (1969) 64-79) 、 HT1080 (Rasheed， S.等，Cancer 33(1973) 1027-1033)或來自它們的細胞系。 在一個實施方案中，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的免疫球蛋白是重組免疫球蛋白。在另一實施方案中，所述免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。免疫球蛋白的重組產(chǎn)生為本領域所熟知，并描述于例如以下文章中Makrides， S. C. ， Protein Expr.Purif. 17 Q999) 183-202 ;Geisse， S. ， Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ;Kaufman，R. J. ，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-161 ;以及Werner， R. G. ，Drug Res. 48 (1998) 870-880。對于免疫球蛋白的產(chǎn)生，通過標準方法將編碼輕鏈或重鏈或其片段的一種或多種核酸插入表達載體中。表達在本領域中合適的真核宿主細胞中進行，例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞或酵母細胞。在一個實施方案中，在從細胞或者裂解后的細胞上清或者培養(yǎng)基中回收抗體。 在NS0細胞中的表達描述于例如Barnes, L. M.等，Cytotechnology32(2000) 109-123;和Barnes, L.M.等，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270。 瞬時表達描述于例如Durocher， Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9。可變結構域的克隆描述于0rlandi， R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ;Carter， P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289;禾口 Norderhaug， L.等，J. Immunol Meth. 204(1997)77-87。 一種瞬時表達系統(tǒng)(HEK 293)描述于Schlaeger， E. J.和Christensen， K. ， Cytotechnology30 (1999)71-83 ;禾口 Schlaeger， E. J. ;Immunol. Methods194(1996)191-199。 在本發(fā)明方法的步驟(B)中，所述細胞在表達糖基化異源多肽的確定或預定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。本申請中使用的術語"預定的培養(yǎng)條件"表示被開發(fā)用于培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生具有確定糖基化譜的糖基化異源多肽的培養(yǎng)條件。重組細胞克隆一般可以任何期望的方式培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的這一方面添加的營養(yǎng)物包括必需氨基酸(如谷氨酰胺或色氨酸)或/和糖類，以及任選地非必需氨基酸、維生素、微量元素、鹽或/和生長因子如胰島素。在某些實施方案中，營養(yǎng)物包括至少一種必需氨基酸和至少一種糖類。在本發(fā)明的某些方面中，這些營養(yǎng)物以溶解態(tài)稱量(meter)到發(fā)酵培養(yǎng)物中。在一個實施方案中，在細胞的整個生長期(培養(yǎng))中添加營養(yǎng)物，即，取決于培養(yǎng)基中測得的選定參數(shù)的濃度(這稱之為補料培養(yǎng))。 本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物在適用于所培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中制備。在本發(fā)明的一個實施方案中，所培養(yǎng)的細胞是CH0細胞。適用于哺乳動物細胞的培養(yǎng)條件是已知的(參閱如Cleveland, W. L等，J. Immunol. Methods 56(1983)221-234)。此外，可根據(jù)經(jīng)驗確定特定細胞系所需的營養(yǎng)物和生長因子及其濃度，而無需過度試驗，如"Mammalian cell culture",Mather(編著，Plenum Press :NY， 1984) ;Animal cell culture :A Practical Approach,第二片反；Rickwood， D.禾卩Hames， B. D.編著，Oxford University Press :NewYork， 1992 ;Barnes, D.，和Sato， G. ， Cell, 22 (1980) 649中所述。 術語"在適于表達的條件下"表示用于培養(yǎng)表達糖基化異源多肽之細胞的條件，其是已知的或可由本領域技術人員容易地確定。本領域技術人員已知，這些條件可根據(jù)所培
11養(yǎng)細胞的類型和所表達多肽的類型而變化。 一般而言，將細胞在0. 01至107升的體積中，在一定溫度下(例如2(TC至40°C )培養(yǎng)足以允許有效產(chǎn)生綴合物的時間(如4至28天)。
"多肽"是包含由通過肽鍵連接的氨基酸組成的多聚體，其是天然產(chǎn)生或合成產(chǎn)生的。少于約20個氨基酸殘基的多肽可稱為"肽"，而由兩個或更多個多肽組成或者包含多于IOO個氨基酸殘基的一個多肽的分子可稱為"蛋白質(zhì)"。多肽可包含非氨基酸組分，例如糖類基團/聚糖、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可由表達該多肽的細胞添加，并可根據(jù)細胞類型而變化。多肽在本文中根據(jù)其氨基酸骨架結構或其編碼核酸來定義。添加(如糖類基團) 一般不標出，但仍可存在。 在一個實施方案中，營養(yǎng)物溶液可補充有一種或多種選自以下類別的組分血漿組分、生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或EGF)、激素、鹽、無機離子、緩沖劑、核苷和堿基、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、抗生素、脂質(zhì)(如亞油酸)。