專(zhuān)利名稱(chēng)：人外周血微泡中的mirna表達(dá)和其用途的制作方法
人外周血微泡中的MIRNA表達(dá)和其用途發(fā)明人 :Clay B. Marsh, Melissa G. Hunter, Noura Ismail優(yōu)先權(quán)要求和關(guān)于聯(lián)邦政府贊助的研究的聲明本申請(qǐng)要求2007年9月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/993，809和2008年5 月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/055，178的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用完整地并入本文。本 發(fā)明并非由任何政府做出并且政府在本發(fā)明中沒(méi)有權(quán)利。
背景技術(shù)：
微RNA(miRNA或miR)是動(dòng)物和植物中表達(dá)的小的非編碼RNA。它們調(diào)節(jié)細(xì)胞功 能、細(xì)胞存活、細(xì)胞活化和發(fā)育期間的細(xì)胞分化。7 ；8微RNA是19-25個(gè)核苷酸RNA的小的非編碼家族，其通過(guò)以序列特異性方式靶向 信使RNA (mRNA)，誘導(dǎo)翻譯抑制或mRNA降解(取決于miRNA和它們的靶之間的互補(bǔ)程度) 來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)(Bartel，D. P. (2004)Cell 116,281-297 ；Ambros. V. (2004)Nature 431， 350-355)。許多miR在序列上在遠(yuǎn)緣生物體之間是保守的，表明這些分子參與重要過(guò)程。 的確，miR參與發(fā)育期間基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(Xu, P.等(2003) Curr. Biol. 13，790-795)，細(xì)胞 增殖(Xu, P.等(2003) Curr. Biol. 13，790-795)，細(xì)胞凋亡(Cheng，A.M.等(2005)Nucl. AcidsRes. 33，1290-1297)，葡萄糖代謝(Poy,M. N.等(2004) Nature 432，226-230)，壓力抗 性(Dresios, J.等(2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，1865-1870)和癌癥(Calin, G. A 等(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,1554-15529 ；Calin, G. A.等(2004)Proc. Natl. Acad. Sci USAlOl，11755-11760 ；He，L.等(2005) Nature 435,828-833 ；和 Lu，J.等(2005) Nature 435 :834_838)。還有強(qiáng)有力的證據(jù)表明miR在哺乳動(dòng)物造血中起作用。在小鼠中，miR-181、 miR-223和miR-142在造血組織中差異表達(dá)，并且它們的表達(dá)在造血和譜系定向(lineage commitment)期間被調(diào)節(jié)(Chen, C. Ζ.等(2004) Science 303,83-86) miR-181 在鼠造血祖 細(xì)胞中的異位表達(dá)導(dǎo)致B細(xì)胞區(qū)室中的增殖(Chen，C. Ζ.等(2004) Science 303,83-86) 鼠造血系統(tǒng)的細(xì)胞中的系統(tǒng)性miR基因特征譜分析顯示與神經(jīng)元組織相比造血系統(tǒng)中不 同的miR表達(dá)模式，并且鑒定了在細(xì)胞分化期間發(fā)生的單獨(dú)的miR表達(dá)變化(Monticelli， S.等(2005)GenomeBiology 6，R71)。最近的研究已經(jīng)鑒定，miR-221 和 miR-222 在 CD34+ 臍血祖細(xì)胞的人紅細(xì)胞生成培養(yǎng)物中下調(diào)(Felli，N.等(2005)Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102,18081-18086) ο已發(fā)現(xiàn)這些miR靶向癌基因c_Kit。進(jìn)一步的功能研究表明這兩 種miR在紅細(xì)胞生成培養(yǎng)物中的下降在翻譯水平上開(kāi)啟了 Kit蛋白產(chǎn)生，導(dǎo)致早期紅系細(xì) 胞的擴(kuò)增(FelIi,N.等(2005)Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102，18081-18086)。與 miR 調(diào)控 細(xì)胞分化的假說(shuō)一致，發(fā)現(xiàn)miR-223是牽涉C/EBPa和NFI-A的調(diào)控回路(circuit)的關(guān)鍵 成員，其在全反視黃酸處理的急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系中控制粒細(xì)胞的分化(Fazi， F.等(2005)Cell 123,819-831)。在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病中已鑒定到兩種miR的頻繁缺失和降低的表達(dá)9。 這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了很多的論文，其證明miR在頭頸癌，小細(xì)胞肺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，乳腺癌，慢 性淋巴細(xì)胞性白血病和Burkitt淋巴瘤中異常表達(dá)9_12。最近，已經(jīng)報(bào)道了巨噬細(xì)胞中炎癥和miR之間的關(guān)系。13為了檢測(cè)此類(lèi)病癥，已獲得組織樣品以證實(shí)此類(lèi)巨噬細(xì)胞的存在。另外，至今，一直沒(méi)有報(bào)道證明在血液中循環(huán)的微泡(microvesicle)包含miR。本發(fā)明的另外的優(yōu)勢(shì)，目的和特征將部分地在隨后的說(shuō)明書(shū)中闡明并且在檢查下 列內(nèi)容后對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將部分地變得顯然，或可以從本發(fā)明的實(shí)踐中認(rèn)識(shí)到。如 附加的權(quán)利要求中特別指出的，可以實(shí)現(xiàn)和獲得本發(fā)明的目的和優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述在一個(gè)方面中，提供了用于鑒定特定miR的方法，所述miR存在于微泡中，和/或 在組織、液體和/或細(xì)胞中具有改變的特定miR的表達(dá)水平。微泡促進(jìn)細(xì)胞之間的聯(lián)系。許多細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、血小板、T-細(xì)胞和腫瘤)釋 放包含核酸和/或蛋白的小的微泡1A包含在微泡內(nèi)的因子調(diào)節(jié)血管發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì) 胞分化1;3。在另一個(gè)方面中，確定了 miR在液體例如患特定病癥的患者的外周血中的存在。在另一個(gè)方面中，確定了 miR在患肺纖維化的患者的肺組織中的存在。在另一個(gè)方面中，本文提供了診斷或預(yù)測(cè)受試者(例如，人)中的特定病癥的方 法。根據(jù)一種特定的方法，將來(lái)自受試者的受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì) 照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平進(jìn)行比較。相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的 水平，受試樣品中miR基因產(chǎn)物水平的變化(例如增加，減少)表示受試者患有急性炎性病 癥，或者處于發(fā)生急性炎性病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自受試者的受試樣品中miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照的水 平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自本文所示的miRNA。在特定的實(shí)施方案中，被診斷或預(yù)測(cè)的病癥是導(dǎo)致單核吞噬細(xì)胞和/或THP-I細(xì) 胞釋放微泡的病癥。在特定的實(shí)施方案中，被診斷或預(yù)測(cè)的病癥是引起炎性應(yīng)答的病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是治療受試者(例如，人)的癌癥和/或炎性病癥的 方法。在一個(gè)特定的方法中，將有效量的用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合 物施用給受試者，所述miR基因產(chǎn)物選自表I-VI中的一個(gè)或多個(gè)組。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物抑制選自表 I-VI中的一個(gè)或多個(gè)組的miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療癌癥和/或炎性病癥的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在 特定的實(shí)施方案中，所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對(duì)miR基因產(chǎn)物是特異的，所述miR 基因產(chǎn)物的表達(dá)，與正常相比，在來(lái)自患病的患者的血液中更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含至少一種抗炎劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于治療與miR基因產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)有關(guān)的癌癥和/ 或與miR基因產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)有關(guān)的肺部病癥的藥物組合物。此類(lèi)藥物組合物包括有效量的 至少一種miR基因產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物結(jié)合并且 減少所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與所述miR-基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一 種miR基因產(chǎn)物是miR或其變體或生物學(xué)活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還 包含至少一種抗癌劑。根據(jù)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，當(dāng)根據(jù)附圖閱讀時(shí)，本發(fā)明的各種目的和優(yōu) 勢(shì)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示來(lái)自巨噬細(xì)胞的微泡的釋放誘導(dǎo)的分化。外周血單核細(xì)胞(PBM)未經(jīng)處 理(淺色)或用GM-CSF處理(深色)24小時(shí)。收集無(wú)細(xì)胞上清液并且進(jìn)行超速離心。將 小泡重懸浮于PBS中并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析大小。分析之前，用2 μ m標(biāo)準(zhǔn)珠校準(zhǔn)FSS和 SSC參數(shù)(未顯示)。顯示的是來(lái)自三個(gè)不同供體的代表性數(shù)據(jù)。圖2A-2C顯示微泡介導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化。從PMA處理的THPl細(xì)胞收集微泡，然后將 其添加到未分化的THPl細(xì)胞(圖2B)或單核細(xì)胞(圖2C)中。作為對(duì)照，THPl細(xì)胞未進(jìn) 行處理(圖2A)。每天對(duì)所述細(xì)胞拍照。顯示的是第3天的細(xì)胞。圖3A-3C顯示外周血微泡的分離。經(jīng)告知同意后，從來(lái)自正常志愿者供體的20cc 血液中獲得血漿。來(lái)自0. 5cc血漿的微泡和⑶206-FITC或MHCII-FITC抗體一起溫育并且 在BD FACS Calibur上分析大小(利用前向角對(duì)側(cè)向角散射(forward vs. side scatter)) (圖3A)和表面抗原表達(dá)(圖3B)。針對(duì)圖3A所示的門(mén)控區(qū)(gatedregion)，確定CD206或 MHC II的百分比表達(dá)(與同種型對(duì)照相比)(圖3C)。顯示的是兩個(gè)供體的平均值士SEM。圖4.外周血微泡的來(lái)源的分析。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)自健康供體(η = 10)的外周血微泡。為了確定細(xì)胞來(lái)源， 針對(duì)CD3、CD202b (Tie-2)、CD66b、CD79a或CD41a對(duì)微泡進(jìn)行染色以確定來(lái)源于T-細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞或血小板的微泡。單核吞噬細(xì)胞衍生的微泡對(duì)于CD14、 CD206、CCR3、CCR2或CCR5是陽(yáng)性的。顯示的是平均的總門(mén)控事件的最大值％ 士S. Ε. M。圖5A-5D.來(lái)自外周血微泡和PBMC的miRNA表達(dá)。(圖5A)基于過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)顯示微 泡和PBMC的層次聚類(lèi)(Hierarchal clustering)分析。產(chǎn)生顯示微泡(圖5B)和PBMC(圖 5C)的表達(dá)特征譜的熱圖。(圖5D)顯示各個(gè)樣品組共有的和特異的數(shù)目。圖6 顯示多種疾病和與其相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)的miR的表I。列出了人類(lèi)疾病(包 括癌和非癌)組織中重要的微RNA。通過(guò)將來(lái)自我們的數(shù)據(jù)集(圖7，表II)的血漿中未檢 測(cè)到的miRNA與已知在特定疾病組織中增加的miRNA相比較，現(xiàn)在發(fā)明人相信我們預(yù)測(cè)幾 種miRNA可以用作血漿中的生物標(biāo)志物(參見(jiàn)圖6，表I增加表達(dá)欄中粗體的miR)。圖7 顯示在血漿中表達(dá)的miR和未檢測(cè)到的miR的表II。圖8 表III列出了 miR并且顯示在來(lái)自所有個(gè)體的血漿微泡和PBMC中表達(dá)最高 的十種miRNA。圖9 表IV顯示參與代謝和獲得性免疫系統(tǒng)的調(diào)控的經(jīng)典途徑(canonical pathway)受這些 miRNA(僅使用 Sanger miRBase(上部))或來(lái)自 Sanger miRBase 和 TargetScan的共有的靶(底部)的表達(dá)的高度調(diào)控。
