專利名稱：用雙順反子基因表達(dá)的生物合成β-胡蘿卜素的融合多核苷酸以及用其生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用多順反子基因共表達(dá)的生物合成β-胡蘿卜素的融合多核苷酸以 及用其生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法。更具體地，它涉及一種編碼八氫番茄紅素合酶、FMDV源 2Α序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的融合多核苷酸， 以及用該方法生產(chǎn)胡蘿卜素的方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)了多種基因工程方法以生產(chǎn)有用的代謝物 質(zhì)并且將所述物質(zhì)修飾為有效形式。在實(shí)踐中，已完成了許多有關(guān)植物代謝工程和植物分 子農(nóng)事的研究。所述植物代謝工程利用植物作為媒介，所述植物分子農(nóng)事生產(chǎn)來自非植物 的高附加值非植物可食用疫苗和來自植物用于藥用等的重組蛋白。然而，存在各種技術(shù)困 難并且研究結(jié)果也不成功。尤其為了調(diào)控代謝過程，可在一定條件下同時(shí)表達(dá)若干基因。目前，在本領(lǐng)域中剛 開始嘗試使用煙草報(bào)告子基因的模型研究。與原核生物相比，調(diào)控真核生物如植物和動(dòng)物 中的多順反子基因表達(dá)較為困難。真核生物具有通過單順反子mRNA機(jī)制從一個(gè)啟動(dòng)子只 表達(dá)一個(gè)基因的特性。通常，農(nóng)桿菌(Agrobacterium)用于通過插入T-DNA來轉(zhuǎn)化植物。在這種情況下， 通常進(jìn)行(1)在一個(gè)T-DNA中引入多個(gè)盒；(2)農(nóng)桿菌的共轉(zhuǎn)化；(3)轉(zhuǎn)化體之間的有性雜 交；和⑷將多順反子基因插入到盒中，以同時(shí)引入和表達(dá)多順反子基因。精確地，在一個(gè)T-DNA中引入多個(gè)盒的方法被普遍使用。不幸的是，用一個(gè)T-DNA 載體很難表達(dá)兩個(gè)以上的不包括選擇性標(biāo)記基因的目標(biāo)基因，因?yàn)橛糜谵D(zhuǎn)化的盒的總數(shù)僅 限于3或4。此外，當(dāng)進(jìn)行所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化時(shí)，每個(gè)T-DNA均應(yīng)具有不同的選擇性 標(biāo)記以選擇轉(zhuǎn)化體。在這種情況下，所述選擇性標(biāo)記可為一種阻礙植物轉(zhuǎn)化的限制性因素。 因此，這種方法對(duì)應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行了不利的限制。通過使用轉(zhuǎn)化體之間的有性雜交堆積基因的方法可將每個(gè)個(gè)體的有用性狀收集 到一株植物中。然而，這種方法需要消耗很長時(shí)間并且難以精確控制結(jié)果。此外，在進(jìn)行代謝工程研究之前已經(jīng)嘗試了將多順反子基因引入盒并獲得對(duì)抗應(yīng) 激或疾病的復(fù)合抗性的方法。在這種方法中，應(yīng)用了蛋白表達(dá)的真核生物機(jī)制從而將真核 細(xì)胞的特異識(shí)別位點(diǎn)引入目標(biāo)基因之間。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)嘗試了開發(fā)遺傳工程植物。發(fā)明人已經(jīng)通過使用多順反子基 因表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)了可表達(dá)具有生物活性的胡蘿卜素的融合多核苷酸和含有該融合基 因的重組載體。通過使用所述融合多核苷酸和所述重組載體，發(fā)明人還在水稻中開發(fā)了生產(chǎn)營養(yǎng)β-胡蘿卜素的植物轉(zhuǎn)化體，盡管天然條件下水稻根本不能表達(dá)類胡蘿卜素，并且 成功地完成了本發(fā)明。因此，鑒于上述問題進(jìn)行了本發(fā)明，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)就是提供用于生物合成 β-胡蘿卜素的融合多核苷酸及其應(yīng)用。技術(shù)方案為達(dá)成本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供一種表達(dá)八氫番茄紅素合酶和胡蘿卜素去 飽和酶的融合多核苷酸來進(jìn)行生物合成。為達(dá)成本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的包含融合多核苷酸 的重組載體。為達(dá)成本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供一種被所述重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。為達(dá)成本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供一種用所述重組載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或 轉(zhuǎn)化體來生物合成β _胡蘿卜素。為達(dá)成本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供一種通過使用用所述重組載體轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞或者轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)胡蘿卜素的方法來生物合成胡蘿卜素。以下將更清楚地解釋本發(fā)明。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，可通過提供編碼八氫番茄紅素合酶、FMDV源2Α序列或內(nèi) 部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的融合多核苷酸來達(dá)成上述和 其他目標(biāo)。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合多核苷酸可為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :42的DNA或RNA。 當(dāng)所述多核苷酸為RNA時(shí)，胸腺嘧啶(T)可被替換為尿嘧啶(U)。本發(fā)明的多核苷酸可通過 任何現(xiàn)有技術(shù)公開的化學(xué)合成方法生產(chǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供含有包含編碼八氫番茄紅素合酶的多核苷酸、FMDV源 2Α序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和編碼胡蘿卜素去飽和酶的多核苷酸的 融合多核苷酸的重組載體。通常，胡蘿卜素是通過圖2所述的方法合成的。在一株植物中，類胡羅卜素 的基本合成路徑包括下列步驟利用八氫番茄紅素合酶(PSY)將2分子的GGPP (焦磷酸牛 龍牛兒基牛龍牛兒酯(geranylgeranylpyrophosphate))聚合成包含40個(gè)碳(3個(gè)共軛雙 鍵)的八氫番茄紅素；利用八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)經(jīng)過兩步去飽和生成胡蘿卜 素(7個(gè)共軛雙鍵)；然后使用胡蘿卜素去飽和酶(ZDS)再經(jīng)過兩步去飽和反應(yīng)；最后 經(jīng)鏈孢紅素(9個(gè)共軛雙鍵)生成番茄紅素(11個(gè)共軛雙鍵)。番茄紅素是一種非環(huán)狀類 胡蘿卜素的終產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化為兩種環(huán)狀胡蘿卜素。一種胡蘿卜素是使用番茄紅素環(huán)化 酶(β-LCY)經(jīng)過兩步反應(yīng)從Y-胡蘿卜素合成的胡蘿卜素。另一種胡蘿卜素是使用 番茄紅素-ε -環(huán)化酶(ε -LCY)和β-LCY經(jīng)過合作反應(yīng)(cooperative reaction)分別從 Y-胡蘿卜素和胡蘿卜素合成的α-胡蘿卜素。然而由于水稻不表達(dá)類胡蘿卜素生物 合成的一種起始酶一八氫番茄紅素合酶(PSY)，因此根本不產(chǎn)生任何種類的胡蘿卜素。因 此，本發(fā)明人構(gòu)建了重組載體，其含有一個(gè)啟動(dòng)子，以及與所述啟動(dòng)子可操作地連接的編碼 八氫番茄紅素合酶的多核苷酸、FMDV源2Α序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和編碼胡蘿卜素去飽和酶的多核苷酸。然后，發(fā)明人表達(dá)了該酶以使用所述重組載體從水 稻中大規(guī)模生產(chǎn)胡蘿卜素。
八氫番茄紅素合酶為一種聚合2分子GGPP(焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯) 來產(chǎn)生八氫番茄紅素的生物合成酶。在本發(fā)明中，公開的任何種類的八氫番茄紅素合酶 或任何種類的編碼該酶的多核苷酸都可被使用。優(yōu)選地，它們可源自胡椒、番茄、擬南芥 (Arabidopsis)、土豆等，更優(yōu)選地，八氫番茄紅素合酶的多核苷酸可為SEQ ID NO 5或SEQ ID NO6的核苷酸序列。FMDV( 口蹄疫病毒)源的2A序列在翻譯過程中通過內(nèi)核糖體“跳躍”機(jī)制自加工 [Donnelly et al. ,1991, J. Gen.Virol. ,78,13-21 ；Ryanet al. ,1991, J.Gen. Virol. ,72, 2727-2732]。優(yōu)選地，所述FMDV源的2A序列可含有SEQ ID NO :2的氨基酸序列并且編碼 所述FMDV源的2A序列的多核苷酸可含有SEQ ID NO :3的氨基酸序列。本發(fā)明的氨基酸序 列和核苷酸序列是對(duì)水稻優(yōu)化的。所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)是一種在mRNA中間起始翻譯的核苷酸序列。優(yōu) 選地，所述IRES可具有SEQ ID NO 31的核苷酸序列并對(duì)應(yīng)源自CrTMV (感染十字花科植物 的煙草花葉病毒)的衣殼蛋白上游的150bp。胡蘿卜素去飽和酶(CrtI)是一種源自噬夏孢歐文菌(Erwiniauredovora)或菠蘿 泛菌(Pantoea ananatis)的去飽和酶并且起到兩種去飽和酶PDS和ZDS的作用以將八氫 番茄紅素轉(zhuǎn)化成番茄紅素。在本發(fā)明中，現(xiàn)有技術(shù)公開的任何種類的胡蘿卜素去飽和酶或 編碼該酶的多核苷酸都可被使用。優(yōu)選地，所述胡蘿卜素去飽和酶可具有SEQ ID N0:7的 氨基酸序列并且所述多核苷酸可具有SEQ ID NO 8的核苷酸序列。在本發(fā)明中，含有八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連 接序列和胡蘿卜素去飽和酶的融合蛋白可包括所述蛋白的功能等價(jià)物。這種功能等價(jià)物被 定義為一種具有與八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連接序列 和胡蘿卜素去飽和酶基本相似的生理活性的多肽。所述“基本相似的生理活性”是以下的 生物活性通過聚合兩分子的GGPP(焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯)生成八氫番茄紅素； 通過一種非蛋白水解機(jī)制自加工；以及進(jìn)入內(nèi)核糖體并通過PDS和ZDS將八氫番茄紅素轉(zhuǎn) 化成番茄紅素。優(yōu)選地，所述功能等價(jià)物可為一種多肽，其與分別對(duì)應(yīng)八氫番茄紅素合酶、FMDV源 2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 7的氨基酸序列具有任意的序列同源性(同一性)。優(yōu) 選地，所述序列同源性為至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，最優(yōu)選至少90 %。精確地，所述功能 等價(jià)物可包括一種具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性的多肽。所述功能等價(jià)物可通過部分添加、取代或刪除八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序 列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的氨基酸序列來制備。優(yōu)選地， 所述氨基酸取代是一種保守性取代。例如，氨基酸的保守性取代可在脂肪族氨基酸(Gly、 Ala、Pro)、疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、酸性氨基酸(Asp、 Glu)、堿性氨基酸(His、Lys、Arg、Gin、Asn)和含硫氨基酸(Cys, Met)中實(shí)現(xiàn)。此外，氨基 酸的刪除可包括部分刪除八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連 接序列和胡蘿卜素去飽和酶的氨基酸序列的修飾。優(yōu)選地，氨基酸的刪除和取代可位于不直接受影響的區(qū)域。此外，氨基酸的添加可包括在八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi) 部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的氨基酸序列的兩端或者內(nèi)部添加一 個(gè)以上氨基酸的修飾。所述功能等價(jià)物還包括保持了骨架和生理活性但在化學(xué)結(jié)構(gòu)上被部 分修飾的多肽衍生物。例如，所述功能等價(jià)物包括一種用于改變其穩(wěn)定性、儲(chǔ)存性、揮發(fā)性、 可溶性或純度的結(jié)構(gòu)修飾。