在一個實施方案中，所述營養(yǎng)物溶液是無動物血清的。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)。此外，在另一實施方案中，所述細胞在含有低血清含量(如最高約1% (v/v))的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)是無血清培養(yǎng)，例如在無血清低蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)(參閱如WO 96/35718)。含有適當添加劑的市售培養(yǎng)基如Ham' s F10或F12 (Sigma)、基本必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma) 、RPMI-1640 (Sigma)或Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM， Sigma)是示例性的營養(yǎng)物溶液。必要時，任何這些培養(yǎng)基中均可補充上述組分。 本發(fā)明方法允許在大于約1升、優(yōu)選大于約10升、優(yōu)選50升至10000升的培養(yǎng)體積中培養(yǎng)。此外，本發(fā)明方法允許進行高細胞密度發(fā)酵，這是指細胞濃度在生長期后(即收獲時)高于1 X 106個細胞/ml，在一個實施方案中高于5X 106個細胞/ml，或者細胞干重高于100g/l，在一個實施方案中高于200g/l。 用于大規(guī)?；蛐∫?guī)模生產(chǎn)糖基化多肽的細胞培養(yǎng)方法可用于本發(fā)明的內(nèi)容中?？梢允褂玫姆椒òǖ粌H限于流式床生物反應器、空心纖維生物反應器、滾瓶培養(yǎng)或攪動水箱式生物反應器系統(tǒng)，在后兩種系統(tǒng)中，使用或不使用微載體。系統(tǒng)可以以分批、補料分批、分批次、連續(xù)或連續(xù)灌注模式運行。在本發(fā)明的某些實施方案中，以分批次過程來實施培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的需求補料，其中在生長期后收獲培養(yǎng)液的一部分，剩余的培養(yǎng)液保留在發(fā)酵罐中，然后用新鮮培養(yǎng)基補足工作體積。本發(fā)明方法允許以極高的產(chǎn)率收獲期望的糖基化多肽。因此，收獲時的濃度為例如至少300mg/l，在一個實施方案中為500mg/l，在一個實施方案中為1000mg/l，在另一實施方案中為1500mg/l。 根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，建議用補料分批或連續(xù)細胞培養(yǎng)條件來增強細胞培養(yǎng)物中生長期哺乳動物細胞的生長。在生長期中，細胞在使生長盡可能大的條件和時間下培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(如溫度、PH、溶解氧(D02)等)是用于具體宿主的那些，并為本領域技術人員所知。 一般而言，用酸(如C02)或堿(如Na2C03或NaOH)或基于HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸)的緩沖體系將pH調(diào)整至約6. 5至7. 5的水平，使用NaHC03進一步緩沖并用稀釋NaOH調(diào)整。培養(yǎng)哺乳動物細胞(如CHO細胞)的合適溫度范圍為約2(TC至4(TC，在一個實施方案中為25t:至38t:，在另一實施方案中為3(rC至37t:。在一個實施方案中，。02為5-90%空氣飽和度。摩爾滲透壓濃度可通過改變氯化鈉、氨基酸、水解產(chǎn)物或氫氧化鈉的濃度來調(diào)節(jié)，在本發(fā)明的一個方面中的值為320至380mOsm。
根據(jù)本發(fā)明，在細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)期中控制細胞培養(yǎng)環(huán)境。用于待產(chǎn)生的糖基化多肽的培養(yǎng)條件通過以下參數(shù)來定義
1.基本培養(yǎng)基 營養(yǎng)物的濃度和類型、任選的血漿組分、生長因子、鹽和緩沖劑、核苷和堿基、蛋白
質(zhì)水解產(chǎn)物、抗生素和脂質(zhì)、合適的載體， 2.已知改變糖基化譜的參數(shù) 糖類的類型和濃度、溶解氧、銨濃度、pH值、摩爾滲透壓濃度、溫度、細胞密度、生長速率 3.任選的其他添加劑 其他添加劑為例如剌激細胞生長和/或增強細胞存活和/或以任何期望方向操作糖基化多肽的糖基化譜的非必需化合物。添加劑包括血清組分、生長激素、肽水解產(chǎn)物、小分子(如地塞米松(dexamethason)、皮質(zhì)醇、離子螯合劑等)、無機化合物(如Selene等)和已知影響糖基化譜的化合物(如丁酸鹽或奎尼定(參閱如US 6，506，598)、鏈烷酸(US5， 705， 364)或銅(EP 1092037)。在一個方面中，上述1、2和3項列出的所有參數(shù)和化合物為無血清參數(shù)，在另一實施方案中，為無動物來源組分的參數(shù)。 在本發(fā)明的一個方面中，糖類為單糖和/或二糖如葡萄糖、葡糖胺、核糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、甘露糖-1-磷酸、甘露糖-1-硫酸或甘露糖_6-硫酸。在本發(fā)明的一個方面中，發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中所有糖的總濃度為0. lg/1至10g/l，在一個實施方案中為2g/1至6g/1。根據(jù)細胞的相應需求添加糖類混合物(參閱如US 6， 673， 575)。
通過向培養(yǎng)基中添加NH4C1來改變銨濃度(Gawlitzek， M.等，Biotech.Bioeng. 68(2000)637-646)。 在用于產(chǎn)生重組糖基化多肽的本發(fā)明方法的步驟(C)中，從粗發(fā)酵液中獲得樣品，并在該方法的步驟(D)中，將樣品與磁性親和珠孵育。 使用本領域成熟的技術，從培養(yǎng)基中回收目的糖基化多肽。在本發(fā)明的某些實施方案中，目的糖基化多肽作為分泌多肽從培養(yǎng)基中回收，或從宿主細胞裂解物中回收。