圖10 表V顯示20種miRNA在PBMC級(jí)分中具有三倍以上的表達(dá)增加(與微泡血 漿樣品相比)，并且顯示血漿微泡中與PMBC相比的倍數(shù)變化(最后一欄)。圖11 表VI顯示所有檢測(cè)到的miR的標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)數(shù)據(jù)檢測(cè)器名稱(chēng)，ave-MNC,std-MNC，檢測(cè)器名稱(chēng)，ave-血清，std-血清。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明部分基于參與炎性應(yīng)答和/或在血液中具有改變的表達(dá)水平的特定微RNA(miRNA)的鑒定。本發(fā)明還部分基于這些miRNA與特定的診斷、預(yù)后和治療特征的關(guān)聯(lián)。如本文描述和舉例說(shuō)明的，特定的miRNA在組織損傷和/或炎癥期間上調(diào)或下調(diào)。如在本文中可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“微RNA”、“miR”、“miR”或“miRNA”是 指來(lái)自miR基因的未加工或已加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)，因 此術(shù)語(yǔ)“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白質(zhì)。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱(chēng)為“miR前體”，其通 常包括長(zhǎng)度大約70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^(guò)用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut 或RNA酶III (例如大腸桿菌RNA酶III))將其消化成具有活性的19至25個(gè)核苷酸的RNA 分子來(lái)加工miR前體。該具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱(chēng)為“已加工的”miR基 因轉(zhuǎn)錄物或“成熟的” miRNA?？赏ㄟ^(guò)天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過(guò)合成加工途徑 (例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)，從miR前體獲得具 有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解，還可通過(guò)生物或化學(xué)合成(而不用從miR前 體加工)，直接產(chǎn)生具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。當(dāng)在本文中用名稱(chēng)提及微RNA 時(shí)，該名稱(chēng)對(duì)應(yīng)前體和成熟形式，除非另有說(shuō)明。本發(fā)明包括診斷或預(yù)測(cè)受試者是否患有釋放微泡的病癥或處于發(fā)展釋放微泡的 病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。該方法包括確定來(lái)自受試者的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平和將樣品中 的miR基因產(chǎn)物水平與對(duì)照相比較。如本文所使用的，“受試者”可以是患有或懷疑患有此 類(lèi)病癥的任何哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是患有或懷疑患有此類(lèi)病癥的 人?？稍趶氖茉囌攉@得的生物樣品的細(xì)胞中，測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從受試者中取出樣品，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取和分離 DNA。例如，在某些實(shí)施方案中，可以在開(kāi)始放射療法、化學(xué)療法或其它療法之前從受試者獲 得樣品。可從受試者的未受影響的樣品、從正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群體或從相應(yīng)于受試 者的樣品的大部分細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞獲得相應(yīng)的對(duì)照樣品或?qū)φ諈⒄諛悠?例如獲自對(duì)照 樣品群體)。然后可將對(duì)照樣品與來(lái)自受試者的樣品一起進(jìn)行處理，以便可將從來(lái)自受試 者的樣品的細(xì)胞中給定的miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自對(duì)照樣品的細(xì)胞的相 應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平進(jìn)行比較。可選地，可以從受試樣品分開(kāi)地得到和加工參照樣品 (例如，在不同時(shí)間)，并且可以將從來(lái)自受試樣品的細(xì)胞中的給定的miR基因產(chǎn)生的miR 基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自參照樣品的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相對(duì)比。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平高于對(duì)照樣品中相應(yīng) 的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)來(lái)自受 試者的樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照(例如，參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照細(xì)胞樣品，對(duì)照組織樣品) 中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平低于對(duì)照樣品中相 應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“下調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)從來(lái)自受試者的樣品中的該基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量低于從對(duì)照樣品中的相同基因產(chǎn)生的 量時(shí)，miR基因的表達(dá)“下調(diào)”?？筛鶕?jù)一個(gè)或多個(gè)RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)確定對(duì)照和正常樣品中相 對(duì)miR基因表達(dá)。所述標(biāo)準(zhǔn)可包括例如OmiR基因表達(dá)水平、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表 達(dá)水平、受試者的未受影響的樣品中的miR基因表達(dá)水平或之前從正常人對(duì)照群體獲得的 miR基因表達(dá)的平均水平(例如對(duì)照參考標(biāo)準(zhǔn))?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種技術(shù)(例如定量或半定量RT-PCR，Northern印 跡分析，溶液雜交檢測(cè))測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在特定的實(shí)施方案中，通過(guò) 下述測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組 靶寡脫氧核苷酸，將靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA特異性探針寡核苷酸(例如包含 miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交以提供受試樣品的雜交特征譜，和將受試樣品 雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較。相對(duì)于對(duì)照樣品，受試樣品中至少一 種miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有特定病癥或處于發(fā)展特定病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。還可從基因特異性寡核苷酸探針(所述探針從已知的miRNA序列產(chǎn)生)制備微陣 列。對(duì)于各miRNA，陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種探針包含活性成熟序列，而另 一種探針特異于miRNA的前體。陣列還可包含可用作雜交嚴(yán)格條件的對(duì)照的對(duì)照，例如與 人直系同源物只相異于少數(shù)幾個(gè)堿基的一個(gè)或多個(gè)小鼠序列。還可將來(lái)自?xún)蓚€(gè)物種的tRNA 和其它RNA(例如，rRNA, mRNA)印制在微芯片上，從而為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定 的陽(yáng)性對(duì)照。還可將用于非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照包含在微芯片上。為了該 目的，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性選擇序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制備微陣列。例如，在位置C6上對(duì)合適長(zhǎng)度例如 40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5’ -胺修飾，并且使用可商購(gòu)獲得的微陣列系統(tǒng)例如 GeneMachine OmniGrid IOOMicroarrayer 和 Amersham CodeLink 活化的載玻片進(jìn)行印 制。通過(guò)用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來(lái)制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡聚物。在第一 鏈合成后，使RNA/DNA雜交物變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜交 條件(例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37°C下于0. 75X TNT 中清洗40分鐘)下與微陣列芯片雜交。在陣列上的其中固定的探針DNA識(shí)別樣品中的互 補(bǔ)靶cDNA的位置上，發(fā)生雜交。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記陣列上的其中發(fā)生結(jié)合的確切位置，從 而允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出信號(hào)由一列雜交事件組成，其標(biāo)示了特定cDNA序列的相對(duì)豐 度，從而標(biāo)示了患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA 寡聚物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過(guò)使用例如鏈霉抗生物素 蛋白-AleXa647綴合物直接檢測(cè)包含生物素的轉(zhuǎn)錄物來(lái)處理微陣列，和使用常規(guī)掃描方法 掃描微陣列。陣列上的各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。
