專利名稱：對檸檬酸鹽穩(wěn)定的中性金屬蛋白酶的用途和生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用于清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應(yīng)用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以 對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌屬(Bacillus)的成員是革蘭氏陽性細菌，其分泌許多工業(yè)上有用的酶， 所述酶可通過發(fā)酵而大量廉價地產(chǎn)生。分泌的芽孢桿菌酶的實例是枯草桿菌蛋白酶絲氨 酸蛋白酶、含鋅的中性蛋白酶、a-淀粉酶以及纖維素酶。芽孢桿菌蛋白酶廣泛應(yīng)用于紡織 品、洗衣店和家用工業(yè)中(Galante，Current Organic Chemistry，7 :1399_1422，2003 ；以 及 Showell, Handbookof Detergents, Part D Formulation, Hubbard (編輯),NY Taylor andFrancis Group, 2006) 0從被洗的東西中高效移除顏色和染色需要蛋白酶。然而，清潔 和洗滌劑的液體制備物通常含有增效助劑、表面活性劑和金屬螯合劑，其對大多數(shù)蛋白酶 具有去穩(wěn)定效果。一般而言，變性劑誘導金屬蛋白酶通過自溶快速地降解。因此，已經(jīng)研究了蛋白 酶自溶的分子機制作為產(chǎn)生穩(wěn)定的金屬蛋白酶的途徑(Eijsink等，J Biotechnol,113 105-120, 2004) 0對自溶途徑的理解是很復雜的，因為(i)蛋白酶局部降解變性蛋白形態(tài) 的高效率，以及(ii)因為多種未折疊形態(tài)很可能存在并遍布于蛋白質(zhì)分子，導致多種和平 行的自溶途徑。已報道了嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶自溶的分子機制(Eijsink等，Nat Struct Biol,2 374-379,1995；van den Burg 等，Biotechnol Appl Bioeng，30 :35_40， 1999 ；以及 Vriend，J Comput Aided Mol Des，7 :367_396，1993)。然而，在本領(lǐng)域仍然需要闡明其它工業(yè)有關(guān)的金屬蛋白酶的自溶機制。具體而言， 仍然需要了解檸檬酸鹽誘導的解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性金屬 蛋白酶(NprE)的自溶作用，其可用于設(shè)計在鈣螯合劑的存在下具有改良的穩(wěn)定性的NprE 變體。這在解淀粉芽胞桿菌NprE的情況下尤為重要，因為該酶的結(jié)構(gòu)和功能依賴于鈣，使 其更易受到諸如檸檬酸鹽的鈣清除劑的影響。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用于清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應(yīng)用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。本發(fā)明提供了分離的中性金屬蛋白酶變體，其對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有改 良的抗性。在一些優(yōu)選的實施方案中，該中性金屬蛋白酶變體是具有以下氨基酸序列的芽 孢桿菌中性金屬蛋白酶變體，所述序列在選自等價于SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的位置 129、130、138、190和220中的3個、4個或5個處包含替換。在一些優(yōu)選的實施方案中，所 述替換包含選自 S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/ D220P的多重突變。在優(yōu)選的實施方案中，該芽孢桿菌是解淀粉芽胞桿菌。在一些實施方案 中，該中性金屬蛋白酶與包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的中性金屬蛋白酶具有至少約 45 %、至少約50 %、至少約53 %、至少約55 %、至少約57 %、至少約60 %、至少約63 %、至少 約65 %、至少約67 %、至少約70 %、至少約73 %、至少約75 %、至少約77 %、至少約80 %、至 少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 % 的氨基酸同一性。本發(fā)明還提供了編碼本文所述中性金屬蛋白酶變體的分離的核酸，以及 包含該核酸的表達載體。此外，本發(fā)明還提供了包含該表達載體的宿主細胞。在另一實施 方案中，本發(fā)明提供了從所述包含該表達載體的宿主細胞中獲得的中性金屬蛋白酶變體。此外，本發(fā)明提供了分離的解淀粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體，其對檸檬酸鹽 誘導的自溶作用具有改良的抗性。在一些優(yōu)選的實施方案中，該中性金屬蛋白酶變體具有 在選自等價于SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的位置129、130、138、190和220中的3個、4個 或5個位置處包含替換的氨基酸序列。還提供了包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的多重 突變的分離的解淀粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體，其中所述多重突變選自S129I/F130L/ D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P。在一些優(yōu)選的實施方 案中，該分離的解淀粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體包含SEQ ID N0:18(S129I/F130L/ D220P)、SEQ ID NO 19 (M138L/V190I/D220P)或 SEQ IDN0 20 (S129I/F130L/M138L/V190I/ D220P)所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本文所述中性金屬蛋白酶變體的分離的核 酸，以及包含該核酸的表達載體。此外，本發(fā)明還提供了包含該表達載體的宿主細胞。在另 一實施方案中，本發(fā)明提供了從所述包含該表達載體的宿主細胞中獲得的中性金屬蛋白酶 變體。此外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有中性金屬蛋白酶活性的酶的方法，包括用包含編碼 中性金屬蛋白酶變體的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；以及在適于產(chǎn)生該中性金屬蛋白酶 的條件下培養(yǎng)該經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明的一些實施方案還包括收獲所產(chǎn)生的中性金屬 蛋白酶的步驟。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬物種，而在尤其優(yōu)選的實施方 案中，芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。本發(fā)明還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的組合物，其中所述的變體具有 對檸檬酸鹽誘導的自溶作用的經(jīng)改良的抗性。在一些實施方案中，該組合物還包含至少一 種鈣離子和/或至少一種鋅離子。在其它的實施方案中，該組合物還包含檸檬酸鹽。在一 些優(yōu)選的實施方案中，該組合物是清潔組合物(例如，洗滌劑)。在一些特別優(yōu)選的實施方 案中，該組合物還包含至少一種選自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶(marmanase)、果 膠酶、角質(zhì)酶(cutinase)、氧化還原酶、半纖維素酶和纖維素酶的的附加酶或酶衍生物。在 本發(fā)明的一些實施方案中，該組合物包含至少約0. 0001重量百分數(shù)的中性金屬蛋白酶變 體，或約0. 001至約0. 5重量百分數(shù)的中性金屬蛋白酶變體。本發(fā)明的一些組合物還包含至少一種附屬組分。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，該組合物還包含足量的PH調(diào)節(jié)劑以給 該組合物提供約3至約5的凈pH，該組合物基本上沒有在約pH 3至約pH 5的pH水解的物 質(zhì)。在一些實施方案中，在約pH 3至約pH 5的pH水解的物質(zhì)包含至少一種表面活性劑。 在一些優(yōu)選的實施方案中，該表面活性劑是包含環(huán)氧乙烷部分的烷基硫酸鈉表面活性劑。 在一些實施方案中，該組合物是液體。此外，本發(fā)明還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的動物飼料組合物，其中 所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有經(jīng)改良的抗性。在其它實施方案中，還提供了包 含分離的中性金屬蛋白酶變體的織物加工組合物，其中所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作 用具有經(jīng)改良的抗性。在其它實施方案中，還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的皮 革加工組合物，其中所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有經(jīng)改良的抗性。此外，本發(fā)明還提供了清潔方法，包括使表面和/或包含織物(例如，材料)的物 品與包含分離的中性金屬蛋白酶變體的清潔組合物接觸的步驟，其中所述變體對檸檬酸鹽 誘導的自溶作用具有經(jīng)改良的抗性。在一些實施方案中，該方法還包括在使該表面或材料 與清潔組合物接觸后漂洗該表面和/或織物的步驟。附圖簡述

圖1顯示了檸檬酸鹽誘導的解淀粉芽胞桿菌中性蛋白酶(NprE)的自溶作用。圖 A提供了在0.1M Tris-HCl(pH 8.4)中作為檸檬酸鹽濃度(0_250mM)和鈣濃度(0-10mM) 的函數(shù)顯示0.4mg/ml蛋白酶失活的圖。應(yīng)用琥珀?；痏酪蛋白/TNBSA測量剩余的活 性，并且將剩余的活性與在10mM氯化鈣的存在下測量的活性進行比較。圖B描述了 10% SDS-PAGE分析，其說明了檸檬酸鹽誘導的蛋白酶的自溶模式。在含有0-100mM檸檬酸鹽的 5mM HEPES(pH 8.0)中使約0. 4mg/ml蛋白質(zhì)在冰上溫育100分鐘。在凝膠上樣之前，用 0. IN HC1失活蛋白酶以停止自溶。泳道1表示在不存在檸檬酸的情況下溫育的對照，泳道 2-7含有在增加的檸檬酸鹽的存在下的蛋白質(zhì)，以及泳道8含有分子量標記。圖2提供了解淀粉芽胞桿菌中性蛋白酶(NprE)自溶片段的氨基酸序列片段 1(SEQ ID NO :13)、片段 2(SEQ ID NO 14)、片段 3 (SEQ IDN0 :15)、片段 4 (SEQ ID NO: 16) 以及片段5(SEQ ID N0:17)。自溶片段N端用粗體著重顯示。編號對應(yīng)于NprE成熟形式 的位置。圖3提供了通過針對檸檬酸鹽敏感性篩選在NprE中3個位置上所有可能的氨基 酸替換而獲得的活性數(shù)據(jù)的代表圖。圖A提供了來自位置M138活性篩選的數(shù)據(jù)。圖B提 供了來自位置D220活性篩選的數(shù)據(jù)。圖C提供了來自位置V190活性篩選的數(shù)據(jù)。在25mM HEPES (pH 8. 0)中在存在或不存在50mM檸檬酸鹽的情況下在25°C篩選60分鐘。Y軸是任 意的并且表示相對于野生型蛋白質(zhì)的增加。圖4提供了作為檸檬酸濃度和溫育時間的函數(shù)顯示中性蛋白酶變體活性的圖。圖 A 闡釋了野生型蛋白酶( )、V190I(〇M138L(T),D220P( A )、M138L-D220P ( ■) 和S129I-F130L-M138L-V190I-D220P ( )在室溫60分鐘后測量的活性的檸檬酸鹽濃 度依賴性。圖B描述了 10% SDS-PAGE分析，其顯示了檸檬酸鹽對野生型NprE和變體 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P的作用。在4°C使約0. 4mg/ml蛋白與增加的檸檬酸鹽濃 度溫育100分鐘。泳道1-4作為檸檬酸鹽(0-75mM)的函數(shù)闡述野生型的自溶模式，以及泳 道6-10顯示了完整(未自溶)的S129I-F130L-M138L-V190I-D220P。泳道5表示標準分子量標記。圖5提供了顯示野生型和變體蛋白酶熱穩(wěn)定性的圖。圖A提供了在130mM檸 檬酸鹽的存在下 0. 4mg/ml 蛋白酶變體 S129I、D220E、V190I-D220P、S129I-F130L-D220P 和 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 的量熱圖。應(yīng)用 Auto-Cap VP-DSC(MicroCal, Northampton, MA, USA)以200°C /hr的掃描率從20_90°C收集數(shù)據(jù)。針對緩沖液基線校準 所有顯示的數(shù)據(jù)。緩沖液是5mM HEPES, pH 8.0。圖B提供了許多單、二重和三重蛋白酶變體的柱狀圖，其顯示了在130mM檸檬酸鹽 (pH 8.0)的存在下熱熔點(Tm)的增量升高。圖6提供了列出野生型NprE及其變體的活性和熱穩(wěn)定性的表。圖7提供了本發(fā)明示范性的對檸檬酸鹽穩(wěn)定的NprE變體的氨基酸序列。 圖A提供了 S129I-F130L-D220P NprE變體的氨基酸序列(SEQ IDN0 :18)。圖B提 供 了 M138L-V190I-D220P NprE 變體的氨基酸序列(SEQID NO :19)。圖 C 提供了 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P NprE 變體的氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)。圖8提供了 Kcat/Km對pH的圖，闡明了野生型NprE和五重NprE變體 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)都在 pH 6. 5 對 AGLA 底物具有最佳活性。圖9提供了剩余NprE活性對pH的圖，闡明了鈣的添加在低和高pH穩(wěn)定了野生型 NprE 和五重 NprE 變體(S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)。發(fā)明的一般描述本發(fā)明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用于清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應(yīng)用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以 對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。除非另有指明，本發(fā)明的實踐涉及分子生物學、微生物學、以及重組DNA領(lǐng)域通常 所用的常規(guī)技術(shù)，它們在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們被描 述于大量的教材和參考文獻中(見，例如Sambrook等，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual”，第二版(Cold SpringHarbor)，1989 和 Ausubel 等，“Current Protocols inMolecularBiologyM987) 本文中(包括上文和下文中)提到的所有專利、專利申請、 文章和出版物都通過引用明確并入本文。除非在本文中另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員通常理解的含義。例如，Singleton 和 Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wiley andSons, NY(1994)；以及 Hale 和 Marham， The Harper Collins Dictionary ofBiology,Harper Perennial,NY(1991)為本令頁域技術(shù) 人員提供了許多本文所用的術(shù)語的一般解釋。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同 的任何方法和材料都可以用于本文中所描述的本發(fā)明的實踐，但本文中描述了優(yōu)選的方法 和材料。因此，通過作為一個整體參考該說明書更詳細的描述了以下即將定義的術(shù)語。同樣，如本文中所使用的，除非上下文明確另外指出，單數(shù)術(shù)語“一個”、“一種”和 “該”包括對復數(shù)的提及。數(shù)值范圍包括界定該范圍的數(shù)字。除非另外指出，分別地，核酸 以5’至3’方向從左至右書寫；氨基酸序列以從氨基至羧基的方向從左至右書寫。應(yīng)當理解，本發(fā)明不局限于描述的特定的方法、方案和試劑，因為取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們 的背景，它們可發(fā)生變化。此外，本文中提供的標題不是本發(fā)明多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗疲渲兴龅姆?面或?qū)嵤┓桨缚梢酝ㄟ^參考作為一個整體的本說明書獲得。因此，下文馬上定義的術(shù)語通 過參考作為一個整體的本說明書進行更充分地描述。然而，為了促進理解本發(fā)明，下文定義 了眾多術(shù)語。定義除非在本文中另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員通常理解的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料 都可以用于本文中所描述的本發(fā)明的實踐，但本文中描述了優(yōu)選的方法和材料。因此，通過 作為一個整體參考該說明書更詳細的描述了以下即將定義的術(shù)語。同樣，如本文中所使用 的，除非上下文明確另外指出，單數(shù)術(shù)語“一個”、“一種”和“該”包括對復數(shù)的提及。除非 另外指出，分別地，核酸以5’至3’方向從左至右書寫；氨基酸序列以從氨基至羧基的方向 從左至右書寫。應(yīng)當理解，本發(fā)明不局限于描述的特定的方法、方案和試劑，因為取決于本 領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們的背景，它們可發(fā)生變化。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最大數(shù)字界限意圖包括每個較小的數(shù)字界限， 如同在本文中明確地寫出此類較小的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最小數(shù) 字界限將包括每個較高的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較高的數(shù)字界限。在本 說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個數(shù)字范圍將包括落入這種較寬泛數(shù)字范圍內(nèi)的每個較窄的 數(shù)字范圍，如同在本文中明確地寫出此類較窄的數(shù)字范圍。在相關(guān)部分引用的所有文件通過參考并入本文；對于任何文件的引用不應(yīng)當被理 解為承認其為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。如本文中所用，術(shù)語“蛋白酶”和“蛋白酶解活性”指這樣的蛋白質(zhì)或肽，其顯示 水解肽或具有肽鍵的底物的能力。存在用于測量蛋白酶解活性的眾多熟知方法(見例如 Kalisz, “ Microbial Proteinases,“在Fiechter (編輯)，Advances in Biochemical EnRineerinR/BiotechnoloRY, 1988)。例如，蛋白酶解活性可以通過比較測定法確定，其 中所述比較測定法分析相應(yīng)蛋白酶水解商品底物的能力。在這種分析蛋白酶或蛋白酶 解活性中有用的示例性底物包括但不限于二-甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原蛋白 (SigmaC-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。使用 這些底物的比色測定法是本領(lǐng)域中熟知的(見例如W0 99/34011和美國專利號6，376，450， 兩篇均再此引入作為參考)。pNA測定法(見例如DelMar等人，Anal Biochem,99 =316-320, 1979)也發(fā)現(xiàn)用于確定梯度洗脫期間所收集級分的有效酶濃度。這種測定法測量酶水解可 溶性合成底物琥珀酰_丙氨酸_丙氨酸_脯氨酸_苯丙氨酸_對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時 釋放對硝基苯胺的速率。從水解反應(yīng)產(chǎn)生黃顏色的速率在分光光度計上于410nm處測量并 且與有效酶濃度成正比。此外，在280nm處的吸光度量值可以用來確定總蛋白濃度。有效 酶/總蛋白比產(chǎn)生了該酶純度。如本文所使用的，術(shù)語“NprE蛋白酶”和“NprE”指本文描述的中性金屬蛋白酶。 在一些優(yōu)選的實施方案中，NprE蛋白酶是在本文中命名為純化的MULTIFECT 中性 或PMN的蛋白酶，其來自解淀粉芽胞桿菌。因此，在一些實施方案中，術(shù)語“PMN蛋白酶”指衍生自解淀粉芽胞桿菌的具有與SEQ ID NO :3所提供的基本上同一的氨基酸序列的天然存 在的成熟蛋白酶。在備選的實施方案中，本發(fā)明提供了 NprE蛋白酶的部分。術(shù)語“芽孢桿菌蛋白酶同源物”指與衍生自解淀粉芽胞桿菌的成熟蛋白酶具有基 本上同一的氨基酸序列的天然存在蛋白酶，或編碼此類天然存在蛋白酶的多核苷酸序列， 并且所述蛋白酶保留由此類核酸編碼的中性金屬蛋白酶的功能特征。如本文中所用，使用術(shù)語“NprE變體，，和“NprE蛋白酶變體”指這樣的蛋白酶，所 述蛋白酶與野生型NprE相似、尤其在其功能上相似，但在其氨基酸序列中具有使它們在序 列上不同于野生型蛋白酶的突變。如本文中使用的，“芽孢桿菌屬物種”指所有在“芽孢桿菌”屬中的物種，其是革 蘭氏陽性細菌，并被歸類為桿菌(Bacilli)綱Bacillales目芽孢桿菌(Bacillaceae)科 的成員?！