專利名稱：非侵入性自動(dòng)細(xì)胞增殖裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞增殖裝置，及一種以非 侵入、持續(xù)的方式培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的貼壁依賴性細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)具有的固有局限性，限制了在包括細(xì)胞、 組織及基因工程等許多領(lǐng)域的發(fā)展。貼壁依賴性細(xì)胞習(xí)慣上是在平面二維(2D)聚苯乙烯 培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)。一旦形成單層細(xì)胞，通過蛋白水解酶的消化作用或機(jī)械方法，將細(xì)胞從 培養(yǎng)皿表面移除。當(dāng)需要大量的細(xì)胞時(shí)，如在組織和基因工程中，需要重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞分裂、 種植、細(xì)胞生長直至鋪滿并且隨后使細(xì)胞從該聚苯乙烯培養(yǎng)皿移除，以獲得期望數(shù)量的細(xì) 胞。傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)方法累贅、耗時(shí)久且勞動(dòng)密集，增大了在每次收獲或培養(yǎng)分裂時(shí)細(xì) 胞培養(yǎng)污染的風(fēng)險(xiǎn)。二維(2D)培養(yǎng)物往往不模擬體內(nèi)組織及所謂的3D培養(yǎng)物，特別是關(guān)于細(xì)胞形狀 和細(xì)胞的環(huán)境。對于體外細(xì)胞培養(yǎng)，理想的細(xì)胞支架應(yīng)該呈現(xiàn)類似于生理學(xué)上的細(xì)胞外基 質(zhì)(ECM)的三維(3D)形態(tài)。由于改善了細(xì)胞間相互作用及營養(yǎng)、氧氣和廢物交換、提高了 細(xì)胞生存能力和功能，該三維系統(tǒng)與體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境非常的近似。已發(fā)現(xiàn)，用作用力太強(qiáng)的酶促法或機(jī)械分離法去釋放2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)物中的粘 連細(xì)胞，不利于細(xì)胞的形態(tài)和功能。已發(fā)現(xiàn)，酶消化作用，典型地為使用胰蛋白酶，會(huì)破壞 所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，產(chǎn)生解聚的且成為圓形的細(xì)胞。此外，細(xì)胞膜上的細(xì)胞 間連接蛋白及受體蛋白質(zhì)經(jīng)常會(huì)受到破壞。機(jī)械釋放法所產(chǎn)生的細(xì)胞被具有缺乏抵抗力 (compromised)的細(xì)胞外基質(zhì)的晶狀間質(zhì)所包圍。已知對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活 性和功能降低，危害細(xì)胞的生長和分化。本發(fā)明目的在于解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種用于自動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖裝置，所述增殖 裝置包括在其中包含刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架的生物反應(yīng)器。所述刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架可以可逆地將其表面性質(zhì)在親水狀態(tài)和疏水 狀態(tài)之間改變。所述支架材料可由一種基質(zhì)制成，所述基質(zhì)選自纖維、半滲透或非滲透中空纖維、 水凝膠、顆粒和由聚合物或陶瓷制成的單片多孔支架中的一種或多種。該支架可包括半滲 透中空纖維基質(zhì)。所述支架可選自聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺、天然聚合物(如膠原、 透明質(zhì)酸等等)及其他任何適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料中任一成份。所述支架可通過枝接(如化學(xué)修飾)用熱-反應(yīng)聚合物表面層修飾。所述枝接技術(shù)可選自下列任一項(xiàng)或多項(xiàng)溶液自由基聚合(solutionfreeradical polymerization)；伽瑪輻射；等離子體輻射；電子束輻射；及紫外輻射。所述支架可通過吸附或物理附著技術(shù)用熱_反應(yīng)聚合物表面層修飾。所述熱_反 應(yīng)聚合物可選自聚N-取代的丙烯酰胺、聚乙烯_氧化物及其各自的共聚物或其類似物中的 任一項(xiàng)或多項(xiàng)。