專利名稱：：產(chǎn)生具有改良的解離速率的適配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性涉及產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的適配體(aptamer)和光適配體(photoaptamer)的方法，以及涉及由此產(chǎn)生的改良的適配體和光適配體。特別地，本發(fā)明描述了對(duì)感興趣的靶高度特異的慢解離速率(off-rate)適配體。本發(fā)明描述了這些慢解離速率適配體的組成以及選擇其的方法。本發(fā)明進(jìn)一步描述了用于檢測(cè)方法的具有的改良功能性的適配體構(gòu)建體。進(jìn)一步地，本發(fā)明描述了這些改良的適配體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：以下說明書提供了與本
發(fā)明內(nèi)容相關(guān)的信息總結(jié)，但并非承認(rèn)本文提供的任何信息或參考的任何出版物是請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。SELEX方法是在體外選擇能高特異性結(jié)合靶分子的核酸分子的方法，在發(fā)明名稱為“NucleicAcidLigands”的美國(guó)專利No.5，475，096和發(fā)明名稱為“NucleicAcidLigands”的美國(guó)專利No.5，270，163(也見WO91/19813)中描述，所述專利在此均特異性地援引進(jìn)入。這些專利在此統(tǒng)稱作SELEX專利，描述了產(chǎn)生任何希望的靶分子的適配體的方法。已對(duì)基本的SELEX方法進(jìn)行了修飾以實(shí)現(xiàn)許多特別目的。例如，發(fā)明名稱為“MethodforSelectingNucleicAcidsontheBasisofStructure，，美國(guó)專利No.5，707，796描述了SELEX方法結(jié)合凝膠電泳在選擇具有特異性結(jié)構(gòu)特征的核酸分子如bentDNA中的應(yīng)用。發(fā)明名稱為“High-AffinityNucleicAcidLigandsThatDiscriminateBetweenTheophyllineandCaffeine”的美國(guó)專利No.5，580，737描述了鑒別能區(qū)分密切相關(guān)的分子的高特異性適配體的方法，稱作Coimter-SELEX。發(fā)明名稱為"SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichmentSolutionSELEX"白勺美國(guó)專利No.5，567，588描述了基于SELEX的方法，其實(shí)現(xiàn)了高效分開(partitioning)對(duì)靶分子具有高和低親和性的寡核苷酸。發(fā)明名稱為“NucleicAcidLigandstoHIV-RTandHIV-1Rev"的美國(guó)專利No.5，496，938描述了在進(jìn)行SELEX之后獲得改良的適配體的方法°發(fā)明名禾爾為"SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichmentChemi-SELEX”的美國(guó)專利No.5，705，337描述了共價(jià)連接適配體與其靶的方法。SELEX方法包括鑒別含有賦予配體改良特征的修飾的核苷酸的高親和性適配體，所述特征如改良的體內(nèi)穩(wěn)定性或者改良的輸送特征。這種修飾的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或堿基位置的化學(xué)取代。SELEX方法鑒別的含有修飾的核苷酸的適配體在發(fā)明名稱為“HighAffinityNucleicAcidLigandsContainingModifiedNucleotides”的美國(guó)專利No.5，660，985中描述，其描述了在嘧啶的5'-和2'-位置含有化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。如前的美國(guó)專利No.5，580，737描述了含有用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-0-甲基(2'-OMe)修飾的一或多個(gè)核苷酸的高特異性適配體。對(duì)SELEX方法的進(jìn)一步修改在發(fā)明名稱為“SystematicEvolutionofNucleicAcidLigandsbyExponentialEnrichment:PhotoselectionofNucleicAcidLigandsandSolutionSELEX“的美國(guó)專利No.5，763，177、美國(guó)專利No.6，001，577和美國(guó)專利No.6，291，184以及發(fā)明名稱為"PhotoselectionofNucleicAcidLigands”的美國(guó)專利No.6，458，539中所述。這些專利在此統(tǒng)稱為“PhotoSELEX專利”，其描述了選擇含有能結(jié)合和/或光交聯(lián)(photocrosslinking)和/或光失活靶分子的光反應(yīng)性官能團(tuán)的適配體的各種SELEX方法。所得光反應(yīng)性適配體稱做光交聯(lián)適配體或者光適配體。盡管這些SELEX和光SELEX(photoSELEX)方法是有用的，但是仍需要使得在體外選擇方法中產(chǎn)生的適配體性質(zhì)改良的方法。例如，需要與天然發(fā)生的DNA或者RNA核苷酸相比與靶分子具有更好的結(jié)合親和性的適配體，以及產(chǎn)生這種適配體的方法。對(duì)于許多應(yīng)用而言，例如體外測(cè)定、診斷、治療或者成像應(yīng)用，感興趣的是產(chǎn)生從適配體/靶親和性復(fù)合物具有慢解離速率的適配體。已經(jīng)提議一些技術(shù)用于產(chǎn)生這種試劑(見例如1099/^27133和US2005/0003362)。然而，這些選擇方法不區(qū)分與靶具有快結(jié)合動(dòng)力學(xué)(即快結(jié)合速率)的試劑的選擇及與靶具有慢解離動(dòng)力學(xué)(即慢解離速率)的試劑的選擇。因此，需要新的方法和技術(shù)以有利地選擇慢解離速率適配體，同時(shí)抑制與靶具有快結(jié)合速率的適配體的選擇。最后，需要包括不同的內(nèi)在功能性的適配體構(gòu)建體。這些功能性可包括用于固定標(biāo)簽(tag)、檢測(cè)標(biāo)記(label)、促進(jìn)或控制分離的方式等。發(fā)明概述本發(fā)明描述了新的適配體以及產(chǎn)生和使用這種適配體的方法。特別地，本發(fā)明描述了慢解離速率適配體、含有C-5修飾的嘧啶的慢解離速率適配體以及通過稀釋、加入競(jìng)爭(zhēng)劑或者通過組合這兩種方法選擇慢解離速率適配體的方法。此外，本發(fā)明描述了多種靶分子如蛋白質(zhì)和肽的慢解離速率適配體。本發(fā)明還描述了具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征和解鏈溫度的慢解離速率適配體。本發(fā)明還描述了具有光反應(yīng)性官能團(tuán)的慢解離速率適配體，耐聚陰離子材料存在的適配體，及選擇這些適配體的方法，以及用多種其它功能性構(gòu)建的適配體以改良其在多種應(yīng)用中的用途。本發(fā)明描述了產(chǎn)生能結(jié)合靶分子的適配體的改良的SELEX方法。更特別地，本發(fā)明描述了產(chǎn)生與用先前的SELEX方法獲得的適配體和光適配體相比與其各自的靶分子具有更慢的解離速率的適配體和/或光適配體的方法。通常，在候選混合物與靶分子接觸及使得核酸_靶復(fù)合物形成之后，導(dǎo)入慢解離速率富集過程，其中具有快解離速率的核酸_靶復(fù)合物將解離且不再形成，而具有慢解離速率的復(fù)合物保持完整。導(dǎo)入慢解離速率富集過程的方法包括但不限于在核酸與靶分子的混合物中加入競(jìng)爭(zhēng)劑分子，稀釋核酸與靶分子的混合物，或者組合這兩種方法。本發(fā)明進(jìn)一步描述了使用這些方法獲得的適配體與光適配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括制備核酸的候選混合物；將該候選混合物與靶分子接觸，其中與靶分子具有最高相對(duì)親和性的核酸優(yōu)先結(jié)合靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；導(dǎo)入慢解離速率富集過程以誘導(dǎo)具有相對(duì)快解離速率的核酸-靶分子復(fù)合物解離；分開候選混合物中剩余的結(jié)合的核酸-靶分子復(fù)合物與游離核酸；以及鑒別結(jié)合靶分子的核酸。所述過程可進(jìn)一步包括擴(kuò)增結(jié)合靶分子的核酸以產(chǎn)生富集結(jié)合靶分子但仍產(chǎn)生具有慢解離速率的核酸_靶分子復(fù)合物的核酸的核酸混合物的重復(fù)步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸的候選混合物包括含有修飾的核苷酸堿基的核酸，所述修飾的核苷酸堿基可有助于具有慢解離速率的修飾的核酸-靶復(fù)合物的形成。用修飾的核苷酸包括含有光反應(yīng)性或者其它官能團(tuán)的核苷酸或者含有光反應(yīng)性基團(tuán)占位物(placeholder)的核苷酸進(jìn)行SELEX的改良的方法在2008年7月17日與本申請(qǐng)同時(shí)申請(qǐng)的發(fā)明名稱為“ImprovedSELEXandPH0T0SELEX”的美國(guó)申請(qǐng)系列No.12/175,388中描述，其以全文援引加入本文。占位核苷酸也可用于非光反應(yīng)性的修飾的核苷酸的SELEX中或者SELEX后導(dǎo)入。本文描述的多種方法和步驟可用于產(chǎn)生能(1)結(jié)合靶分子或者(2)結(jié)合靶分子及隨后在用UV光或者可見光照射時(shí)與靶分子形成共價(jià)連接的適配體。另一方面，本文描述的多種方法和步驟可用于產(chǎn)生通過結(jié)合和/或交聯(lián)靶分子而能修飾靶分子的生物活性的適配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒別了與特殊疾病相關(guān)或有關(guān)的獨(dú)特靶分子的適配體。這個(gè)適配體可用作體外或體內(nèi)診斷試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶分子的適配體可以施用給個(gè)體及用于在體內(nèi)治療疾病。本發(fā)明鑒別的適配體和光適配體可用于可以無限制地使用適配體、寡核苷酸、抗體和配體的任何診斷、成像、高通量篩選或者靶確認(rèn)技術(shù)或者程序或者測(cè)定中。例如，根據(jù)在同時(shí)提交的名稱為"MultiplexedAnalysesofTestSamples”的美國(guó)申請(qǐng)系列No._中詳細(xì)描述的方法，可以使用本發(fā)明鑒別的適配體和光適配體，該申請(qǐng)以其全文援引加入本文。不具有本發(fā)明適配體的慢解離速率性質(zhì)的先前的適配體已經(jīng)用于多種目的。在幾乎所有的這種應(yīng)用中，慢解離速率適配體相對(duì)于未選擇具有慢解離速率性質(zhì)的適配體具有改良的性能。已經(jīng)批準(zhǔn)適配體Macugen(見例如美國(guó)專利No.6，168，778、美國(guó)專利No.6，051，698、美國(guó)專利No.6，426，335和美國(guó)專利No.6，962，784，其均以全文援引加入本文)用于治療黃斑變性，其由于對(duì)VEGF的特異性親和性而發(fā)揮功能。其它適配體已經(jīng)被研究和/或在用作治療劑的開發(fā)中。未選擇具有慢解離速率性質(zhì)的適配體也已經(jīng)用于許多診斷和成像應(yīng)用(見例如美國(guó)專利No.5，843，653、美國(guó)專利No.5，789，163、美國(guó)專利No.5，853，984、美國(guó)專利No.5，874，218、美國(guó)專利No.6，261，783、美國(guó)專利No.5，989，823、美國(guó)專利No.6，177，555、美國(guó)專利No.6，531，286，其均以全文援引加入本文)、高通量篩選(見例如美國(guó)專利No.6，329，145、美國(guó)專利No.6，670，132、美國(guó)專利No.7，258，980，其均以全文援引加入本文)以及PCR試劑盒(見例如美國(guó)專利No.6，183，967、美國(guó)專利No.6，020，130、美國(guó)專利No.5，763，173、美國(guó)專利No.5，874，557、美國(guó)專利No.5，693，502，其均以全文援引加入本文)。本發(fā)明的慢解離速率適配體可用于任何診斷、治療、成像或者使用抗體、適配體和配體結(jié)合對(duì)的任何其它應(yīng)用中。另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明所述改良的方法鑒別的適配體和光適配體、包括這種適配體和光適配體的診斷試劑盒以及這種適配體和光適配體的治療和診斷應(yīng)用。使用所述方法鑒別的新的慢解離速率適配體和光適配體可用于多種測(cè)定中，包括使用平面陣列、珠及其它類型固體支持物的測(cè)定。在各種情形中可以使用的測(cè)定包括生命科學(xué)研究應(yīng)用、臨床診斷應(yīng)用(例如疾病的診斷檢驗(yàn)，或者預(yù)防性保健的“健康”檢測(cè))，AL0NA和UPS測(cè)定以及體內(nèi)成像應(yīng)用。對(duì)于一些應(yīng)用，可以使用應(yīng)用所述適配體和光適配體的多元測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，本文描述的慢解離速率適配體(或者光適配體)可用作CAT掃描及其它成像應(yīng)用的靜脈內(nèi)或者口服造影劑。CAT掃描用于診斷肌和骨病癥、定位血凝塊、檢測(cè)內(nèi)部出血、監(jiān)測(cè)疾病如癌癥等。所述慢解離速率適配體可以用CAT掃描可檢測(cè)成分如碘、鋇或者gastrograffin標(biāo)記。除了具有可檢測(cè)成分之外，所述適配體可以被設(shè)計(jì)為使所述成分定向于特異組織或者希望的靶。所述適配體可以濃縮或定位可檢測(cè)成分并因此通過增加可利用的信號(hào)而改良信噪比。由于適配體的解離速率可以足夠低，因此可以增加掃描的持續(xù)時(shí)間，且可以改良掃描的信噪比。在這些成像應(yīng)用中適配體對(duì)靶的特異性也可以改良信噪比。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢解離速率適配體用反磁性或者順磁性材料標(biāo)記。在這個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記的適配體可用于改良磁共振成像(MRI)的性能。MRI特別適于成像小的、選擇性的具有高水含量的區(qū)域和組織或者適于監(jiān)測(cè)血流。慢解離速率適配體的特異性可改良MRI試劑定位于希望的組織切片。相似地，慢解離速率適配體可用如氟、碳11、氧15或者氮13等材料修飾以用于PET掃描中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，適配體可以用可用于紅外成像的IR活性材料標(biāo)記。也預(yù)期可以標(biāo)記慢解離速率適配體以與其它成像技術(shù)一起使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用作非常靈敏的和特異的試劑，以摻入各種體外診斷方法或試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，慢解離速率適配體在許多感染性或者其它類型疾病檢測(cè)方法中用作抗體的替代物，其中感興趣的靶的適配體包括可檢測(cè)材料和固定或捕獲成分任一或二者。在這些實(shí)施方案中，在將試劑盒中的適配體與臨床樣本混合后，可以利用各種測(cè)定形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，適配體也包括可檢測(cè)標(biāo)記如熒光團(tuán)。在其它實(shí)施方案中，測(cè)定形式可包括熒光猝滅、雜交方法、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜分析、抑制或競(jìng)爭(zhēng)方法、酶聯(lián)寡核苷酸測(cè)定、SPR、倏逝波法(evanescentwavemethod)等。在一些實(shí)施方案中，適配體在試劑盒中在溶液中提供。在其它實(shí)施方案中，試劑盒中適配體固定于固體支持物上，與檢測(cè)樣本的測(cè)定聯(lián)合使用。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物被設(shè)計(jì)為檢測(cè)一或多個(gè)感興趣的靶。在其它實(shí)施方案中，試劑盒可進(jìn)一步包括提取感興趣的靶的試劑、擴(kuò)增適配體的試劑、洗滌試劑、檢測(cè)試劑等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用于治療性成像研究中。在新的治療化合物的開發(fā)期間，通常難以評(píng)估化合物的某些特征，如生物分布、洗脫率(washoutrate)、生物利用率、體內(nèi)藥物/靶相互作用等。在許多情況中，如果使用合適的可檢測(cè)材料修飾所述治療化合物，則可以使用成像研究評(píng)估所有這些特征。盡管直接修飾治療化合物通常抑制其與其靶的相互作用能力并因此降低效力，但是適配體的小規(guī)格和可定制的特異性使其潛在地非常適于與治療化合物(例如抗體或其它基于蛋白質(zhì)的治療劑)反應(yīng)，同時(shí)使得對(duì)于化合物的治療效力的任何不希望的作用最小化。為了評(píng)估這種特征如生物分布和洗脫率，可以使適配體/治療復(fù)合物保持一段時(shí)間。這些類型的研究在治療化合物是慢解離速率適配體的情況中可簡(jiǎn)化。在多個(gè)實(shí)施方案中，治療性、成像和診斷應(yīng)用中使用的適配體可包括各種修飾如2'氟及其它修飾以在暴露于檢測(cè)樣品中可能存在的各種成分或者體內(nèi)如核酸酶及其它樣品或者體液成分時(shí)增加適配體的穩(wěn)定性。附圖簡(jiǎn)述圖IA例證了舉例的SELEX方法，圖IB例證了舉例的SELEX方法，其包括摻入慢解離速率富集過程的步驟。圖例證了本發(fā)明中使用的代表性適配體模板、引物和互補(bǔ)寡核苷酸序列。所述寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)制備。B=dT-生物素。圖3例證了如實(shí)施例2所述不用㈧和用⑶慢解離速率富集過程選擇的親和性適配體的解離速率常數(shù)的柱狀圖。圖4A和B示出用于如實(shí)施例3和4所述制備候選混合物或者進(jìn)行選擇過程中的各個(gè)步驟的寡核苷酸。所述寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)制備。這個(gè)實(shí)施例中使用兩個(gè)候選混合物序列，稱作1和2。B=dT-生物素。BrdU(5-溴-dUTP)、蒽醌(AQ)和補(bǔ)骨脂素(Psor)生色團(tuán)以亞磷酰胺形式購(gòu)買，并在合成期間加入正向引物的5'末端。4-疊氮-2-硝基_苯胺(ANA)制備成對(duì)-硝基-苯基碳酸鹽/酯衍生物且在合成后與5‘己胺亞磷酰胺偶聯(lián)。這個(gè)實(shí)施例中使用兩個(gè)候選混合物序列，稱作1和2。(A)模板1與含有5'-BrdU,AQ和ANA的候選混合物一起使用；(B)模板2與含有5‘-Psor的候選混合物一起使用。圖5例證了與如圖4A和4B例證的正向引物的5'末端偶聯(lián)的生色團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖6例證了使用實(shí)施例3所述的5'-固定光SELEX對(duì)TIMP-35'ANA/BzdU富集的文庫(kù)的交聯(lián)活性的PAGE分析。凝膠例證了游離適配體(Af)、分子內(nèi)交聯(lián)的適配體(Af*)以及交聯(lián)的蛋白質(zhì)適配體復(fù)合物(PA)的分離。圖7是已經(jīng)鑒別了其慢解離速率適配體的500個(gè)以上的靶的圖表。圖8A-8D例證了含有多種不同及任選功能性包括固定標(biāo)簽、標(biāo)記、光交聯(lián)部分、間隔序列和可釋放部分的適配體構(gòu)建體。圖9A-9F例證了包括可裂解或可釋放元件、標(biāo)簽(例如生物素)、間隔序列和標(biāo)記(例如Cy3)的適配體構(gòu)建體的實(shí)例。圖10例證了本發(fā)明所述的適配體和引物構(gòu)建體。Cy3表示花菁3染料，PC表示光可裂解接頭，ANA表示光反應(yīng)性交聯(lián)基團(tuán)，(AB)2表示由dA殘基分開的一對(duì)生物素殘基，(T)8表示聚dT接頭。引物構(gòu)建體與適配體構(gòu)建體的完整3’固定區(qū)互補(bǔ)。圖11A-11C例證了慢解離速率適配體對(duì)傳統(tǒng)適配體與三個(gè)不同靶的劑量應(yīng)答曲線。圖12A和12B例證了慢解離速率適配體的性能曲線，其中靶是肽。圖13例證了許多慢解離速率適配體的測(cè)量的解鏈溫度相對(duì)于預(yù)測(cè)的解鏈溫度的圖示。圖14描述了本發(fā)明中包括的核苷酸的堿基修飾。除了在核苷酸附著點(diǎn)與R基團(tuán)之間可以使用接頭⑴之外，還描述了可以使用的R基團(tuán)。圖中還示出了核苷酸的修飾位置。圖15例證了用于確定含有C-5修飾嘧啶的適配體的結(jié)合常數(shù)的圖示。發(fā)明詳述除非特別指出，則實(shí)施本發(fā)明應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡述。見例如Sambrook，etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(CurrentEdition)；DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,CurrentEdition)；NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,CurrentEdition)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds.,CurrentEdition)。本說明書中引用的所有出版物、公開的專利文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)均表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)水平。本文引用的所有出版物、公開的專利文件和專利申請(qǐng)均以如每篇出版物、公開的專利文件或?qū)＠暾?qǐng)通過特異和單獨(dú)的援引加入形式相同的程度援引加入本文。如在本說明書包括所附權(quán)利要求書中所用，除非特別指出，則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、“所述……，，包括復(fù)數(shù)引用，且可與“至少一個(gè)/種”及“一或多個(gè)/種”互換使用。因此，“一種適配體”包括適配體混合物，“一種探針”包括探針混合物等。如本文所用，術(shù)語“大約”代表數(shù)值的非顯著修改或改變，從而數(shù)值涉及的項(xiàng)目的基本功能不變。如本文所用，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”及其任何變化用語均意指非排除性包括，由此包含、包括或含有一個(gè)元件或一系列元件的過程、方法、方法限定的產(chǎn)物或物質(zhì)組合物不僅只包括所述那些元件還包括沒有明確列出的或所述過程、方法、方法限定的產(chǎn)物或物質(zhì)組合物所固有的其他元件。