把挎邨U菌”屬包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“芽孢桿菌”屬中的所有種，其包括但 不限于，枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、遲緩芽孢桿菌 (B. lentus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪桿菌(B. stearothermophilus)、嗜堿芽孢 桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、耐鹽芽孢桿菌 (B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝固芽孢桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢 桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)和蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)。應(yīng) 當認識到，芽孢桿菌屬還將繼續(xù)經(jīng)歷分類重構(gòu)。因此，該屬包括已經(jīng)被重新分類的物種，這 包括但不限于嗜熱脂肪桿菌等生物，其現(xiàn)在被稱為“Geobacillus stearothermophilus”。 存在氧時產(chǎn)生抗性內(nèi)生孢子被認為是芽孢桿菌屬的界定特征，盡管該特征也適用于新 近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、硫 胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibaci 1 lus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybaci 1 lus)、短芽孢桿菌 屬(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿 菌(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、需鹽芽孢桿菌屬(Salibacillus)、 耐熱芽孢桿菌屬(Thermobacillus)、解脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬 (Virgibacillus)。相關(guān)的(和衍生的)蛋白質(zhì)包含“變體蛋白質(zhì)”。在一些優(yōu)選的實施方案中，變體 蛋白質(zhì)與親本蛋白質(zhì)之間以及變體蛋白質(zhì)彼此之間有少量氨基酸殘基不同。不同的氨基酸 殘基數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個氨基酸殘基。 在一些優(yōu)選的實施方案中，變體之間不同的氨基酸數(shù)目是1至10。在一些特別優(yōu)選的實施 方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)并且尤其是變體蛋白質(zhì)包含至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的氨基酸序列同一性。此外，本 文所使用的相關(guān)蛋白質(zhì)或變體蛋白質(zhì)是指在重要區(qū)域數(shù)目上與另一相關(guān)蛋白質(zhì)或親本蛋 白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。例如，在一些實施方案中，變體蛋白質(zhì)具有1、2、3、4、5或10個與親本 蛋白質(zhì)不同的相應(yīng)的重要區(qū)域。本領(lǐng)域已知數(shù)種方法適于產(chǎn)生本發(fā)明的酶的變體，包括但不限于位點飽和誘變、 掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、定點誘變和定向進化以及多種其它重組方法。通過任何合適的方法或“測試”來表征野生型和突變蛋白質(zhì)，并且優(yōu)選基于評估感 興趣的特性。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中確定PH和/或溫度、以及洗滌劑和/或氧 化穩(wěn)定性。實際上，預期在一個或多個這些特征(PH、溫度、蛋白酶解穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性和/或氧化穩(wěn)定性)中具有各種穩(wěn)定性程度的酶將是有用的。本文中可相互交換使用的術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”指任何長度的核苷酸的聚合 形式，無論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語包括但不限于單鏈、雙鏈或三鏈的 DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶堿基，或其他天然的、化學 的、生物化學修飾的、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。以下是多核苷酸的非限制性例 子基因、基因片段、染色體片段、EST、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組 多核苷酸、支化多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針 和引物。在一些實施方案中，多核苷酸包含修飾的核苷酸(諸如甲基化核苷酸)和核苷酸 類似物、尿嘧啶、其他糖和連接基團諸如氟代核糖(fluororibose)與硫代酯(thioate)和 核苷酸分支(nucleotide branche)。在備選實施方案中，核苷酸的序列被非核苷酸組分間 斷。如本文中所用，術(shù)語“DNA構(gòu)建體”和“轉(zhuǎn)化DNA”可互換地用來指用于將序列導入 宿主細胞或生物中所用的DNA。該DNA可以在體外通過PCR或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意 其他合適技術(shù)產(chǎn)生。在特別優(yōu)選的實施方案中，DNA構(gòu)建體包含目的序列(例如作為引入的 序列)。在一些實施方案中，該序列與額外元件諸如調(diào)控元件(例如啟動子等)有效連接。 該DNA構(gòu)建體還可以包含選擇標記。它還可以包含在側(cè)翼分布有同源性盒的引入的序列。 在其他實施方案中，轉(zhuǎn)化DNA包含添加至末端的其他非同源序列(例如填充序列或側(cè)翼序 列)。在一些實施方案中，引入的序列的末端閉合，從而該轉(zhuǎn)化DNA形成閉合環(huán)。所述轉(zhuǎn)化 序列可以是野生型、突變或修飾的。在一些實施方案中，該DNA構(gòu)建體包含與宿主細胞染色 體同源的序列。在其他實施方案中，該DNA構(gòu)建體包含非同源序列。一旦該DNA構(gòu)建體在 體外裝配起來，則它可以用來1)插入異源序列至宿主細胞的預期靶序列中；和/或2)誘 變宿主細胞染色體的區(qū)域(即用異源序列替換內(nèi)源序列)，3)缺失靶基因；和/或?qū)霃椭?型質(zhì)粒至宿主中。如本文中所用，術(shù)語“表達盒”和“表達載體”指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其 具有允許特定核酸在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定核酸元件。該重組表達盒可以摻入質(zhì)粒、 染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段。一般地，表達載體的重組表達盒部分包括 待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子，以及其他序列。在優(yōu)選的實施方案中，表達載體具有摻入和在 宿主細胞中表達異源DNA片段的能力。眾多原核和真核表達載體是市售的。對合適表達載 體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。術(shù)語“表達盒”在本文中與“DNA構(gòu)建體”以及它 們的語法等同物可互換地使用。對合適表達載體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。如本文中所用，術(shù)語“載體”指設(shè)計以將核酸導入至一個或多個細胞類型中的多核 苷酸構(gòu)建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、盒等。在一些實施方案中，所 述多核苷酸構(gòu)建體包含編碼蛋白酶(例如前體或成熟蛋白酶)的DNA序列，其中所述DNA 序列與能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在合適宿主中表達的合適前導序列(例如分泌序列等)有效連接。如本文中所用，術(shù)語“質(zhì)?！敝赣米骺寺≥d體并且在一些真核生物或原核生物中形 成染色體外自我復制性遺傳元件或整合至宿主染色體中的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建體。如本文在導入核酸序列至細胞中的上下文中所用，術(shù)語“導入”指適合轉(zhuǎn)移核酸 序列至細胞中的任意方法。此類導入方法包括但不限于原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、接合 和轉(zhuǎn)導(見例如 Ferrari 等人，“Genetics” 在 Hardwood 等人(編輯)，Bacillus, PlenumPublishing CorD.，第 57-72 頁，1989 中)。如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”和“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”指具有整合至其基因組中或作為 維持至少兩個世代的游離型質(zhì)粒的非天然(異源)多核苷酸序列的細胞。如本文中所用，術(shù)語“編碼選擇標記的核苷酸序列”指這樣的核苷酸序列，它能夠 在宿主細胞中表達并且其中該選擇標記的表達賦予含有所表達基因的細胞在相應(yīng)選擇劑 存在下或缺少必需養(yǎng)分時生長的能力。如本文中所用，術(shù)語“選擇標記”和“選擇性標記”指允許易于選擇含有所述載體的 那些宿主的能夠在宿主細胞中表達的核酸(例如基因)。此類選擇標記的實例包括但不限 于抗微生物劑。因而，術(shù)語“選擇標記”指這樣的基因，它們提供了宿主細胞已經(jīng)攝取外來目 的DNA或某種其他反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生的指示。一般，選擇標記是這樣的基因，它們賦予宿主細胞 抗微生物抗性或代謝優(yōu)勢以使得含有外源DNA的細胞區(qū)別于轉(zhuǎn)化期間沒有接受任何外源 序列的細胞?！霸∵x擇標記”是位于待轉(zhuǎn)化的微生物的染色體上的選擇標記。原住選擇標 記編碼與轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建體上的選擇標記不同的基因。選擇標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。 如上文所述，標記優(yōu)選地是抗微生物抗性標記(例如ampK ；phleoE ；specE ；kanE ；eryE ；tetE ； cmpK 禾口 neoK(見例如 Guerot-Fleury, Gene, 167 :335_337，1995 ；Palmeros 等人，Gene247 255-264，2000和Trieu-Cuot等人，Gene，23 :331_341，1983)。根據(jù)本發(fā)明有用的其他標記 包括但不限于營養(yǎng)缺陷型標記諸如色氨酸；和檢測標記，諸如半乳糖苷酶。如本文中所用，術(shù)語“啟動子”指發(fā)揮指導下游基因轉(zhuǎn)錄的作用的核酸序列。在優(yōu) 選的實施方案中，啟動子適于其中表達靶基因的宿主細胞。該啟動子，連同其他轉(zhuǎn)錄性和翻 譯性調(diào)節(jié)核酸序列(又稱作“調(diào)控序列”)對于表達給定基因是必需的。通常，該轉(zhuǎn)錄性和 翻譯性調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起 始和終止序列和增強子或激活子序列。當一種核酸與另一個核酸序列處于功能性關(guān)系中時，它是“有效連接的”。例如，如 果表達為參與多肽分泌的前蛋白，則編碼分泌性前導序列(即信號肽)的DNA與編碼多肽 的DNA有效連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子與編碼序列有 效連接；或者，如果核糖體結(jié)合位點的放置促進翻譯，則核糖體結(jié)合位點與編碼序列有效連 接。通常，“有效連接”意指連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌性前導序列的情況下，是 連續(xù)且符合可讀相的(in reading phase) 0然而，增強子不必是連續(xù)的。連接通過在便利 的限制性位點處連接而完成。如果此類位點不存在，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成性寡核苷酸 銜接頭或接頭。如本文中所用，術(shù)語“基因”是指這樣的多核苷酸(例如，DNA區(qū)段)，該多核苷酸 編碼多肽并包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，也包括在各個編碼區(qū)段(外顯子)之間的間 插序列(內(nèi)含子)。如本文中所用，“同源基因”指來自不同但通常相關(guān)物種的基因?qū)?，它們相互對?yīng) 并且是彼此同一或極為相似的。該術(shù)語包括因物種形成(即新物種發(fā)展)而分離的基因 (例如直向同源基因)，以及因遺傳復制而分離的基因(例如旁系同源基因)。如本文中所用，“直向同源物”和“直向同源基因”指不同物種中因物種形成而已經(jīng) 從共同先祖基因(即同源基因)進化的基因。一般地，直向同源物在進化期間仍保留相同 的功能。直向同源物的鑒定用于新測序基因組中可靠地預測基因功能。
如本文中所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指因基因組內(nèi)部復制而相關(guān)的基 因。盡管直向同源物在進化期間自始至終保留相同的功能，然而旁系同源物演化出新功能， 即便一些功能往往與初始功能相關(guān)。旁系同源基因的例子包括，但不限于編碼胰蛋白酶、糜 蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，其中所述酶均為絲氨酸蛋白酶并在相同物種中共同 存在。如本文中所用，“同源性”指序列相似性或同一性，優(yōu)選同一性。使用本領(lǐng)域已知的 標準技術(shù)(見例如 Smith 和 Waterman，Adv. App 1. Math.，2 :482，1981 ；Needleman 和 Wunsch， J. Mol. Biol. ,48 :443，1970 ；Pearson 禾口 Lipman，Proc. Natl. AcacL Sci. USA, 85 :2444，1988 ； 程序諸如 WisconsinGenetics 軟件包 Ge netics Computer Group, Madison, WI 中的 GAP、 BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 以及 Devereux 等人，Nuc 1. Acid Res.，12 :387_395，1984]確定 這種同源性。如本文中所用，“類似序列”是這樣一種序列，其中所述基因的功能基本上與基于 解淀粉芽胞桿菌NprE蛋白酶的基因相同。另外，類似基因包括與解淀粉芽胞桿菌NprE蛋 白酶的序列至少約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約 85 %、約90 %、約95 %、約97 %、約98 %、約99 %或約100 %的序列同一性。在額外的實施 方案中，超過一種上述屬性適用于該序列。類似序列通過已知的序列比對方法確定。常見 使用的比對方法是BLAST，盡管如上文及下文所示，存在用于比對序列的其他方法。一個有用算法的實例是PILEUP。使用累進配對比對法，PILEUP從一組相關(guān)序 列產(chǎn)生多重序列比對結(jié)果。它也可以繪制顯示聚類關(guān)系的進化樹，其中所述聚類關(guān)系用 來產(chǎn)生該比對結(jié)果。PILEUP使用Feng和Doolittle累進比對方法(Feng和Doolittle, J. Mol. Evol. ,35 =351-360,1987)的簡化形式。該方法類似于Higgins和Sharp描述的方法 (Higgins 和 Sharp，CABI0S5 151-153，1989)。有用的 PILEUP 參數(shù)包括缺省空位權(quán)重 3. 00、 缺省空位長度權(quán)重0. 10和加權(quán)末端空位。有用算法的另一個實例是由Altschul等人(Altschul等人，J. Mol. Biol.，215 403-410，1990 和 Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA，90 :5873_5787，1993)描述的 BLAST算法。一個特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(見，Altschul等人，Meth. Enzymol.，266 =460-480,1996)。WU-BLAST-2使用數(shù)個搜索參數(shù)，其中大部分設(shè)置為缺省 值。設(shè)置具有以下值的可調(diào)節(jié)參數(shù)重疊覆蓋區(qū)=1，重疊分數(shù)=0. 125，字閾值(T) = 11。 HSP S和HSP S2參數(shù)是動態(tài)值并且根據(jù)具體序列的組成和具體數(shù)據(jù)庫的組成，由程序自身 建立，其中目的序列針對所述具體數(shù)據(jù)庫進行檢索。然而，可以調(diào)節(jié)所述值以提高靈敏度。 八％氨基酸序列同一性值由匹配的相同殘基數(shù)除以比對區(qū)域中“較長”序列的殘基總數(shù)確 定?！拜^長”序列是比對區(qū)域中具有最多實際殘基的序列(忽略由WU-Blast-2導入以使得 比對評分最大化的空位)。因而，“核酸序列同一性百分數(shù)(％)”定義為候選序列中與起始序列(即目的 序列)的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基百分數(shù)。一個優(yōu)選的方法使用設(shè)置成缺省參數(shù)的 WU-BLAST-2的BLASTN模塊，重疊覆蓋區(qū)和重疊分數(shù)分別設(shè)置成1和0. 125。如本文中所用，術(shù)語“雜交”指核酸的一條鏈通過堿基配對作用與互補鏈結(jié)合的過 程，如本領(lǐng)域已知的那樣。如果兩個序列在中至高嚴格雜交和洗滌條件下彼此特異地雜交，則將一個核酸序列視為與一個參考核酸序列“可選擇性雜交”。雜交條件基于核酸結(jié)合復合體或探針的解 鏈溫度(Tm)。例如，“最大嚴格性”一般在約Tm-5°C (比探針的Tm低5°C )上出現(xiàn)；“高嚴 格性”在低于該Tm約5-10°C上出現(xiàn)；“中等嚴格性”在低于探針Tm的10_20°C上出現(xiàn)并且 “低嚴格性”在低于該Tm約20-25°C上出現(xiàn)。在功能上，最大嚴格性條件可以用來鑒定與雜 交探針具有嚴格同一性或近乎嚴格同一性的序列；而中等或低嚴格雜交可以用來鑒定或檢 測多核苷酸序列同源物。
中等至高嚴格雜交是本領(lǐng)域熟知的。高嚴格性條件的實例包括在約42°C于50% 甲酰胺，5X SSC，5XDenhardt，s溶液，0.5% SDS和100 μ g/ml變性載體DNA中雜交，隨后 在室溫于2X SSC和0. 5% SDS中洗滌2次并且在42°C于0. 1 X SSC和0. 5% SDS中額外洗 滌2次。中等嚴格條件的例子包括在37°C于包含20%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM檸 檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,5XDenhardt' s溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性 剪切鮭精DNA的溶液中過夜溫育，隨后在約37-50°C于IXSSC中洗滌濾膜。本領(lǐng)域技術(shù)人 員知道如何按照需要調(diào)節(jié)溫度、離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等的因素。如本文中所用，“重組體”包括對細胞或載體的稱謂，其中所述的細胞或載體已經(jīng) 通過導入異源核酸序列被修飾或所述細胞從如此修飾的細胞衍生。因而，例如重組細胞表 達在該細胞的天然(非重組)形式中不以相同形式存在的基因或因人有意干預而異常表 達、不足表達或根本不表達的天然基因。“重組”、“進行重組”和生成“重組的”核酸一般是 兩個或多個核酸片段的裝配，其中所述裝配產(chǎn)生嵌合基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用在至少一個密碼子中的位點飽和誘變法產(chǎn)生突變 DNA序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，對2個或多個密碼子進行位點飽和誘變。在其他實 施方案中，突變DNA序列與野生型序列具有超過約50 %、超過約55 %、超過約60 %、超過約 65%、超過約70%、超過約75%、超過約80%、超過約85%、超過約90%、超過約于95%或 超過約98%的同源性。在備選實施方案中，使用任意的已知誘變方法例如，諸如輻射、亞硝 基胍等，在體內(nèi)產(chǎn)生突變DNA。隨后分離期望的DNA序列并用于本文提供的方法中。如本文中所用，術(shù)語“靶序列，，指宿主細胞中編碼這樣序列的DNA序列，其中期望 在所述序列處將引入的序列插入宿主細胞基因組。在一些實施方案中，靶序列編碼有功能 的野生型基因或操縱子，而在其他實施方案中，靶序列編碼有功能的突變基因或操縱子，或 無功能的基因或操縱子。如本文中所用，“側(cè)翼序列”指位于所討論序列上游或下游的任意序列(例如，對 于基因A-B-C，基因B在側(cè)翼具有A和C基因序列)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該引入的 序列在每一側(cè)具有同源盒。在另一實施方案中，該引入的序列和同源盒包含在每一側(cè)具有 填充序列的單元。在一些實施方案中，側(cè)翼序列僅在單側(cè)(3’或5’)存在，但是在優(yōu)選的實 施方案中，它在側(cè)翼相接的序列的每一側(cè)存在。在一些實施方案中，側(cè)翼序列僅在單側(cè)(3’ 或5’ )存在，而在優(yōu)選的實施方案中，它在側(cè)翼相接的序列的每一側(cè)存在。如本文中所用，術(shù)語“填充序列”指在同源盒側(cè)翼的任意額外DNA(—般是載體序 列)。然而，該術(shù)語包括任意非同源的DNA序列。不受任何理論限制，填充序列為細胞提供 了非關(guān)鍵靶以啟動DNA攝取。如本文中所用，術(shù)語“擴增”和“基因擴增”指這樣的過程，其中憑借該過程不成比 例地復制特異的DNA序列，從而使得擴增的基因以比起初基因組中拷貝數(shù)更高的拷貝數(shù)存在。在一些實施方案中，通過在藥物(例如可抑制酶的抑制物)存在下生長而選擇細胞(這 導致編碼在該藥物存在下生長所需的基因產(chǎn)物的內(nèi)源性基因擴增)，或通過擴增編碼這種 基因產(chǎn)物的外源(即輸入)序列或這兩種方式選擇細胞?！皵U增”是涉及模板特異性的核酸復制的具體情形。它與非特異性模板復制(即具 有模板依賴性但不依賴于特異性模板的復制)形成對比。模板特異性這里區(qū)別于復制忠實 性(即正確多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)特異性。 模板特異性往往 以術(shù)語“靶”特異性描述。靶序列是在尋求將其與其他核酸相區(qū)分開的意義上的“靶”。已 經(jīng)設(shè)計擴增技術(shù)主要用于這種區(qū)分過程。如本文中所用，術(shù)語“共擴增”指將可擴增標記連同其他基因序列(即包含一個或 多個不可選擇性基因，諸如表達載體中所包含的那些基因)導入單個細胞并且施加適宜的 選擇壓力，從而使得該細胞擴增該可擴增標記和其它不可選擇性基因序列。這個可擴增標 記可以與其它基因序列物理地連接，或備選地，可將一個含有可擴增標記以及另一個含有 非選擇標記的兩個獨立DNA片段導入相同的細胞。如本文中所用，術(shù)語“可擴增標記”、“可擴增基因”和“擴增載體”指在適宜生長條 件下允許該基因擴增的基因或編碼基因的載體?！澳０逄禺愋浴痹诖蠖鄶?shù)擴增技術(shù)中通過酶的選擇實現(xiàn)。擴增酶是在使用這些酶 的條件下僅會處理異質(zhì)性核酸混合物中特定核酸序列的酶。例如在Q3復制酶的情況下， MDV-I RNA是該復制酶的特異性模板(見例如Kacian等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 3038,1972)并且其他核酸不被這種擴增酶復制。類似地，在T7RNA聚合酶的情況下，這種 擴增酶具有對其自身啟動子的嚴格特異性(見Chamberlin等人，Nature 228 ,221,1970)。 在T4DNA連接酶的情況下，該酶不會連接其中寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間在連接 接合處存在錯配的兩個寡核苷酸或多核苷酸(見Wu和Wallace，Genomics 4 :560，1989)。 最后，由于Taq和Pfu聚合酶在高溫下發(fā)揮作用的能力，發(fā)現(xiàn)它們針對由弓丨物結(jié)合并且因而 限定的序列表現(xiàn)高度特異性；所述高溫產(chǎn)生促進引物與靶序列雜交而不與非靶序列雜交的 熱動力條件。如本文中所用，術(shù)語“可擴增的核酸”指可以由任意擴增方法擴增的核酸。考慮了 “可擴增的核酸”通常包含“樣品模板”。如本文中所用，術(shù)語“樣品模板”指源自樣品的核酸，其中對所述樣品分析“靶”(下 文定義的)的存在。相反，“背景模板”用來指代樣品模板之外的核酸，它可能存在或可能不 存在于樣品中。背景模板最經(jīng)常地是偶然存在的。它可以是夾帶的結(jié)果，或它可以因試圖 從樣品中純化去除的核酸雜質(zhì)的存在所致。例如，來自待檢測生物之外的生物的核酸可以 作為背景存在于試樣中。如本文中所用，術(shù)語“引物”指這樣的寡核苷酸，無論天然存在(如在純化的限制 性消化產(chǎn)物中)或合成地產(chǎn)生，其中當將所述寡核苷酸置于誘導互補于一條核酸鏈的引物 延伸產(chǎn)物合成的條件(即存在核苷酸和誘導劑(諸如DNA聚合酶)和在適宜的溫度和pH 上)下時，其能夠充當合成的起始點。為了擴增中的最大效率，引物優(yōu)選地是單鏈的，但可 以備選地為雙鏈。若為雙鏈，首先處理該引物以在使用其制備延伸產(chǎn)物前分開其鏈。優(yōu)選 地，該引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在誘導劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物合成。引 物的確切長度將取決于眾多因素，這包括溫度、引物來源和所用的方法。