所述熱-反應(yīng)聚合物可以是聚-N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)。所述PNIPAm鏈可 配置在支架上，其層厚度為0. Inm至100 μ m。更具體地，所述PNIPAm鏈可配置在支架上，其 層厚度為0. Inm至lOOnm。所述細(xì)胞增殖裝置可包括用于存儲(chǔ)所述生物反應(yīng)器上游的細(xì)胞培養(yǎng)基的儲(chǔ)蓄槽， 所述儲(chǔ)蓄槽與所述生物反應(yīng)器流體流動(dòng)聯(lián)系(fluid flowcommunication)。所述細(xì)胞增殖裝置可包括排代設(shè)備，用于將細(xì)胞培養(yǎng)基從所述儲(chǔ)蓄槽轉(zhuǎn)移到所述 生物反應(yīng)器。所述排代設(shè)備可為正排量泵。所述細(xì)胞增殖裝置可包括一個(gè)或多個(gè)溫度傳感器，用于監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基、生物反 應(yīng)器及支架中任一個(gè)或多個(gè)的溫度。所述細(xì)胞增殖裝置可包括一個(gè)或多個(gè)氧合器，用于氧合所述生物反應(yīng)器中所包括 的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞中的任一項(xiàng)。所述細(xì)胞增殖裝置可包括組合的溫度/氧合器單元。所述細(xì)胞增殖裝置可包括可編程序邏輯控制器(PLC)，用于所述系統(tǒng)操作程序的 自動(dòng)化。所述細(xì)胞增殖裝置可包括細(xì)胞回收單元，其與所述生物反應(yīng)器流動(dòng)聯(lián)系，并且其 是所述生物反應(yīng)器的下游，用于分離從細(xì)胞培養(yǎng)基釋放的細(xì)胞。所述細(xì)胞回收單元可為離 心機(jī)，用于分離從細(xì)胞培養(yǎng)基釋放的細(xì)胞。所述細(xì)胞回收單元的出口可與細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)蓄槽通過流體流動(dòng)聯(lián)系，以便所述細(xì) 胞培養(yǎng)基的再利用。所收獲和分離的細(xì)胞可截留到(entrap)細(xì)胞存儲(chǔ)槽中備用或者低溫 冷凍待用。該細(xì)胞增殖裝置可包括，在所述生物反應(yīng)器的一側(cè)或兩側(cè)上有至少一個(gè)注入/提 取口，以便于在操作該裝置的過程中添加生物化學(xué)品/化學(xué)品及進(jìn)行取樣。其目的可為添 加化學(xué)品調(diào)節(jié)或改變細(xì)胞習(xí)性和/或功能和/或生存能力，監(jiān)控細(xì)胞功能和/或生存能力， 或者確定這些化學(xué)品對細(xì)胞功能和/或生存能力的作用。在一個(gè)具體方式方式中，可使用溶液自由基聚合的枝接技術(shù)制備支架，可通過使 用氧化還原劑(如Fe2YH2O2)、過硫酸鹽及熱引發(fā)劑(如偶氮化合物、過氧化物、氫過氧化 物、過氧化氫二磷酸鹽等等)中的任一種實(shí)現(xiàn)所述溶液自由基聚合。當(dāng)該枝接技術(shù)依靠輻射或光誘導(dǎo)時(shí)，同時(shí)或預(yù)照射法都可使用，在前者中，該 NIPAm和該支架同時(shí)在溶液中被照射，而對于后者，該支架在NIPAm溶液中先被預(yù)照射，然 后被活化(通過加熱或化學(xué)引發(fā))。在溶液自由基聚合過程中，可用多價(jià)陽離子，如Cu2+或Fe2+，還原該均聚物。優(yōu)選 地，可用硫酸亞鐵銨，也稱為莫爾鹽，還原該均聚物。為了提高支架的反應(yīng)性，可在枝接前或枝接過程中，使用選自下列任一種 或多種的離子化技術(shù)輻射技術(shù)如伽瑪輻射、等離子體輻射及電子束輻射；光化學(xué)技 術(shù)如紫外照射；臭氧化作用，化學(xué)法如使用含多價(jià)離子的過硫酸鹽溶液，氧氟化作用
6(oxyfluorination)等等，將官能基浸漬/共價(jià)鍵結(jié)合到支架上。在某些實(shí)施方式中，該多 價(jià)離子可為鎳(II)或鈰(IV)。物理改性技術(shù)可包括使用溶脹/退脹(swelling/deswelling)法或吸附技術(shù)，將 PNIPAm鏈物理截留到該支架表面上。在使用中空纖維膜生物反應(yīng)器的特定情況中，氧合作用可直接在該生物反應(yīng)器中 發(fā)生，并且可經(jīng)由中空纖維的內(nèi)腔或外毛細(xì)管空間(extracapillary space,ECS)發(fā)生溫度 控制。然后，該溫度釋放機(jī)制在細(xì)胞沿纖維附著的點(diǎn)處直接發(fā)生，而細(xì)胞培養(yǎng)基溫度不會(huì)發(fā) 生劇烈的變化，這些在無紡布支架或其他支架情況下是必須的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還可 以想到其他可以達(dá)到同樣效果的設(shè)計(jì)，比如通過對該生物反應(yīng)器支架表面進(jìn)行內(nèi)部溫度控 制，如利用中空支架內(nèi)的液體循環(huán)，在生物反應(yīng)器的外部進(jìn)行氧合。