專(zhuān)利名稱(chēng)：使用細(xì)菌生產(chǎn)生物能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物能的組合物和方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及使用奇球菌屬 (Deinococcus)和/或相關(guān)屬的細(xì)菌進(jìn)行生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的修飾，以生產(chǎn)生物能產(chǎn) 物和代謝物。
背景技術(shù)：
使用微生物進(jìn)行生物質(zhì)、主要是植物生物質(zhì)的修飾，以生產(chǎn)生物能產(chǎn)物例如乙醇， 已為人所知。當(dāng)前的工業(yè)方法只允許在30°C附近的溫度下培養(yǎng)和生長(zhǎng)微生物，以發(fā)酵和提取乙 醇，這是由于使用的工業(yè)微生物(酵母)的脆弱性。它們還必須承擔(dān)發(fā)酵后濃縮乙醇的主 要生物能成本，因?yàn)槟壳坝糜谶@種發(fā)酵的酵母不能忍受高于I00g/1的濃度。此外，這些酵 母的發(fā)酵在實(shí)踐中只能利用葡萄糖類(lèi)型的C6糖類(lèi)。處理生物材料、尤其是細(xì)菌菌株，以賦予其改進(jìn)的性質(zhì)，這一點(diǎn)也已為人所知。例如，S. Del Cardayre等的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，716，631描述了基于重組和選擇/篩 選的反復(fù)循環(huán)的方法，來(lái)賦予整個(gè)細(xì)胞和整個(gè)生物體以所需性質(zhì)。添加的性質(zhì)是例如對(duì)遺 傳重組的增加的誘發(fā)適應(yīng)力，增加的基因組拷貝數(shù)，增加的表達(dá)和/或分泌蛋白和次級(jí)代 謝物的能力。通過(guò)采用分子遺傳學(xué)手段，作者提出了適當(dāng)修飾細(xì)胞和生物體的基因組，以賦予 其新的、改進(jìn)的性質(zhì)的技術(shù)。在US 6，716，631中描述的方法使用了不同細(xì)胞的群體，將這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通 過(guò)原生質(zhì)體融合形成了雜交細(xì)胞，然后篩選或選擇朝向獲得所需性質(zhì)演化的細(xì)胞，并重復(fù) 這些步驟，直到獲得至少一個(gè)具有所需修飾的細(xì)胞。這種方法被提出作為基于菌種改良程 序的已知方法的有優(yōu)勢(shì)的替代方案。進(jìn)行所述融合的原生質(zhì)體可以源自于原核生物體。在該美國(guó)專(zhuān)利中設(shè)想的應(yīng)用之一是例如乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，提出使用所述重組方 法，通過(guò)所使用的微生物的DNA改組(shuffling)來(lái)改進(jìn)其產(chǎn)率和成本。例如，提到了已知 能夠催化兩相反應(yīng)的紅球菌(Rhodococcus)的同源重組。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No. W001/023526描述了對(duì)輻射具有抗性并能夠執(zhí)行生物治理的細(xì) 菌，特別是奇球菌(尤其是耐輻射奇球菌(D. radiodurans)和D. geothermalis)的生產(chǎn)和 使用，它們被修飾以便更有效地代謝、降解或脫毒無(wú)機(jī)和有機(jī)污染物，例如放射性核素、重 金屬和有機(jī)溶劑。推薦應(yīng)該對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行操作，以表達(dá)能夠脫毒所述元素的異源酶。細(xì) 菌菌株可以被操作，以便將由不同基因編碼的各種不同功能組合在單一宿主中。I. Narumi等在2003年9月18日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 2003/0175977中，描述 了源自于一株D. radiopugnans的內(nèi)源質(zhì)粒pUE30，它可以用作能夠在奇球菌屬的細(xì)菌中自 主復(fù)制的載體，它還可用于構(gòu)建也含有能夠在大腸桿菌(E. coli)及其衍生株中自主復(fù)制、 并能夠在奇球菌屬和大腸桿菌二者的細(xì)菌中都能復(fù)制的質(zhì)粒的穿梭載體。C. B. Fliermans的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，160, 715描述了用于測(cè)量體內(nèi)發(fā)生的DNA鏈斷裂的分布和頻率的方法。這些方法包括使用源自于耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的 PprA 蛋白。