如本文中所用，術(shù)語“探針”指能夠與另一種目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核 苷酸序列)，無論它是天然存在的(如在純化的限制性消化產(chǎn)物中)或合成地、重組地或由 PCR擴增產(chǎn)生。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針用于檢測、鑒定和分離特定的基因序列。 考慮了在本發(fā)明中使用的任意探針將以任何“報告分子”標記，從而使得其可在任意檢測系 統(tǒng)中檢測，所述檢測系統(tǒng)包括，但不限于酶(例如ELISA以及基于酶的組織化學測定法)、熒 光、放射性和化學發(fā)光系統(tǒng)。不意圖將本發(fā)明限于任何具體檢測系統(tǒng)或標記物。 如本文中所用，當談及聚合酶鏈反應(yīng)時，術(shù)語“靶”指由用于聚合酶鏈反應(yīng)的引物 限定的核酸區(qū)域。因而，試圖將“靶”與其他核酸序列區(qū)別開?！皡^(qū)段”定義為靶序列內(nèi)部的 核酸區(qū)域。如本文中所用，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)指美國專利號4，683，195、 4，683，202和4，965，188 (其在此引入作為參考)的方法，所述方法包括用于在不進行克隆 或純化的情況下提高基因組DNA混合物中靶序列區(qū)段的濃度的方法。這一用于擴增靶序列 的方法由以下步驟組成將大量過量的兩種寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混 合物中，隨后在DNA聚合酶的存在下進行精確的熱循環(huán)順序。兩個引物與雙鏈靶序列中它 們各自的鏈互補。為實現(xiàn)擴增，變性該混合物并然后使引物退火至靶分子中它們的互補鏈。 退火后，應(yīng)用聚合酶延伸引物，從而形成新的互補鏈對?？梢远啻沃貜妥冃浴⒁锿嘶鸷途?合酶延伸的步驟(即，變性、退火和延伸組成一個“循環(huán)”；可以有許多個“循環(huán)”)，以獲得期 望靶序列的高濃度擴增區(qū)段。期望靶序列擴增區(qū)段的長度由引物相對于彼此之間的相對位 置決定，并且因此這一長度是可控制的參數(shù)。由于該過程的重復方面，將該方法稱為“聚合 酶鏈式反應(yīng)”(此后稱為“PCR”)。因為期望擴增的靶序列區(qū)段在該混合物中變成優(yōu)勢序列 (就濃度而言)，所以稱它們是“PCR擴增”的。如本文中所用，術(shù)語“擴增試劑”指除引物、核酸模板和擴增酶之外的為擴增所需 的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。一般，將擴增試劑連同其他反應(yīng)組分置 于并納入反應(yīng)容器(試管、微孔等)中。采用PCR，有可能將基因組DNA中單拷貝的特異性靶序列擴增至通過幾種不同方 法(例如與標記探針雜交；摻入生物素化引物，隨后進行抗生物素蛋白_酶綴合物檢測；摻 入32P-標記的脫氧核苷酸三磷酸諸如dCTP或dATP至擴增的區(qū)段)可檢測的水平。除基因 組DNA之外，還可以用適宜的成套引物分子擴增任意的寡核苷酸或多核苷酸序列。特別地， 由PCR過程自身產(chǎn)生的擴增區(qū)段本身是后繼PCR擴增的高效模板。如本文中所用，術(shù)語“PCR產(chǎn)物”、“PCR片段”和“擴增產(chǎn)物”指兩輪或多輪變性、退 火和延伸的PCR步驟結(jié)束后所得的化合物混合物。這些術(shù)語包括其中已經(jīng)擴增一個或多個 序列的一個或多個區(qū)段的情況。如本文中所用，術(shù)語“RT-PCR”指RNA序列的復制和擴增。在這個方法中，逆轉(zhuǎn)錄偶 聯(lián)于PCR，最經(jīng)常地使用其中使用熱穩(wěn)定性聚合酶的單一酶方法，如美國專利號5，322，770 中所述，所述專利在此引入本文作為參考。在RT-PCR中，RNA模板因聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活 性轉(zhuǎn)換成cDNA，并隨后使用聚合酶的聚合活性(即如同其他PCR方法中那樣)進行擴增。如本文中所用，術(shù)語“限制性核酸內(nèi)切酶”和“限制性酶”指細菌酶，其每一個都在 特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA?！跋拗菩晕稽c，，指由給定的限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割的核苷酸序列，并且其往往是用于插入DNA片段的位點。在本發(fā)明的某些實施方案中，將限制性位點改造入選擇標 記中和改造入DNA構(gòu)建體的5，和3，末端。如本文中所用，術(shù)語“染色體整合”指引入的序列籍此導入宿主細胞染色體的過 程。轉(zhuǎn)化DNA的同源區(qū)域與染色體的同源區(qū)域整列。隨后，同源盒之間的序列在雙交換中 由引入的序列替換(即同源重組)。在本發(fā)明的一些實施方案中，DNA構(gòu)建體的失活性染色 體區(qū)段的同源部分與芽孢桿菌染色體的固有染色體區(qū)域的側(cè)翼同源區(qū)整列。隨后，所述固 有染色體區(qū)域在雙交換中由該DNA構(gòu)建體缺失(即同源重 組)?！巴粗亟M”意指兩個DNA分子或配對染色體之間在同一或幾乎同一的核苷酸序列 位點處交換DNA片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，染色體整合是同源重組。如本文中所用的“同源序列，，意指為比較而最佳比對時，與另一個核酸或多肽序 列具有約100%、約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約 91 %、約90 %、約88 %、約85 %、約80 %、約75 %或約70 %序列同一性的核酸或多肽序列。 在一些實施方案中，同源序列具有約85%至約100%的序列同一性，而在其他實施方案中， 存在約90%至約100%的序列同一性，并且在更優(yōu)選的實施方案中，存在約95%至約100% 的序列同一性。如本文中所用，“氨基酸”指肽或蛋白質(zhì)序列或其部分。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多 肽”可互換地使用。如本文中所用，術(shù)語“異源蛋白，，指不天然存在于宿主細胞中的蛋白質(zhì)或多肽。異 源蛋白的實例包括酶，諸如水解酶，包括蛋白酶。在一些實施方案中，編碼蛋白質(zhì)的基因是 天然存在的基因，而在其他實施方案中，使用突變基因和/或合成基因。如本文中所用，“同源蛋白”指細胞中本來或天然存在的蛋白質(zhì)或多肽。在優(yōu)選 的實施方案中，所述細胞是革蘭氏陽性細胞，而在特別優(yōu)選的實施方案中，該細胞是芽孢桿 菌屬宿主細胞。在備選的實施方案中，同源蛋白是由其他生物產(chǎn)生的天然蛋白，所述其他 生物包括但不限于大腸桿菌、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬 (Aspergillus)生物。本發(fā)明包括憑借重組DNA技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白的宿主細胞。如本文中所用，“操縱子區(qū)”包含作為單一轉(zhuǎn)錄單元從共同啟動子轉(zhuǎn)錄并因而經(jīng)歷 共調(diào)節(jié)作用的一組連續(xù)基因。在一些實施方案中，操縱子包括調(diào)節(jié)基因。在最優(yōu)選的實施 方案中，使用這樣的操縱子，其中該操縱子高度表達，如由RNA水平所測量的那樣，但具有 未知或不需要的功能。如本文中所用、“抗微生物區(qū)域”是含有編碼抗微生物蛋白的至少一個基因的區(qū) 域。如果某多核苷酸在其天然狀態(tài)下或由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法操作時，可以被 轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生RNA、多肽或其片段，則稱該多核苷酸“編碼” RNA或多肽。還稱此類 核酸的反義鏈編碼了該序列。如本領(lǐng)域已知，DNA可以被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生RNA，但是RNA可以被逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生DNA。因而DNA可以編碼RNA并且反之亦然。術(shù)語“調(diào)節(jié)區(qū)段”或“調(diào)節(jié)序列”或“表達調(diào)控序列”指DNA的多核苷酸序列，其中 所述多核苷酸序列與編碼多肽鏈的氨基酸序列的DNA的多核苷酸序列有效連接以實現(xiàn)所 編碼氨基酸序列的表達。調(diào)節(jié)序列可以抑制、阻遏或促進有效連接的編碼氨基酸的多核苷酸序列表達?！八拗髦辍被颉八拗骷毎敝笇τ诎景l(fā)明DNA的表達載體適合的宿主。 如果一種酶在所述細胞中以比相應(yīng)野生型細胞中表達此酶的水平更高的水平表 達，則該酶在宿主細胞中“過量表達”。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文可互換地使用。在本公開內(nèi)容中通篇使用如按照 IUPAC-IUB生物化學命名聯(lián)合委員會(JCBN)定義的氨基酸3字母代碼。也應(yīng)當理解，由于 遺傳密碼子的簡并性，多肽可以由多于一個核苷酸序列編碼。“前序列(prosequence) ”是在信號序列與成熟蛋白酶之間對于該蛋白酶分泌為必 需的氨基酸序列。該前序列的切割會產(chǎn)生成熟的活性蛋白酶。術(shù)語“信號序列”或“信號肽”指參與成熟或前體形式的蛋白質(zhì)分泌的任意核苷酸 序列和/或氨基酸序列。信號序列的這個定義是一個功能性定義，意指包括由該蛋白質(zhì)基 因的N端部分編碼的、參與實現(xiàn)蛋白質(zhì)分泌的全部那些氨基酸序列。它們通常但并非普遍 地與蛋白質(zhì)的N端部分或與前體蛋白的N端部分結(jié)合。信號序列可以是內(nèi)源或外源的。信 號序列可以是通常與該蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)連接的信號序列，或可以來自編碼另一種分 泌性蛋白的基因。一個示例性外源信號序列包含來自枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號序 列的頭7個氨基酸殘基，所述的氨基酸殘基與來自緩慢芽孢桿菌(ATCC 21536)的枯草桿菌 蛋白酶的信號序列的剩余部分融合。術(shù)語“雜合信號序列”指其中部分序列從表達宿主獲得的與待表達基因的信號序 列融合的信號序列。在一些實施方案中，使用合成性序列。術(shù)語“成熟”形式的蛋白質(zhì)或肽指該蛋白質(zhì)或肽的最終功能性形式，例如，成熟形 式的本發(fā)明NprE蛋白酶至少包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列。術(shù)語“前體”形式的蛋白質(zhì)或肽指這樣的成熟形式蛋白質(zhì)，其具有與該蛋白質(zhì)的氨 基端或羧基端有效連接的前序列。該前體也可以具有與該前序列的氨基端有效連接的“信 號”序列。該前體還可以具有參與翻譯后活性的額外多核苷酸(例如從中被切除以留下成 熟形式蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸)。“天然存在的酶”指具有與在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列同一的未修飾氨基酸序 列的酶。天然存在的酶包括天然酶，即天然表達的或在特定微生物中發(fā)現(xiàn)的那些酶。術(shù)語“從......衍生”和“從......獲得”不僅指由所討論生物的菌株產(chǎn)生或可
產(chǎn)生蛋白酶，還指由分離自此菌株的DNA序列編碼和在含有此DNA序列的宿主生物中產(chǎn)生 的蛋白酶。另外，該術(shù)語指由合成來源和/或cDNA來源的DNA序列編碼并且具有所討論蛋 白酶的鑒別特征的蛋白酶。例如，“從芽孢桿菌屬物種衍生的蛋白酶”指那些具有蛋白水解 活性的、由芽孢桿菌屬物種天然產(chǎn)生的酶，以及還指類似于由芽孢桿菌屬物種來源產(chǎn)生的 那些、但通過應(yīng)用基因工程技術(shù)由轉(zhuǎn)化有編碼所述中性金屬蛋白酶的核酸的非解淀粉芽胞 桿菌生物產(chǎn)生的中性金屬蛋白酶?！把苌铩痹谠摱x的范圍內(nèi)通常仍使在野生型、天然或親代形式中觀察到的特征 性蛋白酶解活性保留至這樣的程度，即該衍生物用于與野生型、天然或親代形式相似的目 的。中性金屬蛋白酶的功能性衍生物包括具有本發(fā)明中性金屬蛋白酶一般特征的天然存在 的、合成或重組產(chǎn)生的肽或肽片段。術(shù)語“功能性衍生物”指具有編碼中性金屬蛋白酶的核酸的功能特征的核酸的衍生物。編碼本發(fā)明中性金屬蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重組產(chǎn) 生的核酸或片段，并且編碼本發(fā)明的中性金屬蛋白酶特征?；诒绢I(lǐng)域已知的遺傳密碼子 簡并性，編碼本發(fā)明中性金屬蛋白酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因和同源物。在兩個核酸序列或多肽序列的上下文中的術(shù)語“同一的”指這兩個序列中為了最 大對應(yīng)性而比對時是相同的殘基，其中所述最大對應(yīng)性如使用以下序列比較或分析算法之 一測量的那樣。 術(shù)語“最佳比對”指產(chǎn)生最高同一性百分數(shù)評分的比對?！靶蛄型恍园俜謹?shù)”、“氨基酸序列同一性百分數(shù)”、“基因序列同一性百分數(shù)”和/ 或“核酸/多核苷酸序列同一性百分數(shù)”就兩個氨基酸序列、多核苷酸序列和/或基因序列 (如適宜的話)而言，指當最佳比對所述序列時這兩個序列中相同的殘基的百分數(shù)。因而， “80%氨基酸序列同一性”意指這兩個最佳比對的多肽序列中的80%氨基酸是同一的。短語“基本上同一的”在兩個核酸或多肽的上下文中因而指這樣的多核苷酸或多 肽，其中當使用程序或算法(例如81^1^1^10^140，使用標準參數(shù)，與參考序列相比 時，所述多核苷酸或多肽包含至少約70%序列同一性、優(yōu)選至少約75%、優(yōu)選至少約80%、 優(yōu)選至少約85 %、優(yōu)選至少約90 %、優(yōu)選至少約95 %、優(yōu)選至少約97 %、優(yōu)選至少約98 %并 且優(yōu)選至少約99%序列同一性。兩個多肽基本上同一的一個指示是第一多肽與第二多肽發(fā) 生免疫學交叉反應(yīng)。一般地，因保守性氨基酸替換而不同的多肽是免疫學交叉反應(yīng)的。因 此，例如，當兩個肽僅因保守性替換而不同時，一個多肽與第二多肽基本上同一。兩個核酸 序列基本上同一的另一個指示是這兩個分子在嚴格條件(例如在中等至高嚴格性范圍內(nèi)) 下相互雜交。術(shù)語“分離的”或“純化的”指從其初始環(huán)境(例如天然環(huán)境，如果它是天然存在的 話)中取出的物質(zhì)。例如，當該物質(zhì)在特定組合物中以高于或低于天然存在生物或野生型 生物中的濃度存在或與從天然存在生物或野生型生物表達時通常不存在的組分聯(lián)合存在 時，稱該物質(zhì)是“純化”的。例如，在活的動物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離 的，然而與該天然系統(tǒng)中一些或全部共存物質(zhì)分開的該相同多核苷酸或多肽是分離的。此 類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且 仍是分離的，因為這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。在優(yōu)選的實施方案中，例如 如果核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠或印跡中產(chǎn)生基本上一條帶，則稱它是純化的。當談及DNA序列使用時，術(shù)語“分離的，，指這樣的DNA序列，其中所述DNA序列已 經(jīng)從天然遺傳環(huán)境中移除并且因而不含有其他外部或不想要的編碼序列，并且處于適合在 基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。此類分離的分子是與其天然環(huán)境分開的那些分子 并且包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含有通常與之連接的其他基因， 但可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，諸如啟動子和終止子。鑒定相關(guān)的區(qū)域?qū)Ρ绢I(lǐng) 域普通技術(shù)人員將是顯而易見的(見例如Dynan和Tijan，Nature316 =774-78,1985)。術(shù) 語“分離的DNA序列”備選地稱作“克隆的DNA序列”。當談及蛋白質(zhì)使用時，術(shù)語“分離的”指在其天然環(huán)境之外的條件下存在的蛋白 質(zhì)。在一個優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本上不含其他蛋白質(zhì)，尤其其他同源蛋白。分離 的蛋白質(zhì)具有超過約10%的純度、優(yōu)選超過約20%的純度并且甚至更優(yōu)選超過約30%的 純度，如SDS-PAGE所確定的那樣。本發(fā)明的其他方面包括高度純化形式(即超過約40%純度、超過約60%純度、超過約80%純度、超過約90%純度、超過約95%純度、超過約97%純 度并且甚至超過約99%純度)的蛋白質(zhì)，如SDS-PAGE所確定的那樣。可應(yīng)用以下盒式誘變法以幫助構(gòu)建本發(fā)明的酶變體，盡管也可以使用其它方法。 首先，如本文所述，獲得編碼該酶的天然存在的基因并且全部或部分測序。然后，掃描該序 列以獲得這樣的位置，即在該位置上期望制造所編碼的酶的一個或多個氨基酸的突變(缺 失、插入或替換)。評估這一位置兩側(cè)的序列中限制性位點的存在，用于用寡核苷酸庫替換 該基因的短區(qū)段，其中當表達所述寡核苷酸庫時，其將 編碼變體突變。此類限制性位點優(yōu)選 是該蛋白基因中獨特的位點，以易于置換該基因區(qū)段。然而，不在該酶基因中過度冗余的任 何常規(guī)限制性位點都可以使用，只要由限制性消化產(chǎn)生的基因片段可以以適當?shù)捻樞蛟俳M 裝。如果在離所選擇的位點方便的距離之內(nèi)(10至15個核苷酸)的位置上不存在限制性 位點的話，通過在該基因中替換堿基產(chǎn)生此類位點，其中以如下所述方式進行所述替換，即 所示方式使得最終的構(gòu)建體中既沒有改變閱讀框，也沒有改變其編碼的氨基酸。根據(jù)本領(lǐng) 域公知的方法，通過M13引物延伸完成基因突變，以將其序列改變?yōu)榕c期望的序列一致。通 過遺傳密碼子的簡并性、基因的限制性酶圖譜以及大量不同的限制性酶按常規(guī)地完成定位 合適的側(cè)翼區(qū)段以及評估所需改變的任務(wù)，以得到兩個適當?shù)南拗菩孕蛄?。注意到如果?利用合適的側(cè)翼限制性位點的話，僅需與不含有位點的側(cè)翼區(qū)段相關(guān)地應(yīng)用上述方法。一旦克隆了天然存在的DNA和/或合成的DNA，則用相關(guān)的限制性酶消化待突變位 置側(cè)翼的限制性位點，并將復數(shù)個末端互補的寡核苷酸盒與該基因連接。這一方法簡化了 誘變，因為可以合成所有的這些寡核苷酸以具有相同的限制性位點，并且不需要合成的接 頭以產(chǎn)生限制性位點。如本文所用，“相應(yīng)于”指在蛋白質(zhì)或多肽中所列舉出的位置上的殘基，或與在蛋 白質(zhì)或多肽中所列舉出的殘基類似、同源或等價的殘基。如本文所用，“相應(yīng)區(qū)域” 一般指沿著蛋白質(zhì)或親本蛋白質(zhì)相關(guān)的類似位置。如本文中所用，術(shù)語“組合誘變法”指其中產(chǎn)生起始序列的變體文庫的方法。在 這些文庫中，所述變體含有選自預定義突變集合的一個或幾個突變。此外，所述方法提供 了導入隨機突變的手段，其中所述隨機突變不是預定義突變集合的成員。在一些實施方案 中，所述方法包括在2000年10月26日提交的美國專利申請?zhí)?9/699，250(其在此引入作 為參考)中描述的那些方法。