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種非侵入的持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括 以下步驟提供在其中包括刺激_反應(yīng)三維(3D)支架的生物反應(yīng)器；接種細(xì)胞到所述支架上；提供適宜來源的細(xì)胞培養(yǎng)基；使細(xì)胞在適宜細(xì)胞附著和增殖的溫度增殖，直到達(dá)到期望的細(xì)胞密度；及通過將該刺激_反應(yīng)支架的表面性質(zhì)從疏水狀態(tài)改變?yōu)橛H水狀態(tài)，收獲所述細(xì) 胞，從而釋放所附著的細(xì)胞。細(xì)胞類型的例子可包括哺乳動(dòng)物初生細(xì)胞、微生物細(xì)胞、干細(xì)胞、無限增殖化細(xì)胞
系等等。該方法可包括，根據(jù)預(yù)設(shè)程序，使用控制系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)控所述系統(tǒng)參數(shù)，用于細(xì)胞的 增殖和收獲。可通過對選自溫度、pH、流速、壓力降及耗氧量等等中的一種或多種參數(shù)的實(shí)時(shí)測 量，調(diào)控所述控制系統(tǒng)。所述系統(tǒng)的輸入?yún)?shù)可包括特定基材(substrate)的代謝活動(dòng)、耗 氧量、PH、壓力降及溫度?？删幊绦蜻壿嬁刂?PLC)系統(tǒng)用于自動(dòng)化該系統(tǒng)的操作程序。使細(xì)胞充分增殖以填充所述生物反應(yīng)器支架的期望區(qū)域或達(dá)到期望密度(取決 于耗氧量、新陳代謝活動(dòng)、壓力降或其他)，所述方法包括降低或升高所述系統(tǒng)溫度的步驟， 以影響支架表面疏水性的可逆變化，然后使細(xì)胞從所述支架上分離。該方法還包括通過例如離心分離或其他任何適宜的細(xì)胞分離/回收方法分離該 培養(yǎng)基和細(xì)胞混合物的步驟。多余的培養(yǎng)基可被反向循環(huán)到培養(yǎng)基儲(chǔ)蓄槽用于細(xì)胞培養(yǎng)基的再利用。收獲細(xì)胞可包括，降低通過中空纖維支架的內(nèi)腔的氧氣的溫度，以致所述支架的 表面溫度降至溫度為或低于該熱_反應(yīng)材料的最低臨界溶解溫度(LCST)(例如就PNIPAm 而言，LCST為32°C )，以影響細(xì)胞釋放。因此該方法使得細(xì)胞被從該生物反應(yīng)器或支架的 某些部分選擇性地釋放。因此，通過從某些部分選擇性釋放細(xì)胞并且隨后接種不同細(xì)胞類 型，就可能在同一生物反應(yīng)器中同時(shí)培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞。該方法包括氧合所述細(xì)胞?？山?jīng)由所述中空纖維基質(zhì)的內(nèi)腔或外毛細(xì)管空間氧合 所述細(xì)胞。因此可以建立所述具有可通過溫度變化可分別定位的(addressable)支架部分的系統(tǒng)，也可用于在進(jìn)行如DNA/RNA提取的過程中，從生物反應(yīng)器提取少量的細(xì)胞，以提供 有關(guān)該生物反應(yīng)器中的細(xì)胞狀態(tài)的有價(jià)值信息。這樣就能夠在3D環(huán)境里的細(xì)胞培養(yǎng)過程 中進(jìn)行DNA/RNA監(jiān)控，據(jù)我們所知在本發(fā)明之前是不可能實(shí)現(xiàn)的。此能力對于將該系統(tǒng)應(yīng) 用于諸如藥物篩選的應(yīng)用的情況是特別有益的，因?yàn)檫@種情況下常常需要知道體外給藥期 間不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)，而常規(guī)的DNA/RNA提取技術(shù)要求終止實(shí)驗(yàn)并破壞所有細(xì)胞，因 而通常是不可能實(shí)現(xiàn)的。支架中可定位的部分還使得半連續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)物能夠通過循環(huán)釋放經(jīng)過該可定位 的部分，而有充足時(shí)間用于該部分的種群恢復(fù)(!^population)。收獲細(xì)胞可包括逐漸降低進(jìn)料培養(yǎng)基的溫度?？赏ㄟ^中空纖維基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞的氧合作用，使氧氣在中空纖維中流動(dòng)以通過該纖 維擴(kuò)散到培養(yǎng)基中。這使得有充足供應(yīng)的氧氣能夠到達(dá)細(xì)胞，以確保充分的細(xì)胞增殖。中空 纖維表面溫度控制和細(xì)胞氧合作用可以經(jīng)由該中空纖維的內(nèi)腔或外毛細(xì)管空間同時(shí)完成。 可通過使用合成氧載體，例如全氟化碳乳劑或非合成血紅蛋白基氧載體，加強(qiáng)氧氣輸送。