專利名稱：兩步簇缺失和人源化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及，一般地，用于人源化小鼠的方法。具體地，本發(fā)明涉及利用同源重組 和位點(diǎn)特異性重組的組合將小鼠基因簇置換為來自相應(yīng)人簇的一種以上基因的方法。
背景技術(shù)：
小鼠模型是用于研究人疾病的非常寶貴的工具，并且廣泛用于研究許多疾病的進(jìn) 展，和檢驗(yàn)潛在治療法。常規(guī)地，已經(jīng)通過前核注射外源DNA產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。更近期，已 經(jīng)通過融合胚胎干細(xì)胞和含有細(xì)菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)的細(xì)胞產(chǎn)生 小鼠，所述細(xì)菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)包含目的外源基因和用于評(píng)估 外源DNA區(qū)段向胚細(xì)胞基因組內(nèi)整合的選擇性標(biāo)記，如例如W094/02602中所述。該方法依 賴于BAC或YAC通過同源重組的過程整合進(jìn)入胚胎干細(xì)胞基因組。由于處理BAC和YAC中 的技術(shù)要求，和通過使用大DNA構(gòu)建體引起的ES細(xì)胞的低轉(zhuǎn)染率，采用這種方式的轉(zhuǎn)基因 是耗時(shí)、低效且不準(zhǔn)確的。Wallace等(Cell (細(xì)胞)128，197-209 2007)近期描述了稱為重組酶介導(dǎo)的基因 組置換(RMGR)的方法。該方法使用位點(diǎn)特異性重組來將小鼠等位基因置換為直向同源基 因的人等位基因。將兩個(gè)不相互作用的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)(loxP和10x511)通過同源重 組插入到側(cè)鄰靶基因的小鼠染色體中。將同一對(duì)不相互作用的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)插入到 BAC中，從而側(cè)鄰靶基因的人等位基因。BAC向小鼠細(xì)胞中的引入，以及隨后位點(diǎn)特異性重 組酶的表達(dá)導(dǎo)致BAC和小鼠染色體的相容性位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的雙位點(diǎn)特異性重 組反應(yīng)(loxP/loxP和10x511/10x511)，和人基因序列相互交換為小鼠序列。然而，該方法 包含多個(gè)必須在胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行的步驟，從而導(dǎo)致低效，這主要是因?yàn)榧?xì)胞的核型經(jīng)常 受到破壞。因此仍然存在對(duì)最新型人源化小鼠方法的需要，該方法理想地應(yīng)該需要較少的 在胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行的步驟，并從而克服這些低效問題中的一些。另外，本發(fā)明開始解決人源化小鼠生成領(lǐng)域中的另一個(gè)問題。例如，前述用于產(chǎn)生 人源化小鼠模型的方法僅僅集中在將單內(nèi)源小鼠基因置換為相應(yīng)的人基因。這對(duì)于其中一 個(gè)小鼠基因?qū)?yīng)一個(gè)人基因的那些基因座是可接受的方法。然而，在進(jìn)化中，基因簇可以 發(fā)育，其經(jīng)常經(jīng)歷反復(fù)的變化，諸如復(fù)制和多樣化，所以所述簇在不同物種之間可以顯著不 同。因此，在簇內(nèi)，有時(shí)不可能確定物種之間的真正直向同源基因。在極端的情形中，在一 種物種的簇中可能僅存在一種功能基因，但是在另一物種中存在許多更多種的功能基因。 一種這樣的實(shí)例是代謝酶的CYP2D基因簇，其在人中僅表現(xiàn)出一種功能基因(CYP2D6)，但 是在小鼠中表現(xiàn)出9種功能基因。在該情形中，通過同源重組的常規(guī)基因靶向機(jī)制將單小 鼠基因置換為直向同源人基因?qū)⒉粚?dǎo)致功能人源化，這歸因于來自小鼠簇的剩余基因的表 達(dá)。此外，在許多情形中，一種基因的基因產(chǎn)物可以構(gòu)成全簇的主要功能性(例如人 CYP3A簇中的CYP3A4或人CYP2C簇中的CYP2C9)且可能不可能在另一種物種中確定該基因 的功能同源物。這導(dǎo)致關(guān)于應(yīng)該置換哪種基因和用什么置換的不確定性。另外成問題的是 這樣的現(xiàn)實(shí)，即由構(gòu)成全基因簇的小鼠染色體缺失大DNA片段可能不可能作為單一事件，因?yàn)槿绻∈笕旧w上的尋靶臂相距太遠(yuǎn)，則同源重組是低效的。產(chǎn)生人源化小鼠模型的方法，其中人源化基因座成功反映(mirror)等價(jià)的目的 人基因座，應(yīng)該容許更現(xiàn)實(shí)地研究關(guān)于該基因座處編碼的基因的功能，并促進(jìn)研究關(guān)于與 形成類似功能性的基因簇的一部分的基因有關(guān)的病癥的治療介入。本領(lǐng)域中已知位點(diǎn)特異性重組酶可以用于使同源重組靶向特定染色體位置(參 見Jessen等，1997)。該位點(diǎn)特異性重組酶的應(yīng)用容許重組在需要添加位點(diǎn)特異性重組酶 的條件下起始。US2007/0061900描述了用于人源化重鏈和輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)基因座的方 法。該方法包括向兩個(gè)載體，稱為L(zhǎng)TVEC中的每一個(gè)中插入位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，所述點(diǎn)特 異性重組位點(diǎn)是這樣排列從而與人免疫球蛋白可變區(qū)的一部分相鄰接。然后線性化這些 LTVEC并通過同源重組將其引入小鼠細(xì)胞基因組中，以使得位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)側(cè)鄰小鼠 免疫球蛋白可變區(qū)序列，且部分人免疫球蛋白可變區(qū)序列側(cè)鄰該位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。進(jìn) 行位點(diǎn)特異性重組切除小鼠免疫球蛋白可變區(qū)序列并使兩部分人免疫球蛋白可變區(qū)序列 與其中包含的剩余位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)連接。由此產(chǎn)生的小鼠生成包含人可變區(qū)和小鼠 恒定區(qū)的雜交抗體，通過需要的隨后的轉(zhuǎn)化步驟容許生成純?nèi)丝贵w。免疫球蛋白可變區(qū)的 區(qū)段性質(zhì)容許剩余的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)保持在核酸序列中，其具有很少的有害作用的機(jī) 會(huì)。然而，不存在關(guān)于該技術(shù)可以用于人源化非區(qū)段基因的指示，其中編碼該基因中的剩余 位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的核酸序列的存在應(yīng)該消除它的轉(zhuǎn)錄能力。相反，本發(fā)明的方法容許 通過在胚胎干細(xì)胞中的僅兩輪靶向完全人源化任何小鼠基因或基因簇。發(fā)明概述按照本發(fā)明，提供關(guān)于目的基因人源化小鼠的方法，包括a)將一對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)通過同源重組引入小鼠基因組，以使得待置換的小 鼠靶基因序列在每側(cè)側(cè)鄰重組位點(diǎn)；其中這兩個(gè)重組位點(diǎn)中的至少一個(gè)被構(gòu)建為與人置換基因序列相鄰接；且所述人置換基因序列被定位為使得所述重組位點(diǎn)位于所述人置換基因序列和 所述小鼠靶基因序列之間；b)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的重組，以使得將人序列引入到小鼠染色體中以 前被小鼠靶基因占據(jù)的位置，側(cè)鄰剩余位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。本發(fā)明機(jī)制的簡(jiǎn)單示意圖顯示在

圖1中。簡(jiǎn)言之，將兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)通 過兩個(gè)單獨(dú)的常規(guī)同源重組反應(yīng)，引入到胚胎干細(xì)胞中的小鼠染色體中。同源重組是本領(lǐng) 域中公知的現(xiàn)象，然而為了幫助理解，將同源重組機(jī)制的示意圖顯示在圖2中。兩個(gè)重組反 應(yīng)受到靶小鼠染色體和包含位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的置換核酸序列之間的同源短區(qū)的促進(jìn)。 這些同源區(qū)促進(jìn)鏈侵入和隨后的堿基配對(duì)，從而容許將各個(gè)重組位點(diǎn)插入小鼠染色體的鏈 延長(zhǎng)。在小鼠靶序列的一側(cè)或兩側(cè)，除位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)以外，置換核酸序列與意欲 用于置換小鼠靶序列的人基因序列相連。因此，將完整人置換基因序列和附著的位點(diǎn)特異 性重組位點(diǎn)同時(shí)插入到小鼠染色體中，從而導(dǎo)致圖1中所示的排列。兩個(gè)重組反應(yīng)一旦完 成，位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)應(yīng)該因此側(cè)鄰小鼠靶基因。兩個(gè)重組位點(diǎn)應(yīng)該以相同的方向排列， 如圖1中所示，從而容許它們?cè)谶m當(dāng)時(shí)重組在一起。