如本文所用，“核酸配體”、“適配體”與“克隆”可互換使用，是指對(duì)靶分子具有或可具有希望作用的非天然發(fā)生的核酸。希望的作用包括但不限于結(jié)合靶、催化性改變靶、與靶以一定方式反應(yīng)從而修飾或改變所述靶或者所述靶的功能活性、共價(jià)附著于靶(如在自殺抑制劑中)以及促進(jìn)靶與另一分子之間的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述作用是與靶分子的特異性結(jié)合親和性，這種靶分子除了多核苷酸之外是三維化學(xué)結(jié)構(gòu)，其通過主要不依賴于Watson/Crick堿基配對(duì)或者三螺旋結(jié)合的機(jī)制結(jié)合適配體，其中適配體不是具有已知生理學(xué)功能的由靶分子結(jié)合的核酸。適配體包括通過一定方法從核酸候選混合物中鑒別的核酸，所述適配體是指定靶的配體，所述方法包括(a)將候選混合物與靶接觸，其中可以將候選混合物中相對(duì)于其它核酸與所述靶具有增加的親和性的核酸與剩余的候選混合物分開；(b)將親和性增加和/或慢解離速率的核酸與剩余的候選混合物分開；以及(c)擴(kuò)增親和性增加的核酸以產(chǎn)生配體富集的核酸混合物，從而鑒別所述靶分子的適配體。本領(lǐng)域意識(shí)到親和性相互作用是程度的問題，然而在本文中適配體與其靶的“特異性結(jié)合親和性”是指適配體通常以比其結(jié)合混合物或樣品中其它非靶成分高很多程度的親和性結(jié)合其靶。“適配體”或者“核酸配體”是具有特定核苷酸序列的一種類型或種類的核酸分子的一組拷貝。適配體可包括任何合適數(shù)目的核苷酸?！岸喾N適配體”指一組以上這種分子。不同適配體可具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。適配體可以是DNA或RNA且可以是單鏈、雙鏈或者含有雙鏈區(qū)。如本文所用，“慢解離速率”是指適配體/靶復(fù)合物開始解離所需的時(shí)間。這可以半衰期t1/2表示，或者以50%的適配體/靶復(fù)合物已經(jīng)解離的時(shí)間點(diǎn)表示。以t1/2值表示的慢解離速率適配體的解離速率可以是大約>30分鐘、>60分鐘、>90分鐘、>120分鐘、彡150分鐘、彡180分鐘、彡210和大約彡240分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生核酸的合成文庫(kù)的方法包括1)合成核酸；2)使所述核酸去保護(hù)；3)純化所述核酸；以及4)分析所述核酸。在合成步驟中，制備單體混合物，其中優(yōu)化混合物中多種核苷酸的比率以使得終產(chǎn)物中每種核苷酸等比率?；旌衔镏械囊换蚨鄠€(gè)單體可包含修飾的核苷酸。在這個(gè)方法中使用酰胺(amidite)保護(hù)基團(tuán)，在一個(gè)實(shí)施方案中，單體濃度為0.1M。在合成期間，產(chǎn)物核酸中保留5個(gè)主要的保護(hù)基團(tuán)。在固體支持物(受控多孔玻璃，CPG)上進(jìn)行合成，且完成至少大約80次循環(huán)以合成終產(chǎn)物。在合成過程之后，對(duì)核酸產(chǎn)物去保護(hù)。將1.0M賴氨酸水相緩沖液(pH9.0)用于裂解無嘌呤位點(diǎn)，而產(chǎn)物保留在支持物(受控多孔玻璃，CPG)上。用去離子化(dl)水洗滌兩次洗去這些裂解的截短的序列。在準(zhǔn)備去保護(hù)步驟中兩次洗滌之后加入500uL的dl水。這個(gè)步驟包括用1.OmL的112的t-丁胺甲醇水在70°C處理5小時(shí)，隨后冷凍、過濾以及蒸發(fā)干燥?；诒Ｗo(hù)基團(tuán)的疏水性，在PRP-3HPLC柱(Hamilton)上純化核酸產(chǎn)物。收集并集合合適的柱級(jí)分，脫鹽及蒸發(fā)干燥以除去可揮發(fā)的洗脫緩沖液。通過離心用水洗滌終產(chǎn)物并重懸。最后，處理重懸的材料以使終產(chǎn)物去保護(hù)。通過堿基組成、引物延伸和測(cè)序凝膠鑒定終產(chǎn)物。核酸候選混合物也可以使用固相通過酶促方法產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法包括與上述相同的基本步驟。在這種情況中，目標(biāo)是合成反義文庫(kù)且這些文庫(kù)用5'生物素修飾產(chǎn)生。所有剩下的合成過程如上所述。一旦制備了合成文庫(kù)，則核酸可用于含有一或多個(gè)修飾的核苷酸的引物延伸混合物中，通過傳統(tǒng)的引物延伸方法產(chǎn)生最終候選混合物。適配體可以通過用于合成文庫(kù)的相同化學(xué)方法合成。然而，代替核苷酸混合物，在合成的每個(gè)步驟中導(dǎo)入一種核苷酸以控制通過常規(guī)方法產(chǎn)生的最終序列。在合成過程中在序列的所需位置可以導(dǎo)入修飾的核苷酸。使用已知的核苷酸化學(xué)修飾方法可以導(dǎo)入所需的其它功能性。如本文所用，“候選混合物”是從中選擇希望的配體的不同序列的核酸的混合物。候選混合物的來源可以來自天然發(fā)生的核酸或者其片段、化學(xué)合成的核酸、酶促合成的核酸或者通過組合前述技術(shù)產(chǎn)生的核酸。修飾的核苷酸如具有光反應(yīng)性基團(tuán)或者其它修飾的核苷酸可以摻入候選混合物中。此外，可以使用SELEX方法產(chǎn)生候選混合物，即第一個(gè)SELEX方法實(shí)驗(yàn)可用于產(chǎn)生配體富集的核酸混合物，該混合物在第二個(gè)SELEX方法實(shí)驗(yàn)中用作候選混合物。候選混合物也可以包含具有一或多個(gè)普通結(jié)構(gòu)基序的核酸。如本文所用，候選混合物有時(shí)也稱作“集合(pool)，，或者“文庫(kù)”。例如，“RNA集合”是指包括RNA的候選混合物。在不同的實(shí)施方案中，候選混合物中的每個(gè)核酸在隨機(jī)化區(qū)域的任一側(cè)可具有固定的序列以便于擴(kuò)增過程。核酸候選混合物中的核酸在其5'和3'末端均可進(jìn)一步包含固定區(qū)或者“尾”序列以防止在擴(kuò)增過程期間形成高分子量寄生物(parasite)。如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，這種核苷酸可以包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或類似物或者化學(xué)修飾的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括雙鏈或單鏈分子以及三螺旋分子。如果存在，核苷酸的化學(xué)修飾可包含單一或任意組合修飾，2'_位置糖修飾，5-位置嘧啶修飾(例如5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷，5-(N-異丁基羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷，5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷，5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物，5-(N-萘基羧基酰胺)_2'_脫氧尿苷或者5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷)，8-位置嘌呤修飾，環(huán)外胺修飾，4-硫尿嘧啶取代，5-溴-或5-碘-尿嘧啶取代，主鏈修飾，甲基化，獨(dú)特的堿基配對(duì)組合如異堿基異胞苷(isobasesisocytidine)和異胍(isoguanidine)等。修飾也可包括3'和5'修飾，如加帽(capping)或聚乙二醇化。其它修飾可包括一或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸由類似物取代，核苷酸間修飾如具有無電荷連接的那些(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接的那些(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，具有嵌入物的那些(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，含有螯合劑的那些(例如金屬，放射性金屬，硼、氧化金屬等)，含有烷化劑的那些以及具有修飾的連接的那些(例如α異頭核酸等)。進(jìn)一步地，最初存在于糖中的任何羥基可以由膦酸酯或者磷酸酯基團(tuán)置換；由標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)；或者被激活以制備與額外的核苷酸或者固體支持物的額外連接。5'和3'末端OH基團(tuán)可以被磷酸化或者取代為胺、大約1至大約20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)部分或者大約1至大約20個(gè)聚乙二醇(PEG)聚合物或者其它親水性或疏水性生物或合成聚合物的有機(jī)加帽基團(tuán)部分。如果存在，核苷酸結(jié)構(gòu)修飾可以在聚合物裝配之前或之后賦予。核苷酸序列可以由非核苷酸成分間斷。多核苷酸可以在聚合之后被進(jìn)一步修飾，例如通過與標(biāo)記成分綴合進(jìn)行。多核苷酸也可以含有本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括2'-0-甲基_、‘-0-烯丙基、2'-氟-或者2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-異頭糖，差向異構(gòu)體糖如阿拉伯糖、木糖或者來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物和無堿基核苷酸類似物如甲基核苷。如上所述，一或多個(gè)磷酸二酯鍵可以由可變連接基團(tuán)置換。這些可變連接基團(tuán)包括這樣的實(shí)施方案，其中磷酸酯由P(0)S(硫代酯)、P(S)S(二硫代酯)、(O)NR2(酰胺酯(amidate)),P(O)R,P(O)OR'、⑶或者CH2(formacetal)置換，其中每個(gè)R或R'獨(dú)立地是H或者取代或未取代的烷基(1-20C)，任選含有醚(-0-)鍵、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或者araldyl。多核苷酸中不是所有鍵均需要相同。糖、嘌呤和嘧啶的類似形式的取代可有利于設(shè)計(jì)終產(chǎn)物，這樣可以改變主鏈結(jié)構(gòu)如多酰胺主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，適配體的可變區(qū)可包括包括修飾的堿基的核苷酸。某些修飾的適配體可用于任何所述方法、裝置和試劑盒中。這些修飾的核苷酸已經(jīng)示出產(chǎn)生新的適配體，所述新的適配體與其各自的靶具有極慢解離速率，同時(shí)與靶保持高親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以修飾嘧啶堿基的C-5位置。含有具有修飾的堿基的核苷酸的適配體具有不同于僅包含天然核苷酸(即未修飾的核苷酸)的標(biāo)準(zhǔn)適配體的許多性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾核苷酸的方法包括使用酰胺鍵。然而，可以使用其它合適的修飾方法。令人驚奇地觀測(cè)到鑒別的慢解離速率適配體的結(jié)構(gòu)似乎與通過標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)模型預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)不完全一致。這個(gè)觀測(cè)結(jié)果通過這樣的事實(shí)得以支持，即慢解離速率適配體的測(cè)量的解鏈溫度與通過模型預(yù)測(cè)的解鏈溫度不一致，見圖13。正如所示，看起來慢解離速率適配體的測(cè)量的解鏈溫度與預(yù)測(cè)的解鏈溫度之間無相關(guān)性。計(jì)算的平均解鏈溫度(Tm)比測(cè)量的Tm低6°C。測(cè)量的解鏈溫度表示包括這些修飾的核苷酸的慢解離速率適配體比預(yù)測(cè)的更穩(wěn)定及潛在具有新的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些修飾的適配體與僅包括未修飾的核苷酸的相應(yīng)適配體相比也具有不同的圓二色譜。在許多靶的情況中，當(dāng)修飾的核苷酸用于產(chǎn)生初始文庫(kù)或候選混合物時(shí)，所述靶的慢解離速率適配體更可能被鑒別。特定的5-位置嘧啶修飾包括在美國(guó)專利5，719，273和5，945，527中描述的以及在圖14中例證的那些。如本文所用，“修飾的核酸”是指含有一或多個(gè)修飾的核苷酸的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，希望修飾的核苷酸與SELEX方法相容。“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性或者分支的，其可包含修飾的氨基酸，和/或其可以由非氨基酸間斷。該術(shù)語還包含已經(jīng)天然修飾或者通過人工干預(yù)如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或者任何其它操縱或修飾如與標(biāo)記成分綴合而修飾的氨基酸聚合物。這個(gè)定義還包含例如含有一或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知其它修飾的多肽。多肽可以是單鏈或締合的多個(gè)鏈。如本文所用，“光反應(yīng)性核苷酸”是指在用一定波長(zhǎng)的光照射時(shí)能與靶如蛋白質(zhì)光交聯(lián)的任何修飾的核苷酸。例如，通過光SELEX方法產(chǎn)生的光適配體可包括選自如下的光反應(yīng)性基團(tuán)5-溴尿嘧啶(BrU)、5_碘尿嘧啶(IU)、5_溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8_溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-溴脫氧尿苷、8-溴-2'-脫氧腺嘌呤、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶、5-碘-2'-脫氧胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤和7-脫氮-7-溴鳥嘌呤。“光反應(yīng)性嘧啶”是指在用一定波長(zhǎng)的光照射時(shí)能與靶光交聯(lián)的任何修飾的嘧啶。舉例的光反應(yīng)性嘧啶包括5-溴-尿嘧啶(BrdU)、5-溴-胞嘧啶(BrdC)、5-碘-尿嘧啶(IdU)和5-碘-胞嘧啶(IdC)。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述光反應(yīng)性官能團(tuán)將吸收一定波長(zhǎng)的光，這種波長(zhǎng)的光不被靶或者所述寡核苷酸的未修飾部分吸收?！癝ELEX”是指組合了選擇以希望的方式(例如結(jié)合蛋白質(zhì))與靶相互作用的核酸以及擴(kuò)增這些選擇的核酸的方法。任選重復(fù)選擇/擴(kuò)增步驟循環(huán)，以可以選擇與含有非常大量核酸的集合中的靶最強(qiáng)相互作用的一個(gè)或少數(shù)核酸。持續(xù)選擇/擴(kuò)增循環(huán)，直至實(shí)現(xiàn)選擇目標(biāo)。SELEX方法學(xué)在SELEX專利中描述。在SELEX方法的一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生與其靶非共價(jià)結(jié)合的適配體。在SELEX方法的其它實(shí)施方案中產(chǎn)生與其靶共價(jià)結(jié)合的適配體。如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增”是指增加一個(gè)分子或一類分子的量或拷貝數(shù)的任何方法和方法步驟組合。"SELEX靶”或者“靶分子”或者“靶”在本文是指核酸可以希望的方式作用的任何化合物。SELEX靶分子非限制性地可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質(zhì)、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制齊U、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞、組織，前述任何材料的任何部分或片段等。在一個(gè)實(shí)施方案中，SELEX靶不包括已知結(jié)合核酸的分子，例如已知的核酸結(jié)合蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)。實(shí)際上任何化學(xué)或生物效應(yīng)物均可以是合適的SELEX靶。任何大小的分子均可作為SELEX靶。也可以通過一些方式修飾靶以增強(qiáng)所述靶與核酸之間的相互作用的可能性或強(qiáng)度。靶也可以包括特定化合物或分子的任何微小變化，如在蛋白質(zhì)的情況中可包括如氨基酸序列、二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛘呷魏纹渌倏v或修飾如與標(biāo)記成分綴合的的微小變化，其基本上不改變分子的同一性(identity)?！鞍蟹肿印被蛘摺鞍小笔悄芙Y(jié)合適配體的一種類型或種類的分子或多分子結(jié)構(gòu)的一組拷貝?！岸鄠€(gè)靶分子”或“多個(gè)靶”是指一組以上這種分子。其中靶是肽的SELEX方法的實(shí)施方案在發(fā)明名稱為“ModifiedSELEXProcessesWithoutPurifiedProtein”的美國(guó)專利No.6，376，190中描述，其以全部?jī)?nèi)容援引加入本文。圖7列出了已經(jīng)產(chǎn)生其適配體包括各種慢解離速率適配體的500個(gè)以上的靶。如本文所用，“競(jìng)爭(zhēng)劑分子”和“競(jìng)爭(zhēng)劑”可互換使用，是指可以與非靶分子形成非特異性復(fù)合物的任何分子。在本文中，非靶分子包括游離適配體，例如競(jìng)爭(zhēng)劑可用于抑制適配體與另一非靶分子的非特異性結(jié)合(再結(jié)合)?！案?jìng)爭(zhēng)劑分子”或者“競(jìng)爭(zhēng)劑”是一種類型或種類分子的一組拷貝?！岸鄠€(gè)競(jìng)爭(zhēng)劑分子”或者“多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)劑”是指一組以上這種分子。競(jìng)爭(zhēng)劑分子包括但不限于寡核苷酸、聚陰離子(例如肝素、鯡精DNA、鮭精DNA、tRNA、硫酸葡聚糖、聚葡聚糖、無堿基磷酸二酯聚合物、dNTP以及焦磷酸鹽/酯)。在多個(gè)實(shí)施方案中可以使用一或多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)劑的組合。如本文所用，“非特異性復(fù)合物”是指除了適配體與其靶分子之外兩或多個(gè)分子之間的非共價(jià)締合。非特異性復(fù)合物代表分子類別之間的相互作用。非特異性復(fù)合物包括在適配體與非靶分子、競(jìng)爭(zhēng)劑與非靶分子、競(jìng)爭(zhēng)劑與靶分子以及靶分子與非靶分子之間形成的復(fù)合物。如本文所用，術(shù)語“慢解離速率富集過程”是指改變候選混合物的某些成分的相對(duì)濃度的過程，由此具有慢解離速率的適配體親和性復(fù)合物的相對(duì)濃度相對(duì)于具有較快、不太希望的解離速率的適配體親和性復(fù)合物的濃度增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程是基于溶液的慢解離速率富集過程。在這個(gè)實(shí)施方案中，基于溶液的慢解離速率富集過程在溶液中發(fā)生，由此在慢解離速率富集過程期間在混合物中形成適配體親和性復(fù)合物的靶或核酸均不固定在固體支持物上。在多個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程可包括一或多個(gè)步驟，包括加入競(jìng)爭(zhēng)劑及保溫，稀釋混合物，或者這些步驟的組合(例如在存在競(jìng)爭(zhēng)劑分子的條件下稀釋混合物)。由于慢解離速率富集過程的作用通常依賴于不同適配體親和性復(fù)合物(即在候選混合物中靶分子與不同核酸之間形成的適配體親和性復(fù)合物)的不同解離速率，選擇慢解離速率富集過程的持續(xù)時(shí)間以保持高比例的具有低解離速率的適配體親和性復(fù)合物，同時(shí)充分降低具有快解離速率的適配體親和性復(fù)合物的數(shù)量。在SELEX中的一或多個(gè)循環(huán)中可以使用慢解離速率富集過程。當(dāng)組合使用稀釋和加入競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)，其可以同時(shí)或以任何順序相繼進(jìn)行。當(dāng)混合物中總靶(蛋白質(zhì))濃度較低時(shí)可以使用慢解離速率富集過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)慢解離速率富集過程包括稀釋時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際需要稀釋混合物，需注意的是回收適配體保留的核酸以進(jìn)行隨后的SELEX方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程包括使用競(jìng)爭(zhēng)劑以及稀釋，允許以比不使用競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)可能需要的稀釋倍數(shù)更低的稀釋倍數(shù)稀釋混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程包括加入競(jìng)爭(zhēng)劑，所述競(jìng)爭(zhēng)劑是聚陰離子(例如肝素或者硫酸葡聚糖(葡聚糖))。肝素或葡聚糖在先前的SELEX選擇中用于鑒別特異的適配體。然而在這種方法中，肝素或葡聚糖在靶與適配體結(jié)合形成復(fù)合物的平衡步驟期間存在。在這種方法中，隨著肝素或葡聚糖的濃度增加，高親和性靶/適配體復(fù)合物與低親和性靶/適配體復(fù)合物的比率增加。然而，高濃度的肝素或者葡聚糖可以降低在平衡時(shí)高親和性靶/適配體復(fù)合物的數(shù)目，這是由于核酸與競(jìng)爭(zhēng)劑之間對(duì)靶結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)所致。相反，本發(fā)明描述的方法在靶/適配體復(fù)合物已經(jīng)形成之后加入競(jìng)爭(zhēng)劑，因此不影響形成的復(fù)合物的數(shù)目。在靶與適配體之間已經(jīng)出現(xiàn)平衡結(jié)合之后加入競(jìng)爭(zhēng)劑產(chǎn)生非平衡狀態(tài)，其隨時(shí)間進(jìn)化為具有更少靶/適配體復(fù)合物的新平衡。在達(dá)到新的平衡之前捕獲靶/適配體復(fù)合物富集了樣品中的慢解離速率適配體，因?yàn)榭旖怆x速率復(fù)合物首先解離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚陰離子競(jìng)爭(zhēng)劑(例如硫酸葡聚糖或者另一種聚陰離子材料)用于慢解離速率富集過程中以便于鑒別耐聚陰離子存在的適配體。在本文中，“耐聚陰離子適配體”是能形成適配體/靶復(fù)合物的適配體，所述復(fù)合物與包括非耐聚陰離子適配體的適配體/靶復(fù)合物相比在也含有耐聚陰離子材料的溶液中不太可能解離。以這種方式，耐聚陰離子適配體可用于實(shí)施分析方法以檢測(cè)樣品中靶的存在或量或濃度，其中所述檢測(cè)方法包括使用適配體耐的聚陰離子材料(如硫酸葡聚糖)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生耐聚陰離子的適配體的方法。