專利名稱：：甘油的脂肪酸酯結(jié)合多聚賴氨酸用于抗革蘭氏陰性細(xì)菌的用途的制作方法甘油的脂肪酸酯結(jié)合多聚賴氨酸用于抗革蘭氏陰性細(xì)菌的用途本發(fā)明涉及使用基于甘油的脂肪酸酯的組合物用于減少或阻止產(chǎn)品之中或之上的革蘭氏陰性細(xì)菌的活性的方法。本發(fā)明進(jìn)一步針對(duì)使用此方法得到的產(chǎn)品。甘油的脂肪酸單酯因其抗酵母、真菌和食物腐敗細(xì)菌的抗菌活性而為人所知。其還有抗特定的革蘭氏陽性食物病原性細(xì)菌如李斯特菌屬(Listeria)和梭菌屬(Clostridium)的抗菌活性。然而，其獨(dú)自對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌沒有或幾乎沒有效果。US2005/0084471描述了增強(qiáng)劑用于使甘油單酯對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)有活性的用途。該專利申請(qǐng)?zhí)峁┝怂锌赡艿脑鰪?qiáng)劑的廣泛清單。增強(qiáng)劑可以是α-羥基酸、β_羥基酸、其他羧基酸、除了羧基酸之外的螯合試劑、酚類化合物(例如，特定的抗氧化劑和尼泊金(paraben))或Cl-ClO-單羥基乙醇。其他合適的增強(qiáng)劑是對(duì)結(jié)合亞鐵或鐵離子有高度特異性的化合物如鐵載體(例如，腸桿菌素、綠膿桿菌螯鐵蛋白)及鐵結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白)。還包括在內(nèi)的是螯合劑如細(xì)菌素、抗菌酶、糖、糖乙醇及其組合。以上提到的螯合試劑被描述為能夠在溶液中與金屬離子具有多重配位位點(diǎn)的有機(jī)化合物。典型地，這些螯合試劑為多聚陰離子化合物，與多價(jià)金屬離子最好地配對(duì)。實(shí)例為乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)及其鹽，多種基于磷酸鹽和/或膦酸的化合物、己二酸、琥珀酸、二亞乙基三胺五-乙酸、1-羥基乙烯以及特定羧基酸如α-和β-羥基酸、蘋果酸和酒石酸。本發(fā)明提供了一種完全不同的方式以增強(qiáng)甘油的脂肪酸酯抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性。本發(fā)明產(chǎn)生了抗革蘭氏陰性細(xì)菌的一種非常有效的方式，其可在多種產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用，應(yīng)用范圍為從技術(shù)產(chǎn)品和應(yīng)用到用于消費(fèi)和/或個(gè)人護(hù)理的產(chǎn)品。對(duì)此，本發(fā)明針對(duì)的是用于減少和/或阻止產(chǎn)品中或表面上的革蘭氏陰性細(xì)菌的活性、生長和/或存在的方法，包括將所述的產(chǎn)品或表面與包含a)甘油的脂肪酸酯和b)多聚賴氨酸和/或多聚賴氨酸的鹽的組合接觸，其中所述甘油的脂肪酸酯作為抗菌或抗微生物試劑應(yīng)用，而非乳化劑。甘油的脂肪酸酯通常作為乳化劑應(yīng)用，但現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)通過在包含多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中使用甘油的脂肪酸，其可作為特異性抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌試劑而應(yīng)用。據(jù)發(fā)現(xiàn)，多聚賴氨酸和/或鹽與甘油的脂肪酸酯的組合不僅能夠簡單地增強(qiáng)兩種組分的活性，使得所述的增強(qiáng)效果是多聚賴氨酸和甘油的脂肪酸酯二者單個(gè)活性的總和，而是出人意料地顯示出對(duì)于抗菌活性的協(xié)同效果，兩種組分協(xié)同作用產(chǎn)生了比組合物的單個(gè)組分的活性總和顯著更高的抗菌活性。在上述現(xiàn)有技術(shù)中提到的許多增強(qiáng)劑沒有顯示出這種協(xié)同性，且在與甘油脂肪酸單酯組合時(shí)不具有像根據(jù)本發(fā)明的甘油的脂肪酸酯與多聚賴氨酸和/或其鹽的組合的協(xié)同效果。進(jìn)一步地，許多所述的增強(qiáng)劑自身對(duì)于抗革蘭氏陰性細(xì)菌不是非常有效，因此要以高量應(yīng)用以顯示任何增強(qiáng)抗菌作用。以需要達(dá)到該抗菌作用的量，所述的增強(qiáng)劑在口味、顏色、氣味及/或質(zhì)地方面負(fù)面影響其所應(yīng)用的食物產(chǎn)品。例如，有機(jī)酸自身對(duì)于抗革蘭氏陰性細(xì)菌不那么有效，并且為了有增強(qiáng)作用，需要相當(dāng)大量的有機(jī)酸。然而，該酸負(fù)面影響許多產(chǎn)品的口味、質(zhì)地和其他屬性，因?yàn)槠湟跃哂腥魏慰咕饔盟璧牧?，降低了所述食物產(chǎn)品的PH。例如，已知酸負(fù)面影響富含蛋白質(zhì)產(chǎn)品(例如，肉類產(chǎn)品)的質(zhì)地，因?yàn)槠鋵?dǎo)致了例如蛋白質(zhì)的變性。另一個(gè)實(shí)例是在現(xiàn)有技術(shù)中提到的蛋白質(zhì)、鐵載體及細(xì)菌素，這些在其用途方面受限制是因?yàn)槠鋵?duì)于食物產(chǎn)品中的PH-變化非常敏感，或者是因?yàn)槠渚哂袑?duì)食物產(chǎn)品的口味和質(zhì)地有不希望的影響。如現(xiàn)有技術(shù)中提到的，這也是許多Cl-ClO-單羥基乙醇的情況，其缺點(diǎn)是具有強(qiáng)烈、不希望的氣味特征，使其不適合于在食物和飲品產(chǎn)品中的許多應(yīng)用。用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的甘油的脂肪酸酯獨(dú)自對(duì)于抗革蘭氏陰性細(xì)菌也不是很有效，但是在與多聚賴氨酸和/或其鹽組合中，在許多食物和飲品產(chǎn)品能接受的甘油脂肪酸酯濃度，得到了協(xié)同增加的抗菌活性。