為了切除小鼠靶基因序列并將其置換為置換人基因序列，則隨后位點(diǎn)特異性重組 在兩個(gè)重組位點(diǎn)之間進(jìn)行。該機(jī)制描述在圖3中。這些重組事件導(dǎo)致小鼠靶基因序列的切 除，從而保持人置換基因序列位于以前被小鼠靶基因占據(jù)的小鼠染色體中，側(cè)鄰由重組事 件形成的剩余位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。本發(fā)明的方法具有許多優(yōu)勢(shì)。首先，其不必須需要用BAC或YAC處理并且其顯著 促進(jìn)人源化小鼠的產(chǎn)生，因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞階段需要的轉(zhuǎn)化步驟在數(shù)量上減少，即使與上述 Wallace方法相比。在本發(fā)明的方法中，在胚胎干細(xì)胞中需要最少2輪通過同源重組的常規(guī) 靶向，即在靶序列的一側(cè)引入位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)和在另一側(cè)引入位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)+ 人基因。然后所有需要的是單一缺失步驟，其中除去小鼠靶序列。這可以在體外或體內(nèi)進(jìn) 行。該方法學(xué)是更有效的，因?yàn)樗萕allace法少需要至少一個(gè)步驟，這在常規(guī)實(shí)踐中，轉(zhuǎn) 化為在ES細(xì)胞期減少約8周的工作，且顯著減小在多輪轉(zhuǎn)染過程中在ES細(xì)胞中累積破壞 的風(fēng)險(xiǎn)，所述多輪轉(zhuǎn)染可能致使這些細(xì)胞不能傳代種系。還存在其他關(guān)于該方法較后期效率的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榘凑毡景l(fā)明通過同時(shí)置換內(nèi)源小 鼠基因或簇來人源化基因或基因簇確保人基因位于與其置換的小鼠基因相同的位點(diǎn)處。因 此，當(dāng)與純合子雜交時(shí)，僅存在一個(gè)需要置換的基因座。相反，為了敲除小鼠基因和用位于 不同染色體的人基因替換其功能，存在復(fù)雜得多的遺傳背景。需要另外的雜交次數(shù)，從而獲 得小鼠敲除和人置換的純合子。本發(fā)明方法的特殊優(yōu)勢(shì)在其效率方面。如由Wallace的工作所證明地，試圖使用 重組酶介導(dǎo)的重組將大的染色體DNA區(qū)段置換為載體上類似尺寸的區(qū)段是極端低效的。效 率報(bào)告為達(dá)到1/108的數(shù)量級(jí)。相反，在本發(fā)明期間選擇的分子內(nèi)重組事件通常達(dá)到1/106 的數(shù)量級(jí)。此外，因?yàn)橛蒞allace使用的DNA的長(zhǎng)度是如此長(zhǎng)(達(dá)到200kb的數(shù)量級(jí))，所 以存在大量增加的發(fā)生分子內(nèi)重排和不希望的同源重組事件的機(jī)會(huì)，這增加形成無功能或 不正確的DNA結(jié)構(gòu)的機(jī)會(huì)。這些問題利用本發(fā)明的方法來避免。該方法導(dǎo)致產(chǎn)生在缺少等價(jià)小鼠基因的條件下表達(dá)人蛋白的小鼠；這些等價(jià)小鼠 基因在該方法期間從小鼠染色體中缺失。引入的人基因可以在其自身調(diào)節(jié)序列的控制下引入。備選地，可以安排遺傳重組 事件，從而使等價(jià)小鼠調(diào)節(jié)序列位于人序列的上游并因此在其適當(dāng)?shù)奈恢弥惺褂?。有時(shí)， 應(yīng)該需要保持小鼠的調(diào)節(jié)序列而非引入具有基因編碼序列的假定的人調(diào)節(jié)序列。例如，在 CYP3A4的情形中，構(gòu)建了人源化小鼠，其攜帶人啟動(dòng)子且其活性控制CYP3A4基因的調(diào)節(jié)。
Cheung ^ (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (I^JSf 禾口 實(shí)驗(yàn)療法雜志)316，1328-1334 2006)證明在這種安排下，CYP3A4蛋白不在成年雄性中表 達(dá)。因此假定一些啟動(dòng)子元件或其他因子必須存在，其是所用構(gòu)建體中缺少的。相反，通過 保留小鼠調(diào)節(jié)序列和代替人序列使用這些進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以保證保持引入基因的可靠調(diào)節(jié)和 避免所述問題。本發(fā)明方法超越常規(guī)技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是在等價(jià)小鼠基因的位點(diǎn)處的整合確保保 持基因定位的基因組背景，在所述常規(guī)技術(shù)中，人基因整合到小鼠染色體內(nèi)或多或少是隨 機(jī)的。通過在這樣的位點(diǎn)處整合，局部染色體結(jié)構(gòu)在這樣的含義下可能是“開放的”，所述含 義是轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄發(fā)生所需的其他蛋白可能接近染色體DNA。不僅如此，保持與內(nèi)源小鼠 基因相同的染色體背景，從而使得通過組蛋白結(jié)合和染色體局部折疊/解折疊在染色體三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄得到保持。這確?；蜣D(zhuǎn)錄的整體調(diào)節(jié)得到保持，從而使得關(guān) 于引入的人基因遵從與關(guān)于內(nèi)源小鼠基因觀察到的相同的基因調(diào)節(jié)組織分布。這種在基因 轉(zhuǎn)錄水平上的生理學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的完全保持不是現(xiàn)有技術(shù)中常見。本方法的其他優(yōu)勢(shì)涉及致命性問題，其由缺失重要基因或基因簇產(chǎn)生，特別是如 果存在關(guān)于缺失的基因或基因簇的單倍性不足，這在雜合動(dòng)物中導(dǎo)致致死。因?yàn)楸景l(fā)明的 方法同時(shí)缺失小鼠基因和將其置換為其人功能等價(jià)物，所以不存在由該基因編碼的功能受 到危害的時(shí)刻。因此，假如人蛋白的功能的確代替等價(jià)小鼠蛋白的功能，則該性質(zhì)的問題得 到避免。本發(fā)明還容許通過組合在染色體上的小鼠基因或簇的每側(cè)引入的兩個(gè)組成部分 (component halves)形成功能性人基因。在位點(diǎn)特異性重組以切除小鼠基因或簇時(shí)，將人 基因的組成部分集合在一起，從而形成功能性人基因。關(guān)于剩余RT位點(diǎn)破壞編碼序列的潛 在問題可以通過將該RT位點(diǎn)定位在內(nèi)含子中解決。同等地，本發(fā)明容許通常在人染色體中 不連續(xù)定位的不同基因的組合。當(dāng)然，該策略使用現(xiàn)有技術(shù)諸如Wallace的技術(shù)不能起作 用，其中待組合的成分可能在不同的染色體上或相距太遠(yuǎn)以至于不能被單BAC或YAC覆蓋。本文中所述的方法可以特別有利地用在這樣的情形中，其中具體的小鼠和人功能 性由許多不同的基因來編碼，所述不同的基因在一個(gè)簇中的染色體中鄰接相連。本方法容 許將小鼠基因簇簡(jiǎn)單置換為等價(jià)人基因或簇。類似地，且為了相同的理由，本發(fā)明的方法充分適合于小鼠遺傳系統(tǒng)的人源化，所 述小鼠遺傳系統(tǒng)包含處于遺傳水平上的高水平冗余。例如，在一種小鼠基因的功能在缺乏 首選基因的條件下可以完全或部分地被相同基因簇中的另一種小鼠基因接替的情況下，當(dāng) 人源化以確保所有基因被人等價(jià)物置換時(shí)，非常重要；如果不進(jìn)行，則人源化系統(tǒng)的讀出 (readout)將混亂并最終無意義。附圖簡(jiǎn)述圖1.本發(fā)明方法的示意圖。本方法提供關(guān)于人源化的機(jī)制，其包括插入兩對(duì)位點(diǎn) 特異性重組位點(diǎn)，其中之一通過同源重組被排列為與人基因置換序列相鄰接，和在第一對(duì) 位點(diǎn)之間進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，從而切除小鼠靶基因。通過第二對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)進(jìn) 行重組切除人基因置換序列，從而構(gòu)建基因敲除。圖2.同源重組的機(jī)制。同源重組在雙鏈染色體斷裂后發(fā)生。5’到3’外切核酸酶 活性產(chǎn)生3’突出端并容許鏈侵入發(fā)生。DNA合成利用完整鏈作為模板并且連接修復(fù)染色體 斷裂，從而形成霍利迪連接體。隨后分支移位和分離產(chǎn)生重組產(chǎn)物。圖3. A) LoxP位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。B)位點(diǎn)特異性重組的機(jī)制。兩個(gè)LoxP位點(diǎn)通 過互補(bǔ)堿基配對(duì)比對(duì)，從而容許Cre重組酶催化這2個(gè)位點(diǎn)之間的重組，由此切除小鼠靶基 因。圖4.如果人基因的表達(dá)受到小鼠啟動(dòng)子控制的本發(fā)明的原理，其中A)合適的小 鼠啟動(dòng)子在小鼠簇的一個(gè)末端方向向內(nèi)或B)合適的小鼠啟動(dòng)子在小鼠簇的一個(gè)末端方向 向外。A)人置換基因序列插入到小鼠啟動(dòng)子和小鼠靶基因之間，從而容許小鼠啟動(dòng)子保持， 和控制由人基因置換序列表達(dá)。該策略在CYP3A4的情形中，被選用到CYP3A11(參見圖11)。 僅為了克隆的目的而包括另外的FRT位點(diǎn)。B)該策略不適用于本發(fā)明的方法。因此，并也 因?yàn)楹线m的啟動(dòng)子不必然位于小鼠簇的末端，所以人啟動(dòng)子的應(yīng)用，如下圖中所示，或甚至小鼠啟動(dòng)子的重新引入可以更加普遍地應(yīng)用。圖5.如果人基因的表達(dá)受到人啟動(dòng)子控制的本發(fā)明的原理，其中A)小鼠基因在 簇末端的表達(dá)方向向外，B)小鼠基因在簇末端的表達(dá)方向向內(nèi)并定義該基因的啟動(dòng)子或 C)小鼠基因在簇末端的表達(dá)方向向內(nèi)且未定義該基因的啟動(dòng)子。A)人置換基因序列插入 到小鼠基因和小鼠啟動(dòng)子上游的小鼠基因組中。隨后Cre介導(dǎo)的重組將導(dǎo)致包括啟動(dòng)子序 列的簇的末端小鼠基因的物理缺失。該策略在Cyp3a簇的一個(gè)末端，在CYP3A4情形中被選 用到Cyp3all(圖11)和在CYP3A4的情形中被選用到Cyp3a25 (圖7)，且在CYP2D人源化的 情形中，在Cyp2d簇的一個(gè)末端選擇(圖9)。