在這個(gè)實(shí)施方案中，在核酸候選混合物與靶接觸后。使候選混合物中的靶與核酸達(dá)到平衡。導(dǎo)入聚陰離子競(jìng)爭(zhēng)劑，在溶液中保溫足以保證候選混合物中大多數(shù)快解離速率適配體與靶分子解離的一段時(shí)間。而且候選混合物中在存在聚陰離子競(jìng)爭(zhēng)劑條件下可以解離的適配體也從靶分子中釋放。分開該混合物以分離與靶分子保持締合的高親和性慢解離速率適配體及從溶液中除去任何未復(fù)合的材料。然后適配體可以從靶分子中釋放并分離。也可以擴(kuò)增分離的適配體以及進(jìn)行額外的選擇循環(huán)以增加選擇的適配體的整體性能。如果針對(duì)特定應(yīng)用不需要選擇慢解離速率適配體，這個(gè)方法可以使用最短的保溫時(shí)間。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了修改的SELEX方法以鑒別或產(chǎn)生具有慢(長(zhǎng))解離速率的適配體，其中將靶分子與候選混合物接觸并一起保溫足以在靶分子與候選混合物中含有的核酸之間發(fā)生平衡結(jié)合的一段時(shí)間。在平衡結(jié)合之后在混合物中加入過量的競(jìng)爭(zhēng)劑分子如聚陰離子競(jìng)爭(zhēng)劑，將該混合物與過量的競(jìng)爭(zhēng)劑分子一起保溫預(yù)定時(shí)間。在預(yù)定保溫時(shí)間期間，解離速率低于這個(gè)預(yù)定保溫時(shí)間的大部分適配體將與靶解離。使這些“快”解離速率適配體與靶的再締合最小化，因?yàn)檫^量的競(jìng)爭(zhēng)劑分子可以非特異性結(jié)合靶且占據(jù)靶結(jié)合位點(diǎn)。具有較長(zhǎng)解離速率的大部分適配體在預(yù)定保溫時(shí)間期間將保持與靶復(fù)合。在保溫結(jié)束時(shí)，將核酸-靶復(fù)合物與剩余的混合物分開使得可以從具有快解離速率的適配體中分離慢解離速率適配體群。解離步驟可用于使慢解離速率適配體與其靶解離且使得可以分離、鑒別、測(cè)序、合成及擴(kuò)增對(duì)靶分子具有高親和性和特異性的慢解離速率適配體(各個(gè)適配體或者一組慢解離速率適配體)。使用常規(guī)SELEX方法從修改的SELEX方法的一個(gè)循環(huán)中鑒別的適配體序列可用于合成新的候選混合物，由此根據(jù)需要可以重復(fù)多次接觸、平衡結(jié)合、介入競(jìng)爭(zhēng)劑分子、與競(jìng)爭(zhēng)劑分子保溫及分開慢解離速率適配體的步驟。組合在加入競(jìng)爭(zhēng)劑之前使候選混合物與靶達(dá)到平衡結(jié)合，隨后加入過量競(jìng)爭(zhēng)劑及與該競(jìng)爭(zhēng)劑一起保溫預(yù)定時(shí)間可以選擇具有比先前達(dá)到的那些解離速率高很多的解離速率的適配體群。為了實(shí)現(xiàn)平衡結(jié)合，可以將候選混合物與靶保溫至少大約5分鐘，或者至少大約15分鐘、大約30分鐘、大約45分鐘、大約1小時(shí)、大約2小時(shí)、大約3小時(shí)、大約4小時(shí)、大約5小時(shí)或者大約6小時(shí)?？梢愿鶕?jù)需要，考慮到如靶的性質(zhì)以及靶的已知適配體的已知解離速率(如果有的話)等因素，選擇競(jìng)爭(zhēng)劑分子與候選混合物與靶分子的混合物的預(yù)定保溫時(shí)間。預(yù)定保溫時(shí)間可以選自至少大約5分鐘、至少大約10分鐘、至少大約20分鐘、至少大約30分鐘、至少45大約分鐘、至少大約1小時(shí)、至少大約2小時(shí)、至少大約3小時(shí)、至少大約4小時(shí)、至少大約5小時(shí)、至少大約6小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，使用稀釋作為解離速率增強(qiáng)方法，將稀釋的候選混合物、靶分子/適配體復(fù)合物保溫預(yù)定時(shí)間，所述保溫時(shí)間可選自至少大約5分鐘、至少大約10分鐘、至少大約20分鐘、至少大約30分鐘、至少大約45分鐘、至少大約1小時(shí)、至少大約2小時(shí)、至少大約3小時(shí)、至少大約4小時(shí)、至少大約5小時(shí)、至少大約6小時(shí)。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及慢解離速率適配體的鑒別、產(chǎn)生、合成及應(yīng)用。這些適配體是與非共價(jià)適配體-靶復(fù)合物的解離速率(t1/2)大于通過常規(guī)SELEX方法獲得的適配體的解離速率的適配體。對(duì)于含有適配體與靶的非共價(jià)復(fù)合物的混合物，t1/2表示一半的適配體從適配體-靶復(fù)合物中解離所需時(shí)間。本發(fā)明的慢解離速率適配體的t1/2選自如下之一大于或等于大約30分鐘，在大約30分鐘至大約240分鐘之間，在大約30分鐘至大約60分鐘之間，在大約60分鐘至大約90分鐘之間，在大約90分鐘至大約120分鐘之間，在大約120分鐘至大約150分鐘之間，在大約150分鐘至大約180分鐘之間，在大約180分鐘至大約210分鐘之間，在大約210分鐘至大約240分鐘之間。通過SELEX方法鑒別的適配體的特征性特點(diǎn)是其對(duì)靶的高親和性。適配體對(duì)其靶的解離常數(shù)選自如下之一低于大約ΙμΜ、低于大約ΙΟΟηΜ、低于大約ΙΟηΜ、低于大約InM、低于大約ΙΟΟρΜ、低于大約10pM、低于大約ΙρΜ?！敖M織靶”或者“組織”在本文是指上述SELEX靶的某一子集。根據(jù)這個(gè)定義，組織是異質(zhì)環(huán)境中的大分子。如本文所用，組織是指單一細(xì)胞類型、細(xì)胞類型集合、細(xì)胞聚集體，或者大分子聚集體。這與是典型分離的可溶分子如蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單SELEX靶不同。在一些實(shí)施方案中，組織是不溶的大分子，是大于簡(jiǎn)單SELEX靶的量級(jí)。組織是由許多大分子組成的復(fù)雜靶，每個(gè)大分子具有許多潛在表位。包含許多表位的不同大分子可以是蛋白質(zhì)、月旨質(zhì)、碳水化合物等或其組合。組織通常是大分子的物理陣列，在結(jié)構(gòu)和組成方面可以是流動(dòng)性或剛性的。胞外基質(zhì)是在結(jié)構(gòu)和組成方面更剛性的組織的例子，而膜雙層在結(jié)構(gòu)和組成方面是更流動(dòng)性的。組織通常是不溶的，保持為固相，因此可以相對(duì)容易地實(shí)現(xiàn)分開。組織包括但不限于特定種類的細(xì)胞與其胞內(nèi)物質(zhì)的聚集體，形成通常用于表示指定器官如腎組織、腦組織的一般細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)材料之一。四種基本組織類別是上皮組織、結(jié)締組織、神經(jīng)組織和肌組織。符合這個(gè)定義的組織的例子包括但不限于大分子的異質(zhì)聚集體如纖維蛋白凝塊，其是細(xì)胞性的；細(xì)胞的同質(zhì)或異質(zhì)聚集體；含有具有特定功能的細(xì)胞的較高級(jí)別的結(jié)構(gòu)，如器官、腫瘤、淋巴結(jié)、動(dòng)脈等；以及個(gè)體細(xì)胞。組織或細(xì)胞可以在其天然環(huán)境中，是分離的，或者在組織培養(yǎng)物中。組織可以是完整的或者是修飾的。所述修飾可包括許多改變?nèi)甾D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、激活以及亞結(jié)構(gòu)(substructure)分離，例如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器等。組織、細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的來源可以得自原核生物以及真核生物。這包括人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌和病毒結(jié)構(gòu)。如本文所用，術(shù)語“標(biāo)記物質(zhì)”、“標(biāo)記”或者“可檢測(cè)部分”或者“可檢測(cè)元件”或者“可檢測(cè)成分”是指可用于檢測(cè)結(jié)合適配體的靶分子的一或多種試劑?？蓹z測(cè)部分或標(biāo)記能被直接或間接檢測(cè)。通常，任何可檢測(cè)的報(bào)道分子均可以是標(biāo)記。標(biāo)記包括例如(i)通過產(chǎn)生信號(hào)而可以被直接檢測(cè)的報(bào)道分子，(ii)通過隨后與含有報(bào)道分子的同源物(cognate)結(jié)合而可以被間接檢測(cè)的特異性結(jié)合對(duì)成員，(iii)通過質(zhì)譜分析可以檢測(cè)的質(zhì)量標(biāo)簽，(iv)可以提供擴(kuò)增或連接模板的寡核苷酸引物，以及(ν)可作為配體如阻抑物蛋白的特異性多核苷酸序列或識(shí)別序列，其中在后兩種情況中寡核苷酸引物或者阻抑物蛋白具有或者能具有報(bào)道分子等等。報(bào)道分子可以是催化劑如酶，編碼催化劑的多核苷酸，染料，熒光分子、量子點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光分子、輔酶、酶底物、放射性基團(tuán)、小有機(jī)分子、可擴(kuò)增的多核苷酸序列、顆粒如膠乳或碳顆粒、金屬溶膠、微晶、脂質(zhì)體、細(xì)胞等，其可以或者不可以用染料、催化劑或者其它可檢測(cè)基團(tuán)、改變其綴合的分子的分子量以進(jìn)行質(zhì)譜分析的質(zhì)量標(biāo)簽等進(jìn)一步標(biāo)記。所述標(biāo)記可選自電磁性或電化學(xué)材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明揭示顯而易見其它標(biāo)記和標(biāo)記方案。可檢測(cè)部分(元件或成分)可包括上文列出的任何報(bào)道分子及可以任何方式用于產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的任何其它化學(xué)品或成分。所述可檢測(cè)部分可以通過熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)或者依賴于檢測(cè)部分的同一性的任何其它可檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)。在可檢測(cè)部分是酶(例如堿性磷酸酶)的情況中，信號(hào)可以在存在酶底物以及為酶活性所需的任何其它因子的條件下產(chǎn)生。在可檢測(cè)部分是酶底物的情況中，信號(hào)可以在存在酶及為酶活性所需的任何其它因子的條件下產(chǎn)生。使可檢測(cè)部分與靶分子附著的合適試劑構(gòu)型包括可檢測(cè)部分與靶分子的共價(jià)附著、可檢測(cè)部分與共價(jià)附著于靶分子的另一標(biāo)記物質(zhì)成分的非共價(jià)締合以及可檢測(cè)部分與非共價(jià)締合靶分子的標(biāo)記物質(zhì)成分的共價(jià)附著。通用蛋白質(zhì)染色(Universalproteinstains,UPS)在2004年8月12日申請(qǐng)的發(fā)明名稱為“MethodsandReagentsforDetectingTargetBindingbyNucleicAcidLigands，，的美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.10/504,696中詳細(xì)描述?！肮腆w支持物”在本文是指具有分子可以通過共價(jià)或非共價(jià)鍵直接或者間接附著的表面的任何基材。所述基材材料可以是天然發(fā)生的、合成的或者天然發(fā)生的材料的修飾的材料。固體支持物材料可包括硅、石墨、鏡面、薄片、陶瓷、塑料(包括聚合物如聚氯乙烯，環(huán)烯共聚物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚-4-甲基丁烯，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚對(duì)苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯(PTFE或Teflon)，尼龍，聚乙烯醇丁酸酯(polyvinylbutyrate))、鍺、砷化鎵、金、銀等，單獨(dú)使用或者聯(lián)合其它材料一起使用。可以考慮其它剛性材料，如玻璃，包括二氧化硅及進(jìn)一步包括如Bioglass?？捎玫钠渌牧习ㄓ锌撞牧先缡芸赜锌撞Ａе椤Ｒ舶绢I(lǐng)域已知的在表面具有摻入的一或多個(gè)官能團(tuán)如任意氨基、羧基、硫醇或者羥基官能團(tuán)的任何其它材料。固體支持物可采用從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的多種構(gòu)型，可具有多種形狀包括條狀、平板、盤狀、桿狀、顆粒包括珠、管、孔等的任一種。表面可以是相對(duì)平面(例如載玻片)、球形(例如珠)、圓柱狀(例如柱)或者凹槽狀。舉例的可以使用的固體支持物包括微滴定平板孔、顯微鏡載玻片、膜、順磁性珠、帶電荷的紙張、Langmuir-Blodgett膜、硅晶片芯片、流控芯片(flowthroughchip)和微珠。如本文所用，“分開(partitioning)”是指將混合物的一或多種成分與混合物的其它成分分開的任何方法。例如，結(jié)合靶分子的適配體可以與未結(jié)合靶分子的其它核酸以及與非靶分子分開。更廣義而言，分開使得基于核酸對(duì)靶分子的相對(duì)親和性和/或解離速率可以將候選混合物中的所有核酸分離成至少兩個(gè)集合。分開可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法實(shí)現(xiàn)，包括過濾、親和性層析、液體_液體分配、HPLC等。例如，核酸-蛋白質(zhì)對(duì)可以結(jié)合硝化纖維素膜，而未結(jié)合的核酸則否。特異性保留核酸-靶復(fù)合物的柱也可用于分開。例如，能與結(jié)合柱的靶分子締合的寡核苷酸使得可以使用柱層析分開和分離最高親和性適配體。靶分子綴合于其上的珠也可用于分開混合物中的適配體。如果珠是順磁性的，則可以通過施加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)分開。表面等離子體共振技術(shù)可用于分開混合物中的核酸，通過將靶固定于傳感芯片上并使混合物流經(jīng)該芯片進(jìn)行，其中對(duì)靶具有親和性的那些核酸可以結(jié)合靶，剩余的核酸可被洗去。可以使用液體-液體分配以及過濾凝膠阻滯和密度梯度離心。靶分子上的親和性標(biāo)簽也可用于將與標(biāo)簽標(biāo)記(tagged)的靶結(jié)合的核酸分子與溶液中的游離適配體分離。例如，使用鏈霉抗生物素蛋白順磁性珠，可以將生物素化的靶分子以及與其結(jié)合的適配體與未結(jié)合的核酸序列溶液隔離(sequester)。在制備期間也可以將親和性標(biāo)簽摻入適配體中。如本文所用，“光SELEX，，是PhotochemicalSystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment的首字母縮寫，是指產(chǎn)生光交聯(lián)適配體的SELEX方法的實(shí)施方案。在光SELEX方法的一個(gè)實(shí)施方案中，摻入通過吸收光激活的光反應(yīng)性核苷酸代替RNA-或ssDNA-隨機(jī)化寡核苷酸文庫(kù)中的天然堿基，照射所述核酸靶分子混合物使得摻入核酸-靶分子復(fù)合物中的一些核酸通過光反應(yīng)性官能團(tuán)與靶分子交聯(lián)，選擇步驟是根據(jù)光交聯(lián)活性進(jìn)行選擇。所述光SELEX方法在光SELEX專利中更詳細(xì)描述。如本文所用，“光適配體”、“光反應(yīng)性適配體”以及“光反應(yīng)性適配體”可互換使用，是指含有可與靶分子共價(jià)結(jié)合或者“交聯(lián)”的一或多個(gè)光反應(yīng)性官能團(tuán)的適配體。例如，可以修飾天然發(fā)生的核酸殘基以包括在所述核酸殘基暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的放射源時(shí)賦予光反應(yīng)性的化學(xué)官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，光反應(yīng)性適配體是最初鑒別的。在其它實(shí)施方案中，首先鑒別適配體，隨后對(duì)其進(jìn)行修飾以摻入一或多個(gè)光反應(yīng)性官能團(tuán)，從而產(chǎn)生光適配體。在這些實(shí)施方案中，可以在適配體中摻入一或多個(gè)光反應(yīng)性核酸殘基，通過用光反應(yīng)性核酸殘基取代適配體中一或多個(gè)其它核苷酸如一或多個(gè)胸苷和/或胞苷或者通過修飾一或多個(gè)核酸殘基以包括光反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行。舉例的可以通過光適配體摻入的光反應(yīng)性官能團(tuán)包括5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-硫尿嘧啶、4-硫胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤和7-脫氮-7-溴鳥嘌呤。除了這些舉例的基于核苷的光反應(yīng)性官能團(tuán)之外，也可以使用通過使用合適接頭分子可以加入適配體末端的其它光反應(yīng)性官能團(tuán)。這種光反應(yīng)性官能團(tuán)包括苯甲酮、蒽醌、4-疊氮-2-硝基-苯胺、補(bǔ)骨脂素，任何這些官能團(tuán)的衍生物等。通過光適配體摻入的光反應(yīng)性官能團(tuán)可以通過任何合適方法激活。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過將光適配體及其結(jié)合的靶分子暴露于電磁放射源而使含有光反應(yīng)性官能團(tuán)的光適配體與其靶交聯(lián)。合適類型的電磁放射包括紫外光、可見光、X-射線和Y射線。合適的放射源包括利用單色光或者濾波的多色光的源。如本文所用，術(shù)語“親和性SELEX方法”是指其中產(chǎn)生靶的非光交聯(lián)適配體的SELEX方法的實(shí)施方案。在親和性SELEX方法的一些實(shí)施方案中，在將靶與核酸候選混合物接觸之前或之后將靶固定于固體支持物上。靶與固體支持物的締合使得候選混合物中已經(jīng)結(jié)合的核酸(以及在使用慢解離速率富集過程的情況中)保持結(jié)合將與剩余的候選混合物分開的靶。術(shù)語“珠親和性SELEX方法”是指親和性SELEX方法的特定實(shí)施方案，其中例如在與核酸候選混合物接觸之前將靶固定于珠上。在一些實(shí)施方案中，所述珠是順磁性珠。術(shù)語“濾膜親和性SELEX方法”是指這樣的實(shí)施方案，其中通過其與濾膜如硝化纖維素膜的締合而將核酸靶復(fù)合物與候選混合物分開。這包括這樣的實(shí)施方案，其中靶與核酸最初在溶液中接觸及與濾膜接觸；也包括這樣的實(shí)施方案，其中將核酸與預(yù)先固定在濾膜上的靶接觸。術(shù)語“平板親和性SELEX方法”是指這樣的實(shí)施方案，其中將靶固定于平板如多孔微滴定平板的表面。在一些實(shí)施方案中，所述平板包括聚苯乙烯。在一些實(shí)施方案中，通過疏水性相互作用在平板親和性SELEX方法中將靶附著于平板。本發(fā)明描述了改良的SELEX方法用以產(chǎn)生能結(jié)合靶分子的適配體。更特別地，本發(fā)明描述了鑒別與使用先前的SELEX方法獲得的適配體相比與其各自的靶向分子具有較慢解離速率的適配體和/或光適配體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步描述了通過使用本文所述方法獲得的適配體和/或光適配體及使用其的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒別與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸序列的候選混合物；(b)將候選混合物與靶分子接觸，其中對(duì)靶分子具有最高相對(duì)親和性的核酸優(yōu)先結(jié)合靶分子，形成核酸-靶分子復(fù)合物；(c)應(yīng)用慢解離速率富集過程法使得具有相對(duì)快解離速率的核酸-靶分子復(fù)合物解離；(d)將剩余的核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物中的游離核酸及非靶分子分開；以及(e)鑒別靶分子的適配體。所述方法可進(jìn)一步包括擴(kuò)增結(jié)合靶分子的核酸的重復(fù)步驟以產(chǎn)生能結(jié)合靶分子但仍產(chǎn)生具有慢解離速率的核酸_靶分子復(fù)合物的序列富集核酸的混合物。如上所述，慢解離速率富集過程可選自稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物，在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑，以及稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物以及在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒別與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與其靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸-靶分子復(fù)合物；(c)將候選混合物與靶分子一起保溫足以實(shí)現(xiàn)平衡結(jié)合的一段時(shí)間；(d)在(c)的混合物中加入過量的至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子；(e)將(d)的候選混合物、核酸-靶分子復(fù)合物與競(jìng)爭(zhēng)劑分子的混合物保溫預(yù)定時(shí)間；(f)將核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(g)使核酸_靶分子復(fù)合物解離以產(chǎn)生游離核酸；(h)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而可以鑒別所述靶分子的適配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括制備或合成適配體，所述適配體包括通過包括如下步驟的方法鑒別的核酸序列(a)制備核酸候選混合物；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將候選混合物與靶分子保溫足以實(shí)現(xiàn)平衡結(jié)合的一段時(shí)間；(d)在(c)的混合物中加入過量的至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子；(e)將(d)的候選混合物、核酸_靶分子復(fù)合物和競(jìng)爭(zhēng)劑分子的混合物保溫預(yù)定時(shí)間；(f)將核酸_靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(g)解離核酸_靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(h)擴(kuò)增游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而鑒別所述靶分子的適配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒別與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸的候選混合物，其中所述候選混合物包含修飾的核酸，其中候選混合物的至少一個(gè)或每個(gè)核酸的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸-靶分子復(fù)合物；(c)將具有增加的親和性的核酸與剩余的候選混合物分開；及(d)擴(kuò)增具有增加的親和性的核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而可以鑒別所述靶分子的適配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括制備或合成適配體，所述適配體包括通過如下方法鑒別的核酸序列(a)制備核酸的候選混合物，其中所述候選混合物包含修飾的核酸，其中候選混合物的至少一個(gè)或每個(gè)核酸的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸-靶分子復(fù)合物；(c)將具有增加的親和性的核酸與剩余的候選混合物分開；及(d)擴(kuò)增具有增加的親和性的核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而鑒別所述靶分子的適配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適配體與其靶的非共價(jià)復(fù)合物，其中所示適配體與其靶的解離速率(t1/2)選自如下之一大于或等于大約30分鐘、在大約30分鐘至大約240分鐘之間、在大約30分鐘至大約60分鐘之間、在大約60分鐘至大約90分鐘之間、在大約90分鐘至大約120分鐘之間、在大約120分鐘至大約150分鐘之間、在大約150分鐘至大約180分鐘之間、在大約180分鐘至大約210分鐘之間、大約210分鐘至大約240分鐘之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適配體與靶的非共價(jià)復(fù)合物，其中所述適配體與靶的Kd為大約lOOnM或更低，其中適配體與靶的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘，且其中適配體的核酸序列中的一個(gè)、若干個(gè)或所有嘧啶在堿基5-位置被修飾。