專利名稱：：微生物濃集方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于捕集或濃集微生物使得它們保持活力以便檢測(cè)或測(cè)定的方法。在其他方面，本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述濃集方法的濃集劑(及其制備方法)和診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：由微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病和醫(yī)院內(nèi)獲得性感染為世界各地關(guān)注的問(wèn)題。因此，測(cè)定各種診斷樣品、食品樣品、環(huán)境樣品或其他樣品中細(xì)菌或其他微生物的存在以確定所存在的微生物的身份和/或量常常是合乎需要的或是必要的。例如，可測(cè)定細(xì)菌DNA或細(xì)菌RNA，以甚至在存在其他細(xì)菌種類的情況下評(píng)估特定細(xì)菌種類的存在與否。然而，檢測(cè)特定細(xì)菌的存在的能力至少部分取決于被分析的樣品中細(xì)菌的濃度?？蓪?duì)細(xì)菌樣品進(jìn)行鋪板或培養(yǎng)，以增加樣品中細(xì)菌的數(shù)量，來(lái)確保足夠的檢測(cè)水平，但培養(yǎng)步驟通常需要大量的時(shí)間且因此會(huì)明顯耽擱評(píng)估結(jié)果。使樣品中的細(xì)菌濃集可縮短培養(yǎng)時(shí)間或甚至消除對(duì)于培養(yǎng)步驟的需要。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了通過(guò)使用特定細(xì)菌菌株的特異性抗體(例如，為抗體包被的磁性顆?；蚍谴判灶w粒的形式)來(lái)分離(并由此濃集)該菌株的方法。然而，這些方法往往昂貴，而且對(duì)于至少一些診斷應(yīng)用來(lái)說(shuō)速度仍比期望的稍慢。也已經(jīng)使用了非菌株特異性的濃集方法(例如是對(duì)樣品中存在的微生物作較為一般性的評(píng)估)。在濃集了微生物混合群體之后，如果需要，可通過(guò)使用菌株特異性探針來(lái)測(cè)定特定菌株的存在。已經(jīng)通過(guò)基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法實(shí)現(xiàn)了微生物的非特異性濃集或捕集。涂覆殼聚糖的支持物已經(jīng)被用作非特異性捕集裝置，并且用作微生物營(yíng)養(yǎng)素的物質(zhì)(例如，碳水化合物、維生素、鐵螯合的化合物以及鐵載體)也已經(jīng)被描述為可用作配體以進(jìn)行微生物的非特異性捕集。多種無(wú)機(jī)材料(例如，羥基磷灰石和金屬氫氧化物)已經(jīng)用于非特異性結(jié)合和濃集細(xì)菌。物理濃集方法(例如，過(guò)濾、色譜、離心和重力沉降)也已經(jīng)用于非特異性捕集，其使用和/或不使用無(wú)機(jī)結(jié)合劑。這些非特異性濃集方法在速度、成本(至少一些需要昂貴的設(shè)備、材料和/或受過(guò)訓(xùn)練的技術(shù)人員)、樣品要求(例如，樣品性質(zhì)和/或體積限制)、空間要求、使用的方便性(至少一些需要復(fù)雜的多步驟方法)、現(xiàn)場(chǎng)使用的適合性和/或效果方面不同。
發(fā)明內(nèi)容因此，我們認(rèn)為迫切需要用于快速檢測(cè)病原微生物的方法。所述方法將優(yōu)選不僅快速而且成本低、簡(jiǎn)單(不涉及復(fù)雜的設(shè)備或程序)和/或在多種條件下(例如，不同類型樣品基質(zhì)、不同細(xì)菌負(fù)荷以及不同樣品體積)有效。簡(jiǎn)而言之，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于非特異性濃集樣品中存在的微生物菌株(例如，細(xì)菌、真菌、酵母菌、原生動(dòng)物、病毒(包括無(wú)包膜病毒和有包膜病毒)和細(xì)菌內(nèi)生孢子的菌株)使得微生物保留活力以便檢測(cè)或測(cè)定一種或多種菌株的方法。所述方法包括(a)提供濃集劑(優(yōu)選粒狀濃集劑)，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微微細(xì)納米級(jí)金或鉬，或它們的組合；(b)提供包含至少一種微生物菌株的樣品(優(yōu)選流體形式)；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸(優(yōu)選通過(guò)混合接觸)，使得所述至少一種微生物菌株的至少一部分被所述濃集劑結(jié)合或捕集。優(yōu)選地，所述方法還包括檢測(cè)所述至少一種結(jié)合的微生物菌株的存在(例如，通過(guò)基于培養(yǎng)的檢測(cè)方法、顯微鏡法/成像檢測(cè)方法、基因檢測(cè)方法、基于生物發(fā)光的檢測(cè)方法或免疫檢測(cè)方法)和/或離析(優(yōu)選地，通過(guò)重力沉降)所得的結(jié)合微生物的濃集劑。所述方法還可任選包括將所得的離析的濃集劑與樣品分離。本發(fā)明的方法不靶向特定的微生物菌株。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些較便宜的無(wú)機(jī)材料可令人驚訝地有效捕集多種微生物。這類材料可以以非菌株特異性方式濃集存在于樣品(例如，食品樣品)中的微生物菌株，使得可較容易且快速地測(cè)定一種或多種微生物菌株(優(yōu)選地，一種或多種細(xì)菌菌株)。本發(fā)明的方法相對(duì)簡(jiǎn)單且成本低(不需要復(fù)雜的設(shè)備或昂貴的菌株特異性材料)，并且相對(duì)快速(相對(duì)于對(duì)應(yīng)的無(wú)濃集劑的對(duì)照樣品，優(yōu)選的實(shí)施例在少于約30分鐘捕集存在于樣品中的至少約70%(更優(yōu)選地，至少約80%；最優(yōu)選地，至少約90%)的微生物)。另外，所述方法可對(duì)于多種微生物(包括諸如革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌之類的病原體)和多種樣品(不同的樣品基質(zhì)，并且與至少一些現(xiàn)有技術(shù)的方法不同的是，即使具有低微生物含量和/或大體積的樣品)有效。因此，本發(fā)明的方法的至少一些實(shí)施例可滿足上述對(duì)于在多種條件下快速檢測(cè)病原微生物的低成本、簡(jiǎn)單方法的迫切需要。在另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的診斷試劑盒，所述試劑盒包括(a)濃集劑(優(yōu)選粒狀濃集劑)，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微微細(xì)納米級(jí)金或鉬，或它們的組合；和(b)用于實(shí)施本發(fā)明方法的檢測(cè)容器(優(yōu)選無(wú)菌檢測(cè)容器)。優(yōu)選地，所述診斷試劑盒還包括一種或多種選自以下的組分微生物培養(yǎng)基、裂解試齊U、緩沖劑、基因檢測(cè)分析組分、生物發(fā)光檢測(cè)分析組件、用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)以及它們的組合。在又一方面，本發(fā)明提供了一種濃集劑，所述濃集劑位于粒狀載體上，所述濃集劑包括二氧化鈦、微微細(xì)納米級(jí)金或鉬，或它們的組合，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合。在還一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備濃集劑的方法，所述方法包括(a)提供粒狀載體，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合；和(b)通過(guò)物理氣相沉積將微細(xì)納米級(jí)金或鉬沉積于所述載體上。在又一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備濃集劑的方法，所述方法包括(a)提供粒狀載體，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合；(b)提供可水解的二氧化鈦前體化合物；(C)將所述載體和所述化合物組合；以及(d)水解所述化合物，使得將二氧化鈦沉積于所述載體上。根據(jù)下文的具體實(shí)施方式、隨附的權(quán)利要求以及附圖，本發(fā)明的這些和其他特征、方面以及優(yōu)點(diǎn)將更好理解，其中圖1顯示了一種裝置的側(cè)面剖面圖，該裝置用于制備用以實(shí)施本發(fā)明方法的實(shí)施例(下文實(shí)例部分中描述)的濃集劑。圖2顯示了圖1裝置的透視圖。這些理想化的附圖不是按比例來(lái)繪制的，并且旨在僅作為例示和非限制性的。具體實(shí)施例方式如本專利申請(qǐng)中所使用的“樣品”是指所采集的(例如，待分析的)的物質(zhì)或材料?！皹悠坊|(zhì)”是指除了微生物以外的樣品組分?！皺z測(cè)”是指鑒定微生物的至少一種組分，由此測(cè)定該微生物的存在?！盎驒z測(cè)”是指對(duì)衍生自靶微生物的遺傳物質(zhì)組分如DNA或RNA的鑒定?！懊庖邫z測(cè)”是指對(duì)衍生自靶微生物的抗原物質(zhì)如蛋白質(zhì)或蛋白多糖的鑒定?！拔⑸铩笔侵妇哂羞m于分析或檢測(cè)的遺傳物質(zhì)的任何細(xì)胞，包括，例如細(xì)菌、酵母菌、病毒和細(xì)菌內(nèi)生孢子?！拔⑸锞辍笔侵缚赏ㄟ^(guò)檢測(cè)方法區(qū)分的特定類型的微生物，例如，不同屬的微生物，屬內(nèi)不同種的微生物或種內(nèi)不同分離菌株的微生物)?！鞍形⑸铩笔侵感枰獧z測(cè)的任何微生物。濃集劑適用于實(shí)施本發(fā)明方法的濃集劑包括包含硅藻土的那些濃集劑，所述硅藻土在其表面的至少一部分帶有表面處理，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉬，或它們的組合。使用上述濃集劑進(jìn)行的濃集或捕集通常對(duì)于任何特定菌株、種或類型的微生物來(lái)說(shuō)是非特異性的，因此提供了對(duì)樣品中微生物全體群落的濃集。然后，可使用任何已知的檢測(cè)方法使用菌株特異性探針從捕集的微生物群落中檢測(cè)特定的微生物菌株。因此，所述濃集劑可用于檢測(cè)臨床樣品、食品樣品、環(huán)境樣品或其它樣品中的微生物污染物或病原體(特別是食源性病原體，例如細(xì)菌)。在實(shí)施本發(fā)明方法中，可以以適于樣品接觸和微生物捕集的任何形式(例如，以顆粒形式或施加到支持物，例如浸漬片、薄膜、過(guò)濾器、試管、微孔、培養(yǎng)板、珠、膜或微流體裝置的通道等)使用所述濃集劑。