在本發(fā)明中，可通過使用現(xiàn)有技術(shù)公開的任何用于植物轉(zhuǎn)化的基本載體構(gòu)建含有 編碼八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和胡 蘿卜素去飽和酶的融合多核苷酸的重組載體。優(yōu)選地，可使用二元載體或者共整合載體。 多種二元載體被廣泛用于植物轉(zhuǎn)化且?guī)缀跛卸d體都是商品化的。它們可從國際組 織和大學(xué)研究機(jī)構(gòu)如 CAMBIA(The Center for the Application of Molecular Biology tolnternational Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)獲得。二 元載體的基本結(jié)構(gòu)源自Ti質(zhì)粒并用外源基因、啟動(dòng)子和終止子等在左邊界和右邊界進(jìn)行 了改造。在本發(fā)明中，所述重組載體可采用現(xiàn)有技術(shù)公開的可在植物中行使功能的任何啟 動(dòng)子。編碼八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列 和胡蘿卜素去飽和酶的融合多核苷酸可操作地連接于啟動(dòng)子的下游。所述啟動(dòng)子是一種在 特定宿主細(xì)胞中調(diào)控其下游的基因表達(dá)的DNA序列。所述可操作的連接是一種當(dāng)核酸結(jié)合 時(shí)它們相互影響以行使功能或表達(dá)其的連接。所述重組載體還可包括任何用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 操作子序列，編碼mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的正確序列和轉(zhuǎn)錄及翻譯的終止子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子可選自水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb)啟動(dòng)子、谷蛋白(GT、 Glt或Glu)啟動(dòng)子、玉米泛素(Ubi)啟動(dòng)子、花椰菜花葉病病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、玄參花 葉病病毒35S啟動(dòng)子、甘蔗桿菌病毒啟動(dòng)子、鴨跖草黃化斑駁病毒啟動(dòng)子、源自核酮糖-1， 5_雙-磷酸羧化酶亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟 動(dòng)子、源自擬南芥的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白1基因啟動(dòng)子、甘 露堿合酶啟動(dòng)子和章魚堿合酶啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，其可為水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb) 啟動(dòng)子。優(yōu)選地，選擇性標(biāo)記基因可選自但不限于抗生素抗性基因、除草劑抗性基因、代 謝相關(guān)基因、發(fā)光基因、綠色熒光蛋白(GFP)基因、葡糖苷酸酶(GUS)基因、β-半 乳糖苷酶(GAL)基因等。更優(yōu)選地，其可選自除草劑抗性Bar基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 IKNPT II)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、草銨膦乙?；D(zhuǎn)移酶(phosphinothricine acetyltransferase)基因或去氫葉酸還原酶基因等，并且最優(yōu)選地，其可為除草劑抗性 Bar基因。優(yōu)選地，本發(fā)明用于植物轉(zhuǎn)化的重組載體可為圖1所示的pGlb-PAC載體或圖9 所示的pGlb-PIC載體。具體地，所述pGlb-PAC載體是通過使用pMJ-103載體(從右邊 界到左邊界由SEQ ID:57表示)作為骨架構(gòu)建，其中attBl序列、編碼胡椒八氫番茄紅素 合酶的多核苷酸、FMDV源2A序列的連接序列、編碼細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶的多核苷酸以 及attB2序列被順序連接到水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb)啟動(dòng)子和土豆蛋白酶抑制劑 IKPin II)的終止子之間。此外，通過將FMDV源的2A序列替換為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)而從 pGlb-PAC載體構(gòu)建pGlb-PIC載體。在這種情況下，通過使用pSBll載體(Genbank AcessionNo. AB027256)- 一種含有壯觀霉素抗性基因的超二元質(zhì)粒一作為骨架生成pMJ-103載 體。pMJ-103載體是一種整合水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb)啟動(dòng)子和土豆蛋白酶抑制劑 IKPin II)終止子的通道載體，并且在35S啟動(dòng)子的下游區(qū)域含有除草劑抗性Bar基因作 為植物選擇性標(biāo)記。上述標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是廣為人知的，并在以下文獻(xiàn)中被 描述(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Ε. F. and Maniatis，Τ.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory :Cold Spring Harbor，NY 1989 ； Silhavy, Τ. J.，Bennan, Μ. L and Enquist，L. W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory :Cold Spring Harbor，NY，1984 ；禾口 Ausubel，F(xiàn). Μ. et al.， Current Protocols in Molecular Biology,published by GreenePublishing Assoc，and Wi ley-interscience,1987)。 同時(shí)，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefacience) LBA4404中，并將本發(fā)明的基因通過所述轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿 菌引入植物細(xì)胞中。因此，本發(fā)明提供一種被本發(fā)明的用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可為但不限于原核宿主細(xì)胞，如農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium spp.)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鏈霉菌(Streptomyces)、假單胞菌 (Pseudomonas)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)；低等 真核細(xì)胞如真菌(例如曲霉菌(Aspergillus)和酵母(例如畢赤酵母(Pichia pastoris)、 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、粗糙鏈孢霉 (Neurospora crassa))；以及高等真核生物源細(xì)胞，包括昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳細(xì)胞， 優(yōu)選根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。此外，本發(fā)明提供了一種被引入所述載體并產(chǎn)生胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可通過現(xiàn)有技術(shù)公開的植物轉(zhuǎn)化方法制備。例如，但不限于，通過 使用農(nóng)桿菌屬、基因槍轟擊、碳化硅晶須、超聲處理、電穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀的轉(zhuǎn)化。 優(yōu)選地,可使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Horsch et al. ,Science 227 :1229_1231，1985)。例如， 現(xiàn)有技術(shù)公開了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化(An et al.，EMBO J.，4 =227-288,1985)。本發(fā)明的植物細(xì)胞可根據(jù)任何傳統(tǒng)方法培育，包括肉湯培養(yǎng)的細(xì)胞、愈傷組織細(xì) 胞、培養(yǎng)的原生質(zhì)體以及分化后的植物組織或植物。精確地，可通過使用現(xiàn)有技術(shù)公開的標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)將用所述重組載體轉(zhuǎn)化的植物誘導(dǎo)為愈傷組織、在土壤中生根和分離(refine)，從 而再分化為一株植物。所得植物可通過無性和有性生殖兩種方法生產(chǎn)。所述無性生殖方法 包括插扦、嫁接等，所述有性生殖方法包括播種。所述植物細(xì)胞在從母體植物的一部分中分離后在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行 繁殖。此過程可通過現(xiàn)有技術(shù)公開的任何方法實(shí)現(xiàn)，包括組織片段的肉湯培養(yǎng)、組織片段的 愈傷組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。這種培養(yǎng)條件和方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。所述植物細(xì)胞的分化在可誘導(dǎo)所培養(yǎng)愈傷組織或原生質(zhì)體分化的合適條件下進(jìn) 行。所得愈傷組織和原生質(zhì)體可生成植物組織或植物。這種分化條件和方法可由本領(lǐng)域技 術(shù)人員確定。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組植物或蘑菇來生成β _胡