如果目的糖基化多肽是異源多肽，則可選擇僅結合該異源多肽從而在單個步驟中將其與培養(yǎng)物中的其他多肽分離的磁性親和珠。因此，在一個實施方案中，步驟(D)的特征為將步驟(C)獲得的上述樣品與磁性親和珠接觸，從而僅有糖基化異源多肽與所述磁性親和珠結合，由此將所述糖基化異源多肽與培養(yǎng)物中的其他多肽分離，這通過在單個步驟中除去所述樣品以及未結合的化合物來實現(xiàn)。在一個實施方案中，所述糖基化異源多肽占所述結合多肽的多于75wt^，或多于所述結合多肽的多于85wt^，或多于所述結合多肽的95wt%。"異源多肽"指在給定的宿主細胞中不天然存在的多肽或多肽群。特定宿主細胞的異源DNA分子可含有來自宿主細胞物種的DNA(即，內(nèi)源DNA)，只要宿主DNA與非宿主DNA(即，外源DNA)結合即可。例如，這樣的DNA分子被認為是異源DNA分子所述DNA分子含有與包含啟動子的宿主DNA區(qū)段有效連接的編碼多肽的非宿主DNA區(qū)段。反過來說，異源DNA分子可包含與外源啟動子有效連接的內(nèi)源結構基因。非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。 采樣可以自動或手動進行。在本發(fā)明的某些實施方案中，采樣步驟自動進行。樣
13品體積為lOOiU至1000 iU。在一個實施方案中，獲得的樣品是純化的。在一個實施方
案中，用于純化糖基化異源多肽的方法選自透析、在免疫親和柱或離子交換柱上分級、乙醇
沉淀、反相高效液相層析(HPLC)、在二氧化硅或陽離子交換樹脂(如DEAE)上層析、層析 聚焦、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、硫酸銨沉淀、凝膠過濾(例如在 SEPHADEX G-75⑧上)或在蛋白結合膜(如PVDF膜、尼龍膜或聚四氟乙烯(PTFE)膜)上印 跡?？墒褂玫鞍酌敢种苿?如苯甲基磺酰氟(PMSF))在純化過程中抑制蛋白酶解降解。本 領域技術人員會認識到，也適用于目的糖基化多肽的已知純化方法可需要進行修改，以補 償在重組細胞中表達后糖基化多肽特征的變化。 在本發(fā)明的一個實施方案中，純化方法包括將重組糖基化多肽與磁性親和珠結 合，從而將糖基化多肽與雜質(zhì)迅速分離。通過由瓊脂糖或惰性聚合物材料包圍的鐵核，所 述珠在磁場中的行為類似于磁體，而在撤去磁場后不保留剩磁。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這 使純化過程簡化并縮短，因為不需要柱或離心，這與例如傳統(tǒng)瓊脂糖親和法不同(Smith, C. ， NatureMethods 2(2005)71-77)。具體地，親和結合和吸附動力學發(fā)生的時間為對含 有溶質(zhì)的液體進行緩慢柱洗脫所需時間的幾分之一，參閱如Chaiken， I.等，Analytical Biochemistry, 201 (1992) 197-210。因此，通過本發(fā)明方法，可對培養(yǎng)產(chǎn)生的糖基化異源多 肽的瞬時糖基化譜進行迅速測定，其中所述測定所需的時間特別短。因此，本發(fā)明在一個方 面中提供了在培養(yǎng)中在生產(chǎn)過程中對糖基化異源多肽的糖基化譜進行在線或?qū)崟r測定的 方法，從而允許在需要時在培養(yǎng)過程中調(diào)整培養(yǎng)條件，以獲得具有參照樣品糖基化譜一致 的糖基化譜的糖基化異源多肽。磁珠的另一優(yōu)點是它們可以以微量滴定板的形式使用，允 許將所述系統(tǒng)自動化。因此，本發(fā)明的另一方面是在培養(yǎng)過程中自動化測定糖基化異源多 肽的糖基化譜。因此，上述優(yōu)點提高了產(chǎn)生糖基化多肽之糖基化譜的速度。
例如，可通過與結合有A蛋白、G蛋白或L蛋白的磁珠一起孵育來純化抗體。為此， 將截短形式的重組A蛋白、G蛋白或L蛋白與非多孔磁性顆粒共價偶聯(lián)。蛋白A對許多物 種(包括人、兔和小鼠)的IgG亞類顯示高親和力。蛋白質(zhì)通過穩(wěn)定并在寬pH范圍內(nèi)具有 滲漏抗性的連接來偶聯(lián)。這允許從腹水、血清或細胞培養(yǎng)物上清中免疫磁性純化IgG。在一 個實施方案中，從細胞培養(yǎng)上清中純化所述IgG。例如，一般可通過與磁性親和珠一起孵育 來純化糖基化多肽，所述磁性親和珠上結合有對糖基化多肽具有特異性的去糖基化抗體、 凝集素或特定標簽。使用去糖基化抗體作為親和分子使得其后可以分析糖基化多肽的糖基 化譜，而無需先裂解抗體-糖基化多肽復合體。此外，蛋白A磁珠可用于從細胞粗裂解物中 免疫沉淀靶蛋白，其中使用與所述珠結合的選定的去糖基化一抗。 在另一實施方案中，步驟(D)包括離心步驟，以從培養(yǎng)液中除去細胞和顆粒狀細 胞碎片。在另一實施方案中，在步驟(E)之前，步驟(D)包括除去結合有糖基化多肽的磁珠 周圍的溶液。 在本發(fā)明方法的步驟(E)中，以酶促或化學方法從糖基化多肽中釋放聚糖，而蛋
白質(zhì)仍與磁珠結合。由于缺少從磁珠上釋放糖基化多肽的洗脫步驟，與本領域已知方法相
比，測定糖基化譜的速度被顯著提高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在切割聚糖之前從磁珠上洗脫糖基化多肽
并不是要求保護的方法的必要步驟，并且可以省略而不損害對糖基化譜的分析。 用于分析糖基化多肽中聚糖的實施方案主要包括使用本領域已知的任何化學或
酶促方法或其組合將聚糖從非糖部分上切下。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述化學去糖
14基化方法是肼解。在另一些實施方案中，可通過堿性硼氫化物處理或三氟甲磺酸(TFMS)處 理從糖基化多肽中除去聚糖。在后一情況下，去糖基化多肽可再溶解在8M尿素中，其后進 行進一步分析。 用于切割聚糖的酶促方法包括對N-或0-連接糖具有特異性的方法。這些酶促方 法包括使用內(nèi)切糖苷酶，例如選自內(nèi)切糖苷酶F(EndoF)或內(nèi)切糖苷酶H(Endo H)或內(nèi)切糖 苷酶N(Endo N)或內(nèi)切糖苷酶D(Endo D)或N_聚糖酶F (PNGaseF)或其組合。N_糖苷酶F 也稱為PNGase F，是從N_連接糖基化多肽中在最內(nèi)側GlcNAc與高甘露糖雜合及復合寡糖 的天冬酰胺殘基之間進行切割的酰胺酶。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用切割所有哺乳 動物N-聚糖結構的PNGaseF來切割N_聚糖。 通過本發(fā)明方法分析的聚糖還可以在額外的步驟中與聚糖降解酶接觸。在一個實 施方案中，步驟(E)還包括將所述釋放的聚糖與聚糖降解酶接觸。聚糖降解酶的實例本領 域已知，包括外切糖苷酶，或N-聚糖酶，或神經(jīng)氨酸酶I，或神經(jīng)氨酸酶III，或半乳糖苷酶 I，或N-乙酰葡糖胺酶I，或a -巖藻糖苷酶II和III，或唾液酸酶，或甘露糖苷酶，或其組合。 在另一實施方案中，該步驟(E)還包括將聚糖依次或同時與多于一種聚糖降解酶 接觸。在一些實施方案中，酶促消化是依次進行的，從而不立即除去全部(單)糖。經(jīng)消化 的聚糖可在每個消化步驟后進行分析，以獲得糖基化譜(參閱如WO 2006/114663)。