使用陣列對(duì)于miRNA表達(dá)的檢測(cè)具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上鑒 定相同樣品中的數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過(guò)寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成 熟分子和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2. 5yg總RNA可提供可重現(xiàn)的結(jié)果。數(shù)目相對(duì)有限的miRNA (每物種數(shù)百個(gè))允許對(duì)數(shù)個(gè) 物種構(gòu)建共同的微陣列，其中對(duì)每一物種使用不同的寡核苷酸探針。這樣的工具允許分析 各已知的miR在不同條件下的跨物種表達(dá)。除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測(cè)定外，包含相應(yīng)于miRNome的大部分(優(yōu)選整個(gè)miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于進(jìn)行miR基因表達(dá)特征譜分 析，以分析miR的表達(dá)模式。可使不同的miR特征(signature)與已建立的疾病標(biāo)志物關(guān) 聯(lián)或直接與疾病狀態(tài)關(guān)聯(lián)。按照本文中描述的表達(dá)特征譜分析法，對(duì)來(lái)自懷疑患有特定病癥的受試者的樣品 的總RNA進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。然后 將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品的雜 交特征譜。結(jié)果是顯示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交特征譜。雜交特征譜包括來(lái) 自靶寡脫氧核苷酸(其來(lái)自樣品)與微陣列中的miRNA-特異性探針寡核苷酸的結(jié)合的信 號(hào)。所述特征譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在(信號(hào)對(duì)0信號(hào))。更優(yōu)選地，記錄的特征譜 包括來(lái)自各雜交的信號(hào)的強(qiáng)度。將所述特征譜與從正常的對(duì)照樣品或參照樣品產(chǎn)生的雜交 特征譜相比較。信號(hào)的改變表示受試者中存在特定病癥或發(fā)展特定病癥的傾向。 用于測(cè)量miR基因表達(dá)的其它技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，其包括用于 測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種方法。本發(fā)明還提供診斷受試者是否患有具有不利的預(yù)后的特定病癥或處于發(fā)展具有 不利的預(yù)后的特定病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。在該方法中，測(cè)量與特定病癥的不利的預(yù)后有關(guān) 的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自從受試者獲得的受試樣品的RNA以提供 一組靶寡脫氧核苷酸。然后使所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA特異性探針寡核苷 酸(例如包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交以提供受試樣品的雜交特征譜， 和將受試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較。相對(duì)于對(duì)照樣品，受試 樣品中至少一種miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有具有不利的預(yù)后的特定病癥或處于 發(fā)展具有不利的預(yù)后的特定病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。在某些情況下，可能期望同時(shí)測(cè)定樣品中多種不同的miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。 在其他的情況下，可能期望測(cè)定與特定的病癥相關(guān)的所有已知的miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá) 水平。評(píng)估數(shù)百種miR基因或基因產(chǎn)物的特定表達(dá)水平非常耗時(shí)并且需要大量的總RNA (例 如，對(duì)于每一個(gè)Northern印跡至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。為了克服這些限制，可構(gòu)建以微芯片形式(即，微陣列)存在的寡核苷酸文庫(kù)，該 文庫(kù)包含一組特異于一組miR基因的寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸)探針。使用該微陣 列，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，將它們與微陣列上的探針寡核苷酸雜 交以產(chǎn)生雜交特征譜或表達(dá)特征譜，來(lái)測(cè)定生物樣品中多個(gè)微RNA的表達(dá)水平。然后可將 受試樣品的雜交特征譜與對(duì)照樣品的雜交特征譜比較，從而確定具有改變的表達(dá)水平的微 RNA。如本文中所使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸 雜交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脫氧核苷酸”是指待檢測(cè)(例如，通過(guò)雜交)的分 子?！癿iR-特異性探針寡核苷酸”或“特異于miR的探針寡核苷酸”是指具有選擇用于與特 定miR基因產(chǎn)物或特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。特定樣品的"表達(dá)特征譜"或"雜交特征譜"本質(zhì)上是樣品狀態(tài)的指紋圖譜；雖 然兩種狀態(tài)可能具有相似表達(dá)的任何特定基因，大量基因的同時(shí)評(píng)估允許產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞狀態(tài) 來(lái)說(shuō)是獨(dú)特的基因表達(dá)特征譜。即正常樣品可以區(qū)別于相應(yīng)的展示病癥的樣品。在此類(lèi)展 示病癥的樣品中，可以確定不同的預(yù)后狀態(tài)(例如良好的或不良的長(zhǎng)期存活希望)。通過(guò)比 較不同的狀態(tài)中的展示病癥的樣品的表達(dá)特征譜，獲得關(guān)于在每一種狀態(tài)下哪些基因是重要的(包括基因的上調(diào)和下調(diào))的信息。在展示病癥的樣品中差異表達(dá)的序列的鑒定，以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表 達(dá)，允許以許多方式使用該信息。例如，可評(píng)估特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是 否改善特定受試者的長(zhǎng)期預(yù)后)。類(lèi)似地，可以通過(guò)比較來(lái)自受試者的樣品與已知的表達(dá)特 征譜來(lái)進(jìn)行或確認(rèn)診斷。此外，這些基因表達(dá)特征譜(或單獨(dú)的基因)允許篩選藥物候選 物，所述藥物候選物抑制特定病癥的表達(dá)特征譜或?qū)⒉涣嫉念A(yù)后特征譜轉(zhuǎn)變?yōu)楦玫念A(yù)后 特征譜。
細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變可導(dǎo)致這些miR的一種或多種預(yù)期的 靶失調(diào)，這可導(dǎo)致特定的病癥。因此，改變miR基因產(chǎn)物水平(例如，通過(guò)減少在展示病癥 的細(xì)胞中上調(diào)的miR的水平，通過(guò)增加在展示病癥的細(xì)胞中下調(diào)的miR的水平)可成功地 治療病癥。因此，本發(fā)明包括治療受試者的病癥的方法，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在受試 者的細(xì)胞中失調(diào)(例如，下調(diào)、上調(diào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中的至少一種miR基因 產(chǎn)物的水平大于對(duì)照或參照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受 試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。當(dāng) 至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在受試樣品中下調(diào)時(shí)，該方法包括施用有效量的該至少一種 分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學(xué)活性片段，從而抑制受試者中展示病癥的細(xì) 胞的增殖。例如，當(dāng)miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中下調(diào)時(shí)，對(duì)受試者施用有效量的分離 的miR基因產(chǎn)物，可以抑制癌細(xì)胞的增殖。對(duì)受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物可以與在 癌細(xì)胞中下調(diào)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物相同，或可以是其變體或生物學(xué)活性片段。如本文定義的，miR基因產(chǎn)物的“變體”是指與對(duì)應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有小 于100%的同一性且具有對(duì)應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物學(xué)活性的miRNA。 這樣的生物學(xué)活性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)(例如，抑制靶RNA分子 的翻譯，調(diào)控靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制與癌癥和/或骨髓增生 病癥有關(guān)的細(xì)胞過(guò)程(例如，細(xì)胞分化，細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞死亡)。這些變體包括物種變體和 由于miR基因中的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換，缺失，插入)而產(chǎn)生的變體。在某些實(shí)施 方案中，變體與對(duì)應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有至少約70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 98%、或99%的同一性。如本文定義的，miR基因產(chǎn)物的“生物學(xué)活性片段”是指具有對(duì)應(yīng)的野生型miR基 因產(chǎn)物的一種或多種生物學(xué)活性的miR基因產(chǎn)物的RNA片段。如上所述，這樣的生物學(xué)活 性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)和抑制與癌癥和/或骨髓增生病癥有關(guān)的 細(xì)胞過(guò)程。在某些實(shí)施方案中，生物學(xué)活性片段的長(zhǎng)度是至少約5，7，10，12，15或17個(gè)核 苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以將分離的miR基因產(chǎn)物與一種或多種其它的抗癌治療 組合地施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如，放化療 (chemoradiation)) 0當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中上調(diào)時(shí)，該方法包括給受試者施用有 效量的抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制展示病癥的細(xì)胞的增殖。這 樣的化合物在本文中稱(chēng)作miR基因表達(dá)抑制化合物。合適的miR基因表達(dá)抑制化合物的實(shí)例包括、但不限于，本文所述的那些(例如，雙鏈RNA，反義核酸和酶促RNA分子)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可以將miR基因表達(dá)抑制化合物與一種或多種其它的抗癌治療組合地施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如， 放化療)。如本文所述的，當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中上調(diào)時(shí)，所述方法包 括將有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物施用給受試者， 從而抑制癌細(xì)胞的增殖。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”、“醫(yī)治”和“療法”是指改善與疾病或病況例如癌 癥和/或其他病況或病癥相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減少疾病、 病癥或病況的癥狀的嚴(yán)重度或頻率。術(shù)語(yǔ)“受試者”、“患者”和“個(gè)體”在本文中定義為包括 動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小 鼠或其它?？?