所述修飾可選自圖14所示化合物的基團(tuán)，這些修飾被稱作“堿基修飾的核苷酸”。可以設(shè)計(jì)適配體具有希望的堿基修飾的嘧啶的任意組合。使用修飾的核苷酸包括含有光反應(yīng)性基團(tuán)的核苷酸或者含有光活性基團(tuán)占位物(placeholder)的核苷酸進(jìn)行SELEX的改良的方法在發(fā)明名稱為“ImprovedSELEXandPH0T0SELEX”的美國(guó)申請(qǐng)系列No.12/175，388中揭示，其與本申請(qǐng)同時(shí)申請(qǐng)，且以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子候選混合物包括含有可有助于具有相對(duì)較慢解離速率的修飾的核酸_靶復(fù)合物形成的修飾的核苷酸堿基的核酸。本文描述的各種方法和各個(gè)步驟可用于產(chǎn)生能(1)結(jié)合靶分子或者(2)結(jié)合靶分子及隨后在照射時(shí)與靶分子形成共價(jià)鍵的適配體。根據(jù)本文所述方法鑒別的適配體可用于診斷和治療方法中。慢解離速率適配體將長(zhǎng)期結(jié)合靶。這在適配體與靶的結(jié)合可用于檢測(cè)靶分子的存在、不存在、量或數(shù)量以及適配體與靶的延長(zhǎng)的相互作用促進(jìn)這種檢測(cè)的診斷方法中有用。在慢解離速率適配體用于體外或體內(nèi)成像方法的情況中提供相似優(yōu)點(diǎn)。適配體與靶延長(zhǎng)的相互作用也提供改良的治療方法，其例如由于靶分子或者下游信號(hào)級(jí)聯(lián)的較長(zhǎng)時(shí)間活化或抑制，延長(zhǎng)的相互作用可以改良治療效果。因此在多個(gè)實(shí)施方案中，通過本文所述方法獲得、鑒別或產(chǎn)生的慢解離速率適配體可用于多種醫(yī)學(xué)治療或者診斷方法(體外或體內(nèi))中。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用于疾病治療方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用于疾病的體內(nèi)診斷方法中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用于疾病的體外診斷方法中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可用于生產(chǎn)用于疾病的治療或診斷方法中的治療劑(如藥物組合物)或者診斷劑。慢解離速率適配體的診斷或者治療應(yīng)用可包括依賴于慢解離速率適配體與其靶的特異性和/或高親和性結(jié)合的診斷或者治療結(jié)果。慢解離速率適配體也可用于藥物開發(fā)過程中的靶確認(rèn)和高通量篩選測(cè)定中。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體是體內(nèi)分子成像的合適試劑。在這個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率適配體可在體內(nèi)用于檢測(cè)個(gè)體(如人或動(dòng)物)機(jī)體內(nèi)病理學(xué)、疾病過程或者其它病癥的存在，其中適配體與其靶的結(jié)合表示疾病過程或其它病癥的存在。例如，VEGF受體的適配體可以在體內(nèi)用于檢測(cè)個(gè)體機(jī)體特定區(qū)域(例如組織、器官等)內(nèi)癌癥的存在，因?yàn)閂EGF受體在腫瘤及其新血管內(nèi)高豐度表達(dá)；或者EGF受體的適配體可以在體內(nèi)用于檢測(cè)個(gè)體機(jī)體特定區(qū)域(例如組織、器官等)內(nèi)癌癥的存在，因?yàn)镋GF受體在腫瘤細(xì)胞上通常高水平表達(dá)。即分子靶是誘導(dǎo)的受體的胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)，因?yàn)檫@些靶位于細(xì)胞的外部且可通過血管接近。此外，EOT趨于位于病變部位，即使小部分特異性EOT級(jí)分可以通過生物學(xué)過程包括細(xì)胞死亡而脫落(shed)。分子成像的顯而易見的候選物，高親和性單克隆抗體，未成為選擇用于這項(xiàng)應(yīng)用的試劑。分子成像試劑具有精確的要求。它們與人或動(dòng)物體內(nèi)其指定靶必須具有高結(jié)合親和性，而對(duì)于其它靶具有低結(jié)合活性。慢解離速率適配體具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其可用于體內(nèi)分子成像。一方面，選擇具有慢解離速率常數(shù)的適配體，因此可以在體內(nèi)指定靶上停留足夠時(shí)間(至少大約30分鐘)。另一方面，期望慢解離速率適配體具有從血管中極快的清除率。慢解離速率常數(shù)和從血管中的快清除率是在體內(nèi)分子成像的兩個(gè)希望的性質(zhì)。從動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)看，良好的體內(nèi)分子成像試劑必須定位于病理學(xué)部位，而周圍血管中游離的試劑濃度低。這是信噪限制。合適的信噪比可以通過在血管中過量信號(hào)的病理學(xué)部位積聚信號(hào)而獲得，或者可以通過保持病理學(xué)部位的信號(hào)同時(shí)降低血管濃度而獲得。在動(dòng)物和人體中對(duì)不具有慢解離速率性質(zhì)的與慢解離速率適配體具有大約相同分子量和凈電荷的適配體已經(jīng)研究10年以上。通常發(fā)現(xiàn)這些適配體從血管中快速清除，一般通過進(jìn)入腎和/或肝，然后進(jìn)一步代謝而排泄。除非高分子量加合物(如PEG)與適配體連接，否則這種適配體示出所謂的“首過”清除率。在其靶是生腱蛋白C的適配體內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，生腱蛋白C是在一些腫瘤中高濃度存在的胞外蛋白(不是E⑶)。在這些實(shí)驗(yàn)中，生腱蛋白C-特異性適配體快速清除且能保持在腫瘤部位，因?yàn)樯斓鞍證的胞外局部濃度非常高。相反，慢解離速率適配體保持適配體的快速清除率，但是由于其慢解離速率而提供動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)，使其適用于在感興趣的部位(例如病理學(xué)部位)的存在可能略微稀少的靶(例如腫瘤上的EOT)。分子成像的可選試劑不具有這兩個(gè)慢解離速率適配體性質(zhì)(即慢解離速率和從機(jī)體的快清除率)。單克隆抗體通常具有高親和性和特異性，且可以具有慢解離速率常數(shù)；然而單克隆抗體具有極慢的從血管中的清除率。通過如噬菌體展示方法鑒別的短肽可具有快速清除率，但是與指定的靶的親和性和特異性差且解離速率快。Affibody是抗體模擬物的一種特定的肽形式，可具有合適的親和性和特異性以及具有比單克隆抗體快的清除率，但是為了實(shí)現(xiàn)與其靶的慢解離速率，通常將Affibody制成二聚體和更高級(jí)別的多聚體，減慢其清除率的同時(shí)增強(qiáng)其解離速率。慢解離速率適配體可以與一或多種低分子量加合物一起用于體內(nèi)分子成像，所述加合物保護(hù)慢解離速率適配體免于機(jī)體內(nèi)核酸酶解且檢測(cè)與慢解離速率適配體結(jié)合的指定靶。例如，慢解離速率適配體可以被血液中核酸酶攻擊，典型為核酸外切酶(對(duì)于DNA而言)，其通過在慢解離速率適配體的5'和3'末端位置使用耐核酸外切酶加合物而易于被封閉，或者是核酸內(nèi)切酶(對(duì)于RNA而言)，其通過在慢解離速率適配體中摻入耐核酸內(nèi)切酶嘧啶(如2'氟核苷酸)而易于被封閉。慢解離速率適配體-靶復(fù)合物的檢測(cè)可以通過使檢測(cè)部分附著于慢解離速率適配體而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，為了這些目的的檢測(cè)部分可包含放射性分子(例如锝99)籠(cage)、磁共振檢測(cè)的鐵簇(cluster)、用于PET成像的氟同位素等。應(yīng)設(shè)計(jì)為保護(hù)機(jī)體內(nèi)慢解離速率適配體的完整性且使得能夠檢測(cè)指定靶而對(duì)慢解離速率適配體進(jìn)行的修飾，由此其不干擾慢解離速率適配體與其靶的相互作用且不導(dǎo)致慢解離速率適配體從血管中太緩慢清除。本發(fā)明也提供了診斷或測(cè)定裝置，如柱、測(cè)試條或生物芯片，在該裝置的固體表面上粘附一或多個(gè)慢解離速率適配體?？啥ㄎ凰鲆换蚨鄠€(gè)適配體以能結(jié)合與固體表面接觸的靶分子以形成保持粘附于該裝置表面的適配體-靶復(fù)合物，從而捕獲所述靶且能檢測(cè)及任選量化所述靶。慢解離速率適配體的陣列(其可以相同或不同)可以提供在這種裝置上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括慢解離速率適配體和靶的復(fù)合物。在其它實(shí)施方案中，提供了特征在于與其相應(yīng)靶分子具有高親和性以及與適配體的非共價(jià)復(fù)合物具有慢解離速率(t1/2)的一類適配體。參考圖1A，基本SELEX方法通常從制備不同序列的核酸的候選混合物開始。所述候選混合物通常包括這樣的核酸序列，即所述核酸序列包括兩個(gè)固定區(qū)(即候選混合物的每個(gè)成員在相同位置均含有相同序列)和可變區(qū)。典型地，選擇固定的序列區(qū)，由此其有助于下文所述的擴(kuò)增步驟或者增強(qiáng)候選混合物中核酸的指定結(jié)構(gòu)排列的潛力。可變區(qū)典型提供候選混合物中每個(gè)核酸的靶結(jié)合區(qū)且這個(gè)可變區(qū)可以是完全隨機(jī)的(即在任何位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基的概率是1/4)或者僅是部分隨機(jī)的(例如在任何位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基的概率可以在0-100%之間的任意水平)。將制備的候選混合物與選擇的靶在一定條件下接觸，所述條件是有利于在靶與候選混合物成員之間發(fā)生結(jié)合的條件。在這些條件下，靶與候選混合物的核酸之間的相互作用通常形成核酸-靶對(duì)，其成對(duì)成員之間具有最強(qiáng)的相對(duì)親和性。將對(duì)靶具有最強(qiáng)親和性的核酸與對(duì)靶具有較低親和性的核酸分開。所述分開過程以保留最大數(shù)目的高親和性候選物的方式進(jìn)行。擴(kuò)增在分開期間選擇的對(duì)靶具有相對(duì)高親和性的那些核酸以產(chǎn)生富集對(duì)靶具有相對(duì)高親和性的核酸的新候選混合物。重復(fù)上述分開與擴(kuò)增步驟，新形成的候選混合物含有越來越少的獨(dú)特序列，且核酸混合物與靶的平均親和性程度通常將增加。最終，SELEX方法將產(chǎn)生含有一或極少數(shù)獨(dú)特核酸的候選混合物，獨(dú)特核酸表示來自原始候選混合物的對(duì)靶分子具有最高的親和性的那些核酸。然而，這種基本SELEX方法不選擇對(duì)于與其靶具有慢解離速率的適配體。SELEX專利和光SELEX專利詳細(xì)描述和解釋了這種方法。這些專利包括可用于所述方法中的各種靶、制備初始候選混合物的方法、分開候選混合物中核酸的方法以及擴(kuò)增分開的核酸以產(chǎn)生富集的候選混合物的方法的描述。SELEX專利還描述了針對(duì)許多不同類型靶分子獲得的適配體溶液，所述靶分子包括蛋白質(zhì)靶，其中蛋白質(zhì)是或不是核酸結(jié)合蛋白。參考圖1B，本發(fā)明揭示的修改的SELEX方法包括在核酸候選混合物與一或多個(gè)靶平衡之后導(dǎo)入慢解離速率富集過程以及在SELEX方法的隨后步驟之前導(dǎo)入分開步驟。在基本SELEX方法中導(dǎo)入慢解離速率富集過程提供了富集與包括多種解離速率的一組核酸_靶復(fù)合物具有慢解離速率的適配體親和性復(fù)合物的方式。因此修改的SELEX方法提供了鑒別結(jié)合靶分子且一旦結(jié)合即與靶分子具有相對(duì)慢解離速率的適配體的方法。如本文所用，“結(jié)合”一般是指配體與靶之間形成非共價(jià)締合，這種締合非必須是可逆的。術(shù)語“核酸-靶復(fù)合物”或者“復(fù)合物”或者“親和性復(fù)合物”用于指這種非共價(jià)結(jié)合締合的產(chǎn)物。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述慢解離速率適配體可以是單鏈或雙鏈RNA或DNA寡核苷酸。所述適配體可含有非標(biāo)準(zhǔn)或修飾堿基。進(jìn)一步地，所述適配體可含有任何類型修飾。如本文所用，“修飾堿基”可包括對(duì)天然核酸殘基的相對(duì)簡(jiǎn)單的修飾，這種修飾賦予核酸殘基的物理性質(zhì)改變。這種修飾包括但不限于嘧啶5-位置修飾，用疏水性基團(tuán)如芐基、異丁基、吲哚或者萘基取代，或者用親水性基團(tuán)如季胺或胍基取代，或者用更“中性”基團(tuán)如咪唑等取代。額外的修飾可存在于核糖環(huán)例如2'-位置如2'-氨基(2'-NH2)和2'-氟(2'-F)或者位于磷酸二酯主鏈例如硫代酸磷酸酯或者甲基膦酸酯。在多個(gè)實(shí)施方案中，將一組隨機(jī)化的含有修飾的核苷酸堿基的核酸序列的候選混合物與一些靶分子混合，使得與靶分子建立結(jié)合平衡。通常僅一些與靶分子高親和性結(jié)合的那些核酸將與靶有效的分開。在多個(gè)實(shí)施方案中，候選混合物包括具有可變區(qū)的核酸序列，所述可變區(qū)包括修飾的基團(tuán)。所述修飾的基團(tuán)可以是修飾的核苷酸殘基。所述可變區(qū)可含有完全或部分隨機(jī)序列；其也可以含有摻入可變區(qū)內(nèi)的固定序列的一部分。固定區(qū)內(nèi)的核苷酸也可以含有修飾的核苷酸堿基，或者其可以含有一組標(biāo)準(zhǔn)的天然發(fā)生的堿基。在一些實(shí)施方案中，在分開檢測(cè)混合物的成員后且其是被擴(kuò)增的核酸之后進(jìn)行擴(kuò)增。例如可以通過一系列三個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增RNA分子產(chǎn)生選擇的RNA的cDNA拷貝，使用聚合酶鏈反應(yīng)增加每個(gè)cDNA的拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)錄所述cDNA拷貝以獲得具有與選擇的RNA相同序列的RNA分子?？梢赃m當(dāng)?shù)厥褂帽绢I(lǐng)域已知的任何反應(yīng)或者反應(yīng)組合，包括直接DNA復(fù)制、直接RNA擴(kuò)增等，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。擴(kuò)增方法可使得擴(kuò)增的混合物的比例代表擴(kuò)增前混合物中不同序列的比例。已知許多核酸修飾與酶擴(kuò)增相容。如果需要，在每次擴(kuò)增循環(huán)后可以產(chǎn)生與擴(kuò)增不相容的修飾?？梢酝ㄟ^各種方式對(duì)候選核酸混合物進(jìn)行修飾以增加核酸具有促進(jìn)性質(zhì)或者其它希望性質(zhì)的可能性，特別是具有增強(qiáng)核酸與靶之間相互作用的那些性質(zhì)。預(yù)期的修飾包括導(dǎo)入具有適當(dāng)電荷、極性、氫鍵或者靜電作用的其它化學(xué)基團(tuán)的修飾以增強(qiáng)希望的配體_靶相互作用?？稍鰪?qiáng)核酸的結(jié)合性質(zhì)包括親和性和/或解離速率的修飾例如包括親水性部分、疏水性部分、剛性結(jié)構(gòu)、在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的官能團(tuán)如咪唑、伯醇、羧酸酯、胍基、氨基、硫代等。修飾也可以用于增加適配體-靶復(fù)合物在可用于產(chǎn)生更廣范圍靶的慢解離速率適配體的嚴(yán)格選擇壓力下的存活。在一個(gè)實(shí)施方案中，Bz-dU(芐基-dU)用于產(chǎn)生用于產(chǎn)生慢解離速率適配體的候選混合物，其它修飾的核苷酸也非常適用于產(chǎn)生這種適配體。其它修飾的核苷酸在圖14中示出。為此使用目的修飾的核苷酸候選混合物是包括天然發(fā)生及非天然發(fā)生的核苷酸的任何RNA或DNA候選混合物。合適的修飾包含對(duì)核酸的每一殘基、對(duì)核酸的一個(gè)殘基、對(duì)隨機(jī)殘基、對(duì)所有嘧啶或者所有嘌呤、對(duì)核酸中所有出現(xiàn)的特異堿基(即G、C、A、T或U)的修飾，或者可適于特定應(yīng)用的任何其它修飾方案。技術(shù)人員意識(shí)到修飾不是促進(jìn)適配體的活性或者結(jié)合能力的必要條件。適配體可包括修飾的dUTP和dCTP殘基。慢解離速率適配體的候選混合物可包含在5-堿基位置具有不同修飾的一組嘧啶。C-5修飾可以通過酰胺鍵直接或者間接、通過另一類型鍵導(dǎo)入。這些候選混合物用于SELEX方法中以鑒別慢解離速率適配體。這種方法也可包括使用慢解離速率富集過程。候選混合物可以通過酶促或者合成產(chǎn)生。如上所述，可以通過多種方式修飾核苷酸，包括修飾核糖和/或磷酸酯和/或堿基位置。某些修飾在發(fā)明名稱為“HighAffinityNucleicAcidLigandsContainingModifiedNucleotides”的美國(guó)專利No.5，660，985、發(fā)明名稱為“MethodforPalladiumCatalyzedCarbon-CarbonCouplingandProduct”的美國(guó)專利No.5，428，149、發(fā)明名禾爾為“PurineNucleosideModificationsbyPalladiumCatalyzedMethods"的美國(guó)專利No.5，580，972中描述，所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾是其中另一化學(xué)基團(tuán)附著于嘧啶的5-位置、嘌呤的8-位置或者糖的2'位置的那些修飾。對(duì)于可摻入各個(gè)核苷酸上的其它化學(xué)基團(tuán)的類型無限制。在一些實(shí)施方案中，所得修飾的核苷酸是可擴(kuò)增的或者在擴(kuò)增步驟之后可以被修飾(見例如發(fā)明名稱為"Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:Chemi_SELEX，，白勺美國(guó)專利No.6，300，074所述)。在其它實(shí)施方案中，某些核苷酸被修飾，由此產(chǎn)生結(jié)合其靶分子且在光激活親和性復(fù)合物時(shí)與其靶分子形成共價(jià)交聯(lián)的適配體的方法。這種方法包含結(jié)合、光交聯(lián)和/或光失活靶分子的適配體。在多個(gè)實(shí)施方案中，適配體含有在用光照射時(shí)能與靶分子光交聯(lián)的光反應(yīng)性基團(tuán)。在其它實(shí)施方案中，適配體能與靶在無照射的條件下形成鍵。光反應(yīng)性基團(tuán)可以是含有光生色團(tuán)且能與靶分子光交聯(lián)的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。盡管在本文稱作光反應(yīng)性基團(tuán)，但是如下文所述在一些情況中照射對(duì)于在適配體與靶之間發(fā)生共價(jià)結(jié)合不是必需的。在一些實(shí)施方案中，光反應(yīng)性基團(tuán)將吸收不被靶或者寡核苷酸的未修飾部分吸收的波長(zhǎng)的光。光反應(yīng)性基團(tuán)包含5-鹵代-尿苷、5-鹵代-胞嘧啶、7-鹵代-腺苷、2-硝基-5-疊氮苯甲酰、diazirine、芳基疊氮化物、氟化芳基疊氮化物、苯甲酮、氨基二苯(甲)酮、補(bǔ)骨脂素、蒽醌等。在照射締合的核酸_靶對(duì)時(shí)，光反應(yīng)性基團(tuán)與靶通常形成鍵。在一些情況中，照射對(duì)于鍵形成不是必需的。典型發(fā)生的光交聯(lián)是締合的適配體與靶之間的共價(jià)鍵形成。然而，在照射時(shí)也可以發(fā)生適配體與靶之間的緊密離子相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于暴露于電磁照射而發(fā)生光交聯(lián)。電磁照射包括紫外光、可見光、X-射線和、射線。在各種其它實(shí)施方案中，使用SELEX方法限制性選擇寡核苷酸，隨后使用光SELEX方法選擇。初始的SELEX選擇循環(huán)使用含有光反應(yīng)性基團(tuán)的寡核苷酸進(jìn)行。在多次SELEX循環(huán)后，進(jìn)行光SELEX以選擇能結(jié)合靶分子的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了在適配體序列中包括可裂解或可釋放部分(也稱作元件或成分)的適配體的產(chǎn)生。這些額外的成分或元件是結(jié)構(gòu)元件或成分，其在適配體中導(dǎo)入額外的功能性且因此是功能性元件或成分。進(jìn)一步產(chǎn)生的適配體具有一或多個(gè)如下額外成分(也稱作功能或結(jié)構(gòu)元件或成分或部分或這些術(shù)語的組合)標(biāo)記的或可檢測(cè)的成分，間隔序列成分以及特異性結(jié)合標(biāo)簽或者固定元件或成分。如上所述，本發(fā)明提供了鑒別適配體的方法，所述適配體結(jié)合靶分子且一旦結(jié)合則具有慢解離速率。使用這種方法獲得的慢解離速率可具有超過大約1小時(shí)的半衰期，以及多如大約240分鐘，即一旦產(chǎn)生一組核酸-靶復(fù)合物，該組中一半的復(fù)合物在1小時(shí)后仍保持結(jié)合。由于慢解離速率富集過程的作用依賴于適配體親和性復(fù)合物的不同解離速率，因此選擇慢解離速率富集過程的持續(xù)時(shí)間以保持高比例的具有慢解離速率的適配體親和性復(fù)合物，同時(shí)明顯降低具有快解離速率的適配體親和性復(fù)合物的數(shù)目。例如在實(shí)施慢解離速率富集過程之后將所述混合物保溫相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間，與使用較短保溫時(shí)間的慢解離速率富集過程選擇的適配體相比可選擇具有較長(zhǎng)解離速率的適配體。