以K. Satoh等的名義公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 2004/0224320描述了分離和純化的 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(登記號(hào)ATCC BAA-149或其突變株)。該分離株能夠降解多種多樣的有機(jī) 污染物，并適合于在存在電離輻射的情況下對(duì)各種不同的有機(jī)污染物進(jìn)行生物治理。此外，最近關(guān)于使用微生物菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的專(zhuān)著，在美國(guó)能源部(United States Department of Energy)禾口國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory)的資助下，由 J. R. Hettenhaus 以《乙醇發(fā)酵菌株》(Ethanol Fermentation Strains)的題目出版(1998年12月16日)。在該文獻(xiàn)中，總結(jié)了所涉及領(lǐng)域中由參與方 做出的貢獻(xiàn)，其中指出_僅有的可以在現(xiàn)有設(shè)備中使用的微生物菌株應(yīng)該與已經(jīng)使用的類(lèi)似，即酵母 (Saccharomyces)、發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)禾口大腸桿菌(E. coli)；-在短時(shí)期內(nèi)，增加木糖和阿拉伯糖的發(fā)酵可以作為靶目標(biāo)，但是特別指出增加其 他己糖或寡聚體類(lèi)型的糖類(lèi)的轉(zhuǎn)化效能沒(méi)有多少利益；_長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)說(shuō)，在較高的操作溫度以及酶生產(chǎn)、糖化和水解步驟的組合方面，可能獲
得利益。因此，對(duì)于發(fā)酵生物質(zhì)和獲得乙醇以及任選的其他代謝物的方法，存在著需求，所 述方法能夠在比現(xiàn)有方法明顯更好的操作條件下執(zhí)行，同時(shí)能夠比已知方法更容易中試， 并且能夠產(chǎn)生更廉價(jià)和更容易升級(jí)的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明能夠?yàn)檫@些期望帶來(lái)解決方案，并提供改進(jìn)的方法，通過(guò)生產(chǎn)替代的生物 能產(chǎn)品從生物質(zhì)獲取利益，由于化石來(lái)源能源的顯著減少，這正變得越來(lái)越有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的方法和組合物。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及 使用特定微生物，從生物質(zhì)或其衍生物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。本發(fā)明尤其源自于下述 發(fā)現(xiàn)，即奇球菌屬的微生物具有出人意料的有利性質(zhì)來(lái)修飾或轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生 物，以獲得可用于在工業(yè)規(guī)模上經(jīng)濟(jì)可靠地生產(chǎn)生物能、特別是乙醇的化合物。因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的方法，包括將生物質(zhì)或生物 質(zhì)衍生物接觸天然或修飾的、在由脅追造成破壞時(shí)具有完全或部分地重新裝配其基因組的 能力的細(xì)菌，優(yōu)選為天然或修飾的奇球菌屬細(xì)菌，或其提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物轉(zhuǎn)化成生物能產(chǎn)物或代謝物的 方法，包括在存在奇球菌屬細(xì)菌或在由脅迫造成破壞時(shí)具有完全或部分地重新裝配其基因 組的能力的細(xì)菌，或其提取物的情況下，處理所述生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物。在具體方面，本發(fā)明涉及的方法包括下列步驟a)在好氧和/或厭氧條件下培養(yǎng)和/或生長(zhǎng)所述細(xì)菌，b)使用含有所述細(xì)菌或其提取物的組合物，將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾成 具有工業(yè)重要性的生物能產(chǎn)物或代謝物(例如生物能源例如乙醇，化學(xué)構(gòu)件(chemical building blocks)例如琥珀酸)，以及c)收集從所述生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的修飾產(chǎn)生的至少一種生物能產(chǎn)物或代謝物