蘿卜素。
上述植物可包括整株植物、植物的一部分、愈傷組織、植物組織、植物細(xì)胞和植物 種子。本發(fā)明的植物可包括單子葉植物和雙子葉植物。所述單子葉植物不限于，但優(yōu)選地為 水稻、小麥、大麥、竹筍、玉米、芋頭、蘆筍、洋蔥、大蒜、大蔥、韭蔥、野胡蒜、甘薯(yam)和生 姜。所述雙子葉植物不限于，但優(yōu)選地為擬南芥、茄子、煙草、胡椒、番茄、牛蒡、苘蒿、萵苣、 風(fēng)鈴草、菠菜、泰菜、番薯(sweet potato)、旱芹、胡蘿卜、歐合葉子、西芹、白菜、卷心菜、小 蘿卜、西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、草莓、大豆、綠豆、四季豆、百脈根、土豆、浮萍、青紫蘇、 木豆、水仙、金盞花和青豆。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種生產(chǎn)β -胡蘿卜素的方法，其包括下列步驟(a)將 含有本發(fā)明的融合多核苷酸的重組載體引入到細(xì)胞中；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞或從所述細(xì)胞中 分化的植物；和(C)從培養(yǎng)后的細(xì)胞或植物中分離胡蘿卜素。以上清楚地描述了所述重組載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用所述重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化為 一個(gè)完整細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)如愈傷組織。然后，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)或者培育以表達(dá)整合到所述重組 載體中的八氫番茄紅素合酶和胡蘿卜素去飽和酶?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)中公開的任何常規(guī)方 法，優(yōu)選地通過使用有機(jī)溶劑的萃取方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞或植物中純化胡蘿卜素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分離胡椒八氫番茄紅素合酶基因和細(xì)菌胡蘿卜素去 飽和酶基因以進(jìn)行克隆并且通過使用密碼子將編碼FMDV源2Α序列的核苷酸序列針對(duì)水稻 進(jìn)行優(yōu)化。然后，構(gòu)造本發(fā)明的融合多核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將重組序列(如attBl和attB2)連接到所述融合 多核苷酸上并且將其插入到PD0NR201載體中。然后用pMJ-103載體轉(zhuǎn)化所述融合多肽以 構(gòu)建pGlb-PAC載體，其中pMJ-103載體由作為骨架的pSBll載體、水稻內(nèi)胚芽特異的球蛋 白(Glb)啟動(dòng)子和土豆蛋白酶抑制劑II(PinII)終止子構(gòu)成。將pGlb-PAC載體引入農(nóng)桿 菌以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將源自CrTMV (感染十字花科植物的煙草花葉病 毒)并對(duì)應(yīng)衣殼蛋白上游的150bp的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)插入所述胡椒八氫番茄紅素合酶 基因和細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶基因之間以構(gòu)建所述融合多核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將重組序列(如attBl和attB2)連接到所述融合 多核苷酸上并且將其插入PD0NR201載體中。然后，用pMJ-103載體轉(zhuǎn)化所述融合多肽以構(gòu) 建pGlb-PIC載體，其中所述pMJ-103載體由作為骨架的pSBll載體、Glb啟動(dòng)子和PinII終 止子構(gòu)成。將PGlb-PIC載體引入農(nóng)桿菌以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用由pGlb-PAC載體或pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化的農(nóng) 桿菌轉(zhuǎn)化水稻。然后，選擇會(huì)向單個(gè)植物分化的水稻。裸眼觀察到所述植物轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出 比完整植物的對(duì)照組更深的黃色。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，檢查了所述植物轉(zhuǎn)化體是否引入了所述融合多核 苷酸以及是否合成了類胡蘿卜素，并進(jìn)一步測(cè)量了表達(dá)的RNA水平和蛋白水平。因此，證實(shí) 了所述融合多核苷酸被正確插入所述轉(zhuǎn)化體，并且在RNA和蛋白水平上活躍地表達(dá)，從而 大量產(chǎn)生類胡蘿卜素，尤其是胡蘿卜素。有益效果
本發(fā)明提供在細(xì)胞轉(zhuǎn)化體、重組載體、用所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞和植物轉(zhuǎn) 化體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)八氫番茄紅素合酶基因和細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶基因的融合多核苷酸。本 發(fā)明的融合多核苷酸可用于調(diào)控植物生產(chǎn)的胡蘿卜素的生物合成代謝。此外，其還可 用于有效增加一 一種有用的代謝物一β _胡蘿卜素的含量。


參考下面附圖所示的某些示例性實(shí)施方案詳細(xì)描述本發(fā)明的上述和其他特性，所 述示例性實(shí)施方案僅出于說明的目的，因此并非對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，并且其中圖1是pGlb-PAC載體的示意圖(LB 左邊界；RB 右邊界；Glb 水稻內(nèi)胚芽特異的 球蛋白啟動(dòng)子；Psy 源自韓國胡椒栽培品種NocKwang的八氫番茄紅素合酶基因；st2A 對(duì) 水稻優(yōu)化的2A序列；Tp 葉綠體靶向?qū)щ?；CrtI 細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶基因；PinII 土豆 蛋白酶抑制劑II終止子；P35S =CaMV 35S啟動(dòng)子；Bar 草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；NOS 胭月旨 堿合成酶終止子；和MAR 基質(zhì)附著區(qū)域)；圖2是類胡蘿卜素包括β -胡蘿卜素的一種植物代謝過程(GGPS 焦磷酸牛龍牛 兒基牛龍牛兒酯合酶；PSY 八氫番茄紅素合酶；PDS 八氫番茄紅素去飽和酶；ZDS ζ -胡 蘿卜素去飽和酶；β -LCY 番茄紅素- β -環(huán)化酶；ε -LCY 番茄紅素-ε -環(huán)化酶；β -CH : β -胡蘿卜素羥化酶；ε -CH ε -胡蘿卜素羥化酶；ZE 玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶；VDE 紫黃質(zhì)去環(huán) 氧酶；NXS 新黃質(zhì)合酶；CCS 辣椒黃素-辣椒玉紅素合酶)；圖3是從水稻內(nèi)胚芽收集的Tl、Τ2和Τ3-代成熟種子，所述內(nèi)胚芽被多順反子 PGlb-PAC載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生β -胡蘿卜素并呈現(xiàn)黃色。圖4是通過進(jìn)行PCR (A)和DNA印跡⑶識(shí)別的植物的細(xì)胞轉(zhuǎn)化(M，Ikb梯形DNA 大小標(biāo)記；PC，pGlb-PAC質(zhì)粒DNA;NC，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?洛東(Nakdong)稻)；9、10、11、 2-1、2-2、4-2、4-3，pGlb-PAC 水稻轉(zhuǎn)化體)。圖5是通過進(jìn)行RT-PCR識(shí)別的本發(fā)明植物中的基因表達(dá)。圖6是通過進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡識(shí)別的本發(fā)明植物中的蛋白表達(dá)(GF 胡椒的青果； RF:胡椒的紅果)；圖7是通過HPLC分析識(shí)別的本發(fā)明植物中的β-胡蘿卜素的產(chǎn)生(L，葉黃素；Ζ， 玉米黃質(zhì)；B-C，β-胡蘿卜素)；圖8是由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)啟動(dòng)子的兩個(gè)獨(dú)立基因的共表達(dá)示意圖；圖9是用于產(chǎn)生β-胡蘿卜素的含有多順反子PIC基因的水稻內(nèi)胚芽特異的 pGlb-PIC載體的詳細(xì)構(gòu)建(基因圖譜)(LB 左邊界；RB 右邊界；Glb 水稻內(nèi)胚芽特異的球 蛋白啟動(dòng)子；Psy 源自韓國胡椒NocKwang的八氫番茄紅素合酶基因；IRES 內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)；Tp 葉綠體靶向?qū)щ模籆rtI 細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶基因；PinII 土豆蛋白酶抑制 劑II終止子；P35S =CaMV 35S啟動(dòng)子；Bar 草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；NOS 胭脂堿合成酶終 止子；和MAR:基質(zhì)附著區(qū)域)；圖10是從水稻內(nèi)胚芽收集的Tl和T2代成熟種子，所述內(nèi)胚芽被本發(fā)明的多順反 子pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生β-胡蘿卜素并呈現(xiàn)黃色；圖11是通過進(jìn)行凝膠電泳識(shí)別的水稻的基因插入(M，Ikb梯形DNA大小標(biāo)記；PC， pGlb-PAC質(zhì)粒DNA ；NC,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?洛東稻)；4、5、β、7、8 用pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化的水稻Tl代)；
圖12是通過使用水稻染色體DNA進(jìn)行基因組DNA印跡識(shí)別的基因插入和基因拷 貝數(shù)(M，Ikb梯形DNA大小標(biāo)記；PC，pGlb-PAC質(zhì)粒DNA ；NC,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?洛東稻)； 4-2、5-1、6-1、7-1、8-2、8-3 用 pGlb-PIC 載體轉(zhuǎn)化的水稻 T2 代)；圖13是使用從用多順反子pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化的水稻種子中分離的總RNA進(jìn)行 RT-PCR后，轉(zhuǎn)錄體的基因表達(dá)模式的比較(M，Ikb梯形DNA大小標(biāo)記；NC，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?稻(洛東稻)的成熟種子；4、5、6、7、8:用pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化的水稻種子)；圖14是用多順反子pGlb-PIC載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生β-胡蘿卜素并呈現(xiàn)黃色的水稻成 熟種子(Glb 水稻內(nèi)胚芽特異的球蛋白啟動(dòng)子；Tp 葉綠體靶向?qū)щ幕?；Psy 源自韓國 胡椒NocKwang的八氫番茄紅素合酶基因；st2A 在水稻中優(yōu)化的2A序列；IRES 內(nèi)部核糖 體進(jìn)入位點(diǎn)；CrtI 細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶基因；PinII 土豆蛋白酶抑制劑II終止子)。應(yīng)理解，附圖不必是按比例尺縮放的，而是表示對(duì)說明本發(fā)明基本原理的多種優(yōu) 選特性的某種程度的簡化描述。本文公開的本發(fā)明的具體設(shè)計(jì)特性，包括例如具體尺寸、方 向、位置和形狀，可部分地由具體的計(jì)劃應(yīng)用和使用環(huán)境確定。