在另一實施方案中，可使用胰蛋白酶或內(nèi)蛋白酶(如Arg C、Lys C和Glu C)在測 定目的糖基化多肽的糖基化譜之前獲得肽消化物。 在另一實施方案中，去糖基化步驟包括在切割聚糖之前使糖基化異源多肽變性和 /或去折疊。在另一實施方案中，變性劑選自去污劑或尿素或鹽酸胍或熱。在另一實施方案 中，在變性后還原糖基化異源多肽。在另一實施方案中，用還原劑還原糖基化異源多肽。在 某些實施方案中，還原劑選自DTT或P-巰基乙醇或TCEP。在另一實施方案中，在還原后用 烷化劑將糖基化異源多肽烷基化。在某些實施方案中，烷化劑選自碘乙酸或碘乙酰胺。可 對蛋白質(zhì)進行碘化和/或還原，而蛋白質(zhì)仍結合在磁珠上。 在產(chǎn)生重組蛋白的方法的步驟(F)中，對酶促或化學釋放的聚糖進行純化，以用 于進一步分析。在本發(fā)明的某些實施方案中，從樣品中除去除聚糖以外的全部成分。在 本發(fā)明的某些實施方案中，通過反相液相層析或陽離子交換層析進行聚糖純化。例如， 在化學切割或酶消化之后使用用于分離聚糖和蛋白質(zhì)的市售樹脂或?qū)游霾牧虾?或藥 筒(cartridge)系統(tǒng)來純化樣品。這些樹脂、材料和藥筒包括離子交換樹脂和純化柱，如 GlycoCleanH、S和R藥筒。在一些實施方案中，將GlycoClean S與GlycoClean H聯(lián)合用于 純化。這種固相提取(SPE)藥筒含有用于在質(zhì)譜(MALDI-T0F)分析之前除去蛋白質(zhì)并使所 釋放聚糖脫鹽的多孔石墨碳(PGC)基質(zhì)。在另一實施方案中，使用強陽離子交換樹脂(AG 50W-X2)。 通過利用不同的純化方法，可以適用于不同的材料。例如，離子交換樹脂以不同名 稱提供，并來自多個公司，如陽離子交換樹脂Bio-Rex (如70型)、Chelex (如100型)、 Macro-Pr?、?如CM、High S、25S型)、AG (如50W、MP型)，均來自BioRad Laboratories ; WCX 2，來自Ciphergen ;Dowex MAC_3，來自Dow chemical company ;Mustang C禾口 Mustang S，來自Pall Corporation ;Cellulose CM(如23、52型)、hyper-D、 partisphere，來自Whatman pic. ;Amberlite IRC(如76、747、748型)、Amberlite GT 73、 Toyopearl (如SP、 CM、650M型)，均來自TosohBioscience GmbH ;CM 1500和CM 3000，來自BioChrom Labs ;SP-S印haroseTM、CM-S印haroseTM，來自GE Healthcare ;Poros樹脂，來自PerS印tive Biosystems ;Asahipak ES(如502C型)、CXpak P、 IEC CM(如825、2825、5025、 LG型)、 IEC SP(如420N、825型)、IEC QA (如LG、825型)，來自Shoko America Inc. ;50W陽離子 交換樹脂，來自EichromTechnologies Inc.;以及例如陰離子交換樹脂，如Dowex 1，來自 Dowchemical company ;AG (如1、2、4型)、Bio-Rex 5、 DEAE Bio-Gel 1、 Macro-Pr印⑧ DEAE，均來自BioRad Laboratories ;陰離子交換樹脂1型，來自Eichrom Technologies Inc. ;Source Q、 ANX S印harose 4、 DEAES印harose (如CL_6B、 FF型)、Q S印harose、 Capto Q、Capto S，均來自GE Healthcare ;AX-300，來自PerkinElmer ;Asahipak ES_502C、 AXpakWA(如624、 G型)、IEC DEAE，均來自Shoko America Inc. ;Amberlite IRA_96、 Toyopearl DEAE、 TSKgel DEAE，均來自Tosoh BioscienceGmbH ;Mustang Q，來自Pall Corporation.在膜型離子交換材料中，結合位點可見于流通孔壁中，而不藏在擴散孔中，使 得物質(zhì)可通過對流(而不是擴散)進行轉(zhuǎn)移。膜型離子交換樹材料以不同名稱提供，來自 多個公司，例如Sartorius(陽離子SartobindTM CM、 Sartobind S，陰離子SartobincT Q);或Pall Corporation(陽離子-Mustang S、MustangTMC，陰離子-Mustang Q)或Pall BioPharmaceuticals。優(yōu)選地，所述膜型陽離子交換材料為Sartobind CM或Sartobind S或Mustang S或Mustang C。 在另一實施方案中，通過透析或者通過用乙醇或丙酮沉淀污染蛋白并移出含有聚 糖的上清來純化聚糖。用于除去蛋白質(zhì)、去污劑(來自變性步驟)或/和鹽的其他實驗方 法包括本領域已知的方法。 在另一實施方案中，如下純化聚糖使聚糖與磁珠親和結合或與磁性反相珠(如 C18珠)結合，除去鹽和蛋白質(zhì)，其后從珠上洗脫聚糖。 也適用于本發(fā)明的一般性層析方法及其用途為本領域技術人員所知。參閱如 Chromatography,第五片反，Part A-Fundamentals and Techniques, Heftma皿，E.(編著)， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ;Advanced Chromatographic and Electromigration Methods inBiosciences， Deyl， Z.(編著)，Elsevier Science BV， Amsterdam, TheNetherlands， (1998) ^Chromatography Today, Poole， C. F. 禾卩 Poole， S. K. ， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ;Scopes， ProteinPurification-Principles and Practice(1982) ;Sambrook， J. 等(編 著)， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二片反，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ，1989 ;或Current Protocolsin Molecular Biology, Ausubel， F. M.等(eds) ， John Wiley&Sons， Inc. ， New York。 例如，為了純化重組產(chǎn)生的異源免疫球蛋白，常利用不同柱層析步驟的組合。 一般 而言，蛋白A親和層析后是一個或兩個額外的分離步驟。最后的純化步驟是所謂的"精制 步驟"，用于除去痕量雜質(zhì)和污染物，如聚集的免疫球蛋白、殘余的HCP (宿主細胞蛋白質(zhì))、 DNA(宿主細胞核酸)、病毒或內(nèi)毒素。為進行該精制步驟，常使用流通模式的陰離子交換材 料。 所述親和材料可以是例如蛋白A親和材料、蛋白G親和材料、疏水電荷誘導層析材