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以設(shè)想到該系統(tǒng)的其他應(yīng)用。例如，該裝置還可用于固著 懸浮細(xì)胞的獨(dú)立細(xì)胞增殖，籍此細(xì)胞可以由于該支架孔徑(例如就中空纖維而言)而截留 到基材中，或者當(dāng)該SRP處于擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)(例如就無紡布和膠而言)，所分泌的蛋白質(zhì)優(yōu)先吸 附到該SRP包被的基材上。因此，本發(fā)明可以根據(jù)所述LCST或者所用SRP的其他相關(guān)反應(yīng) 性能提供選擇性蛋白質(zhì)吸附，保留疏水蛋白質(zhì)或親水蛋白質(zhì)。同樣地，可使用當(dāng)前的系統(tǒng)作 為組合的細(xì)胞增殖器和選擇性蛋白質(zhì)純化裝置也因此是顯而易見的。對于PH敏感的SRP 也可用于截留細(xì)胞和蛋白質(zhì)到這樣的基材中，因此也具有細(xì)胞增殖器和蛋白質(zhì)純化裝置的 功能。參照附圖，以不為實(shí)施例所限制的方式記載本發(fā)明的其他特征。


圖1顯示了 a)純PP，b)PP-g_PNIPAm(使用如實(shí)施例1所記載的10wt% NIPAm)及 c)純PNIPAm的ATR-FTIR光譜。在該枝接基質(zhì)的表面上可檢測到N-H存在于3294CHT1和 1536cm-1 ；以及 C = O 存在于 1643cm-1 ；圖2顯示了 a)純PP無紡布支架，及b)根據(jù)實(shí)施例1的枝接有IOwt % NIPAm的 PP-g-PNIPAm無紡布支架的SEM圖，顯示存在枝接層；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞增殖裝置的示意圖；圖4顯示了當(dāng)溫度從37°C變化為4°C后，從PNIPAm中空纖維支架釋放的細(xì)胞的 圖。圖5顯示了在細(xì)胞接種前，浸在細(xì)胞培養(yǎng)基中的PP-g-PNIPAm無紡布支架的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種非侵入性自動(dòng)細(xì)胞增殖器。該裝置包括一刺激_反應(yīng)三維基材/ 支架，由此通過改變或者添加一種或多種刺激物，使增殖的細(xì)胞同時(shí)從系統(tǒng)釋放。該系統(tǒng)以 一種易于重復(fù)和輕松的方式應(yīng)用于細(xì)胞和組織工程學(xué)，由此使得細(xì)胞培養(yǎng)效果得以擴(kuò)大規(guī) 模到可產(chǎn)生大量有活力的、類似體內(nèi)的3D細(xì)胞培養(yǎng)物(或者類組織結(jié)構(gòu))。這種裝置還可用于基因工程中蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)分析。聚-N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)是一種聚合物，當(dāng)溫度跨越約為32°C的最低臨界 溶解溫度(LCST)時(shí)，該聚合物可在疏水狀態(tài)和親水狀態(tài)之間可逆地轉(zhuǎn)變。這樣，當(dāng)在37°C 該P(yáng)NIPAm表面為疏水狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞可以附著到其表面上，而在低于LCST時(shí)，細(xì)胞自發(fā)地從 親水表面釋放。已知，使用PNIPAm進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)勢是，細(xì)胞可以被非侵入性地收獲，而 具有臨界細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、生長因子受體及細(xì)胞間連接蛋白質(zhì)的完整的細(xì)胞層片仍然保持完整。實(shí)施例1-使用PP無紡布的溶液自由基枝接法將聚丙烯(PP)纖維針刺和熱熔(145°C，1.5m/s)到密度為130g/m2、開孔率為 (40%孔< 100 μ m，40%孔為100-200 μ m，及20%孔> 200 μ m)的無紡布?jí)|中。在乙醇中洗 無紡布?jí)|(6CmX6CmX3.21Cm)l小時(shí)，水洗，之后用烘箱50°C干燥。然后將無紡布支架放 置到10wt%的過硫酸銨(APS)水溶液中，并且室溫條件放置24小時(shí)。用氮?dú)馇鍧嵢苊浀?支架30分鐘后，放置到用氮?dú)忸A(yù)起泡30分鐘的10wt% NIPAm水溶液中。在一個(gè)密封容器 中70°C進(jìn)行枝接24小時(shí)。然后將枝接后的纖維支架在冷的去離子水中洗滌3天。通過用 190-400nm的UV-VIS光譜監(jiān)測水洗滌物和觀察45°C時(shí)洗滌物的混濁度，查證枝接后的墊的 純度，最后在烘箱50°C干燥。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(參見實(shí)施例7)前，將該枝接后的無紡布在 120°C條件下高壓滅菌15分鐘。