B)人置換基因序列插入到小鼠基因和小鼠啟 動(dòng)子上游的小鼠基因組中。隨后Cre介導(dǎo)的重組將導(dǎo)致包括啟動(dòng)子序列的簇的末端小鼠基 因的物理缺失。然而，小鼠啟動(dòng)子的長(zhǎng)度通常沒有充分定義，因此該策略不應(yīng)該用在本發(fā)明 的方法中。C)人置換基因序列插入到小鼠啟動(dòng)子和小鼠基因之間的小鼠基因組中。Cre介 導(dǎo)的重組將因此保持小鼠啟動(dòng)子完整。為了避免干擾人表達(dá)盒，剪接受體多聚A(sApA)序 列終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。sApA序列可以位于內(nèi)含子1中，條件為是小鼠基因，或在任何下游內(nèi) 含子中。如果同源重組是這樣的，即發(fā)生在小鼠基因的外顯子中，則單獨(dú)的多聚A信號(hào)(無 剪接受體位點(diǎn))足以終止轉(zhuǎn)錄。該策略在Cyp3a簇的另一個(gè)末端，在CYP3A4情形中被選用 到Cyp3all(圖11)和在CYP3A4的情形中被選用到Cyp3a25 (圖7)，且在CYP2D人源化的情 形中在Cyp2d簇的另一個(gè)末端(圖9)和在CYP2C9的情形中在Cyp2c簇的兩個(gè)末端均選用 到Cyp2c55(圖8)。應(yīng)該注意到A)，B)，和C)中所示的關(guān)于小鼠簇一個(gè)末端(在所有圖中 以左端顯示)的相同考慮也應(yīng)該針對(duì)該簇的另一端進(jìn)行。圖6.用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。轉(zhuǎn)基因小鼠通過將一個(gè)以上改變的胚胎干細(xì) 胞插入發(fā)育的胚泡中生成的。然后將胚泡植入假懷孕的小鼠中并容許發(fā)育，從而生成嵌合 體。該嵌合體與缺失者品系的雜交引起小鼠靶基因的切除并生成關(guān)于人源化基因雜合的小 鼠。兩種所述雜合子的雜交生成關(guān)于人源化事件的純合的小鼠。圖7.利用相應(yīng)的人啟動(dòng)子的CYP3A4人源化方法。用于生成關(guān)于CYP3A4人源化 的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP3A簇并且可以隨后敲除人表達(dá)盒。圖8.利用相應(yīng)的人啟動(dòng)子的CYP2C9人源化方法。用于生成關(guān)于CYP2C9人源化 的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP2C簇并且可以隨后敲除人表達(dá)盒。圖9.利用相應(yīng)的人啟動(dòng)子的CYP2D6人源化方法。用于生成關(guān)于CYP2D6人源化 的小鼠的靶策略，其中缺失CYP2D簇并且可以隨后敲除人表達(dá)盒。圖10. PCR分析證明成功生成雜合CYP2D6人源化小鼠。特異性引物的應(yīng)用容許 通過PCR分析小鼠染色體。A)結(jié)果證明成功引入所需的人置換CYP2D基因序列并缺失小 鼠CYP2D簇，從而生成關(guān)于CYP2D6的雜合人源化小鼠。B) :PCR驗(yàn)證純合CYP2D6人源化小 鼠。具有IDs 224504，225938，225939和225944的小鼠是關(guān)于CYP2D6純合人源化的并攜帶 小鼠Cyp2d簇的缺失。C) :huCYP2D6小鼠肝中的CYP2D6蛋白表達(dá)。將lug雄性huCYP2D6 小鼠肝微粒體(MLM) (n = 1)，以及匯集的野生型小鼠(n = 20)和人肝微粒體(HLM) (n =20)(兩種性別)加載到10%Nu-PAGE凝膠上。用單克隆小鼠人特異性CYP2D6抗體 (1 2000，Gentest)和抗小鼠 HRP 綴合物(1 2000, GE Healthcare (GE 健康護(hù)理))溫育 該膜。ECL以30秒曝光顯影。標(biāo)準(zhǔn)負(fù)荷如下；1，小鼠重組Cyp2d22 his-標(biāo)記的(0. Olpmol, CXRBiosciences (CXR 生物科學(xué)))。2，人 CYP2D6 baculosomes (0. Olpmol, Invitrogen)，3，小鼠重組 Cyp3allhis-標(biāo)記的(0. lpmol, CXR Biosciences (CXR 生物科學(xué)))，4，人 CYP3A4 baculosomes (0. lpmol, Invitrogen) ,5,小鼠重組 his-標(biāo)記的 Cyp2c29 (0. lpmol CXR Biosciences (CXR 生物科學(xué)))，6，人 CYP2C9 baculosomes (0. 5pmol)。圖11.利用小鼠Cyp3all啟動(dòng)子的huCYP3A4人源化方法。利用Cyp3all啟動(dòng)子 生成關(guān)于CYP3A4人源化的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP3A簇。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供關(guān)于目的基因人源化小鼠的方法，包括a)將一對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)通過同源重組引入小鼠染色體，以使得待置換的小 鼠靶基因序列在每側(cè)側(cè)鄰重組位點(diǎn)；其中這兩個(gè)重組位點(diǎn)中的至少一個(gè)被構(gòu)建為與人置換基因序列相鄰接；且所述人置換基因序列被定位為使得所述重組位點(diǎn)位于所述人置換基因序列和 所述小鼠靶基因序列之間；b)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的重組，以使得將人序列引入到小鼠染色體中以 前被小鼠靶基因占據(jù)的位置，側(cè)鄰剩余位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“人源化(humanise，humanised和humanising) ”，用于本文中時(shí)涉及將人基 因引入小鼠基因組，代替內(nèi)源鼠基因。該術(shù)語(yǔ)可以用于描述所述基因置換對(duì)小鼠染色體、細(xì) 胞、組織、器官或生物體的影響。方法學(xué)按照本發(fā)明，插入到轉(zhuǎn)基因模型中的置換人基因優(yōu)選插入內(nèi)源等價(jià)基因或基因簇 天然存在的染色體中位置。這具有這樣的優(yōu)勢(shì)，即保持基因座的背景，這意味著由該位點(diǎn)轉(zhuǎn) 錄的保真性與野生型系統(tǒng)中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄水平盡可能的相似。按照本領(lǐng)域中公知并在下文中進(jìn)一步討論的方法，重組步驟優(yōu)選在小鼠胚胎干細(xì) 胞中進(jìn)行。胚胎干細(xì)胞是全能細(xì)胞的培養(yǎng)的細(xì)胞系，其中該細(xì)胞，在引入早期胚胎時(shí)，將發(fā) 育增殖為發(fā)育中的生物體的所有組織。該方法中的第一步是將一對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)引入小鼠染色體，也稱為重組酶 靶標(biāo)或RT位點(diǎn)。RT位點(diǎn)由位點(diǎn)特異性重組酶(SSR)識(shí)別。暴露于SSR酶活性導(dǎo)致由RT位 點(diǎn)傾向確定的DNA重排，其在線性DNA分子中導(dǎo)致干擾序列被切除，或切掉。待置換的小鼠靶基因序列應(yīng)該在每一側(cè)側(cè)鄰RT位點(diǎn)。兩個(gè)RT位點(diǎn)之間的重組應(yīng) 該由此切掉干擾序列。兩個(gè)重組位點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè)被設(shè)計(jì)為與人置換基因序列相鄰接。人序列應(yīng)該被 定位為使得重組位點(diǎn)位于人置換基因序列和待置換的小鼠靶基因序列之間。這具有這樣的 作用，即當(dāng)重組發(fā)生在兩個(gè)RT位點(diǎn)之間時(shí)，這樣切掉小鼠靶序列，人序列被引入小鼠染色 體先前被小鼠靶基因占據(jù)的位置。剩余的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)應(yīng)該保持在小鼠靶序列以前 所在的位置。有利地，設(shè)計(jì)整合事件，以使剩余RT位點(diǎn)不破壞引入的基因的編碼序列或有 害地影響由調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。這可以通過小心地定位RT位點(diǎn)，從而不干擾編碼序列，或 通過將RT位點(diǎn)定位在內(nèi)含子中來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用多于一個(gè)人置換基因序列，從而使人置換 基因序列定位在內(nèi)源小鼠靶基因序列的上游和下游。以這種方式，在位點(diǎn)特異性重組時(shí)，切 除小鼠靶序列并將置換人序列集合在其位置處。