實(shí)施例以下，將詳細(xì)給出本發(fā)明的多種實(shí)施方案，其中的實(shí)施例在附圖中圖示并在下面 描述。盡管本發(fā)明連同示范實(shí)施方案一起被描述，然而應(yīng)理解這種描述并不意圖將本發(fā)明 限制為那些示范實(shí)施方案。相反，本發(fā)明不僅意圖涵蓋示范實(shí)施方案，還意圖涵蓋屬于如所 附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種替代、改造、等價(jià)或其他實(shí)施方案。<實(shí)施例1>對(duì)水稻優(yōu)化的FMDV源2A序列(st2A基因)的合成已知FMDV( 口蹄疫病毒)源2A序列在氨基酸的特定C-末端處(G丨P)自加工。 在FMDV源2A序列內(nèi)，SEQ ID NO 2的氨基酸序列被用來設(shè)計(jì)對(duì)水稻優(yōu)化的多核苷酸。精確 地，水稻密碼子使用數(shù)據(jù)被用來確定60bp的最優(yōu)核苷酸序列。在核苷酸序列的兩個(gè)末端， 連接3bp核苷酸作為限制性內(nèi)切酶PstI和Smal的識(shí)別位點(diǎn)來設(shè)計(jì)SEQ ID NO 3的多核苷 酸(st2A-正義ssDNA)。然后，再設(shè)計(jì)與SEQ ID NO :3的多核苷酸互補(bǔ)的SEQ ID NO :4的 多核苷酸(st2A-反義ssDNA)。從商業(yè)公司合成了上面設(shè)計(jì)的SEQ ID NO :3的多核苷酸和SEQ ID NO :4的多核苷 酸。然后，將這些序列從65°C緩慢退火至室溫以轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA(dsDNA)。用限制性內(nèi)切酶 PstI和Smal消化所述dsDNA并將其連接到經(jīng)相同酶消化的質(zhì)粒pKS+載體(stratagene) 中。從而構(gòu)建了 pBS-st2A載體。<實(shí)施例2>胡椒PSY基因和細(xì)菌CrtI基因的分離(2-1)胡椒PSY基因的分離為克隆源自韓國胡椒一辣椒栽培品種NocKwang的SEQ ID NO 6的八氫番茄紅素 合酶基因(PSY)，從胡椒根中提取總RNA。具體地，每個(gè)樣品取約Ig在液氮下的混合碗中進(jìn) 行超聲處理，再轉(zhuǎn)移到2mL試管中，用500 μ L的RNA提取緩沖液(ρΗ 5. 5的50mM乙酸鈉、 150mM LiCl、5mM EDTA、0. 5% SDS)和500 μ L苯酚萃取。將所述混合物在65°C下加熱10分 鐘，然后用旋轉(zhuǎn)振蕩器在室溫下攪拌15分鐘。然后，以lOOOOrpm在4°C下離心10分鐘，將上 清液收集到一個(gè)新試管中，再加入500 μ L的氯仿。再次萃取此上清液，再離心以收集上清液。然后加入0.6倍體積的8M氯化鋰(LiCl)，在-20°C下反應(yīng)2小時(shí)以上。將反應(yīng)產(chǎn)物在 4°C下以12000rpm離心20分鐘以沉淀RNA沉淀，并用4M LiCl和80% EtOH洗滌一次。將 所述RNA沉淀溶解到50 μ L的蒸餾水中。通過在使用前用UV分光光度計(jì)在Α260/Α280下測(cè) 量光密度來對(duì)所述RNA洗出液進(jìn)行定量。將此RNA用作模板并加入對(duì)胡椒PSY基因特異的 引物對(duì)SEQ ID NO :9 (Psy-Fw引物)和SEQ ID NO 10 (Psy-Rv引物)。然后，通過進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增所述胡椒PSY基因。具體地，大約2 μ g的總RNA與50 μ M 的寡聚dT引物在以下條件下反應(yīng)55°C 20分鐘，99°C 5分鐘，并在冰上冷卻。然后，用1 μ L 的核糖核酸酶 H 與 IOxRT 緩沖液(25mM MgCl2、0. IM DTT, RNase OUT、Superscript RT)在 37°C下處理20分鐘來合成cDNA。將所合成的cDNA用作模板并加入每種引物各IOpmol。然 后，用 IOxTaq 聚合酶緩沖液(250 μ M MgCl2UOOyM dNTP、1 單位 Ex-Taq 聚合酶(Takara)) 與其反應(yīng)以將總體積調(diào)節(jié)到20 μ L，反應(yīng)條件為在94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、 720C 1分鐘，重復(fù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，然后為75°C 5分鐘。 將上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到用于PCR克隆的pCR2. 1載體(Invitrogen)中，從 而構(gòu)建了 PCR2. I-Psy載體。(2-2)細(xì)菌CrtI基因的分離為克隆源自噬夏孢歐文菌20D3的SEQ ID NO :8的胡蘿卜素去飽和酶基因(CrtI)， 從KACC(韓國農(nóng)用微生物保存中心)獲得細(xì)菌ATCC 19321菌株。通過使用常規(guī)分子克隆 方法提取細(xì)菌基因組DNA。將此基因組DNA用作模板并加入對(duì)細(xì)菌CrtI基因特異的引物對(duì) SEQ ID NO 11 (CrtI-Fw 引物)和 SEQ ID NO 12 (CrtI-Rv 引物)各 IOpmol。然后，將其與 IOxTaq 聚合酶緩沖液(250 μ M MgCl2,100 μ M dNTP、1 單位 Ex-Taq 聚合酶(Takara))混合 以將總體積調(diào)節(jié)到20 μ L，反應(yīng)條件為在94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分 鐘，重復(fù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，然后為75°C 5分鐘。結(jié)果分離到細(xì)菌CrtI基因。然后，將上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy載 體(Promega)中，構(gòu)建了 pGEM-Crtl 載體。<實(shí)施例3>用于β -胡蘿卜素生產(chǎn)的PAC基因的制備 _2] (3-1)八氡,番茄紅素合因禾Π 2Α序歹I丨的連接為制備β-胡蘿卜素誘導(dǎo)的PSY和CrtI基因的多順反子PAC基因，首先將限制性 內(nèi)切酶HindIII和PstI的識(shí)別位點(diǎn)連接到PSY基因的末端。具體地，將在實(shí)施例2_1中制 備的pCR2. I-Psy載體用作模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO 13 (5H_Psy引物)和SEQ ID NO: 14(3P-Psy引物)各lOpmol。然后，將其與IOxTaq聚合酶緩沖液(250 μ M MgCl2UOOyM dNTP、1單位Ex-Taq聚合酶(Takara))反應(yīng)以將總體積調(diào)節(jié)到50 μ L，反應(yīng)條件為在94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘，重復(fù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，然后為75°C下5分鐘。 結(jié)果，用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI消化所得PCR產(chǎn)物，然后克隆到經(jīng)相同酶消化的質(zhì) 粒pBS-st2A(見實(shí)施例1)中st2A序列的5'-上游區(qū)域。從而構(gòu)建了 pBS-Psy-st2A載 體。(3-2) TP序列的克隆所述細(xì)菌CrtI基因需與一個(gè)可將PSY酶移向β -胡蘿卜素(合成位點(diǎn)葉綠 體、淀粉體等)的額外導(dǎo)肽(Tp)連接，盡管植物源PSY基因天然具有Tp信號(hào)。因此，將 rbcS-Tp(150bp)基因一一種從rbcS (核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基)基因分離的水稻Tp-按照下述方式克隆到CrtI基因的5'-上游區(qū)域。
將含有水稻rbcS基因的pSK-RTG載體用作模板(Jang et al.，1999，Mol. Breeding，5 :453-461)并加入在Tp序列的兩端含有限制性內(nèi)切酶PstI和NcoI的識(shí)別位 點(diǎn)的引物對(duì) SEQ ID NO :15(5P-Tp 引物)和 SEQ IDNO :16 (3Nc_Tp 引物)。然后，在 94°C 10 秒、60°C 10秒、72°C 10秒、72°C 1分鐘的條件下簡單進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果，用限制性內(nèi)切酶PstI和NcoI消化上面擴(kuò)增的160bp PCR產(chǎn)物，然后克隆到 經(jīng)相同酶消化的PGEM-T easy載體中。從而構(gòu)建了 pGEM_Tp載體。(3-3) TP序列和CrtI基因的連接為將CrtI基因克隆到Tp序列的上游區(qū)域，在CrtI基因的兩端連接限制性內(nèi)切酶 NcoI和ApaI的識(shí)別位點(diǎn)并且將其連接到pGEM-Crtl載體中。將pGEM-Crtl載體用作模板 并加入引物對(duì) SEQ ID NO :17(5Nc-CrtI 引物)和 SEQ ID NO 18 (3Ap_CrtI 引物)。然后， 在與CrtI基因擴(kuò)增的條件相同的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。用限制性內(nèi)切酶NcoI和ApaI消化1. 5kb的所述PCR產(chǎn)物，然后將其克隆到經(jīng)相 同酶消化的pGEM-Tp載體中Tp序列的3'-下游區(qū)域。從而構(gòu)建了 pGEM-Tp-Crtl載體。(3-4)氡黼浦鋪細(xì)、2A麻"禾口古膀卜縣細(xì)歸_連接將pGEM-Tp-Crtl載體包含的Tp-CrtI基因插入到pBS_Psy-st2A載體包含的 Psy-st2基因的3' _下游區(qū)域，并使兩個(gè)基因的編碼框一致。首先，在Tp-CrtI基因的兩 端引入限制性內(nèi)切酶SmaI和XbaI的識(shí)別位點(diǎn)。將所述Tp-CrtI基因克隆到pBS-Psy-st2A 載體中。具體地，將PGEM-Tp-CrtI載體用做模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO 19 (5Sm-TpCrtI 引物)與SEQ ID N0:20(3Xb-TpCrtI引物)。然后，在與CrtI基因擴(kuò)增的條件相同的條件 下進(jìn)行PCR反應(yīng)。用限制性內(nèi)切酶SmaI和XbaI消化1. 642kb的所述PCR產(chǎn)物，然后將其克隆到 經(jīng)相同酶消化后的pBS-Psy-st2A載體中Psy-st2A序列的3'-下游區(qū)域。從而構(gòu)建了 pBS-Psy-st2A-Tp-CrtI,即pBS-PAC載體。最終，通過再一次對(duì)總核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序分析 將最終的PAC融合基因鑒定為具有2，952bp的總核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。<實(shí)施例4>用于水稻轉(zhuǎn)化的重組載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(4-1)用于水稻轉(zhuǎn)化的重組載體的構(gòu)建為構(gòu)建用于水稻轉(zhuǎn)化以誘導(dǎo)水稻胚乳特異性表達(dá)的重組載體，將在實(shí)施例3中 制備的PBS-PAC載體用作模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO :21 (PAC-B1引物)和SEQ ID NO: 13(PAC-B2引物)各lOpmol。