在多個(gè)實(shí)施方案中，將候選混合物與一些靶分子混合，使得與靶分子建立結(jié)合平衡。在將靶結(jié)合的核酸與從溶液中那些游離的分開之前，實(shí)施慢解離速率富集過程以富集慢解離速率的結(jié)合的群。如上所述，慢解離速率富集過程可以通過加入競(jìng)爭(zhēng)劑分子、通過樣品稀釋、通過在存在競(jìng)爭(zhēng)劑分子的條件下組合樣品稀釋進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程通過在含有核酸_靶復(fù)合物的混合物中導(dǎo)入競(jìng)爭(zhēng)劑分子及將該混合物保溫一段時(shí)間之后將游離的與結(jié)合的核酸分開進(jìn)行。競(jìng)爭(zhēng)劑分子的量通常為高于所述核酸分子的量至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，可以高于兩或更多個(gè)數(shù)量級(jí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，慢解離速率富集過程通過將核酸_靶復(fù)合物的樣品混合物的體積稀釋幾倍(如至少大約2x、3x、4x、5x之一)及將該混合物保溫一段時(shí)間之后將游離的與結(jié)合的核酸分開進(jìn)行。稀釋體積通常為高于原始體積至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，且可以是高于大約兩或更多個(gè)數(shù)量級(jí)。在另一實(shí)施方案中，競(jìng)爭(zhēng)劑分子與稀釋二者的組合用于實(shí)施慢解離速率富集過程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)示出使得慢解離速率適配體的頻率增加的候選混合物用于選擇許多候選適配體。篩選這些適配體以鑒別慢解離速率適配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生了在適配體的固定區(qū)中包括可裂解或可釋放部分的慢解離速率適配體。也可以產(chǎn)生具有一或多個(gè)如下額外成分的適配體標(biāo)記的成分、間隔序列成分以及特異性結(jié)合標(biāo)簽。任何或所有這些元件均可以被導(dǎo)入單鏈適配體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述元件被導(dǎo)入在適配體的5'末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過產(chǎn)生部分雙鏈適配體以包括一或多個(gè)這些元件，其中一條鏈含有希望的不同元件以及與含有可變靶結(jié)合區(qū)的第二條鏈的固定序列部分之一互補(bǔ)的序列。“可釋放”或“可裂解”元件或部分或成分是指其中官能團(tuán)中的某些鍵可以被破壞以產(chǎn)生2個(gè)單獨(dú)成分的官能團(tuán)。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)可以通過以適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射該官能團(tuán)(光可裂解的)而被裂解或者通過用合適的化學(xué)或酶試劑處理而裂解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可釋放元件可以是二硫鍵，可以用還原劑處理破壞該鍵?？舍尫旁垢街诠腆w支持物的適配體/靶親和性復(fù)合物與固體支持物分離，如通過洗脫復(fù)合物而分離?？舍尫旁梢栽谑Ｓ鄿y(cè)定條件下保持穩(wěn)定且在不破壞適配體/靶復(fù)合物的條件下可以是可釋放的。如本文所述，適配體可進(jìn)一步包含“標(biāo)簽”或“固定成分或元件”或者“特異性結(jié)合成分或元件”，其是指使適配體(以及與其結(jié)合的任何靶分子)附著或固定于固體支持物的成分?！皹?biāo)簽”是能締合探針的一種類型或種類的成分的一組拷貝?！岸鄠€(gè)標(biāo)簽”是指一組以上這種成分?？梢酝ㄟ^任何合適方法將標(biāo)簽附著于或者包括在適配體內(nèi)。通常，標(biāo)簽使適配體直接或者間接締合附著于固體支持物的探針或受體。所述探針可以與所述標(biāo)簽高特異性相互作用且在所有隨后的加工步驟或程序期間保持這種締合。所述標(biāo)簽可以使適配體親和性復(fù)合物(或者任選共價(jià)適配體親和性復(fù)合物)定位于固體支持物上空間指定地址。因此，不同標(biāo)簽可以使不同適配體共價(jià)復(fù)合物定位于固體支持物上不同的空間指定地址。標(biāo)簽可以是多核苷酸、多肽、肽核酸、鎖定核酸、寡糖、多糖、抗體、affybody、抗體模擬物、細(xì)胞受體、配體、脂質(zhì)、生物素、這些結(jié)構(gòu)的任何片段或衍生物，前述結(jié)構(gòu)的任意組合，或者用其可以設(shè)計(jì)或構(gòu)型探針(或者接頭分子，如下文所述)以特異性結(jié)合或另外締合的任何其它結(jié)構(gòu)。通常標(biāo)簽被構(gòu)型為與其自身或者與其附著的適配體或者其一部分不發(fā)生分子內(nèi)相互作用。如果使用SELEX鑒別適配體，則該標(biāo)簽可以在SELEX之前或之后加入適配體。所述標(biāo)簽包括在SELEX之后適配體的5'-末端，或者該標(biāo)簽包括在SELEX之后適配體的3'-末端，或者該標(biāo)簽可以包括在SELEX方法之后適配體的3'和5'兩個(gè)末端。如圖8D所示，熒光染料(如Cy3)、光可裂解及生物素部分全部加入適配體的末端。由于光可裂解部分與染料之間的潛在相互作用，在這兩個(gè)部分之間插入間隔序列。所有構(gòu)建體均可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法合成。代表性適配體構(gòu)建體在圖9A-圖9F示出。所述功能性可以在5'和3'末端之間分開或者在任一端組合。除了光可裂解部分之夕卜，可以使用其它可裂解部分，包括化學(xué)或酶促可裂解部分?？梢允褂迷S多間隔序列部分，且可包含一或多個(gè)生物素部分。也可以摻入除了生物素之外的標(biāo)簽(也稱作固定或特異性結(jié)合元件或成分)。合適的構(gòu)建試劑包括生物素亞磷酰胺、PC接頭(GlenResearchPN10-4920-02)、PC生物素亞磷酰胺(GlenResearchPN10-4950-02)、dSpacerCE亞磷酰胺(GlenResearchPN10-1914-02)、Cy3亞磷酰胺(GlenResearchPN10-5913-02)以及Arm26-AchSpacerAmidite(FidelitySystemsPNSP26Ach_05)。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸的堿基修飾用于產(chǎn)生適配體的可變區(qū)。這些修飾的核苷酸已經(jīng)示出產(chǎn)生與其靶具有極慢解離速率的適配體。在本發(fā)明的方法中，候選混合物可包含修飾的核酸，候選混合物中至少一個(gè)或者每個(gè)核酸中的一個(gè)、若干個(gè)(如一個(gè)或者至少1個(gè)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè))或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾。任選地，候選混合物的核酸中所有C殘基在5-位置均被化學(xué)修飾。任選地，候選混合物的核酸中所有T殘基在5-位置均被化學(xué)修飾。任選地，候選混合物的核酸中所有U殘基在5-位置均被化學(xué)修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將慢解離速率適配體與樣品混合或暴露于樣品。使慢解離速率適配體與樣品中其特異性靶反應(yīng)或結(jié)合以形成復(fù)合物。許多方法可用于檢測(cè)靶或適配體。所述靶可以在復(fù)合物中或者在從復(fù)合物中釋出時(shí)被檢測(cè)。所述適配體可以在復(fù)合物中或者在從復(fù)合物中釋出時(shí)被檢測(cè)。適配體/靶復(fù)合物可用于將特異性靶與檢測(cè)樣品中其它成分分離。當(dāng)希望用多元測(cè)定法檢測(cè)多個(gè)靶時(shí)可以使用多個(gè)適配體。本發(fā)明的方法在實(shí)施例1-7中舉例說明。本發(fā)明的方法在實(shí)施例1-6中一般舉例說明。實(shí)施例1描述了使用包含修飾的核苷酸的候選混合物的一般親和性SELEX方法。實(shí)施例2描述了使用包含修飾的核苷酸和5'-末端光反應(yīng)性基團(tuán)的候選混合物的光SELEX方法，以及其中使用稀釋為平衡的適配體靶混合物提供慢解離速率富集過程的改良的SELEX方法。實(shí)施例3通過在稀釋步驟中加入競(jìng)爭(zhēng)劑擴(kuò)展了實(shí)施例2所述的方法。實(shí)施例4例證了慢解離速率富集過程的效力。使用修飾核苷酸5-芐基-dUTP(BzdUTP)、5-異丁基-dUTP(iBdUTP)或5-色氨基(tryptaminocarboxyamide)-dUTP在不存在慢解離速率富集過程的條件下選擇的適配體的平均解離半衰期值(t1/2)為20分鐘，一些適配體的t1/2值直至1小時(shí)。這明顯長(zhǎng)于先前使用天然堿基或者其它修飾的核苷酸描述的。使用慢解離速率富集過程選擇的適配體的平均值超過85分鐘。更特別地，參考圖3B，可以看出導(dǎo)入慢解離速率富集過程產(chǎn)生t1/2值為大約>30分鐘、>60分鐘、>90分鐘、>120分鐘、>150分鐘、>180分鐘、彡210和>240分鐘的適配體。這些適配體靶復(fù)合物的解離速率是史無前例的。實(shí)施例5描述了使用NpdUTP候選混合物產(chǎn)生慢解離速率適配體。實(shí)施例6描述了肽靶的慢解離速率適配體的產(chǎn)生。實(shí)施例提供下述實(shí)施例僅為例證目的，不是試圖限制所附權(quán)利要求中的本發(fā)明的范圍。_仿丨丨1.在核iff庫(kù)中摻入修飾的核苷_導(dǎo)致在親禾nt牛SELEX高親禾Pt牛富集的文庫(kù)A.制備候選混合物候選混合物用dATP，dGTP，5-甲基-dCTP(MedCTP)及dTTP或三種dUTP類似物5-芐基-dUTP(BzdUTP)、5-異丁基-dUTP(iBdUTP)或5-色氨基-dUTP(TrpdUTP)之一制備。候選混合物通過聚合酶延伸與生物素化模板退火的引物而制備(圖2)。對(duì)于每種候選混合物組合物，將4.81111101正向？0引物和41111101模板組合在10(^1^IXKODDNA聚合酶緩沖液(Novagen)中，加熱至95°C8分鐘，在冰上冷卻。將每種IOOyL引物模板混合物加入到400μL延伸反應(yīng)中，延伸反應(yīng)含有IXKODDNA聚合酶緩沖液、0.125U/yLKODDNA聚合酶和0.5mM每種dATP、MedCTP、dGTP及dTTP或dUTP類似物，并70°C保溫30分鐘。通過加入ImL鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(MagnaBindStreptavidin,Pierce,5mg/mL于IMNaCl+0.05%TWEEN-20中)并在25°C混合保溫10分鐘而經(jīng)模板鏈生物素捕獲雙鏈產(chǎn)物。珠用0.75mLSBlT緩沖液(40mMHEPES，pH7.5，125mMNaCl，5mMKCl，ImMMgCl2,ImMCaCl2,0.05%TWEEN-20)洗3次。適配體鏈用1.2mL20mMNa0H從珠洗脫，用0.3mL80mMHCl中和，及用15μLIMHEPES，pH7.5緩沖。候選混合物用Centricon-30濃縮至大約0.2mL，用UV吸收光譜定量。B.靶蛋白的固定購(gòu)買靶蛋白，其具有聚His標(biāo)簽，如(His)6標(biāo)簽(R&DSystems)并固定在Co+2_NTA順磁性珠(TALON，Invitrogen)上。靶蛋白在0.5mLB/W緩沖液(50mM磷酸鈉，pH8.0,300mMNaCl，0.01%TWEEN-20)中稀釋至0.2mg/mL,并加入到0.5mLTALON珠(預(yù)先用B/W緩沖液洗3次并在B/W緩沖液中重懸至10mg/mL)?；旌衔镌?5°C旋轉(zhuǎn)30分鐘，在4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。還制備了用(His)fJi包被的TALON珠并如上所述儲(chǔ)存。使用前，珠用B/W緩沖液洗3次，用SBlT洗1次，重懸于SBlT中。C.適配體選擇方案用每種候選混合物單獨(dú)進(jìn)行親和性選擇，比較靶蛋白珠(信號(hào)，S)和(His)6珠(背景，B)之間的結(jié)合。對(duì)于每種樣品，在40yLSBlT中制備0.5μM候選DNA混合物。將IyL(His)6-互補(bǔ)寡聚物(ImM)(圖2)與10μL蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)劑混合物(0.1%HSAaOyM酪蛋白和10μM凝血酶原于SBlT中)一起加入到DNA。結(jié)合反應(yīng)通過將50μL靶蛋白包被的珠或(His)6包被的珠(5mg/mL于SBlT中)加入DNA混合物并在37°C混合保溫15分鐘而進(jìn)行。除去DNA溶液，珠用含有0.lmg/mL鯡精DNA(Sigma-Aldrich)的SBlT在37°C洗5次。除非說明，所有洗滌均通過將珠重懸于100μL洗滌溶液，混合30秒，用磁鐵分離珠及除去洗滌溶液而進(jìn)行。結(jié)合的適配體通過加入IOOyLSB1T+2M胍-HCl并在37°C混合保溫5分鐘而從珠洗脫。適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移到新管中。在前二次選擇循環(huán)后，5次靶珠洗滌的最后兩次進(jìn)行5分鐘而非30秒。引物珠通過將生物素化反向PCR引物固定于鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁性珠(MyOne-SA，Invitrogen)而制備。將5mLMyOne-SA珠(10mg/mL)用NaClT(5MNaCl,0.01%TWEEN-20)洗1次，并重懸于5mL生物素化反向PCR引物(5μM于NaClT中)中。樣品在25°C保溫15分鐘，用5mLNaClT洗2次，重懸于12.5mLNaClT中(4mg/mL)，儲(chǔ)存在4°C。將25μL引物珠(4mg/mL于NaClT中)加入到100μL在胍緩沖液中的適配體溶液中并在50°C混合保溫15分鐘。除去適配體溶液，珠用SBlT洗5次。通過加入85μL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘從珠洗脫適配體。80μL適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移到新管中，用20μL80mMHCl中禾口，用1μL0.5ΜTris-HCl,ρΗ7·5緩沖。D.適配體擴(kuò)增及純化經(jīng)QPCR擴(kuò)增和量化選擇的適配體DNA。將48μLDNA加入到12μLQPCRMix(5XKODDNA聚合酶緩沖液，25mMMgCl2,10μM正向PCR引物，10μM生物素化反向PCR引物，5ΧSYBRGreen1,0.125U/yLKODDNA聚合酶，和ImM每種dATP，dCTP,dGTP和dTTP)并在ABI5700QPCR儀器中經(jīng)下述方案熱循環(huán)1個(gè)循環(huán)的99.9°C>15秒，55°C、10秒，70°C、30分鐘；30個(gè)循環(huán)的99.9°C、15秒，72°C、1分鐘。定量用儀器軟件進(jìn)行，比較用靶珠和(His)6珠選擇的DNA的拷貝數(shù)以確定信號(hào)/背景比。擴(kuò)增后，經(jīng)生物素化反義鏈將PCR產(chǎn)物捕獲在MyOne-SA珠上。將1.25mLMyOne-SA珠(10mg/mL)用0.5mL20mMNaOH洗2次，用0.5mLSBlT洗1次，重懸于2.5mL3MNaCl中并儲(chǔ)存在4°C。將25μLMyOne-SA珠(4mg/mL于3MNaCl中)加入到50μL雙鏈Q(jìng)PCR產(chǎn)物中并在25°C混合保溫5分鐘。珠用SBlT洗1次，通過加入200μL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘將“有義”鏈從珠中洗脫。洗脫的鏈棄去，珠用SBlT洗3次，用16mMNaCl洗1次。適配體有義鏈通過用合適的核苷酸組合物經(jīng)從固定的反義鏈的引物延伸而制備。珠重懸于20μL引物延伸反應(yīng)混合物中(IXKODDNA聚合酶緩沖液，1.5mMMgCl2，5yM正向PCR引物，0.125U/μLKODDNA聚合酶，0.5mM每種dATP，MedCTP，dGTP及dTTP或dUTP類似物)并在68°C混合保溫30分鐘。珠用SBlT洗3次，通過加入85μL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘將適配體鏈從珠洗脫。80μL適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移到新管中，用20μL80mMHCl中禾口，用5μL0.IMHEPES,ρΗ7·5緩沖。Ε.選擇嚴(yán)格性及反饋選擇步驟的相對(duì)靶蛋白濃度應(yīng)答如下S/B比率在每輪循環(huán)中降低，其中信號(hào)S和背景B在上述章節(jié)C中定義如果S/B<10，[P](i+1)=[P]i如果10≤S/B<100，[P](i+Ι)=[P]i/3.2如果S/B≤100，[P](i+1)=[P]i/10其中[P]=蛋白質(zhì)濃度，i=當(dāng)前循環(huán)數(shù)通過調(diào)整加入到選擇步驟的靶蛋白珠(及用于背景確定的(His)6珠)的質(zhì)量降低靶蛋白濃度。在每輪選擇后，確定富集的DNA混合物的趨同狀態(tài)。用含有IXSYBRGreenI的4mMMgCl2將5μL雙鏈Q(jìng)PCR產(chǎn)物稀釋至200μL。樣品用75μL硅油覆蓋并用Qt分析分析趨同，該分析測(cè)量雙鏈寡核苷酸的復(fù)雜混合物的雜交時(shí)間。樣品用如下方案熱循環(huán)3個(gè)循環(huán)的98°C、1分鐘，85°C、1分鐘；1個(gè)循環(huán)的93°C、1分鐘，85°C、15分鐘。在85°C、15分鐘期間，以5秒間隔測(cè)量熒光成像。熒光強(qiáng)度作為log(時(shí)間)的函數(shù)繪圖以評(píng)估序列多樣性。F.測(cè)量平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)富集文庫(kù)的平衡結(jié)合常數(shù)用TALON珠分開(partitioning)測(cè)量。通過加熱至95°C并緩慢冷卻至37°C復(fù)性DNA。通過在SBl緩沖液(如前所述)中混合低濃度的放射性標(biāo)記的DNA(IXl(T11M)與一系列濃度范圍的靶蛋白(1XICT7M至1XICT12M最終)并在37°C保溫形成復(fù)合物。將每個(gè)反應(yīng)的一部分轉(zhuǎn)移至尼龍膜并干燥以確定每個(gè)反應(yīng)中的總計(jì)數(shù)。將少量5mg/mLMyOneTALON珠(Invitrogen)加入到余下的每個(gè)反應(yīng)中并在37°C混合1分鐘。將一部分在真空下通過MultiScreenHVPlate(Millipore)以從未結(jié)合的DNA中分離蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物并用IOOyLSBl緩沖液洗滌。尼龍膜和MultiScreenHVPlates磷光成像(phosphorimaged)，每個(gè)樣品中放射性的量用FUJIFLA-3000定量。捕獲的DNA的級(jí)分作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)作圖，用非線性曲線擬合算法從數(shù)據(jù)中提取平衡結(jié)合常數(shù)(Kd值)。表1示出每種富集的候選混合物對(duì)一組靶確定的Kd值。NT表示針對(duì)特定堿基組成富集的文庫(kù)看起來未從原始候選混合物中改變，如Qt分析(前述)所確定的，并因此未測(cè)試(NT)。表1示出富集的集合對(duì)15種不同蛋白質(zhì)靶和4個(gè)不同DNA文庫(kù)的平衡結(jié)合常數(shù)天然發(fā)生的堿基(dT)，芐基(BzdU)，異丁基(iBdU)或色氨酸(TrpdU)。具有小于1X10_8的Kd的適配體是希望的。修飾的堿基在SELEX方法中的應(yīng)用產(chǎn)生了顯著更高百分比的希望的高親和性適配體。觀測(cè)到用正常核苷酸產(chǎn)生的14個(gè)適配體中僅2個(gè)具有希望的慢解離速率。對(duì)于BzdUTP、iBdUTP和TRPdUTP分別鑒別了14個(gè)中的9個(gè)、14個(gè)中的7個(gè)及14個(gè)中的14個(gè)用修飾的核苷酸產(chǎn)生的慢解離速率適配體。表1.用不同的修飾核苷酸選擇的富集的文庫(kù)的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)，以體積摩爾濃度報(bào)道。NT=未測(cè)試<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例2.用5’固定光SELEX和經(jīng)稀釋的慢解離諫率富集過稈產(chǎn)牛光適配體A.候選混合物的制備含有dATP，dCTP，dGTP和BzdUTP的候選混合物通過聚合酶延伸與生物素化模板退火的引物而制備(圖4A-B)。對(duì)于每種模板，使用4種不同的正向引物，每種在5’末端具有獨(dú)特的生色團(tuán)(圖5)。對(duì)于每種候選混合物，將Ilnmol正向引物(具有5’生色團(tuán))和IOnmol模板在250μL引物延伸緩沖液(120mMTris-HCl,pH7.8,IOmMKCl，6mM(NH4)2SO4,7mMMgS04,0.lmg/mLBSA,0.1%TritonX-100)中組合，加熱至95°C5分鐘，在冰上冷卻。將125μL每種引物模板混合物加入到ImL含有引物延伸緩沖液、0.125U/yLKODDNA聚合酶及0.5mM每種dATP，dCTP，dGTP和BzdUTP的延伸反應(yīng)中，在70°C保溫30分鐘。每種ImL反應(yīng)分成4個(gè)250μL等份并在冰上冷卻。通過將ImL鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(MagnaBind-Str印tavidin，Pierce，5mg/mL于IMNaCl+0.05%TWEEN-20中)加入每個(gè)250μL等份中并在25°C混合保溫60分鐘經(jīng)模板鏈生物素捕獲雙鏈產(chǎn)物。珠用0.5mLSB17T緩沖液(40mMHEPES,pH7.5,125mMNaCl,5mMKCl,5mMMgCl2,ImMEDTA，0.05%TWEEN-20)洗3次。適配體鏈用ImL20mMNaOH從珠洗脫，用0.25mL80mMHCl中和，用10μLIMHEPES,ρΗ7.5緩沖。候選混合物用Centricon-30濃縮至大約0.2mL,并用UV吸收光譜定量。B.靶蛋白的制備未標(biāo)簽標(biāo)記的靶蛋白通過共價(jià)偶聯(lián)NHS-PE04-生物素(Pierce)至賴氨酸殘基而生物素化。蛋白質(zhì)(300pmol于50μL中)用S印hadexG-25微離心(microspin)柱交換進(jìn)SB17T中。將NHS-PE04-生物素加入到1.5mM并且反應(yīng)在4°C保溫16小時(shí)。未反應(yīng)的NHS-PE04-生物素用S印hadexG-25微離心柱除去。C.使用慢解離速率富集過程和光交聯(lián)的適配體選擇用每種候選混合物單獨(dú)進(jìn)行選擇，比較具有靶蛋白的樣品(信號(hào)S)及無靶蛋白的樣品(背景B)間的結(jié)合。進(jìn)行前3輪循環(huán)選擇親和性(無光交聯(lián))；第二和第三輪包括慢解離速率富集過程。第四至第八輪包括慢解離速率富集過程及光交聯(lián)二者。對(duì)于每個(gè)樣品，用10_20pmole候選混合物(第一輪中IOOpmole)和IOOpmole反向引物在SB17T中制備90μLDNA混合物。