存在大量這樣的情形，其中這樣的策略可能是有利的。例如，假定現(xiàn)有同源重組技 術(shù)的尺寸局限性，可能必需引入2個(gè)單獨(dú)的人旁側(cè)置換序列，從而引入需要量的置換序列。 例如，可將CYP1A1引入到內(nèi)源鼠等價(jià)物的上游，同時(shí)可將CYP1A2引入下游。還可能合適地引入2個(gè)處于這樣的方式的單獨(dú)的基因，即可能在基因簇中相距太 遠(yuǎn)的基因，因此它們不由單BAC或YAC覆蓋，或2個(gè)位于不同染色體上的基因。這樣的策略 在實(shí)踐中不能利用現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)執(zhí)行。本發(fā)明還容許通過組合在染色體上的小鼠基因或簇的每側(cè)引入的兩種組成部分 形成功能性人基因。在位點(diǎn)特異性重組以切除小鼠基因或簇時(shí)，將人基因的組成部分集合 在一起，從而形成功能性人基因。通過該方法，可以獲得人基因的時(shí)間或組織特異性活化和 小鼠基因的滅活。剩余RT位點(diǎn)破壞編碼序列的潛在問題可以通過將該RT位點(diǎn)定位在內(nèi)含 子中來解決。用于將RT位點(diǎn)引入染色體的方法應(yīng)該是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的，且優(yōu)選通過 使用同源重組方法進(jìn)行。同源重組涉及可以用于容許將核酸序列插入到小鼠染色體中的遺 傳機(jī)制。該機(jī)制由比對(duì)雙鏈小鼠和人核酸序列起始。小鼠序列中雙鏈斷裂和5’到3’外切 核酸酶活性促進(jìn)鏈侵入，由此導(dǎo)致同源人和小鼠序列通過短同源區(qū)配對(duì)。隨后的小鼠序列 鏈延長(zhǎng)使用人序列作為模板并且分離生成具有位于其中的人序列的小鼠基因組序列，同時(shí) 人序列保持完整。用于執(zhí)行同源重組的方法是本領(lǐng)域中已知的，且使用外源提供的DNA分子和靶染 色體之間的同源區(qū)引入RT位點(diǎn)。合適的定向遞送系統(tǒng)的實(shí)例對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該 是清楚的，且包括使用注射的或定向的裸DNA，包封和/或與DNA復(fù)合的定向脂質(zhì)體，定向的 反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)和定向縮合DNA諸如魚精蛋白和聚賴氨酸-縮合DNA，或電穿孔。還可以使 用其他的遞送方法，諸如通過利用核酸表達(dá)載體、聚陽(yáng)離子縮合DNA或配體連接DNA(參見 Curiel (1992) Hum Gene Ther (人基因療法)3 :147_154 ;Wu (1989) J Biol Chem(生物化學(xué) 雜志)264 :16985-16987)，和使用基因轉(zhuǎn)移基因槍，(US 5，149，655中所述)。還可以使用 裸DNA，如在國(guó)際專利申請(qǐng)W0 90/11092中詳細(xì)記述地。RT 對(duì)優(yōu)選選自由 LoxP，F(xiàn)RT, attP/attB 和 rox 組成的組(Sauer 和 McDermott. Nucleic Acids Res.(核酸研究)32 (20) :6086_95，2004)。該列表僅通過舉例的方式提供， 并不意欲進(jìn)行限制。在該方面中，所述位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)對(duì)之間的重組分別通過相應(yīng)的 位點(diǎn)特異性重組酶，即Cre，F(xiàn)LP，PhiC31和Dre來進(jìn)行。應(yīng)該理解所述位點(diǎn)特異性重組可以 在體內(nèi)或體外進(jìn)行。作為實(shí)際的問題，每個(gè)RT位點(diǎn)應(yīng)該被構(gòu)建為與選擇性標(biāo)記物相連，和優(yōu)選相鄰 接。包括選擇性標(biāo)記物容許檢測(cè)小鼠染色體中的RT位點(diǎn)，并同樣容許監(jiān)測(cè)RT位點(diǎn)對(duì)的成 功插入。每種選擇性標(biāo)記物優(yōu)選這樣定位以使其位于小鼠靶序列和RT位點(diǎn)之間的間隔 中。這意味著在成功重組時(shí)，選擇性標(biāo)記物從染色體中除去并且因此不參與在該方法中的 其他部分。這樣，可以確定選擇性標(biāo)記物對(duì)人源化后染色體中保持的人序列的調(diào)節(jié)不具有 干擾作用。每種選擇性標(biāo)記物優(yōu)選彼此不同。這容許每個(gè)重組位點(diǎn)的插入得到彼此分開和獨(dú) 立地監(jiān)測(cè)。
選擇性標(biāo)記物優(yōu)選是編碼針對(duì)生長(zhǎng)ES細(xì)胞可以對(duì)其暴露的化合物諸如抗生素具 有抗性的一些類型的基因。實(shí)例包括使用賦予針對(duì)加入到細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的抗生素的 抗性的選擇性標(biāo)記物，例如賦予針對(duì)G418，潮霉素或嘌呤霉素的抗性的新霉素抗性標(biāo)記物。 另外的實(shí)例包括利用核酸序列的檢測(cè)，所述核酸序列是互補(bǔ)序列和與按照本發(fā)明前述方面 的核酸序列或其組成部分雜交。實(shí)例應(yīng)該包括Southern印跡分析，northern印跡分析和 PCR。優(yōu)選的策略包括構(gòu)建改變的鼠胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選以分開的步驟，由此每個(gè)RT位點(diǎn) 與其選擇性標(biāo)記物分開引入。改變的胚胎干細(xì)胞可以隨后插入到胚泡中。常規(guī)地，胚泡由 交配后約3天的雌性小鼠中分離。應(yīng)該理解至多20個(gè)改變的胚胎干細(xì)胞可以同時(shí)插入該 胚泡，優(yōu)選約16個(gè)。通過將改變的胚胎干細(xì)胞插入胚泡，胚胎干細(xì)胞將被引入發(fā)育早期的 胚胎中，優(yōu)選通過其移植進(jìn)入假懷孕小鼠，該小鼠已被誘導(dǎo)為反映懷孕小鼠的特征。根據(jù)該 方法，含有改變的胚胎干細(xì)胞的胚泡將植入假懷孕小鼠的子宮壁內(nèi)，并將在小鼠體內(nèi)持續(xù) 發(fā)育直到完成妊娠。改變的胚胎干細(xì)胞將增殖并分裂，從而增殖發(fā)育轉(zhuǎn)基因小鼠的所有組 織，包括其生殖系。在該方法的一個(gè)方面，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠可以是嵌合體，其在每個(gè)體組織中和生 殖系中包含改變的和未改變的細(xì)胞。為了進(jìn)行RT位點(diǎn)之間的重組，必須將基因組暴露于處于SSR酶形式的SSR活 性。術(shù)語(yǔ)“SSR”指在特定DNA基因座中介導(dǎo)DNA重排的任何重組系統(tǒng)的任何蛋白成分， 包括整合酶或解離酶/轉(zhuǎn)化酶類型的SSR(Abremski，K. E.和Hoess，R. H. (1992)Protein Engineering(蛋白質(zhì)工程)5，87-91 ;Khan，等，(1991)Nucleic acids Res.(核酸研究)19， 851-860 ;Nunes-Duby 等，(1998) Nucleic Acids Res (核酸研究)26391-406 ;Thorpe 和 Smith, (1998) P. N. A. S USA 95 5505-10)和由內(nèi)含子編碼的內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性 重組(Perrin 等，(1993) EMBO J. (EMB0 雜志)12，2939-2947)。優(yōu)選的重組酶蛋白選自由以下各項(xiàng)組成的組FLP重組酶，Cre重組酶，Dre重組 酶，來自魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)質(zhì)粒pSRl的R重組酶，來自果蠅克
(Kluyveromyces drosophilarium)pKDl 的;gti_，:5fe 自 Kluyveromyces
waltii質(zhì)粒pKWl的重組酶，來自桿菌屬(Bacillus)轉(zhuǎn)座子Tn4430的TrpI，A Int重組系 統(tǒng)的任意成分，phiC31，Gin重組系統(tǒng)的任意成分，或其變體。用于調(diào)節(jié)Cre/lox-介導(dǎo)的缺失，適合于缺失大DNA片段(200kb_數(shù)百萬(wàn)堿基) 的方法已經(jīng)記述在以下文獻(xiàn)中(Li Zff, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, ffeissmann C. Generation of mice with a200_kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediatedsite—specific recombination in embryonic stem cells (生成具有通過胚胎干細(xì)胞中的Cre重組酶-介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重 組缺失的200-kb淀粉狀前體蛋白基因的小鼠)Proc Natl Acad Sci USA.(美國(guó)國(guó)際科學(xué) 院學(xué)報(bào))1996年 6 月 11 日；93(12) :6158_62.勘誤表在:Proc Natl Acad Sci USA(美國(guó)國(guó) 際科學(xué)院學(xué)報(bào))1996 年 10 月 15 日；93 (21) 12052 中；在 Su H,ffang X，Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice (在小鼠中用反轉(zhuǎn)錄 病毒載體誘導(dǎo)的嵌套染色體缺失).Nat Genet.(自然遺傳學(xué))2000年1月；24(1) :92_5) 中；Call LM，Moore CS，Stetten G，Gearhart JD. Acre-lox recombination system for
11the targeted integration of circular yeastartificial chromosomes into embryonic stem cells(用于將環(huán)形酵母人工染色體定向整合進(jìn)入胚胎干細(xì)胞的cre-lox重組系 統(tǒng)).Hum Mol Genet.(人分子遺傳學(xué))2000 年 7 月 22 日；9(12) 1745-51)。如上提及地，位點(diǎn)特異性重組事件可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。位點(diǎn)特異性重組可 以通過在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)SSR的活性實(shí)現(xiàn)。實(shí)際上，在活體系統(tǒng)中成功使用位點(diǎn)特異 性重組來改變基因型需要調(diào)節(jié)重組事件的策略。這可以通過控制重組酶mRNA，或蛋白 質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行(Baubonis 和 Sauer(1993)Nucl Acids Res.(核酸研究)21，2025-2029 ； Sauer B, (1994)Curr OpinBiotechnol (當(dāng)前生物技術(shù)觀點(diǎn))5 :521_7 ；Rajewsky 等， (1996)J Clin Invest (臨床研究雜志)98，600-3 ;Metzger 禾P Feil, (1999)Curr. OpinionsBiotechnology(當(dāng)前生物技術(shù)觀點(diǎn))10，470-476)，從而使獲得的表達(dá)模式僅限 于這些組織特異性元件具有活性的時(shí)間和位置。