然后，將其與IOxTaq聚合酶緩沖液(250 μ M MgCl2UOOyM dNTP、1單位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以將總體積調(diào)節(jié)到50 μ L，在以下條件下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘，重復(fù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)， 再在68°C下10分鐘。在這種情況下，為在兩端包含部分細(xì)菌特異的核苷酸序列(attBl和 attB2)(各為12bp)，設(shè)計(jì)了引物對(duì)SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :13。因此，當(dāng)噬菌體感染 細(xì)菌時(shí)，可特異地?cái)U(kuò)增PAC基因。將上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(2，976bp)用作模板并加入引物對(duì)SEQ IDNO 25 (attBl引 物)與SEQ ID NO :26(attB2引物)各2pmol。然后，將其與IOxTaq聚合酶緩沖液(250 μ M MgCl2,100 μ M dNTP、1單位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以將總體積調(diào)節(jié)到50 μ L，并在 950C 3分鐘、94°C 30秒、45°C 30秒、68°C 2分鐘，重復(fù)反應(yīng)5個(gè)循環(huán)；然后在94°C 30秒、55°C 30秒、68°C 2分鐘，重復(fù)反應(yīng)20個(gè)循環(huán)；然后在68°C下放置10分鐘。在這種情況下， 為在重組噬菌體感染細(xì)菌后在兩端包含整個(gè)細(xì)菌特異的核苷酸序列(attBl和attB2)(各 為 29bp)，設(shè)計(jì)了 引物對(duì) SEQID NO 23 和 SEQ ID NO :24。加入BP克隆酶(Invitrogen)后，在重組噬菌體感染細(xì)菌后在兩端含有細(xì)菌特異 的核苷酸序列(attBl和attB2)的PCR產(chǎn)物首先與在重組噬菌體感染細(xì)菌后在兩端含有細(xì) 菌特異的核苷酸序列(attPl和attP2)的pD0NR201載體(Invitrogen)在25°C下反應(yīng)1小 時(shí)。通過此BP反應(yīng)，構(gòu)建了 pENTR-PAC載體。 為將pENTR-PAC載體中包含的PAC基因克隆到用于水稻轉(zhuǎn)化的最終載體中，加入 LR克隆酶(Invitrogen)后，用Myungji University 生產(chǎn)的pMJ-103載體(Green Gene Bio) 在25°C下進(jìn)行第二步反應(yīng)1小時(shí)。通過此所謂的LR反應(yīng)，構(gòu)建了用于水稻轉(zhuǎn)化的pGlb-PAC 載體(見圖1)。在這種情況下，PMJ-103載體為一種含有水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb) 啟動(dòng)子、土豆蛋白酶抑制劑II (Pin II)終止子和在35S啟動(dòng)子下游作為植物選擇性標(biāo)記的 除草劑抗性Bar基因的通道載體，而其骨干為pSBl 1載體，一種含有作為選擇性標(biāo)記的壯觀 霉素抗性基因的超二元質(zhì)粒。(4-2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化使用一種常規(guī)方法(三親交配)將PGlb-PAC載體引入用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌 中。具體地，將用含有超二元質(zhì)粒的PSBl載體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404在添加有四環(huán) 素(10mg/L)的AB培養(yǎng)平板上在28°C下培養(yǎng)2-3天，其中所述超二元質(zhì)粒包括vir基因， 并將含有一種夫妻輔助質(zhì)粒(conjugal helper plasmid) pRK201的大腸桿菌HBlOl和含有 pGlb-PAC載體的大腸桿菌DH-5ci分別在添加有卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(50mg/L) 的LB培養(yǎng)平板上在37°C下過夜培養(yǎng)，從而收集全部3種菌落。將這3種菌落混合并在營養(yǎng)瓊脂平板(Difco)上在28°C下過夜培養(yǎng)。將所得細(xì)菌 用培養(yǎng)肉湯(或水)稀釋10倍，在添加有壯觀霉素(50mg/L)和四環(huán)素(10mg/L)的AB培 養(yǎng)平板(AB-st)上劃線以分離單個(gè)細(xì)胞，然后在28°C下培養(yǎng)3天。將AB培養(yǎng)平板(AB_st) 上出現(xiàn)的單個(gè)菌落再次劃線并在28°C下培養(yǎng)3天以選擇最終的單個(gè)菌落(根癌農(nóng)桿菌 LBA4404pGlb-PAC)。將所得農(nóng)桿菌接種到添加有壯觀霉素(50mg/L)和四環(huán)素(10mg/L) 的YEP培養(yǎng)肉湯(YEP-st)中并在28°C下振蕩培養(yǎng)2天。然后，分離質(zhì)粒以分析限制性消 化模式。結(jié)果，再次確定了農(nóng)桿菌被PGlb-PAC基因轉(zhuǎn)化。接著，使用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 pGlb-PAC來轉(zhuǎn)化水稻。<實(shí)施例5>使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻為了轉(zhuǎn)化水稻，使用成熟的種子。首先，將水稻(洛東稻)的種子去皮，在70%的 乙醇中浸泡1分鐘，用蒸餾水洗滌2-3次，然后用2%的次氯酸鈉(商品"R0X")溶液消毒 表面，同時(shí)攪拌20分鐘。然后，將所得種子用蒸餾水消毒4-5分鐘，用濾紙干燥并置于愈傷 組織誘導(dǎo)平板(N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3 %蔗糖、2mg/L 2，4_D、 0.25%植物凝膠，pH 5.8)上。將所得種子在黑暗條件下在28°C下培養(yǎng)4-5周以生成愈傷 組織。然后，只選擇胚胎發(fā)生的愈傷組織，使其再分化為一株轉(zhuǎn)化植物。將被pGlb-PAC載體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404 pGlb-PAC培養(yǎng)30小時(shí)并用AAM 培養(yǎng)肉湯(含IOOmM乙酰丁香酮)稀釋至0D600值為1. 0-1. 2的細(xì)胞濃度。然后，將所述 農(nóng)桿菌與所述胚胎發(fā)生的愈傷組織孵育15分鐘。將所得愈傷組織在消毒的濾紙上干燥并在共培養(yǎng)平板(N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3%蔗糖、2mg/L 2，4_D、 IOOmM乙酰丁香酮、0. 25%植物凝膠)上在24°C下黑暗共培養(yǎng)2_3天。為除去殘留在表面上的農(nóng)桿菌，將所述共培養(yǎng)愈傷組織用含有頭孢噻肟(250mg/ L)的AAM培養(yǎng)肉湯洗滌，用消毒的濾紙覆蓋而除去水分，并轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基(N6基礎(chǔ) 培養(yǎng)基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3 %蔗糖、2mg/L 2，4_D、0. 25 %植物凝膠、6mg/ L草銨膦、250mg/L頭孢噻肟，pH 5.8)以只收集轉(zhuǎn)化的愈傷組織。然后，每兩周用新鮮的選 擇培養(yǎng)基將所得愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在5周后使用用于植物再分化的培養(yǎng)基(MS基 礎(chǔ)培養(yǎng)基、3%蔗糖、0. 5mg/L NAA(萘乙酸)、2mg/L激動(dòng)素、250mg/L頭孢噻肟、3mg/L草銨 膦、0.3%植物凝膠，pH 5.8)再培養(yǎng)。誘導(dǎo)后，在通氣條件下在MS培養(yǎng)基上純化所得植物。每步中所用的培養(yǎng)基條件示于下表1中?！幢?>
從培養(yǎng)瓶中收集上面培養(yǎng)的植物。將所述根用水洗滌，轉(zhuǎn)移到裝滿稻田土壤的新 塑料瓶中并在溫室中培育。<實(shí)施例6>對(duì)從轉(zhuǎn)化水稻收獲的種子的鑒定根據(jù)種子的黃色比較被上面獲得的PGlb-PAC基因(PAC2-1、2_2、4_2、4_3、5、7、8、 9、10和11)轉(zhuǎn)化的10株再分化的水稻，這是由于它們?cè)诓煌碾A段再分化一PAC2-l、2-2、 4-2和4-3系在T3種子中產(chǎn)生β-胡蘿卜素，PAC9、10和11系在Τ2種子中產(chǎn)生β -胡蘿
卜素，而PAC5、7和8系在Tl種子中產(chǎn)生β-胡蘿卜素。收獲每系的成熟種子后，用水稻脫殼機(jī)(TR-200電動(dòng)水稻脫殼機(jī)，Kett產(chǎn)品)去 殼，然后用精米機(jī)(Pearlest精米機(jī)，Kett)精制1分鐘以去除糊粉層。將這些精制的大米相互比較。結(jié)果，觀察到不管是T2還是T3代，PAC10、ll、2-l、2-2和4-2(4-3)系都呈現(xiàn)相似的黃色，如圖3所示。在T2代中，PAC9呈現(xiàn)比PAClO和11更淡的黃色。此外，Tl代的 PAC5、7和8趨于呈現(xiàn)淡黃色。<實(shí)施例7>棺物轉(zhuǎn)化的分析(7-1)通過PCR分析轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)化的水稻中，收集帶有葉組織的PAC9、10、11、2-1、2-2、4-2和4-3。然后，使 用基因組DNA純化試劑盒(I. J. BIO DNA System)分離并純化基因組DNA。通過用UV分光 光度計(jì)在A260/A280下測(cè)量光密度來對(duì)所得DNA洗出液進(jìn)行定量。將IOOng的基因組DNA 用作模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO :25 (Psy-CT-Fw引物)和SEQ ID NO 26 (CrtI-NT-Rv引 物)以進(jìn)行PCR反應(yīng)(94°C 2分鐘、95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 30秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)， 再在72°C下放置5分鐘)。結(jié)果，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化水稻中觀察到370bp的PCR產(chǎn)物。從而鑒定出每系都被完 全地轉(zhuǎn)化。(7-2)通過DNA印跡的轉(zhuǎn)化分析將5μ g在實(shí)施例(7-1)中提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶XbaI消化并進(jìn)行瓊 脂凝膠電泳，通過常規(guī)DNA印跡方法分析。然后，將其通過毛細(xì)管反應(yīng)轉(zhuǎn)移到NC (硝酸纖維 素)膜上并用1. 5kb的32P-標(biāo)記的CrtI基因作為探針進(jìn)行印跡。結(jié)果，如圖4B(左)所示，除PAC 2-2以外，在PAC 9、10、11、2_1、4_2和4-3中都 觀察到了 4. Ikb的插入基因。此外，為通過進(jìn)行DNA印跡計(jì)算基因拷貝數(shù)，將5 μ g相同的基因組DNA用限制性 內(nèi)切酶EcoRI消化，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳分析，再轉(zhuǎn)移到NC膜上并使用1. 