本發(fā)明還涉及使用奇球菌屬細(xì)菌或其提取物，從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物生產(chǎn)生物 能產(chǎn)物或代謝物。本發(fā)明還涉及含有奇球菌屬細(xì)菌和生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的組合物。本發(fā)明還涉及使用上述方法生產(chǎn)的生物能產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以使用各種不同的天然或修飾的奇球菌屬菌種來(lái)進(jìn)行，例如 但不限于 Deinococcus geothermalis，耐福身寸奇球菌(Deinococcus radiodurans)， Deinococcus murrayi 或 Deinococcuscellulosilyticus。本發(fā)明顯不，奇球菌屬細(xì)菌可以 有效地促進(jìn)生物燃料例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇、丙二醇，或化學(xué)上重要的有機(jī)酸 及其鹽例如乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸或酯的生產(chǎn)，特別是在上面提到的 醇與酸之間形成的酯的生產(chǎn)。本發(fā)明還出人意料地顯示，奇球菌可以在例如升高的溫度，寬范圍的pH，存在溶 齊U，存在原料底物的條件下操作，適合于從各種不同底物生產(chǎn)大量的生物能產(chǎn)物或代謝物。因此，本發(fā)明提供了以非常有效的方式生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的新方法和組合 物。


圖1 乙醇對(duì)處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Deinococcus geothermalisDSM11301的殺細(xì)菌劑 效應(yīng)在指數(shù)生長(zhǎng)期中，含量高于8. 2%時(shí)，乙醇的殺細(xì)菌劑潛力明顯。圖2 乙醇對(duì)處于靜止期的Deinococcus geothermalis DSM11301的殺細(xì)菌劑效 應(yīng)在靜止期中，含量高于11. 7%時(shí)，乙醇的殺細(xì)菌劑潛力明顯。圖3 丁醇對(duì)處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Deinococcus geothermalisDSM11300的殺細(xì)菌劑 效應(yīng)在指數(shù)期中，含量高于1.5%時(shí)，丁醇的殺細(xì)菌劑潛力明顯。圖4 丁醇對(duì)處于靜止期的Deinococcus geothermalis DSM11300的殺細(xì)菌劑效 應(yīng)在靜止期中，含量高于2%時(shí)，丁醇的殺細(xì)菌劑潛力明顯。圖 5 乙醇對(duì)Deinococcus geothermalis DSM11300 生長(zhǎng)的影響黑色方塊，0% 乙 醇；白色方塊，0.8%乙醇；黑色圓圈，1.2%乙醇；白色圓圈，2.4%乙醇；黑色三角形，3. 1%乙醇。圖 6A :pH 對(duì) D. geothermalis DSM 113000 (DRH05)生長(zhǎng)的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6B :pH 對(duì) D. geothermalis HAMBI 2481 (DRH37)生長(zhǎng)的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6C :pH 對(duì) D. geothermalis HAMBI 2480 (DRH38)生長(zhǎng)的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6D :pH 對(duì) D. geothermalis HAMBI 2411 (DRH39)生長(zhǎng)的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖7 :D. cellulosilyticus在不同液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。細(xì)菌按照實(shí)施例9的材 料與方法中的描述生長(zhǎng)。