優(yōu)選地，以顆粒形式使用所述濃集劑。無(wú)機(jī)材料當(dāng)分散或懸浮于水系統(tǒng)中時(shí)，顯示出表征該材料和水系統(tǒng)pH的表面電荷。該材料-水界面的電位稱為電位”，這可從電泳遷移率(即，從該材料顆粒在置于水系統(tǒng)中的帶電電極之間移動(dòng)的速率)計(jì)算得到。至少一些用于實(shí)施本發(fā)明方法的濃集劑其ζ電位為比未處理的硅藻土的ζ電位至少稍大的正值，所述濃集劑可令人驚訝地比未處理的硅藻土顯著更有效地濃集微生物如細(xì)菌，所述微生物表面通常傾向于帶負(fù)電荷。優(yōu)選地，所述濃集劑在約7的pH具有負(fù)ζ電位(更優(yōu)選地，在約7的ρΗ具有范圍在約-5豪伏至約-20豪伏的ζ電位；甚至更優(yōu)選地，在約7的ρΗ具有范圍在約-8豪伏至約-19豪伏的ζ電位；最優(yōu)選地，在約7的ρΗ具有范圍在約-10豪伏至約-18豪伏的ζ電位)。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含某些種類的經(jīng)表面處理或表面修飾的硅藻土(即，帶有包括表面修飾劑的表面處理，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉬或它們的組合)的濃集劑可令人驚訝地比未處理的硅藻土更有效地濃集微生物。所述表面處理優(yōu)選還包括選自氧化鐵、氧化鋅、氧化鋁等以及它們的組合(更優(yōu)選氧化鐵)的金屬氧化物。盡管已知諸如金的貴金屬表現(xiàn)有抗微生物的特性，但用于本發(fā)明方法的含金濃集劑令人驚訝地不僅可有效濃集微生物，還可有效保持它們具有活力以便檢測(cè)或測(cè)定。有用的表面修飾劑包括微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與至少一種金屬氧化物(優(yōu)選二氧化鈦、氧化鐵或它們的組合)組合、二氧化鈦、二氧化鈦與至少一種其它的金屬氧化物(即，除了二氧化鈦)組合等，以及它們的組合。優(yōu)選的表面修飾劑包括微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與至少氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與至少氧化鐵的組合，以及它們的組合。更優(yōu)選的表面修飾劑包括微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合(甚至更優(yōu)選微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合)。最優(yōu)選的是微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合以及它們的組合。金和/或鉑包含微細(xì)納米級(jí)金或鉬的濃集劑可通過(guò)物理氣相沉積(任選地，通過(guò)在氧化氣氛中的物理氣相沉積)將金或鉬沉積于硅藻土上而制備。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“微細(xì)納米級(jí)金或鉬”是指其所有維度尺寸小于或等于5納米(nm)的金或鉬團(tuán)粒(例如，顆?；蛟哟?。優(yōu)選地，至少一部分沉積的金或鉬其所有維度(例如，粒徑或原子簇直徑)平均尺寸在最高達(dá)(小于或等于)約IOnm的范圍(更優(yōu)選最高達(dá)約5nm，甚至更優(yōu)選最高達(dá)約3nm)。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，至少一部分金是超納米級(jí)(即，其至少兩個(gè)維度尺寸小于0.5nm且所有維度尺寸小于1.5nm。單個(gè)金或鉬納米顆粒的尺寸可通過(guò)透射電子顯微術(shù)(TEM)分析來(lái)測(cè)定，這是本領(lǐng)域熟知的。在硅藻土上提供的金或鉬的量可在很大范圍變動(dòng)。因?yàn)榻鸷豌f昂貴，理想的是所用的金和鉬量不多于為達(dá)到所需程度的濃集活性而合理需要的量。另外，因?yàn)楫?dāng)使用PVD進(jìn)行沉積時(shí)納米級(jí)金或鉬可具有高度移動(dòng)性，如果使用太多金或鉬則由于至少一些金或鉬聚結(jié)成大的團(tuán)粒可能損失活性。出于這些原因，基于硅藻土和金或鉬的總重量，硅藻土上金或鉬的載重優(yōu)選為約0.005(更優(yōu)選0.05)至約10重量百分?jǐn)?shù)的范圍，更優(yōu)選約0.005(甚至更優(yōu)選0.05)至約5重量百分?jǐn)?shù)，甚至更優(yōu)選約0.005(最優(yōu)選0.05)至約2.5重量百分?jǐn)?shù)。可通過(guò)PVD技術(shù)(例如通過(guò)濺射)沉積金和鉬來(lái)在載體表面上形成具有濃集活性的細(xì)納米級(jí)顆?；蛟哟?。據(jù)信金屬主要以元素形式沉積，盡管還可存在其它氧化態(tài)。除了金和/或鉬，還可在相同的硅藻土載體上和/或在其它與含金和/或鉬的載體相互混合的其它載體上提供一種或多種其它金屬。這樣的其它金屬的例子包括銀、鈀、銠、釕、鋨、銅、銥等，以及它們的組合。如果使用的話，這些其它金屬可從與所使用的金或鉬源靶相同或不同的靶源共沉積到載體上?；蛘撸@些金屬可在金和/或鉬沉積之前或之后提供在載體上。需要熱處理來(lái)進(jìn)行活化的金屬可有利地在沉積金和/或鉬之前先施加到載體并進(jìn)行熱處理。物理氣相沉積是指金屬?gòu)暮饘俚膩?lái)源或靶物理轉(zhuǎn)移至載體介質(zhì)。物理氣相沉積可被視為涉及一個(gè)原子接一個(gè)原子地沉積，盡管在實(shí)際操作中金屬可作為極其細(xì)小的團(tuán)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，每個(gè)團(tuán)粒由不止一個(gè)原子構(gòu)成。沉積的金屬可與載體介質(zhì)的表面發(fā)生物理形式的、化學(xué)形式的、離子形式和/或其它形式的相互作用。物理氣相沉積優(yōu)選在金屬移動(dòng)性很強(qiáng)并傾向于在載體介質(zhì)表面上遷移直至以某種方式(例如，通過(guò)粘附到載體表面上的某一部位或非?？拷d體表面的某一部位)被固定化為止的溫度和真空條件下進(jìn)行。粘附部位可包括缺陷處(例如表面空位)、結(jié)構(gòu)的間斷處(例如臺(tái)階和位錯(cuò))以及相或晶體或其它金屬物質(zhì)(例如小金屬簇)之間的界面邊界。通過(guò)PVD沉積的金屬明顯地充分被固定化，使得金屬可保留高水平的活性。相比之下，常規(guī)的方法常常使得金屬聚結(jié)成大的團(tuán)粒從而使活性受損甚至喪失?？梢砸圆煌绞絹?lái)進(jìn)行物理氣相沉積。代表性的方法包括濺射沉積(優(yōu)選)、蒸發(fā)以及陰極電弧沉積。任何這些或其它PVD方法可用于制備用于實(shí)施本發(fā)明方法的濃集劑，但PVD技術(shù)的性質(zhì)可影響所得的活性。例如，物理氣相沉積技術(shù)的能量可影響沉積的金屬的移動(dòng)性并因此影響其聚結(jié)趨向。更高的能量趨向?qū)?yīng)于金屬聚結(jié)趨向增加。聚結(jié)增加又趨向減小活性。通常，沉積物質(zhì)的能量對(duì)于蒸發(fā)來(lái)說(shuō)最低，對(duì)于濺射來(lái)說(shuō)較高(可包括其中一小部分碰撞的金屬被離子化的一定離子含量)，對(duì)于陰極電弧沉積來(lái)說(shuō)最高(可包括百分之幾十的離子含量)。因此，如果一種具體的PVD技術(shù)所得到的沉積金屬其移動(dòng)性大于所期望的，則改為使用較小能量的PVD技術(shù)是有用的。物理氣相沉積優(yōu)選在充分混合(例如，翻滾、流態(tài)化、碾磨等)待處理載體介質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行，以確保載體表面得到充分處理。翻滾顆粒以供通過(guò)PVD進(jìn)行沉積的方法在美國(guó)專利號(hào)4，618，525(Chamberlain等人)中描述，將其說(shuō)明內(nèi)容以引用方式并入本文中。當(dāng)在微細(xì)顆?；蛭⒓?xì)顆粒團(tuán)聚物(例如，平均直徑小于約10微米)上進(jìn)行PVD時(shí)，優(yōu)選在至少一部分PVD過(guò)程中將載體介質(zhì)混合并粉碎(例如，研磨或碾磨至一定程度)這可有助于在沉積過(guò)程中保持顆?；驁F(tuán)聚物的分離和自由流動(dòng)。在微細(xì)顆粒或微細(xì)顆粒團(tuán)聚物的情況下，在仍保持金屬的可控沉積的同時(shí)使顆粒的混合盡可能劇烈和快速是有利的?？赏ㄟ^(guò)使用目前所使用或?qū)?lái)開(kāi)發(fā)用于該目的的任何類型的裝置來(lái)進(jìn)行PVD。不過(guò)，在附圖1和2中顯示了優(yōu)選的裝置10。所述裝置10包括殼體12，所述殼體12限定真空室14，所述真空室14含有顆粒攪拌器16。所述殼體12(如果需要的話，可由鋁合金制造)是垂直取向的中空?qǐng)A筒體(例如，高45cm，直徑50cm)。基座18具有高真空閘閥22的出口20，高真空閘閥后接15.2cm(6英寸)擴(kuò)散泵24和顆粒攪拌器16的支撐體26。所述真空室14能夠被抽真空成1.13mPa(10_6托)范圍的背景壓力。所述殼體12的頂部包括可拆卸的用L形橡膠墊圈密封的板28，該板配有安裝在外的、7.6cm(3英寸)直徑的直流電(dc)磁控管濺射沉積源30(USGunII，US,INC.，SanJose,CA)。所述濺射沉積源30中固定有金或鉬濺射靶32[例如，7.6cm(3.O英寸)直徑X0.48cm(3/16英寸)厚度]。濺射沉積源30由配有Sparc-Ie20消弧系統(tǒng)(AdvancedEnergyIndustries,Inc,FortCollins,CO)的MDX-10磁控管驅(qū)動(dòng)器(AdvancedEnergyIndustries,Inc,FortCollins,CO)提供動(dòng)力。顆粒攪拌器16為具有矩形開(kāi)口34(例如，6.5cmX7.5cm)的中空?qǐng)A筒體(例如12cm長(zhǎng)X9.5cm直徑，臥式)開(kāi)口34被設(shè)置在金濺射靶32的表面36正下方約7cm，使得濺射的金原子可進(jìn)入攪拌器的腔體38內(nèi)。攪拌器16配有在其軸線上的軸40。軸40具有矩形橫截面(例如，IcmXlcm)，其上栓固四個(gè)矩形的葉片42，該矩形葉片形成用于被翻滾的載體顆粒的攪拌機(jī)構(gòu)或葉輪。每個(gè)葉片42包括兩個(gè)洞44(例如，直徑2cm)，以用于促進(jìn)包含在由葉片42與顆粒攪拌器16形成的四個(gè)扇形體的每一個(gè)中的顆粒體積之間的連通。選擇葉片42的尺寸以使其與攪拌器壁48之間的側(cè)部間距和端部間距為2.7mm或1.7mm。