5kb的32P-標(biāo)記的 CrtI基因作為探針進(jìn)行印跡。結(jié)果，如圖4B(右)所示，由于PAC4-2和PAC4-3具有相同的信號(hào)模式，因此證明 它們?yōu)橄嗤南?。此外，PAClO和11清晰地顯示出兩個(gè)Mar信號(hào)帶(左邊1. 3kb的Mar信 號(hào)帶；右邊由于水稻基因組DNA在未知位點(diǎn)被限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，因此根據(jù)插入位 點(diǎn)不同而大小不同的Mar信號(hào)帶)。通過使用Mar基因作為探針，此結(jié)果證明插入了一個(gè)基 因拷貝。此外，PAC9、2-1和2-2分別顯示出1、2和1個(gè)Mar信號(hào)帶，并被估計(jì)具有一個(gè)拷 貝插入。否則，據(jù)猜測(cè)，當(dāng)轉(zhuǎn)化水稻的基因組DNA時(shí)，它們可引發(fā)插入基因的重排。<實(shí)施例8>植物轉(zhuǎn)化體的基因表達(dá)分析從由轉(zhuǎn)化植物收獲的水稻中提取總RNA并通過進(jìn)行RT-PCR分析以根據(jù)多順反子 位點(diǎn)檢測(cè)PAC基因的表達(dá)。具體地，為提取總RNA，每系取Ig水稻樣品浸泡約2小時(shí)，在液 氮下用混合碗充分粉碎并與5mL RNA提取緩沖液[200mM Tris-HCl (pH 9. 0)、400mM LiCl、 25mM EDTA (pH 8. 2)U% SDS]以及5mL苯酚混合。將所述混合物轉(zhuǎn)移到15mL的試管中，以 3000rpm離心10分鐘，將上清液層小心地轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中。然后，加入ImL氯仿和ImL 苯酚，振蕩混合并再次以3000rpm離心10分鐘以收集上清液。然后，小心地將所述上清液 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中，在加入2mL氯仿后充分振蕩混合以萃取所述溶液。將此過程重復(fù)兩 次。將所得上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中，并在加入2. 5倍體積等量的乙醇和0. 1倍體積等 量的3M(乙酸鈉，pH 5. 2)后在-20°C下儲(chǔ)存1小時(shí)。然后，以12，OOOrpm在4°C下離心10分鐘以收集DNA和RNA沉淀，溶解于2M氯化鋰(LiCl)溶液中并在_20°C下孵育2小時(shí)以上以沉淀RNA。將所得RNA沉淀用80% EtOH洗滌一次并溶解于80-100 μ L的DEPC溶液。 通過用UV在Α260/Α280處測(cè)量光密度來對(duì)所述RNA提取物進(jìn)行定量，以進(jìn)行mRNA選擇性 RT-PCR。將1 μ g的總RNA用作模板并使用商品試劑盒(TAKARA mRNA選擇性RT-PCR試劑 盒[IxRT緩沖液、5mM MgCl2UmM dNTP、50yM Oligo dT引物、核糖核酸酶抑制劑(0. 8單位 / μ L)、AMV RTase XL (0· 1單位/ μ L) ] Takara,日本)進(jìn)行擴(kuò)增。為合成cDNA,將其在30°C 下反應(yīng)10分鐘，在42°C下反應(yīng)30分鐘，然后在4°C下冷卻。所合成的cDNA與下列引物對(duì) 反應(yīng)。精確地，加入PST基因特異的引物對(duì)SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10 ;Tp_CrtI基因 特異的引物對(duì)SEQ ID N0:19和SEQ ID NO :20 ；對(duì)PAC基因的st2A序列的SL (小長度)特 異的引物對(duì)SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26 ；擴(kuò)增PAC基因全長(PAIC-F1和PAIC-Rl引 物)的引物對(duì)SEQ ID N0:27和SEQ ID NO :28 ；以及確認(rèn)RNA的固定相對(duì)量的水稻谷蛋白 特異的引物對(duì)SEQ ID N0:29和SEQ ID NO :30各IOpmol。然后，將其與IOxTaq聚合酶緩 沖液(250 μ M MgCl2,100 μ M dNTP、1單位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以將總體積調(diào)節(jié) 到50 μ L，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分 鐘，重復(fù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，再在68°C下放置10分鐘。特別地，根據(jù)合成基因的長度控制72°C 下的擴(kuò)增步驟，調(diào)節(jié)為對(duì)Psy基因1分鐘，對(duì)Tp-CrtI基因1. 5分鐘，對(duì)PAC_SL基因30秒， 對(duì)PAC_FL 3分鐘和對(duì)谷蛋白30秒。結(jié)果，如圖5所示，Psy基因、CrtI基因、PAC_SL基因、PAC_FL基因的全部轉(zhuǎn)錄物 都未在完整水稻種子(洛東稻)中檢測(cè)到，但所述全部轉(zhuǎn)錄物都在各自的轉(zhuǎn)化水稻種子中 以所估計(jì)的大小被清楚地檢測(cè)到。當(dāng)使用谷蛋白作為對(duì)照組時(shí)，在PIC轉(zhuǎn)化體的4個(gè)位點(diǎn) 比較基因表達(dá)的程度。盡管有些差異，但觀察到以10 > 2-1 > 4-2 > 9 > 11系順序降低。<實(shí)施例9>植物種子的分離和蛋白質(zhì)印跡分析從由轉(zhuǎn)化水稻收獲的水稻中提取粗蛋白并分析測(cè)量外源PAC蛋白的翻譯和積聚 程度。具體地，為了提取種子蛋白，用水浸泡每個(gè)水稻系的2個(gè)谷粒約2個(gè)小時(shí)，粉碎并 與 200 μ L 的尿素樣品緩沖液
混合。將所得溶液充分振蕩30分鐘，以13，OOOrpm在4°C下離心60分鐘 并小心地轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中。使用7. 5% Gradi-Gel II (ElpisBio)PAGE將上面提取的蛋白進(jìn)行定量并且離 心為20μ g，通過半干法將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。然后，將獲得的膜用 5%的脫脂奶粉包覆，并在加入1000 1稀釋的抗PSY多克隆抗體(來自Dr. Bile Camara, France)后，在含有 Tween-20 的 TBS 緩沖液[20mM Tris-HCl (ρΗ 7. 5)，137mM NaCl]中 反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后，用TBS緩沖液洗滌10分鐘并重復(fù)洗滌4次。將獲得的膜與6，000 1 稀釋的堿性磷酸酶(AP)-共軛二抗反應(yīng)1小時(shí)，然后用TBS緩沖液洗滌4次并轉(zhuǎn)移到塑料 袋中以顯色。使產(chǎn)色底物混合物(加有33 μ L的ΝΒΤ、16. 5 μ L BCIP的5mL堿性磷酸酶緩 沖液；Promega)均勻包覆在膜上并觀察著色程度。達(dá)到合適的著色時(shí)，加入終止溶液[加 有200 μ L的0. 5Μ EDTA (ρΗ 8. 0)的50mL TBS]并在室溫下干燥。結(jié)果，如圖6所示，PSY蛋白的表達(dá)在約IlOkDa的估計(jì)區(qū)域被檢測(cè)到，并以相當(dāng)近 似的量積聚，盡管在PAC2-1系中稍高。
<棚列10>植物種子中的類胡蘿卜含量的測(cè)量
(10-1)棺物種子I中的類胡I卜素含量的測(cè)丨量通過改造 Minguez-Mosquera et al. [Minguez-Mosquera et al. r J. Agric. Food Chem.，41，1616，1993]的方法完成了類胡蘿卜素的提取，HPLC定量等。為提取類胡蘿卜素和類胡蘿卜素酯，用攪拌器分別粉碎從普通水稻(洛東稻)和 轉(zhuǎn)化水稻PAC4-2收獲的3g水稻。攪拌加入200mL氯仿、250mL三蒸水、ImL 1 % BHT ( 丁基 化羥基甲苯的MeOH溶液)溶液和ImL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(蘇丹II)并過濾。重復(fù)此過程2_3次 來收集萃取的溶液。然后，將無水硫酸鈉加入萃取的溶液中以除去水分。將所得溶液用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，用50mL的乙醚重懸浮，然后加入2. 5mL的飽和KOH溶液在室溫下皂化16小 時(shí)。為了除去堿，用50mL的蒸餾水分餾溶劑并用無水硫酸鈉處理乙醚層以除去水分。然后， 將反應(yīng)產(chǎn)物濃縮，溶于含有BHT的ImL的MeOH TBME(叔丁基甲醚)(1 1，ν/ν)溶 液中，再用0. 45 μ m的過濾器過濾。將樣品儲(chǔ)存在小瓶中以待HPLC分析。在裝有Shimadzu IOAvp 泵和控制器的 PDA (SPD-MlOAvp)和 YMC (3 μ m-C3Q-反 相，250x4. 6mm)柱和前置柱(Delta-pak C185 μ mlOO A, Waters)上進(jìn)行 HPLC。使用溶劑 A(Me0H-MTBE-水-三乙基胺，90 6 4 0. 1，ν/ν/ν)和溶劑 B (MeOH-MTBE-水-三乙基 胺，6 90 4 0. 1，ν/ν/ν)作為流動(dòng)相。等強(qiáng)度溶劑A在梯度條件下流動(dòng)直至15分鐘 后達(dá)到100%，40分鐘后更換為100%溶劑B，45分鐘后再換為溶液Α，50分鐘后達(dá)到穩(wěn)定。 在450nm的波長和0. 8mL/min的流速下，上樣30 μ L的樣品并使用以下公式測(cè)量分析數(shù)據(jù)。含量(單位μ g/100g)=(樣品面積χ內(nèi)標(biāo)使用量(0. 5mg)x轉(zhuǎn)化因子 (100000))/(內(nèi)標(biāo)面積X使用樣品量(3g))在這種情況下，除蘇丹II、α-和β-胡蘿卜素(Sigma)以外的大部分標(biāo)準(zhǔn)物都是 從Extrasynthese獲得的。這些步驟在黑暗條件下進(jìn)行并在所有溶劑中加入BHT以防 止酸化。將所述溶液用鋁箔包裹并儲(chǔ)存在_20°C下備用。結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)類胡蘿卜素(葉黃素、玉米黃質(zhì)、胡蘿卜素等)時(shí)， 觀察到PAC4-2系含有相當(dāng)多的總類胡蘿卜素(548yg/100g)，尤其是β-胡蘿卜素 (403μ g/100g)。(10-2)植物種子II中的類胡蘿卜素含量的測(cè)量為獲得更客觀的含量數(shù)據(jù)，首先請(qǐng)求食品分析的權(quán)威組織韓國食品研究所(Korea Food Research Institute)對(duì)3種轉(zhuǎn)化水稻樣品(普通洛東稻、PAC2-1和PAC4-2)進(jìn)行 了 胡蘿卜素分析。然后，又請(qǐng)求韓國食品研究所對(duì)4種轉(zhuǎn)化水稻樣品(普通洛東稻、 PAC4-2、PAC10-3 和 PACl 1-2)進(jìn)行了 β _ 胡蘿卜素分析[Food Code (2006)，Analysis of TraceNutrients]。結(jié)果，在首次分析中觀察到PAC2-1和PAC2-1系分別包括0. 474mg/100g和 0. 536mg/100g的β -胡蘿卜素水平，但在普通水稻(洛東稻)中根本未檢測(cè)到β _胡蘿
卜素。在第二次分析中，檢測(cè)到PAC4-2、PAC10-3和PACl 1-2分別包括1. 271mg/100g、 l.OOOmg/lOOg和0.910mg/100g的β -胡蘿卜素水平。因此，確定了當(dāng)引入本發(fā)明的多順反 子重組PAC基因時(shí)，每IOOg水稻中生成約0. 5-1.3mg的β -胡蘿卜素?！磳?shí)施例11>源自CrTMV(感染十字花科植物的煙草花葉病毒)的內(nèi)部核糖體結(jié)合 位點(diǎn)的合成