、羊科、馬科、犬科、貓科、嚙齒目或鼠科物種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。如本文中使用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是合成的或通過(guò)人工介入從天然狀態(tài)改 變或取出的miR基因產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物，或部分或完全從其天然狀態(tài)的共存 材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以以大體上純化的 形式存在，或可以存在于已將所述miR基因產(chǎn)物遞送入其中的細(xì)胞中。因此，有意地被遞送 至細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR 前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)本發(fā)明，本文所述的分離的 miR基因產(chǎn)物可以用于制備用于治療受試者(例如，人)的藥劑。分離的miR基因產(chǎn)物可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方 法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞 磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑 的提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany) > Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. ) > Pierce Chemical (Perbio Science 的一部分，Rockford, IL, U. S. Α. ) > Glen Research (Sterling, VA, U. S. A. ) > ChemGenes (Ashland, MA, U. S. A.)禾口 Cruachem(Glasgow, UK)?；蛘?，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)形或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物。用 于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如U6或HlRNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病 毒啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還 可包括用于在細(xì)胞(例如癌細(xì)胞，展示骨髓增生病癥的細(xì)胞)中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo) 型或可調(diào)控的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。還 可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至細(xì)胞并且在其中直接表達(dá)。miR基因產(chǎn)物可從分開(kāi)的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后通過(guò)合適的加工系統(tǒng)(包 括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)有的加工系統(tǒng))將該前體分子加工成功能性miR基因產(chǎn)物。適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇、用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá)基因 產(chǎn)物的方法以及將重組質(zhì)粒遞送至目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。參見(jiàn)， 例如，Zeng 等人(2002)，Molecular Cell 9 :1327_1333 ；Tuschl (2002)，Nat. Biotechnol,20 446-448 ；Brummelkamp 等人(2002)，Science 296 :550_553 ；Miyagishi等人(2002)， Nat.Biotechnol. 20 497-500 ；Paddison 等人(2002)， Genes Dev. 16 948-958 ；Lee 等 人(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :500_505 ；和 Paul 等人(2002)，Nat. Biotechnol. 20 505-508，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。例如，在某些實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn) 物的質(zhì)粒可以包含在CMV立即早期啟動(dòng)子(intermediate-early promoter)控制下編碼 miR前體RNA的序列。如本文中所使用的，“在啟動(dòng)子的控制下”是指編碼miR基因產(chǎn)物的 核酸序列位于啟動(dòng)子的3'端，以便啟動(dòng)子可起始miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。miR基因產(chǎn)物還可從重組病毒載體表達(dá)。預(yù)期miR基因產(chǎn)物可從兩個(gè)分開(kāi)的重組 病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病 毒載體表達(dá)的RNA或所述RNA可在細(xì)胞(例如癌細(xì)胞，展示骨髓增生病癥的細(xì)胞)中直接 表達(dá)。在本發(fā)明的治療方法的其它實(shí)施方案中，可對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制 miR表達(dá)的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表達(dá)”是指治療后miR基因產(chǎn)物的前體 和/或活性成熟形式的產(chǎn)量低于治療前產(chǎn)生的量。通過(guò)使用例如本文討論的測(cè)定miR轉(zhuǎn)錄 物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR的表達(dá)在細(xì)胞中是否已被抑制。抑制可 在基因表達(dá)的水平上(即，通過(guò)抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工的水 平上(例如，通過(guò)抑制miR前體至成熟的活性miR的加工)發(fā)生。如本文中所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是足以在患有癌癥和/ 或骨髓增生病癥的受試者中抑制細(xì)胞的增殖的量。通過(guò)考慮因素，例如受試者的大小和體 重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、施用的途徑以及施用是局部的還是全身 性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定的受試者施用的抑制miR表達(dá)的化合物的有效 量。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對(duì)給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化 合物的合適的給藥方案，如本文所述。用于抑制miR基因表達(dá)的合適的化合物包括雙鏈 RNA (例如短的或小干擾RNA或“siRNA”)、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些化合物 中的每一種可被靶向給定的miR基因產(chǎn)物，并且干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，通過(guò)抑 制翻譯，通過(guò)誘導(dǎo)切割和/或降解)。例如，給定的miR基因的表達(dá)可通過(guò)用分離的雙鏈RNA( “dsRNA” )分子誘導(dǎo)miR 基因的RNA干擾來(lái)抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定實(shí)施方案中，dsRNA分子 是“短或小干擾RNA”或“siRNA”。至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種用于抑制miR表達(dá)的化合物的施用將在患有癌 癥和/或骨髓增生病癥的受試者中抑制細(xì)胞(例如癌細(xì)胞，展示骨髓增生病癥的細(xì)胞)的 增殖。如本文中所使用的，“抑制癌細(xì)胞或展示骨髓增生病癥的細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞 或永久性或暫時(shí)地阻止或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果受試者中所述細(xì)胞的數(shù)目在施用miR基因 產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物后保持恒定或減少，那么可推斷細(xì)胞增殖被抑制。如果所 述細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長(zhǎng)的速度下降，則也可推斷癌細(xì)胞或展示骨髓增生病癥的 細(xì)胞增殖被抑制。還可通過(guò)任何合適的腸內(nèi)或胃腸外施用途徑對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)施用途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)給藥。合適的胃腸外施用途徑包括例如血管內(nèi)給藥(例如，靜脈內(nèi)團(tuán)注(bolus injection)、靜脈內(nèi) 輸注、動(dòng)脈內(nèi)團(tuán)注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和至脈管系統(tǒng)內(nèi)的導(dǎo)管滴注)；組織外周(peri-tissue)和 組織內(nèi)注射(例如，腫瘤外周和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或 沉積，包括皮下輸注(例如通過(guò)滲透泵)；對(duì)目的組織的直接施用，例如通過(guò)導(dǎo)管或其它安 置裝置(例如，視網(wǎng)膜丸劑(retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無(wú)孔的或凝膠狀材料 的植入物)；以及吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射入腫瘤?？稍趯?duì)受試者施用前，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑 制化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱(chēng)為“藥劑”。因此，本發(fā)明包括用于治療癌癥和/或骨髓 增生病癥的藥物組合物。本藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基 因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或HliR基因表達(dá)抑制化合物的序列 的核酸)(例如，按重量計(jì)算0. 1至90% )或其生理上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的藥物組合物另外包含一種或多種抗癌劑(例如，化療劑)。本發(fā)明的藥物制劑還可包 含由脂質(zhì)體封裝的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編 碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的核酸)和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑 包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、重量摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包 括例如生理上生物相容性緩沖劑(例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙 酰胺)或鈣螯合絡(luò)合物(例如，鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)的添加或任選地，鈣或鈉鹽(例 如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發(fā)明的藥物組合物可以以液體 形式包裝使用或可以進(jìn)行凍干。對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)無(wú)毒性的固體的藥學(xué)上可接受的載 體例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸 鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任何載體和賦形劑以及10-95%，優(yōu)選25% -75%的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少 一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含按重量 計(jì)算0.01-20%，優(yōu)選-10%的封裝在上文所述的脂質(zhì)體中的至少一種miR基因產(chǎn)物或 miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物 的序列的核酸)和噴射劑。