用傅立葉變換衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)掃描和 掃描電子顯微鏡法(SEM)確認(rèn)枝接。實(shí)施例2 使用PP無紡布的溶液自由基枝接法2為提高枝接產(chǎn)量，可重復(fù)實(shí)施例1，在枝接前，在該NIPAm溶液中加入0. 25襯％的 硫酸亞鐵(II)銨六水合物(莫爾鹽)。實(shí)施例3 用方法3進(jìn)行溶液自由基枝接如上所述，洗滌PP無紡布(6cmX6cmX3. 21cm)。將支架放入IOwt %的APS水溶 液中并且在80°C條件下加熱3小時(shí)，之后在去離子水中徹底洗滌。然后將處理后的支架放 置到由氮?dú)忸A(yù)起泡30分鐘的、含有0. 002M硝酸鋪(IV)銨和0. 04M硝酸的、10wt% NIPAm 水溶液中。在烘箱中50°C枝接24小時(shí)。然后如前所述，將枝接后的支架洗滌3天并干燥。 通過ATR-FTIR確認(rèn)枝接。實(shí)施例4 使用PP中空纖維盒(cartridge)的溶液自由基枝接用IOwt % APS水溶液填充CelImax PP中空纖維盒(孔徑:0· 5μπι，外徑:630ym), 室溫放置24小時(shí)。然后排放該APS溶液，換用由氮?dú)忸A(yù)起泡30分鐘的10wt% NIPAm水溶 液。然后將該盒放入70°C水浴5小時(shí)。通過蠕動(dòng)泵，使用冷的去離子水灌注該枝接后的中 空纖維2天。通過用190-400nm的UV-VIS光譜監(jiān)測水洗滌物和檢查45°C時(shí)洗滌物的混濁 度，查證枝接后的盒的純度。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(參見實(shí)施例6)前，將該枝接后的盒在120°C 條件下高壓滅菌15分鐘。實(shí)施例5圖3記載了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞增殖裝置10的部件。而且記載了細(xì)胞增殖裝置10 的操作。通過容積式泵14將液槽(reservoir) 12中的緩沖后的細(xì)胞培養(yǎng)基輸送到溫度和 /或氧合器單元16，該溫度和/或氧合器單元16用于控制溫度和/或氧合該接種了細(xì)胞的生物反應(yīng)器18中所含的細(xì)胞。該生物反應(yīng)器包括一刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架。該生物反應(yīng)器18中的溫度_反應(yīng)基材被溫度變化所激發(fā)，從而釋放附著在支架上 的細(xì)胞。然后這些細(xì)胞由細(xì)胞分離器20回收并貯存在存儲(chǔ)設(shè)備22中。在細(xì)胞生長過程中，來自液槽的含有培養(yǎng)基的細(xì)胞經(jīng)過2個(gè)三路閥24和26，回到 該液槽12。在中空纖維膜生物反應(yīng)器16的特定具體實(shí)施方式
中，在準(zhǔn)確地控制培養(yǎng)基的溫 度以維持細(xì)胞生長時(shí)，氧合作用可在生物反應(yīng)器中直接發(fā)生。然后經(jīng)由中空纖維的內(nèi)腔進(jìn) 行氧合作用。在此實(shí)施方式中，該溫度釋放機(jī)制直接在沿著纖維的細(xì)胞隨著點(diǎn)處啟動(dòng)，沒有 顯著改變細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度，這在無紡布基材的實(shí)施方式中是必要的。本領(lǐng)域技術(shù)普通人員可知，該細(xì)胞增殖裝置10的不同配置和部件可產(chǎn)生相似的 結(jié)果，因此本發(fā)明不僅限于上述實(shí)施例。實(shí)施例6 在Cellmax PP-g-PNIPAm中空纖維生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Ifep3G細(xì)胞實(shí)施例4描述了用MPAm枝接中空纖維支架/盒的技術(shù)方案。在枝接后的盒的內(nèi) 腔培養(yǎng)ifep3B肝細(xì)胞。該細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10 % FBS和1 % Pen/Strep抗生素的EMEM (有 L-谷氨酰胺)組成。在細(xì)胞接種前，將用PNIPAm枝接的聚丙烯盒用培養(yǎng)基在恒溫箱中37°C 預(yù)培養(yǎng)一天。然后在恒溫箱中、在37°C及5% CO2,20% O2和75% N2條件下，將細(xì)胞接種在 內(nèi)腔中，細(xì)胞密度為2X106。使細(xì)胞靜態(tài)附著1小時(shí)，通過旋轉(zhuǎn)30分鐘擴(kuò)散細(xì)胞在整個(gè)纖 維上的附著。通過外毛細(xì)管空間連續(xù)灌注培養(yǎng)基，并且在2天的培養(yǎng)期內(nèi)一天換一次培養(yǎng) 基。