物理氣相沉積可在非常寬泛的范圍內(nèi)的基本上任意所需溫度下進(jìn)行。然而，如果金屬在相對(duì)較低的溫度(例如，在低于約150°C的溫度下，優(yōu)選低于約50°C，更優(yōu)選在環(huán)境溫度下(例如，約20°C至約27°C)或更低)沉積，則沉積的金屬可具有更高的活性(可能歸因于更多的缺陷和/或更低的移動(dòng)性和聚結(jié))通?？蓛?yōu)選在環(huán)境溫度下操作，因?yàn)樵诔练e過(guò)程中不需要加熱或冷卻所以既有效又經(jīng)濟(jì)。物理氣相沉積可在惰性濺射氣氣氛(例如，在氬、氦、氙、氡或它們兩種或多種的混合物中(優(yōu)選氬))下進(jìn)行，任選地，物理氣相沉積在氧化氣氛下進(jìn)行。氧化氣氛優(yōu)選包括至少一種含氧氣體(更優(yōu)選地，選自氧氣、水、過(guò)氧化氫、臭氧以及它們的組合的含氧氣體，甚至更優(yōu)選地，選自氧氣、水以及它們的組合的含氧氣體，最優(yōu)選地，氧氣)。氧化氣氛還包括惰性濺射氣體，例如氬、氦、氙、氡或它們中的兩種或多種的混合物(優(yōu)選氬)。在PVD工藝過(guò)程中真空室中的總氣體壓力(所有氣體)可為約0.13Pa至約3.3Pa(l毫托至約25毫托)[優(yōu)選地，約0.67Pa至約1.9Pa(5毫托至約15毫托]?；谡婵帐抑兴袣怏w的總重量，氧化氣氛可包含約0.05重量％至約60重量％的含氧氣體(優(yōu)選約0.1重量％至約50重量％；更優(yōu)選約0.5重量％至約25重量％)。硅藻土載體介質(zhì)可任選在金屬沉積之前進(jìn)行煅燒，但這可增加其晶體二氧化硅含量。與通過(guò)一些其它方法沉積不同，由于當(dāng)經(jīng)PVD沉積時(shí)金和鉬立即具有活性，通常在金屬沉積之后不需要熱處理。然而，如果需要的話，可進(jìn)行所述熱處理或煅燒，以提高活性。通常，熱處理可涉及在任何合適的氣氛中，例如空氣，諸如氮?dú)?、二氧化碳、氬的惰性氣氛，諸如氫氣等的還原氣氛等，在范圍約125°C至約1000°C的溫度下，加熱載體持續(xù)約1秒至約40小時(shí)、優(yōu)選約1分鐘至約6小時(shí)的時(shí)間。要使用的特定熱條件可取決于多種因素，包括載體性質(zhì)。通常，在比載體組分會(huì)被分解、被降解或以其它方式被不適當(dāng)?shù)責(zé)崞茐牡臏囟鹊臏囟认逻M(jìn)行熱處理。取決于諸如載體性質(zhì)、金屬量等的因素，如果系統(tǒng)在太高溫度下熱處理，活性會(huì)有一定程度的損失。二氧化鈦和/或其它金屬氧化物包含金屬氧化物的濃集劑可通過(guò)水解可水解的金屬氧化物前體化合物而將金屬氧化物沉積在硅藻土上來(lái)制備。合適的金屬氧化物前體化合物包括可被水解而生成金屬氧化物的金屬絡(luò)合物和金屬鹽。有用的金屬絡(luò)合物包括包含醇鹽配體、過(guò)氧化氫配體、羧酸鹽功能配體等以及它們的組合的那些金屬絡(luò)合物。有用的金屬鹽包括金屬硫酸鹽、硝酸鹽、鹵化物、羧酸鹽、草酸鹽、氫氧化物等以及它們的組合。當(dāng)使用金屬鹽或者過(guò)氧化氫配體或羧酸鹽功能配體的金屬絡(luò)合物時(shí)，可通過(guò)化學(xué)方式或熱方式來(lái)誘導(dǎo)水解。在化學(xué)誘導(dǎo)的水解中，可以將金屬鹽以液體形式引入硅藻土的分散體中，所得的組合的PH可通過(guò)添加堿溶液而提高，直至金屬鹽作為金屬的氫氧化物絡(luò)合物沉淀于硅藻土上。合適的堿包括堿金屬和堿土金屬氫氧化物以及碳酸鹽、銨和烷基銨的氫氧化物和碳酸鹽等，以及它們的組合。金屬鹽溶液和堿溶液的濃度通常可為約0.1至約2M。優(yōu)選地，通過(guò)攪拌(優(yōu)選，快速攪拌)硅藻土分散液來(lái)進(jìn)行將金屬鹽添加至硅藻土?？煞珠_(kāi)(以任何順序)或同時(shí)將金屬鹽溶液和堿溶液引入到硅藻土分散液，以實(shí)現(xiàn)所得的金屬氧化物絡(luò)合物與硅藻土表面的優(yōu)選基本均勻的反應(yīng)?？扇芜x在反應(yīng)過(guò)程中加熱反應(yīng)混合物，以加快反應(yīng)速度。通常，所添加的堿的量可等于金屬摩爾量乘以金屬鹽或金屬絡(luò)合物上的非氧和非氫氧反荷離子的量?；蛘?，當(dāng)使用鈦或鐵的鹽時(shí)，可將金屬鹽熱誘導(dǎo)而水解生成金屬氫氧化物絡(luò)合物，并使之與硅藻土表面相互作用。在該情況中，通?？蓪⒔饘冫}溶液添加至已經(jīng)被加熱至足夠高的溫度(例如，大于約50°C)的硅藻土分散液(優(yōu)選，攪拌過(guò)的分散體)，以促進(jìn)金屬鹽水解。優(yōu)選地，溫度在約75°C至100°C之間，但如果在高壓釜裝置中進(jìn)行反應(yīng)的話可使用更高的溫度。當(dāng)使用金屬醇鹽絡(luò)合物時(shí)，可通過(guò)在醇溶液中部分水解金屬醇鹽而誘導(dǎo)金屬絡(luò)合物水解生成金屬的氫氧化物絡(luò)合物。金屬醇鹽在硅藻土的存在下的水解可導(dǎo)致金屬氫氧化物沉積于硅藻土表面。或者，可通過(guò)在硅藻土存在下使氣相金屬醇鹽與水反應(yīng)來(lái)水解金屬醇鹽并使其沉積至硅藻土表面上。在這種情況，可在例如流化床反應(yīng)器或轉(zhuǎn)鼓反應(yīng)器中沉積的過(guò)程中攪拌硅藻土。在上述在硅藻土的存在下水解金屬氧化物前體化合物之后，可通過(guò)沉降或通過(guò)過(guò)濾或通過(guò)其它已知的技術(shù)分離所得的表面處理過(guò)的硅藻土。可通過(guò)用水洗滌來(lái)純化分離的產(chǎn)物，然后可對(duì)其進(jìn)行干燥(例如，在50°C至150°C)。盡管表面處理過(guò)的硅藻土通常在干燥之后可具有功能性，通常任選可通過(guò)在空氣中加熱至約250°C至650°C來(lái)煅燒而去除揮發(fā)性副產(chǎn)物，而不喪失功能。當(dāng)金屬醇鹽用作金屬氧化物前體化合物時(shí)，該煅燒步驟可為優(yōu)選的。通常，對(duì)于鐵的金屬氧化物前體化合物，所得的表面處理包括納米顆粒氧化鐵。當(dāng)氧化鐵與硅藻土的重量比為約0.08時(shí)，X射線衍射(XRD)顯示不存在界限清楚的氧化鐵材料。而在3.80,3.68以及2.94.A觀察到另外的X射線反射。該材料的TEM檢測(cè)顯示硅藻土的表面較均勻地涂覆有球形納米顆粒氧化鐵材料。氧化鐵材料的晶粒尺寸小于約20nm，大部分晶體的直徑小于約lOnm。這些球形晶體在硅藻土表面上的堆積外觀上密集，硅藻土的表面看起來(lái)因這些晶體的存在而變得粗糙。通常，對(duì)于鈦的金屬氧化物前體化合物，所得的表面處理包括納米顆粒二氧化鈦。當(dāng)將二氧化鈦沉積至硅藻土上時(shí)，在煅燒至約350°C之后所得的產(chǎn)物的XRD可顯示存在銳鈦型二氧化鈦的小晶體。在鈦/硅藻土比例較低的情況下或在使用鈦和氧化鐵前體的混合物的情況下，通過(guò)X射線分析通常觀察不到銳鈦型二氧化鈦的跡象。由于熟知二氧化鈦為強(qiáng)效的光氧化催化劑，本發(fā)明的二氧化鈦修飾的硅藻土濃集劑可用于濃集微生物以便分析，并然后還可任選用作光活化劑，以便在使用之后殺死殘留的微生物和去除不想要的有機(jī)雜質(zhì)。因此，二氧化鈦修飾的硅藻土既可分離生物材料以便分析，然后還可進(jìn)行光化學(xué)清潔以便再利用。這些材料也可用于可能需要微生物去除及抗微生物效果的過(guò)濾應(yīng)用中。硅藻土硅藻土是由硅藻(一類海棲微生物)殘骸產(chǎn)生的天然硅質(zhì)材料。因此，它可獲自天然來(lái)源，也可商購(gòu)獲得(例如，來(lái)自AlfaAesar,AJohnsonMattheyCompany,WardHill,ΜΑ)。硅藻土顆粒通常包含對(duì)稱立方體、圓柱體、球形、板形、矩形盒等形式的二氧化硅微小開(kāi)放網(wǎng)絡(luò)。這些顆粒中的孔結(jié)構(gòu)通常可為顯著均勻的。硅藻土可作為未經(jīng)加工的開(kāi)采材料或作為經(jīng)純化和任選碾磨的顆粒用于實(shí)施本發(fā)明方法。優(yōu)選地，硅藻土是直徑尺寸范圍為約1微米至約50微米(更優(yōu)選，約3微米至約10微米)的碾磨的顆粒形式。硅藻土可任選在使用前先進(jìn)行熱處理以去除有機(jī)殘余物的任何殘余。如果使用熱處理，在500°C或更低溫度熱處理可為優(yōu)選的，這是因?yàn)楦叩臏囟瓤僧a(chǎn)生不想要的高水平的晶體二氧化硅。腿本發(fā)明的方法可用于多種不同類型的樣品，包括但不限于醫(yī)學(xué)樣品、環(huán)境樣品、食品樣品、飼料樣品、臨床樣品和實(shí)驗(yàn)室樣品以及它們的組合。醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)樣品可包括(例如)來(lái)自生物來(lái)源(例如，人或動(dòng)物)的待測(cè)定以便進(jìn)行臨床診斷的細(xì)胞、組織或流體。環(huán)境樣品可為(例如)來(lái)自醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)設(shè)施、工業(yè)設(shè)施、土壤、水源、食品制備區(qū)(食品接觸和非接觸區(qū))、實(shí)驗(yàn)室或可潛在遭受生物恐怖的區(qū)域。優(yōu)選的是食品加工、處理以及制備區(qū)樣品，這是因?yàn)檫@些區(qū)域在細(xì)菌病原體導(dǎo)致的食品供應(yīng)污染方面常常受到特別的關(guān)注。以液體形式或以固體于液體中的分散液或懸浮液形式獲得的樣品可直接使用，或可進(jìn)行濃縮(例如，通過(guò)離心)或稀釋(例如，通過(guò)添加緩沖液(控制PH的溶液))。固體或半固體形式的樣品可直接使用，或者，如果需要的話，可通過(guò)某種方法進(jìn)行萃取，所述方法例如用液體介質(zhì)(例如，緩沖液)洗滌或漂洗，或者懸浮或分散于該液體介質(zhì)(例如，緩沖液)中?？蓮谋砻?例如，通過(guò)擦洗或漂洗)獲取樣品。優(yōu)選地，樣品為流體(例如，液體、氣體，或者固體或液體于液體或氣體中的分散體或懸浮液)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明方法的樣品的例子包括食品(例如，新鮮農(nóng)產(chǎn)品或即食型午餐食品或“deli”肉)、飲料(例如，果汁或碳酸鹽飲料)、飲用水和生物流體(例如，全血或其組分，例如血漿，富含血小板的血液級(jí)分、血小板濃縮物或濃縮紅細(xì)胞；細(xì)胞制劑(例如，分散的組織、骨髓抽吸物或椎體骨髓)；細(xì)胞懸浮液；尿液、唾液以及其它體液；骨髓；肺流體；腦流體；傷口滲出物；傷口活檢樣品；眼睛流體；脊髓液等)，以及可使用已知程序例如使用裂解緩沖液生成的裂解制劑，例如細(xì)胞裂解物等。優(yōu)選的樣品包括食品、飲料、引用水、生物流體以及它們的組合(更優(yōu)選為食品、飲料、飲用水以及它們的組合)。樣品體積可根據(jù)具體應(yīng)用而不同。例如，當(dāng)本發(fā)明方法用于診斷或研究應(yīng)用時(shí)，所述樣品的體積通常為微升范圍(例如，10微升或更大)。