還可如所期望的包含載體例如卵磷脂以用于鼻內(nèi)遞送。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種抗癌劑。在一個(gè)特定實(shí)施方案中， 所述組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編 碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的核酸)和至少一種化療劑。適用于 本發(fā)明方法的化療劑包括、但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn) 定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-CoA抑制 齊IJ，CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三 螺旋DNA，核酸適配體，和分子上修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素劑。適用于本發(fā)明組合物的試 劑的實(shí)例包括、但不限于，胞苷阿拉伯糖苷，甲氨蝶呤，長(zhǎng)春新堿，依托泊苷(VP-16)，多柔比星(阿霉素)，順鉬(CDDP)，地塞米松，arglabin，環(huán)磷酰胺，沙可來(lái)新，甲基亞硝脲，氟尿嘧 啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，長(zhǎng)春堿，喜樹(shù)堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，過(guò)氧化氫，奧沙利鉬，伊立 替康，托泊替康，亞葉酸，卡莫司汀，鏈佐星，CPT-11，紫杉酚，他莫昔芬，達(dá)卡巴嗪，利妥昔單 抗，柔紅霉素，l-β -D-阿糖呋喃糖胞嘧啶(l-β -D-arabinofuranosylcytosine)，伊馬替 尼，氟達(dá)拉濱，多西他賽和F0LF0X4。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給細(xì)胞提供受試試劑和測(cè)量與癌細(xì)胞中減少的表 達(dá)水平關(guān)聯(lián)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照(例如，對(duì)照細(xì)胞中miR基因 產(chǎn)物的水平)相比，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加指示受試試劑為抗癌試劑。合適的試劑包括但不限于藥物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、 核酸)。試劑可通過(guò)重組、合成產(chǎn)生，或其可從天然來(lái)源分離(即，純化)。用于給細(xì)胞提 供此類(lèi)試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且在上文中描述了幾種此 類(lèi)方法。用于檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、 RT-PCR、表達(dá)特征譜分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。本文也描述了幾種此類(lèi)方法。
實(shí)施例通過(guò)參考下列非限制性實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例用于舉例說(shuō)明 而非限 制本發(fā)明。本文的數(shù)據(jù)表明活化的人單核吞噬細(xì)胞和THP-I細(xì)胞釋放誘導(dǎo)新鮮分離的單核 細(xì)胞存活和分化的微泡。不希望受理論束縛，發(fā)明人認(rèn)為，在特定的炎性疾病下，微泡的內(nèi) 容物可以發(fā)生改變以迅速誘導(dǎo)應(yīng)答。數(shù)據(jù)還表明微泡在人外周血中循環(huán)。循環(huán)的微泡調(diào)控 正常的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并且在組織損傷和炎癥期間將指示傳播至遠(yuǎn)端細(xì)胞。微泡可以用作疾病病因?qū)W生物標(biāo)志物和先天免疫應(yīng)答的系統(tǒng)性介體。因此，能夠 通過(guò)分離外周血中的微泡(而非通過(guò)侵入性方法獲得組織)來(lái)獲得類(lèi)似的信息是有利的。 并且對(duì)外周血中微泡的正常特征的了解提供了了解急性炎性事件期間的事件的基礎(chǔ)。如本文所示，異常的巨噬細(xì)胞分化促成免疫穩(wěn)態(tài)的破壞。因?yàn)镚M-CSF或M-CSF誘 導(dǎo)單核細(xì)胞成熟，因此本發(fā)明人開(kāi)始研究以了解GM-CSF和M-CSF介導(dǎo)的分化之間的機(jī)制和 差異。應(yīng)答GM-CSF而非M-CSF的分化的定向(commitment)是快速和不可逆的(數(shù)據(jù)未顯 示)。連續(xù)的GM-CSF刺激并非是該效應(yīng)所必需的，因?yàn)閮H4個(gè)小時(shí)的處理即可誘導(dǎo)巨噬細(xì) 胞分化。在用作巨噬細(xì)胞分化的模型的PMA處理的THPl細(xì)胞中獲得相似的觀察結(jié)果。因此，發(fā)明人確定，在誘導(dǎo)分化后分泌至少一種因子，其保持信號(hào)或者活化其他細(xì) 胞以進(jìn)行分化。因此，將單核細(xì)胞或THPl細(xì)胞分別暴露于GM-CSF4小時(shí)或暴露于PMAl小 時(shí)，然后清洗所述細(xì)胞并且將其置于不具有刺激物的基本培養(yǎng)基中。24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上 清液并且將其添加到未分化的單核細(xì)胞或THPl細(xì)胞中。特別地，來(lái)自PMA處理的THPl細(xì) 胞或GM-CSF處理的單核細(xì)胞的上清液使單核細(xì)胞和THPl細(xì)胞分化(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)使用Bioplex懸浮液陣列系統(tǒng)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中多達(dá)27種的不同的細(xì)胞因 子，發(fā)明人未能檢測(cè)到負(fù)責(zé)的細(xì)胞因子。由于發(fā)明人用GM-CSF刺激的單核細(xì)胞的上清液使 不依賴(lài)于生長(zhǎng)因子的THPl細(xì)胞系分化，發(fā)明人推斷細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子不負(fù)責(zé)該效應(yīng)。接 著發(fā)明人研究微泡被分泌到培養(yǎng)上清液中以介導(dǎo)骨髓成熟的可能性。如圖1所示，與未經(jīng)處理的單核細(xì)胞(淺色點(diǎn))相比，用GM-CSF處理24小時(shí)的單核細(xì)胞在培養(yǎng)上清液中釋放顯著數(shù)目的微泡(深色點(diǎn))。類(lèi)似地，PMA處理的THPl細(xì)胞也在分化期間分泌微泡(數(shù)據(jù)未顯示)。特別地，圖 1顯示來(lái)自巨噬細(xì)胞的微泡的釋放誘導(dǎo)的分化。外周血單核細(xì)胞(PBM)未經(jīng)處理(淺色) 或用GM-CSF處理(深色)24小時(shí)。收集無(wú)細(xì)胞的上清液并且進(jìn)行超速離心。在PBS中重懸 小泡并且用流式細(xì)胞術(shù)分析大小。分析前，用2 μ m標(biāo)準(zhǔn)珠校準(zhǔn)FSS和SSC參數(shù)(未顯示)。 顯示的是來(lái)自三個(gè)不同的供體的代表性數(shù)據(jù)。純化來(lái)自PMA處理的THPl細(xì)胞的微泡并且將其添加到新鮮分離的單核細(xì)胞或者 未分化的THPl細(xì)胞。單獨(dú)的微泡在兩個(gè)細(xì)胞種類(lèi)中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，如通過(guò)形態(tài)學(xué)(參 見(jiàn)圖2A-2C)和表面抗原的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)所表明的。已分析這些微泡的內(nèi)容物。發(fā)明人檢測(cè)到，來(lái)自PMA處理的THPl細(xì)胞的微泡中存 在miRNA (數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)明人還評(píng)估正常志愿者的外周血中循環(huán)的微泡和miRNA?；诖笮。l(fā)明人在循 環(huán)中發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞群的微泡(圖3A)。用檢測(cè)甘露糖受體(CD206)和MHC II的抗體檢測(cè)到 巨噬細(xì)胞衍生的微泡(圖3B)?；冖?06或者M(jìn)HCII的表達(dá)，血漿中大約40%的總微泡 (門(mén)控區(qū)域)來(lái)源于巨噬細(xì)胞(圖3C)。發(fā)明人進(jìn)一步確定外周血微泡中是否包含miRNA。我們檢測(cè)到很多miRNA的表達(dá)。 檢測(cè)到的表達(dá)最高的miRNA在展示表III的圖8中顯示(η = 51)。特別地，在外周血中未檢測(cè)到miR-146，而miR-155的表達(dá)比表達(dá)最高的miRNA低 80倍。因?yàn)閙iR-146和miR-155在我們的IPF患者樣品中都升高，但在來(lái)自正常供體的外 周血中低至不可檢測(cè)，因此循環(huán)的miRNA的檢查可以用作疾病的生物標(biāo)志物。本文現(xiàn)表明，循環(huán)的微泡包含miRNA而且循環(huán)的微泡可以提供miRNA途徑以引發(fā) 細(xì)胞間聯(lián)系。微泡中的miRNA還可以提供對(duì)疾病的遺傳基礎(chǔ)的了解并且可以用作預(yù)測(cè)性生 物標(biāo)志物。巨噬細(xì)胞分化期間釋放的微泡還可以介導(dǎo)未成熟的細(xì)胞成熟。在巨噬細(xì)胞成熟期 間收集的微泡介導(dǎo)人單核細(xì)胞的分化和存活并且包含RNA。miRNA和經(jīng)加工的mRNA負(fù)責(zé)給 予未成熟細(xì)胞的成熟信號(hào)。實(shí)施例_血號(hào)從正常健康個(gè)體的血漿分離微泡。從微泡和匹配的單核細(xì)胞分離RNA并且通過(guò)實(shí) 時(shí)PCR分析420個(gè)已知的成熟miRNA的特征譜。數(shù)據(jù)集的層次聚類(lèi)分析表明外周血單核細(xì) 胞(PBMC)和血漿微泡之間的miRNA表達(dá)的顯著差異。
我們?cè)谖⑴莺蚉BMC中分別觀察到顯著表達(dá)的104和75種miRNA。特別地，與PBMC 相比，33種miRNA在微泡中特異性表達(dá)。對(duì)miRNA進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模以確定受檢測(cè)到的miRNA 調(diào)控的生物學(xué)途徑。預(yù)測(cè)在來(lái)自血液的微泡中表達(dá)的大多數(shù)微RNA調(diào)控血細(xì)胞的細(xì)胞分化 和代謝途徑。有趣地，預(yù)測(cè)選擇的幾個(gè)微RNA為免疫功能的重要調(diào)諧子。該實(shí)施例首次鑒定和定義正常受試者的循環(huán)的血漿微泡中的miRNA表達(dá)。最近的證據(jù)顯示，可通過(guò)外來(lái)體(exosome)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間的mRNA和 miRNA的遺傳交換(PMID 17486113)。微泡是由正常健康的或損傷的細(xì)胞類(lèi)型釋放的內(nèi) 吞來(lái)源的小的外來(lái)體 / 小泡(PMID :17337785，PMID =17409393, PMID =16791265)。微泡從 質(zhì)膜排入細(xì)胞外環(huán)境中以促進(jìn)細(xì)胞間的聯(lián)系。盡管尺寸較小(50nm至Ιμπι)，微泡富含生物活性分子并且推測(cè)包含核酸和/或蛋白；這些細(xì)胞顆粒在生長(zhǎng)、分化和癌癥進(jìn)程中起作 用(PMID 16453000)。在外周血中，三分之二的微泡來(lái)源于血小板。源于血小板的微泡在 血管發(fā)生和癌癥(例如肺癌)的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散中起作用(PMID: 15499615)。當(dāng)調(diào)控造血、內(nèi) 皮和單核細(xì)胞中的基因表達(dá)時(shí)，源于血小板的微泡誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(PMID 17378242，PMID 17127485)。有趣地，最近已經(jīng)確定微泡和miRNA之間的關(guān)系。最近，Valadi和同事報(bào)道，從人 和鼠的肥大細(xì)胞系釋放的小泡包含多于1200種的mRNA和大約121種miRNA分子(PMID 17486113)。相反，本發(fā)明涉及天然發(fā)生的包含微RNA的人血漿和血液微泡，其導(dǎo)致離體生 物學(xué)作用。圖8-表I顯示在人類(lèi)疾病(包括癌癥和非癌癥)中重要的微RNA。與疾病組織 中增加的表達(dá)相關(guān)但在人血漿微泡中通常表達(dá)低或不可檢測(cè)的微RNA分子(表I，示于圖6 中)提供了確定健康和疾病中的變化的可能并且可能是有效的生物標(biāo)志物(粗體，增加表 達(dá)欄)。類(lèi)似地，通常豐富的微RNA可能在人血漿微泡中減少，從而反映組織中觀察到的減 少(粗體，減少表達(dá)欄)。相當(dāng)多的證據(jù)證明作為人遺傳系統(tǒng)的不可缺少的基石的miRNA的重要性。使用微 泡來(lái)轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)將是人體內(nèi)有效的轉(zhuǎn)移方法。miRNA的微泡運(yùn)輸將使得能夠遠(yuǎn)距離聯(lián)系。