對于第二天的細(xì)胞釋放，當(dāng)預(yù)熱到37°C的培養(yǎng)基穿過內(nèi)腔時(shí)，溫度約為4°C的培養(yǎng)基經(jīng) 由ECS灌注30分鐘。然后收集所有釋放的細(xì)胞到一單獨(dú)的液槽中，用于進(jìn)一步分析。圖4所示為釋放的細(xì)胞的形態(tài)特征?？梢钥吹结尫懦鰜碓S多顆粒和細(xì)胞片。還可 以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將所回收的細(xì)胞保持在最佳溫度37°C時(shí)，間接溫度釋放法使得細(xì)胞有效釋放。實(shí)施例7-在PP-g-PNIPAm無紡布支架上培養(yǎng)Ifep3G細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例1，將直徑為4cm的PNIPAm枝接后的聚丙烯(PP)的無紡布進(jìn)行枝接和 滅菌。在細(xì)胞接種前，在與實(shí)施例7類似的條件下用培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)該枝接后的盤1天。然 后進(jìn)行細(xì)胞接種，接種3X IO5細(xì)胞/ml到無紡布盤的一個(gè)小區(qū)域上。逐滴加入細(xì)胞，使之 附著1小時(shí)。恒溫箱中37°C靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞2天，1天換一次培養(yǎng)基。為了啟動(dòng)細(xì)胞釋放，將 培養(yǎng)基換為冷培養(yǎng)基(4°C)并且隨后收集所釋放的細(xì)胞，用于進(jìn)一步分析?？捎^察到出現(xiàn) 許多顆粒和細(xì)胞片。該實(shí)施例闡明了通過引起培養(yǎng)基溫度變化而從無紡布支架釋放細(xì)胞的 機(jī)理。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為其所發(fā)明的一種自動(dòng)化細(xì)胞增殖裝置和方法，相對于傳統(tǒng)的 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有很多優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括本發(fā)明提供了一種有益的、具有熱_反應(yīng)支架 以用于高生產(chǎn)能力的細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化細(xì)胞增殖裝置，使用者不需使用任何侵入性技術(shù)。 因此本發(fā)明的裝置適用于高生產(chǎn)能力的細(xì)胞培養(yǎng)并且降低了傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)所要求的 時(shí)間損耗。本發(fā)明還可以顯著降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。同樣地，本裝置具有3D熱-反應(yīng)支架，可能 夠無需使用酶如胰蛋白酶或其他積極的細(xì)胞移除方法而釋放細(xì)胞。該裝置具有3D熱-反 應(yīng)支架可能制備的細(xì)胞培養(yǎng)物，與單層培養(yǎng)物相比，能夠更好地保持的細(xì)胞分化和功能。此 外，該裝置提供一種溫和的細(xì)胞釋放觸發(fā)器，使得細(xì)胞不會(huì)經(jīng)受細(xì)胞培養(yǎng)基中強(qiáng)烈的溫度 變化。
此外，在某些具體實(shí)施方式
中，考慮到在制作該裝置過程中會(huì)采用生物化學(xué)品或 化學(xué)品及進(jìn)行取樣，該非侵入性細(xì)胞增殖裝置便利地在生物反應(yīng)器的一邊或兩邊上提供了 注入/提取口。其目的可是用化學(xué)品調(diào)整或改變細(xì)胞的習(xí)性和/或功能和/或生存能力， 監(jiān)控細(xì)胞的功能和/或生存能力，或確定這些化學(xué)品對細(xì)胞的功能和/或生存能力的作用 效果。為了完成生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括該生物反應(yīng)器外殼、細(xì)胞支架、管道、液槽等等，可 由可消毒的塑料成分制成。此外，本發(fā)明的裝置是一種緊湊的、模塊化的、便于使用的、低成 本的用于細(xì)胞增殖和收獲的裝置。
1權(quán)利要求