在備選的實施方案中，組合誘變方法包括市售試劑盒(例如 QUIKCHANGE Multisite, Stratagene, San Diego, CA)。如本文中所用，術(shù)語“突變體文庫”指絕大部分基因組相同但包括一個或多個基因 的不同同源物的細胞群體。此類文庫可以用來例如鑒定具有改良性狀的基因或操縱子。如本文中所用，術(shù)語“起始基因”和“親本基因”指編碼目的蛋白的目的基因，其中 所述的目的蛋白待使用本發(fā)明進行改良和/或改變。如本文中所用，術(shù)語“多重序列比對”和“MSA”指使用算法(例如Clustal W)進 行比對的一個起始基因的多個同源物的序列。如本文中所用，術(shù)語“共有序列，，和“規(guī)范序列，，指具體目的蛋白質(zhì)或目的序列的 全部變體與之進行比較的原型氨基酸序列。該術(shù)語也指顯示目的DNA序列中最經(jīng)常存在的 核苷酸的序列。對于基因的每個位置，共有序列給出在MSA中該位置內(nèi)最多見的氨基酸。如本文中所用，術(shù)語“共有突變”指起始基因序列和共有序列中的差異。共有突變通過比較起始基因的序列和從MSA獲得的共有序列進行鑒定。在一些實施方案中，將共有 突變導入起始基因，從而使得起始基因變得與共有序列更相似。共有突變也包括將起始基 因中的氨基酸改變成下述氨基酸的氨基酸變化，其中所述氨基酸相對于起始基因中該氨基 酸的頻率更頻繁地在該位置處出現(xiàn)于MSA中。因而，術(shù)語共有突變包含用比MSA中氨基酸 更豐富的氨基酸替換起始基因中氨基酸的全部單一氨基酸改變 。術(shù)語“修飾的序列”和“修飾的基因”在本文中可互換地用來指包括天然存在的核 酸序列中的缺失、插入或間斷的序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，修飾序列的表達產(chǎn)物是截 短的蛋白質(zhì)(例如如果所述修飾是序列缺失或間斷的話)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中， 這種截短的蛋白質(zhì)仍保留生物學活性。在備選的實施方案中，修飾序列的表達產(chǎn)物是延長 的蛋白質(zhì)(例如，包含向核酸序列中插入的修飾)。在一些實施方案中，插入產(chǎn)生截短的蛋 白質(zhì)(例如當該插入導致終止密碼子形成時)。因而，插入可以產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)或延長的 蛋白質(zhì)作為表達產(chǎn)物。如本文中所用，術(shù)語“突變序列”和“突變基因”可互換地使用并且指具有在宿主細 胞的野生型序列中出現(xiàn)的在至少一個密碼子中的改變的序列。該突變序列的表達產(chǎn)物是相 對于野生型具有已改變氨基酸序列的蛋白質(zhì)。該表達產(chǎn)物可以具有改變的功能性能力(例 如增強的酶活性)?！罢T變引物”或“誘變寡核苷酸”(在本文中可互換地使用)意圖指對應(yīng)于模板序 列的一部分并能夠與之雜交的寡核苷酸組合物。就誘變引物而言，該引物不會精確地匹配 模板核酸，該引物中的一個錯配或多個錯配用于導入期望的突變至核酸文庫中。如本文中 所用，“非誘變引物”或“非誘變寡核苷酸”指與模板核酸精確匹配的寡核苷酸組合物。在本 發(fā)明的一個實施方案中，僅使用誘變引物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，如此設(shè)計引 物從而使得其中已經(jīng)包括誘變引物的至少一個區(qū)域，也存在包含于寡核苷酸混合物中的非 誘變引物。通過添加誘變引物和與所述誘變引物至少之一相對應(yīng)的非誘變引物的混合物， 有可能產(chǎn)生其中提供了多種組合突變模式的結(jié)果核酸文庫。例如，如果期望突變核酸文庫 的一些成員仍在某些位置處保留其親代序列而其他成員在此類位點處突變，則所述非誘變 弓丨物提供了在該核酸文庫內(nèi)部針對給定殘基獲得特定水平非突變成員的能力。本發(fā)明的方 法使用一般具有10-50個堿基長度、更優(yōu)選約15-45個堿基長度的誘變和非誘變寡核苷酸。 然而，可能需要使用比10堿基更短或比50堿基更長的引物以獲得期望的誘變結(jié)果。就相 應(yīng)的誘變和非誘變引物而言，不需要相應(yīng)的寡核苷酸具有相同的長度，但僅需要在對應(yīng)于 待添加突變的區(qū)域中存在重疊?？梢砸愿鶕?jù)本發(fā)明的預定比率添加引物。例如，如果期望所得文庫在相同或不同 位點處具有顯著水平的某種特定突變和較少量的不同突變，則通過調(diào)整添加的引物數(shù)量， 有可能產(chǎn)生期望的偏態(tài)文庫。備選地，通過添加更少或更多數(shù)量的非誘變引物，有可能調(diào)節(jié) 突變核酸文庫中產(chǎn)生相應(yīng)突變的頻率。術(shù)語“野生型序列”或“野生型基因”在本文中可互換地用來指宿主細胞中本來或 天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列指作為蛋白質(zhì)工程項目起點的目的序列。 該野生型序列可以編碼同源或異源蛋白。同源蛋白是宿主細胞在無干預下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。 異源蛋白是宿主細胞本不會產(chǎn)生但因干預而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。術(shù)語“氧化穩(wěn)定的”指在本發(fā)明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間占優(yōu)勢的條件下，例如當暴露于或與漂白劑或氧化劑接觸時，經(jīng)過給定時間段后仍保留特定量酶活 性的本發(fā)明蛋白酶。在一些實施方案中，與漂白劑或氧化劑接觸后經(jīng)過給定時間段，例如至 少1分鐘、3分鐘、5分鐘、8分鐘、12分鐘、16分鐘、20分鐘等之后，所述蛋白酶仍保留至少 約 50%、約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%或約99%的蛋白酶解活性。術(shù)語“螯合劑穩(wěn)定的，，指在本發(fā)明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間占優(yōu)勢 的條件下，例如當暴露于或與螯合劑接觸時，經(jīng)過給定時間段后仍保留特定量酶活性的本 發(fā)明蛋白酶。在一些實施方案中，與螯合劑接觸后經(jīng)過給定時間段，例如至 少10分鐘、20分 鐘、40分鐘、60分鐘、100分鐘等之后，所述蛋白酶仍保留至少約50%、約60%、約70%、約 75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的蛋白 酶解活性。術(shù)語“熱穩(wěn)定的”和“熱穩(wěn)定性”指在暴露于確定的溫度后，在本發(fā)明的蛋白酶解、 水解、清潔或其他過程期間占優(yōu)勢的條件下，例如當暴露于改變的溫度時，經(jīng)過給定時間段 后仍保留特定量酶活性的本發(fā)明蛋白酶。改變的溫度包括提高或降低的溫度。在一些實施 方案中，在暴露于改變的溫度后經(jīng)過給定時間段，例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240 分鐘、300分鐘等之后，所述蛋白酶仍保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、 約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%蛋白酶解活性。如本文所用，術(shù)語“化學穩(wěn)定性”是指蛋白質(zhì)(例如，酶)針對對其活性有不利影響 的化學物質(zhì)的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，此類化學物質(zhì)包括但不限于過氧化氫、高酸、陰 離子去污劑、陽離子去污劑、非離子去污劑、螯合試劑等。然而，不打算將本發(fā)明限于任何具 體的化學穩(wěn)定性水平，也不限于化學穩(wěn)定性的范圍。具體地，術(shù)語“去污劑穩(wěn)定的”和“LAS 穩(wěn)定的”是指在本發(fā)明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間占優(yōu)勢的條件下，暴露于去 污劑組合物給定時間段后仍保留特定量酶活性的本發(fā)明蛋白酶。在一些實施方案中，在暴 露于去污劑經(jīng)過給定時間段，例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240分鐘、300分鐘等之 后，所述蛋白酶仍保留至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約 92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%蛋白酶解活性。術(shù)語“增強的穩(wěn)定性”在氧化作用、螯合劑、熱和/或pH穩(wěn)定的蛋白酶的上下文中 指隨時間流逝，與其它中性金屬蛋白酶和/或野生型酶相比保留的更高的蛋白酶解活性。術(shù)語“削減的穩(wěn)定性”在氧化作用、螯合劑、熱和/或pH穩(wěn)定的蛋白酶的上下文中 指隨時間流逝，與其它中性金屬蛋白酶和/或野生型酶相比保留的更低的蛋白酶解活性。如本文中所用，除非另外指出，術(shù)語“清潔組合物”包括顆粒形式或粉末形式的 通用或“重役(heavy-duty)”洗滌劑，尤其是清潔洗滌劑；液體劑、凝膠劑或糊劑形式的 通用洗滌劑，尤其所謂重役液體型洗滌劑；液體精細_織物洗滌劑；盤碟手洗洗滌劑或輕 垢盤碟洗滌劑，尤其那些泡沫豐富類型的盤碟洗滌劑；盤碟機洗洗滌劑，包括居家和機構(gòu) 用途的多種片狀、顆粒、液體和漂洗輔助型盤碟機洗洗滌劑；液體清潔與消毒劑，包括抗菌 性洗手液型、清潔棒、漱口液、口腔清潔劑、轎車或毛毯香波、浴室清潔劑；發(fā)用香波和洗發(fā) 劑；沐浴凝膠和泡沫浴清潔劑和金屬清潔劑；以及清潔助劑，諸如漂白添加劑和“粘污漬劑 (stain-stick) ”、預處理類型添加劑。除非另外說明，全部組分或組合物水平指均就該組分或組合物的有效水平而言，并且不包括雜質(zhì)，例如可能存在于市售來源中的殘余溶劑或副產(chǎn)物。
酶組分重量基于總活性蛋白質(zhì)。全部百分數(shù)和比率由重量計算，除非另外說明?；?于總組成計算所有百分數(shù)和比率，除非另外說明。術(shù)語“清潔活性”指由所述蛋白酶在本發(fā)明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期 間占優(yōu)勢的條件下實現(xiàn)的清潔性能。在一些實施方案中，清潔性能通過應(yīng)用涉及酶敏感性 污漬例如草、血液、乳或卵蛋白的多種測定法確定，如在所述污漬經(jīng)歷標準洗滌條件作用 后，通過多種色譜、分光光度或其他定量方法學所確定的那樣。示例性測定法包括，但不限 于W099/34011和美國專利號6，605，458(兩個均在此引入作為參考)中描述的那些測定法 以及實施例中所包括的那些方法。術(shù)語蛋白酶的“清潔有效量”指本文中前述的蛋白酶量，所述的蛋白酶量在特定清 潔組合物中實現(xiàn)期望的酶活性水平。此類有效量由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地確定并且基于許 多因素，諸如所用的具體蛋白酶、清潔用途、該清潔組合物的具體組成和是否需要液態(tài)或干 態(tài)(例如顆粒狀、棒狀)組合物等。如本文中所用的術(shù)語“清潔輔助物質(zhì)”意指為所期望的清潔組合物的特定類型或 產(chǎn)品形式(例如液體劑、顆粒劑、粉劑、棒劑、糊劑、噴撒劑、片劑、凝膠劑或泡沫劑組合物) 所選擇的任何液體、固體或氣態(tài)物質(zhì)，所述物質(zhì)也優(yōu)選地與該組合物中使用的蛋白酶相容。 在一些實施方案中，顆粒劑組合物是“密實”形式，而在其他實施方案中，液體劑組合物是 “濃縮”形式。如本文中所用，“低洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括其中小于約SOOppm洗滌劑組分存在于洗 滌水中的洗滌劑。一般認為日本洗滌劑是低洗滌劑濃度系統(tǒng)，因為它們通常具有存在于洗 滌水中的大約667ppm洗滌劑組分。如本文中所用，“中等洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括其中約SOOppm至約2000ppm洗滌劑組 分存在于洗滌水中的洗滌劑。通常認為北美洗滌劑是中等洗滌劑濃度系統(tǒng)，因為它們通常 具有存在于洗滌水中的大約975ppm洗滌劑組分。巴西洗滌劑一般具有存在于洗滌水中的 大約1500ppm洗滌劑組分。如本文中所用，“高洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括大于約2000ppm洗滌劑組分存在于洗滌 水中的洗滌劑。通常認為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統(tǒng)，因為它們通常具有洗滌水中大 約3000-8000ppm的洗滌劑組分。如本文中所用，“織物清潔組合物”包括手工和機器衣物洗滌劑組合物，其包括衣 物添加組合物和適用于浸泡和/或預處理污漬織物(例如衣物、亞麻布和其他紡織材料) 的組合物。如本文中所用，“非織物清潔組合物”包括非紡織物(即織物)表面清潔組合物，其 包括但不限于洗滌餐具的洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、義齒清潔組合物和個人清潔組 合物。本文中清潔組合物的“密實”形式最好由密度反映，并且就組合物而言，由無機填 充鹽的量反映。無機填充鹽是粉末形式的洗滌劑組合物常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中， 填充鹽以相當大的量存在，一般占總組合物重量的17-35%。相反，在密實組合物中，填充鹽 以不超過總組合物15%的量存在。在一些實施方案中，填充鹽以不超過組合物重量10%、 更優(yōu)選5%的量存在。在一些實施方案中，無機填充鹽選自硫酸堿金屬鹽和堿土金屬鹽以及氯化堿金屬鹽和堿土金屬鹽。優(yōu)選的填充鹽是硫酸鈉。發(fā)明詳述中性金屬內(nèi)肽酶(S卩，中性金屬蛋白酶)(EC 3.4.24.4)屬于絕對需要鋅離子用于 催化 活性的蛋白酶類。這些酶在中性PH及在30至40kDa大小范圍內(nèi)具最佳活性。中性金 屬蛋白酶結(jié)合2至4個鈣離子，所述鈣離子有助于該蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在金屬蛋白酶活 性部位結(jié)合的金屬離子是關(guān)鍵特點，其允許水分子的活化。該水分子隨后作為親核試劑起 作用并且切割肽鍵的羰基。中性鋅結(jié)合金屬蛋白酶家族包括細菌酶嗜熱菌蛋白酶、和類嗜熱菌蛋白酶 (“TLPs”)，以及羧肽酶A(消化酶)，以及催化參與組織重建和降解的反應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋 白酶。就穩(wěn)定性和功能而言，這些蛋白酶中僅有的最佳表征的是嗜熱菌蛋白酶及其變體 (TLP) 0實際上，許多研究集中于工程化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中性金屬蛋 白酶，以增加這些酶的熱穩(wěn)定性(例如，參見Vriend等，在Tweel等(編輯)的Stability and Stabilization ofEnzymes 一書中，Elsevier, pp. 93-99[1993])。大多數(shù)努力集中于通過改變可阻止局部解折疊過程的結(jié)構(gòu)決定因素(通過分子 建模確定)來增加蛋白酶的穩(wěn)定性，所述的局部解折疊過程將導致蛋白質(zhì)的自溶以及在高 溫下導致該中性蛋白酶變性。(例如，參見van denBurg等，在Hopsu-Havu等，(編輯)， Proteolysis in Cell FunctionsManipulatinR the Autolvtic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical andHealth Research,卷 13, IOS Press [1997]p.576.)。本文中提供了用于改造具有改良特性的中性金屬蛋白酶的組合物和方法。如本文 所述，已報道鈣離子能夠幫助阻止其它蛋白酶(諸如嗜熱菌蛋白酶)自溶。已通過添加鈣 穩(wěn)定了嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)中性蛋白酶對抗自溶和蛋白酶解降解 (參見 DUrrschmidt 等，F(xiàn)EBS J.，272 1523-1534 [2005])。實際上，本發(fā)明提供了適于改造不依賴鈣來維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的中性金屬蛋白酶 的組合物和方法。在一些實施方案中，改造防止了特定二級結(jié)構(gòu)元件中的局部解折疊，其可 能可防止蛋白水解。天然和經(jīng)改造的蛋白酶(諸如枯草桿菌蛋白酶)通常在枯草芽孢桿菌中表達，并 且數(shù)種所述蛋白酶已應(yīng)用于洗滌劑組合物中，用于移除蛋白質(zhì)污漬。其它例如已用于烘烤 業(yè)(例如，來自熱溶蛋白芽孢桿菌(Bacillusthermoproteolyticus)的嗜熱菌蛋白酶，例如 參見 Galante 和 Formantici，Curr. Organic Chem.，7，1399-1422 [2003])。一般地，絲氨酸 蛋白酶已更廣泛地應(yīng)用于洗滌劑中，至少部分是因為這些蛋白酶相對容易穩(wěn)定。實際上，由于許多原因，金屬蛋白酶更少用于工業(yè)，尤其是更少用于洗滌劑工業(yè)。 這些酶涉及更復雜的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，因為這些酶的穩(wěn)定和功能分別絕對地需要鈣離子和鋅離 子。此外，洗滌劑溶液以及用于洗衣過程的水往往含有通常干擾該酶與所述離子結(jié)合、或螯 合這些離子的組分，導致蛋白酶蛋白水解功能的降低或喪失以及使蛋白酶不穩(wěn)定。如在本發(fā)明的開發(fā)期間所確定的那樣，NprE在檸檬酸鹽的存在下的自溶模式可通
過等式表示 其中N是天然形式，I表示部分折疊的中間體，以及Ap是自溶的蛋白酶。對于NprE而言，檸檬酸鹽最可能通過移除鈣離子使蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所述鈣離子的移除產(chǎn)生部分解 折疊的中間體(I)狀態(tài)，使得環(huán)和表面殘基易于自溶。自溶蛋白片段的產(chǎn)生將是快速的并 且是高序的。在這些區(qū)域中或鄰近這些區(qū)域的穩(wěn)定化替換產(chǎn)生不那么易于自溶的NprE變 體。變體的模式與野生型的模式最可能類似，但是自溶蛋白(Ap)的產(chǎn)生實質(zhì)性地減緩了。在 檸檬酸鹽存在或不存在下的熱解折疊是強調(diào)表示活性和完整變體在檸檬酸鹽的情況下具 有折疊結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。這一數(shù)據(jù)表明對檸檬酸鹽穩(wěn)定的替換最可能增加了鈣-脅迫的蛋白質(zhì) 的穩(wěn)定性，因為所發(fā)現(xiàn)的突變中沒有一個直接參與鈣結(jié)合。因此，如本文所述，可通過改進 鈣脅迫的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性間接地矯正NprE由于喪失鈣導致的檸檬酸鹽誘導的不穩(wěn)定性。
具體地，應(yīng)用活性測定法和SDS-PAGE所研究的野生型解淀粉芽胞桿菌NprE蛋白 酶的對檸檬酸鹽誘導的失活和自溶是迅速且不可逆的。通過Edman降解鑒定的初始自溶位 點的N端位于環(huán)區(qū)并且在分子的表面。單位點飽和誘變和隨后的組合誘變產(chǎn)生了示范性的 對檸檬酸鹽穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其在S129、F130、M138、V190和D220具有5個氨基酸替換，所述 位點分布在環(huán)和表面位點區(qū)域。當在室溫溫育過夜時，S129I-F130L-M138L-V190I-D220P分 子在IOOmM檸檬酸鹽的存在下完全有活性且結(jié)構(gòu)完整。在檸檬酸鹽存在下對單和多重組合 變體的熱熔點的熱測定顯示出加成性，并且表觀八徹是+101。認為這一穩(wěn)定效果是由于 產(chǎn)生了不會經(jīng)歷不可逆失活及自溶過程的穩(wěn)定的天然狀態(tài)。由于工業(yè)洗滌劑通常含有檸檬 酸鹽，本發(fā)明為在生產(chǎn)和開發(fā)含有NprE變體的工業(yè)洗滌劑中的應(yīng)用提供了極其有益的機石。本發(fā)明清潔制劑和洗滌制劑的詳細描述除非另外說明，本文提供的所有組分或組合物水平指均就該組分或組合物的有效 水平而言，并且不包括雜質(zhì)，例如可能存在于市售來源中的殘余溶劑或副產(chǎn)物。酶組分重量 基于總活性蛋白質(zhì)。全部百分數(shù)和比率由重量計算，除非另外說明。基于總組成計算所有 百分數(shù)和比率，除非另外說明。在示范性的洗滌劑組合物中，將酶水平表達為純酶占總組合物的重量，并且除非 另外明確說明，按照占總組合物的重量表達洗滌劑成分。包含中性金屬蛋白酶的清潔組合物本發(fā)明的中性金屬蛋白酶可用于配制各種洗滌組合物。本發(fā)明的清潔組合物可有 利地用于例如，洗衣店應(yīng)用、硬表面清潔、自動碟洗應(yīng)用、以及化妝品應(yīng)用，諸如假牙、牙齒、 頭發(fā)和皮膚。然而，由于本發(fā)明的酶在較低溫度的溶液中升高的效果以及較高的顏色安全 特征，本發(fā)明的酶理想地適于洗衣店應(yīng)用，諸如漂白織物。此外，本發(fā)明的酶還可用于顆粒 和液體組合物中。本發(fā)明的酶還可用于清潔添加產(chǎn)品。當期望附加的漂白效果時，包括至少一種本 發(fā)明的酶的清潔添加產(chǎn)品理想地適于包括在洗滌過程中。此類情況包括但不限于低溫溶液 清潔應(yīng)用。該添加產(chǎn)品以其最簡單的形式可以是本發(fā)明提供的一種或多種中性金屬蛋白 酶。在一些實施方案中，以劑量形式包裝該添加物用于添加至清潔程序中，其中應(yīng)用了過氧 化物源并且期望增加的漂白效果。在一些實施方案中，所述的單劑量形式包含丸劑、片劑、 軟膠囊或其它單劑量形式(包括預計量的粉末和/或液體)。在一些實施方案中，包括填 充劑和/或載體材料，以增加此類組合物的體積。合適的填充劑或載體材料包括但不限于 各種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽以及滑石粉、粘土等。在一些實施方案中，用于液體組合物的填充劑和/或載體材料包括水和/或低分子量伯醇或仲醇，包括多元醇和二醇。此類醇的 實例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，組合物包含約5%至約 90%的此類材料。在其它的實施方案中，應(yīng)用酸性填充劑以降低組合物的pH。在一些備選 的實施方案中，所述清潔添加物包括至少一種如下所描述的活化的過氧化物(peroxygen) 源和/或如下面更詳細描述的輔助劑組分。本發(fā)明的清潔組合物和清潔添加物需要有效量的本發(fā)明提供的中性金屬蛋白酶。 在 一些實施方案中，通過添加一種或多種本發(fā)明提供的中性金屬蛋白酶達到酶的所需水 平。一般地，本發(fā)明的清潔組合物包含至少0. 0001重量百分數(shù)、約0. 0001-約1重量百分 數(shù)、約0. 001-約0. 5重量百分數(shù)、或甚至約0. 01-約0. 1重量百分數(shù)的至少一種本發(fā)明提 供的中性金屬蛋白酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，一般地如此配制本文提供的清潔組合物，使得在水性 清潔操作中使用時，洗滌水具有約5. 