研究人員已經(jīng)使用直接轉(zhuǎn)染，利用重組病毒的感染或注射編碼SSR蛋白的DNA或 mRNA或其蛋白本身(Konsolaki等，(1992)New Biol.(新生物學(xué))4 :551_557)，從而表達(dá) SSR酶。更精確的控制程度可以通過調(diào)節(jié)這些SSR酶的活性而非表達(dá)來獲得。一種策略使用 融合蛋白，其中SSR酶與類固醇受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)融合，從而提供SSR-LBD蛋白 (見 EP-B-0 707 599 ；以及 Logie 和 Stewart (1995) P. N. A. S. USA 92 :5940_5944 ；Brocard 等，(1997) P. N. A. S. USA 94 :14559-14563 ;Akagi 等，(1997) NucleicAcids Res(核酸研 究)25，1766-73)。該策略依賴于僅在配體與受體部分結(jié)合時(shí)激活SSR活性的類固醇受體的 配體的應(yīng)用。受體的LBD在缺乏關(guān)聯(lián)配體(cognate ligand)的條件下抑制SSR活性。關(guān) 聯(lián)配體的遞送減輕SSR抑制，由此允許RT位點(diǎn)之間的重組。誘導(dǎo)可以因此通過誘導(dǎo)所述SSR轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)SSR翻譯，或由SSR除去抑制劑來實(shí) 現(xiàn)。備選地，SSR可以人工引入所述轉(zhuǎn)基因小鼠中。該方法的另一個(gè)要素是位點(diǎn)特異性重 組可以在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)實(shí)現(xiàn)，由此導(dǎo)致切除小鼠靶基因和伴隨生成人源化小鼠。優(yōu)選地，位點(diǎn)特異性重組可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠與缺失者品系小鼠的雜交來實(shí)現(xiàn)。 術(shù)語(yǔ)“缺失者品系”用于本文中時(shí)指在這樣的種系中表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶的小鼠，所述種 系可以與轉(zhuǎn)基因小鼠雜交從而實(shí)現(xiàn)小鼠靶基因的切除。以這種方式，體內(nèi)重組產(chǎn)生關(guān)于目 的基因雜合的后代。轉(zhuǎn)基因小鼠與缺失者品系的雜交因此導(dǎo)致后代的產(chǎn)生，其中含有小鼠 染色體的細(xì)胞改變?yōu)楹腥酥脫Q基因序列和位點(diǎn)特異性重組酶，由此導(dǎo)致小鼠靶基因的切 除和細(xì)胞的功能人源化。這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠因此是關(guān)于特定基因或基因簇的人源化雜合 的。在該方法的另一方面，位點(diǎn)特異性重組酶可以僅在重組酶品系小鼠的某些組織中 表達(dá)。本領(lǐng)域中已知缺失某些基因或基因簇可能是致命的或可能具有亞致命表現(xiàn)型作用。 此外，將這樣的基因置換為它們的人等價(jià)物可能不能阻止致命性。在這些情形中，通過僅在 某些組織中表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶可能克服任何這樣的致命性問題。如果已知特定基因是 某組織中必需的，則特別有利，因?yàn)橐赃@樣的方式表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶容許小鼠基因保 持在那些組織中。在本發(fā)明的這個(gè)方面，SSR可以是清蛋白-Cre。清蛋白-Cre是SSR Cre的特定變 體，其對(duì)RT位點(diǎn)LoxP起作用。清蛋白-Cre僅在肝中表達(dá)，并且因此容許小鼠靶序列保持 在除肝以外的所有組織中，從而克服可能的致命性問題，同時(shí)提供功能人源化的肝。
最后，按照以上方法生成的2只雜合小鼠可以雜交，從而生成關(guān)于目的基因的人 等位基因純合的轉(zhuǎn)基因小鼠。雜交2只雜合轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生關(guān)于人源化純合的后代群體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下文中公開的方法從頭生成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng) 物，以使其包括所有前述特性。還可能的是，位點(diǎn)特異性重組事件在體細(xì)胞中進(jìn)行，所述體細(xì)胞可以然后被用作 核轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞，從而按照W000/51424的方法制備克隆小鼠群體或其變種。在本發(fā)明涉及包含使用前述核酸構(gòu)建體制備轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物 的實(shí)施方案中，細(xì)胞或非人動(dòng)物可以經(jīng)歷另外的基因轉(zhuǎn)移，其中所述基因轉(zhuǎn)移是引入另外 的基因或編碼蛋白的核酸序列?；蜣D(zhuǎn)移可以是細(xì)胞或細(xì)胞系的瞬間或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，細(xì)胞或 細(xì)胞系中的附加型表達(dá)系統(tǒng)，或通過前核顯微注射，通過非胚胎干(ES)細(xì)胞中的重組事 件，非人胚胎干(ES)細(xì)胞中的隨機(jī)基因轉(zhuǎn)移或通過轉(zhuǎn)染其核用作核轉(zhuǎn)移克隆程序中的供 體核的細(xì)胞來制備轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞系，或轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法，其中所述方法包括瞬間或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞或細(xì)胞系，在細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)附加型表達(dá)系統(tǒng)，或前核顯微注射，ES細(xì)胞 或其他細(xì)胞系中的重組事件，或通過轉(zhuǎn)染可以沿不同發(fā)育途徑分化且其核用作核轉(zhuǎn)移供體 的細(xì)胞系；其中另外的核酸序列或構(gòu)建體的表達(dá)用于按照本發(fā)明前述方面篩選轉(zhuǎn)染或基因 轉(zhuǎn)移。實(shí)例包括使用賦予針對(duì)加入到細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的抗生素的抗性的選擇性標(biāo)記物， 例如賦予針對(duì)G418抗性的新霉素抗性標(biāo)記物。另外的實(shí)例包括利用核酸序列的檢測(cè)，所述 核酸序列是互補(bǔ)序列和與按照本發(fā)明前述方面的核酸序列或其組成部分雜交。實(shí)例包括 Southern印跡分析，northern印跡分析和PCR。人置換基因序列本發(fā)明還利用許多基因中的任一種實(shí)現(xiàn)，如應(yīng)該對(duì)本領(lǐng)域中技術(shù)人員清楚地。不 存在針對(duì)可以在小鼠靶標(biāo)和人置換之間交換的基因類型的限制。然而，本發(fā)明特別有助于 遺傳系統(tǒng)，其中小鼠功能性由許多不同的基因編碼，所述不同的基因在一個(gè)簇中的染色體 中鄰接相連。本方法容許將小鼠基因簇簡(jiǎn)單置換為等價(jià)人基因或簇。本方法還適合于人源 化小鼠遺傳系統(tǒng)，所述小鼠遺傳系統(tǒng)包含處于遺傳水平上的高水平冗余。與先前使用的方 法相反，不存在這樣的要求或優(yōu)選，即交換的基因是節(jié)段基因，諸如免疫球蛋白基因；在優(yōu) 選實(shí)施方案中，交換的基因不是分段基因，諸如免疫球蛋白基因。優(yōu)選地，因此，至少一種小鼠靶基因的表達(dá)產(chǎn)物保持與等價(jià)人置換基因相同、相似 或等同的功能。基因可以是功能等價(jià)的，和/或結(jié)構(gòu)同源的。例如，小鼠靶基因和人置換基 因可以共享一定程度的同源性。優(yōu)選地，所述同源性大于30%，大于40%，大于50%，大于 60%，大于70%，大于80%，大于90%，或甚至大于95%。人置換基因序列可以包括cDNA，基因組DNA，或二者的混合物。基因組DNA在許多 情形中是有利的，因?yàn)閷⒈３旨艚颖Ｕ嫘?。然而，僅需要保持大部分剪接事件發(fā)生處的那些 內(nèi)含子，因此序列的剩余部分可以是cDNA。這可以簡(jiǎn)化克隆過程，特別是當(dāng)基因組DNA包含 大內(nèi)含子時(shí)；在這樣的情形中，假如剪接同種型不在基因組DNA的這個(gè)區(qū)域內(nèi)編碼，則不能 包括較大的內(nèi)含子。對(duì)于用于本發(fā)明的方法中特別合適的基因的實(shí)例是藥物代謝酶基因，包括，例如， 1期藥物代謝酶，II期藥物代謝酶，和轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)例包括cyp酶家族，即含有血紅素鐵中心并通過電子傳遞系統(tǒng)氧化多種底物的血紅素蛋白家族。cyp蛋白的血紅素中心通過由細(xì) 胞色素P450還原酶，鐵氧還蛋白，或細(xì)胞色素b5傳遞的電子還原，分子氧被還原的血紅素 基團(tuán)結(jié)合和分裂，且底物氧化為醇或環(huán)氧化物，伴隨血紅素基團(tuán)的剩余Fe3+狀態(tài)的再生。 這樣的蛋白的綜述，即比較人和鼠CYP基因由Nelson等，2004 (Pharmacogenomics (藥物遺 傳學(xué))14(1) ；1-18)提供。其它實(shí)例對(duì)本領(lǐng)域中技術(shù)人員是清楚的。優(yōu)選地，編碼1期藥物代謝酶的人DNA選自包括細(xì)胞色素P450，包括但不僅限于 CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19，和CYP2D6的組。