內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一種取代帽結(jié)構(gòu)的機(jī)制，一種常見的真核生物翻譯機(jī)制，見于病毒、昆蟲、動(dòng)物等。CrTMV-IRES序列(SEQ ID NO 31)源自一種植物病毒CrTMV(感 染十字花科植物的煙草花葉病毒)，并對(duì)應(yīng)衣殼蛋白上游的150bp。為合成CrTMV-IRES序 列，設(shè)計(jì)了由分別在21、20和25mer重疊的53、53、54和56mer構(gòu)成的4種引物(1F，SEQ ID NO 32 ；2R, SEQ ID NO 33 ；3F, SEQ ID NO 32 ；4R, SEQ ID NO 32)。IF(5' -ACGAATTCGTCGATTCGG TTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGA-3' :SEQ ID NO 32),2R(5' -ACTACACCCTTTTCTTCA ACCTTCTTTTTCCTTCTTTTAAAGTTGTCAACCGC-3' :SEQ ID NO 33),3F(5' -GTTGAAGAAAAGGGTGTA GTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCC-3' :SEQ ID NO 34)，and4R(5' -TTTCTTCTTTCAAATTAA ACGAATCAGGACCGGCGTACTTCTCCGGTCTGTACTTA-3' :SEQ ID NO 35)將每種合成引物稀釋至40pmOle/yL。然后，制備含有IF和4R引物各1 μ L以 及2R和3F引物各2μ L的反應(yīng)混合物作為底物和引物，并在下列條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)95°C 10秒、58°C 10秒、72°C 10秒，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。將所得150bp的PCR產(chǎn)物連接到 pGEM-T easy載體(Promega)中并通過進(jìn)行核苷酸測(cè)序來分析。構(gòu)建了 pCrTMV-IRES載體 并用于以下實(shí)驗(yàn)。<實(shí)施例12>克降多順/i子PIC某因以牛產(chǎn)β -胡I卜素為了制備生產(chǎn)β-胡蘿卜素的PSY和CrtI的多順反子PIC基因，需要再將導(dǎo)肽 (Tp)- 一種對(duì)將CrtI酶蛋白移向β -胡蘿卜素生物合成位點(diǎn)(質(zhì)體如葉綠體和淀粉體) 必需的轉(zhuǎn)移信號(hào)一連接到細(xì)菌CrtI基因上。因此，將源自水稻核酮糖二磷酸羧化酶/氧 合酶小亞基(rbcS-Tp)的150bp的Tp基因連接在CrtI基因的5'-上游區(qū)域。為此，將包 含水稻rbcS基因的pSK-RTG載體用作模板并加入在兩端含有限制性內(nèi)切酶PstI和NcoI 的識(shí)別位點(diǎn)的引物對(duì)SEQ ID NO :36(5PTp引物)和SEQ ID NO :37 (3Nc_Tp引物)來進(jìn)行 PCR0然后，將160bp的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶PstI和NcoI消化并連接到pGEM_T easy 載體中。從而構(gòu)建了 PGEM-Tp載體。為在Tp序列的下游連接CrtI基因，在CrtI基因的兩端加入限制性內(nèi)切酶NcoI 和ApaI的識(shí)別位點(diǎn)。具體地，將pGEM-Crt I載體用作模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO 38(5Nc-CrtI 引物)與 SEQ ID NO :20(3Ap_CrtI 引物)來進(jìn)行 PCR0 然后，將 1. 5kb 的 PCR 產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoI和ApaI消化并連接到經(jīng)相同酶消化的pGEM_Tp載體中Tp序列 的3'-下游區(qū)域。從而構(gòu)建了 pGEM-Tp-Crtl載體。為在CrTMV-IRES基因的末端引入限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)，將 pCrTMV-IRES載體用作模板并加入引物對(duì)SEQ ID NO :40(5SacIRES引物)和SEQ ID NO 41 (3SacBamIRES引物)來進(jìn)行PCR。然后，將所得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SacI消化并 連接到經(jīng)相同酶消化的pGEM-Tp-Crtl戴體中。從而構(gòu)建了 pGEM-IRES-TpCrtl載體。為將Psy基因克隆到CrTMV-IRES基因的上游，用限制性內(nèi)切酶EcoRI 消化pCR2. I-Psy載體以分離1，257bp的Psy基因并將其連接到經(jīng)相同酶消 化的pGEM-IRES-TpCrtl載體上。然后，分析所述核苷酸序列。從而構(gòu)建了pGEM-Psy-IRES-TpCrtl (或pGEM-PIC載體)。整個(gè)PIC基因的核苷酸序列由3，077bp組成 (SEQ ID NO 42)。<實(shí)施例13>用于水稻轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的構(gòu)建為構(gòu)建用于水稻轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)水稻內(nèi)胚乳特異表達(dá)的質(zhì)粒載體，將pGEM-PIC載體 用作模板并設(shè)計(jì)引物對(duì)SEQ ID NO :43(PIC-B1引物)和SEQID NO 44 (PIC-B2引物)以在 兩端含有部分細(xì)菌特異性核苷酸序列(attBl和attB2)(各為12bp)。因此，當(dāng)噬菌體感染 細(xì)菌時(shí)，可特異地?cái)U(kuò)增PIC基因。進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增3101bp的PIC基因。當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，通過使用被設(shè)計(jì)為含有整個(gè)細(xì)菌特異性序列(各為29bp) 的引物對(duì)SEQ ID NO :45 (attBl引物)和SEQ ID NO :46 (attB2引物)，使用引物對(duì)(PIC-B1 和PIC-B2引物)擴(kuò)增PIC基因的PCR產(chǎn)物再次反應(yīng)。當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，將所得PCR產(chǎn)物克隆到含有噬菌體特異性序列(attPl和 attP2)的 pD0NR221 載體(Invitrogen)中。通過此 BP 反應(yīng)，構(gòu)建了 pENTR-PIC 載體。為將pENTR-PIC載體中包含的PIC基因轉(zhuǎn)移到用于水稻轉(zhuǎn)化的最后載體中， pMJ-103載體通過LR反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)以構(gòu)建用于植物轉(zhuǎn)化的pGlb-PIC載體(見圖9)。在這 種情況下，PMJ-103載體為一種含有水稻內(nèi)胚乳特異的球蛋白(Glb)啟動(dòng)子、土豆蛋白酶抑 制劑II (Pin II)終止子和在35S啟動(dòng)子下游作為植物選擇性標(biāo)記的除草劑抗性Bar基因 的通道載體，而其骨干為PSBll載體，一種含有作為選擇性標(biāo)記的壯觀霉素抗性基因的超 二元質(zhì)粒。使用一種常規(guī)方法(三親交配)將pGlb-PIC載體引入用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌 中。具體地，將用含有超二元質(zhì)粒的PSBl載體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404在添加有四環(huán)素 (10mg/L)的AB培養(yǎng)平板(AB-t)上在28°C下培養(yǎng)2_3天，其中所述超二元質(zhì)粒包括vir基 因。2天后，將含有一種夫妻輔助質(zhì)粒pRK201的大腸桿菌HBlOl和含有pGlb-PIC載體的大 腸桿菌DH-5 α分別在添加有卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)平板上在 37°C下過夜培養(yǎng)，從而收集全部3種菌落。將這3種菌落與注射環(huán)混合，并且在營養(yǎng)瓊脂平 板(Difco)上在28°C下過夜培養(yǎng)。將所得細(xì)菌用培養(yǎng)肉湯(或水)稀釋10倍，在添加有壯 觀霉素(50mg/L)和四環(huán)素(10mg/L)的AB培養(yǎng)平板(AB_st)上劃線以分離單個(gè)細(xì)胞，然后 在28°C下培養(yǎng)3天。將AB培養(yǎng)平板(AB-st)上出現(xiàn)的單個(gè)菌落再次劃線并在28°C下培養(yǎng) 3天，以當(dāng)再次出現(xiàn)時(shí)選擇最終的單個(gè)菌落(根癌農(nóng)桿菌LBA4404pGlb-PAC)。將所得農(nóng)桿 菌接種到添加有壯觀霉素(50mg/L)和四環(huán)素(10mg/L)的YEP培養(yǎng)肉湯(YEP_st)中并振 蕩培養(yǎng)2天。然后，提取質(zhì)粒以分析限制性消化模式。結(jié)果，再次確定了農(nóng)桿菌被pGlb-PIC 基因轉(zhuǎn)化。。接著，使用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 pGlb-PIC來轉(zhuǎn)化水稻。。<實(shí)施例14>農(nóng)桿菌植物轉(zhuǎn)化和收獲水稻轉(zhuǎn)化體后種子的顏代如實(shí)施例5所述完成相同的程序，但使用pGlb-PIC載體替代pGlb-PAC載體來轉(zhuǎn) 化水稻。結(jié)果，根據(jù)種子的黃色深度比較7株上述獲得的pGlb-PIC基因(PIC_3、4、5、6、7、8和9)轉(zhuǎn)化的再分化水稻。由于它們分別在不同的階段再分化，因此檢測(cè)在T2種子中產(chǎn) 生β-胡蘿卜素的PIC4、5、6、7和8系以及在Tl種子中產(chǎn)生β -胡蘿卜素的PIC3和9系 以比較在產(chǎn)生胡蘿卜素后呈現(xiàn)的黃色深度。收獲后，將每系的成熟種子用水稻脫殼機(jī) (TR-200電動(dòng)水稻脫殼機(jī)，Kett產(chǎn)品)去殼，然后用精米機(jī)(Pearlest精米機(jī)，Kett)精制1分鐘以去除糊粉層。將這些精制的水稻相互比較。因此，用裸眼觀察到PIC8呈現(xiàn)最深的黃色而PIC4、5、6和7呈現(xiàn)相似的比PIC8淡 的黃色。對(duì)于PIC3和9系，Tl代種子趨于呈現(xiàn)比T2代種子淺的黃色(見圖10)。<實(shí)施例15>棺物轉(zhuǎn)化體的分離、PCR分析和DNA印跡分析 在轉(zhuǎn)化的水稻中，選擇PIC4、5、6、7和8來收集葉組織。然后，使用基因組DNA純 化試劑盒(I. J.BIO DNA System)提取并純化基因組DNA。。通過用UV分光光度計(jì)在A260/ A280下測(cè)量光密度來對(duì)所得DNA洗出液進(jìn)行定量。將IOOng的基因組DNA用作模板并加入 IOpmol的含有CrTMV-IRES的引物對(duì)以進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述引物對(duì)由含有Psy基因C-末端 的 SEQ ID NO :47 的Psy-CT-Fw 引物和含有 CrtI 基因 N-末端的 SEQ IDNO :48 的 CrtI-NT-Rv 引物組成。將其與IOxTaq聚合酶緩沖液(250 μ MMgC12、100 μ M dNTP、1單位Pyrobest聚 合酶(Takara))以將總體積調(diào)節(jié)到20 μ L，并在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)95°C 30秒、 550C 30秒、72°C 30秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，再在72°C下延伸10分鐘。結(jié)果，如預(yù)期的發(fā)現(xiàn)了 460bp的PCR產(chǎn)物(見圖11)。每系取5μ g上面分離的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化并通過 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。