0至約11. 5的pH，或在備選的實施方案中，甚至是約 6. 0至約10. 5。在一些優(yōu)選的實施方案中，一般地配制液體產(chǎn)品制劑以具有約3. 0至約9. 0 的凈pH，而在一些備選的實施方案中，該制劑具有約3至約5的凈pH。在一些優(yōu)選的實施 方案中，一般地配制顆粒洗衣店產(chǎn)品以具有約8至約11的pH。將pH控制在推薦使用水平 的技術(shù)包括應(yīng)用緩沖劑、堿和酸等，并且是本領(lǐng)域公知的。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，當至少一種中性金屬蛋白酶應(yīng)用于顆粒組合物或 液體中時，該中性金屬蛋白酶以包封的顆粒的形式以在儲存期間保護其不與該顆粒組合物 中的其它組分接觸。此外，包封還提供了在清潔過程期間控制中性金屬蛋白酶利用率的方 式，并且可以增強中性金屬蛋白酶的功效。預期本發(fā)明的包封的中性金屬蛋白酶可用于各 種環(huán)境。還預期可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何合適的包封材料和方法包封該中性金屬蛋白酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，包封材料一般地至少包封一部分中性金屬蛋白酶催化 齊U。在一些實施方案中，包封材料是水可溶的和/或水可分散的。在一些額外的實施方案 中，包封材料具有o°c或更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)(更多有關(guān)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的信息例 如參見，WO 97/11151，尤其是從第6頁25行至第7頁第2行)。在一些實施方案中，包封材料選自碳水化合物、天然或合成樹膠、幾丁質(zhì)和脫乙 酰殼多糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和它 們的組合物。在包封材料是碳水化合物的一些實施方案中，其選自單糖、寡糖、多糖和它們 的組合。在一些優(yōu)選的實施方案中，包封材料是淀粉(對于一些示范性的合適淀粉的描述 例如參見 EP 0922499、US 4，977，252、US 5，354，559 和 US 5，935，826)。在其它實施方案中，包封材料包含制備自塑料的微球體(例如，熱塑料、丙烯腈、 甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和它們的混合物；可用的商業(yè)可獲得的微球體包括 但不限于EXPANCEL [Casco Products, Stockholm, Sweden]、PM 6545、PM 6550、 PM 7220,PM 7228、EXTENDOSPHERES 和Q-CEL [PQ Corp. ,Valley Forge, PA]、LUXSIL 和 SPHERICEL1 [Potters Industries, Inc. , Carlstadt, NJ andValley Forge, PA])。制備和應(yīng)用本申請人的清潔組合物的方法在一些優(yōu)選的實施方案中，可通過配制者選擇的任意方法將本發(fā)明的組合物配制 為任何合適的形式，(對于一些非限制性實例，例如參見U. S. 5，879，584、U. S. 5，691，297、U. S. 5，574，005、U. S. 5，569，645、U. S. 5，565，422、U. S. 5，516，448、U. S. 5，489，392 和 U. S. 5，486，303)。在一些期望低pH清潔組合物的實施方案中，通過添加諸如HCl的酸性材 料調(diào)節(jié)此類組合物的pH。輔助材料
盡管對本發(fā)明的目的不重要，但在一些實施方案中，本文描述的輔助劑的非限制 性列表適用于本發(fā)明的清潔組合物中。實際上，在一些實施方案中，將輔助劑整合到本發(fā)明 的清潔組合物中。在一些實施方案中，輔助材料協(xié)助和/或增強清潔功效、處理待清潔的底 物、和/或修飾清潔組合物的美觀(例如，香料、著色劑、染料等)。應(yīng)當理解，將此類輔助 劑添加至本發(fā)明的中性金屬蛋白酶中。這些額外組分的確切性質(zhì)、其摻入水平取決于組合 物的物理形式和待應(yīng)用其的清潔操作性質(zhì)。合適的輔助材料包括但不限于表面活性劑、 增效助劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、沉淀助劑、分散劑、額外的酶、和酶穩(wěn)定劑、催化材料、 漂白活化劑、漂白增效劑、過氧化氫、過氧化氫源、預先形成的過酸、聚合分散劑、粘土移除/ 抗再沉積劑、光亮劑、抑泡劑、染料、芳香劑、結(jié)構(gòu)伸縮劑、織物柔軟劑、載體、水溶增溶劑、力口 工助劑和/或顏料。除了本文明確提供的那些之外，其它的輔助材料是本領(lǐng)域公知的(例 如參見，美國專利號5，576，282,6, 306，812B1和6，326，348B1)。在一些實施方案中，前述的 輔助劑成分構(gòu)成了本發(fā)明清潔組合物的平衡。表面活件劑-在一㈣實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含至少一種表面活件劑 或表面活性劑系統(tǒng)，其中所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、 陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兩性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑、和 它們的混合物。在一些低PH清潔組合物實施方案(例如，具有約3至約5的凈pH的組合 物)中，該組合物一般不含有烷基乙氧基化的硫酸鹽，因為據(jù)信這一類表面活性劑可被該 組合物的酸性組分水解。在一些實施方案中，表面活性劑以清潔組合物重量的約0. 至約60%重量的水 平存在，而在備選的實施方案中，該水平是約至約50%，在其它實施方案中，該水平是 約5%至約40%。遭 在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑增效 助劑或增效助劑系統(tǒng)。在一些摻入至少一種增效助劑的實施方案中，該清潔組合物包含清 潔組合物重量的至少約1%、約3%至約60%，或者甚至約5%至約40%的增效助劑。增效助劑包括但不限于多磷酸的堿金屬鹽、銨鹽和烷醇銨鹽、堿金屬硅酸鹽、堿 土金屬和堿金屬碳酸鹽、鋁硅酸鹽增效助劑聚羧酸酯化合物、醚羥基聚羧酸酯、馬來酐和乙 烯或乙烯基甲醚的共聚物、1，3，5_三羥基苯-2，4，6-三磺酸、和羧甲氧琥珀酸，聚乙酸的各 種堿金屬鹽、銨鹽和取代的銨鹽，諸如乙二胺四乙酸和氨三乙酸、和聚羧酸酯，諸如苯六甲 酸、琥珀酸、檸檬酸、氧聯(lián)二琥珀酸、聚蘋果酸、苯1，3，5_三羧酸、羧甲氧基琥珀酸及其可溶 鹽。實際上，預期任意適合的增效助劑都可應(yīng)用在本發(fā)明不同的實施方案中。MML-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物含有至少一種螯合劑。適當?shù)?螯合劑包括但不限于銅、鐵和/或錳螯合劑、和它們的混合物。在應(yīng)用了至少一種螯合 劑的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含目標清潔組合物的約0. 至約15%或甚至約 3. 0%至約10%重量的螯合劑。沉淀助劑-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物含有至少一種沉淀助劑。合適的沉淀助劑包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸酯、土壤釋放聚合物諸如聚對苯 二甲酸、粘土諸如高嶺石、蒙脫石、活性白土、伊利石、斑脫土、埃洛石、和它們的混合物。染料轉(zhuǎn)移抑制劑-在一㈣實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包括一種或多種染 料轉(zhuǎn)移抑制劑。合適的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺 N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑 或其混合物。
在其中應(yīng)用了至少一種染料轉(zhuǎn)移抑制劑的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含 該清潔劑組合物的約0. 0001 %至約10 %、約0. 01 %至約5 %、或甚至約0. 1 %至約3 %重量 的染料轉(zhuǎn)移抑制劑。iMH-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物含有至少一種分散劑。合適的 水溶性有機材料包括但不限于同-或共-聚合酸或它們的鹽，其中多聚羧酸包含至少兩個 被不超過兩個碳原子彼此隔開的羧基。直-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑酶，其提供 清潔功效和/或織物護理益處。合適的酶的實例包括但不限于半纖維素酶、過氧化物酶、 蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧 化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、單寧分解酶、戊聚糖酶、malanases, β -葡 聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些實施方 案中，應(yīng)用酶的組合(即“雞尾酒”混合物)，其包含與淀粉酶聯(lián)合應(yīng)用通?？蓱?yīng)用的酶，例 如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶和/或纖維素酶。SII^lL-在本發(fā)明的一些實施方案中，穩(wěn)定本發(fā)明的洗滌劑制劑中使用的酶。 預期各種酶穩(wěn)定技術(shù)均可用于本發(fā)明。例如，在一些實施方案中，通過在提供此類離子給酶 的已完成的組合物中存在的鋅(II)、鈣(II)和/或鎂(II)離子的水溶性源穩(wěn)定本文應(yīng)用 的酶，以及其它金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷 (II)、銅(II)、鎳(II)和氧釩(IV))。催化金屬ff合物-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物含有一種或多種催化 金屬復合物。在一些實施方案中，應(yīng)用含有金屬的漂白催化劑。在一些優(yōu)選的實施方案中， 所述金屬漂白催化劑包含這樣的催化系統(tǒng)，所述催化系統(tǒng)包含確定漂白催化活性的過渡金 屬陽離子(例如，銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽離子)、幾乎不具有或不具有漂白催化活性的 輔助金屬陽離子(例如，鋅或鋁陽離子)以及具有用于催化和輔助金屬陽離子的明確的穩(wěn) 定常數(shù)的隔離物，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)和其可水溶鹽(例如參見 U. S. 4，430，243)。在一些實施方案中，通過錳化合物的方式催化本發(fā)明的清潔組合物。此類化合物 和使用水平是本領(lǐng)域公知的(例如參見U. S. 5，576，282)。在其它的實施方案中，在本發(fā)明的清潔組合物中使用鈷漂白催化劑。各種鈷漂白 催化劑是本領(lǐng)域公知的(例如參見U. S. 5，597，936和U. S. 5，595，967)。通過已知方法能很 容易地制備此類鈷催化劑(例如參見=U. S. 5，597，936和U. S. 5，595，967)。在其它實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包括大的多環(huán)剛性配體(“MRL”)的過渡 金屬復合物。作為實用物質(zhì)，并且不以限制性的方式，在一些實施方案中，調(diào)節(jié)本發(fā)明提供 的組合物和清潔過程以在水性洗滌介質(zhì)中提供約至少一億分之一份的活性MRL物質(zhì)，并且在一些優(yōu)選的實施方案中，在洗滌水溶液中提供約0. 005ppm至約25ppm、更優(yōu)選約0. 05ppm 至約lOppm、以及最優(yōu)選約0. Ippm至約5ppm的MRL。在瞬時過渡金屬漂白催化劑中優(yōu)選的過渡金屬包括但不限于錳、鐵和鉻。優(yōu)選 的MRL還包括但不限于橋聯(lián)的特殊極端剛性配體(例如，5，12_ 二乙基-1，5，8，12-四氮雜 二環(huán)[6.6.2]十六烷)。通過已知方法可很容易地制備合適的過渡金屬MRL(例如，參見WO 00/32601 和 U. S. 6，225，464)。制備和應(yīng)用清潔組合物的方法 可通過配制者選擇的任意合適的方法將本發(fā)明的清潔組合物配制為任何合適 的形式，(例如，參見 U. S. 5，879，584、U. S. 5，691，297、U. S. 5，574，005、U. S. 5，569，645、 U. S. 5，565，422、U. S. 5，516，448、U. S. 5，489，392、U. S. 5，486，303、U. S. 4，515，705、 U. S. 4，537，706、U. S. 4，515，707、U. S. 4，550，862、U. S. 4，561，998、U. S. 4，597，898、 U. S. 4，968，451、U. S. 5，565，145、U. S. 5，929，022、U. S. 6，294，514 和 U. S. 6，376，445，對于 一些非限制性實施例每一個均在此引入作為參考)。使用方法在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物可用于清潔表面和/或織物。在一些 實施方案中，所述表面和/或織物的至少一部分與本發(fā)明至少一個實施方案的清潔組合物 (以凈形式或稀釋于洗滌溶液中)接觸，并且然后任選地洗滌和/或漂洗該表面和/或織 物。為本發(fā)明的目的，“洗滌”包括但不限于擦洗和機械攪拌。在一些實施方案中，織物 包含能夠在普通消費者使用條件下洗滌的任何織物。在優(yōu)選的實施方案中，以在溶液中約 500ppm至約15，OOOppm的濃度使用本發(fā)明的清潔組合物。在其中洗滌溶劑是水的一些實施 方案中，水溫一般為約5°C至約90°C。在一些用于織物清潔的實施方案中，水與織物的質(zhì)量 比一般為約1 1至約30 1。實驗提供了以下實施例旨在展示和進一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，并 且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。在隨后的實驗公開內(nèi)容中，使用以下縮寫V (攝氏度)；rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)； H20(水)；HCl(鹽酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(堿基)；kb(千堿基)；kD(千道爾頓)； gm(克)；μ g和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μ 1禾Π ul (微升)；ml (毫升)；mm(毫 升)；nm (納米)；ym和um (微米)；M (摩爾)；mM (毫摩爾)；μ M和uM (微摩爾)；U (單位)； V(伏特)；麗(分子量)；sec (秒)；min (分鐘)；hr (小時)；MgCl2 (氯化鎂)；NaCl (氯化 鈉)；OD280 (在28Onm的光密度)；OD4os (在405nm的光密度)；OD600 (在600nm的光密度)； PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH (乙醇)；PBS (磷酸鹽緩沖鹽水[150mM NaCl，10mM磷酸 鈉緩沖液，PH 7. 2]) ；LAS (十二烷基磺酸鈉)；SDS (十二烷基硫酸鈉)；Tris (H (羥甲基) 氨基甲烷)；TAED(N，N，N，N，_ 四乙酰乙二胺)；BES(聚醚砜(polyethersulfone)) ；MES( — 水合2-嗎啉乙磺酸；分子量195. 24 ；Sigma#M-3671) ；CaCl2 (無水氯化鈣；分子量110. 99 ； Sigma#C-4901) ；DMF (N, N-二 甲基甲酰胺，分子量 73. 09，d = 0. 95) ；Abζ-AGLA-Nba (2-氨 基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基芐酰胺，分子量583. 65 ； Bachem#H-6675, VffR目錄號#100040-598) ；SBG 1 % (具葡萄糖的超級肉湯；6g大豆胨 [Difco]、3g酵母提取物、6gNaCl、6g葡萄糖)；在使用本領(lǐng)域已知的方法消毒前，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7. l;w/v(重量比體積)；ν/ν(體積比體積)；Npr和npr (中性金屬蛋白酶)； SEQUEST (SEQUEST數(shù)據(jù)庫搜索程序，華盛頓大學)；MS (質(zhì)譜)；BMI (血液、乳、墨 汁)；SRI (污漬去除指數(shù))；Npr和npr (中性金屬蛋白酶基因)；NprE和nprE(解淀粉芽孢 桿菌中性金屬蛋白酶)；P麗(純化的MULTIFECT 金屬蛋白酶)；以及Quint (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 五重 NprE 變體)。 應(yīng)用以下縮寫用于公司，其中在示范性實施例中提及了所述公司的產(chǎn) 品或服務(wù)TIGR(基因 組研究所，Rockville, MD) ；AATCC(美國紡織化學師與印 染 師 協(xié) 會)；Amersham(Amersham Life Science，Inc.ArlingtonHeights, IL)； Corning(Corning International， Corning， NY) ；ICN(ICNPharmaceuticals, Inc.， Costa Mesa，CA) ；Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford，IL) ；Equest (Equest， Warwick International Group， Inc. ， Flintshire， UK) ；EMPA(Eidgenossische Material Prufungs und VersuchAnstalt, St.Gallen, 瑞士)；CFT(試 驗 材 料 ΦVlaardingen, # 生)；Amicon(Amicon, Inc. ， Beverly, ΜΑ) ；ATCC( _ _
^ M ^ ^ U M ^ Manassas, VA) ；Becton Dickinson(Becton Dickinson Labware, LincolnPark，NJ) ；Perkin-EImer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA)； Rainin(Raininlnstrument，LLC，Woburn, MA) ；Eppendorf (德國漢堡 Eppendorf AG)； Waters (Waters, Inc. ， Milford, MA) ；Geneart ( ^M H mWJiM GeneartGmbH) ；Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN) ；Molecular Probes(Molecular Probes， Eugene， OR) ；BioRad(BioRad， Richmond， CA) ；Clontech(CLONTECH 實驗室， Palo Alto, CA) ；Cargill (Cargill, Inc.，Minneapolis，MN) ；Difco (Difco 實驗室， Detroit，MI) ；GIBCOBRL 或 Gibco BRL (Life Technologies，Inc.，Gaithersburg， MD) ； NewBrunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc.，Edison，NJ)； Thermoelectron (Thermoelectron Corp.，Waltham，MA) ；BMG(德國奧芬堡 BMG Labtech， GmbH，) ；Greiner(Greiner Bio-One, Kremsmuenster, 奧 地 禾丨J ) ；Novagen(Novagen, Inc. ， Madison， WI) ；Novex(Novex, San Diego, CA) ；Finnzymes(Finnzymes ΟΥ,芬蘭)； Qiagen (Qiagen，Inc.，Valencia, CA) ；Invitrogen (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)； Sigma(Sigma ChemicalCo.，St.Louis, MO) ；DuPont Instruments (Asheville，NY)； Global MedicalInstrumentation 或 GMI(Global Medical Instrumentation ；Ramsey, MN) ；MJ Research (MJ Research，Waltham，MA) ；Infors(Infors AG，Bottmingen，瑞 士 ) ；Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla，CA) ；Roche (Hoffmann La Roche，Inc.，Nut ley, NJ) ；Agi lent(AgiIentTechnologies, Palo Alto, CA)； S-Matrix (S-Matrix Corp.，Eureka，CA) ；USTesting (United States Testing Co.， Hoboken， NY) ；West Coast AnalyticalServices(West Coast Analytical Services, Inc. , Smta Fe Springs, CA)；離子束分析實驗室(薩里大學離子束中心離子束分析 實驗室(Guildford，UK) ；TOM(Terg-o-Meter) ；BaChem(BaChem AG，Bubendorf，瑞士)； Molecular Devices (Molecular Devices, Inc.，Sunnyvale, CA) ；Corning (Corning International，Corning，NY) ；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton, MA) ；Chemical Computing (Chemical Computing Corp.，Montreal，加拿大)；NCBI (美國國家生物技術(shù) 信息中心)；ArgoBioanalytica(Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey) ；Vydac(GraceVydac，Hesperia，CA) ；Minolta(Konica Minolta,Ramsey,NJ)；禾口 Zeiss (CarlZeiss，Inc.， Thornwood, NY)。