黑色圓圈，在豐富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；黑色方塊，在含有CM-纖維素的 基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；白色方塊，在缺乏碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及使用奇球菌屬細(xì)菌生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的方法。本發(fā)明確實(shí)顯示 了奇球菌屬細(xì)菌以非常有效的方式，從生物質(zhì)生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。紅在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“奇球菌屬(Deinococcus)的細(xì)菌”包括奇球菌屬的野 生型或天然變異菌株，以及重組菌株，通過(guò)DNA改組技術(shù)或通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)獲得的菌株?！凹?xì)菌的提取物”是指從細(xì)菌獲得的任何級(jí)份，例如細(xì)胞上清液，細(xì)胞碎片，細(xì)胞 壁，DNA提取物，酶或酶制備物，或任何通過(guò)化學(xué)、物理和/或酶法處理從細(xì)菌產(chǎn)生的制備 物，它基本上不含活細(xì)菌。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“生物能”是指源自生物質(zhì)的可再生能源。更具體來(lái)說(shuō)， 術(shù)語(yǔ)“生物能產(chǎn)物”是指“生物燃料”和所有可以用作燃料的生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾的 最終產(chǎn)物，例如乙醇。術(shù)語(yǔ)“代謝物”是指在將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾成生物能產(chǎn)物的 過(guò)程中產(chǎn)生的所有可能的中間分子，包括但不限于幾種工業(yè)上重要的化學(xué)產(chǎn)物，例如有機(jī) 酸和構(gòu)件。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”是指活的和最近死亡的可以用作燃料或用于 工業(yè)生產(chǎn)的生物材料。更通常，生物質(zhì)是指長(zhǎng)成用來(lái)發(fā)電或生產(chǎn)生物燃料的植物物質(zhì)，但是 它也包括用于生產(chǎn)纖維、化學(xué)物質(zhì)或熱量的植物或動(dòng)物物質(zhì)。生物質(zhì)也可以包括可以作為 燃料燃燒的可生物降解廢物。術(shù)語(yǔ)生物質(zhì)不包括已經(jīng)被地質(zhì)過(guò)程轉(zhuǎn)變成諸如煤或石油的物 質(zhì)的有機(jī)材料。工業(yè)生物質(zhì)可以從大量類(lèi)型的植物，包括芒屬植物、柳枝黍、大麻、甜菜、小麥、玉 米、楊樹(shù)、柳樹(shù)、高梁、甘蔗，以及從桉樹(shù)到油棕的各種不同樹(shù)種生長(zhǎng)。本發(fā)明的生物質(zhì)包含原料生物質(zhì)和/或次級(jí)生物質(zhì)。原料生物質(zhì)是來(lái)自生物物質(zhì) 的未加工的材料。例子包括林業(yè)產(chǎn)品，例如不適合用于木材或造紙的成熟樹(shù)木，農(nóng)業(yè)產(chǎn)品， 例如草、作物和動(dòng)物糞肥，以及水生產(chǎn)品，例如藻類(lèi)和海草。次級(jí)生物質(zhì)是任何最初源自于 原料生物質(zhì)，經(jīng)歷了顯著的化學(xué)和物理變化的材料。例子包括紙張、皮革、棉花、麻、天然橡 膠產(chǎn)品、食品加工副產(chǎn)物以及用過(guò)的烹調(diào)油。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)衍生物”是指所有源自于上面定義的原料生物質(zhì)和/ 或次級(jí)生物質(zhì)的分子，特別是任何最初源自于原料生物質(zhì)、已經(jīng)經(jīng)歷了顯著的化學(xué)和物理 變化的物質(zhì)，例如淀粉、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。本文中使用的“中間產(chǎn)物平臺(tái)”是通過(guò)生物質(zhì)衍生物的生理化學(xué)或生物化學(xué)轉(zhuǎn)化 獲得的分子，例如糖類(lèi)、淀粉和生物基合成氣體(合成氣)。詳細(xì)描述本發(fā)明提出了使用奇球菌屬細(xì)菌從生物質(zhì)生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。本發(fā)明確實(shí) 顯示出，奇球菌屬細(xì)菌表現(xiàn)出出人意料的性質(zhì)，該性質(zhì)允許它們?cè)谕ㄟ^(guò)發(fā)酵生物質(zhì)或生物 質(zhì)衍生物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物中進(jìn)行協(xié)作。