一種用于自動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖裝置，所述增殖裝置包括生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器包含刺激 反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞 支架將其表面性質(zhì)在親水狀態(tài)和疏水狀態(tài)之間進(jìn)行可逆的改變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述支架材料可由一種基質(zhì) 制成，所述基質(zhì)選自纖維、半滲透或非滲透中空纖維、水凝膠、顆粒和由聚合物或陶瓷制成 的單片多孔支架中的任一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述支架包括半滲 透中空纖維基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述支架選自聚苯 乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺及天然聚合物中任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述支架通過枝接 用熱_反應(yīng)聚合物的表面層修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述枝接技術(shù)選自下列任一項(xiàng) 或多項(xiàng)溶液自由基聚合；伽瑪輻射；等離子體輻射；電子束輻射；及紫外輻射。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述支架通過物理 吸附或附著技術(shù)用熱_反應(yīng)聚合物的表面層修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述熱-反應(yīng)聚合物 選自聚N-取代的丙烯酰胺、聚乙烯-氧化物及其各自的共聚物中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述熱_反應(yīng)聚合物是 聚-N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述PNIPAm鏈配置在支架上， 其層厚度為0. Inm至100 μ m。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述PNIPAm鏈配置在支架上， 其層厚度為0. Inm至lOOnm。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括用于存儲(chǔ)所 述生物反應(yīng)器上游的細(xì)胞培養(yǎng)基的儲(chǔ)蓄槽，所述儲(chǔ)蓄槽與所述生物反應(yīng)器通過流體流動(dòng)聯(lián) 系。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括排代設(shè)備，用 于將細(xì)胞培養(yǎng)基從所述儲(chǔ)蓄槽轉(zhuǎn)移到所述生物反應(yīng)器。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述排代設(shè)備為正排量泵。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括一個(gè)或多個(gè) 溫度傳感器，用于監(jiān)測所述細(xì)胞培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器及支架中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的溫度。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括一個(gè)或多個(gè) 氧合器，用于氧合所述生物反應(yīng)器中所含有的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括組合的溫度/ 氧合器單元。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括可編程序邏 輯控制器(PLC)，用于所述系統(tǒng)操作程序的自動(dòng)化。
20.根據(jù)權(quán)利要求12-19中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，包括細(xì)胞回收單 元，其與所述生物反應(yīng)器流動(dòng)聯(lián)系，并且其是所述生物反應(yīng)器的下游，用于分離從細(xì)胞培養(yǎng) 基釋放的細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述細(xì)胞回收單元的出口與 細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)蓄槽通過流體流動(dòng)相聯(lián)，以便所述細(xì)胞培養(yǎng)基的再利用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，所述生物反應(yīng)器 的一邊或兩邊上包括至少一個(gè)注入/提取口，以便于在操作所述裝置過程中添加生物化學(xué) 品或化學(xué)品及進(jìn)行取樣。