方法血液收集和微泡分離。在告知同意后，在EDTA管中收集來(lái)自24個(gè)女性和27個(gè) 男性健康的不吸煙的高加索人(Caucasian)供體的外周血(40cc)。在早晨和下午初期之 間收集血液。女性供體的中值年齡是29歲，男性供體也是。如之前所述，用無(wú)菌的低內(nèi)毒 素的PBS 1 1稀釋外周血，在ficoll-hypaque上分層(d = 1. 077)，和進(jìn)行離心(PMID 16931806)。在PBS中清洗單核細(xì)胞級(jí)分一次。從血漿中純化微泡。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)以 160，OOOxg在4°C下離心1小時(shí)來(lái)濃縮微泡(PMID 10648405)。RNA 提取。通過(guò) Trizol (Invitrogen，Carlsbad，CA)提取法分離總 RNA。為 了增加 小 RNA 的得率，過(guò)夜沉淀 RNA。通過(guò)在 Agilent 2100Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc Santa Clara,CA)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳來(lái)確定RNA濃度和RNA完整性。對(duì)于分離自單核 細(xì)胞的RNA，僅使用RNA完整性指數(shù)(RNA integrity number, RIN)彡9。因?yàn)橥暾?8s 和28s rRNA在微泡中是可變的，因此RIN不是對(duì)這些樣品的限制。通過(guò)定量PCR進(jìn)行的miRNA特征譜分析。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析420種成熟人miRNA的 表達(dá)的特征譜。通過(guò)用420種已知的人成熟miRNA的環(huán)引物的混合物作為引物(Mega Plex 試劑盒，Applied Biosystems,Foster City，CA)，用之前公開(kāi)的逆轉(zhuǎn)錄條件將RNA(50ng)轉(zhuǎn) 變?yōu)閏DNA(PMID :18158130)。因?yàn)槲⑴葜袥](méi)有已知的對(duì)照miRNA，檢驗(yàn)幾種內(nèi)部對(duì)照。內(nèi)部 對(duì)照小核仁(sno)RNA U38B, snoRNA U43，小核(sn)RNA U6以及18S和5S rRNA的引物包 含于引物的混合物中。用配備有384孔反應(yīng)板的Applied Biosystems 7900HT實(shí)時(shí)PCR儀分析表達(dá)的特 征譜。液體操作自動(dòng)儀(Liquid-handling robot)和Zymak Twister自動(dòng)儀用于增加通量 和減少誤差。使用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。流式細(xì)胞術(shù)。外周血微泡直接在血漿中進(jìn)行免疫染色而不經(jīng)過(guò)離心濃縮。為了確 定細(xì)胞來(lái)源，每組抗體免疫染色0. 5cc血漿。組I包含識(shí)別⑶66b-FITC(嗜中性粒細(xì)胞)，CD202b (Tie2) -PE (內(nèi)皮細(xì)胞)，CD206PE_Cy5 (巨噬細(xì)胞 / 樹(shù)突細(xì)胞)，CD79a_APC(B 細(xì)胞) 和CD14Pe-Cy7 (單核細(xì)胞)的抗體。組II包含抗CD4Ia-PE-Cy5 (血小板)，CCR2-APC (單 核細(xì)胞)，CCR3-PE (樹(shù)突細(xì)胞)，CCR5-PE-Cy7 (巨噬細(xì)胞)和CD3_Alexa 610 (Τ細(xì)胞)的 抗體。組III包含同種型對(duì)照抗體。用BD Aria流式細(xì)胞儀(BD Biosciences San Jose, CA)分析樣品。數(shù)據(jù)表達(dá)為門(mén)控細(xì)胞的百分比。統(tǒng)計(jì)分析。為了減少背景噪聲，在數(shù)據(jù)分析期間，其中80%的個(gè)體觀察結(jié)果具有大 于35的原始CT得分的miRNA不予考慮。在血漿微泡中，內(nèi)部對(duì)照(18S、5S、snoRNA U38B、 snoRNA U43和snRNA U6)是高度可變的，并且與外周血單核細(xì)胞(PBMC)相比，在血漿微泡 中表達(dá)水平顯著不同。因此，為了減少由將特定miRNA用作標(biāo)準(zhǔn)化校正因子引起的偏差并且為了減少 RT-PCR陣列間的樣品變異，基于其相對(duì)表達(dá)(相對(duì)于各個(gè)陣列上的總體miRNA表達(dá)，使用中 值標(biāo)準(zhǔn)化分析)比較血漿微泡和PBMC之間的miRNA (PMID 16854228)。通過(guò)控制供體的性 別和年齡，線性混合模型用于評(píng)估血漿微泡和PBMC之間的特定miRNA的差異?；谠u(píng)估的 均值差異計(jì)算倍數(shù)變化。用通過(guò)針對(duì)各個(gè)組織的過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)的miRNA產(chǎn)生熱圖并且基于miRNA的相對(duì)平均表 達(dá)，對(duì)miRNA層次聚類(lèi)。還基于血漿微泡和PBMC的miRNA的原始CT得分，對(duì)miRNA表達(dá)進(jìn) 行排列。進(jìn)行另外的統(tǒng)計(jì)分析(例如AN0VA)以確定在兩個(gè)處理組之間顯著表達(dá)的miRNA。
禾口予頁(yè)IlJ。 ffi miR￡md￡i(microrri￡L Sanger· ac· uk/t￡irgets/v5/)石角胃予頁(yè)IlJ 的miRNA靶。基于miRanda算法，產(chǎn)生各個(gè)靶的得分，僅大于17的得分進(jìn)一步用Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) ^lf。 i^ffii亥
miRNA的靶確定經(jīng)典途徑。檢查數(shù)據(jù)集以基于miRNA的靶的基因本體(ontology)確定相關(guān) 的途徑。結(jié)果外周血微泡亞群最初，我們檢查正常健康個(gè)體的外周血內(nèi)的微泡的細(xì)胞來(lái)源。使用流式細(xì)胞術(shù)，我 們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)外周血微泡源于血小板(圖4)，如之前報(bào)道的(PMID 10648405)。我們還觀察到第二大的微泡群體，其來(lái)源于單核細(xì)胞吞噬細(xì)胞譜系。用檢測(cè)單核 吞噬細(xì)胞上的表面抗原的抗體對(duì)該群體免疫染色。特別地，僅小百分比的外周血微泡來(lái)源 于T-細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。我們未能檢測(cè)到來(lái)源于B細(xì)胞的微泡(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的 是，我們檢測(cè)到表達(dá)來(lái)自?xún)?nèi)皮細(xì)胞的表面抗原的小的微泡亞群。血漿微泡和PBMC中的miRNA表達(dá)為了檢測(cè)外周血內(nèi)的微泡區(qū)室中是否包含miRNA以使得能夠在體內(nèi)的不同組織 之間進(jìn)行聯(lián)系和影響遺傳變化，我們對(duì)來(lái)自血漿的純化的微泡進(jìn)行miRNA特征譜分析。我 們分析來(lái)自51個(gè)不吸煙的健康個(gè)體(包括27個(gè)男性和24個(gè)女性)的微泡的所有亞群。為 了確定微泡和PBMC之間的miRNA表達(dá)是否存在差異，我們還從各個(gè)供體純化了 PBMC。進(jìn)行 實(shí)時(shí)PCR分析以檢查420種miRNA的表達(dá)。對(duì)過(guò)濾的數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，比較PBMC和 血漿樣品之間的miRNA表達(dá)特征譜(圖5A)。除了三種以外的所有PBMC樣品與微泡樣品分別聚類(lèi)，表明兩組之間的miRNA表達(dá) 特征譜顯著不同。基于減少背景噪聲的過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)微泡和PBMC樣品中分別表達(dá)104 種和 75 種 miRNA (圖 5B 禾口 5C)。在這些miRNA中，71種是各個(gè)樣品組共有的(圖5D)。特別地，僅兩種miRNA， miR-031 和 29c 僅在 PBMC 樣品中表達(dá)，而四種 miRNA (miR-127、-134、-485_5p 和-432)僅在 血漿級(jí)分中表達(dá)。顯示了通常在血漿中表達(dá)的所有104種miRNA(表II，在圖7中顯示)。年齡和性別的影響我們?cè)谌我粯悠方M的miRNA表達(dá)中沒(méi)有觀察到年齡和/或性別的影響。特別地，女 性和男性供體的中值年齡都是29歲。最年長(zhǎng)的個(gè)體是58歲，而最年輕的是21歲。因此， 我們進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)分層以檢查差異。年齡匹配的樣品之間的檢查沒(méi)有顯示對(duì)PBMC和微泡 樣品之間的miRNA表達(dá)的任何顯著的影響。當(dāng)控制性別時(shí)，我們還將上四分位年齡與下四 分位年齡相比，各個(gè)組的平均年齡分別為48. 9士6. 2和21. 9士 1. 2。然而，我們未能檢測(cè)到 基于年齡的樣品組之間的miRNA表達(dá)的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。微泡和PBMC中的miRNA表達(dá)的比較 表III，圖8中顯示的是來(lái)自所有個(gè)體的血漿微泡和PBMC中表達(dá)前十的miRNA。對(duì) 于血漿來(lái)說(shuō)，表達(dá)前十的miRNA以遞減的順序?yàn)閙iR-223、-484、-191、-146a、-016、-026a、_ 222、-024、-126 和-32。而 PBMC 中高表達(dá)的是 miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146a、_19 l、-026a、-019b和-020a。微泡中表達(dá)前十的miRNA在100%的個(gè)體中被檢測(cè)到。然而，在 PBMC樣品中，在100%的個(gè)體中觀察到除miR-150 (98%的供體)和miR-484 (89%的供體) 外的所有表達(dá)前十的miRNA。我們還發(fā)現(xiàn)PBMC和微泡的表達(dá)前十的miR中共有六種miR(miR_223、miR-484、 miR-191、miR-146a、miR-26a和miR-16)。特別地，在兩個(gè)區(qū)室中最顯著表達(dá)的miR都是 miR-223。基于各個(gè)單獨(dú)供體的排序分析，確定特定miRNA出現(xiàn)在表達(dá)前十的miRNA中的頻 率，miR-223在PBMC和微泡中的頻率為100%。盡管miR-486的表達(dá)是血漿微泡中表達(dá)前 十的miRNA，但發(fā)現(xiàn)該miRNA僅在20%的個(gè)體特征譜中是表達(dá)前十。有趣地，在血漿微泡中 高表達(dá)的miRNA未被鑒定為組織特異性miR。我們進(jìn)一步檢查微泡和PBMC中分別具有大于> 66%和> 88%的任意值的排序評(píng) 分(數(shù)據(jù)集的天然截?cái)嘀?的miR的集體功能(collectivefimction)?；谠摌?biāo)準(zhǔn)，我們 進(jìn)一步檢查來(lái)自微泡和PBMC樣品的排在前9的miR。因此，我們分析血漿中發(fā)現(xiàn)的miR-22 3、-484、-191、-146a、-016、-026a、-222、-024、和-126 的組合的功能。對(duì)于 PBMC，我們檢查 下列 miRNA 的組合的功能，miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146a、-191、-026a 和 _019b。 使用Sanger miRBase Target版本5，我們發(fā)現(xiàn)血漿微泡的組合的miR的1578個(gè)預(yù)測(cè)的靶 (數(shù)據(jù)未顯示)。計(jì)算機(jī)分析這些組合的靶以確定它們集體調(diào)控的途徑。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件，我們發(fā)現(xiàn)參與代謝和獲得性免疫系統(tǒng)的調(diào)控的經(jīng)典途徑受 這些顯示的miRNA的表達(dá)高度調(diào)控(表IV，示于圖9中，上部)。在檢查的來(lái)自PBMC級(jí)分的9種miRNA中，我們發(fā)現(xiàn)了 1857個(gè)預(yù)測(cè)的mRNA靶(數(shù) 據(jù)未顯示)。最后，由這些miRNA調(diào)控的前五的經(jīng)典途徑特別地是多種氨基酸和脂質(zhì)代謝途 徑(表IV，示于圖9中，上部)。我們還從Sanger miRBase和TargetScan中發(fā)現(xiàn)了共有的 預(yù)測(cè)的靶并且確定了它們的功能(表IV，示于圖9中，下部)。然后我們檢查了在微泡和PBMC之間差異表達(dá)的miRNA。我們發(fā)現(xiàn)20種miRNA在 PBMC級(jí)分中與微泡樣品相比具有三倍以上的表達(dá)增加(表V，示于圖10)。相比之下，與PBMC相比，15種miRNA在血漿微泡中顯著表達(dá)。圖11 表VI顯示在PBMC和血漿中表達(dá)的所有miRNA(檢測(cè)器名稱(chēng))的平均的標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)及各自的標(biāo)準(zhǔn)差。討論在這些實(shí)施例中，發(fā)明人現(xiàn)表明miR在正常穩(wěn)態(tài)條件下在外周血的微泡中循環(huán)。 此處，我們顯示了 104種在血漿微泡中表達(dá)的miR并且miR表達(dá)顯著不同于PBMC。到目前 為止，大量的研究顯示了 miR調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能的能力。