樣品加熱至95°C3分鐘，以0.IC/秒速率冷卻至37°C。樣品與10μL蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)劑混合物(0.HSA，10μM酪蛋白和10μM凝血酶原于SB17T中)組合，加入到0.5mgDynalMyOneStreptavidin珠(預(yù)先用20mMNaOH洗2次，用SB17T洗1次)，在37°C混合保溫5分鐘。經(jīng)磁分離除去珠。通過將10iiL靶蛋白(0.5iiM于SB17T中)或SB17T加入40yLDNA混合物并在37°C保溫30分鐘進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。當(dāng)采用慢解離速率富集過程時(shí)，樣品通過加入950iiLSB17T(預(yù)熱至37°C)稀釋20X，在37°C保溫30分鐘，之后捕獲復(fù)合物。通過加入0.25mgMyOne-SA珠(Invitrogen)并在37°C混合保溫15分鐘經(jīng)蛋白質(zhì)生物素將復(fù)合物捕獲在SA珠上。游離DNA通過用SB17T洗珠5次除去。除非說明，所有洗滌均通過將珠重懸于100uL洗滌溶液，在25°C混合30秒，用磁鐵分離珠及除去洗滌溶液而進(jìn)行。通過加入85iiL20mMNa0H并在37°C混合保溫1分鐘而從珠洗脫適配體鏈。將80yL適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移至新管，用20iiL80mMHC1中和，用lyL0.5MTris-HCl,pH7.5緩沖。當(dāng)采用光選擇時(shí)，50PL結(jié)合反應(yīng)(或者lmL任選的經(jīng)稀釋的慢解離速率富集過程后的結(jié)合反應(yīng))用高壓汞燈從上方照射(OpticalAssociates,Inc.model0131-0003-01，500W,具有310nm鏡裝置(mirrorset))。具有BrdU生色團(tuán)的候選混合物被照射37秒，具有ANA生色團(tuán)的那些被照射60秒，具有AQ或補(bǔ)骨脂素生色團(tuán)的那些被照射10分鐘。對(duì)于ANA、AQ和補(bǔ)骨脂素生色團(tuán)使用額外的濾波器(5mm平板玻璃)以消除320nm以下不需要的但潛在破壞性波長(zhǎng)。如上所述捕獲復(fù)合物，通過用4M胍-HC1+0.05%TWEEN-20在50°C洗滌10分鐘洗滌1次，用20mMNaOH在25°C洗滌2分鐘洗滌1次，用SB17T洗滌2次及用16mMNaCl洗滌1次珠而除去未交聯(lián)的DNA。交聯(lián)的DNA未從珠表面除去，用于擴(kuò)增步驟。D.適配體擴(kuò)增及純化經(jīng)QPCR擴(kuò)增和定量選擇的適配體DNA。將48iiLDNA加入到12uLQPCRMix(5XK0DDNA聚合酶緩沖液，25mMMgCl2，10yM正向PCR引物，10yM生物素化反向PCR引物，5XSYBRGreen1,0.125U/uLK0DDNA聚合酶，和ImM每種dATP，dCTP,dGTP和dTTP)并在Bio-RadMylQQPCR儀器中經(jīng)下述方案熱循環(huán)1個(gè)循環(huán)的99.9°C、15秒，55°C、10秒，68°C、30分鐘；30個(gè)循環(huán)的99.9°C、15秒，72°C、1分鐘。對(duì)于光SELEX循環(huán)，進(jìn)行最初30分鐘保溫。量化用儀器軟件進(jìn)行，比較用靶或未用靶蛋白選擇的DNA的拷貝數(shù)以確定信號(hào)/背景比。當(dāng)采用光選擇時(shí)，選擇的DNA的cDNA拷貝通過在珠表面上的引物延伸制備。洗滌的珠重懸于20iiLcDNA延伸混合物(含有5iiM反向PCR引物、0.5mM每種dATP，dCTP，dGTP及dTTP和0.125U/uLK0DDNA聚合酶的引物延伸緩沖液)并在68°C混合保溫30分鐘。珠用SB17T洗3次，適配體鏈通過加入85iiL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘而從珠洗脫。將80yL適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移至新管，用20yL80mMHC1中和，用1yL0.5MTris-HCl,pH7.5緩沖。cDNA通過如上述30個(gè)循環(huán)的99.9°C、15秒，72°C、1分鐘的QPCR擴(kuò)增和定量。擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)生物素化反義鏈捕獲在My0ne-SA珠上。將1.25mLMy0ne-SA珠(10mg/mL)用0.5mL20mMNaOH洗2次，用0.5mLSB17T洗1次，重懸于1.25mL3MNaCl+0.05%Tween中，并儲(chǔ)存在4°C。將25iiLMy0ne-SA珠(10mg/mL于3MNaCIT中)加入到50yL雙鏈Q(jìng)PCR產(chǎn)物中并在25°C混合保溫5分鐘。珠用SB17T洗1次，“有義”鏈通過加入200uL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘從珠洗脫。棄去洗脫的鏈，珠用SB17T洗3次，用16mMNaCl洗1次。適配體反義鏈用合適的生色團(tuán)經(jīng)從固定的反義鏈的引物延伸而制備。珠重懸于20PL引物延伸反應(yīng)混合物中(IX引物延伸緩沖液，1.5mMMgCl2，5yM具有合適5’生色團(tuán)的正向引物，0.5mM每種dATP，dCTP，dGTP及BzdUTP和0.125U/uLKODDNA聚合酶)并在68°C混合保溫30分鐘。珠用SB17T洗3次，適配體鏈通過加入85yL20mMNaOH并在37°C混合保溫1分鐘而從珠洗脫。將80yL適配體洗脫液在磁分離后轉(zhuǎn)移至新管，用20yL80mMHC1中禾口，用5iiL0.1MHEPES,pH7.5緩沖。E.選擇嚴(yán)格性及反饋靶蛋白在每輪如實(shí)施例1所述調(diào)整。每輪選擇后，富集集合的趨同狀態(tài)如實(shí)施例1所述確定。F.富集文庫(kù)的平衡集合常數(shù)結(jié)合親和性如實(shí)施例1所述確定，但是使用MyOne-SA捕獲珠。下表2總結(jié)了用具有慢解離速率富集過程的光SELEX方案獲得的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表2.用不同生色團(tuán)選擇的富集文庫(kù)的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)，以體積摩爾濃度報(bào)道。在未趨同的文庫(kù)上未進(jìn)行測(cè)量(用x標(biāo)記)。G.交聯(lián)活性測(cè)定富集文庫(kù)的交聯(lián)率經(jīng)測(cè)量在飽和蛋白質(zhì)和光條件下交聯(lián)至蛋白質(zhì)的DNA的百分比確定。放射性標(biāo)記的DNA(50pM)與反向引物(16nM)在SB17T中混合，加熱至95°C3分鐘，以0.IC/秒冷卻至37°C。將靶蛋白加入DNA混合物中至IOnM終濃度并在37°C保溫30分鐘。同時(shí)制備無蛋白質(zhì)的對(duì)照樣品。樣品用上述生色團(tuán)特異性條件交聯(lián)，但是具有飽和劑量(對(duì)于BrdU為6分鐘，對(duì)于ANA為10分鐘，對(duì)于AQ和Psor為30分鐘)。樣品經(jīng)變性PAGE分析，圖6，并量化，結(jié)果見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表3.用不同生色團(tuán)選擇的富集文庫(kù)的交聯(lián)率，以交聯(lián)至蛋白質(zhì)的總DNA的百分比單位報(bào)道。在未趨同的文庫(kù)上未進(jìn)行測(cè)量(用X標(biāo)記)。實(shí)施徹丨3.有競(jìng)爭(zhēng)布丨的‘障解離諫率富集過蔣產(chǎn)Φ‘障解離諫率i舌配/本A.候選混合物的制備經(jīng)聚合酶延伸與生物素化模板退火的引物制備針對(duì)94個(gè)蛋白質(zhì)靶的含有dATP，dCTP,dGTP及BzdUTP的候選混合物。55nmol正向引物(具有5，ANA生色團(tuán))和55nmol模板組合在0.5mL引物延伸緩沖液中(120mMTris-HCl，ρΗ7·8，IOmMKCl，6mM(NH4)2SO4，7mMMgSO4,0.lmg/mLBSA，0.1%TritonX-100)，加熱至95°C5分鐘，70°C5分鐘，48°C5分鐘，在冰上冷卻。將所述引物模板混合物加到5.5mL含有引物延伸緩沖液、0.125U/yLKODDNA聚合酶和0.5mM每種dATP，dCTP，dGTP及BzdUTP的延伸反應(yīng)中，在70°C保溫60分鐘。延伸反應(yīng)完成后，溶液在冰上冷卻。通過向引物延伸產(chǎn)物中加入25mL鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(MagnaBind-Str印tavidin，Pierce，5mg/mL于IMNaCl+0.05%TWEEN-20中)并在25°C旋轉(zhuǎn)保溫15分鐘而經(jīng)模板鏈生物素捕獲雙鏈產(chǎn)物。珠用40mLSB17T緩沖液(40mMHEPES,pH7.5,125mMNaCl,5mMKCl,5mMMgCl2,ImMEDTA，0·05%TWEEN-20)洗3次。用35.2mL20mMNaOH振蕩5分鐘從珠洗脫適配體鏈。洗脫的鏈用8.8mL80mMHCl中和并用400μL1MHEPES，ρΗ7.3緩沖。候選混合物用Centricon-30濃縮至大約0.7mL,并用UV吸收光譜定量。B.制備靶蛋白未標(biāo)簽標(biāo)記的靶蛋白如實(shí)施例2所述生物素化。C.用慢解離速率富集過程和光交聯(lián)選擇適配體如實(shí)施例2所述單獨(dú)進(jìn)行選擇，在第六至第九輪慢解離速率富集過程期間加入IOmM硫酸葡聚糖作為適配體重結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)劑。慢解離速率富集過程以三種不同方式進(jìn)行。在第二和第三輪，通過在捕獲復(fù)合物之前加入950μLSB17T(預(yù)熱至37°C)并在37°C保溫30分鐘而將樣品稀釋20Χ。在第四和第五輪，通過在交聯(lián)之前加入950μLSB17T(預(yù)熱至37°C)并在37°C保溫30分鐘而將樣品稀釋20X。在第六和第七輪，通過加入950μLSB17T(預(yù)熱至37°C)而將樣品稀釋20X。將50μL每種稀釋樣品轉(zhuǎn)移至950μLSB17T+10mM5000K硫酸葡聚糖(預(yù)熱至37°C)中而再次稀釋，產(chǎn)生總體400X稀釋，并在37°C保溫60分鐘，之后交聯(lián)。在第八和第九輪，通過加入950μLSB17T(預(yù)熱至37°C)而將樣品稀釋20X，50μL每種樣品轉(zhuǎn)移至950μLSB17T(預(yù)熱至37°C)中而再次稀釋，產(chǎn)生400X稀釋。最后50μL每種400X稀釋樣品轉(zhuǎn)移至950μLSB17T+10mM5000K硫酸葡聚糖(預(yù)熱至37°C)中而再次稀釋，產(chǎn)生總體8000X稀釋，并在37°C保溫60分鐘，之后交聯(lián)。復(fù)合物如實(shí)施例2所述捕獲和洗滌。當(dāng)采用光交聯(lián)時(shí)，在如實(shí)施例2所述進(jìn)行復(fù)合物捕獲之前將經(jīng)慢解離速率富集過程之后的ImL結(jié)合反應(yīng)用470nmLED陣列從上方照射60秒。D.適配體擴(kuò)增及純化擴(kuò)增及純化如實(shí)施例2所述進(jìn)行。E.選擇嚴(yán)格性及反饋靶蛋白在每輪如實(shí)施例1所述調(diào)整，除了是在第六和第八輪。為了最大化這些大稀釋之后的信號(hào)，對(duì)于第六和第八輪靶蛋白增加至ΙΟΟηΜ。在每輪選擇后，富集集合的趨同狀態(tài)如實(shí)施例1所述確定。F.解離速率常數(shù)確定方案通過測(cè)量在作為時(shí)間函數(shù)的稀釋后保持結(jié)合的預(yù)先形成的適配體蛋白質(zhì)復(fù)合物的級(jí)分針對(duì)每個(gè)適配體確定適配體蛋白質(zhì)復(fù)合物解離的速率常數(shù)(koff)。放射性標(biāo)記的適配體(50pM)用濃度為高于測(cè)量的Kd值10倍的蛋白質(zhì)在37°C在SB17T-0.002(具有降低至0.002%的TWEEN-20的SB17T)中平衡。樣品用SB17T-0.002在37°C稀釋100X，在不同時(shí)間點(diǎn)取等份并分開以從蛋白質(zhì)適配體復(fù)合物分離游離適配體。分開如下完成，將ZORBAX樹脂(Agilent)加入樣品，在樹脂上捕獲復(fù)合物，將樣品在真空下通過DuraPore膜，及用SB17T-0.002洗滌樹脂。對(duì)于未用ZORBAX樹脂有效捕獲的蛋白質(zhì)，用生物素化蛋白質(zhì)在SB17T中進(jìn)行測(cè)定，分開通過用DyanalMyOne-SA珠捕獲復(fù)合物完成。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)剩余的復(fù)合物的量通過用FUJIFLA-3000磷光成像儀量化樹脂上的放射性標(biāo)記的適配體而確定。復(fù)合物級(jí)分作為時(shí)間函數(shù)繪圖，解離速率常數(shù)(koff)及解離半衰期值(t1/2)通過用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)至用于生物分子解離動(dòng)力學(xué)的分析式而確定。G.一些適配體的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)下表4總結(jié)了用這一方案針對(duì)10個(gè)靶選擇的適配體所獲得的解離半衰期值(t1/2)。_靶蛋白tl/2(min)bFGFR__66_C3.164—過氧化氫酶■58—FGF-17__91_‘IB組磷脂酶i40HB-EGF‘49HCC-4.143IL-6sRa114SAP.186uPA85表4.用競(jìng)爭(zhēng)劑慢解離速率富集步驟方案的適配體的解離半衰期值(t1/2)實(shí)施例4慢解離速率富集過程增加選擇的適配體的解離半衰期對(duì)用實(shí)施例1所述的親和性SELEX方法或美國(guó)專利No.6，458，539(發(fā)明名稱〃PhotoselectionofNucleicAcidLigands“)所述的無慢解離速率富集過程的光SELEX方法選擇的65個(gè)適配體測(cè)量解離半衰期值(t1/2)并作圖(圖3A)。還對(duì)通過具有通過稀釋或用競(jìng)爭(zhēng)劑稀釋的慢解離速率富集過程的實(shí)施例2所述的慢解離速率富集過程選擇的72個(gè)適配體測(cè)量了t1/2值并作圖(圖3B)。用修飾的核苷酸5-芐基-dUTP(BzdUTP)、5-異丁基-dUTP(iBdUTP)、或5-色氨基-dUTP在不存在慢解離速率富集過程下選擇的適配體的平均t1/2值是20分鐘，一些適配體具有直至1小時(shí)的t1/2值。這實(shí)質(zhì)上長(zhǎng)于先前用天然堿基或其它修飾的核苷酸所述的值。用慢解離速率富集過程選擇的適配體的平均值超過85分鐘，一些適配體具有超過4小時(shí)的t1/2值。實(shí)施例5從NpdUTP隨機(jī)文庫(kù)產(chǎn)生適配體A.候選混合物制備含有dATP，dCTP，dGTP及NpdUTP的候選混合物如實(shí)施例3所述制備，但是不具有5'-ANA光反應(yīng)性基團(tuán)。B.靶蛋白的固定靶蛋白含有(His)6標(biāo)簽并如實(shí)施例1所述用Co+2-NTA珠捕獲。C.用慢解離速率富集過程進(jìn)行適配體選擇適配體選擇如實(shí)施例3所述進(jìn)行，但是沒有光交聯(lián)。D.適配體擴(kuò)增及純化擴(kuò)增及純化如實(shí)施例3所述進(jìn)行。E.選擇嚴(yán)格性及反饋選擇嚴(yán)格性及反饋如實(shí)施例3所述進(jìn)行。F.適配體性質(zhì)來自這一選擇的4個(gè)適配體的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)如表5所列。表5.NpdUTP適配體的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例6.用具有競(jìng)爭(zhēng)劑的慢解離速率富集過程產(chǎn)生對(duì)于肽靶的慢解離速率適配體A.候選混合物制備含有dATP，dCTP，dGTP及BzdUTP的候選混合物經(jīng)聚合酶延伸具有5，ANA生色團(tuán)的引物而制備并如實(shí)施例3純化。B.用慢解離速率富集過程和光交聯(lián)進(jìn)行適配體選擇用29個(gè)氨基酸的生物素化靶肽SMAP29(綿羊骨髓抗菌肽MAP-29，Anaspec)如實(shí)施例3所述進(jìn)行適配體選擇。C.適配體擴(kuò)增及純化擴(kuò)增及純化如實(shí)施例3所述進(jìn)行。D.選擇嚴(yán)格性及反饋選擇嚴(yán)格性及反饋如實(shí)施例3所述進(jìn)行。E.適配體性質(zhì)來自這個(gè)選擇的適配體的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)是1.2e_8M(根據(jù)實(shí)施例1所述方案測(cè)量)。這個(gè)適配體的解離半衰期(tl/2)是69分鐘(根據(jù)實(shí)施例3所述方案測(cè)量)。結(jié)果示于圖12A和圖12B。實(shí)施例7親和性珠雜交捕獲步驟1實(shí)施例7檢測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)測(cè)量通過具有慢解離速率的適配體進(jìn)行。步驟1適配體/引物混合物和檢測(cè)樣品的制備具有生物素Cy3檢測(cè)標(biāo)記的適配體(每種4nM)與3X過量的捕獲探針(互補(bǔ)于適配體3’固定區(qū)的含有生物素標(biāo)簽和光可裂解元件的寡核苷酸)在IXSB17T中混合，在95°C加熱4分鐘，然后37°C13分鐘，在IxSB17T中14稀釋。將55uL適配體/引物混合物加入微滴定板(Hybaid#AB-0407)并用箔密封。通過在SB17T中混合已知濃度的蛋白質(zhì)分析物并用SB17T系列稀釋而在微滴定板中制備檢測(cè)樣品。步驟2:樣品平衡將55uL適配體/引物混合物加入到55uL檢測(cè)樣品中并在箔密封微滴定板中在37°C保溫15分鐘。每個(gè)適配體在平衡混合物中的終濃度是0.5nM。平衡后，這個(gè)方法的所用后續(xù)步驟均在室溫進(jìn)行，除非另有說明。步驟3適配體捕獲及游離蛋白質(zhì)去除DuraPore過濾平板(MilliporeHVcat#MAHVN4550)用IOOuLIXSB17T經(jīng)真空過濾洗滌1次，向每孔中加入133.3uL7.5%鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂(Pierce)并用200uLIXSB17T洗2次。將IOOuL平衡樣品轉(zhuǎn)移至含有鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂的Durapore平板并在熱混合儀(Eppendorf)上以800rpm保溫5分鐘。樹脂用200uLIXSB17T+100uM生物素洗1次，用200uLIXSB17T洗1次。步驟4用生物素標(biāo)簽標(biāo)記蛋白質(zhì)將在即將使用前制備的IOOuL于SB17T中的1.2mMNHS-PE04-生物素加入到具有捕獲的適配體和適配體蛋白質(zhì)復(fù)合物的樹脂中并在熱混合儀上以SOOrpm保溫20分鐘。樹脂用200uLIXSB17T經(jīng)真空過濾洗滌5次。步驟5慢解離速率富集過程及光裂解從DuraPore平板下面除去導(dǎo)管(dripdirector)并將該平板置于ImL微滴定收集平板上。樹脂用200uLIXSB17T經(jīng)IOOOxg離心30秒洗1次。將80uLIXSB17T+10mMDxS04加入樹脂并用BlackRay汞燈照射，在熱混合儀上800rpm10分鐘。將所述DuraPore平板轉(zhuǎn)移至新的ImL深孔板并在IOOOxg離心30秒收集光裂解的適配體及蛋白質(zhì)適配體復(fù)合物。步驟6蛋白質(zhì)捕獲及游離適配體去除將50uLMyOne-鏈霉抗生物素蛋白Cl順磁性珠(Invitrogen)(10mg/mL于IXSB17T中)加入到微滴定板。珠用磁鐵分離60秒，去除上清。將225uL光裂解混合物加入到珠中并混合5分鐘。通過分離磁珠及更換洗滌緩沖液用200uLIXSB17T洗滌珠4次。除去最終洗滌緩沖液。步驟7適配體洗脫將IOOuL磷酸鈉洗脫緩沖液(IOmMNa2HPO4,pHll)加入到珠中并混合5分鐘。將90uL洗脫液轉(zhuǎn)移到微滴定板中并用IOuL磷酸鈉中和緩沖液(IOmMNaH2PO4,pH5)中和。步驟8適配體雜交至微陣列用固定化在市售顯微鏡玻片支持物上的寡核苷酸捕獲探針制備DNA陣列，所述探針包含每個(gè)適配體的可變區(qū)的互補(bǔ)序列。多個(gè)陣列(亞陣列)存在于每個(gè)玻片上，各亞陣列經(jīng)附加用于樣品施加的襯墊(gasket)(Grace)而物理分隔。陣列用IOOuL封閉緩沖液預(yù)處理并在熱混合儀上于65°C保溫15分鐘。將30uL高鹽雜交緩沖液加入到微滴定板中的90uL中和的適配體洗脫液中，在熱循環(huán)儀中于95°C加熱5分鐘，以0.1°C/秒冷卻至65°C。從陣列除去封閉緩沖液，將IlOuL適配體樣品加入到陣列中并在恒濕箱中于65°C保溫20小時(shí)。步驟9:陣列洗滌從陣列除去適配體樣品并將陣列用200uL磷酸鈉Tween-20洗滌緩沖液在65°C洗滌1次(襯墊在原位)，用25mL磷酸鈉、Tween-20洗滌緩沖液在papjar中于65°C洗3次(襯墊被除去)。陣列用氮槍干燥。步驟10量化陣列上的信號(hào)在重新載入的(Reloaded)TECANLS300上在針對(duì)Cy3檢測(cè)的合適通道中掃描陣列玻片，量化每個(gè)陣列特征上的Cy3信號(hào)。結(jié)果用傳統(tǒng)SELEX方法及材料產(chǎn)生特異于三種不同靶(bFGF、VEGF和髓過氧化物酶)的適配體。用5-位置修飾的核苷酸制備特異于相同組的靶的第二組適配體并選擇對(duì)它們各自靶的非常慢的解離速率。傳統(tǒng)方法中制備的適配體的測(cè)量的解離速率在小于5分鐘的級(jí)別。用修飾的核苷酸在選擇期間使用慢解離速率富集過程制備的適配體的解離速率大于20分鐘。對(duì)每個(gè)靶經(jīng)兩種不同方法制備2組適配體，對(duì)于每個(gè)靶總共4個(gè)不同適配體群。這些適配體群測(cè)量檢測(cè)樣品中分析物濃度的能力如上所述對(duì)一系列靶濃度來評(píng)估。來自DNA芯片檢測(cè)的相對(duì)信號(hào)對(duì)輸入靶濃度作圖。見圖IlA至11C。傳統(tǒng)適配體的應(yīng)答曲線非常平，檢測(cè)的靈敏性相當(dāng)?shù)?。用慢解離速率適配體檢測(cè)其各自靶的靈敏性非常好。數(shù)據(jù)支持需要使用慢解離適配體用于最大化分析性能。實(shí)施例8.產(chǎn)生對(duì)人凝血酶的高親和性BzdU適配體A.候選混合物制備如實(shí)施例3所述經(jīng)聚合酶延伸具有5’ANA生色團(tuán)的引物而制備含有dATP，dCTP，dGTP和BzdUTP的候選混合物并純化。B.靶蛋白制備如實(shí)施例2所述用生物素標(biāo)簽標(biāo)記人凝血酶。C.用慢解離速率富集及光交聯(lián)進(jìn)行適配體選擇用生物素化人凝血酶作為靶如實(shí)施例3所述進(jìn)行適配體選擇。D.適配體擴(kuò)增及純化如實(shí)施例3所述進(jìn)行擴(kuò)增及純化。E.選擇嚴(yán)格性及反饋如實(shí)施例3所述進(jìn)行選擇嚴(yán)格性及反饋。F.適配體性質(zhì)來自這個(gè)選擇的適配體2336-17的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)是4.4e_llM(根據(jù)實(shí)施例1所述方案測(cè)量)，如圖15所示。針對(duì)人凝血酶的單鏈DNA適配體從包含天然dA，dC，dG及dT核苷酸的文庫(kù)選擇(Bock,etal.