16料(HCIC)或疏水相互作用層析材料(HIC，例如苯-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間氨 基苯基硼酸)。優(yōu)選地，疏水親和材料是蛋白A材料或HCIC材料。 在該方法的步驟(G)中，測定重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)的糖基化譜。有若干技術可用于測 定糖基化異源多肽(糖蛋白)的糖基化譜，用于分析糖基化多肽之糖基化譜的任何分析方 法均可使用。術語"分析糖基化譜"表示獲得可用于確定糖蛋白的糖基化位點或/和糖基 化位點占據(jù)，或/和聚糖或/和糖蛋白的非糖部分的身份或/和結構或/和組成或/和數(shù) 量，以及特定糖形的身份及數(shù)量的數(shù)據(jù)。 可用于分析糖基化譜的方法可選自質(zhì)譜、核磁共振(NMR，如2D-NMR)、層析法或 電泳法。示例性質(zhì)譜法為FAB-MS、 LC-MS、 LC_MS/_MS、 MALDI-MS、 MALDI-T0F、 TANDEM-MS、 FTMS或電噴霧電離四極飛行時間-MS(ESI-QTOF-MS ;參閱如Miithing， J.等，Biotech. Bioeng. 83(2003)321-334) 。 NMR法為例如C0SY、T0CSY或N0ESY。電泳法為例如CE-LIF (參 閱如Mechref，Y.等，Electrophoresis 26(2005)2034-2046)。在本發(fā)明的某些實施方 案中，層析方法為高效陰離子交換層析-脈沖安培計檢測(HPAEC;參閱如Field, M.等， Anal. Biochem. 239 (1996) 92-98)、弱離子交換層析(WAX)、凝膠滲透層析(GPC)、高效 液相層析(HPLC)、正相高效液相層析(NP-HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)或多孔石墨碳 HPLC(PGC-HPLC)。 在另一些實施方案中，使用結構和/或組成和/或身份已知的聚糖標準品的校準 曲線來定量聚糖。 可用于在從蛋白質(zhì)釋放后分析聚糖的糖組成的其他方法包括涉及用化學或熒光 標記對糖進行標記的方法。這些方法為熒光輔助糖類電泳(FACE)、HPLC或毛細管電泳(CE， 參閱如Rhomberg， E.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1998)4176-4181)。
在一些實施方案中，通過質(zhì)譜測量來補充HPLC，測定糖基化譜。在有大量樣品可 用時，作為能解析更復雜聚糖之結構的單獨的不相關技術，補充性質(zhì)譜數(shù)據(jù)(如MALDI、ESI 或LC/MS)可用于例如驗證HPLC測定的糖基化譜。在本發(fā)明的某些實施方案中，用于標準聚糖的分析方法包括使用MALDI-T0F MS。
其中未修改的聚糖信號強度代表其在樣品中的相對摩爾分數(shù)，使得可對中性及唾液酸化的
聚糖信號進行相對定量。用于分析寡糖的MALDI MS技術還描述于(Juhasz，P.和Biema皿，
K. ， Carbohydr. Res. 270(1995) 131-147 ;Venkataraman， G等，Science 286 (1999)537-542 ;
Rhomberg， E.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 4176-4781 ;Harvey， D. J. ， Mass.
Spectrom. Rev. 18(2000)349-450)。 本發(fā)明的實驗條件在以下實施例中描述。 基質(zhì)化合物和樣品制備方法對分析物在MALDI MS中的離子響應有重大影響。在 本發(fā)明的某些實施方案中，基質(zhì)制劑為2， 5- 二羥基苯甲酸(DHB)。在一些實施方案中，基質(zhì) 制劑是含有或不含精胺的咖啡酸。在另一些實施方案中，基質(zhì)制劑是含有精胺的DHB。例 如，精胺可以300mM的濃度存在于基質(zhì)制劑中?；|(zhì)制劑還可以是DHB、精胺和乙腈的組合。 MALDI MS也可以在Nafion和ATT (6-氮雜_2-硫代胸腺嘧啶)存在下進行。在另一些實 施方案中，可使用以下基質(zhì)0_氰基-4-羥基-肉桂酸(4-11(1^)、4-羥基-3-甲氧基肉桂 酸(FA)、3-羥基妣啶甲酸(HPA)、5-甲氧基唾液酸(MSA)、DHB/MSA、DHB/MSA/巖藻糖、DHB/ Isocarbostyril(HIC)，或US 5， 045， 694和US 6， 228， 654中所述那些。除了基質(zhì)以外，樣品制備方法(如氯化鈉濃度(對于非衍生寡糖)、蒸發(fā)環(huán)境(空氣還是真空)和重結晶條件 (使用不同有機溶劑))可影響總體分析的靈敏度，因此必須進行控制。
此外，在使用MALDI-TOF MS分析樣品時，也可以修改儀器參數(shù)。這些參數(shù)包括 導線電壓、加速電壓、網(wǎng)格值或/和負模式還是正模式。在本發(fā)明的某些實施方案中，對 于陽離子模式的未修飾聚糖的MALDI-TOFMS，本發(fā)明的最佳質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)記錄范圍為大于 (over)200m/z，對于改進的數(shù)據(jù)質(zhì)量為大于m/z 1000。對于陰離子模式的未修飾聚糖的 MALDI-TOF質(zhì)譜，本發(fā)明的最佳質(zhì)譜數(shù)據(jù)記錄范圍為大于m/z 200，對于改進的數(shù)據(jù)質(zhì)量為 大于m/z 1000。 優(yōu)選的范圍取決于樣品聚糖的大小。具有高分支或多糖含量或者具有高唾液酸化