在該實(shí)例中，基因之間的等價(jià)性可以 通過底物特異性，調(diào)節(jié)模式(例如通過轉(zhuǎn)錄因子或外源藥物)，序列同源性和組織分布的 組合來評(píng)估。某些基因具有精確的等價(jià)性；這樣的基因的實(shí)例是CYP2E1，CYP1A1，CYP1A2， CYP2B6和CYP2D，其中人中只存在一種基因，而小鼠中存在許多等價(jià)基因。在人中存在四個(gè) CYP2C基因，且在小鼠中存在許多等價(jià)基因。在這樣的情形中，至少1，優(yōu)選2，3，4，5以上或 甚至全部等價(jià)小鼠基因是無效的(annulled)。CYP3A4是一個(gè)實(shí)例，其中在小鼠中不存在明 顯的直向同源物，但CYP3A11可以被認(rèn)為是至少一種等價(jià)小鼠基因，因?yàn)槠涓伪磉_(dá)，調(diào)節(jié)模 式和序列同源性。另一個(gè)實(shí)例可以通過CYP2D6的情形提供，其中小鼠中存在9種基因，其 對(duì)應(yīng)于人中僅一種功能性基因。為了引入到P450人源化非人動(dòng)物中而選擇人P450同種型主要通過多種P450同 種型在相關(guān)組織中的代謝中的已知相對(duì)重要性來推動(dòng)。因此，例如，至今在人肝中識(shí)別的單 個(gè)最顯著P450同種型是CYP3A4，且因此CYP3A4因此可能是選擇用于肝的P450人源化的 第一個(gè)人P450同種型。為了本發(fā)明的多-P450人源化小鼠而選擇人P450由使用者的需要 來指導(dǎo)。在這個(gè)方面，預(yù)期任何一種以上的以下人同種型是優(yōu)選的3A4，3A5，2D6，2B6, 2C9， 2C19，1A1，1A2，2C8，2E1。然而，應(yīng)該理解引入到動(dòng)物細(xì)胞中的同種型取決于使用者的需要。 以這種方式，人源化的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以被“設(shè)計(jì)”用于研究特定同種型在代謝過程中的作 用。按照本發(fā)明的教導(dǎo)，可以置換單個(gè)基因、基因簇或單個(gè)基因或基因簇的組合。全基 因簇在可能時(shí)，應(yīng)該優(yōu)選被置換，而非簡(jiǎn)單置換單個(gè)基因。這形成這樣的情形，其中任何基 因簇中的基因表達(dá)水平的比與這些基因體內(nèi)表達(dá)的比相同。引入的基因簇意欲在功能上等 價(jià)于小鼠靶基因，或當(dāng)存在等價(jià)基因簇時(shí)，其等價(jià)于小鼠靶基因簇。將合適的小鼠靶基因置 換為等價(jià)人置換基因序列因此導(dǎo)致基因組、細(xì)胞、組織、器官或生物體的人源化，而不考慮 人或小鼠簇是否含有相同數(shù)量的基因。術(shù)語(yǔ)“簇”用于本文中時(shí)，因此是任何具有生成多于2種基因產(chǎn)物能力的基因組區(qū) 域，并包括相同基因的多重剪接。在這個(gè)方面，基因簇可以優(yōu)選編碼參與代謝的蛋白質(zhì)，和 更優(yōu)選可以形成細(xì)胞色素P450 (cyp)基因簇的一部分。例如，認(rèn)為小鼠中存在7種P450基 因簇；即 CYP2ABFGST 簇，CYP2C 簇，CYP2D 簇，CYP2J 簇，CYP3A 簇，CYP4ABX 簇和 CYP4F 簇。 CYP3A，CYP2C和CYP2D簇是用于按照本發(fā)明置換的1期藥物代謝酶的優(yōu)選簇。任何一種以 上這些基因簇可以按照本發(fā)明置換。按照本發(fā)明，因此，參與特殊途徑的部分或優(yōu)選完整的基因級(jí)聯(lián)可以優(yōu)選被置換。 這確保保持基因功能的部分冗余并因此，還監(jiān)測(cè)真實(shí)的生理學(xué)狀態(tài)。優(yōu)選地，用于人源化的 1期藥物代謝酶的簇是CYP3A簇和CYP2C簇。由于人和普遍使用的靶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物諸如小鼠之間的蛋白功能的冗余，關(guān)于1期藥物代謝酶的人源化優(yōu)選針對(duì)缺失背景執(zhí)行，在所述缺失背景中僅一些(例如1，2，3，4或5)， 和優(yōu)選無靶動(dòng)物1期藥物代謝酶以顯著水平表達(dá)。作為按照本發(fā)明人源化的候選者的人藥物代謝酶的其他實(shí)例包括葡糖苷酸基轉(zhuǎn) 移酶，例如，UGT1A基因或基因簇，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，例如GST (谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)，磺?；?轉(zhuǎn)移酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，用于人源化的2期藥物代謝酶的簇是UGT1A基因簇。調(diào)節(jié)序列控制轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可以優(yōu)選是人源的，或可以源自靶動(dòng)物物種，例如小鼠。在大部分情形中，應(yīng)該需要使用人調(diào)節(jié)序列。這可以僅通過將這些包括在通過同 源重組插入到小鼠染色體中的人置換基因序列內(nèi)來實(shí)現(xiàn)。RT位點(diǎn)由此插入以使側(cè)鄰兩個(gè) RT位點(diǎn)的小鼠靶序列包括內(nèi)源小鼠啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子隨后在位點(diǎn)特異性重組時(shí)被切除。如圖5中所示，當(dāng)對(duì)人調(diào)節(jié)序列的使用作出選擇時(shí)，必須考慮若干因素。這些包括 位于簇邊緣的小鼠基因的方向和關(guān)于小鼠啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件信息的有效性。然而，通常 存在這樣的機(jī)制，通過該機(jī)制人啟動(dòng)子可以功能性插入小鼠基因組中，從而控制人源化基 因的表達(dá)。在一個(gè)在使用人調(diào)節(jié)序列時(shí)，特別是在將置換基因插入具有轉(zhuǎn)錄活性的小鼠染色 體區(qū)中時(shí)優(yōu)選的有利實(shí)施方案中，人工多聚腺苷酸序列可以與插入的人序列上游的任何基 因的下游外顯子融合。例如，剪接受體多聚腺苷酸(sApA)位點(diǎn)可以用在本上下文中，與如 Ishida 和 Leder (Nucleic AcidsRes.(核酸研究)27 (24)，e35，1999)所述的該序列的應(yīng)用 類似。這確保不存在由引入的人置換基因和調(diào)節(jié)序列上游的轉(zhuǎn)錄活性的通讀，這容許在無 來自其他啟動(dòng)子序列的影響的條件下準(zhǔn)確研究人序列。在一些情況下，將人基因插入到小鼠染色體中以前被小鼠靶基因占據(jù)的位置處可 以容許使用小鼠基因的內(nèi)源調(diào)節(jié)序列，條件是適合的內(nèi)源調(diào)節(jié)序列以需要的方向位于小鼠 簇的邊緣，如圖4中所示。在一些其中可能使用本發(fā)明的情形中，使用內(nèi)源鼠調(diào)節(jié)序列。這樣，按照本發(fā)明制 備的人源化動(dòng)物能夠不僅以適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)水平而且在其中小鼠正常表達(dá)等價(jià)內(nèi)源蛋白的 所有組織中表達(dá)人蛋白。然而，應(yīng)該注意小鼠調(diào)節(jié)序列在一些情形中可以比相應(yīng)的人啟動(dòng) 子賦予小鼠中的人基因更加人樣的表達(dá)。例如，雖然CYP3A4組成性地表達(dá)在成年男子的肝 中，但是在轉(zhuǎn)基因小鼠中，CYP3A4啟動(dòng)子在6周齡以上雄性的肝中似乎是沉默的。因此，利 用顯示出與人中CYP3A4啟動(dòng)子類似肝表達(dá)和調(diào)節(jié)的鼠Cyp3all啟動(dòng)子來推動(dòng)人CYP3A4的 表達(dá)，可以提供該基因在小鼠中更加真實(shí)的表達(dá)。在該實(shí)施方案中，當(dāng)已知內(nèi)源小鼠啟動(dòng)子以正確的位置和方向存在，從而推動(dòng)人 置換基因序列的表達(dá)時(shí)，將RT位點(diǎn)插入到小鼠染色體中，從而使RT位點(diǎn)對(duì)的上游的那個(gè)位 于小鼠靶基因和小鼠靶基因的內(nèi)源小鼠啟動(dòng)子之間。在位點(diǎn)特異性重組時(shí)，保持在染色體 中的內(nèi)源小鼠啟動(dòng)子變?yōu)榕c置換人基因序列通過轉(zhuǎn)錄連接，從而實(shí)現(xiàn)人置換基因序列的轉(zhuǎn) 錄，如圖4A中所示。通過“調(diào)節(jié)基因”意指包括轉(zhuǎn)錄目的基因所必需的任何啟動(dòng)子或增強(qiáng) 子序列，5’或3’UTRs，多聚-A終止序列或其他DNA序列。用于插入人序列的轉(zhuǎn)錄物優(yōu)選由 多聚A基序終止。通過“內(nèi)源啟動(dòng)子”意指天然指導(dǎo)小鼠中目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
關(guān)于內(nèi)源和人啟動(dòng)子序列二者，引入對(duì)啟動(dòng)子活性所必需的所有5’上游序列，優(yōu) 選包括任何增強(qiáng)子，已經(jīng)顯示出使用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子實(shí)際上是不必要的且常常是不理想 的；如在天然情形中，內(nèi)源啟動(dòng)子，或完整的人可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子優(yōu)選能夠以生理學(xué)相關(guān)方式 指導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)。一個(gè)實(shí)例通過人CYP1A2基因提供，其在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游具有強(qiáng)增 強(qiáng)子元件。當(dāng)引入全部這種人序列容許合適的轉(zhuǎn)錄機(jī)制發(fā)生時(shí)，這些上游序列的刪除導(dǎo)致 其中存在不完全或不充足的調(diào)節(jié)序列的系統(tǒng)，從而容許將基因表達(dá)的保真性保持為如Chen 等(Journal of Pharmacology and ExperimeritalTherapeutics ( I^JSf 禾口 治