然后，使用207bp的32P-標(biāo)記的Psy基因和420bp的CrtI基因 作為探針來識(shí)別插入基因。在除PIC8以外的PIC4、5、6和7中發(fā)現(xiàn)了 1. 4kb和4. Ikb的插 入基因。但在PIC8中，在用限制性內(nèi)切酶XbaI消化DNA后，當(dāng)用CrtI探針進(jìn)行DNA印跡 時(shí)檢測(cè)到了至少3個(gè)信號(hào)帶。因此，據(jù)猜測(cè)它們可引發(fā)CrtI基因周圍的插入基因的重排。 然后，為計(jì)算基因拷貝數(shù)，將5 μ g相同的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，通過瓊脂 凝膠電泳分析，并使用1.3kb的32P-標(biāo)記的Mar基因作為探針進(jìn)行印跡。結(jié)果，PIC5、6和7 清晰地顯示出兩個(gè)Mar信號(hào)帶(左邊1. 3kb的Mar信號(hào)帶；右邊由于水稻基因組DNA在 未知位點(diǎn)被限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，因此根據(jù)插入位點(diǎn)不同而大小不同的Mar信號(hào)帶)。 通過使用Mar基因作為探針，此結(jié)果證明插入了一個(gè)基因拷貝。此外，PIC4顯示出了 2個(gè) 基因拷貝的情況下期望的信號(hào)模式。PIC8顯示出了 3個(gè)以上基因拷貝的情況下期望的信號(hào) 模式(見圖12)。<實(shí)施例16>植物轉(zhuǎn)化體的RT-PCR分析從在轉(zhuǎn)化植物中收獲的水稻中提取總RNA，并分析以根據(jù)多順反子位點(diǎn)檢測(cè)PIC 基因的表達(dá)。具體地，為提取總RNA，每系取Ig水稻樣品浸泡約2小時(shí)，在液氮下用混合碗 充分粉碎并與 5mL RNA 提取緩沖液[200mMTris-HCl (pH 9. 0)、400mM LiCl、25mM EDTA (pH 8. 2)U% SDS]以及5mL苯酚劇烈混合。將所述混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)15mL的試管中，以 3，OOOrpm離心10分鐘并將上清液小心地轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中。然后，加入ImL氯仿和ImL 苯酚，振蕩并再次以3000rpm離心10分鐘以收集上清液。然后，小心地將所述上清液轉(zhuǎn)移到 一個(gè)新試管中，并在加入2mL氯仿后充分振蕩以萃取所述溶液。將此過程重復(fù)兩次。將所 得上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中，加入2. 5倍體積的乙醇和0. 1倍體積等量的3M乙酸鈉(pH 5. 2)，然后在-20°C下儲(chǔ)存1小時(shí)。然后，以12000rpm在4°C下離心10分鐘以收集DNA和 RNA沉淀，溶解于2M氯化鋰(LiCl)溶液中并在_20°C下孵育2小時(shí)以上以沉淀RNA。將所 得RNA沉淀用80 % EtOH洗滌一次并溶解于80-100 μ L的DEPC溶液。通過用UV在Α260/ Α280處測(cè)量光密度來對(duì)所述RNA提取物進(jìn)行定量，以進(jìn)行mRNA選擇性RT-PCR。將1 μ g的總RNA用作模板并使用商品試劑盒(TAKARA mRNA選擇性RT-PCR試劑盒[IxRT緩沖液、5mM MgCl2UmM dNTP、50yM Oligo dT引物、核糖核酸酶抑制劑(0. 1單位/ μ L)、AMV RTase XL (0· 1單位/ μ L) ]，Takara,日本)進(jìn)行擴(kuò)增。為合成cDNA,將其在30°C 下反應(yīng)10分鐘，在42°C下反應(yīng)30分鐘，然后在4°C下冷卻。。所合成的cDNA與下列引物對(duì) 反應(yīng)。精確地，使用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR，即PST基因特異的引物對(duì)SEQ IDN0:49和SEQ ID NO :50 ;Tp-CrtI 基因特異的引物對(duì) SEQ ID NO :51 禾口 SEQ ID NO :52 ；對(duì) PIC 基因的 460bp SL (小長度)的CrTMV-IRES序列特異的引物對(duì)SEQ ID NO 47和SEQ ID NO :48 ；擴(kuò)增PIC 基因全長的引物對(duì)SEQ ID N0:53和SEQ ID NO :54 ；以及確認(rèn)RNA的固定相對(duì)量的水稻谷 蛋白特異的引物對(duì)SEQ ID NO 66和SEQ ID NO :56。
結(jié)果，Psy基因、CrtI基因、PAC_SL基因、PAC_FL基因的全部轉(zhuǎn)錄物都未在完整水 稻種子(洛東稻)中檢測(cè)到，但所述全部轉(zhuǎn)錄物都在各自的轉(zhuǎn)化水稻種子中以估計(jì)大小被 清楚地檢測(cè)到。當(dāng)使用谷蛋白作為對(duì)照組時(shí)，在Pic轉(zhuǎn)化體的4個(gè)位點(diǎn)比較基因表達(dá)的程 度。據(jù)鑒定，所述表達(dá)在除PIC8以外的所有系中都是相似的(見圖13)。<實(shí)施例17>棺物轉(zhuǎn)化體的種子的HPLC分析請(qǐng)求食品分析的權(quán)威組織韓國食品研究所(Korea Food Researchlnstitute) 對(duì)轉(zhuǎn)化水稻樣品進(jìn)行了 β-胡蘿卜素分析[Food Code (2006), Analysis of Trace Nutrients]。結(jié)果，如預(yù)期的，觀察到PIC4、5、6和7系分別以相似的水平包括183 μ g/100g、 171μ g/100g、195y g/100g和206μ g/100g的β -胡蘿卜素，但在普通水稻(洛東稻)中未 檢測(cè)到β-胡蘿卜素。因此，確定了當(dāng)引入本發(fā)明的多順反子重組PIC基因時(shí)，每IOOg水 稻中生成約0. 2mg的β-胡蘿卜素。工業(yè)實(shí)用性如從前述可見的，本發(fā)明的融合多核苷酸和使用其的重組載體對(duì)八氫番茄紅素合 酶基因和胡蘿卜素去飽和酶基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)有作用。因此，本發(fā)明的融合多核 苷酸可用于調(diào)控生產(chǎn)胡蘿卜素的植物的生物合成代謝。此外，其還可用于有效增加一 種有用的代謝產(chǎn)物胡蘿卜素的含量。
權(quán)利要求
一種用于β-胡蘿卜素的生物合成的融合多核苷酸，其包含編碼八氫番茄紅素合酶的核苷酸序列、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和編碼胡蘿卜素去飽和酶的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述八氫番茄紅素合酶具有SEQID NO :5的多肽序列。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述胡蘿卜素去飽和酶具有SEQID NO :7的多肽序列。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述FMDV源2Α序列具有SEQID NO :3的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)基因具有SEQID NO 31的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述融合多核苷酸具有包括SEQNO ID :1所示核苷酸 序列的胡椒八氫番茄紅素合酶基因，水稻中優(yōu)化的FMDV源2A序列，以及細(xì)菌的胡蘿卜素去 飽和酶基因。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述融合多核苷酸具有包括SEQNOID :42所示核苷酸 序列的胡椒八氫番茄紅素合酶基因，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)基因，以及細(xì)菌的胡蘿卜 素去飽和酶基因。
8.—種重組載體，其包含一個(gè)啟動(dòng)子，以及與所述啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求1 的多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述載體為具有圖1的酶切圖譜的pGlb-PAC載體。
10.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述載體為具有圖9的酶切圖譜的pGlb-PIC載體。
11.一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其被選自權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacience)或毛 根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rbizogene)。
13.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其被選自權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化以合成β-胡蘿 卜素。
14.一種轉(zhuǎn)化的植物，其被選自權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化以合成β-胡蘿卜素。
15.權(quán)利要求14的植物，其為單子葉或雙子葉植物。
16.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物選自水稻、小麥、大麥、竹筍、玉米、芋頭、蘆筍、 洋蔥、大蒜、大蔥、韭蔥、野胡蒜、甘薯、生姜、擬南芥、茄子、煙草、胡椒、番茄、牛蒡、苘蒿、萵 苣、風(fēng)鈴草、菠菜、泰菜、番薯、旱芹、胡蘿卜、歐合葉子、西芹、白菜、卷心菜、小蘿卜、西瓜、甜 瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、草莓、大豆、綠豆、四季豆、百脈根、土豆、浮萍、青紫蘇、木豆、水仙、金 盞花和青豆。
17.一種轉(zhuǎn)化的蘑菇，其被選自權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化以合成β-胡蘿卜素。
18.一種用于制備胡蘿卜素的方法，包括(a)將含有本發(fā)明融合多核苷酸的重組載體引入細(xì)胞中；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞或從所述細(xì)胞中分化的植物；和(c)從培養(yǎng)后的細(xì)胞或植物中分離胡蘿卜素。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于β-胡蘿卜素的生物合成的融合多核苷酸以及用其生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法。更具體地，本發(fā)明涉及編碼八氫番茄紅素合酶、FMDV源2A序列或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的連接序列和胡蘿卜素去飽和酶的融合多核苷酸，以及用其生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法。本發(fā)明的融合多核苷酸和使用其的重組載體對(duì)八氫番茄紅素合酶基因和胡蘿卜素去飽和酶基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化體中的穩(wěn)定表達(dá)有作用。因此，本發(fā)明的融合多核苷酸可用于調(diào)控植物生產(chǎn)β-胡蘿卜素的生物合成代謝。此外，其還可用于有效增加β-胡蘿卜素(一種有用的代謝產(chǎn)物)的含量。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101842487SQ200880105082
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者D·H·金, H·R·鄭, J·B·金, J·K·金, L·Y·史, S·H·河, S·J·權(quán), S-C·徐, Y·M·金 申請(qǐng)人:韓國(管理:農(nóng)村振興廳)