本發(fā)明提供并用到了以下序列SEQ ID NO 1 (NprE) GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCG GGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATC AGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTT CTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAAC GGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATT AAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAG CGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCC ACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGT AACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTA CGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAA CCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCAC CACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATT TCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGA TACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGG TTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGC CGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGAT ATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTA CAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTT ACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCG TCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAG CGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAASEQ ID NO 2 (NprE 前體)MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKV FKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQAL DHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANffEVTVDAETGKILKKQNKVEHAA TTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLG KVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANL NYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGI PNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 3 (NprE 成熟體)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 4(NprE 引物)
CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCGSEQ ID NO 5 (NprE 引物)GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC SEQ ID NO :6 (pUB-Bglll-FW)GTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACCSEQ ID NO :7 (pUB-Bglll-RV)GTCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTCSEQ ID NO 8 (NprE)AATTGTGTTLSEQ ID NO 9 (NprE)DA ⑶ YGGVHTSEQ ID NO : 10 (NPrE)A ⑶ YGGVHTNSEQ ID NO : 11 (NprE)GDYGGVHTNSEQ ID NO 12 (NprE)LSNPTKYGQPSEQ ID NO : 13 (NprE 片段 1)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAV DAHYNLGKVYDYFYQKFNIVSSVHYGSRSLSNPTKYGQPDNFKSEQ ID NO : 14 (NprE 片段 2)DA⑶YGGVHTAAYNTITKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO : 15 (NprE 片段 3)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHY NLGKNSYDNKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDSEQ ID NO 16 (NprE 片段 4)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHY NLGKNSYDNKIVSSVHYGSRMDVSEQ ID NO : 17 (NprE 片段 5)LSNPTKYGQPKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAEQIYYRALTVTFKDAKAALIQSARDLYGSQDA ASVEAAffNAVGLSEQ ID NO 18 (NprE S129I/F130L/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GILFSPLSGSMDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDffDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 19 (NprE M138L/V190I/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITISQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 20 (NprE S129I/F130L/M138L/V190I/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWI ⑶ QMIY ⑶⑶ GILFSPLSGSLDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDffDIGEDITISQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD
yggvhtn sgipnkaayntitkigvnkaeqiyyraltvyltpsstfkdakaaliqsardlygsqdaasveaawnavg實施例1測定法在下文描述的實施例中使用以下測定法。在實施例中指出對下文所提供方案的任 意偏離。在這些實驗中，使用分光光度計來測量反應(yīng)結(jié)束后形成的產(chǎn)物的吸光度。使用反 射計來測量樣品的反射度。A.蛋白質(zhì)含量測定1.在96孔微量滴定板(MTP)中測定蛋白質(zhì)含量的BCA(bicinchoninicacid)測定 法在這些測定法中，使用BCA(Pierce)測定法在MTP規(guī)格上確定蛋白酶樣品中的蛋 白質(zhì)濃度。在這個測定系統(tǒng)中，使用的化學品和試劑溶液是BCA蛋白質(zhì)測定試劑和Pierce 稀釋緩沖液(50mM MES，pH 6. 5，2mMCaCl2，0. 005 % TWEEN -80)。使用的設(shè)備是 SpectraMAX(340 型)MTP 讀數(shù)儀。MTP 從 Costar 獲得(9017 型)。在本試驗中，將200μ1 BCA試劑移入每一孔，隨后移入20 μ 1稀釋的蛋白質(zhì)。徹 底混合后，MTP在37°C溫育30分鐘。除去可能的氣泡，并且在562nm處讀取孔內(nèi)溶液的光 密度(OD)。為測定蛋白質(zhì)濃度，從樣品讀數(shù)中扣除背景讀數(shù)。對蛋白質(zhì)標準品(純化的蛋 白酶)標出OD562值以產(chǎn)生標準曲線。從該標準曲線外推出樣品的蛋白質(zhì)濃度。2.用于在96孔微量滴定板(MTP)中測定蛋白質(zhì)含量的Bradford測定法在這些測定法中，使用Bradford染料試劑(Quick Start)測定法在MTP規(guī)格上確 定蛋白酶樣品中的蛋白質(zhì)濃度。在這個測定系統(tǒng)中，使用的化學品和試劑溶液是快速啟動Bradford染料試劑 (BIO-RAD 目錄號 500-0205)、稀釋緩沖液(IOmM NaCI,0. ImMCaCI2,0.005 %TWEEN -80)。使用的設(shè)備是 Biomek FX Robot (Beckman)和 SpectraMAX(340 型)MTP 讀數(shù)儀。MTP 來自 Costar (9017 型)。在本試驗中，將200 μ 1 Bradford染料試劑移入每一孔，隨后移入15 μ 1稀釋緩沖 液。最后，添加10μ1濾過的培養(yǎng)肉湯至諸孔。徹底混合后，MTP在室溫溫育至少10分鐘。 吹去可能的氣泡并且在595nm處讀取孔的0D。為測定蛋白質(zhì)濃度，從樣品讀數(shù)中扣除背景 讀數(shù)(即來自非溫育孔的讀數(shù))。所得OD595值提供了樣品中蛋白質(zhì)含量的相對量值。B.對于g白 解掛件的檸船I定j牛測丨定法在mM檸檬酸鹽存在下溫育野生型NprE和變體后測量檸檬酸鹽穩(wěn)定性。應(yīng)用DMC 水解測定法確定起始和殘余活性。在這個測定系統(tǒng)中，使用的化學品和試劑溶液是一水合檸檬酸Merck 1.00244CN 10842481 A說 明 書 30/44頁
在這一測定法系統(tǒng)中，應(yīng)用了以下化學物質(zhì)和試劑二甲基酪蛋白(DMC) Sigma C-9801WEEN "80Sigma P—8074PIPES 緩沖液(無酸)Sigma P-1851 ；15. 1 溶解于約 960ml 水中；用 4N NaOH 將 pH 調(diào)節(jié)至 6. 0，加入 1ml 5%TWEEN -80，并使體積升為 1000ml。PIPES 和TWEEN -80的終濃度分別為50mM和0. 005%。間三硝苯基磺酸(TNBS) Sigma P-2297 (5%水溶液)試劑A 將 45. 4g Na2B407. 10H20 (Merck 6308)禾口15ml 4N NaOH—起溶解至 1000ml 終體積(如果需要的話通過加熱)試劑B 將 35. 2g NaH2P04. 1H20 (Merck 6346)和 0. 6g Na2S03(Merck 6657) 一起溶解至 1000ml 的終體積。^^為制備底物，將4g 二甲基酪蛋白溶解于400ml PIPES緩沖液中。將濾過的培養(yǎng) 物上清液稀釋于PIPES緩沖液中。然后，將10 yl每一稀釋的上清液添加到MTP孔中的 200 yl底物中。用帶子覆蓋MTP，振蕩數(shù)秒并且置于25°C的溫箱中30分鐘，無需攪拌。在 從該溫箱中移除第一個板之前約15分鐘，通過使每50ml試劑A混合1ml TNBS制備TNBS 試劑。使MTP的每一孔裝入60 yl TNBS試劑A。振蕩經(jīng)溫育的板數(shù)秒，然后將10 yl轉(zhuǎn)移 至具有TNBS試劑A的MTP中。用帶子覆蓋該板，并在室溫及500轉(zhuǎn)/分鐘在臺式搖床(BMG Thermostar)中振蕩20分鐘。最后，往每一孔加入200 u 1試劑B，在搖床上混合1分鐘，并 應(yīng)用MTP讀數(shù)儀確定在405nm處的吸光度。針對空白值(即，沒有酶的底物)校正得到的吸光度值。得到的吸光度是水解活 性的測量。通過將吸光度除以確定的蛋白質(zhì)濃度計算樣本的(任意的)比活性。D. 2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰丙氨酰硝基芐酰胺蛋白酶 測定法(Abz-AGLA-Nba)下文所提供的方法提供了某種程度的技術(shù)細節(jié)，其中所述技術(shù)細節(jié)產(chǎn)生獨立于時 間和地點的可重復性蛋白酶測定數(shù)據(jù)。盡管該測定法可適應(yīng)于給定的實驗條件，然而必須 使通過改良方法獲得的任意數(shù)據(jù)與通過原始方法產(chǎn)生的結(jié)果相一致。中性金屬蛋白酶切割 2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基芐酰胺(Abz-AGLA-Nba) 的甘氨酸與亮氨酸之間的肽鍵。溶液中游離的2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酸(Abz-AG) 在340nm處最大激發(fā)時在415nm處具有最大熒光發(fā)射。Abz-AG的熒光被完整Abz-AGLA-Nba 分子中的硝基芐酰胺猝滅。在這些實驗中，通過熒光光譜(激發(fā)340/發(fā)射415)監(jiān)測由蛋白酶切割 Abz-AGLA-Nba引起的Abz-AG釋放。Abz-AG的出現(xiàn)率是蛋白酶解活性的度量值。測定法在 非底物限制性初始速度條件下進行。對于可重復性測定結(jié)果，需要帶溫度控制的微量板混合器(例如Eppendorf Thermomixer)。在添加酶之前，測試溶液在微量板混合器中溫育至期望的溫度(例如 25°C )。添加酶溶液至該混合器中的板，劇烈混合并迅速轉(zhuǎn)移至板讀數(shù)儀。需要具有連續(xù)數(shù)據(jù)記錄、線性回歸分析和溫度控制能力的熒光分光光度計(例如SpectraMax M5、Gemini EM、Molecular Devices)。讀數(shù)儀總是維持在期望的溫度(例如 25V )。設(shè)置該讀數(shù)儀用于頂部讀數(shù)熒光檢測并且將激發(fā)設(shè)置到350nm并將發(fā)射設(shè)置到 415nm，不使用截止濾光鏡。將PMT設(shè)置成中等靈敏度并且每孔5個讀數(shù)。打開自動校準， 但僅在第一次讀數(shù)前校準。該測定法測量3分鐘，同時根據(jù)待監(jiān)測的孔數(shù)，使讀數(shù)間隔最小 化。將讀數(shù)儀設(shè)置成計算milli-RFU/分鐘的速率(千個相對熒光單位/分鐘)。用來計算 速率的讀數(shù)數(shù)目(Vmax點)設(shè)置成等同于2分鐘的數(shù)目，如通過讀數(shù)間隔確定的那樣(例 如每隔10秒的讀數(shù)將使用12個點來計算速率)。最大RFU設(shè)置成50，000。酶和底物貯存液的所有吸取均用正壓可調(diào)節(jié)移液器(RaininMicroman)進行。緩 沖液、測試液和酶工作溶液由單通道或多通道空氣排量移液器(Rainin LTS)從試管、試劑 儲庫或貯存微量板吸取。僅當使用少數(shù)孔時，連續(xù)移液器(Eppendorf)才用于轉(zhuǎn)移測試溶 液至微量板孔，以使試劑損失最小化。自動移液儀諸如Beckman FX或Cybio Cybi-well也 用于從工作貯存微量板轉(zhuǎn)移酶溶液至分析微量板以便立刻起始整個微量板。試劑和溶液52. 6mM MES/NaOH, 2. 6mM CaCl2, pH 6. 5-MES 緩沖液將MES酸(10. 28g)和292mg無水CaCl2溶解于大約900mL純化水中。溶液用NaOH 滴定至pH 6.5(在25°C或用溫度調(diào)節(jié)pH探頭)。調(diào)節(jié)過pH的緩沖液補足至1L總體積。最 終溶液經(jīng)過0. 22 y m無菌濾器過濾并保持在室溫。在DMF 中的 48mM Abz-AGLA-Nba-Abz-AGLA-Nba 貯存液將大約28mg Abz-AGLA-Nba置于一支小管內(nèi)。使其溶解于DMF(體積根據(jù)聚結(jié)的 Abz-AGLA-Nba變化)并且渦旋混合幾分鐘。該溶液在室溫避光貯存。50mM MES, 2. 5mM CaCl2,5% DMF, 2. 4mM Abz-AGLA-NbapH 6. 5-測試溶液lmL Abz-AGLA-Nba貯存液添加至19mL MES緩沖液中并渦旋混合。該溶液在室溫 避光貯存。50mM MES, 2. 5mM CaCl2, pH 6. 5_ 酶稀釋緩沖液通過添加5mL純化水至95mL MES緩沖液產(chǎn)生這種緩沖液。50mM MES, 2. 5mM CaCl2,, 5% DMF,pH 6. 5-底物稀釋緩沖液5mL純DMF添加至95mL MES緩沖液。該緩沖液用來確定動力學參數(shù)。酶溶液酶貯存溶液用酶稀釋緩沖液稀釋成大約lppm(l u g/mL)濃度。將 MULTIFECT 中性蛋白酶(野生型NprE)稀釋至濃度低于6ppm(6i! g/mL)。優(yōu)選連 續(xù)稀釋物。溶液在室溫穩(wěn)定1小時，不過對于較長的貯存時間，在冰上保持所述溶液。方法首先，制備全部緩沖液、貯存液和工作溶液。除非另有說明，每種酶稀釋液一式三 份進行測試。當未完全占滿時，酶工作溶液貯存微量板以自板左邊開始的全部垂直列排列 (以適應(yīng)板讀數(shù)儀)。類似地設(shè)置相應(yīng)的測試板。微量板熒光分光光度計如前述設(shè)置。首先，將200 y L等份的測試溶液置于96孔微量板的孔內(nèi)。該板在25°C于溫控微 量板混合器中避光溫育10分鐘。通過從貯存微量板轉(zhuǎn)移10uL酶工作溶液至混合器中的測 試微量板啟動該測定法。最佳地，使用96孔移液吸頭，或在一些實驗中，使用8孔多通道移 液器首先從最左邊列轉(zhuǎn)移。劇烈混合該溶液15秒(在Eppendorf Thermomixer中900轉(zhuǎn)/分鐘)。將測試微量板立即轉(zhuǎn)移至微量板熒光分光光度計并且開始記錄在350nm激發(fā)和 415nm發(fā)射的熒光量值。熒光分光光度計軟件計算每孔熒光增加對milli-RFU/分鐘的線性 回歸的反應(yīng)速率。在一些實驗中，當?shù)谝话逭谧x數(shù)時，將第二塊板置于微量板混合器用于 溫度平衡。初始速率與產(chǎn)物濃度(即釋放的2-氨基苯甲酰基熒光)成線性關(guān)系，直到0. 3mM 產(chǎn)物，這與具有大約22，000RFU背景熒光的始自2. 3mMAbz-AGLA-Nba的溶液中的大約 50，000RFU相對應(yīng)。Abz-AGLA-Nba溶解于DMF中并且在制備當日使用。實施例2在枯草芽孢桿菌中的NprE蛋白酶產(chǎn)生在該實施例中，描述了在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生NprE蛋白酶所開展的實驗。特別 地，提供了在將質(zhì)粒pUBnprE轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌中所使用的方法。轉(zhuǎn)化如本領(lǐng)域已知那 樣(見，例如W0 02/14490和W02007/044993，兩個均在此引入作為參考)進行。下文提供 的DNA序列(來自解淀粉芽孢桿菌的nprE前導序列、nprE pro和nprE成熟DNA序列)編 碼NprE前體蛋白。GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCG GGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATC AGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTT CTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAAC GGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATT AAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAG CGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCC ACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGT AACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTA CGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAA CCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCAC CACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATT TCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGA TACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTFCATTCTTCTCACCTCTTTCCGG TTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGC CGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGAT ATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTA CAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTT ACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCG TCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAG CGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAA(SEQ ID NO 1)在以上序列中，粗體表示編碼成熟NprE蛋白酶的DNA，標準字體表示前導序列 (nprE前導序列)，且下劃線部分表示前序列(nprE pro)。下文提供的氨基酸序列(NprE前 導序列、NprE pro和NprE成熟DNA序列)(SEQ ID NO 2)與全長NprE前體蛋白相對應(yīng)。在 這個序列中，下劃線部分表示前序列并且粗體表示成熟NprE蛋白酶。
MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKV FKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQAL DHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANffEVTVDAETGKILKKQNKVEHAA TTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNL GKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETA NLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDA⑶YGGVHTNS GIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(SEQ ID NO 2)成熟NprE序列如SEQ ID N0:3所示。使用該序列作為制備本文所述變體文庫的