奇球菌屬細(xì)菌已經(jīng)顯示出當(dāng)由脅迫造成破壞時(shí)，具有全部或部分地重新裝配它們 的基因組的能力(PCT/EP2006/005826Radman-Zahradka)。正如前面提到的，這些細(xì)菌，特別 是耐輻射奇球菌，已被提議用于生物治理。但是，從未公開(kāi)過(guò)或建議過(guò)奇球菌屬細(xì)菌能夠從 生物質(zhì)生產(chǎn)生物能產(chǎn)物和代謝物。此外，從未建議過(guò)具有所需生物學(xué)性質(zhì)的奇球菌屬細(xì)菌可以被分離并培養(yǎng)。現(xiàn)在，本發(fā)明第一次顯示了能夠分離或培養(yǎng)具有至少一種下列性質(zhì)的奇球菌屬細(xì) 菌，并且所述細(xì)菌能夠生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物-它在高溫下(例如大約40-70°C)是活的或有功能的；-它在從大約3到大約9.5，優(yōu)選在大約4到大約8之間的pH范圍內(nèi)是活的或有 功能的；-它在存在毒性劑，特別是有機(jī)溶劑例如乙醇的情況下是活的或有功能的；-它能夠轉(zhuǎn)化C6和C5糖類(lèi)；-它能夠促進(jìn)纖維素消化以產(chǎn)生葡萄糖；-它能夠促進(jìn)半纖維素消化以產(chǎn)生木糖；-它在存在適合碳源的情況下能夠在好氧和/或厭氧條件下生長(zhǎng)。此外，奇球菌屬細(xì)菌典型地不具有任何病原性，因此可以沒(méi)有特定限制地使用。因此，本發(fā)明第一次公開(kāi)了奇球菌屬細(xì)菌從生物質(zhì)制造生物能產(chǎn)物或代謝物的能 力，以及它們出人意料的在適應(yīng)于這些應(yīng)用的具體條件下生長(zhǎng)和培養(yǎng)的能力。本發(fā)明還提 出了使用任何在由脅迫造成破壞時(shí)具有全部或部分地重新裝配它們的基因組的能力的細(xì) 菌，來(lái)生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用了嗜熱的奇球菌屬菌種，優(yōu)選選自 Deinococcus geothermalis、耐福身寸奇球菌禾口 Deinococcusmurrayi。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，方法使用了在存在毒性劑，特別是存在有機(jī)溶劑例 如乙醇的情況下可存活的奇球菌屬細(xì)菌。本申請(qǐng)的確顯示，奇球菌屬菌株可以在存在高水 平溶劑、例如乙醇或丁醇的情況下生長(zhǎng)，允許以更有效的方式生產(chǎn)生物燃料。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，方法使用了可以在從大約40到70°C，優(yōu)選從 50°C到60°C的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法使用了可以在升高的 溫度(高于40°C )下，也可以在存在上面公開(kāi)的毒性劑或有機(jī)溶劑的情況下生長(zhǎng)的細(xì)菌。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，方法使用了在NaCl或等價(jià)的鹽可能達(dá)到大 約5%重量/體積的濃度條件下可以存活或有功能的奇球菌屬細(xì)菌。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，方法使用了在大約3到9. 5、優(yōu)選在4到8之 間的PH范圍內(nèi)存活的細(xì)菌。確實(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，奇球菌屬菌株可以在這種嚴(yán)緊條件下維 持，這對(duì)于轉(zhuǎn)化生物質(zhì)是特別有利的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了能夠轉(zhuǎn)化C6和/或C5糖類(lèi)，和/或促進(jìn)纖維素 消化以產(chǎn)生葡萄糖，和/或促進(jìn)半纖維素消化以產(chǎn)生木糖的奇球菌屬細(xì)菌。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了方法，其中所述奇球菌屬細(xì)菌能夠在存在木聚 糖的情況下生長(zhǎng)，并促進(jìn)木聚糖的消化。這樣的酶活性，與高耐熱性、寬范圍的pH耐受性和毒性劑耐受性相結(jié)合，以前從 未報(bào)道過(guò)，是引人注目的。正如在實(shí)施例中顯示的，可以分離、培養(yǎng)具有上述性質(zhì)的奇球菌 屬細(xì)菌，并從生物質(zhì)生產(chǎn)大量的生物能產(chǎn)物或代謝物。