水平的樣品優(yōu)選在含有陰離子模式所述較高上限的范圍中進行分析。優(yōu)選組合所述界限以
形成具有最高和最低大小或者最低下限和最低上限的范圍，其他界限類似地提高大小。 質(zhì)譜的聚糖分析范圍包括測定糖基化多肽中糖基化位點的占據(jù)、聚糖和/或非糖
部分的身份、結構、組成和/或數(shù)量，以及特定糖形的身份和數(shù)量。為此，使用聚糖文庫。在
一些實施方案中，使用組合的分析型計算機平臺來實現(xiàn)徹底的聚糖表征。 在另一實施方案中，該方法還包括以計算機生成的數(shù)據(jù)結構來記錄模式。 在該方法的步驟(H)中，將糖基化多肽的糖基化譜與期望的預定參照糖基化譜進
行比較。這可以手動或自動進行。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用Excel macro進行自
動化分析。 在該方法的步驟(I)中，根據(jù)步驟(G)獲得的結果(S卩，當步驟(G)測定的糖基化 譜與預定的參照糖基化譜不同時)，將步驟(A)的細胞克隆在改變的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。接 著，將步驟(C)至(H)重復數(shù)次，在一個實施方案中重復2至20次，在另一實施方案中重 復2至10次，或每日重復，以最終獲得與預定的參照糖基化譜一致的糖基化多糖。例如，如 果檢測到該糖基化多肽僅含有少量的某種單糖，則特別向培養(yǎng)基中加入該單糖(參閱如US 6， 673， 575)。 在本發(fā)明方法的步驟(I)中，對培養(yǎng)條件的修改選自改變所提供營養(yǎng)物、緩沖劑、 添加劑、糖類或銨的類型和濃度，或溶解氧的濃度，或摩爾滲透壓濃度，或pH值，或溫度，或 細胞密度，或生長階段。可以單獨或組合地改變所有這些參數(shù)，以獲得具有參照糖基化多肽 的糖基化模式的糖基化異源多肽。所有這些參數(shù)可手動或自動控制。例如，通過改變氯化 鈉、不同氨基酸、水解產(chǎn)物或氫氧化鈉的濃度來改變摩爾滲透壓濃度，通過添加酸或堿來改 變pH值，例如從pH 6. 9改變至pH 7. 2，通過例如添加谷氨酰胺和/或NH4Cl來調(diào)節(jié)銨濃度。
在一個實施方案中，糖基化多肽的純化、聚糖的去糖基化和純化以及其后的 MALDI-TOF MS分析在微量滴定板中以高通量形式進行，允許將所述系統(tǒng)自動化。所述高通 量形式可使用標準多孔形式，如48孔板或96孔板。例如，本發(fā)明的方法可以高通量形式使 用，其中使用微孔板和微孔板讀數(shù)器(例如Tecan SafireTM、 Infinite 或SunriseTM、TeCan Trading AG、 CH)以平行監(jiān)測多個培養(yǎng)。 意想不到的是，與本領域已知的方法相比，使用本發(fā)明方法可以減少測定糖基化 異源多肽的糖基化譜所需的時間。具體地，從仍結合在磁性親和珠上的糖基化多肽中釋放 聚糖，這有效地減少了分析時間。本發(fā)明方法允許在發(fā)酵過程中調(diào)整培養(yǎng)條件，以獲得期望 的糖基化譜。此外，本發(fā)明方法可以96孔微量滴定板的形式進行，從而可以完全自動化，例如使用Tecan機器人系統(tǒng)。 蛋白質(zhì)翻譯后糖基化的高度動態(tài)過程(其中糖類機構應答于細胞信號或細胞階 段而迅速發(fā)生變化)在一些嚴重的人類疾病中產(chǎn)生關鍵的信息標志物。例如，已知類風濕 性關節(jié)炎患者中的糖類結構可顯著改變，特定的糖類在胰腺癌和結腸癌中用作腫瘤相關標 志物(Nishimura， S. I.等，Angew. Chem. Int. Ed 44(2005)91-96)。 因此，本發(fā)明還涉及適用于診斷的方法，其包括測定和/或定量疾病的糖基化標 志物。所述方法包括要求保護的糖基化多肽生產(chǎn)方法的步驟。 因此，本發(fā)明的一個方面是確定和/或定量糖基化標志物的方法，其包括以下步 驟 (A)使得自患者的含有糖基化多肽的樣品接觸磁性親和珠，以使所述糖基化多肽 與所述磁性親和珠結合， (B)從樣品中除去帶有結合的糖基化多肽的磁性親和珠， (C)從與磁性親和珠結合的糖基化多肽中釋放聚糖，而不從磁性親和珠上釋放該 多肽， (D)測定所述糖基化標志物的量，禾口 (E)將該糖基化標志物確定的量與參照糖基化標志物的量進行比較。 在另一實施方案中，該方法在步驟(A)之前包括步驟(A-l)，通過應用一種或多種
層析柱來純化樣品。在一個實施方案中，該方法在步驟(C)之后和步驟(E)之前包括步驟
(D)，以純化釋放的聚糖。 待用上述方法分析的樣品可以是例如機體組織或體液(如全血清、血漿、滑液、 尿、精液或唾液、痰、淚液、CSF)、糞便、組織或細胞的樣品。待分析的糖基化多肽可以是樣品 中的全部糖基化多肽，一部分或僅一種糖基化多肽(已知為一種或多種特定疾病的一種或 多種診斷標志物)。 本申請中使用的術語"糖基化標志物"表示至少由三種單糖組成的多糖，其量在某 些疾病中發(fā)生改變(增加或減少)。 在一個實施方案中，所述與疾病狀態(tài)相關的模式是與癌癥相關的模式，所述癌癥
為例如前列腺癌、黑素瘤、膀胱癌、乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌或頭頸癌。在
另一些實施方案中，所述與疾病狀態(tài)相關的模式是與免疫疾病、神經(jīng)退行性疾病(如傳染
性海綿狀腦病、阿爾茨海默病或神經(jīng)病)、炎癥、類風濕性關節(jié)炎、囊性纖維化或感染(病毒
或細菌感染)相關的模式。在另一實施方案中，所述方法是用于監(jiān)測預后的方法，并且已知
的模式與疾病的預后相關。在另一實施方案中，該方法是監(jiān)測藥物治療的方法，并且已知的 模式與藥物治療相關。 在一個實施方案中，將測得的糖基化譜與推定為健康的另一受試者的對照糖基化 譜進行比較，以測定特定疾病的一種或多種糖基化標志物。在一個實施方案中，糖基化譜 的比較可包括比較譜中的峰值比。在鑒定多于一種糖基化標志物時，可以選擇與診斷為患 有特定疾病的受試者的一種或多種參數(shù)具有最高相關性的一種或多種標志物(也參閱US 2006/0270048)。 有不同的方法已成熟，并廣泛用于蛋白質(zhì)回收和純化，例如用微生物蛋白進行親 和層析(如蛋白A或蛋白G親和層析)、離子交換層析(如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(如使用P-巰基乙醇和其 他SH配體)、疏水相互作用或芳香吸附層析(例如用苯基_瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹 脂或間氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(如，使用Ni (II)_和Cu(II)-親和物質(zhì))、大 小排阻層析和電泳法(如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi， M. A. ， A卯l. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。 提供以下實施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在所附權利要求書 中公開。應該理解，可對所述方法進行改變而不偏離本發(fā)明的精神。