■石出。AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQ RAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHE MTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNT DA⑶YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAA WNAVGL(SEQ ID NO 3)使用兩條特異性引物01igoAB1740 :CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATC ATTTTTCCCG(SEQ ID NO 4)和 01igoAB1741 :GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCAT GGTGAAGCC (SEQ ID NO :5)，通過PCR從解淀粉芽孢桿菌染色體DNA擴增nprE基因而構(gòu)建 pUBnprE表達載體。在熱循環(huán)儀中用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)進行PCR。PCR混合物含 有 10 ill 5 X 緩沖液(Finnzymes Phusion) ,1 U 1 10mM dNTPsU. 5u 1 DMS0、1 ii 1 每種弓丨 物、liil Finnzymes Phusion DNA 聚合酶、1 ii 1 染色體 DNA 溶液 50ng/ii 1，34. 5 ii 1 MilliQ 水。使用以下PCR方案PCR 方案1)98°C30 秒；2) 98 °C 10 秒；3) 55 °C 20 秒；4)72°C1 分鐘;5)步驟2至4進行25個循環(huán)；和6) 72 °C 5 分鐘。該PCR產(chǎn)生1. 9kb DNA片段，該片段用Bglll和Bell DNA限制性酶消化。多拷貝 芽孢桿菌載體 pUB110(見例如 Gryczan, J Bacterid, 134 =318-329,1978)用 BamHl 消化。 隨后在pUBllOxBamHI載體中連接PCR片段xBglllxBclI以形成pUBnprE表達載體。將 pUBnprE 轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌(A aprE，A nprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE: : (xylR, pxylA-comK)菌株。如W0 02/14490 (其在此引入作為參考)描述進行枯 草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化。在含有具20mg/L新霉素的25mlMBD培養(yǎng)基(基于M0PS的確定成分培養(yǎng) 基)的搖瓶中使攜帶PUBnprE載體的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體進行選擇性生長?；旧先绫绢I(lǐng) 域已知那樣(見Neidhardt等人，J Bacterid, 119 :736_747，1974)制備MBD培養(yǎng)基，但是 基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含NH4Cl2、FeS04和CaCl2，使用3mM K2HP04并且該基礎(chǔ)培養(yǎng)基補充有60mM脲、75g/L葡萄糖和大豆胨。另外，將該微營養(yǎng)物制備為1升中含有400mg FeSO4. 7H20、IOOmg MnSO4. H2O> IOOmgZnSO4. 7H20、50mg CuCl2. 2H20、IOOmg CoCl2. 6H20、IOOmgNaMoO4. 2H20、IOOmg Na2B4O7. IOH2OUOml IM CaCl2和IOml 0. 5M檸檬酸鈉的100X貯存液。培養(yǎng)物在37°C于溫箱 /搖床(Infors)中孵育3日。該培養(yǎng)導致具有蛋白酶解活性的分泌性NprE蛋白酶的產(chǎn)生， 如通過蛋白酶測定法證實的那樣。使用NuPage Novex 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen， 目錄號NP0301B0X)進行凝膠分析。為制備分析用樣品，2體積上清液與1體積IM HC1、1體 積4XLDS樣品緩沖液(Invitrogen，目錄號NP0007)和1 % PMSF(20mg/ml)混合。隨后在 70°C加熱該樣本10分鐘。然后，將25 μ L每份樣 品連同IOyL SeeBlue plus 2預染蛋白 質(zhì)標準品(Invitrogen，目錄號LC5925) —起上樣到凝膠上。結(jié)果清晰地證明本實施例中描 述的nprE克隆策略適合在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生有活性的NprE。實施例3位點評價文庫(SEL)的產(chǎn)生在本實施例中，描述了用于構(gòu)建nprE SEL的方法。nprE SEL的產(chǎn)牛-方法I 含有上文所述nprE表達盒的pUBnprE載體充當模板DNA。該載體含有在位點評價 文庫構(gòu)建中使用的獨特的BglII限制性位點。簡而言之，為構(gòu)建nprE位點評價文庫，進行 3個PCR反應(yīng)，包括在成熟nprE DNA序列中導入目的突變密碼子的2個誘變PCR和用來融 合這兩個誘變PCR以構(gòu)建pUBnprE表達載體的第三PCR，其中所述pUBnprE表達載體在成熟 nprE序列中包括期望的突變密碼子。誘變的方法基于密碼子特異的突變方法，其中使用包含專門設(shè)計的三聯(lián)體DNA序 列NNS(N = A、C、T或G ；并且S = C或G)的長度25至45個核苷酸的正向和反向寡核苷 酸引物進行在特定DNA三聯(lián)體中一次產(chǎn)生全部可能的突變，其中所述NNS與待突變密碼子 的序列相對應(yīng)，并且確保在這個特定nprE成熟密碼子處隨機摻入核苷酸。引物名稱中列出 的數(shù)字對應(yīng)于特定nprE成熟密碼子位置。包括評價的多重位點。示例性引物序列表在WO 2007/044993中描述，其在此引入作為參考。用來構(gòu)建位點評價文庫的兩條額外引物含有BglII限制性位點連同兩側(cè)有BglII 限制性位點的一部分pUBnprE DNA序列。這些引物由Invitrogen生產(chǎn)(50nmole規(guī)格，脫 鹽)pUB-BglII-FWGTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC(SEQ ID NO 6)；和 pUB-Bglll-RV G TCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC(SEQ IDNO 7)。每個SEL的構(gòu)建始于使用pUB-BglII-FW引物和特異性nprE反向誘變引物的兩個 初級PCR擴增。對于第二 PCR，使用pUB-BglII-RV引物和特異性nprE正向誘變引物(對于 正向和反向誘變引物，nprE成熟密碼子位置相同)。所述突變在成熟nprE序列中的導入使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes ； 目錄號F-530L)進行。全部PCR根據(jù)隨同該聚合酶提供的Firmzymes方案進行。對于初級 PCR的PCR條件是對于初級PCR 1 pUB-Bglll-FW引物和特異性NPRE反向誘變引物-兩者均1 μ L(10 μ M)；對于初級PCR 2 pUB-Bglll-RV引物和特異性NPRE正向誘變引物-兩者均1 μ L(10 μ M)；
以及5 XPhusion HF 緩沖液 IOyLIOmM dNTP 混合物1 μ L Phusion DNA 聚合酶 0. 75 μ L (2 單位 / μ L)DMSO, 100%1 μ LpUBnprE 模板 DNA1 μ L (0. I-Ing/ μ L)高壓滅菌蒸餾水直至50 μ LPCR 程序是98°C 30 秒，30x (98°C 10 秒，55°C 20 秒，72°C 1. 5 分鐘)和 72°C 5 分 鐘，在PTC-200Peltier熱循環(huán)儀(MJ Research)中進行。所述PCR實驗產(chǎn)生大約2至3kB 的2個片段，其具有目的NprE成熟密碼子周圍約30個核苷酸堿基的重疊。在第三PCR反 應(yīng)中使用前述這兩個片段以及正向和反向BglII引物來融合所述片段。該融合PCR反應(yīng)在 以下溶液中實施pUB-Bglll-正向引物和 pUB-Bglll-反向引物-均 1 μ L(10 μ Μ)，以及5 XPhusion HF 緩沖液 IOyLIOmM dNTP 混合物1 μ LPhusion DNA 聚合酶 0. 75 μ L (2 單位 / μ L)DMSO, 100%1 μ L初級PCR 1反應(yīng)混合物 1 μ L初級PCR 2反應(yīng)混合物 1 μ L高壓滅菌蒸餾水直至50 μ LPCR 融合程序如下98 V 30 秒，30χ (98 °C 10 秒，55 V 20 秒，72 °C 2:40 分鐘)禾口 72°C 5 分鐘，在 PTC-200Peltier 熱循環(huán)儀(MJ Research)中進行。擴增的線性6. 5Kb片段使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號28106)進 行純化并用BgIII限制酶消化以在該融合片段的兩側(cè)產(chǎn)生粘性末端-35 μ L純化的線性DNA片段-4 μ L REACT 3 緩沖液(Invitrogen)-1 μ L BglII，10 單位 /ml (Invitrogen)反應(yīng)條件1小時，30°C。連接經(jīng)BglII消化并使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號28106)純化 的片段產(chǎn)生了含有所期望突變的環(huán)狀和多聚DNA -30 μ L純化的BglII消化的DNA片段-8 μ L T4DNA 連接酶緩沖液(Invitrogen 目錄號 46300_018)-IyL T4DNA 連接酶，1 單位/μ L(Invitrogen 目錄號 15224-017)反應(yīng)條件16_20小時，在16°C。隨后，將連接混合物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌(AaprE，AnprE, ορρΑ, Δ spoIIE， degUHy32, Δ amyE: : (xylR，pxylA-comK)菌株中。如 W002/14490 (在此引入作為參考)描 述的那樣進行枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化。對于每個文庫，挑取96個單克隆并在含新霉素和1. 25g/ L酵母提取物的MOPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于序列分析(BaseClear)和篩選目的。每個文庫包括 最多19個nprE位點特異性變體。
通過在37°C在96孔MTP中的含20mg/L新霉素和1. 25g/L酵母提取物的MBD培養(yǎng) 基中培育枯草芽孢桿菌SEL轉(zhuǎn)化體68小時，產(chǎn)生了所述變體。nprE SEL 的產(chǎn)牛-方法 II還描述了產(chǎn)生nprE SEL的備選方法。這些方法適合產(chǎn)生其他目的酶的SEL。如上 所述，含有nprE表達盒的pUBnprE載體充當用于產(chǎn)生nprESEL和NprE變體的模板DNA來 源。這兩種方法之間的主要不同在于本方法需要使用互補性定點誘變引物進行 完整載體的 擴增。MM含有pUBnprE載體的芽孢桿菌菌株Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen 目錄號 12143)即用型-Lyse溶菌酶(Epicentre 目錄號 R 1802M)dam 甲基化酶試劑盒(New England Biolabs 目錄號 M0222L)Zymoclean 凝膠 DNA 回收試劑盒(Zymo Research 目錄號 D4001)nprE定點誘變引物，IOOnmole規(guī)格，5，磷酸化的，PAGE純化的(Integrated DNA Technologies)QUIKCHANGE 多位點定點誘變試劑盒(Stratagene目錄號200514)MJ Research PTC-200 Peltier WM^iX (Bio-Rad Laboratories)1. 2%瓊脂糖 E-凝膠(Invitrogen 目錄號 G5018-01)TempliPhi 擴增試劑盒(GE Healthcare 目錄號 25-6400-10)枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞(AaprE，AnprE,ορρΑ，Δ spoIIE, degUHy32, Δ amyE(xylR, pxylA-comK)方法為獲得含有一個突變的pUBnprE質(zhì)粒(通過如上文實施例3中和W02007/044993 中所述的nprE SEL篩選法鑒定的，所述專利申請在此引入本文作為參考)，使用每種目的 芽孢桿菌菌株的單克隆來接種5ml LB+10ppm新霉素試管(例如起子培養(yǎng)物)。該培養(yǎng)物 在37°C培育，以225轉(zhuǎn)/分鐘振搖6小時。然后，IOOml新鮮LB+10ppm新霉素用Iml起子 培養(yǎng)物接種。該培養(yǎng)物在37°C培育過夜，以225轉(zhuǎn)/分鐘振搖。在這次孵育后，通過充分離 心以提供細胞沉淀來收集細胞沉淀。該細胞沉淀重懸于IOml緩沖液Pl (Qiagen Plasmid Midi試劑盒)中。隨后，添加10 μ 1即用型-Lyse溶菌酶至重懸的細胞沉淀并在37°C溫育 30分鐘。使用造成細胞培養(yǎng)物容積增加的IOml緩沖液P2和P3繼續(xù)進行QiagenPlasmid Midi試劑盒方案。從芽孢桿菌分離含有單一 nprE突變的每種pUBnprE質(zhì)粒后，測定每種 質(zhì)粒的濃度。所述質(zhì)粒隨后使用dam甲基化酶試劑盒(New England Biolabs)按照制造商 的說明書進行dam甲基化，以甲基化每管大約2 μ g的每種pUBnprE質(zhì)粒。使用Zymoclean 凝膠DNA回收試劑盒來純化和濃縮dam-甲基化的pUBnprE質(zhì)粒。隨后定量dam-甲基化 pUBnprE質(zhì)粒并將其稀釋成每種質(zhì)粒的50ng/μ 1工作濃度。分別為每個反應(yīng)制備混合的 定點誘變引物。例如，使用PUBnprE T14R質(zhì)粒作為模板來源，混合的定點誘變引物管將含 有 10 μ 1 的 nprE-S23R、10 μ 1 nprE_G24R、10 μ 1 nprE-N46K 和 10 μ 1 nprE_T54R(全部引 物均為10 μ Μ)。使用QuikChange多位點定向誘變試劑盒(Stratagene)按照照制造商的 說明書進行PCR反應(yīng)(例如，1 μ 1含有一個突變的dam甲基化pUBnprE質(zhì)粒(50ng/ μ 1)、2μ 1 nprE 定點誘變引物(10μΜ)、2·5μ1 IOXQuikChange Multi 反應(yīng)緩沖液、1 μ 1 dNTP 混合物、1 μ 1 QuikChange Multi酶混合物(2. 5U/ μ 1)和17. 5μ 1高壓滅菌的蒸餾水以產(chǎn) 生總計25 μ 1反應(yīng)混合物。使用以下條件擴增nprE變體文庫95°C，1分鐘(僅第1循環(huán))， 隨后95°C 1分鐘，55°C 1分鐘，65°C 13. 5分鐘并且重復循環(huán)29次。反應(yīng)產(chǎn)物在4°C貯存過 夜。隨后，該反應(yīng)混合物進行Dpni消化處理(由QUIKCHANGE 多位點定向誘變試 劑盒供應(yīng))以使用制造商方案(即1.5μ1 DpnI限制性酶添加至每個管并在37°C溫育3小 時；2 μ 1經(jīng)DpnI消化的PCR反應(yīng)物隨后在1. 2% E-凝膠上分析以確保PCR反應(yīng)運行和親 代模板被降解)消化親代pUB-nprE質(zhì)粒。隨后使用制造商方案(即對于約Ilyl總反應(yīng)， 1 μ 1經(jīng)DpnI處理的QuikChange多位點定向誘變PCR,5 μ 1 TempliPhi樣品緩沖液、5 μ 1 TempliPhi反應(yīng)緩沖液和0. 2μ 1 TempliPhi酶混合物；在30°C溫育3小時；該TempliPhi反 應(yīng)通過添加200 μ 1高壓滅菌的蒸餾水進行稀釋并短暫渦旋混合)進行TempliPhi滾環(huán)擴 增來產(chǎn)生大量的DNA，以增加nprE多重變體文庫的大小。隨后，將1. 5 μ 1稀釋的TempliPhi 物質(zhì)轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞中，并且使用LA+10ppm新霉素+1. 6%脫脂乳板選擇 nprE多重變體。挑取菌落并隨后對其測序以鑒定不同的nprE變體文庫組合。集成的DNA技術(shù)(Integrated DNA Technologies)合成全部用于誘變的引物 (IOOnmole規(guī)格，5，-磷酸化和PAGE純化)。評價的位點包括:4、12、13、23、45、49、50、54、 59、60、65、82、90、110、119、128、129、130、135、136、137、138、139、140、151、152、155、179、 190、197、198、199、204、205、214、216、217、218、219、220、221、222、224、243、244、260、261、 263、265、269、273、282、285、286、289、293、296、297 和 299。示范性的誘變引物描述于 WO 2007/044993，其在此引入作為參考。實施例4變體蛋白酶的表達、發(fā)酵和純化本實施例描述了用來表達、發(fā)酵和純化前述實施例的經(jīng)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的蛋白 酶的方法。中性金屬蛋白酶重組枯草芽孢桿菌通過常規(guī)分批發(fā)酵法在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用一個甘油小管 的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物(含有解淀粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶或其變體)來接種600ml含 有200mg/L氯霉素的SBG 培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)物在37°C培育36-48小時。所應(yīng)用的備選 方法包括在35°C在確定組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組枯草芽孢桿菌60小時。隨后，如本領(lǐng)域已 知，通過在12，000轉(zhuǎn)/分鐘離心回收培養(yǎng)液(SORVALL 離心機型號RC5B)。從培養(yǎng) 液分離所述分泌性中性金屬蛋白酶并使用具有BES (聚醚砜)IOkDa截斷值的Amicon過濾 系統(tǒng)8400濃縮大約10倍。濃縮的上清液在4°C對含有ImM CaCl2的pH 5. 4的25mM MES緩沖液透析過夜。透 析物隨后加載到陽離子交換柱Poros HS20 (總體積約83mL的Applied Biosystems柱；結(jié) 合容量約4. 5g蛋白質(zhì)/mL柱；水)上。該柱用含有ImM CaCl2的pH 5. 4的25mM MES緩沖 液預先平衡。應(yīng)用從 25mM MES、pH 5. 4、lmM CaCl2 至 50mM MES、pH 6. 2、2mM CaCljP IOOmM NaCl的pH和鹽梯度洗脫結(jié)合的 蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)洗脫在pH 5. 8和6. 0之間進行。將純化 的蛋白質(zhì)濃縮并緩沖液交換至含有2mM CaCl2和40%丙二醇的pH5. 8的25mM MES緩沖液 中。通過測量蛋白酶解活性和通過10% (w/v) NU-PAGE Novex SDS-PAGE(InvitrogenCorp.)評估制備物的純度，并且發(fā)現(xiàn)純度大于95%。實施例5鑒定NprE蛋白酶的檸檬酸鹽誘導的自溶位點在這一實施例中，描述了用于評估檸檬酸鹽誘導的野生型和重組變體NprE自溶 的方法。在這些實驗中，應(yīng)用檸檬酸納(Sigma)誘導來自解淀粉芽胞桿菌的中性金屬蛋白 酶(在枯草芽胞桿菌中表達的天然和重組變體)的自溶作用。通過在(i)在25mM MES，pH 6. 5中4°C，或(ii)5mM HEPES pH8. 0中室溫進行反應(yīng)從而控制自溶過程。在這些實驗中， 通過使(a)在IOmM檸檬酸鹽中的溫育時間(0-120分鐘)，或(b)歷時100分鐘的檸檬酸鹽 濃度(IO-IOOmM)不同而優(yōu)化0.4mg/ml NprE的自溶作用。在相似的條件下溫育僅稀釋于 緩沖液(即，沒有檸檬酸鹽)的中性金屬蛋白酶對照。應(yīng)用合成肽(Abz-AGLA-Nba)測量剩 余的蛋白酶活性，并相對于其本身無檸檬酸鹽的對照進行計算。如圖IA所示，中性金屬蛋白酶NprE在檸檬酸鹽的存在下失活，其中所述的檸檬酸 鹽是弱的鈣螯合劑。在100-250mM檸檬酸鹽的存在下，以及在不存在鈣的情況下，當在室溫 溫育5分鐘時，野生型中性金屬蛋白酶的活性降低到少于30%。這一通過檸檬酸鹽對蛋白 酶的失活通過滴加氯化鈣而克服。此外，在2mM氯化鈣的存在下，野生型中性金屬蛋白酶完 全穩(wěn)定并具酶活性。這一結(jié)果證實鈣而非鋅的減損是導致NprE在檸檬酸鹽的存在下不穩(wěn) 定的原因。在4°C進行的自溶反應(yīng)通過添加等體積的IN HCl而終止。應(yīng)用TCA沉淀樣本，洗 滌沉淀，并應(yīng)用丙酮干燥。將得到的沉淀重懸于20 μ L緩沖液(pH 6.5)和4XLDS樣本緩 沖液(NuPage，Invitrogen)。通過10% (w/v) SDS-PAGE分開自溶片段并電印跡至PVDF膜。 通過Edman降解(ArgoBioanalytica)測序前10個氨基酸殘基，并顯示于表5_1。應(yīng)用胰 蛋白酶凝膠內(nèi)消化確定自溶片段的部分氨基酸序列，并應(yīng)用LCQ-MS(Agilent)分析。凝膠 內(nèi)消化過程包括浸軟含有蛋白質(zhì)的凝膠塊，移除考馬斯藍染色，隨后在含有2M尿素的25mM NH4CO3中再水合凝膠塊。加入胰蛋白酶至經(jīng)再水合的凝膠塊中，在37°C歷時約6小時。消 化后，應(yīng)用乙腈和TCA提取肽。應(yīng)用乙腈-水梯度在C4-疏水柱(Vydac)分離肽。應(yīng)用 SEQUEST 數(shù)據(jù)庫檢索程序針對含有Genencor酶的數(shù)據(jù)庫檢索得到的肽圖譜。將每一 片段前10個氨基酸的氨基酸序列與已知的解淀粉芽胞桿菌NprE氨基酸序列進行比較。這 使得能夠鑒定N端的氨基酸序列，并因此鑒定NprE中的切割位點。在4°C在增加濃度的檸檬酸鹽的存在下研究檸檬酸鹽對野生型中性蛋白酶的自溶 作用，如圖IB所示。在用IOmM檸檬酸鹽溫育90分鐘后，觀察到除剩余完整NprE之外的兩 個初級自溶片段(泳道1)。完整NprE的分子量為約32kDa，而初級自溶片段為約24kDa及 9kDa大小。檸檬酸鹽增加至IOOmM濃度導致進一步的自溶以及產(chǎn)生其它的次級自溶片段 (泳道4-7)。對增加的檸檬酸鹽特異性地，24kDa的自溶片段進一步水解，產(chǎn)生3個更小的 21kDa、15kDa 及 IlkDa 的片段。通過Edman降解鑒定片段的N端 (圖2)。片段1、3和4都具有天然的N端序列， 而片段2和5具有獨特的N端。片段2是有爭議的，N端的開始處是在或接近D220、A221 和G222。基于15kDa片段的大小推導其C端，并且其在或接近位置L198。凝膠內(nèi)胰蛋白酶 消化和LCQ-MS證實了這些自溶片段的身份?；贜prE切割片段的N端和LCQ-MS分析，初 級切割位點被鑒定為在氨基酸位置M138、L198、D220、A221和G222處。