然而，這些研究大多暗含，miR處 于其宿主細(xì)胞內(nèi)以引起作用(PMID 17923084)。我們的數(shù)據(jù)表明，微泡中包含的miRNA可 能是至遠(yuǎn)端細(xì)胞的聯(lián)系信號(hào)以調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。微泡中的這些miRNA可循環(huán)至不同的組織靶。血漿微泡中表達(dá)最高的miRNA的進(jìn) 一步檢查證實(shí)很多這些功能調(diào)控造血和細(xì)胞分化程序(表III，示于圖8)。例如，miR-223 的表達(dá)調(diào)控骨髓、粒細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化(PMID 18278031，PMID 17471500，PMID 16325577)。其還顯示在造血干細(xì)胞增殖中起作用(PMID 18278031)。有趣地，miR-223在 急性髓性白血病(AML)中喪失(PMID :18056805)。相反，miR-126的下調(diào)在巨核細(xì)胞分化 期間發(fā)生(PMID =16549775)。特別地，miR-24的表達(dá)受TGF-β (其為造血的有效的正和 負(fù)調(diào)節(jié)子)調(diào)控(PMID 16123808, PMID 18353861)。在微泡中表達(dá)的 miR-24 和 miR-16 都調(diào)控紅細(xì)胞產(chǎn)生(PMID =17906079, PMID :17976518)，而miR-16還調(diào)節(jié)淋巴發(fā)育(PMID 16616063)。miR-16表達(dá)的喪失已在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中得到廣泛驗(yàn)證(PMID: 17327404，PMID 17351108)。血漿微泡中表達(dá)的許多miR還調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的進(jìn)程(PMID 18365017， PMID 17914108)。MiR-222 靴向 p27Kipl(PMID 17914108)而 miR-24 抑制 pl6(INK4a) (PMID 18365017)。miR-16的增加的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞周期的G0/G1期積累(PMID 16123808)。相反，乳腺癌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)增加細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)但抑制轉(zhuǎn)移 (PMID 18185580)。這通過(guò)血管細(xì)胞粘附分子_1 (VCAMl)的調(diào)控發(fā)生(PMID 18227515)。與在血漿微泡中高表達(dá)的其他miR不同，miR_146a顯示在不同的水平上發(fā)揮作 用。雖然已表明miR-146a作為腫瘤抑制因子起作用并且該miR的喪失與前列腺癌的發(fā)展 相關(guān)(PMID 18174313)，miR-146a 還調(diào)節(jié)免疫功能(PMID 16885212，PMID 18057241)?？?能該miR在血漿微泡中的表達(dá)定義免疫調(diào)節(jié)功能(表IV，示于圖9)。基于檢查靶的基因本體的IPA分析，預(yù)測(cè)受miR-146a表達(dá)影響的最相關(guān)網(wǎng)絡(luò)是細(xì) 胞增殖，免疫和淋巴系統(tǒng)發(fā)育和功能。另外，預(yù)測(cè)該miR調(diào)控先天免疫應(yīng)答。根據(jù)上述分析， 我們發(fā)現(xiàn)LPS/IL-1和toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)是預(yù)測(cè)受mir-146a調(diào)控的前五的經(jīng)典途徑之
一ο到目前為止，還不清楚miR-484或miR-486的功能。與miR_146a相似，miR-484 和miR-486似乎作為免疫應(yīng)答性的調(diào)節(jié)子起作用。特別地，基于相對(duì)表達(dá)，miR-484是微泡 級(jí)分中第二高表達(dá)的miR。預(yù)測(cè)模型表明該miR具有多種功能。與微泡中表達(dá)的很多其他 miR 一樣，預(yù)測(cè)miR-484調(diào)控造血作用。特別地，預(yù)測(cè)NK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和IL-4信號(hào)傳導(dǎo)途 徑是miR-484的靶，而miR-486調(diào)控抗原呈遞。此外，miR-486顯示調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和 生長(zhǎng)。雖然我們?cè)谘獫{微泡中檢測(cè)到104種miR，但存在許多在總miR特征譜中檢測(cè)不到的miR。血漿微泡中檢測(cè)不到的miR也可用作疾病的生物標(biāo)志物。最近，Lawrie等報(bào)道， 在患有B細(xì)胞淋巴瘤的患者的血漿中檢測(cè)到miR(PMID =18318758)。該研究表明miR-155、 miR-210和miR-21在來(lái)自這些患者的血漿中升高并且miR-21與復(fù)發(fā)有關(guān)?；谠撗芯?，我 們?cè)谡€(gè)體中檢測(cè)到miR-155和miR-21，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR-210。有趣地，我們發(fā)現(xiàn)75%的 個(gè)體在血漿中表達(dá)miR-155而60%表達(dá)miR-21 (數(shù)據(jù)未顯示)。因此，對(duì)于待用作疾病的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的這些miR，每個(gè)個(gè)體在疾病檢測(cè)前將需要基 線。因此，miR-210的表達(dá)可用作B細(xì)胞淋巴瘤的較好的標(biāo)志物。可以存在另外的關(guān)系。例 如，miR-203在血漿微泡中檢測(cè)不到。該miR的升高的表達(dá)與膀胱癌和結(jié)腸腺癌有關(guān)并因 此可以用作生物標(biāo)志物(PMID 18230780，PMID 17826655)。對(duì)于在正常情況下表達(dá)而在疾病情況下喪失的血漿miR來(lái)說(shuō)，可存在相反的關(guān) 系。例如，在急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)中，miR-223下調(diào)(PMID 18056805)。因?yàn)?miR-223是血漿微泡中表達(dá)的最顯著的miR，其減少的表達(dá)可用作ALL的診斷標(biāo)志物。此外， miR-15a/16在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中喪失或下調(diào)(PMID 18362358)。然而我們發(fā) 現(xiàn)miR-16在檢查的所有健康個(gè)體中表達(dá)，miR-15a僅在44%的進(jìn)行特征譜分析的個(gè)體中表 達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，我們?cè)谡€(gè)體的血液中沒(méi)有檢測(cè)到組織特異性miRNA (PMID 18025253 )。來(lái)自正常個(gè)體的大多數(shù)微泡來(lái)源于血細(xì)胞。我們的確檢測(cè)到少量百分比的微泡 來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，源于內(nèi)皮細(xì)胞的微泡可能增加。同樣地，在組織損傷時(shí)， 在外周血中檢測(cè)到組織特異性miR和微泡可能是頻繁的事件。因?yàn)槟[瘤產(chǎn)生微泡(PMID: 16283305)，因此這些微泡可以在外周血中檢測(cè)到。雖然已報(bào)道在血漿中檢測(cè)到miR(PMID 18318758)，但本文是表征來(lái)自血漿的所 有已知miR的最早的研究。在該研究中，我們將種族作為因素進(jìn)行控制。檢測(cè)外周體液和/或血液中miR水平的存在、缺失或變化可以用作生物標(biāo)志物以 檢查多種疾病、鑒定獨(dú)特的miRNA特征譜和預(yù)測(cè)疾病。包含在微泡中的循環(huán)的miR在調(diào)控 血細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)生產(chǎn)以及代謝功能中具有重要功能。未明確通過(guò)引用并入的本文引述的所有出版物的相關(guān)教導(dǎo)以其全文通過(guò)引用并 入本文。盡管已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)地顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解 其中可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種變化，而不背離所附權(quán)利要求包括的本發(fā)明的范圍。雖然已通過(guò)參考各種和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，可進(jìn)行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行 許多改進(jìn)以使特定的情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離本發(fā)明的基本范圍。因此， 本發(fā)明不意欲限定于本文中公開(kāi)的預(yù)期用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案，而是意欲包括落 在權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。目的mi R在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中列出。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，公共數(shù)據(jù)庫(kù)可以是由 Sanger Institute 提供的重要儲(chǔ)庫(kù) www, http //microrna. Sanger, ac. uk/sequences/, M miR序列提交至該庫(kù)以進(jìn)行命名和系統(tǒng)命名分配(nomenclature assignment)，并且將所述 序列置于數(shù)據(jù)庫(kù)中以進(jìn)行存檔和用于經(jīng)由萬(wàn)維網(wǎng)的聯(lián)機(jī)檢索。通常，由Sanger Institute 收集的關(guān)于miR序列的數(shù)據(jù)包括物種，來(lái)源，相應(yīng)的基因組序列和基因組位置(染色體坐 標(biāo))，以及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和成熟的完全加工的miRNA (具有5'末端磷酸基團(tuán)的miRNA)的序列。另一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以是GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其可通過(guò)NationalCenter for Biotechnology
Information(NCBI)網(wǎng)址訪問(wèn)，并且由National Institutes of Health 禾口 National Library of Medicine維護(hù)。這些數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)引用完全并入本文。
miR

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權(quán)利要求
一種診斷或預(yù)測(cè)受試者中的疾病或病癥的方法，其包括i)確定來(lái)自受試者的包含微泡的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和ii)將樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照進(jìn)行比較，其中與對(duì)照的水平相比，來(lái)自受試者的樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的增加診斷或預(yù)測(cè)所述病癥。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表I中所示的組和其組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表II中所示的過(guò)濾后的表 達(dá)的血漿miR的組和其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表III中所示的組和其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表IV中所示的組和其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表V中所示的組和其組合。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表VI中所示的組和其組合。
8.—種生物標(biāo)志物，其包含一種或多種微泡作為疾病病因?qū)W的生物標(biāo)志物和先天免疫 應(yīng)答的系統(tǒng)性介體。