已知多聚賴氨酸發(fā)揮抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性。α-多聚賴氨酸和ε-多聚賴氨酸二者都具有抗菌活性，盡管后者的程度顯著更大，如Shima等人(1984年11月)描述的。如該文章中描述的，ε-多聚賴氨酸可以以大約1-8微克/ml的濃度有效地用于抗革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌。Hiraki等人(2000)描述了當(dāng)ε_(tái)多聚賴氨酸與抗菌試劑如甘油、乙酸(以醋的形式)、乙醇或硫胺素十二烷基磺酸鹽一同使用時(shí)，其抗菌活性被極大地增強(qiáng)了。然而卻沒有提到一種方法，其中將甘油的脂肪酸酯與ε“多聚賴氨酸組合以實(shí)現(xiàn)抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性，很可能是由于甘油脂肪酸酯對(duì)這種類型的革蘭氏陰性細(xì)菌活性很弱這一點(diǎn)深深為人所知。JP2000-270821、JP7-135943、JP4-8273、JP2001-587465、JP2001-094794、JP1999-321013,JP11113779,JP1994-298780、JP2001-384674描述了包含與單-和二-甘油酯以及其他抗菌組分(如魚精蛋白、乙醇、甘氨酸、溶菌酶等)組合的ε-多聚賴氨酸的組合物。以上提到的組合物描述為對(duì)于抗形成孔的以及產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌、抗腐敗性細(xì)菌如明珠串菌屬(Leuconostoc)(革蘭氏陽性)以及抗酵母和真菌如念珠菌屬(Candida)有效?，F(xiàn)有技術(shù)，包括以上提到的專利文獻(xiàn)，沒有描述甘油的脂肪酸酯與多聚賴氨酸和/或其鹽組合能非常有效地應(yīng)用于抗革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是抗大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)及假單胞菌屬(Pseudomonas)。進(jìn)一步地，現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)的是甘油的脂肪酸酯在可能包含抗菌試劑如多聚賴氨酸和其他的混合物中作為乳化劑或表面活性劑的用途，例如在JP2002-274742中。沒有發(fā)現(xiàn)有現(xiàn)有技術(shù)描述了甘油的脂肪酸酯已經(jīng)在包含多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中用作抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌試劑。現(xiàn)有技術(shù)沒有描述甘油的脂肪酸酯可以用于協(xié)同增加多聚賴氨酸和/或其任何鹽的抗微生物作用。因此本發(fā)明包括用于減少或阻止革蘭氏陰性細(xì)菌的活性、生長和/或存在的方法，包括將所述細(xì)菌與包含a)甘油的脂肪酸酯和b)多聚賴氨酸和/或多聚賴氨酸的鹽的組合物接觸，其中所述甘油的脂肪酸酯作為抗菌試劑使用。多聚賴氨酸可以以ε-多聚賴氨酸、α-多聚賴氨酸或其混合物存在。ε_(tái)多聚賴氨酸是優(yōu)選的，因?yàn)槠湎啾扔诙嗑圪嚢彼岬钠渌问骄哂懈叩目垢锾m氏陰性細(xì)菌的抗菌活性，因此需要更少量的這種抗菌試劑以在應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性的滿意的協(xié)同性。進(jìn)一步，ε_(tái)多聚賴氨酸優(yōu)選地包含通過自由羧基基團(tuán)及e-氨基基團(tuán)之間的肽鍵連接的30-50個(gè)L-賴氨酸單體。本發(fā)明的脂肪酸酯還可以與一種或多種多聚賴氨酸的鹽組合。本發(fā)明的甘油脂肪酸酯(也稱為甘油酯或甘油或基于甘油的脂肪酸酯)可以包括甘油的單酯、二酯或三酯或者其混合物。生產(chǎn)這些酯的方式常常產(chǎn)生多種單_、二或三酯的混合物，可能如通常已知的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)能從這些混合物中分離出這些酯。因此，當(dāng)指的是單酯時(shí)，這些甘油的單酯包括純組分以及主要包括單酯卻還包括二-和三-酯(作為所述的混合物的進(jìn)一步組分)的混合物。當(dāng)細(xì)菌或含有所述細(xì)菌的產(chǎn)品以及表面與包括多聚賴氨酸和甘油的單_和二酯的組合的組合物接觸時(shí)，得到了非常好的結(jié)果。在包括與甘油的脂肪酸酯和脂肪酸結(jié)合的多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中觀察到有產(chǎn)生高抗菌活性的高度協(xié)同性，其中所述的脂肪酸包括飽和脂肪酸例如但不限于己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)、十二酸(C12)、十四酸(C14)、十六酸(C16)、十八酸(C18)和其混合物。當(dāng)本申請(qǐng)中指的是例如C8-甘油酯或ClO-甘油酯時(shí)，意為甘油的脂肪酸酯，并且分別是辛酸和癸酸。據(jù)發(fā)現(xiàn)，如果細(xì)菌或含有細(xì)菌的產(chǎn)品或表面與包括甘油脂肪酸酯、多聚賴氨酸和/或其鹽以及進(jìn)一步的一種或多種乳酸酯(鹽)(Iayctylate)的組合物接觸，根據(jù)本發(fā)明的方法甚至更有效。乳酸鹽(酯)為乳酸(和/或乳酸的鹽)的脂肪酸酯且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。