當(dāng)所述方法用于食品病原體檢測(cè)分析或用于飲用水安全性檢測(cè)時(shí)，樣品的體積可通常為毫升至升的范圍(例如，100毫升至3升)。在工業(yè)應(yīng)用中，例如生物工藝或制藥配方中，所述體積可為成千上萬(wàn)升。本發(fā)明方法可從濃集狀態(tài)的樣品分離微生物，并且還可使得能從可對(duì)待使用的檢測(cè)程序造成限制的樣品基質(zhì)組分分離微生物。在所有這些情況中，本發(fā)明的方法可伴隨或替代微生物濃集的其它方法而使用。因此，任選地，如果需要另外的濃集，可在實(shí)施本發(fā)明方法之前或之后從樣品長(zhǎng)出培養(yǎng)物。^M可通過(guò)多種已知的或?qū)?lái)開(kāi)發(fā)的提供兩種材料之間接觸的方法中的任何方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法。例如，可將濃集劑添加至樣品，或者可將樣品添加至濃集劑。可將涂覆濃集劑的浸漬片浸于樣品溶液中，可將樣品溶液傾注至涂覆濃集劑的薄膜上，可將樣品溶液傾注至涂覆濃集劑的試管或微孔中，或者可將樣品溶液通過(guò)涂覆有濃集劑的過(guò)濾器(例如，織造濾布或非織造濾布)。然而，優(yōu)選地，在多種容器(任選地但也優(yōu)選地，帶蓋的容器、閉合或密封容器，更優(yōu)選地，帶蓋的試管、瓶子或罐)中的任何容器中合并(使用任何添加次序)濃集劑和樣品。用于實(shí)施本發(fā)明方法的合適的容器將由具體樣品決定，可在尺寸和性質(zhì)上大不相同。例如，所述容器可為小容器，例如10微升容器(例如，試管)或更大的容器，例如100毫升或3升容器(例如，三角錐形瓶或聚丙烯大口瓶)。容器、濃集劑以及直接接觸樣品的任何其它裝置或添加劑可在使用前進(jìn)行滅菌(例如，通過(guò)受控?zé)?、環(huán)氧乙烷氣或輻射來(lái)進(jìn)行)，以減少或防止任何可導(dǎo)致檢測(cè)誤差的對(duì)樣品的污染。足以捕集或濃集特定樣品的微生物以便成功檢測(cè)的濃集劑的量是可變動(dòng)的(取決于例如，濃集劑的性質(zhì)和形式以及樣品體積)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，對(duì)于一些應(yīng)用而言，每毫升樣品10毫克濃集劑是實(shí)用的。如果需要，可通過(guò)將粒狀濃集劑至少通過(guò)樣品一次來(lái)實(shí)現(xiàn)接觸(例如，通過(guò)依賴重力沉降例如約10分鐘的一段時(shí)間)?？赏ㄟ^(guò)混合(例如，通過(guò)攪拌、搖動(dòng)或使用振動(dòng)臺(tái))使得濃集劑顆粒反復(fù)經(jīng)過(guò)或沉降入樣品的大部分，來(lái)增強(qiáng)接觸。對(duì)于微升級(jí)的小體積(通常，小于0.5毫升)來(lái)說(shuō)，諸如通過(guò)渦旋或“章動(dòng)”，混合可以是快速的，例如，如美國(guó)專利號(hào)5，238，812(Coulter等人)所述，將其說(shuō)明內(nèi)容以引用方式并入本文中。對(duì)于大于或等于0.5毫升(通常0.5毫升至3升)的較大體積來(lái)說(shuō)，可通過(guò)以“翻跟頭”(endoverend)的方式輕輕翻轉(zhuǎn)粒狀濃集劑和樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)混合，例如，如美國(guó)專利號(hào)5，576，185(Coulter等人)所述，將其說(shuō)明內(nèi)容以引用方式并入本文中?？山柚诶绫辉O(shè)置成固定試管或其它類型反應(yīng)容器并以“翻跟頭”方式緩慢旋轉(zhuǎn)試管或容器的裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)所述翻轉(zhuǎn)?？蛇M(jìn)行接觸達(dá)所需的時(shí)間(例如，對(duì)于等于或小于約100毫升體積的樣品，最多約60分鐘的接觸是有用的；優(yōu)選，約15秒至約10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間；更優(yōu)選，約15秒至5分鐘)。因此，在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，混合(例如，攪動(dòng)、振動(dòng)或攪拌)和/或孵育(例如，在室溫下)是任選的但也是優(yōu)選的，以便增加微生物與濃集劑的接觸。優(yōu)選的接觸方法包括將含微生物的樣品(優(yōu)選流體)與粒狀濃集劑一起混合(例如，約15秒至約5分鐘)和孵育(例如，約3分鐘至約30分鐘)。如果需要，在濃集劑和樣品的組合中，可包括一種或多種添加劑[例如，裂解試劑、生物發(fā)光檢測(cè)試劑、核酸捕集試劑(例如，磁珠)、微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基、緩沖劑(例如，用以潤(rùn)濕固體樣品)、微生物染色試劑、洗滌緩沖液(例如，用以洗除未結(jié)合材料)、洗脫劑(例如，血清白蛋白)、表面活性劑(例如，可從UnionCarbideChemicalsandPlastics(Houston,TX)獲得的TritonX-100非離子型表面活性劑)、機(jī)械磨蝕劑/洗脫劑(例如，玻璃珠)等]。如果需要，可將濃集劑(單獨(dú)，或與例如抗微生物材料和/或與液體(例如水或油)、固體(例如，織物、聚合物、紙或無(wú)機(jī)固體)、凝膠、乳膏、泡沫或糊劑形式的載體材料進(jìn)行組合)施加至或擦涂無(wú)孔或多孔、固體、受微生物污染的或可受微生物污染的材料或表面(例如，用作“清潔”劑)。如果需要，可使用粘合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑或其它性質(zhì)改性劑。對(duì)于這樣的用途，可將濃集劑施加至織造無(wú)或非織造物，并且可施加至一次性表面，例如紙、手巾紙、棉拭子以及多種吸收性和非吸收性材料。例如，可將濃集劑摻入布或紙載體材料，以用作“清潔”擦拭物。可將濃集劑施加至(例如，以包含載體材料的擦拭物或糊劑的形式)固體表面，例如，在家庭、日間護(hù)理、工業(yè)以及醫(yī)院設(shè)施中，用于清洗玩具、設(shè)備、醫(yī)學(xué)裝置、工作表面等。當(dāng)用于清洗或其它目的時(shí)，如果需要，可以以單獨(dú)一個(gè)步驟同時(shí)采集樣品和使其與濃集劑接觸。離析和/或分離任選地但也優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括離析所得的結(jié)合微生物的濃集劑。優(yōu)選可通過(guò)至少部分依賴于重力沉降(重力沉淀，例如，經(jīng)約5分鐘至約30分鐘的時(shí)間)實(shí)現(xiàn)這樣的離析。然而，在一些情況下，可取的是加快離析(例如，通過(guò)離心或過(guò)濾)，或者采用任何所述離析方法的組合。本發(fā)明的方法還可任選包括將所產(chǎn)生的結(jié)合微生物的濃集劑與樣品分離。對(duì)于流體樣品而言，這可涉及去除或分離離析時(shí)產(chǎn)生的上清液?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法(例如，通過(guò)傾析或虹吸，以使得結(jié)合微生物的濃集劑留在用于實(shí)施本發(fā)明方法的容器或器皿的底部)實(shí)現(xiàn)上清液的分離。本發(fā)明的方法可手動(dòng)實(shí)施(例如，以分批方式實(shí)施)或者可為自動(dòng)化的(例如，以使得能夠連續(xù)或半連續(xù)處理)。腿可通過(guò)使用本發(fā)明方法來(lái)濃集并任選但也優(yōu)選地檢測(cè)多種微生物，包括(例如)細(xì)菌、真菌、酵母菌、原生動(dòng)物、病毒(包括無(wú)包膜病毒和有包膜病毒)、細(xì)菌內(nèi)生孢子等以及它們的組合(優(yōu)選為細(xì)菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子、真菌以及它們的組合；更優(yōu)選為細(xì)菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合；甚至更優(yōu)選為細(xì)菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢予以及它們的組合；最優(yōu)選為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、無(wú)包膜病毒(例如，諾沃克病毒(norovirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒以及它們的組合)、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合)。所述方法可用于檢測(cè)病原體，這對(duì)于食品安全或?qū)τ卺t(yī)學(xué)、環(huán)境或反恐原因來(lái)說(shuō)是重要的。所述方法尤其可用于檢測(cè)病原性細(xì)菌(例如，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌)，以及多種酵母菌、霉菌和支原體(以及這些中的任何的組合)。待檢測(cè)的靶微生物屬包括但不限于李斯特菌屬(Listeria)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、梭狀芽？包桿菌屬(Clostridium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)>葡萄球菌屬(Staphylococcus)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸球菌屬(Enterococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、志賀氏菌屬(Shigella)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、博德特氏菌屬(Bordetella)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、酵母菌屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)等以及它們的組合。樣品可含有多種微生物菌株，并且任何一種菌株可獨(dú)立于任何其它菌株而被檢測(cè)到?？