附圖簡述

圖1用于重組產(chǎn)生具有確定糖基化譜的抗體A的本發(fā)明方法的示例性方案。
圖2在產(chǎn)生單克隆抗CCR5抗體的過程中通過PNGase F從樣品中釋放的寡糖的 MALDI-T0F MS。如實施例2所述，釋放抗體的N-連接寡糖，并使用DHB基質(zhì)，通過陽離子模 式的MALDI-TOF MS進行分析。 圖3在補料分批培養(yǎng)中產(chǎn)生單克隆抗CCR5抗體的過程中跟蹤選定的聚糖，在培養(yǎng) 過程中不改變培養(yǎng)pH。在不同的時間點，通過PNGase F消化后的MALDI-TOF MS來測定所 產(chǎn)生的與磁性親和珠結合的抗體的糖基化譜。顯示了發(fā)酵過程中選定的不同聚糖結構的相 對量?！?Man5， Man6， ▲ Man7， Man8。 圖4在補料分批培養(yǎng)中產(chǎn)生單克隆抗CCR5抗體的過程中跟蹤選定的聚糖，在培養(yǎng) 過程中改變培養(yǎng)條件。在不同的時間點，通過PNGase F消化后的MALDI-TOF MS來測定所產(chǎn) 生的與磁性親和珠結合的抗體的糖基化譜。在培養(yǎng)過程中，在第8天將pH由7. 2變成6. 9。 顯示了發(fā)酵過程中選定的不同聚糖結構的相對量。■ Man5， Man6， ▲ Man7，參Man8。
實施例 實施例1 產(chǎn)生單克隆抗CCR5抗體 根據(jù)成熟的方法產(chǎn)生生產(chǎn)重組抗CCR5抗體的細胞(參閱如Olson， W.C.等， J. Virol. 73(1999)4145-4155 ;Samson， M.等，J. Biol. Chem. 272(1997)24934-24941 ; EP 1322332 ;W0 2006/103100 ;W0 2002/083172)并在受控的生物反應器環(huán)境中 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(補料分批培養(yǎng))(參閱如Meissner， P.等，Biotechnol. Bioeng. 75(2001) 197-203)。將溫度保持在37"，pH設置為6. 9或7. 2，溶解氧濃度保持在 35%。在發(fā)酵開始時，細胞密度為5X105個細胞/ml。在發(fā)酵過程中的特定時間點，從培養(yǎng) 物中取出含有重組抗體的樣品進行分析。
實施例2 分析含有抗體的樣品的糖基化譜 對每個樣品，將包被有蛋白G的磁性親和珠(MagnaBind Protein G， Pierce)用 250 ii 1蛋白G IgG結合緩沖液(Protein G IgG Binding buffer,Pierce)洗滌3次。每次 洗滌步驟后，完全除去結合緩沖液。接著，將200 每種樣品和100 結合緩沖液加入制 備好的磁性親和珠中。接著將溶液在室溫下孵育1小時。其后，將液體完全除去。接著將孵 育后的珠用含有2mMTRIS-HCl和150mM NaCl，pH 7. 0的250 y 1溶液洗滌兩次，以除去非特 異性結合的材料。其后，將珠用超純水洗滌3次。每次洗滌步驟之后，將液體完全除去。接
20著向珠中加入60 ii 1超純水和2 ii 1 PNGase F溶液(lOOmU溶于100 y 1超純水中)。消化 在37t:下進行4小時。消化后，將2. 2iUl. 5M乙酸溶液加入20 樣品中，在室溫下再孵 育3小時，以將葡基胺轉(zhuǎn)化成還原形式。接著使用弱陽離子交換材料純化聚糖。對每個樣 品單獨準備柱。將陽離子交換材料(AG⑧50W-X8樹脂，BIO-RAD)用超純水洗滌3次。然后 將900ii1經(jīng)洗滌的樹脂裝入層析離心柱中(Micro Bio-Spin， BIO-RAD)。將柱以lOOOXg 離心1分鐘以除去過量的水。接著將22. 2iU每種樣品上樣至準備好的柱的表面。將柱以 lOOOXg再離心1分鐘?，F(xiàn)在液體中含有純化的糖結構。接著將樣品與sDHB基質(zhì)(1.6mg 2，5-二羥基苯甲酸和0. 08mg 5-甲氧基唾液酸溶于125iU超純乙醇和125iill0mM NaCl 溶液中)以l : 2的比例混合。接著將l. 5iU化合物直接點樣到MALDI-TOF靶上。使樣 品干燥，以用于后續(xù)的MALDI-TOF分析。使用陽離子反射模式的MALDI-TOF質(zhì)譜進行測量。
結果 在圖3中，顯示了在補料分批培養(yǎng)中產(chǎn)生單克隆抗CCR5抗體的過程中選定聚糖的 情況。PH設定為6.9。 Man5含量在發(fā)酵過程中穩(wěn)步提高，在培養(yǎng)15天后相對量為約20X。 在圖4中，顯示了在改變的環(huán)境條件下同一抗體的糖基化譜pH在發(fā)酵開始時設定為7. 2。 發(fā)酵開始8天后將pH改變成6. 9。與圖3所示實驗中獲得的數(shù)據(jù)相比，Man5的相對量在發(fā) 酵的最后幾天中下降，導致較低的最終Man5相對含量(16% )。
2權利要求
用于在發(fā)酵過程中對重組產(chǎn)生的糖基化多肽的糖基化譜進行在線分析的方法，其包括以下步驟(A)從培養(yǎng)產(chǎn)生所述糖基化異源多肽的真核細胞的培養(yǎng)基中獲得樣品，(B)使所述樣品與磁性親和珠在適于所述異源多肽與所述珠結合的條件下接觸，(C)從與所述磁性親和珠結合的異源多肽中釋放聚糖，而不從所述磁性親和珠上釋放所述異源多肽，(D)通過高效液相層析純化(C)中釋放的聚糖，(E)通過襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時間質(zhì)譜分析(D)中純化的聚糖，從而測定所述異源多肽的糖基化譜。
2. 用于重組產(chǎn)生糖基化異源多肽的方法，其包括以下步驟(A) 提供含有編碼所述異源多肽的核酸的細胞，(B) 在適于表達所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述細胞，(C) 從所述細胞的培養(yǎng)基中獲得樣品，(D) 使所述樣品與磁性親和珠在適于所述異源多肽與所述磁性親和珠結合的條件下接觸，(E) 從與所述磁性親和珠結合的所述異源多肽中釋放聚糖，而不釋放所述異源多肽，(F) 純化步驟(E)中釋放的聚糖，(G) 測定所述異源多肽的糖基化譜，(H) 將所測定的糖基化譜與參照糖基化譜進行比較，(I) 根據(jù)步驟(H)所得結果調(diào)整培養(yǎng)條件，任選地繼續(xù)進行培養(yǎng)和步驟(J)，或者終止 培養(yǎng)并獲得所述糖基化異源多肽，和(J)重復步驟(C)至(H)，以獲得糖基化的異源多肽。
3. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述糖基化異源多肽是免疫球蛋白。
4. 根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于所述磁性親和珠是其上結合有A蛋白、G蛋白或 L蛋白的磁性親和珠。
5. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述聚糖的釋放是通過N-糖苷酶 進行的酶促釋放。
6. 根據(jù)權利要求1至4中任一項的方法，其特征在于所述聚糖的釋放是通過肼解進行 的化學釋放。
7. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述對釋放的聚糖的純化通過使用 反相層析樹脂和/或陽離子交換層析樹脂進行的高效液相層析來進行。
8. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述對異源多肽糖基化譜的測定通 過對釋放和純化的聚糖進行襯質(zhì)輔助激光解吸與電離_飛行時間質(zhì)譜分析或定量高效液 相層析分離來進行。
9. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于步驟(D)至(G)使用微量滴定板以高通量形式 進行。
10. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述對培養(yǎng)條件的調(diào)整包括對以下一種或多種的改變(i) 營養(yǎng)物、糖類、添加劑、緩沖劑、銨、溶解氧的濃度，或/和(ii) 摩爾滲透壓濃度、pH值、溫度或細胞密度，或/和(iii) 生長狀態(tài)。
11. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述方法包括額外的步驟(K) :(K)從培養(yǎng)基 或細胞中回收所述糖基化異源多肽。
12. 根據(jù)權利要求11的方法，其特征在于所述方法在步驟(K)之后包括額外的步驟(L):(L)純化所述異源多肽。
13. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述步驟(E)是(E) 通過從樣品中除去具有結合的異源免疫球蛋白的磁性親和珠而從異源多肽中釋放 聚糖，并回收釋放的聚糖而不從磁性親和珠上釋放異源多肽。
14. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述步驟(F)是(F) 通過在陽離子交換樹脂或反相上進行高效液相層析來純化(E)中釋放的聚糖。
15. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述細胞是CHO細胞，或BHK細胞， 或HEK細胞。
16. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于根據(jù)測定的糖基化譜而在細胞培養(yǎng)全程中連 續(xù)添加營養(yǎng)物。
17. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基和營養(yǎng)物溶液是無動物血清的。
18. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)。
19. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于生長期后的細胞濃度大于1X106個細胞/ml 或大于5 X 106個細胞/ml ，或者細胞的細胞干重大于100g/l或大于200g/l 。
20. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于發(fā)酵過程中所有糖的總濃度為0. lg/1至10g/1。
21. 根據(jù)權利要求20的方法，其特征在于培養(yǎng)基中所有糖的總濃度為2g/l至6g/l。
22. 根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述糖基化異源多肽分別占步驟 (B)或(D)中所述結合多肽的大于75wt^。
23. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于步驟(E)還包括使所述釋放的聚糖與聚糖降解 酶接觸。
24. 根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于所述去糖基化步驟(E)包括在切割聚糖之前使 該糖基化異源多肽變性和/或去折疊。
25. 根據(jù)權利要求24的方法，其特征在于在變性后使所述糖基化異源多肽還原。
26. 用于定量哺乳動物細胞所表達的糖基化標志物的方法，其包括以下步驟(A) 使來自哺乳動物細胞、細胞培養(yǎng)上清、細胞裂解物或樣品的含有糖基化多肽的樣品 接觸磁性親和珠，(B) 通過N-糖苷酶從親和結合的糖基化多肽中酶促釋放聚糖，而不釋放該糖基化多肽，(C) 通過HPLC和/或陽離子交換層析純化所釋放的聚糖，(D) 通過LC-MS、 MALDI-TOF或定量HPLC測定所述糖基化標志物的量，(E) 通過將所述糖基化譜與參照譜進行比較來定量糖基化標志物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生糖基化異源多肽的方法，其包括以下步驟從粗發(fā)酵液中獲得樣品，將該樣品與磁性親和珠一起孵育，從固定的糖基化多肽中釋放聚糖，測量糖基化譜，將該糖基化譜與該重組糖基化多肽的期望糖基化譜進行比較，根據(jù)獲得的糖基化譜改變培養(yǎng)條件，以及重復該方法以獲得具有期望的糖基化譜的糖基化異源多肽。使用相似的方法，可以鑒定和定量診斷標志物。
文檔編號C12P21/00GK101784670SQ200880104294
公開日2010年7月21日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權日2007年8月31日
發(fā)明者D·羅伊施, M·哈伯格 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司