就此而言，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于這樣的方法，其中所述奇球菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)在 含有C6糖、優(yōu)選為葡萄糖，或更復(fù)雜的糖、優(yōu)選為蔗糖、纖維二糖或淀粉，或C5糖、優(yōu)選為木 糖，來(lái)作為碳源的基本培養(yǎng)基中。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于下述事實(shí)，即所述奇球菌屬細(xì)菌可以在存在C3碳水化合物，優(yōu)選為甘油或丙酮酸鈉的情況下生長(zhǎng)。適合用于本發(fā)明的細(xì)菌的具體例子是保藏號(hào)為DSM11300、DSM11301、DSM11302、 HAMB12480、HAMB12481 和 HAMBI2411 的 Deinococcus geothermalis 菌株；保藏號(hào) 為 DSM11303 和 DSM11305 的 Deinococcus murrayi 菌株；或保藏號(hào)為 DSM18568T 的 Deinococcuscellulosilyticus菌株(列于表1中)，或基本上與其類(lèi)似的菌株或其突變株。表1 奇球菌屬(Deinococcus)菌株列表 所有上表中列出的菌株都能夠在pH7下在PGY類(lèi)型的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。其他適合的 培養(yǎng)基公開(kāi)在實(shí)驗(yàn)部分中。
應(yīng)該理解，具有本文證明和發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)的其他奇球菌屬菌株，現(xiàn)在可以由專(zhuān)業(yè)技 術(shù)人員，根據(jù)本申請(qǐng)的講述內(nèi)容，例如通過(guò)仿效在實(shí)驗(yàn)部分中描述的指導(dǎo)和試驗(yàn)，進(jìn)行篩選 和鑒定。正如上面提到的，在本申請(qǐng)中使用的奇球菌屬菌株可以以天然形式使用，或者可 以被修飾(例如化學(xué)或遺傳地)以獲得改進(jìn)的性質(zhì)。就此而言，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā) 明使用了通過(guò)加速進(jìn)化，或通過(guò)DNA改組技術(shù)，或通過(guò)插入真核生物、原核生物或合成的非 奇球菌DNA，或通過(guò)插入另一種奇球菌菌株DNA而進(jìn)行修飾的奇球菌細(xì)菌，所述修飾影響了 所述細(xì)菌的存活力、生長(zhǎng)或功能以促進(jìn)生物質(zhì)的修飾。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的細(xì)菌可以是有利地使用例如在國(guó)際專(zhuān)利申 請(qǐng)No. PCT/EP2006/005826中描述的方法重組或修飾的細(xì)菌菌株。正如前面討論的，本發(fā)明顯示出，在例如D. geothermal i s、耐輻射奇球菌或 D. murrayi中選擇的奇球菌屬細(xì)菌或其衍生菌，表現(xiàn)出有利的性質(zhì)，能夠從各種不同的原料 底物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。因此，本發(fā)明涉及使用奇球菌屬細(xì)菌，從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍 生物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物。本發(fā)明還涉及通過(guò)將所述生物質(zhì)暴露或培養(yǎng)在存在奇球菌 屬細(xì)菌或其提取物的情況下，并回收產(chǎn)生的生物能產(chǎn)物或代謝物，而從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍 生物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的方法。培養(yǎng)或暴露，可以在任何允許生物質(zhì)或衍生物修飾以產(chǎn)生生物能產(chǎn)物的適合條件 條件或環(huán)境下進(jìn)行。就此而言，方法可以按照需要，在反應(yīng)器中，在發(fā)酵罐中，在戶(hù)外，在存 在適合的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或添加劑的情況下進(jìn)行。方法典型在PH條件，高于40°C的溫度和存在適 合底物的情況下進(jìn)行。