勺鳛闄z測(cè)靶的具體微生物菌株包括大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、假結(jié)核耳口爾森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、葡萄球菌腸毒素亞禾中(Staphylococcalenterotoxinssp)、賭樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)(Bacillusatrophaeus)lif(Bacillussubtilis)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)、肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbotulinum)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等以及它們的組合(優(yōu)選地，金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、釀酒酵母、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、人類感染性無(wú)包膜腸道病毒(大腸埃希氏桿菌噬菌體為替代物)及它們的組合)ο由濃集劑捕集或結(jié)合(例如，通過(guò)吸附)的微生物可通過(guò)基本上任何目前已知或?qū)?lái)開(kāi)發(fā)的所需方法來(lái)檢測(cè)。這些方法包括(例如)基于培養(yǎng)的方法(當(dāng)時(shí)間允許時(shí)可為優(yōu)選)、顯微鏡法(例如，使用可用于觀察標(biāo)記有熒光染料的微生物的透射光顯微鏡或落射熒光顯微鏡)以及其它成像方法、免疫檢測(cè)方法和基因檢測(cè)方法。微生物捕集之后的檢測(cè)過(guò)程可任選包括洗滌，以去除樣品基質(zhì)組分。免疫檢測(cè)是對(duì)衍生自靶生物體的抗原物質(zhì)的檢測(cè)，該抗原物質(zhì)通常是充當(dāng)細(xì)菌或病毒顆粒的表面上的標(biāo)志的生物分子(例如，蛋白質(zhì)或蛋白多糖)。抗原物質(zhì)的檢測(cè)通?？赏ㄟ^(guò)抗體、選自諸如噬菌體展示之類的過(guò)程的多肽或來(lái)自篩選過(guò)程的適體來(lái)進(jìn)行。免疫檢測(cè)方法是熟知的，包括(例如)免疫沉淀和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。可以多種方式(例如，通過(guò)用熒光染料、用量子點(diǎn)或用可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶或有色底物來(lái)標(biāo)記第一抗體或第二抗體，和使用讀板機(jī)或側(cè)流裝置)來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。還可通過(guò)基因檢測(cè)(例如，通過(guò)核酸雜交或引物指導(dǎo)的擴(kuò)增)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，基因檢測(cè)常常是優(yōu)選的方法。可將捕集或結(jié)合的微生物裂解，以使它們的遺傳物質(zhì)可供檢測(cè)。裂解方法是熟知的，包括(例如)下述處理聲裂法、滲透壓休克、高溫處理(例如，約50°c至約100°C)以及與酶一起孵育，該酶例如為溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶細(xì)胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒內(nèi)溶素。許多常用的基因檢測(cè)分析可檢測(cè)特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA?；驒z測(cè)方法中使用的條件的嚴(yán)格性與所檢測(cè)的核酸序列的變異水平相關(guān)。高嚴(yán)格的鹽濃度和溫度條件可使檢測(cè)限于靶標(biāo)的精確核酸序列。因此，使用高度嚴(yán)格的基因檢測(cè)可區(qū)分靶核酸序列存在小變異的微生物菌株?；驒z測(cè)可以基于核酸雜交，其中，單鏈核酸探針與微生物的變性核酸雜交，使得產(chǎn)生包含探針鏈的雙鏈核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉用于在凝膠電泳、毛細(xì)管電泳或其它分離方法之后檢測(cè)雜交物的探針標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記以及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。特別有用的基因檢測(cè)方法是基于引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增。引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增方法包括(例如)熱循環(huán)方法(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及連接酶鏈反應(yīng)(LCR))以及等溫法和鏈置換擴(kuò)增(SDA)(以及它們的組合，優(yōu)選地，為PCR或RT-PCR)。用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法包括(但不限于)例如凝膠電泳分離和溴化乙錠染色，以及檢測(cè)產(chǎn)物中摻入的熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記。還可使用在檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物之前不需要分離步驟的方法(例如，實(shí)時(shí)PCR或均相檢測(cè))。生物發(fā)光檢測(cè)方法是熟知的，并且包括(例如)腺苷酸三磷酸(ATP)檢測(cè)方法，包括美國(guó)專利號(hào)7，422，868(Fan等人)中所描述的那些，將其說(shuō)明內(nèi)容以引用方式并入本文中。由于本發(fā)明方法是非菌株特異性的，它提供了使得可在同一樣品中靶向多種微生物菌株以便檢測(cè)的通用捕集系統(tǒng)。例如，在測(cè)定食品樣品的污染時(shí)，將同一樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌、大腸埃希氏桿菌以及沙門氏菌一并檢測(cè)是合乎需要的。在單個(gè)捕集步驟之后接著可進(jìn)行PCR或RT-PCR測(cè)定，其使用特異性引物來(lái)擴(kuò)增來(lái)自這些微生物菌株中每個(gè)菌株的不同核酸序列。因此，可避免需要對(duì)每個(gè)菌株分開(kāi)進(jìn)行樣品處理和制備程序。診斷試劑盒一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的診斷試劑盒包括(a)上述濃集劑(優(yōu)選粒狀濃集齊U)；和(b)用于實(shí)施本發(fā)明方法的檢測(cè)容器(優(yōu)選無(wú)菌檢測(cè)容器)。優(yōu)選地，所述診斷試劑盒還包括一種或多種選自以下的組分微生物培養(yǎng)基或生長(zhǎng)培養(yǎng)基、裂解試劑、緩沖劑、生物發(fā)光檢測(cè)分析組件(例如，光度計(jì)、裂解試劑、螢光素酶、酶底物、反應(yīng)緩沖劑等)、基因檢測(cè)分析組分、用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)以及它們的組合。優(yōu)選的裂解試劑是在緩沖劑中提供的水解酶，優(yōu)選的基因檢測(cè)分析組分包括靶微生物的一種或多種特異性引物。例如，本發(fā)明的診斷試劑盒的優(yōu)選實(shí)施例包括粒狀濃集劑(例如，在諸如玻璃或聚丙烯瓶的無(wú)菌一次性容器中)，連同關(guān)于使用所述濃集劑實(shí)施本發(fā)明方法的說(shuō)明書(shū)(例如，通過(guò)將濃集劑與待分析的流體樣品混合，通過(guò)重力使得濃集劑沉降，去除產(chǎn)生的上清液，以及檢測(cè)至少一種被濃集劑結(jié)合的靶微生物菌株的存在)。任選地，濃集劑可在含有防腐劑的小量緩沖液中水合以提高儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性，和/或可裝在/等分分配在撕開(kāi)式密封袋中以防止污染。濃集劑可以是液體中的分散液或懸浮液形式，或者可為粉末形式。優(yōu)選地，診斷試劑盒包括預(yù)量出的等份的(例如，基于樣品體積)粒狀濃集劑(更優(yōu)選地，裝在一個(gè)或多個(gè)撕開(kāi)式密封袋內(nèi))。^M通過(guò)以下的實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)，但不應(yīng)當(dāng)將這些實(shí)例中例舉的具體材料及其量以及其它的條件和細(xì)節(jié)理解成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限制。Mfi硅藻土購(gòu)自AlfaAesar(AJohnsonMattheyCompany,WardHill，MA)，為白色粉末(325目，所有顆粒的尺寸均小于44微米)。X射線衍射(XRD)顯示該材料含有無(wú)定形二氧化硅以及晶態(tài)α-方石英和石英。煅燒的硅藻土購(gòu)自德國(guó)法蘭克福Solvadis，GmbH(據(jù)觀察包含長(zhǎng)度約5至約80微米和寬約3至約8微米的小棒，和原始長(zhǎng)度達(dá)約60微米的多孔盤和盤片段，以及原始長(zhǎng)度約3至約60微米的不對(duì)稱片段)。XRD顯示該材料主要包含α“方石英。所有微生物培養(yǎng)物均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)。通過(guò)下文描述的方式表面處理硅藻土來(lái)制備包含多種不同表面修飾劑(即，二氧化鈦、二氧化鈦和氧化鐵組合、鉬、金以及金與氧化鐵組合)的濃集劑金沉積在150°C的烤箱中進(jìn)一步干燥約57_60g干燥的硅藻土或金屬氧化物修飾的硅藻土載體介質(zhì)(約300mL體積的粉末)24小時(shí)，以去除殘留的水分。將所得的干燥的樣品趁熱放入上文具體實(shí)施方式中描述的PVD裝置，該P(yáng)VD裝置具有漿葉間隙為2.7mm的顆粒攪拌器。然后將該裝置的真空室抽真空至約1.3mPa(5X10_5托)的背景壓力，讓包含氬濺射氣體的氣體以約1.3Pa(10毫托)的壓力下進(jìn)入該室。然后，通過(guò)向該裝置的陰極施加功率達(dá)預(yù)設(shè)定的一段時(shí)間進(jìn)行金屬沉積過(guò)程；在0.02kff的受控功率下進(jìn)行金屬的DC磁控管濺射涂覆過(guò)程中，該裝置的顆粒攪拌器軸和帶孔葉片以4rpm轉(zhuǎn)動(dòng)。濺射涂覆的持續(xù)時(shí)間為5小時(shí)。