這些組分以其乳化作用已知，因此作為乳化劑使用。單乳酸酯(鹽)和二乳酸酯(鹽)二者都與其混合物一樣合適。乳酸酯(鹽)組分常常作為例如主要是單乳酸酯(鹽)的混合物獲得，并且由于其制備方式而進(jìn)一步包括二乳酸酯(鹽)的混合物。極有可能混合物中還存在有更高度聚合的多聚乳酸酯(鹽)。乳酸酯(鹽)可以通過例如色譜分離的方式或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方式以純的形式(例如，只有單聚的形式)獲得。用于根據(jù)本發(fā)明的方法的抗菌組合物進(jìn)一步可以包括一種或多種有機(jī)酸和/或其鹽或酯，因?yàn)檫@些成分進(jìn)一步增強(qiáng)抗菌活性。優(yōu)選地，使用選自乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、酒石酸、葡萄糖酸、丙酸和己酸的一種或多種有機(jī)酸和/或其鹽或酯，因?yàn)檫@些酸對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量在例如產(chǎn)品口味、氣味和顏色上沒有負(fù)面影響?？蛇x地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法的抗菌組合物進(jìn)一步包括一種或多種金屬螯合試齊U。螯合試劑可選自例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽，二亞乙基三胺五-乙酸及其鹽，多種基于磷酸的化合物如六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉和多聚磷酸、有機(jī)膦酸鹽螯合化合物如植酸、1，1_二膦酸、鐵載體及鐵結(jié)合蛋白質(zhì)如腸桿菌素和乳鐵蛋白，以及羧基酸和羥基羧酸以及/或其鹽，例如但不限于琥珀酸、抗壞血酸、乙醇酸、苯甲酸、辛酸和脂肪酸。據(jù)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)大腸埃希氏屬(例如大腸埃希氏菌)、沙門氏菌屬(例如沙門氏菌屬多個(gè)種)、彎曲桿菌屬(例如彎曲桿菌屬多個(gè)種)和假單胞菌屬(例如假單胞菌屬多個(gè)種)家族的革蘭氏陰性細(xì)菌非常有效，因?yàn)槎嗑圪嚢彼峤M分和甘油酯組分在組合物中對(duì)這些特異性靶標(biāo)生物體協(xié)同作用，從而達(dá)到了足以阻止和/或減少這些革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長和/或活性的抗菌活性。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的方法可應(yīng)用于多種產(chǎn)品和應(yīng)用中，范圍從例如低和高pH值的產(chǎn)品、高度濃縮或稀釋的產(chǎn)品、可用于
技術(shù)領(lǐng)域：
品(例如，在用于工業(yè)或家居用途的去垢劑中)、藥用領(lǐng)域(例如，用于清潔和消毒設(shè)備或制備藥物組合物或其包裝)、個(gè)人護(hù)理(例如，在制造化妝品、香波、霜?jiǎng)┖腿橐?、飼料工業(yè)(例如，用于清潔設(shè)備、制造、儲(chǔ)存、處理及制備動(dòng)物飼料和飲品產(chǎn)品)到食物和飲品工業(yè)的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明涉及在包括多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中，甘油脂肪酸酯作為抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌試劑用于減少和/或阻止革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長或活性的用途，具體而言是之前提到的去垢劑、化妝品產(chǎn)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的制造、處理、儲(chǔ)存和制備中的細(xì)菌。對(duì)此，根據(jù)本發(fā)明的用于減少或阻止去垢劑產(chǎn)品、化妝品產(chǎn)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長或活性的方法包括在所述產(chǎn)品的制造、處理、儲(chǔ)存或制備的一個(gè)或多個(gè)階段中根據(jù)本發(fā)明的多種實(shí)施方式將所述產(chǎn)品與包括甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物接觸，其中所述的甘油脂肪酸酯用作抗菌試劑。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)包括甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸和/或鹽的組合物對(duì)于清潔表面非常有用。因此根據(jù)本發(fā)明的方法還針對(duì)減少或阻止表面上的革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長或活性，具體而言是之前提到的細(xì)菌，所述方法包括將所述的表面與包括甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸和/或鹽的組合物接觸，其中所述的甘油脂肪酸酯用作抗菌試劑。本發(fā)明進(jìn)一步針對(duì)甘油脂肪酸酯在包括多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中，在用于飼料工業(yè)的食物和飲品產(chǎn)品以及用于人類消費(fèi)的食物和飲品產(chǎn)品的制造、處理、儲(chǔ)存和制備中，作為抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌試劑的用途。