23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，使用溶液自由基聚合的枝接技 術(shù)，所述溶液自由基聚合是通過使用氧化還原劑、過硫酸鹽及熱引發(fā)劑中任一種完成的。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，使用多價(jià)陽離子還原形成均 聚物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞增殖裝置，其特征在于，使用硫酸亞鐵銨還原形成均 聚物。
26.一種非侵入的持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟提供在其中包括刺激-反應(yīng)三維(3D)支架的生物反應(yīng)器；接種細(xì)胞到所述支架上；提供適宜來源的細(xì)胞培養(yǎng)基；使細(xì)胞在適宜細(xì)胞附著和增殖的溫度增殖，直到達(dá)到期望的細(xì)胞密度；及通過將所述刺激_反應(yīng)支架的表面性質(zhì)從疏水狀態(tài)改變?yōu)橛H水狀態(tài)，收獲所述細(xì)胞， 從而釋放所附著的細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，根據(jù)預(yù)設(shè)程序，控制系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)控所述 系統(tǒng)參數(shù)，用于細(xì)胞增殖和收獲。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，通過選自溫度、pH、流速、壓力降及耗氧 量中的一種或多種參數(shù)的實(shí)時(shí)測量，調(diào)控所述控制系統(tǒng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，包括所述控制系統(tǒng)的輸入?yún)?shù)，其選自 特定基材的代謝活動(dòng)、耗氧量、PH、壓力降及溫度中的任一種或多種。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，使細(xì)胞充分增殖以填充所述生物反應(yīng) 器支架的期望區(qū)域或達(dá)到期望密度，所述方法包括降低或升高所述系統(tǒng)溫度的步驟，以影 響支架表面疏水性的可逆變化，然后使細(xì)胞從所述支架上分離。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞被從所述生物反應(yīng)器或支架 的某些部分選擇性地釋放。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，還包括將所述培養(yǎng)基與細(xì)胞混合物分 離的步驟。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述多余的培養(yǎng)基被反向循環(huán)到培養(yǎng) 基儲(chǔ)蓄槽用于細(xì)胞培養(yǎng)基的再利用。
34.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，收獲所述細(xì)胞包括降低通過中空纖維 支架的內(nèi)腔的氧氣溫度，以致所述支架溫度降至溫度為或低于最低臨界溶解溫度(LCST) 從而影響細(xì)胞釋放。
35.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，收獲細(xì)胞包括逐漸將進(jìn)料培養(yǎng)基的溫 度降低至低于最低臨界溶解溫度。
36.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，包括氧合所述細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，經(jīng)由所述中空纖維基質(zhì)的內(nèi)腔或外毛 細(xì)管空間氧合所述細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞增殖裝置，如于此所充分記載和表明的。
39.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，如于此所充分記載和表明的。
40.一種細(xì)胞增殖裝置及一種新的方法，如于此所充分記載的。
全文摘要
一種用于自動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖裝置，所述增殖裝置包括在其中包含刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架的生物反應(yīng)器，所述刺激-反應(yīng)三維(3D)細(xì)胞支架可被可逆地操作以將其表面性質(zhì)在親水狀態(tài)和疏水狀態(tài)之間改變。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101960004SQ200880115050
公開日2011年1月26日 申請日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日
發(fā)明者弗朗西斯·肖恩·穆爾曼, 科舍·奈度, 艾德蘭·雅各布斯·凡威克 申請人:Csir