在濺射涂覆完成之后，用空氣將真空室通氣至環(huán)境條件，從PVD裝置移除所得的涂覆金屬的樣品，并通過(guò)25目(0.707mm)篩網(wǎng)過(guò)篩，以分離該過(guò)程中產(chǎn)生的微細(xì)顆粒。通過(guò)稱量所利用的金屬濺射靶(沉積過(guò)程之前和之后)來(lái)測(cè)定已沉積于樣品上的金屬的量。通常，約18%的靶重量損失代表沉積于樣品上的金屬(基于電感耦合等離子體分析)。從該信息計(jì)算出載體介質(zhì)上的所得金量為約0.9重量百分?jǐn)?shù)。鉑沉積大致重復(fù)上述的金沉積過(guò)程，例外的是7.62cm(3英寸)鉬靶代替所使用的7.62cm(3英寸)金靶，將功率設(shè)定為0.03kW，沉積時(shí)間為1小時(shí)。計(jì)算出載體介質(zhì)上所得的鉬量為約0.25重量百分?jǐn)?shù)。二氧化鈦的沉積通過(guò)在攪拌下在80.Og去離子水中溶解20.OgTiO(SO4)2H20(NoahTechnologiesCorporation,SanAntonio,TX)來(lái)制備20重量百分?jǐn)?shù)的脫水硫酸氧鈦(IV)(titanium(IV)oxysulfatedehydratesolution)溶液。將50.Og該溶液與175mL去離子水一起混合，產(chǎn)生二氧化鈦前體化合物溶液。通過(guò)在大燒杯中在快速攪拌下將50.Og硅藻土分散于500mL去離子水來(lái)制備硅藻土分散液。在將硅藻土分散液加熱至約80°C之后，在快速攪拌下滴加二氧化鈦前體化合物溶液約1小時(shí)時(shí)間。在添加之后，將燒杯用表面皿蓋住，并將其內(nèi)容物加熱至沸騰20分鐘。將氫氧化鋁溶液添加至燒杯，直至內(nèi)容物的pH為約9。通過(guò)沉降/傾析來(lái)洗滌所得的產(chǎn)物，直至洗滌水的PH為中性。過(guò)濾分離出產(chǎn)物，并將其在100°C過(guò)夜干O將一部分干燥的產(chǎn)物放入瓷坩堝，通過(guò)以約3°C/分鐘的加熱速度從室溫加熱至350°C并然后保持在350°C1小時(shí)來(lái)進(jìn)行煅燒。氧化鐵的沉積使用基本上上述的二氧化鈦沉積工藝將氧化鐵沉積至硅藻土上，例外的是用20.OgFe(NO3)3·9H20(J.Τ.Baker,Inc.，Phillipsburg,N.J.)溶于175mL去離子水所得的溶液代替硫酸氧鈦溶液。將一部分所得的氧化鐵修飾的硅藻土相似地煅燒至350°C以作進(jìn)一步檢測(cè)。氧化鐵和二氧化鈦的沉積使用基本上上述的二氧化鈦沉積工藝將氧化鐵和二氧化鈦的混合物沉積至硅藻土上，例外的是用10.OgFe(NO3)3·9H20(J.Τ.Baker,Inc.，Phillipsburg,N.J.)禾口25.OgTiO(SO4)·2H20(NoahTechnologiesCorporation,SanAntonio,TX)175mLi^^/jC所成的溶液代替硫酸氧鈦溶液。將一部分所得的氧化鐵和二氧化鈦修飾的硅藻土相似地煅燒至350°C以作進(jìn)一步檢測(cè)。微牛物濃集試驗(yàn)方法將分離的微生物菌落接種于5mLBBLLTrypticase大豆肉湯(BectonDickinson,Sparks,MD)中并在37°C孵育18-20小時(shí)。將約IO9個(gè)菌落形成單位/mL的該過(guò)夜培養(yǎng)物在ρΗ7·2的吸附緩沖液(含5mMKCl、lmMCaCl2、0.ImMMgCl2,以及ImMK2HPO4)中稀釋，獲得IO3個(gè)微生物/mL的稀釋液。將1.ImL體積的微生物稀釋液添加至各個(gè)經(jīng)標(biāo)記的含IOmg濃集劑的5mL無(wú)菌聚丙烯管(BDFalcon,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ),iu^^i^^t^f^.ThermolyneMaximixPlusvortex(BarnsteadInternational,Iowa)上混合。在室溫(25°C)下于ThermolyneVariMix振動(dòng)器平臺(tái)(BarnsteadInternational,Iowa)上孵育各封蓋的管15分鐘。在孵育后，讓各管在試驗(yàn)臺(tái)上靜放10分鐘以使?jié)饧瘎┏两迪聛?lái)。以相同方式處理含有1.ImL微生物稀釋液但無(wú)濃集劑的對(duì)照樣品管。然后將所得的沉降的濃集劑和/或上清液(以及對(duì)照樣品)用于分析。將沉降的濃集劑重懸浮于ImL無(wú)菌巴特非爾德氏(Butterfield's)緩沖溶液(pH7.2士0.2；磷酸二氫鉀緩沖溶液；VWR目錄號(hào)83008-093，VffR,WestChester,PA)中，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)鋪板于3MTMPetrifilmTM好氧性微生物計(jì)數(shù)板培養(yǎng)基(干燥、可再水合,3M公司(St.Paul.，MN))。使用3MPetrifilm讀板機(jī)(3M公司(St.Paul.，MN))對(duì)好氧性微生物計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。使用下式計(jì)算結(jié)果重懸浮的濃集劑中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL=(來(lái)自鋪板的重懸浮濃集劑的菌落數(shù))/(來(lái)自鋪板的未處理對(duì)照樣品的菌落數(shù))XlOO(其中，CFU=菌落形成單位，其為活的或有活力的微生物的單位)。然后使用下式以微生物被濃集劑捕集的百分?jǐn)?shù)來(lái)報(bào)告結(jié)果捕集效率或捕集百分?jǐn)?shù)=重懸浮的濃集劑中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL濃集劑為了比較的目的，在至少一些情況下，移取ImL上清液，未稀釋地進(jìn)行鋪板或在巴特非爾德氏緩沖溶液中以110稀釋進(jìn)行鋪板，將其鋪板至3MPetrifilm好氧性微生物計(jì)數(shù)板培養(yǎng)基上。使用3MTMPetrifilmTM讀板機(jī)(3M公司(St.Paul.，MN))對(duì)好氧性微生物計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。使用下式計(jì)算結(jié)果上清液中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL=(來(lái)自鋪板的上清液的菌落數(shù))/(來(lái)自鋪板的未處理對(duì)照樣品的菌落數(shù))X100(其中，CFU=菌落形成單位，其為活的或有活力的微生物的單位)。當(dāng)微生物菌落和濃集劑的顏色相似時(shí)(給讀板機(jī)提供的對(duì)比度很小)，結(jié)果是基于上清液，因而使用下式以微生物被濃集劑捕集的百分?jǐn)?shù)來(lái)報(bào)告結(jié)果捕集效率或捕集百分?jǐn)?shù)=100-上清液中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL實(shí)例1-12以及比較例1和2使用上述微生物濃集試驗(yàn)方法，分別測(cè)定多種不同的經(jīng)表面處理的硅藻土濃集劑或經(jīng)表面處理的煅燒硅藻土濃集劑(如上所述制備)各IOmg和IOmg未處理的硅藻土(下文為DE)對(duì)靶微生物的細(xì)菌濃集作用，所述靶微生物為革蘭氏陰性菌腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(ATCC6538)。結(jié)果示于下表1中。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)例14-19以及比較例3使用上述微生物濃集試驗(yàn)方法，分別測(cè)定多種不同的經(jīng)表面處理的硅藻土濃集劑或經(jīng)表面處理的煅燒硅藻土濃集劑(如上所述制備)各10mg和10mg未處理的硅藻土(下文為DE)對(duì)靶微生物釀酒酵母(102CFU/mL;ATCC201390)的酵母菌濃集作用。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將所得的材料鋪板于3MPetrifilm酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)板培養(yǎng)基(干燥，可再水合；3M公司，St.Paul,MN)，并孵育5天。對(duì)分離的酵母菌菌落進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，并如上所述計(jì)算出捕集百分?jǐn)?shù)。結(jié)果示于下表2中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%)。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)例20-22以及比較例4-6食品樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)氐碾s貨店(CubFoods，St.Paul)。在無(wú)菌玻璃皿中稱量火腿片、萵苣以及蘋果汁樣品(llg)，加入到無(wú)菌Stomacher聚乙烯過(guò)濾袋(SewardCorp,Norfolk,UK)中。使用腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的18-20小時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)物(原種)，以102CFU/mL的濃度對(duì)各食品樣品進(jìn)行接種然后，添加99mL巴特非爾德氏緩沖液至各接種樣品。在Stomacher400Circulator實(shí)驗(yàn)室攪拌機(jī)(SewardCorp.Norfolk，英國(guó))中攪拌所得樣品2分鐘時(shí)間。將攪拌過(guò)的樣品收集在無(wú)菌50mL錐形聚丙烯離心管(BDFalcon,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)中，以2000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心(Eppendorf離心管5804；ffestbury,NY)5分鐘，以去除大的碎片。將所得上清液用作進(jìn)一步試驗(yàn)的樣品。使用上述微生物濃集試驗(yàn)方法，將各lmL如上所述制備的試驗(yàn)樣品分別添加至含有10mg經(jīng)表面處理的硅藻土的試管和含有10mg未經(jīng)處理的硅藻土的對(duì)照試管中，測(cè)試對(duì)靶微生物腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的細(xì)菌濃集作用。