對(duì)此，根據(jù)本發(fā)明的用于減少或阻止在用于動(dòng)物或人類消費(fèi)的食物和飲品產(chǎn)品中革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長或活性的方法包括在食物加工過程如所述產(chǎn)品的制造、處理、儲(chǔ)存或制備的一個(gè)或多個(gè)階段中，將所述產(chǎn)品與包括甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物接觸，其中所述的甘油脂肪酸酯作為抗菌試劑應(yīng)用。食物和飲品產(chǎn)品的實(shí)例為飲品例如碳酸和非碳酸飲料，基于水果或蔬菜的果汁、富含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品例如多種肉類和魚類產(chǎn)品、調(diào)味品、醬和配料、即食及即飲產(chǎn)品、冷藏和高溫處理產(chǎn)品等。這些產(chǎn)品能用根據(jù)本發(fā)明的方法非常好地制造或處理。所得的產(chǎn)品在例如口味、質(zhì)地和顏色方面的感官質(zhì)量上沒有受到負(fù)面影響，同時(shí)產(chǎn)品受到針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌存在和活性造成的食物腐敗及/或食物中毒的保護(hù)。正常地，甘油脂肪酸酯以多至產(chǎn)品重量5%的量存在于食物或飲品產(chǎn)品中，優(yōu)選地從0.0001%IlJ5%,優(yōu)選地從0.0001%IlJ2%,優(yōu)選地從0.0001%到1%。正常地，多聚賴氨酸以多至產(chǎn)品重量的量存在于食物或飲品產(chǎn)品中，優(yōu)選地從0.0001%到1%，優(yōu)選地從0.0001%到0.1%，優(yōu)選地從0.0001%到0.01%，優(yōu)選地從0.0001%到0.001%。正常地，EDTA、有機(jī)磷酸鹽和多聚磷酸鹽以多至產(chǎn)品重量的量存在于食物或飲品產(chǎn)品中，優(yōu)選地從0.0001%到1%。正常地，乳酸酯(鹽)以多至產(chǎn)品重量的量存在于食物或飲品產(chǎn)品中，優(yōu)選地從0.0001%IlJ1%，甚至從0.0001%IlJ0.1%，最優(yōu)選地從0.0001%IlJ0.01%。正常地，有機(jī)酸例如乳酸、延胡索酸、琥珀酸、酒石酸、抗壞血酸、羥基乙酸、苯甲酸、醋酸、丙酸、辛酸、蘋果酸及己二酸可以多至產(chǎn)品重量10%的量存在于食物或飲品產(chǎn)品中，優(yōu)選地從0.0001%到10%，優(yōu)選地從0.0001%IlJ5%O根據(jù)本發(fā)明的方法中，以上提到的食物和飲品產(chǎn)品與包括甘油脂肪酸酯及多聚賴氨酸和/或其鹽的本發(fā)明的組合物接觸。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，食物和飲品產(chǎn)品與以上提到的組合物一并進(jìn)行注射。組合物然后存在于產(chǎn)品的內(nèi)部部分或產(chǎn)品內(nèi)ο在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施條件中，所述方法包括了用包括甘油脂肪酸酯及多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行表面處理。這可能不僅在最后的產(chǎn)品階段，還在過程中完成，例如肉類產(chǎn)品制造中獸體消毒過程中或在應(yīng)用于水果和蔬菜的洗滌步驟中。所述抗菌組合物可通過多種方式例如作為噴灑、沖洗或洗滌溶液或作為多種食物產(chǎn)品浸入其中的溶液與待處理產(chǎn)品接觸或弓I入待處理產(chǎn)品中。依據(jù)應(yīng)用的類型以及本發(fā)明組合物是否在最終產(chǎn)品中用作活性成分或者是作為例如洗滌溶液或噴劑的組分使用，所述組合物的組分在濃度上和內(nèi)部比例上有變化，這些對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。包括甘油脂肪酸酯及多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物可以以固體或液體形式得到。如果所述組合物是以液體形式的，其通常是水性組合物的形式，可以是溶液或者分散液。根據(jù)本發(fā)明，基于溶液的總重量，這種水性組合物通常包括從0.OOOlwt%到多至40wt%；更優(yōu)選地從0.Iwt%到35wt%，最優(yōu)選地從1到25wt%的多聚賴氨酸以及從0.OOOlwt%到多至45wt%，更優(yōu)選地從1到40wt%，最優(yōu)選地從5到35wt%的甘油脂肪酸酯。所述組合物可以進(jìn)一步包括乳酸酯(鹽)，其量為0到45wt%，更優(yōu)選地為從5到35wt%，并且進(jìn)一步含有機(jī)酸，范圍是0到45wt%，更優(yōu)選地為從0到30wt%。甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸或其鹽可通過載體引入液體組合物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道何種載體可以使用。在多種熟知的載體中，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇和/或乳酸酯(鹽)很好地以載體發(fā)揮功能。載體可以以大約50-98wt%的濃度存在。進(jìn)一步地，可添加本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種乳化劑。優(yōu)選地，乳化劑如聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯60或80)和卵磷脂的應(yīng)用濃度為例如0.1-25%，更優(yōu)選地為1-10%，最優(yōu)選地為2-4%，基于100%脂肪酸衍生物如甘油脂肪酸酯和/或乳酸酯(鹽)，如果除甘油脂肪酸酯及多聚賴氨酸或其鹽之外還在組合物中使用了后者組分。