本發(fā)明的具體目標(biāo)在于包括下列步驟的方法a)在好氧和/或厭氧條件下培養(yǎng)和/或生長(zhǎng)所述細(xì)菌，b)使用含有所述細(xì)菌或其提取物的組合物，將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾(例如 轉(zhuǎn)化或處理)成生物能產(chǎn)物或代謝物，以及c)收集從所述生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的修飾產(chǎn)生的至少一種生物能產(chǎn)物或代謝 物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于使用至少一種例如上面描述的細(xì)菌或細(xì)菌提取物或例 如上面描述的組合物，轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的方法，包括下列組合 在適合的生長(zhǎng)和發(fā)育條件下將所述細(xì)菌菌株或所述細(xì)菌菌株提取物進(jìn)行培養(yǎng)和 發(fā)育的至少一種操作， 在適合量的所述細(xì)菌菌株或所述細(xì)菌菌株提取物的作用下，在適合于所述生物 質(zhì)或生物質(zhì)衍生物轉(zhuǎn)化的條件下，轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的至少一種操作，以及 收集至少一種源自于所述生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物轉(zhuǎn)化的生物能產(chǎn)物或代謝物， 特別是收集由此產(chǎn)生的乙醇。在上述方法中，培養(yǎng)和/或生長(zhǎng)所述細(xì)菌的第一個(gè)步驟，和使用含有所述細(xì)菌或 其提取物的組合物將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾成生物能產(chǎn)物或代謝物的第二個(gè)步驟，可 以同時(shí)或相繼地進(jìn)行；收集生物能產(chǎn)物或代謝物的第三個(gè)步驟，可以與第一和/或第二個(gè) 步驟同時(shí)、或相繼地進(jìn)行。就此而言，生物質(zhì)可以與細(xì)菌在允許所述細(xì)菌擴(kuò)增的適合條件下 相接觸，從而增加工藝效率。可選地，細(xì)菌菌株可以在適合的培養(yǎng)條件下單獨(dú)擴(kuò)增，然后添加到生物質(zhì)中。應(yīng)該理解，為了將生物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化成大量生物能產(chǎn)物或代謝物所最初使用 的細(xì)菌的準(zhǔn)確量，可以由專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員根據(jù)細(xì)菌的類(lèi)型、生物質(zhì)或衍生物的類(lèi)型以及培養(yǎng) 條件進(jìn)行調(diào)整。在本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案中，奇球菌屬細(xì)菌獨(dú)立于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行生長(zhǎng)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，方法使用的組合物包含奇球菌屬細(xì)菌或其提取物，以 及至少一種適合的添加劑或賦形劑，優(yōu)選為選自消泡劑和營(yíng)養(yǎng)劑的至少一種劑。適合的消 泡劑特別是分散劑、去污劑和表面活性劑，更通常為兩親性化合物。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的反應(yīng)器中進(jìn)行。“反應(yīng)器”是指 常規(guī)的發(fā)酵罐或任何特別設(shè)計(jì)用以執(zhí)行本發(fā)明的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化裝置或系統(tǒng)，因此具體來(lái)說(shuō)包 括生物反應(yīng)器，生物過(guò)濾器，旋轉(zhuǎn)式生物接觸器，和其他用于處理生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的 氣相和/或液相生物反應(yīng)器?？捎糜诒景l(fā)明的裝置可以以連續(xù)或分批裝料的方式使用。在反應(yīng)器中，為了執(zhí)行本發(fā)明的方法，使用了至少一種細(xì)菌或細(xì)菌提取物，和/或 至少一種例如上面定義的組合物，與此同時(shí)，所述反應(yīng)器的安排和提供使得生理化學(xué)條件 在其中建立并維持，使得所述細(xì)菌針對(duì)所考慮的應(yīng)用進(jìn)行工作，并任選使得細(xì)菌在其中可 能生長(zhǎng)并優(yōu)選促進(jìn)生長(zhǎng)。