__表5-1. NprE自溶片段的N-端序列_ 實施例6對檸檬酸鹽誘導的自溶具抗性的NprE變體的產(chǎn)生這一實施例描述了篩選在鈣螯合劑的存在下具有改善的穩(wěn)定性的NprE變體。應(yīng) 用實施例3以及在WO 2007/044993(在此全文引入作為參考)中描述的基因構(gòu)建體和 測序方法針對初級切割位點M138、L198、D220、A221和G222，以及鄰近這些位點和/或 在酶表面的氨基酸進行誘變。制備了 S129、F130、M138、V190和D220的位點評價文庫， 其中在該文庫中由19種備選氨基酸殘基之一分別地替換天然存在的氨基酸殘基。同 樣，構(gòu)建 了二重(M138L-D220P ；F130L-D220P、S129I-D220P、V190I-D220P、S129I-V190I、 S129V-V190I、S129V-D220P)、三重(M138L-V190I-D220P、S129I-F130L-D220P)和五重 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)氨基酸替換變體。在50mM檸檬酸鈉的存在或不存在下篩選NprE SEL成員。所使用的緩沖 液是含有0. ImM CaCl2的25mM HEPES, pH 8. 0。應(yīng)用琥珀酰化-酪蛋白/TNBSA方 法(Pierce, Inc. Rockford, IL)或熒光標記的 Abz-AGLA-Nba 肽測定法(Vriend 等， J Biol Chem, 255 =3482-3486,1980)測量蛋白酶活性。所應(yīng)用的分光光度計是 SpectraMax M2e(MolecularDevices)，并且所有的測定法都是在介質(zhì)蛋白酶結(jié)合的96孔板 (CorningInternational)中進行的。在室溫溫育60分鐘后對4個重復計算殘余蛋白酶活 性。相對于野生型NprE的觀察結(jié)果歸一化這些值。選擇對檸檬酸鹽顯示出增加的穩(wěn)定性 (相對于野生型)的各個變體蛋白質(zhì)，用于進一步分析特征。應(yīng)用DMC/TNBSA端點測定法針 對NprE SEL 138 (自溶位點)、190 (表面暴露位點)和220 (自溶位點)的代表性檸檬酸鹽 篩選數(shù)據(jù)顯示于表3。類似地，通過針對合成的肽測量蛋白酶活性以及通過SDS-PAGE分 析評估單(S129I/L、F130L、M138I/L、V190I、D220P/E)、二 重(S129I-V190I、 S129V V190I、M138L-D220P、S129I-D220P、F130L-D220P、V190I-D220P 禾Π S129V-D220P)、三重(S129I-F130L-D220P 和 M138L-V190I-D220P)以及五重 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)NprE變體的檸檬酸鹽穩(wěn)定性。檸檬酸鹽篩選數(shù)據(jù)表明通過Leu替換M138、通過Pro或Glu替換D220、通過Ile或Leu替換S129、通過Leu替換 F130以及通過Leu或Ile替換V190產(chǎn)生對檸檬酸鹽誘導的自溶較不敏感的蛋白酶。選擇的中性蛋白酶變體對檸檬酸鹽濃度依賴的穩(wěn)定性顯示于圖4A。當在室溫在 IOOmM檸檬酸鹽的存在下溫育時，單氨基酸替換變體S129I/V、M1381/L和D220E/P產(chǎn)生比 野生型蛋白高20-30%的剩余活性。在室溫在IOOmM檸檬酸鹽中溫育60分鐘后，V190I 顯示出最高的剩余活性( 60%)。這些突變的組合證實了加成性。最對檸檬酸鹽穩(wěn) 定的變體是5個單個突變的組合，即S129I-F130L-M138L-V190I-D220P。這一五重變體 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P在IOOmM的檸檬酸鹽中150分鐘后保留其所有的活性， 并且其改進的穩(wěn)定性得到了不存在自溶片段的證實，如通過SDS-PAGE所觀察到的那樣。具 體而言，將在增加濃度的檸檬酸鹽的存在下野生型NprE的自溶模式特征(泳道1-4)與 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P不存在自溶(泳道6_10)相比較，如圖4B所示。在IOOmM 檸檬酸鹽的存在下在室溫溫育60分鐘后，野生型NprE和變體中性金屬蛋白酶的剩余活性 百分數(shù)顯示于圖6，清楚地表明了單個替換對自溶抗性的加成性。實施例7差異掃描量熱法(DSC)應(yīng)用超靈敏高通量微熱量計VP-Cap DSC (MicroCal，Inc.，Northampton, ΜΑ)測量 過量熱容曲線。需要約50(^1^ 200-至-400 111蛋白質(zhì)。一般地，在20至100°C的溫度范 圍內(nèi)掃描400ppm NprE和變體金屬蛋白酶(在存在和不存在130mM檸檬酸鹽的情況下)。 然后再掃描相同的樣本，以檢查該過程的可逆性。對于中性蛋白酶，熱解折疊過程是不可逆 的。所應(yīng)用的緩沖液是5mM HEPES，pH 8. 0。以25至200°C /小時的掃描率評估NprE熱熔 點的掃描率依賴數(shù)據(jù)。最終選擇200°C /小時的掃描率以最小化可產(chǎn)生自聚集或自溶的任 何人工現(xiàn)象。將DSC曲線的熱中點(Tm)用作熱穩(wěn)定性的指標。440-ppm野生型中性蛋白酶 展示69.2 士 0.5°C的熱熔點(Tm)。野生型和NprE變體的熱熔點顯示于圖6，其顯示在不存 在檸檬酸鹽的情況下，突變對熱熔點僅有極微的影響。相反，突變體NprE在檸檬酸鹽存在下的熱解折疊顯示出與野生型NprE很大的不 同(圖6)。在130mM檸檬酸鹽(pH 8.0)的存在下，對野生型蛋白質(zhì)沒有獲得熱解折疊樣 式。這與其快速和完全的檸檬酸鹽誘導的自溶和失活相一致。相比之下，所有對檸檬酸鹽 穩(wěn)定的變體顯示出熱解折疊樣式。野生型NprE和變體的熱解折疊中點顯示于圖5B。在 130mM檸檬酸鹽的存在下，應(yīng)用DSC表征的檸檬酸鹽最不穩(wěn)定的變體具有48°C的熱熔點，以 及最穩(wěn)定的單變體具有52°C的熱熔點(圖6)。對檸檬酸鹽穩(wěn)定的替換顯示出加成性，并且 在S129I-F130L-M138L-V190I-D220P變體的蛋白酶骨架上5個點突變的組合具有59. 2°C的 Tm。因此，5個改進突變的組合導致Tm增加了 10°C (圖5和6)。匯總這些結(jié)果，表明在檸 檬酸鹽的存在下，對檸檬酸鹽誘導的自溶的抗性和熱穩(wěn)定性之間存在聯(lián)系。實施例8NprE的同源性建模
這一實施例描述了基于蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)NprE的已知結(jié)構(gòu)，對解淀粉芽 胞桿菌NprE的結(jié)構(gòu)進行建模，其中解淀粉芽胞桿菌NprE與所述的蠟樣芽孢桿菌NprE是 45%同一的。此外，還應(yīng)用微PIXES分析確認NprE的化學計量和鋅及鈣結(jié)合。應(yīng)用這一模 型鑒定NprE可能暴露于溶劑的氨基酸。
用于序列分析、比對和建模的結(jié)構(gòu)的坐標從PDB中下載。解淀粉芽胞桿菌NprE的 蛋白質(zhì)序列在Swissprot No. P06832中找到，并且成熟形式的序列如SEQ ID NO 3所示。 應(yīng)用程序組MOE(Chemieal ComputingCorp Montreal,Canada)根據(jù)該程序提供的手冊進行 比對計算和手工再校正、分析和建模。選擇Charmm27參數(shù)設(shè)置用于能量最小化計算。
來自蠟樣芽孢桿菌(B. cereus) (INPC)、熱溶蛋白芽孢桿菌 (B. thermoproteolyticus) (PDB ID 1KEI)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) (IEZM)和金黃色 葡萄球菌(S. aureus) (IBQB)的鋅中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)是可獲得的。這些結(jié)構(gòu)中與解淀粉芽 胞桿菌NprE的成熟蛋白酶結(jié)構(gòu)域最密切同源的是蠟樣芽孢桿菌NprE，其用作用于建模的 模板結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)上對它們進行比對。序列比對的比較揭示了在解淀粉芽胞桿菌NprE序列 和蠟樣芽孢桿菌NprE序列之間的許多插入和缺失。對比對的檢查揭示了在兩者中很可能 的錯誤，并且手工調(diào)整比對。與模板INPC結(jié)構(gòu)相比，解淀粉芽胞桿菌NprE在環(huán)上具有4個 殘基的缺失，其中預測兩個Ca2+與蛋白質(zhì)結(jié)合。這導致了對這一非常重要區(qū)域的建模的最 初的困難。幸運地是，與解淀粉芽胞桿菌NprE具有相同的金屬結(jié)合化學計量的金黃色葡萄 球菌NprE在這一環(huán)中具有同一的缺失。這允許使用金黃色葡萄球菌NprE結(jié)構(gòu)以引導在這 一區(qū)域的手工重建，以更精確地建模Ca2+與該酶的結(jié)合。盡管試圖能量最小化該模型，但對 于鋅和鈣結(jié)合位點得到很差的結(jié)果。因此，在能量最小化過程中使金屬離子以及它們的配 體保持固定。沒有將水分子添加到這一模型中。解淀粉芽胞桿菌NprE同源性模型含有成熟酶的300個殘基。最終模型的 Ramachandron標繪圖揭示了三個外露氨基酸。它們是S23、N61和S191。暴露于表面的殘基 的分析顯示在表面的8個脂肪族或芳香族殘基。它們是Y49、L55、1117、F130、V190、L216、 V260和L282。這些殘基在表面暴露環(huán)中，其中所述環(huán)通常是應(yīng)用同源性建模方法最不精確 建模的區(qū)域，并且可能表明該模型中最不可靠的區(qū)域。解淀粉芽胞桿菌NprE酶的N端部分含有8個鏈混合的β片層，其圍住了長螺旋 約75%的表面。該酶C端部分主要由6個螺旋束和2個反向平行β-片層短鏈組成。發(fā)現(xiàn) 該酶的活性部位在這兩個亞結(jié)構(gòu)域之間的界面上。底物結(jié)合裂口非常大并且是開放的，其 與所觀察到的內(nèi)蛋白酶活性相一致。在底物裂口的中間發(fā)現(xiàn)了催化中很重要的Zn2+離子。模型預測Η143、Η147和Ε167 結(jié)合這一 Zn2+離子，其具有四面體幾何形狀。在嗜熱菌蛋白酶中，第四種配體是水，但是沒 有將水添加到解淀粉芽胞桿菌NprE同源性模型中。殘基D139、D178、Ε180、D181、Ε186和 D197形成了雙鈣位點。該模型的CA351與D139、D178、D181和Ε186的側(cè)鏈、以及D183主 鏈羰基復合。該模型的CA352與D178、Ε180、D181和Ε187的側(cè)鏈復合。D178的側(cè)鏈也與 CA352接近，但是從該模型不清楚其是否與這一離子配位。為測試解淀粉芽胞桿菌NprE的金屬離子化學計量預測，進行微顆粒誘導的X光發(fā) 射(微-ΡΙΧΕ)光譜學以經(jīng)驗地確定鋅和鈣含量。雇用University of Surrey Ion Bean Centre (Guildford, United Kingdom)進行 PIXES 分析。如表 8-1 所示，Zn2+ 的觀察化學計 量是1. 02，以及Ca2+的是1. 62。如果假設(shè)兩個預測的Ca2+離子中的一個或兩個是部分地占 用，則該分析與預測的一致。Zn2+和Ca2+結(jié)合親和力的確定顯示Zn2+比Ca2+的結(jié)合更緊密 10倍，這與在PIXE樣本中觀察到的Ca2+的輕微損失相一致。_表8-1.解淀粉芽胞桿菌NprE的微PIXE分析_ 實施例9 pH依賴的活性和穩(wěn)定性評估A.野生型NprE和變體NprE的pH依賴的活性應(yīng)用MES —水合物、Trizma堿和醋酸鈉(全來自Sigma)的組合制備不同的pH緩 沖液。在緩沖液中各組分的終濃度是25mM醋酸鹽、50mMMES和25mM Tris0應(yīng)用氫氧化鈉或 氯化氫將該緩沖液的pH調(diào)節(jié)至9. 40,8. 69,8. 36,7. 70,7. 45,6. 52,6. 00,5. 45,4. 78和 4. 27 的最終PH值。將AGLA底物(American Peptide Company)溶解于DMF中，濃度是4. 8mM。 制備在每一緩沖液中不同濃度的AGLA底物，使得最終的AGLA濃度是0. 096mM、0. 048mM、 0. 024mM、0. 012mM 和 0. 006mM。將200 μ 1每一底物濃度的每一 pH緩沖液加入到一個96孔板中，往每一孔加入 10 μ 1 0. 94 μ g/ml純化的NprE或變體，然后振蕩該板15秒。在350nm的激發(fā)和415的發(fā) 射處應(yīng)用板讀數(shù)器(Molecular dynamics)監(jiān)測來自每一孔的熒光，每11秒讀數(shù)一次，歷時 5分鐘。記錄每一曲線的Vmax (最大線性斜率)。Vmax對AGLA底物濃度的繪圖產(chǎn)生Kcat/ Km，基于曲線斜率和在底物中的最終酶濃度計算所述Kcat/Km。如圖8所示，野生型NprE和 五重 NprE 變體(S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)均在 pH 6. 5 具有對 AGLA 底物的最佳 活性。B.野生型NprE和變體NprE的pH依賴的穩(wěn)定性在不存在和存在2mM氯化鈣的情況下測試野生型NprE和五重NprE變體 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P ="Quint")在不同pH值時的穩(wěn)定性。應(yīng)用與如上所述 相同的不同PH值的緩沖液組，但還往每一緩沖液中加入0. 005% Tween 80以避免蛋白質(zhì)與 96孔板結(jié)合。往一組緩沖液中加入2mM氯化鈣。加入純化的蛋白質(zhì)，終濃度為10μ g/ml。 在96孔板中的總體積是200 μ 1/孔。在室溫(例如，23°C )溫育該板3小時。應(yīng)用AGLA 測定法測量在不同PH時的每一蛋白質(zhì)的活性。野生型NprE在pH 6.5最穩(wěn)定，在低于或高 于6. 5的pH都觀察到穩(wěn)定性的下降。在pH 4. 3，NprE喪失100%的活性。Quint在pH 5.5 至PH 9. 4的寬pH范圍內(nèi)非常穩(wěn)定。盡管在低于4. 7的pH時Quint的穩(wěn)定性下降。然而， 添加2mM的氯化鈣在低pH和高pH時均穩(wěn)定了 NprE和Quint變體這兩者。在本說明書中提到的所有專利和申請指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水 平。所有專利和申請均在此引入作為參考，就如同具體地指出每一申請并且個別地表明引 入作為參考的同樣的程度。然而，對任何出版物的引用都不能理解為承認其是關(guān)于本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。盡管描述了本發(fā)明的示范性實施方案，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見地是，可以 對公開的實施方案進行各種修飾，并且預期此類修飾在發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地認識到本發(fā)明充分地適應(yīng)于實施所述目的并且獲得所提 及以及其中固有的結(jié)果和優(yōu)勢。本文所述的組合物和方法是代表性的，并且不意圖作為對 本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地知道可以對本文公開的本發(fā)明進行各種替換和 修改而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。本文中示范性描述的本發(fā)明可以在本文未具體公開的任意要素或諸要素、限制或 諸限制不存在的情況下實施。已經(jīng)使用的術(shù)語和表述作為描述性而非限制性術(shù)語使用，并 且在使用此類術(shù)語和表述時不意圖排除所示或所述特征或其部分的任意等同物，不而是承 認在要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)可能存在多種修飾。因此，應(yīng)當理解盡管本發(fā)明已經(jīng)通過例 證性的實施方案和任選特征具體地公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可采取本文中公開的概念的修 飾和變化形式，此類修飾和變化被認為落入所附權(quán)利要求界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明已在本文中進行了廣泛和一般性地描述。屬于一般性公開內(nèi)容的每個更小 種類和次級類屬組也形成本發(fā)明的部分。這包括用限制條款或否定性限制條件對本發(fā)明的 一般性描繪，其中所述的限制條款或否定性限制條件從所述類中排除任意主題物，無論所 排除的材料是否在本文中具體提及。
權(quán)利要求
分離的中性金屬蛋白酶變體，所述變體在金屬螯合劑的存在下與野生型中性金屬蛋白酶在所述金屬螯合劑的存在下相比具有改良的抗性。
2.權(quán)利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，與野生型中性金屬蛋白酶的抗性相比， 其對檸檬酸鹽誘導的自溶具有改良的抗性。
3.權(quán)利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體是芽孢桿菌屬 (Bacillus)中性金屬蛋白酶變體。
4.權(quán)利要求3的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體具有在選自 等價于SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的位置129、130、138、190和220中的3個、4個或5個 位置處包含替換的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的替換包含選自 S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P 的多重突 變。
6.權(quán)利要求3的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的芽孢桿菌屬是解 淀粉芽胞桿菌(B. amyloliquefaciens)。
7.權(quán)利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的分離的中性金屬蛋白酶與包 含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的中性金屬蛋白酶具有至少約45%的氨基酸同一性。
8.編碼權(quán)利要求1的中性金屬蛋白酶變體的分離的核酸序列。
9.包含權(quán)利要求8的核酸序列的表達載體。
10.包含權(quán)利要求9的表達載體的宿主細胞。
11.權(quán)利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體包含SEQID NO 18(S129I/F130L/D220P)、SEQ ID NO 19 (M138L/V190I/D220P)禾Π / 或 SEQ ID NO: 20(S129I/F130L/M138L/V190I/D220P)所示的氨基酸序列。
12.包含權(quán)利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體的組合物。
13.權(quán)利要求12的組合物，還包含至少一種鈣離子和/或至少一種鋅離子。
14.權(quán)利要求13的組合物，還包含檸檬酸鹽。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物是清潔組合物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述的組合物還包含至少一種選自蛋白酶、淀粉酶、月旨 肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、半纖維素酶和纖維素酶的其它酶或酶衍生 物。
17.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物包含至少約0.0001重量百分數(shù)的中性金 屬蛋白酶變體；或約0. 001至約0. 5重量百分數(shù)的中性金屬蛋白酶變體。
18.權(quán)利要求12的組合物，還包含至少一種附屬成分。
19.權(quán)利要求12的組合物，還包含足量的pH調(diào)節(jié)劑以給所述組合物提供約3至約5的 凈PH，所述組合物基本上沒有在約pH 3至約pH 5的pH水解的物質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的組合物，還包含至少一種表面活性劑。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述表面活性劑是包含環(huán)氧乙烷部分的烷基硫酸鈉表 面活性劑。
22.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是液體。
23.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物是動物飼料。
24.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物是織物加工組合物和/或皮革加工組合物。
25.清潔方法，包括使表面和/或包含織物的物品與權(quán)利要求15的清潔組合物接觸的步驟。
26.權(quán)利要求25的清潔方法，還包括漂洗該表面和/或包含織物的物品的步驟。
27.產(chǎn)生中性金屬蛋白酶變體的方法，包括用包含編碼所述中性金屬蛋白酶變體的 核酸的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細胞；在適于產(chǎn)生所述中性金屬蛋白酶變 體的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞；和產(chǎn)生所述中性金屬蛋白酶變體。
28.權(quán)利要求27的方法，還包括收獲所述產(chǎn)生的中性金屬蛋白酶變體的步驟。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述的宿主細胞是芽孢桿菌屬物種。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白酶可用于清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應(yīng)用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶為經(jīng)改造的以對檸檬酸鹽誘導的自溶具有抗性。
文檔編號C12N9/54GK101842481SQ200880114393
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者A·劉, A·肖, L·華萊士, R·W·J·奧姆斯 申請人:丹尼斯科美國公司