如果包括甘油脂肪酸酯和多聚賴氨酸或其鹽的組合物為固體形式，那么其通常為包括相關(guān)組分顆粒的粉末形式。根據(jù)本發(fā)明，基于粉末的總重量，固體形式的組合物通常包括從0.OOOlwt%到多至40wt%，更優(yōu)選地從0.Iwt%到35wt%，最優(yōu)選地從1到25wt%的多聚賴氨酸，以及從0.OOOlwt%到多至45wt.%，更優(yōu)選地從1到40wt%，最優(yōu)選地從5到35wt%的甘油脂肪酸酯?？梢杂玫捷d體。非常合適的載體為二氧化硅和/或麥芽糖糊精，其存在濃度為多至從50到98wt%。所述組合物可進(jìn)一步包括乳酸酯(鹽)，量為從0到45wt%，更優(yōu)選地為從0到35wt%，進(jìn)一步包括有機(jī)酸，范圍是從0到45wt%，更優(yōu)選地為從從0到30wt%。以下非限制實(shí)例進(jìn)一步說明了本發(fā)明。實(shí)施例1在研究中使用以下培養(yǎng)物質(zhì)大腸埃希氏菌(ATCC8739)，大腸埃希氏菌血清型0157:H7(ATCC700728)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)(ATCC13311)和腸炎沙門氏菌(Salmonellaentiritidis)(ATCC13076)。每天將所有培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有IOml腦心浸劑肉湯的螺旋蓋試管中。培養(yǎng)物在30°C下孵育，不攪拌。隨著單/二甘油酯和多聚賴氨酸的量增加，制備腦心浸劑肉湯。辛酸(C8)單/二甘油酯的濃度范圍為以10步每步0.02%從0到0.18%，對(duì)癸酸(ClO)單/二甘油酯為以10步每步0.01%從0到0.09%，對(duì)十二酸(C12)單/二甘油酯為以10步每步0.001%從0到0.009%。單/二甘油酯與多聚賴氨酸組合。多聚賴氨酸的濃度范圍為以10步每步0.0075%從0到0.0675%,產(chǎn)生100種不同培養(yǎng)基。用INHCl或INNaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到6.1-6.2。培養(yǎng)基以IOml的量制備，并通過過濾進(jìn)行滅菌。每份培養(yǎng)基取300μι轉(zhuǎn)移到一組滅菌的Bioscreenc蜂窩式loo孔板中。使用5μ1的滅菌重復(fù)分配器將多孔板用5μ1腦心浸劑肉湯中生長過夜的培養(yǎng)物進(jìn)行孵育。生長速率用Bioscreen確定，其通過垂直光度測(cè)定法動(dòng)力學(xué)地測(cè)量濁度的發(fā)展。板在37°c下孵育16-24小時(shí)，使用寬頻帶濾波器于420-580nm處每30分鐘測(cè)量培養(yǎng)物的光密度。Bioscreen在設(shè)定的時(shí)間間隔測(cè)量培養(yǎng)物的光密度。Bioscreen從這些數(shù)據(jù)計(jì)算最大特定生長速率。進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理的目的為確定兩種氨基酸是否獨(dú)立于彼此作用或者是否其在抑制作用上相互刺激(協(xié)同)還是彼此抵消抑制作用(拮抗)。當(dāng)特定的化合物對(duì)于生物體沒有作用時(shí)，此生物體的特定生長速率(μ)能表示為生長限制性底物濃度(S)的函數(shù)(f)，通過例如莫諾德(Monod)公式，其為μ=ymax*s/(Ks+s)，其中μ_代表最大的特定生長速率，s為培養(yǎng)基中生長限制性底物的穩(wěn)定濃度，Ks為底物濃度，其中μ=0.5·μ_。然而，當(dāng)抑制劑ρ的存在影響細(xì)胞生長時(shí)，必須修改μ的函數(shù)f，即μ=f(S，P)，其中P代表抑制劑P的濃度。細(xì)菌生長抑制動(dòng)力學(xué)的大量研究已經(jīng)表明，許多抑制劑起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用。這暗示了只有最大特定生長速率(μ_)數(shù)值，而非親和力(Ks)受到影響。因此，在抑制劑存在時(shí)的特定生長速率可寫作μ=μ-s/(Ks+s),其中μi為在抑制劑P存在下的最大特定生長速率。μi和μmax及抑制劑P的濃度之間的關(guān)系用對(duì)數(shù)劑量反應(yīng)(LogisticDoseResponse)公式描述，其為μ乂μmax=1/(1+(p/Po.5)b)(Jungbauer,Α.(2001).Thelogisticdoseresponsefunction；arobustfittingfunctionfortransitionphenomenainlifesciences.J.ClinicalLigandAssay24270-274)。該公式中，P代表抑制劑P的濃度，Pa5為μi=0.5·μmax時(shí)P的濃度，μmax為最大特定生長速率，其為抑制劑P不存在時(shí)的特定生長速率，b是無量綱的量，其確定μi和P之間的關(guān)系。將莫諾德和對(duì)數(shù)劑量反應(yīng)公式結(jié)合，可寫作μ=yfflax-s/(Ks+s)/(l+(p/Po.5)b)。在批次培養(yǎng)物中，S常常比Ks高很多倍，該公式簡化為μ=μ_/(1+(ρ/ρ0.5”)。當(dāng)比較相同條件下生長的不同生物體，或不同條件下生長的相同生物體時(shí)，使用相對(duì)生長速率比使用絕對(duì)生長速率作為比較標(biāo)準(zhǔn)更有意義。相對(duì)生長速率(0)為生長速率(μ)對(duì)最大生長速率(μ_)的比率，即0=μ/μχ0可以看到，當(dāng)μ和μ_的量綱為(倍數(shù)廣1時(shí)，其比率0為無量綱，即純數(shù)。類似地，我們能定義相對(duì)抑制劑濃度ε為ρ/ρα5。