9.權(quán)利要求8的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物分離自外周血中的微泡。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥在表I中列出，包括結(jié)腸腺癌，結(jié)腸直腸癌，前列 腺癌，肺癌，乳腺癌，B細(xì)胞淋巴瘤，胰腺癌，彌漫性大BCL癌，CLL，膀胱癌，腎癌，缺氧-腫瘤， 子宮平滑肌瘤，卵巢癌，丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌，ALL，阿爾茨海默病，骨髓纖維化，骨髓 纖維化，真性紅細(xì)胞增多癥，血小板增多癥，HIV, HIV-I潛伏期。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)于血漿微泡中并且包括下列的一 種或多種miR-223、miR-484、miR-191、miR_146a、miR-016、miR_026a、miR-222、miR-024、 miR-126 和 miR-32。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)的miR發(fā)現(xiàn)于PBMC中并且包括下列的一種或 多種miR-223、miR-150、miR_146b、miR-016、miR-484、miR_146a、miR-191、miR_026a、 miR-O19b 和 miR_020a。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是結(jié)腸腺癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-20a、 miR-21、miR-106a、miR-181b 和 miR-203。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是結(jié)腸直腸癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-19a、 miR-21、miR-127、miR-31、miR-96、miR-135b 和 miR-183 ；并且至少下列 miR 下調(diào)miR_30c、 miR-133a、miR-143、miR-133b 和 miR-145。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是前列腺癌并且至少下列MiR上調(diào)mir21；并且 至少下列 miR 下調(diào)15a、miR-16-l、miR-143 和 miR-145。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是肺癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-17-92、 miR-19a、miR-21、miR-92、miR-155、miR-191、miR-205 和 miR-210 ；并且至少下列 miR 下調(diào) miR-let_70
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是乳腺癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-21和miR-155 ；并且至少下列 miR 下調(diào)miR_125b 和 miR-145。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是B細(xì)胞淋巴瘤并且至少下列MiR上調(diào) miR—155、miR—17—92、miR-19a> miR—92、miR—142、miR—155、miR—221、miR—17—92、miR-19a> miR-21、miR-92、miR-155、miR-191、miR-205 和 miR-210。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是胰腺癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-103、 miR-107、miR-18a、miR-31、miR-93、miR-221、miR-224 和 miR-155 ；并且至少下列 miR 下調(diào) miR—133ει、miR—216、miR—217。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是彌漫性大BCL并且至少下列MiR上調(diào)miR-155 和 miR-17-92。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是慢性淋巴細(xì)胞性白血病并且至少下列MiR上 調(diào)miR-23b、miR-24-l、miR-146、miR-155、miR-195、miR-221、miR-331、miR-29a、miR-195、 miR-34a 和 miR_29c ；并且至少下列 miR 下調(diào)miR_15a、miR-16-1、miR-29 和 miR-223。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是膀胱癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-223、 miR-26b、miR-22 1、miR-103—1、miR-185、miR_23b、miR-203、miR-17_5p、miR-23a 禾口 miR-205。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是腎癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-28、 miR-185、miR-27 和 miR-let_7f-2。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是缺氧_腫瘤并且至少下列MiR上調(diào)miR-23、 miR-24、miR-26、miR-27、miR-103、miR-107、miR-181、miR-210 和 miR-213。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是子宮平滑肌瘤并且至少下列MiR上調(diào)miR let-7 家族、miR-21、miR-23b、miR-29b 和 miR-197。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是卵巢癌并且至少下列MiR上調(diào)miR-199*、 miR-200a 和 miR-214 ；并且至少下列 miR 下調(diào)miR_100、miR-let_7 簇和 miR_125b。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌并且至少下列MiR 上調(diào)miR-122、miR-100、和 miR-10a ；并且至少下列 miR 下調(diào)miR_198 和 miR-145。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)并且至少下列 MiR 上調(diào)miR-128b、miR-204、miR-218、miR-331、miR-181b-l 和 miR-17-92。
29.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是阿爾茨海默病并且至少下列MiR上調(diào)miR-9 和miR-128 ；并且至少下列miR下調(diào)miR_107。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是骨髓纖維化并且至少下列MiR上調(diào)miR-190； 并且至少下列miR下調(diào)miR-31、miR-150和miR-95。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是骨髓纖維化、真性紅細(xì)胞增多癥或血小板增多 癥中的一種或多種，并且至少下列MiR下調(diào)miR-34a、miR-342、miR-326、miR-105、miR-149 和 miR-147。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是HIV且至少下列MiR上調(diào)miR-29a、miR-29b、 miR-149、miR-378 和 miR-324_5p。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是HIV-I潛伏期并且至少下列MiR上調(diào)miR_28、 miR-125b、miR-150、miR-223 和 miR-382。
34.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)照選自i)參考標(biāo)準(zhǔn)； )來(lái)自不患有所述病癥的受試者的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和iii)來(lái)自所述受試者的未展示所述病癥的樣品的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是人。
36.一種確定和/或預(yù)測(cè)受試者是否具有病癥分化的方法，其包括 i)確定包含微泡的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和 )將樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照進(jìn)行比較，其中樣品中所述至 少一種miR基因產(chǎn)物的水平相對(duì)于對(duì)照的水平發(fā)生變化指示所述病癥。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述變化是樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平下降。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自表I-VI中所示的組。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述樣品來(lái)自于受試者。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述受試者是人。
41.權(quán)利要求36的方法，其中所述對(duì)照選自 i)參考標(biāo)準(zhǔn)；和 )來(lái)自包含微泡的參照樣品的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
42.一種用于肺部病癥的生物標(biāo)志物，其包括表I-VII中列出的一種或多種miR和其亞組。
43.權(quán)利要求42的生物標(biāo)志物，其中所述病癥包括表II中列出的病癥結(jié)腸腺癌，結(jié) 腸直腸癌，前列腺癌，肺癌，乳腺癌，b細(xì)胞淋巴瘤，胰腺癌，彌漫性大BCL癌，CLL，膀胱癌，腎 癌，缺氧-腫瘤，子宮平滑肌瘤，卵巢癌，丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌，ALL,阿爾茨海默病， 骨髓纖維化，骨髓纖維化，真性紅細(xì)胞增多癥，血小板增多癥，HIV, HIV-I潛伏期。
44.一種診斷受試者是否患有疾病或病癥或處于發(fā)展疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其 包括測(cè)量來(lái)自受試者的受試樣品中至少一種miR的水平，其中所述受試樣品包括來(lái)自受試者的微泡，和其中所述受試樣品中的所述miR的水平相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR的水平發(fā)生變化 指示受試者患有卵巢癌，或處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
45.權(quán)利要求44的方法，其包括鑒定miR表達(dá)與所述疾病或其傾向之間的關(guān)聯(lián)，包括(a)標(biāo)記從受試者的樣品中分離的miR，所述受試者患有或懷疑患有疾病或病況；(b)使miR與miR陣列雜交；(c)確定miR與所述陣列的雜交；和(d)鑒定與參照相比在代表疾病或病況的樣品中差異表達(dá)的miR。
46.權(quán)利要求44的方法，其中鑒定差異表達(dá)的miR包括產(chǎn)生所述樣品的miR特征譜和 評(píng)估所述miR特征譜以確定所述樣品中的miR與正常樣品相比是否差異表達(dá)。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述miR特征譜選自表I-VI中所示的一種或多種miR和其亞組。
48.一種抑制疾病或病癥發(fā)展的方法，其包括i)將一種或多種試劑導(dǎo)入細(xì)胞，所述試劑抑制一種或多種miR的表達(dá)或活性，所述miR 選自表I-VII中所示的組和其亞組； )將一種或多種試劑導(dǎo)入細(xì)胞，所述試劑增加所述miR的一種或多種靶基因的表達(dá)， 或?qū))和ii)的所述一種或多種試劑的組合導(dǎo)入細(xì)胞，和iii)將細(xì)胞保持在這樣的條件下，在所述條件下所述一種或多種試劑抑制所述miR的 表達(dá)或活性，增加所述miR的一種或多種靶基因的表達(dá)或活性，或?qū)е缕浣M合，從而抑制所 述疾病或病癥的發(fā)展。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
50.一種鑒定治療癌癥的試劑的方法，其包括給微泡細(xì)胞提供受試試劑，并且測(cè)量與所 述細(xì)胞中減少的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR的水平，其中所述細(xì)胞中所述miR的水平相 對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞增加，指示所述受試試劑是治療劑。
全文摘要
本發(fā)明提供新的方法和組合物，其通過(guò)檢查包含微泡的樣品和其中的miR而用于病癥的診斷、預(yù)后和治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101842484SQ200880114286
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者C·B·馬什, M·G·皮珀, N·伊斯梅爾 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)