，1992)。適配體的結(jié)合親和性具有從2.5e_8M至2.0e_7M的Kd值。使用相似方案用包含天然dA，dC，dG及修飾的5-(1-戊炔基)-dUTP的文庫(kù)，選擇具有4e-7M至le_6M的Kd值的適配體(Latham，etal.，1994)。實(shí)施例7描述了對(duì)人凝血酶的非常高親和性適配體的發(fā)現(xiàn)，其選自包含dA，dC，dG及修飾的BzdU的文庫(kù)。來自這個(gè)文庫(kù)的最高親和性適配體具有4.4e-llM的Kd值。一些專利、專利申請(qǐng)出版物和科學(xué)出版物被引用和/或列于說明書結(jié)尾。這些的每一篇均以其全文援引加入本文。類似地，援引加入的出版物中提到的所有出版物也以其全文援引加入本文。引用的出版物中的實(shí)例及其相關(guān)限制是例證的而非排除性的。在閱讀說明書和研究附圖后，引用的出版物的其它限制對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。詞語“包含”被解釋為是包括性的而非排除性的。權(quán)利要求鑒別適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸-靶分子復(fù)合物；(c)將所述核酸-靶分子復(fù)合物暴露于慢解離速率富集過程；(d)將所述核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(e)解離所述核酸-靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(f)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的適配體；(g)如果需要重復(fù)步驟(b)至(f)；及(h)鑒別靶分子的至少一個(gè)適配體。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選混合物是單鏈核酸或者雙鏈核酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選混合物包含DNA或RNA。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選混合物包含至少一種化學(xué)修飾。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述化學(xué)修飾的核酸在一或多個(gè)位置包含化學(xué)取代，所述位置獨(dú)立地選自由核糖位置、脫氧核糖位置、磷酸酯位置以及堿基位置組成的組中。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述化學(xué)修飾的核酸獨(dú)立地選自由2'-位置糖修飾、2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-0-甲基(2'-OMe)、5_位置嘧啶修飾、在胞嘧啶環(huán)外胺的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脫氧尿苷的取代、5-溴脫氧胞苷的取代、主鏈修飾、甲基化、3'加帽以及5'加帽組成的組中。7.權(quán)利要求4的方法，其中所述化學(xué)修飾的核酸獨(dú)立地選自由5-(N-芐基羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷，5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷，5-(N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷，5-(N-[l-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物，5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(N-[l-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷組成的組中。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物以及在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶分子選自由蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受體、肽、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、組織以及受控物質(zhì)組成的組中。12.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)適配體與其靶分子具有慢解離速率(t1/2)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述解離速率(t1/2)選自由彡大約30分鐘、彡大約60分鐘、≥大約90分鐘、≥大約120分鐘、≥大約150分鐘、≥大約180分鐘、≥大約210分鐘以及≥大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。16.權(quán)利要求9的方法，其中所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子獨(dú)立地選自由寡核苷酸、聚陰離子、無堿基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯組成的組中。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述聚陰離子選自由肝素、鯡精DNA、鮭精DNA、硫酸葡聚糖以及聚葡聚糖組成的組中。18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法鑒別的適配體。19.權(quán)利要求18的適配體，其中所述適配體與其靶分子具有慢解離速率(t1/2)。20.權(quán)利要求18的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。21.權(quán)利要求18的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。22.權(quán)利要求18的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)選自由≥大約30分鐘、≥大約60分鐘、≥大約90分鐘、≥大約120分鐘、≥》大約150分鐘、≥大約180分鐘、≥大約210分鐘和≥大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選復(fù)合物建立平衡結(jié)合；(ii)在步驟(i)之后，稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物；及(iii)在步驟(ii)之后，保溫含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選復(fù)合物建立平衡結(jié)合；()在步驟(i)之后，將含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物與至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子混合；(iii)在步驟(ii)之后，保溫含有競(jìng)爭(zhēng)劑與核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。25.權(quán)利要求1的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選復(fù)合物建立平衡結(jié)合；()在步驟(i)之后，將含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物與至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子混合；(iii)在步驟(i)之后，稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物；及(iv)保溫含有競(jìng)爭(zhēng)劑和核酸_靶分子復(fù)合物的稀釋的候選混合物。26.權(quán)利要求1的方法，其中核酸候選混合物包括光反應(yīng)性核苷酸。27.與其靶分子具有慢解離速率的適配體，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。28.權(quán)利要求27的適配體，其中所述解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。29.權(quán)利要求27的適配體，其中所述適配體的解離速率(t1/2)選自由≥大約30分鐘、≥大約60分鐘、≥大約90分鐘、≥大約120分鐘、≥大約150分鐘、≥大約180分鐘、≥大約210分鐘和≥大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。30.權(quán)利要求26的適配體，其中靶選自圖7中列出的靶。31.權(quán)利要求26的適配體，其中所述靶是蛋白質(zhì)。32.權(quán)利要求26的適配體，其中所述靶是肽。33.權(quán)利要求26的適配體，其中所述適配體包括獨(dú)立地選自如下一組的至少一個(gè)元件i)可裂解元件，ii)可檢測(cè)元件，iii)間隔序列元件，及iv)標(biāo)簽。34.特異性結(jié)合靶的適配體，其中所述適配體包含至少一個(gè)堿基修飾嘧啶，所述堿基修飾嘧啶獨(dú)立地選自圖14所示的堿基修飾嘧啶。35.權(quán)利要求34的適配體，其中所述適配體進(jìn)一步包含獨(dú)立地選自如下一組的至少一個(gè)光反應(yīng)性核苷酸5_溴尿嘧啶(BrU)、5_碘尿嘧啶(IU)、5_溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-溴脫氧尿苷、8-溴-2'-脫氧腺嘌呤、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶、5-碘-2'-脫氧胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤以及7_脫氮-7-溴鳥嘌呤。36.權(quán)利要求33的適配體，其中所述適配體進(jìn)一步包含至少一個(gè)光反應(yīng)性基團(tuán)，所述光反應(yīng)性基團(tuán)獨(dú)立地選自蒽醌(AQ)、補(bǔ)骨脂素(Psor)、4_疊氮-2-硝基-苯胺(ANA)和5-溴-dUTP。37.鑒別與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將所述核酸_靶分子復(fù)合物暴露于解離速率富集過程；(d)將所述核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(e)解離所述核酸_靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(f)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的適配體；(g)如果需要，重復(fù)步驟(b)至(f)；及(h)鑒別靶分子的至少一個(gè)適配體，其中所述適配體具有與其靶分子的慢解離速率。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述候選混合物是單鏈核酸或者雙鏈核酸。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述候選混合物包含DNA或RNA。40.權(quán)利要求37的方法，其中所述候選混合物包含化學(xué)修飾的核酸。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述化學(xué)修飾的核酸包括在一或多個(gè)位置的化學(xué)取代，所述位置獨(dú)立地選自由核糖位置、脫氧核糖位置、磷酸酯位置和堿基位置組成的組中。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述化學(xué)修飾的核酸獨(dú)立地選自由2'-位置糖修飾、2'-氨基(2'-NH2),2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、5_位置嘧啶修飾、在胞嘧啶環(huán)外胺的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脫氧尿苷的取代、5-溴脫氧胞苷的取代、主鏈修飾、甲基化、3'加帽以及5'加帽組成的組中。43.權(quán)利要求40的方法，其中所述至少一種化學(xué)修飾獨(dú)立地選自由5-(N-芐基羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'_脫氧尿苷以及5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷組成的組中。44.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。45.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括在含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。46.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物以及在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。47.權(quán)利要求37的方法，其中所述靶分子選自由蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受體、肽、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、組織以及受控物質(zhì)組成的組中。48.權(quán)利要求37的方法，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。49.權(quán)利要求37的方法，其中所述解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。50.權(quán)利要求37的方法，其中所述解離速率(t1/2)選自由彡大約30分鐘、彡大約60分鐘、>大約90分鐘、>大約120分鐘、>大約150分鐘、>大約180分鐘、>大約210分鐘以及>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。51.權(quán)利要求45的方法，其中所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子獨(dú)立地選自由寡核苷酸、聚陰離子、無堿基磷酸二酯聚合物、dNTP以及焦磷酸酯組成的組中。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述聚陰離子選自由肝素、鯡精DNA、鮭精DNA、硫酸葡聚糖和聚葡聚糖組成的組中。53.根據(jù)權(quán)利要求37的方法鑒別的適配體。54.權(quán)利要求53的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。55.權(quán)利要求53的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。56.權(quán)利要求53的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)選自由>大約30分鐘、》大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、>大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。57.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物建立平衡結(jié)合；()在步驟(i)之后，稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物；及(iii)在步驟(ii)之后，保溫含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。58.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物建立平衡結(jié)合；()在步驟(i)之后，將含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物與至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子混合；(iii)在步驟(ii)之后，保溫含有競(jìng)爭(zhēng)劑和核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。59.權(quán)利要求37的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括(i)使含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物建立平衡結(jié)合；()在步驟(i)之后，將含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物與至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子混合；(iii)在步驟(i)之后，稀釋含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物；及(iv)保溫含有競(jìng)爭(zhēng)劑和核酸_靶分子復(fù)合物的稀釋的候選混合物。60.權(quán)利要求37的方法，其中所述核酸候選混合物包括光反應(yīng)性核苷酸。61.與其靶具有慢解離速率的適配體，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。62.權(quán)利要求61的適配體，其中所述解離速率(tl/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。63.權(quán)利要求61的適配體，其中所述解離速率(t1/2)選自由彡大約30分鐘、彡大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、》大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。64.權(quán)利要求61的適配體，其中所述靶選自圖7列出的靶。65.權(quán)利要求61的適配體，其中所述靶是蛋白質(zhì)。66.權(quán)利要求61的適配體，其中所述靶是肽。67.權(quán)利要求61的適配體，其中所述適配體包含獨(dú)立地選自如下一組的至少一種元件i)可裂解元件，)可檢測(cè)元件，iii)間隔序列元件，及iv)標(biāo)簽。68.特異性結(jié)合靶的光適配體，其中所述光適配體包含至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶，所述堿基修飾的嘧啶選自圖14所示堿基修飾的嘧啶。69.權(quán)利要求68的光適配體，其中至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶獨(dú)立地選自由5-(N-芐基羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷組成的組中。70.權(quán)利要求68的光適配體，其中所述光適配體進(jìn)一步包含至少一個(gè)光反應(yīng)性核苷酸，所述光反應(yīng)性核苷酸獨(dú)立地選自由5-溴尿嘧啶(BrU)、5-碘尿嘧啶(IU)、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-溴脫氧尿苷、8-溴-2'-脫氧腺嘌呤、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶、5-碘-2'-脫氧胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5_[(4-疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤和7-脫氮-7-溴鳥嘌呤組成的組中。71.權(quán)利要求68的光適配體，其中所述光適配體進(jìn)一步包括至少一個(gè)光反應(yīng)性基團(tuán)，所述光反應(yīng)性基團(tuán)獨(dú)立地選自由蒽醌(AQ)、補(bǔ)骨脂素(Psor)、4_疊氮-2-硝基-苯胺(ANA)和5-溴-dUTP組成的組中。72.含有特異性結(jié)合靶的適配體的診斷試劑盒，其中適配體包含至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶，所述堿基修飾的嘧啶獨(dú)立地選自圖14所示堿基修飾的嘧啶。73.權(quán)利要求72的診斷試劑盒，其中所述適配體進(jìn)一步包含至少一個(gè)光反應(yīng)性核苷酸，所述光反應(yīng)性核苷酸獨(dú)立地選自5-溴尿嘧啶(BrU)、5_碘尿嘧啶(IU)、5_溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-溴脫氧尿苷、8-溴-2'-脫氧腺嘌呤、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶、5-碘-2'-脫氧胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5_[(4-疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤和7-脫氮-7-溴鳥嘌呤組成的組中。74.權(quán)利要求72的診斷試劑盒，其中所述適配體進(jìn)一步包含至少一個(gè)光反應(yīng)性基團(tuán)，所述光反應(yīng)性基團(tuán)獨(dú)立地選自由蒽醌(AQ)、補(bǔ)骨脂素(Psor)、4_疊氮-2-硝基-苯胺(ANA)和5-溴-dUTP組成的組中。75.鑒別與其靶分子具有慢解離速率的光適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物，其中所述候選混合物的每個(gè)核酸含有至少一個(gè)光反應(yīng)性部分；(b)將候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)使在步驟(b)中形成的核酸_靶分子復(fù)合物進(jìn)行慢解離速率富集過程；(d)照射所述核酸-靶分子復(fù)合物，其中所述核酸-靶分子光交聯(lián)；(e)將光交聯(lián)的核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(f)擴(kuò)增所述光交聯(lián)的核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的光適配體；(g)如果需要，重復(fù)步驟(b)至(f)；(h)鑒別靶分子的至少一個(gè)光適配體，其中所述光適配體與其靶分子具有慢解離速率。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述光適配體是單鏈核酸或者雙鏈核酸。77.權(quán)利要求76的方法，其中所述光適配體包含DNA或RNA。78.