簡化的莫諾德和對(duì)數(shù)劑量反應(yīng)公式現(xiàn)在可寫作0=1/(1+εb)D對(duì)于兩種抑制劑X和Y，例如，可以定義以下兩種0的表達(dá)式0X=1/(1+εbl)及Oy=1/(1+εb2)。Ox和Oy能通過檢查X或Y對(duì)于靶標(biāo)生物體生長速率的抑制作用在實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行估計(jì)。知道Ox和Oy的評(píng)估函數(shù)，理論性的獨(dú)立影響定義為0X*Oy。實(shí)驗(yàn)中觀察到的X和Y的組合對(duì)相對(duì)生長速率的作用定義為oxy。X、Y彼此獨(dú)立對(duì)特定生物體產(chǎn)生作用的假說在數(shù)學(xué)上轉(zhuǎn)化成Oxy/Ox·Oy=1。對(duì)此假說的否定暗示了X和Y的組合作用不是獨(dú)立的作用，而是協(xié)同或拮抗作用。在抑制劑X和Y協(xié)同地作用于靶標(biāo)生物體的情況下，oxy/ox·Oy<1(但>0)。在抑制劑X和Y的組合作用的情況下，oxy/ox·Oy>1。協(xié)同性，獨(dú)立作用以及拮抗性，能顯示在Oxy對(duì)Ox·Oy的作圖中。這在圖1-4中有示例，其中，對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌(ATCC13311)和腸炎沙門氏菌(ATCC13076)給出了0。xe.(單甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，實(shí)驗(yàn)中觀察到的相對(duì)生長速率)對(duì)Ocxg·(單甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，預(yù)期的相對(duì)生長速率)的不同作圖，顯示出乳酸酯(鹽)和多聚賴氨酸之間抑制作用的協(xié)同性。該圖中的實(shí)線代表了其中實(shí)驗(yàn)中觀察的相對(duì)生長速率(Oex^ys)等于預(yù)期的相對(duì)生長速率(0μ·0ρ_)的線，其中乳酸酯(鹽)和多聚賴氨酸作為獨(dú)立的抑制劑起作用。圖1為在C8-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，鼠傷寒沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)中觀察的相對(duì)生長速率(Omfys)對(duì)在C8-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，預(yù)期的相對(duì)生長速率(Oc8c·0pLys)的作圖。圖2為在C8-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，腸炎沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)中觀察的相對(duì)生長速率對(duì)在C8-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，預(yù)期的相對(duì)生長速率(0C8G·0pLys)的作圖。圖3為在ClO-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，鼠傷寒沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)中觀察的相對(duì)生長速率對(duì)在CIO-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，預(yù)期的相對(duì)生長速率(Ociog·0pLys)的作圖。圖4為在ClO-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，腸炎沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)中觀察的相對(duì)生長速率(0α(κ;.ρ_)對(duì)在CIO-甘油酯和多聚賴氨酸混合物存在下，預(yù)期的相對(duì)生長速率(Ociog·0pLys)的作圖。圖1-4指出，在所測(cè)試的不同組合中，多聚賴氨酸和甘油酯對(duì)靶標(biāo)生物體協(xié)同作用，0xy/0x·Oy<1且>0(由實(shí)線下的點(diǎn)表示)。表1中給出了協(xié)同性的進(jìn)一步的實(shí)例，例如0.0225%(w/w)多聚賴氨酸和0.12%(w/w)C8-甘油酯或0.0225%(w/w)多聚賴氨酸和0.09%(w/w)ClO-甘油酯之間的協(xié)同性。在表中可以觀察到，大腸埃希氏菌(ATCC8739)、大腸埃希氏菌血清型0157:H7(ATCC700728)，鼠傷寒沙門氏菌(ATCC13311)或腸炎沙門氏菌(ATCC13076)在含有0.0225%(w/w)多聚賴氨酸和0.12%(w/w)C8-甘油酯或者0.0225%(w/w)多聚賴氨酸和0.09%(W/W)C10-甘油酯的培養(yǎng)基中的相對(duì)生長速率在所有情況下都低于根據(jù)這些生物體在含有多聚賴氨酸或這些甘油酯之一的培養(yǎng)基中相對(duì)生長速率的預(yù)期值。表1協(xié)同性的實(shí)例==:觀察的相對(duì)生長速率C8-甘油酯多聚賴氨酸C8-甘油酯加多聚賴氨酸化合物濃度(w/w)0.120%0.0225%_0.12%/0.0225%大腸埃希氏菌ATCC8739~1.08450.75700.0000大腸桿菌0157:H7ATCC7007280.94100.83150.0000鼠傷寒沙門氏菌ATCC133110.40350.96530.0000腸炎沙門氏菌ATCC13076_0.52200.9945_0.0730_~=觀察的相對(duì)生長速率=ClO-甘油酯多聚賴氨酸ClO-甘油酯加多聚賴氨酸化合物濃度(w/w)0.090%0.0225%_0.09%/0.0225%大腸桿菌0157:H7ATCC700728~0.86850.58500.0000鼠傷寒沙門氏菌ATCC133110.46130.99100.0000腸炎沙門氏菌ATCC130760.89600.9600_0.0000__^^^^^aeB^^a^g^^^ssss^^aaBass^^Bai—^^^^^gagggsssgBgai^^^gagi■■■gaa^a·■gaaaaag"丨1ιι.