對(duì)于萵苣試驗(yàn)，將樣品置于無(wú)菌的100X20mm組織培養(yǎng)皿(Sarstedt，Newton，NC)，并在紫外(UV)光下在AlphalmagerMultiImage燈箱(AlphaInnotechCorporation,SanLeandro,CA)中孵育1小時(shí)，以去除背景菌群。這些經(jīng)UV處理的樣品被證實(shí)不存在天然菌群(通過(guò)基本上如上所述進(jìn)行鋪板和計(jì)數(shù)lmL樣品證實(shí))，然后用于濃集試驗(yàn)。結(jié)果示于下表3中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%)。表3.實(shí)例編號(hào)微生物濃集劑樣品捕集百分?jǐn)?shù)C-4沙門氏菌DE蘋果汁4320沙門氏菌Au-Fe203-DE蘋果汁94C-5沙門氏菌DE火腿7521沙門氏菌Au-Fe203-DE火腿94C-6沙門氏菌DE萵苣5522沙門氏菌Au-Fe203-DE萵苣80實(shí)例23-24以及比較例7-8按照上文實(shí)例20-22以及比較例4-6的程序，采用火雞樣品(使用25g切片的火雞和225mL巴特非爾德緩沖液)，分別測(cè)定經(jīng)表面處理的硅藻土和未經(jīng)處理的硅藻土對(duì)大體積樣品(每30mL樣品體積300mg濃集劑)的靶微生物腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的濃集作用。還對(duì)來(lái)自飲水噴頭的飲用水(100mL)進(jìn)行了試驗(yàn)，將所述飲用水收集在無(wú)菌250mL的玻璃瓶(VWR，WestChester,PA)中，用靶微生物腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)以102CFU/mL進(jìn)行接種。將所得的接了種的水手動(dòng)翻轉(zhuǎn)混合5次，在室溫(25°C)下孵育15分鐘。將30mL如上所述制備的樣品添加至含有300mg濃集劑的無(wú)菌50mL錐形聚丙烯離21心管(BDFalcon,BectonDickinson,FranklinLakes，NJ)，使用上述微生物濃集試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。將所得的沉降的濃集劑重懸浮于30mL無(wú)菌巴特非爾德氏緩沖液中，鋪板于3MPetrifilm好氧性微生物計(jì)數(shù)板培養(yǎng)基。結(jié)果示于下表4中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%)o表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)例25-32分別測(cè)定多種不同的經(jīng)表面處理的硅藻土濃集劑樣品(如上所述制備)各10mg對(duì)靶細(xì)菌內(nèi)生孢子萎縮芽孢桿菌(ATCC9372)和枯草芽孢桿菌(ATCC19659)的濃集作用。采用上述的微生物濃集試驗(yàn)方法，但有以下修改過(guò)夜培養(yǎng)物分別具有1.4X103CFU/mL萎縮芽孢桿菌和6X102CFU/mL枯草芽孢桿菌；將所得的上清液未經(jīng)稀釋進(jìn)行鋪板；將沉降的帶有結(jié)合的微生物的濃集劑重懸浮于5mL無(wú)菌巴特非爾德氏緩沖液中并以雙份(每份lmL)進(jìn)行鋪板?；诘米凿伆宓纳锨逡旱挠?jì)數(shù)來(lái)計(jì)算捕集效率，結(jié)果示于下表5中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%)。表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)例33-36分別測(cè)定兩種不同的經(jīng)表面處理的硅藻土濃集劑樣品(即，Pt-DE和Au-Fe2O3-DE)各IOmg對(duì)無(wú)包膜細(xì)菌感染性靶病毒大腸埃希氏桿菌噬菌體MS2(ATCC15597-B1；常用作多種人類感染性無(wú)包膜腸道病毒的替代物)的濃集作用。采用大腸埃希氏桿菌(ATCC15597)作為宿主，用雙層瓊脂方法(下文所述)測(cè)定對(duì)大腸埃希氏桿菌噬菌體MS2(ATCC15597-B1)的捕集。在pH7.2的無(wú)菌IX吸附緩沖液(含有5mMKClUmMCaC12、0.ImMmgCl2，以及ImMK2HPO4)中10倍系列稀釋大腸埃希氏桿菌噬菌體MS2原種，分別獲得每毫升IO3和IO2噬斑形成單位(PFU/mL)的兩種稀釋液。將LOmL體積的所得噬菌體稀釋液添加至含有IOmg濃集劑的經(jīng)標(biāo)記的無(wú)菌5mL聚丙烯管(BDFalcon,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ),并在ThermolyneMaximixPlus潤(rùn)旋混合器(BarnsteadInternational,Iowa)上混合。在室溫(250C)下于ThermolyneVariMix振動(dòng)器平臺(tái)(BarnsteadInternational,Iowa)上孵育封蓋的管15分鐘。孵育后，讓管在試驗(yàn)臺(tái)上靜放10分鐘以使?jié)饧瘎┏两迪聛?lái)。以相同方式處理含有1.OmL噬菌體稀釋液但無(wú)濃集劑的對(duì)照樣品管。然后將所得的沉降的濃集劑和/或上清液(以及對(duì)照樣品)用于分析。移取100微升上清液，使用下文所述的雙層瓊脂方法測(cè)定噬菌體。移取另外的800微升上清液并棄去。也對(duì)100微升沉降的濃集劑測(cè)定噬菌體。雙層瓊脂方法將單菌落的大腸埃希氏桿菌(ATCC15597)接種于25mL無(wú)菌的3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯(Bacto胰蛋白酶大豆肉湯，BectonDickinsonandCompany,Sparks,MD,根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)制備)中，并在設(shè)置為每分鐘250轉(zhuǎn)(rpm)的振動(dòng)培養(yǎng)箱(Irmova44,NewBrunswickScientificCo.，Inc.，Edison,NJ)中在37°C過(guò)夜培養(yǎng)。將750微升的該過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種75mL無(wú)菌的3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯。在設(shè)置為250rpm的振動(dòng)培養(yǎng)箱中于37°C孵育所得培養(yǎng)物，獲得指數(shù)期的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞，指數(shù)生長(zhǎng)期是通過(guò)用SpectraMaxM5分光光度計(jì)(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)于550nm處測(cè)得的吸光度(吸光度值0.3-0.6)來(lái)測(cè)定。將細(xì)胞在冰上孵育直至用于測(cè)定。將100微升的上述噬菌體檢測(cè)樣品與75微升冰孵育的大腸埃希氏桿菌(宿主細(xì)菌)細(xì)胞一起混合，在室溫(25°C)下孵育5分鐘。將所得樣品與5mL無(wú)菌的熔化頂層瓊月旨(3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯、1.5重量百分?jǐn)?shù)的NaCl、0.6重量百分?jǐn)?shù)的瓊脂，當(dāng)天制備，保持在48°C的水浴中)混合。然后將該混合物倒至培養(yǎng)皿中的底層瓊脂(3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯、1.5重量百分?jǐn)?shù)的NaCl、l.2重量百分?jǐn)?shù)的瓊脂)之上。讓混合物的熔化瓊脂組分固化5分鐘，倒置培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，在37°C下孵育。過(guò)夜孵育后，目測(cè)檢查培養(yǎng)板，含有沉降的濃集劑的那些板(以及對(duì)照培養(yǎng)板)顯示存在噬菌體噬斑?；诘米凿伆宓纳锨逡旱挠?jì)數(shù)來(lái)計(jì)算捕集效率，對(duì)于Pt-DE測(cè)定為96%和97%(分別對(duì)于IO3和102PFU/mL稀釋液)，對(duì)于Au-Fe2O3-DE測(cè)定為94%和95%(分別對(duì)于IO3和102PFU/mL稀釋液)(標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%)。實(shí)例37-38蘋果汁購(gòu)自本地雜貨店(CubFoods，St.Paul)。在無(wú)菌玻璃皿中稱量蘋果汁(Ilg)，將其添加至99mL無(wú)菌巴特非爾德氏緩沖液中。將所得的組合進(jìn)行漩渦混合1分鐘，并使用腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)和大腸埃希氏桿菌(ATCC51813)的18-20小時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)物(細(xì)菌原種)，將這兩種細(xì)菌培養(yǎng)物各以lCFU/mL濃度對(duì)所述組合物進(jìn)行接種。如上所述在IX吸附緩沖液中制備細(xì)菌原種的系列稀釋液。使用上述微生物濃集試驗(yàn)方法，將IOmL體積的接了種的蘋果汁樣品添加至含有IOOmg經(jīng)表面處理的硅藻土濃集劑(S卩，TiO2-DE或Au-Fe2O3-DE)的無(wú)菌50mL錐形聚丙烯離心管(BDFalcon,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，孵育15分鐘進(jìn)行靴微生物沙門氏菌(在競(jìng)爭(zhēng)性微生物大腸埃希氏桿菌存在下)的細(xì)菌捕集/濃集。去除所得上清液，將沉降的濃集劑轉(zhuǎn)移至另一裝有2mL3重量百分?jǐn)?shù)的無(wú)菌胰蛋白酶大豆肉湯(BactoTrypticSoyBroth,BectonDickinsonandCompany,Sparks,MD；t艮據(jù)造商的說(shuō)明書(shū)備)的無(wú)菌50mL管。)給管封蓋但不蓋牢，混合其內(nèi)容物，在37°C下孵育。在過(guò)夜孵育后，使用來(lái)自SDI(StrategicDiagnostics,Inc.,Newark,DE)的RapidChek沙門氏菌側(cè)流免疫測(cè)定試驗(yàn)帶檢測(cè)所得肉湯混合物中的沙門氏菌的存在。