志)318，1330-1342，2006)所示。使用啟動(dòng)子諸如現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)使用的清蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)不利結(jié)果，的確在藥 物代謝基因諸如CYP3A2的情形中，是基因表達(dá)的進(jìn)行僅可以在特定組織中監(jiān)測(cè)到，在清蛋 白啟動(dòng)子的情形中，是在肝中。當(dāng)然，許多基因具有相當(dāng)多樣的表達(dá)模式，且這些常常是幾 乎沒有被研究的。內(nèi)源小鼠啟動(dòng)子或相應(yīng)人啟動(dòng)子的應(yīng)用避免所有這樣的問題，且保證人 基因，如果在染色體內(nèi)適當(dāng)構(gòu)型和比對(duì)，以進(jìn)行性地(developmentally)，瞬時(shí)地和以組織 特異性方式保持野生型鼠表達(dá)水平的保真性。結(jié)果，人蛋白在正確的位置，以正確的水平， 在正確的時(shí)間和關(guān)于適當(dāng)?shù)臅r(shí)間量產(chǎn)生。因此，在關(guān)于CYP3A2人源化的小鼠的情形中，本 發(fā)明容許獲得關(guān)于藥物代謝過程的綜合整體簡(jiǎn)單描述。內(nèi)源啟動(dòng)子或相應(yīng)的人啟動(dòng)子的應(yīng)用還使其具有其他優(yōu)勢(shì)。具體地，保持進(jìn)行性 表達(dá)的保真性。天然內(nèi)源啟動(dòng)子的應(yīng)用確保蛋白質(zhì)表達(dá)于在其中天然存在該蛋白質(zhì)的組織 中，且不僅在成年動(dòng)物中，而且在每種發(fā)育期中。這還使其具有這樣的優(yōu)勢(shì)，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 更可能生存并因此有效地用作篩選物和用于下游雜交的開發(fā)。在藥物代謝基因的情形中， 還容許在保持藥物代謝酶的胎盤表達(dá)時(shí)，將動(dòng)物用于篩選測(cè)試化合物的致畸作用。在一些 情形中，靶基因和人置換基因序列可以共享引導(dǎo)序列。這可以通過在構(gòu)建體中保持至少一 個(gè)內(nèi)含子實(shí)現(xiàn)，這通常導(dǎo)致更好的表達(dá)。該策略還確?；虍a(chǎn)物應(yīng)該被指引到正確的胞內(nèi) 位置。人引導(dǎo)序列可能也能夠?qū)崿F(xiàn)該功能，但是代替地使用小鼠引導(dǎo)序列常常更安全。另 外，在MRP2蛋白的情形中，可以保持小鼠蛋白的“引導(dǎo)序列”，其由外顯子1編碼。然后將無 來自外顯子1的序列的人cDNA引入到小鼠基因組序列的外顯子2中。關(guān)于小鼠內(nèi)含子1 的初始剪接位點(diǎn)將被保持，因此該構(gòu)建體編碼來自小鼠外顯子1和人外顯子2-32的氨基酸 的融合蛋白。該構(gòu)建體確保高表達(dá)水平且還確保將MRP2指引到其正確的位置，即質(zhì)膜。技術(shù)人員還理解可以如何將人置換基因序列在靶基因啟動(dòng)子的控制下引入小鼠， 從而與該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄相連。通過“轉(zhuǎn)錄相連”意指啟動(dòng)子指導(dǎo)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平的活性。 優(yōu)選地，這通過將人置換基因序列與相應(yīng)小鼠啟動(dòng)子的翻譯起始位點(diǎn)融合來實(shí)現(xiàn)。例如，在 多藥抗性蛋白MDR1的情形中，人MDR1的cDNA可以與相應(yīng)小鼠基因(Mdrla或Mdrlb)的翻 譯起始位點(diǎn)融合。在轉(zhuǎn)錄因子PXR的實(shí)例中，人PXR cDNA和基因組序列的雜交可以與小鼠 PXR基因的翻譯起始位點(diǎn)融合，由此保持小鼠的起始-ATG。在另一種人轉(zhuǎn)錄因子CAR的情 形中，人序列可以與小鼠CAR基因的翻譯起始位點(diǎn)融合。報(bào)告基因本發(fā)明還有利地提供結(jié)合引入的報(bào)告基因的非人動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，從 而使該細(xì)胞或動(dòng)物可以用于通過報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的常規(guī)測(cè)定來確定藥物或其他異生素 化合物(xenobiotic compound)在人細(xì)胞中代謝途徑的指征。
16
當(dāng)報(bào)告基因已經(jīng)引入到通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的非人動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因非人動(dòng) 物中時(shí)(見下文)，該細(xì)胞或動(dòng)物可以用于確定基因的調(diào)節(jié)并還可以用于通過測(cè)定報(bào)告基 因DNA序列的表達(dá)，提供藥物或其他異生素化合物在同源人細(xì)胞中的可能的機(jī)制和代謝的 指征。該細(xì)胞或動(dòng)物還可以用于提供藥物或其他異生素化合物代謝程度的指征。例如，分 析報(bào)告基因表達(dá)在任何具體組織中的分布容許響應(yīng)于具體的藥物化合物來監(jiān)測(cè)基因表達(dá) 誘導(dǎo)的程度。報(bào)告基因是直接或間接編碼可測(cè)定蛋白質(zhì)的核酸序列。它們用于置換其他編碼 區(qū)，所述編碼區(qū)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不適合于或不能按照預(yù)期的測(cè)定來檢測(cè)。本領(lǐng)域中已知且可 以用于本發(fā)明的合適報(bào)告基因選自那些編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)包括但不僅限于 氯霉素_乙酰轉(zhuǎn)移酶，3 “半乳糖苷酶，3 “葡糖醛酸糖苷酶，熒光素酶，3 “半乳糖苷酶，綠 色熒光蛋白，分泌的堿性磷酸酶(SEAP)，主要尿蛋白(MUP)或人絨毛膜促性腺激素(hCG)。 應(yīng)該理解以上合適的報(bào)告基因列表不是詳盡的或排他的，且不意欲限制本申請(qǐng)的范圍。技 術(shù)人員可以選擇對(duì)本發(fā)明同等適用的另一種報(bào)告系統(tǒng)。按照本發(fā)明，作為關(guān)于連接報(bào)告基因的優(yōu)選靶標(biāo)的小鼠啟動(dòng)子是PXR，CAR, CYP3A4, CYP2C9, CYP2C 19，CYP2B6, CYP2D6, UGT1A, MRP2 和 MDR1。另外的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將第二對(duì)RT位點(diǎn)引入到小鼠染色體中，同樣 優(yōu)選通過同源重組進(jìn)行。該第二對(duì)RT位點(diǎn)應(yīng)該如此定位，從而使2個(gè)組成RT位點(diǎn)側(cè)鄰第 一對(duì)RT位點(diǎn)，如圖1中所示。該第二對(duì)RT位點(diǎn)容許人置換基因序列被切除，如果需要的 話。這容許產(chǎn)生一群或一組可以比較其特性的轉(zhuǎn)基因小鼠；完整的群因此可以包括野生型、 人源化敲入和完整敲除。此外，關(guān)于某些應(yīng)用，關(guān)于敲入或敲除雜合的小鼠也可以在該組中 比較。第二對(duì)RT位點(diǎn)可以同時(shí)、之前或隨后插入到小鼠染色體中，從而在第一對(duì)位點(diǎn)特 異性重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)RT。優(yōu)選地，同時(shí)插入這兩對(duì)位點(diǎn)，以方便改造和克隆。在第一對(duì)RT位點(diǎn)之間位點(diǎn)特異性重組后，將第二對(duì)RT位點(diǎn)定位于染色體中，側(cè)鄰 人置換基因序列。在這種構(gòu)象中，在第一對(duì)RT位點(diǎn)之間重組過程中產(chǎn)生的剩余RT位點(diǎn)應(yīng) 該定位在第二對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的一個(gè)組成和人置換基因序列之間，如圖1中所示。在該方面中，意欲可以在第二對(duì)RT之間進(jìn)行第二輪RT，從而切除人置換基因序列 和敲除目的基因。在本文中，還應(yīng)該切除剩余第一 RT位點(diǎn)，同時(shí)保持剩余第二 RT位點(diǎn)。第二對(duì)RT位點(diǎn)和第一對(duì)RT位點(diǎn)可以同時(shí)或分別引入到小鼠染色體中。其中第二對(duì)RT位點(diǎn)與第一對(duì)RT位點(diǎn)同時(shí)引入，每對(duì)的一個(gè)組成優(yōu)選地包含在單 核酸序列中，所述單核酸序列可以通過一輪同源重組引入到小鼠染色體中。每對(duì)的另一個(gè) 組成可以包含在第二核酸序列中，所述第二核酸序列通過第二輪同源重組也引入到小鼠染 色體中。第二對(duì)RT位點(diǎn)的每個(gè)組成定位于染色體中，使得第一對(duì)RT位點(diǎn)的一半定位于第 二對(duì)RT位點(diǎn)的一半和選擇性標(biāo)記物之間。這兩輪同源重組可以同時(shí)或分別發(fā)生。其中第二對(duì)RT位點(diǎn)與第一對(duì)RT位點(diǎn)分別引入小鼠染色體，第二對(duì)RT位點(diǎn)的每一 半優(yōu)選包含在分開的核酸序列中，且第二對(duì)RT位點(diǎn)通過另外兩個(gè)分開的同源重組反應(yīng)，通 過圖2中所示的機(jī)制引入到小鼠染色體中。這兩輪另外的同源重組可以關(guān)于彼此和關(guān)于第 一個(gè)2輪同源重組同時(shí)或相繼發(fā)生。應(yīng)該理解重組反應(yīng)意欲在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