ι,.-■■丨丨丨.■■，.aaa^^^^^^^aaaa^^^BSsasa丨·■■丨.....ι實(shí)施例2警污染的雞排及牛奶中的抗微生物作用材料和方法培養(yǎng)物及培養(yǎng)條件鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311及大腸埃希氏菌0157:Η7ATCC700728于含有腦心浸劑肉湯的滅菌螺旋蓋管中，30°C下培養(yǎng)18-24小時(shí)。雞排(chickenfilet)的制備將雞排(150-200g)切好，真空包裝，儲(chǔ)存于4-7°C。接著雞排通過Y-輻射(平均輻射劑量12千戈瑞)滅菌。用鼠傷寒沙門氏菌接種雞排。將腦心浸劑肉湯中的鼠傷寒沙門氏菌的Iml過夜培養(yǎng)物用滅菌的0.8%(w/v)NaCl和O.(w/v)蛋白胨稀釋IOOO倍。將0.5ml的該稀釋培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至雞排的一側(cè)。通過輕柔摩擦雞排的整個(gè)表面分散接種物。對(duì)于雞排另一側(cè)重復(fù)該步驟。在6°C下進(jìn)行接種。接種的雞排于6°C下靜置60-120分鐘以使細(xì)胞附著。雞排的去污染將雞排簡短地蘸入并完全浸沒于IL含有適當(dāng)制劑的溶液中，然后轉(zhuǎn)移至含有5ml適當(dāng)制劑的400ml的BagfiIter側(cè)濾袋(Interscience,StNom,France)中。將袋子真空密封并于12°C下孵育多至7天，直到進(jìn)行進(jìn)一步分析。蘸入后30分鐘內(nèi)對(duì)O時(shí)間點(diǎn)樣品鋪板。雞排的微生物分析雞排上的存活鼠傷寒沙門氏菌按如下方法計(jì)數(shù)打開密封袋，向其中加入2倍凈重的滅菌稀釋液體(8.5%(W/v)NaCl和0.1%(w/v)細(xì)菌學(xué)蛋白胨)。將兩份相同的的雞排于Bagmixer400板實(shí)驗(yàn)室混合器(Interscience，StNom，F(xiàn)rance)中進(jìn)行1分鐘的均一化。使用Eddyjet1.23型螺旋鋪板儀(IULInstruments,巴塞羅那，西班牙)將50μ1的均一物或其稀釋液鋪于兩份相同的含有頭孢磺啶(cefsulodin)、新生霉素(novobiocin)補(bǔ)充物(SR0194)(Oxoid，貝辛斯托克，英國)的沙門氏菌屬顯色瓊脂平板(CM1007)上。平板在30°C下孵育24-48小時(shí)，然后計(jì)數(shù)。沙門氏菌屬的數(shù)量表示為每ml均一物的Iogltl菌落形成單位。接種用抗微生物制劑處理過的牛奶從地方超市購買滅菌的低脂牛奶，將IOOml的量轉(zhuǎn)移至一系列滅菌螺旋蓋瓶中。加入ε“多聚賴氨酸、甘油單/二辛酸酯鈉鹽(C8單/二甘油酯)和甘油單/二癸酸酯鈉鹽(C10單/二甘油酯)至表2中顯示的濃度。用大腸埃希氏菌0157:Η7的過夜培養(yǎng)物接種不同的牛奶制品。起始細(xì)胞密度為Iogltl2.5-3.0。牛奶培養(yǎng)物的微生物分析存活的大腸埃希氏菌0157:Η7按如下方法計(jì)數(shù)使用Eddyjetl.23型螺旋鋪板儀(IULInstruments巴塞羅那，西班牙)將兩份相同的50μ1牛奶培養(yǎng)物樣品或其稀釋液鋪于兩份相同的VioletRedBileGlucose(VRBG)瓊脂板(CM0485Oxoid，貝辛斯托克，英國)上。平板在30°C下孵育24-48小時(shí)，然后計(jì)數(shù)。大腸埃希氏菌的數(shù)量表示為每ml均一物的Iog10菌落形成單位。制備抗微生物制劑所研究的制劑的組合物表示在表2中。ε_(tái)多聚賴氨酸和單/二甘油酯溶解于去礦物質(zhì)水中，于120°C下滅菌20分鐘。表2.抗微生物制劑的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>化學(xué)品ε-多聚賴氨酸購自ChissoAmericaIns(紐約，美國)。甘油單/二辛酸酯(C8單/二甘油酯)和甘油單/二癸酸酯(C10單/二甘油酯)的鈉鹽購自CaravanIngredients(萊尼克薩，堪薩斯，美國)。雞排的去污染結(jié)果雞排上存在的鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311暴露于ε-多聚賴氨酸與單/二甘油酯的組合引起存活細(xì)胞的數(shù)量幾乎立刻減少大約90%(表3)。一天后，在12°C下，數(shù)量的減少超過41og1(l。所測(cè)試的組合對(duì)生長的抑制不是永久的；4天后，數(shù)量有所增加，盡管孵育7天后制劑和空白之間的差異不會(huì)少于21og1(l，而且微生物活性仍然存在。表3:12°C下，ε-多聚賴氨酸(ε"PL)與單/二甘油酯的組合對(duì)雞排上鼠傷寒沙門氏菌的作用；以Iogltl菌落形成單位(CFU)/ml表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>各自地，沒有ε-多聚賴氨酸存在時(shí)，甘油酯不顯示任何殺傷或生長抑制作用(表4)。ε-多聚賴氨酸自身減少細(xì)胞數(shù)量，但是作用小于其與脂肪酸衍生物之一組合的情況。這一點(diǎn)在孵育一天后尤其明顯。而對(duì)于組合在數(shù)量上減少的范圍在41og1(l到51og1(l之間(表3)，對(duì)于單獨(dú)添加的ε-多聚賴氨酸，減少量僅為21og1(1(表4)。這表明ε-多聚賴氨酸和脂肪酸衍生物之間在抑制作用上具有一種形式的協(xié)同性。