目測(cè)檢查試驗(yàn)帶顯示其為沙門氏菌陽(yáng)性。還通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)含有微生物的肉湯混合物進(jìn)行核酸檢測(cè)。使用來(lái)自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的TaqManABI腸道沙門氏菌檢測(cè)試劑盒，測(cè)定作為試驗(yàn)樣品的ImL上述過(guò)夜孵育的含有濃集劑的肉湯中的沙門氏菌的存在。也對(duì)作為對(duì)照樣品的ImL的腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的18-20小時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)物(原種)進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)使用下列每個(gè)循環(huán)的循環(huán)條件(45個(gè)循環(huán))在StratageneMx3005PQPCR(定量PCR)系統(tǒng)(StratageneCorporation，LaJolla,CA)中進(jìn)行PCR檢測(cè)25°C30秒，95°C10分鐘，95°C15秒，以及60°C1分鐘。對(duì)照樣品獲得的平均(η=2)循環(huán)閾值(CT值)為17.71。含有TiO2-DE或Au-Fe2O3-DE的檢測(cè)樣品獲得的平均(η=2)CT值分別為20.44和16.53，表明為陽(yáng)性PCR反應(yīng)并證實(shí)了沙門氏菌的存在。將本文所引用的包含在專利、專利文獻(xiàn)以及出版物中的參考說(shuō)明全文以引用方式并入，就如同各自獨(dú)立地并入。在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對(duì)本發(fā)明的多種無(wú)法預(yù)料的修改和更改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非意圖受本文描述的示例性實(shí)施例和實(shí)例的不當(dāng)限制，所述實(shí)例和實(shí)施例僅通過(guò)舉例方式提供，本發(fā)明的范圍旨在僅受本文中如下示出的權(quán)利要求書(shū)的限制。權(quán)利要求一種方法，該方法包括(a)提供濃集劑，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉑，或它們的組合；(b)提供包含至少一種微生物菌株的樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸，使得至少一部分所述至少一種微生物菌株與所述濃集劑結(jié)合或被所述濃集劑捕集。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括檢測(cè)至少一種結(jié)合的微生物菌株的存在。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述濃集劑是粒狀濃集劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與至少一種金屬氧化物的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與至少一種其它金屬氧化物的組合，以及它們的組合。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述金屬氧化物選自氧化鐵、二氧化鈦、氧化鋅、氧化鋁以及它們的組合。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與至少氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與至少氧化鐵的組合，以及它們的組合。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合，以及它們的組合。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是流體形式。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物菌株選自如下物質(zhì)的菌株細(xì)菌、真菌、酵母菌、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述微生物菌株選自如下物質(zhì)的菌株細(xì)菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸是通過(guò)將所述濃集劑與所述樣品混合來(lái)進(jìn)行。14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)選自以下的方法進(jìn)行的基于培養(yǎng)的方法、顯微鏡法和其它成像方法、基因檢測(cè)方法、免疫檢測(cè)方法、基于生物發(fā)光的檢測(cè)方法以及它們的組合。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括離析所得的結(jié)合了微生物的濃集劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述離析是通過(guò)選自重力沉降、離心、過(guò)濾以及它們的組合的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述離析至少部分是通過(guò)重力沉降來(lái)實(shí)現(xiàn)。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法還包括將所述所得的離析的濃集劑與所述樣品分離。19.一種方法，該方法包括(a)提供濃集劑，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合；(b)提供包含至少一種微生物菌株的樣品，所述微生物選自細(xì)菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸，使得至少一部分所述至少一種微生物菌株與所述濃集劑結(jié)合或被所述濃集劑捕集。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法還包括檢測(cè)至少一種結(jié)合的微生物菌株的存在。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述濃集劑包括微粒，所述樣品是流體形式，并且所述接觸是通過(guò)將所述濃集劑與所述樣品混合來(lái)進(jìn)行的。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述方法還包括至少部分通過(guò)重力沉降來(lái)離析所得的結(jié)合了微生物的濃集劑。23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合，以及它們的組合。25.—種試劑盒，其包括(a)濃集劑，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉬，或它們的組合；和(b)用于實(shí)施權(quán)利要求1所述的方法的檢測(cè)容器。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述表面修飾劑選自微細(xì)納米級(jí)金、微細(xì)納米級(jí)鉬、微細(xì)納米級(jí)金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦、二氧化鈦與氧化鐵的組合，以及它們的組合。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括至少一種選自以下的組分微生物培養(yǎng)基、裂解試劑、緩沖劑、基因檢測(cè)分析組分、生物發(fā)光檢測(cè)分析組件、用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)以及它們的組合。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述濃集劑是顆粒形式，所述檢測(cè)容器是無(wú)菌且一次性的，所述檢測(cè)容器裝有所述濃集劑，且所述試劑盒還包括關(guān)于將所述濃集劑用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)。29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括處于至少一個(gè)撕開(kāi)式密封袋中的至少一個(gè)預(yù)量出的等份的顆粒形式的所述濃集劑。30.一種濃集劑，所述濃集劑位于粒狀載體上，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合，所述濃集劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉬或它們的組合。31.一種用于制備濃集劑的方法，該方法包括(a)提供粒狀載體，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合；和(b)通過(guò)物理氣相沉積將微細(xì)納米級(jí)金或鉬沉積于所述載體上。32.一種用于制備濃集劑的方法，所述方法包括(a)提供粒狀載體，所述粒狀載體選自硅藻土、金屬氧化物修飾的硅藻土以及它們的組合；(b)提供可水解的二氧化鈦前體化合物；(C)將所述載體和所述化合物組合；以及(d)水解所述化合物，使得將二氧化鈦沉積于所述載體上。全文摘要本發(fā)明描述了一種用于捕集或濃集微生物以便檢測(cè)或測(cè)定的方法，所述方法包括(a)提供濃集劑，所述濃集劑包含在其表面的至少一部分上帶有表面處理的硅藻土，所述表面處理包括表面修飾劑，所述表面修飾劑包括二氧化鈦、微細(xì)納米級(jí)金或鉑，或它們的組合；(b)提供包含至少一種微生物菌株的樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸，使得至少一部分所述至少一種微生物菌株被所述濃集劑結(jié)合或捕集。文檔編號(hào)C12Q1/06GK101821379SQ200880110383公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2008年10月2日優(yōu)先權(quán)日2007年10月3日發(fā)明者圖沙爾·A·克希爾薩加爾,托馬斯·E·伍德,曼基里·T·克希爾薩加爾申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司