第一和第二對(duì)RT位點(diǎn)優(yōu)選彼此不同。轉(zhuǎn)基因小鼠在本發(fā)明的另一方面，提供通過上述本發(fā)明任何一個(gè)實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基 因小鼠。該小鼠關(guān)于基因或基因簇人源化并且已經(jīng)缺失了相應(yīng)的小鼠基因或簇?，F(xiàn)將通過舉例的方式，更詳細(xì)地描述本發(fā)明的不同方面和實(shí)施方案。應(yīng)該理解在 不偏離本發(fā)明范圍的條件下可以進(jìn)行細(xì)節(jié)的改變。
實(shí)施例實(shí)施例1 利用相應(yīng)的人啟動(dòng)子和小鼠CYP3A簇敲除的CYP3A4人源化小鼠CYP3A簇側(cè)鄰loxP和FRT位點(diǎn)，并將CYP3A4表達(dá)盒插入小鼠簇的一個(gè)末端， 如圖7中所示，從而容許人CYP3A4在13kb人CYP3A4啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。定向載體中包括的loxP序列元件容許Cre介導(dǎo)的小鼠CYP3A簇缺失，從而容許 CYP3A4在缺乏相應(yīng)小鼠基因條件下表達(dá)(見圖7)。隨后，F(xiàn)RT序列元件容許Flp介導(dǎo)的人表達(dá)盒的缺失，從而在小鼠CYP3A基因座處 引起完全敲除(圖7)。實(shí)施例2 利用相應(yīng)人啟動(dòng)子和小鼠CYP2C簇敲除的CYP2C9人源化小鼠CYP2C簇側(cè)鄰loxP和FRT位點(diǎn)，并將CYP2C9表達(dá)盒插入小鼠簇的一個(gè)末端， 如圖8中所示，從而容許人CYP2C9在12kb人CYP2C9啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。定向載體中包括的loxP序列元件容許Cre介導(dǎo)的小鼠CYP2C簇缺失，從而容許 CYP2C9在缺乏相應(yīng)小鼠基因條件下表達(dá)(見圖8)。隨后，F(xiàn)RT序列元件容許Flp介導(dǎo)的人表達(dá)盒的缺失，從而在小鼠CYP2C基因座處 引起完全敲除(圖8)。實(shí)施例3 利用相應(yīng)人啟動(dòng)子和小鼠CYP2D簇敲除的CYP2D6人源化小鼠CYP2D簇側(cè)鄰loxP和FRT位點(diǎn)，并將CYP2D6表達(dá)盒插入小鼠簇的一個(gè)末端， 如圖9中所示，從而容許人CYP2D6在9kb人CYP2D6啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。定向載體中包括的loxP序列元件容許Cre介導(dǎo)的小鼠Cyp2d簇缺失，從而容許 CYP2D6在缺乏相應(yīng)小鼠基因條件下表達(dá)。隨后，F(xiàn)RT序列元件容許Flp介導(dǎo)的人表達(dá)盒的 缺失，從而在小鼠CYP2D基因座處引起完全敲除。特異性引物的應(yīng)用容許通過PCR分析小鼠染色體。結(jié)果證明所需人置換CYP2D基 因序列的成功引入和小鼠Cyp2d簇的缺失(見圖10A和10B)。圖10C證明人CYP2D6蛋白 成功表達(dá)在這些小鼠的肝中。實(shí)施例4 利用小鼠Cyp3all啟動(dòng)子和小鼠CYP3A簇敲除的CYP3A4人源化編碼人CYP3A4的DNA序列插入到小鼠Cyp3a簇中Cyp3all基因座處，如圖10中 所示，從而容許人CYP3A4在小鼠Cyp3all啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。該定向策略被設(shè)計(jì)為容許 CYP3A4在雄性小鼠中表達(dá)，這在使用CYP3A4啟動(dòng)子時(shí)可能是不可能的。編碼人CYP3A4的DNA序列包括人CYP3A4基因內(nèi)含子1的至少一部分(見圖10)。由于如圖10中所示定向載體中包含F(xiàn)RT位點(diǎn)，所以選擇標(biāo)記物(圖10中的neoR) 可以通過在將人CYP3A4插入野生型小鼠Cyp3all基因座中后，與FLP缺失者品系雜交而缺 失。
由于如圖中所示定向載體中包含loxP和FRT位點(diǎn)二者，所以大部分小鼠Cyp3all 簇可以通過與FLP缺失者品系或Cre缺失者品系雜交缺失，條件是將人CYP3A4插入到 Cyp3a簇5'靶向的細(xì)胞。
權(quán)利要求
關(guān)于目的基因人源化小鼠的方法，包括a)將一對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)通過同源重組引入小鼠基因組，以使得待置換的小鼠靶基因序列在每側(cè)側(cè)鄰重組位點(diǎn)；其中這兩個(gè)重組位點(diǎn)中的至少一個(gè)被構(gòu)建為與人置換基因序列相鄰接；且所述人置換基因序列被定位為使得所述重組位點(diǎn)位于所述人置換基因序列和所述小鼠靶基因序列之間；b)實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的重組，以使得將人序列引入到小鼠基因組中以前被小鼠靶基因占據(jù)的位置，側(cè)鄰剩余位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述人置換基因序列插入到小鼠染色體中天然存在內(nèi)源 等價(jià)小鼠靶基因的位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述人置換基因序列含有基因簇。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述基因簇編碼參與藥物代謝的蛋白。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述基因簇是細(xì)胞色素P450(CYP)基因簇的一部分。
6.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述人置換基因序列的轉(zhuǎn)錄在一種以上內(nèi)源小 鼠調(diào)節(jié)序列的控制下。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述人置換基因序列的轉(zhuǎn)錄在內(nèi)源人調(diào)節(jié)序列 的控制下。
8.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)被構(gòu)建為與選擇性標(biāo) 記物相鄰接。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將每個(gè)選擇性標(biāo)記物定位為使得所述選擇性標(biāo)記物位于所 述小鼠靶序列和所述重組位點(diǎn)之間。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中每個(gè)所述選擇性標(biāo)記物彼此不同。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇性標(biāo)記物選自由新霉素和潮霉素組 成的組。
12.權(quán)利要求1的方法，其中將第二對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)引入小鼠基因組；其中第二 對(duì)重組位點(diǎn)中的每一個(gè)側(cè)鄰第一對(duì)重組位點(diǎn)，從而使得人置換序列可以通過實(shí)現(xiàn)該第二對(duì) 位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組而被切除。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將所述人置換基因序列定位于第一對(duì)位點(diǎn)特異性重組位 點(diǎn)的一半和第二對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的一半之間。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的方法，還包括在第二對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn) 第二輪重組，從而切除人置換基因序列和敲除目的基因。
15.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)對(duì)選自由LoxP，F(xiàn)RT 和attP/attB組成的組。
16.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組事件發(fā)生在小鼠胚胎干 細(xì)胞中。
17.權(quán)利要求16的方法，其中隨后將所述胚胎干細(xì)胞插入胚泡。
18.權(quán)利要求17的方法，其中隨后將所述胚泡植入假懷孕小鼠中。
19.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組事件在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組事件通過使以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠和表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶的小鼠的雜交實(shí)現(xiàn)，所述位點(diǎn)特異性重組酶識(shí) 別在將人置換基因序列引入轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中時(shí)所用的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)局限于特定組織。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述重組酶是清蛋白-Cre。
23.關(guān)于目的基因人源化的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠通過按照以上權(quán)利要求 中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于人源化小鼠的方法。具體地，本發(fā)明涉及利用同源重組和位點(diǎn)特異性重組的組合將小鼠基因簇置換為來自相應(yīng)人簇的單或多基因的方法。
文檔編號(hào)C12N15/90GK101855356SQ200880106841
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者尼科·舍爾 申請(qǐng)人:Iti蘇格蘭有限公司