這由體外研究得以證實(shí)，其中這些組合的作用在肉湯中進(jìn)行研究(實(shí)驗(yàn)1)。表4:12°C下，ε-多聚賴氨酸和C8、ClO單/二甘油酯對(duì)雞排上鼠傷寒沙門氏菌各自的作用；以Iogltl菌落形成單位(CFU)/ml表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>牛奶中對(duì)大腸埃希氏菌0157:H7的抑制結(jié)果對(duì)于在脫脂牛奶中生長的大腸埃希氏菌0157:H7，也觀察到ε-多聚賴氨酸和單/二甘油酯的組合對(duì)生長的強(qiáng)烈抑制(表5)。表5:12°C下，ε-多聚賴氨酸(ε"PL)和單/二甘油酯的組合對(duì)牛奶中大腸埃希氏菌0157:H7的作用；以IoglO菌落形成單位(CFU)/ml。(ND無數(shù)據(jù))<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與雞排相反，沒有觀察到初始的殺傷。ε-多聚賴氨酸和C8-單/二甘油酯(甘油單/二辛酸酯)的組合尤其有效。權(quán)利要求用于減少或阻止產(chǎn)品之中或表面之上的革蘭氏陰性細(xì)菌的活性、生長或存在的方法，包括將所述產(chǎn)品或表面與包括a)甘油的酯和脂肪酸以及b)多聚賴氨酸或多聚賴氨酸的鹽或其混合物的組合物接觸，其中所述甘油的酯和脂肪酸用作抗菌試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述甘油的脂肪酸酯為甘油的單_或二-酯或其混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述脂肪酸選自己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸及其混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中多聚賴氨酸為ε-多聚賴氨酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種有機(jī)酸或其鹽或酯，或者其混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種金屬螯合試劑。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種乳酸酯(鹽)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的方法，其中所述組合物為液體或固體的形式，并且其中組合物包括從0.0001到45wt%的甘油的酯和脂肪酸，從0.0001到40wt%的多聚賴氨酸或其鹽或其混合物，從0到45wt%的乳酸酯(鹽)，從0到45wt%的有機(jī)酸或其鹽或酯或其混合物，從0到98wt%的載體及從0到20wt%的乳化劑。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的方法，其中所述組合物與來自大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬或假單胞菌屬家族的細(xì)菌接觸。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)品在制造、處理、儲(chǔ)存或制備產(chǎn)品的一個(gè)或多個(gè)階段中與組合物接觸。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)品為用于人類消費(fèi)的食物或飲品產(chǎn)品、用于動(dòng)物消費(fèi)的飼料或食物產(chǎn)品、清潔產(chǎn)品、去污劑、化妝品產(chǎn)品或個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。12.在包括多聚賴氨酸或多聚賴氨酸的鹽或其混合物的組合物中，甘油的酯和脂肪酸作為抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌試劑，用于減少或阻止產(chǎn)品或表面之中或之上的革蘭氏陰性細(xì)菌的活性的用途。13.根據(jù)權(quán)利要求12的甘油脂肪酸酯的用途，用于抗大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬或假單胞菌屬家族的革蘭氏細(xì)菌。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的甘油脂肪酸酯的用途，其中產(chǎn)品是用于動(dòng)物或用于人類消費(fèi)的食物或飲品產(chǎn)品，或者清潔產(chǎn)品或去污劑，或者化妝品或個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。全文摘要本發(fā)明涉及用于阻止和/或減少革蘭氏陰性細(xì)菌的存在、生長和/或活性的方法，包括應(yīng)用包括基于甘油的脂肪酸酯和多聚賴氨酸和/或多聚賴氨酸的鹽的組合物，其中所述甘油的脂肪酸酯用作抗菌試劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述組合物在多種產(chǎn)品中用作抗菌試劑的用途，所述產(chǎn)品從技術(shù)產(chǎn)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品到用于動(dòng)物和人消費(fèi)的食物和飲品產(chǎn)品。文檔編號(hào)A23L3/3517GK101801223SQ200880107457公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年9月17日優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日發(fā)明者A·M·拉米雷斯,D·R·克莫爾,R·奧托申請(qǐng)人:普拉克生化公司