權(quán)利要求76的方法，其中所述光適配體包含至少一個(gè)光反應(yīng)性核苷酸，所述光反應(yīng)性核苷酸獨(dú)立地選自由5-溴尿嘧啶(BrU)、5_碘尿嘧啶(IU)、5_溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮胞嘧啶、8-疊氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8-疊氮鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-溴脫氧尿苷、8-溴-2'-脫氧腺嘌呤、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶、5-碘-2'-脫氧胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]胞嘧啶、5-[(4_疊氮苯甲酰甲基)硫]尿嘧啶、7-脫氮-7-碘腺嘌呤、7-脫氮-7-碘鳥嘌呤、7-脫氮-7-溴腺嘌呤和7-脫氮-7-溴鳥嘌呤組成的組中。79.權(quán)利要求75的方法，其中所述光適配體包含至少一個(gè)光反應(yīng)性基團(tuán)，所述光反應(yīng)性基團(tuán)獨(dú)立地選自由蒽醌(AQ)、補(bǔ)骨脂素(Psor)、4_疊氮-2-硝基-苯胺(ANA)和5-溴-dUTP組成的組中。80.權(quán)利要求75的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物。81.權(quán)利要求75的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括在含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。82.權(quán)利要求75的方法，其中所述慢解離速率富集過程包括稀釋含有核酸-靶分子復(fù)合物的候選混合物以及在含有核酸_靶分子復(fù)合物的候選混合物中加入至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑。83.權(quán)利要求81的方法，其中所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑獨(dú)立地選自由寡核苷酸、聚陰離子、無堿基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯組成的組中。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述聚陰離子選自由肝素、鯡精DNA、鮭精DNA和硫酸葡聚糖組成的組中。85.權(quán)利要求75的方法，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。86.權(quán)利要求75的方法，其中所述解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。87.權(quán)利要求75的方法，其中所述解離速率(t1/2)選自由彡大約30分鐘、彡大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、》大約210分鐘和彡大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。88.根據(jù)權(quán)利要求75的方法產(chǎn)生的光適配體。89.權(quán)利要求88的光適配體，其中所述光適配體與其靶的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。90.權(quán)利要求88的光適配體，其中所述光適配體與其靶的解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。91.權(quán)利要求88的光適配體，其中所述光適配體與其靶的解離速率選自由>大約30分鐘、》大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、^大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。92.鑒別耐聚陰離子的適配體的方法，所述方法包括a)將核酸候選混合物與靶接觸；b)使該混合物達(dá)到平衡，其中形成核酸-靶復(fù)合物；c)在該混合物中加入聚陰離子材料并保溫該混合物；d)將核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(e)解離核酸-靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(f)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的耐聚陰離子適配體；(g)如果需要，重復(fù)步驟(b)至(f)；(h)鑒別靶分子的至少一個(gè)耐聚陰離子適配體。93.適配體-靶復(fù)合物，其中所述適配體耐聚陰離子材料的存在。94.包含權(quán)利要求53的適配體的生物芯片。95.包含權(quán)利要求53的適配體的診斷裝置。96.包含權(quán)利要求53的適配體的治療材料。97.包含權(quán)利要求53的適配體的成像試劑。98.包含權(quán)利要求53的適配體的組織學(xué)試劑。99.包含權(quán)利要求53的適配體的病理學(xué)試劑。100.包含權(quán)利要求53的適配體的細(xì)胞學(xué)試劑。101.包含權(quán)利要求53的適配體的親和性分離試劑。102.包含權(quán)利要求53的適配體的生物傳感器。103.包含權(quán)利要求54的適配體的ALONA裝置。104.適配體-靶復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。105.權(quán)利要求104的適配體-靶復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。106.權(quán)利要求105的適配體-靶復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的解離速率選自由>大約30分鐘、》大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、》大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。107.權(quán)利要求105的適配體-靶復(fù)合物，所述適配體是光適配體。108.鑒別包含至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物，其中每個(gè)核酸均包含至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶，所述堿基修飾的嘧啶獨(dú)立地選自圖14所示堿基修飾的嘧啶；(b)將候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將所述核酸_靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(d)解離所述核酸-靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(e)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的適配體；(f)如果需要，重復(fù)步驟(b)-(e)；及(g)鑒別靶分子的至少一個(gè)適配體，其中所述適配體包含至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶。109.權(quán)利要求108的方法，其中所述適配體進(jìn)一步包含至少一種額外的化學(xué)修飾。110.權(quán)利要求108的方法，其中所述至少一種額外的化學(xué)修飾是在一或多個(gè)位置的化學(xué)取代，所述位置獨(dú)立地選自由核糖位置、脫氧核糖位置、磷酸酯位置和堿基位置組成的組中。111.權(quán)利要求108的方法，其中所述至少一種額外的化學(xué)修飾獨(dú)立地選自由2'-位置糖修飾、2'-氨基(2'-NH2),2'-氟(2'-F)、2'-0-甲基(2'-0Me)、5_位置嘧啶修飾、胞嘧啶環(huán)外胺的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脫氧尿苷的取代、5-溴脫氧胞苷的取代、主鏈修飾、甲基化、3'加帽和5'加帽組成的組中。112.權(quán)利要求108的方法，其中所述至少一個(gè)堿基修飾的嘧啶獨(dú)立地選自由5-(N-芐基羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷組成的組中。113.權(quán)利要求108的方法，其中所述靶分子選自由蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受體、肽、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、組織和受控物質(zhì)組成的組中。114.權(quán)利要求108的方法，其中所述適配體與其靶分子具有慢解離速率(t1/2)。115.權(quán)利要求114的方法，其中所述解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。116.權(quán)利要求115的方法，其中所述解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。117.權(quán)利要求116的方法，其中所述解離速率(t1/2)選自由彡大約30分鐘、彡大約60分鐘、》大約90分鐘、》大約120分鐘、》大約150分鐘、》大約180分鐘、》大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。118.根據(jù)權(quán)利要求117的方法鑒別的適配體。119.權(quán)利要求118的適配體，其中所述適配體與其靶分子具有慢解離速率(t1/2)。120.權(quán)利要求118的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)大于或等于大約30分鐘。121.權(quán)利要求118的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)在大約30分鐘至大約240分鐘之間。122.權(quán)利要求118的適配體，其中所述適配體與其靶分子的解離速率(t1/2)選自由大于或等于>大約30分鐘、>大約60分鐘、>大約90分鐘、>大約120分鐘、>大約150分鐘、>大約180分鐘、>大約210分鐘和>大約240分鐘的時(shí)間組成的組中。123.權(quán)利要求118的方法，其中核酸候選混合物包含光反應(yīng)性核苷酸。124.鑒別或產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物；(b)將候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸與靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將所述候選混合物與靶分子一起保溫足以實(shí)現(xiàn)平衡結(jié)合的一段時(shí)間；(d)在步驟(c)的混合物中加入過量的至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子；(e)將步驟(d)的候選混合物、靶分子/適配體復(fù)合物以及競(jìng)爭(zhēng)劑分子的混合物保溫預(yù)定的時(shí)間；(f)將所述核酸_靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(g)解離所述核酸_靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(h)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而可以鑒別靶分子的適配體。125.權(quán)利要求124的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括如下步驟⑴如果需要，重復(fù)步驟(b)-(h)；及(j)鑒別靶分子的至少一個(gè)適配體，其中所述適配體與其靶分子具有相對(duì)慢解離速率。126.權(quán)利要求124或125的方法，其中步驟(e)的預(yù)定的時(shí)間選自⑴至少10分鐘，(ii)至少20分鐘，(iii)至少30分鐘，(iν)至少45分鐘，(ν)至少1小時(shí)，(vi)至少2小時(shí)，(vii)至少3小時(shí)，(viii)至少4小時(shí)，(ix)至少5小時(shí)，(χ)至少6小時(shí)。127.權(quán)利要求124-126任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括對(duì)步驟(g)的游離核酸的核酸或者步驟(h)的混合物的核酸進(jìn)行測(cè)序的步驟，從而鑒別所述靶的適配體。128.權(quán)利要求124-126任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括基于由此鑒別的適配體制備適配體的步驟。129.產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求128的方法基于鑒別的適配體制備適配體的步驟。130.產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括基于通過包括如下步驟的方法鑒別的核酸序列制備或合成適配體的步驟(a)制備核酸候選混合物；(b)將核酸混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將所述候選混合物與靶分子一起保溫足以實(shí)現(xiàn)平衡結(jié)合的一段時(shí)間；(d)在步驟(c)的混合物中加入過量的至少一種競(jìng)爭(zhēng)劑分子；(e)將步驟(d)的候選混合物、靶分子/適配體復(fù)合物和競(jìng)爭(zhēng)劑分子的混合物一起保溫預(yù)定的時(shí)間；(f)將所述核酸-靶分子復(fù)合物與候選混合物分開；(g)解離核酸-靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離核酸；(h)擴(kuò)增所述游離核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而鑒別靶分子的適配體。131.權(quán)利要求130的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括步驟⑴如果需要，重復(fù)步驟(b)-(h)；及(j)鑒別靶分子的至少一個(gè)適配體，其中所述適配體與其靶分子具有相對(duì)慢解離速率。132.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述候選混合物包含修飾的核酸，其中至少一個(gè)或者每個(gè)核酸中的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾。133.權(quán)利要求132的方法，其中候選混合物的核酸中所有C殘基均在5-位置被化學(xué)修飾。134.權(quán)利要求132或133的方法，其中候選混合物的核酸中所有T殘基均在5-位置被化學(xué)修飾。135.權(quán)利要求132或134的方法，其中候選混合物的核酸中所有U殘基均在5-位置被化學(xué)修飾。136.權(quán)利要求132-135任一項(xiàng)的方法，其中5-位置化學(xué)修飾選自5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷。137.權(quán)利要求132-135任一項(xiàng)的方法，其中5-位置化學(xué)修飾獨(dú)立地選自圖14所示化學(xué)修飾。138.鑒別或產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括(a)制備核酸候選混合物，其中所述候選混合物包含修飾的核酸，其中候選混合物的至少一個(gè)或者每個(gè)核酸中的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾；(b)將該候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將具有增加的親和性的核酸與剩余的候選混合物分開；(d)擴(kuò)增所述具有增加的親和性的核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而可以鑒別所述靶分子的適配體。139.權(quán)利要求138的方法，其中所述5-位置化學(xué)修飾選自5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷。140.權(quán)利要求138的方法，其中所述5-位置化學(xué)修飾獨(dú)立地選自圖14所示化學(xué)修飾。141.權(quán)利要求138-140任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有C殘基在5-位置被化學(xué)修飾。142.權(quán)利要求138-141任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有T殘基在5-位置被化學(xué)修飾。143.權(quán)利要求138-141任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有U殘基在5-位置被化學(xué)修飾。144.權(quán)利要求138-142任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括對(duì)步驟(d)的混合物的核酸進(jìn)行測(cè)序的步驟，從而鑒別所述靶的適配體。145.權(quán)利要求138-143任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括基于由此鑒別的適配體制備適配體的步驟。146.產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括基于通過權(quán)利要求138或143的方法鑒別的適配體制備適配體的步驟。147.產(chǎn)生與其靶分子具有慢解離速率的適配體的方法，所述方法包括基于通過包括如下步驟的方法鑒別的核酸序列制備或合成適配體的步驟(a)制備核酸候選混合物，其中所述候選混合物包含修飾的核酸，其中候選混合物的至少一個(gè)或者每個(gè)核酸中的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被化學(xué)修飾；(b)將所述候選混合物與靶分子接觸，其中相對(duì)于候選混合物中其它核酸對(duì)靶分子具有增加的親和性的核酸結(jié)合所述靶分子，形成核酸_靶分子復(fù)合物；(c)將具有增加的親和性的核酸與剩余的候選混合物分開；(d)擴(kuò)增所述具有增加的親和性的核酸以產(chǎn)生富含能以增加的親和性結(jié)合靶分子的核酸序列的核酸的混合物，從而鑒別所述靶分子的適配體。148.權(quán)利要求147的方法，其中5-位置化學(xué)修飾選自5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷。149.權(quán)利要求147的方法，其中5-位置化學(xué)修飾獨(dú)立地選自圖14所示化學(xué)修飾。150.權(quán)利要求147-148任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有C殘基在5-位置被化學(xué)修飾。151.權(quán)利要求147-150任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有T殘基在5-位置被化學(xué)修飾。152.權(quán)利要求147-150任一項(xiàng)的方法，其中候選混合物的核酸中所有U殘基在5-位置被化學(xué)修飾。153.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中鑒別或產(chǎn)生的適配體的解離速率(t1/2)選自(i)大于或等于30分鐘；(ii)在大約30分鐘至大約240分鐘之間；(iii)30分鐘至60分鐘(iv)60分鐘至90分鐘(ν)90分鐘至120分鐘(vi)120分鐘至150分鐘(vii)150分鐘至180分鐘(viii)180分鐘至210分鐘(ix)210分鐘至240分鐘。154.一種適配體，其與靶和適配體的非共價(jià)復(fù)合物的解離速率(t1/2)選自如下之一(i)大于或等于30分鐘(ii)在大約30分鐘至大約240分鐘之間(iii)30分鐘至60分鐘(iv)60分鐘至90分鐘(ν)90分鐘至120分鐘(vi)120分鐘至150分鐘(vii)150分鐘至180分鐘(viii)180分鐘至210分鐘(ix)210分鐘至240分鐘。155.適配體與其靶的非共價(jià)復(fù)合物，其中適配體與所述靶的解離速率(t1/2)選自如下之一(i)大于或等于30分鐘(ii)在大約30分鐘至大約240分鐘之間(iii)30分鐘至60分鐘(iv)60分鐘至90分鐘(ν)90分鐘至120分鐘(vi)120分鐘至150分鐘(vii)150分鐘至180分鐘(viii)180分鐘至210分鐘(ix)210分鐘至240分鐘。156.權(quán)利要求155的適配體，其中適配體的核酸序列中的一個(gè)、若干個(gè)或者所有嘧啶在5-位置被修飾。157.權(quán)利要求156的適配體，其中5-位置化學(xué)修飾選自5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷。158.權(quán)利要求157的適配體，其中5-位置化學(xué)修飾獨(dú)立地選自圖14所示化學(xué)修飾。159.權(quán)利要求156-158任一項(xiàng)的適配體，其中適配體的核酸序列中所有C殘基在5-位置被化學(xué)修飾。160.權(quán)利要求156-159任一項(xiàng)的適配體，其中適配體的核酸序列中所有T殘基在5-位置被化學(xué)修飾。161.權(quán)利要求156-160任一項(xiàng)的適配體，其中適配體的核酸序列中所有U殘基在5-位置被化學(xué)修飾。162.適配體與靶的非共價(jià)復(fù)合物，其中所述適配體對(duì)所述靶的Kd為IOOnM或更低，其中適配體與所述靶的解離速率(t1/2)大于或等于30分鐘，且適配體的核酸序列中一個(gè)、若干個(gè)或所有嘧啶在5-位置被修飾，所述修飾選自5-(N-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[2-(1Η-吲哚-3-基)乙基]羧基酰胺)_2'-脫氧尿苷、5-(Ν-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物、5_(N-萘基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷和5-(Ν-[1-(2，3-二羥基丙基)]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷或者獨(dú)立地選自圖14所示化學(xué)修飾。全文摘要本發(fā)明描述了產(chǎn)生能結(jié)合靶分子的適配體的改良的SELEX方法，以及產(chǎn)生能結(jié)合且共價(jià)交聯(lián)靶分子的光反應(yīng)性適配體的改良的光SELEX方法。特別地，本發(fā)明描述了產(chǎn)生與使用先前的SELEX和光SELEX方法獲得的適配體相比具有更慢的解離速率常數(shù)的適配體和光適配體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步描述了與使用先前方法獲得的適配體和光適配體相比具有更慢的解離速率常數(shù)的適配體和光適配體。此外，本發(fā)明描述了包含多種功能性的適配體構(gòu)建體，其包括可裂解元件、檢測(cè)元件以及捕獲或固定元件。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101809167SQ200880107336公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日發(fā)明者B·伊頓,C·博克,D·J.·施奈德,D·濟(jì)奇,L·戈?duì)柕?S·K.·威爾科克斯申請(qǐng)人:私募蛋白質(zhì)體公司