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌在轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的過(guò)程 中在反應(yīng)器中生長(zhǎng)，同時(shí)建立并維持使這種細(xì)菌可能生長(zhǎng)、優(yōu)選促進(jìn)生長(zhǎng)的適合生理化學(xué) 條件。例如，可以使用500ml錐形瓶(Erlenmeyer)，其中有50°C溫度的100ml 167 Thermus 培養(yǎng)基或下面描述的基本培養(yǎng)基。在本發(fā)明的可選實(shí)施方案中，生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化在好氧、厭氧或微需 氧條件下進(jìn)行。根據(jù)另一方面，本發(fā)明的目標(biāo)是使用例如上面定義的奇球菌屬細(xì)菌或細(xì)菌提取 物，或例如上面定義的組合物，用于轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的反應(yīng)器。本發(fā)明的方法可用于從各種不同類(lèi)型的生物質(zhì)生產(chǎn)生物能。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 生物質(zhì)包括木材和木材殘余料，林業(yè)殘余料，制造廠(chǎng)殘余料，農(nóng)業(yè)作物，農(nóng)業(yè)殘余料，可食用 和/或不可食用植物或其部分，稻草，園藝殘余料，水生植物，動(dòng)物廢料，家畜經(jīng)營(yíng)殘余料， 糞肥，有機(jī)城市廢料和/或工業(yè)有機(jī)廢料。生物質(zhì)也可包括可生物降解廢物。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物或中間產(chǎn)物平臺(tái)修飾成 生物能產(chǎn)物或代謝物的方法，其中生物質(zhì)衍生物優(yōu)選為木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、淀粉，其 中中間產(chǎn)物平臺(tái)優(yōu)選為碳水化合物例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘 露聚糖、木葡聚糖、淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李 糖、半乳糖和/或果糖。本發(fā)明的具體目標(biāo)在于生產(chǎn)生物燃料的方法。在本發(fā)明的環(huán)境中，術(shù)語(yǔ)“生物燃 料”是指源自于剩余的或最近死亡的生物碳源的燃料。生物燃料可以從可再生資源，特別是 植物或動(dòng)物生物質(zhì)，或從城市和工業(yè)廢物生產(chǎn)。本發(fā)明的生物燃料包括“第一代生物燃料” 和/或“第二代生物燃料”。第一代生物燃料從植物或動(dòng)物有機(jī)材料，優(yōu)選從糖、淀粉、植物油或動(dòng)物脂肪獲 得。用于生產(chǎn)第一代生物燃料的主要來(lái)源是可食用植物或其部分。第一代生物燃料包括植 物油、生物柴油、生物醇類(lèi)、生物氣、合成氣和固體生物燃料。生物醇類(lèi)包括乙醇、丙醇和丁醇。更優(yōu)選，本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)乙醇、丙醇和丁醇。最優(yōu)選的生物燃料是乙醇。第二代生物燃料優(yōu)選從不可食用植物或植物的不可食用部分生產(chǎn)。它們包括非糧 食作物，生物質(zhì)廢物，小麥、玉米的莖稈和木材。優(yōu)選，本發(fā)明的生物燃料包括纖維素生物燃 料。根據(jù)起始生物質(zhì)，生物能產(chǎn)物或代謝物例如生物燃料的生產(chǎn)需要兩個(gè)連續(xù)的步 驟水解步驟，由酶、優(yōu)選為纖維素酶或漆酶催化，將長(zhǎng)的、復(fù)雜的碳水化合物鏈例如纖維素 或木質(zhì)素分別分解成較小的可發(fā)酵糖；以及發(fā)酵步驟，該步驟將有機(jī)化合物例如糖類(lèi)進(jìn)一 步分解成醇類(lèi)。應(yīng)該指出，本發(fā)明的奇球菌屬菌株可用于任何一個(gè)或兩個(gè)所述反應(yīng)。本發(fā) 明的確顯示，奇球菌能夠水解長(zhǎng)的碳水化合物鏈(例如木聚糖或纖維素)，也能夠從C3、C5 或C6糖產(chǎn)生代謝物(例如乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇，以及乙酸、丙酸、丙酮酸和丁酸)。但 是，應(yīng)該指出，如果需要，奇球菌屬菌株可以與任何其他細(xì)菌菌株組合使用。給出下面的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，而不是限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 詵擇試騎為了確定微生物是否具有本發(fā)明所需的性質(zhì)，必須進(jìn)行特定的試驗(yàn)以便確定屬、 種和/或細(xì)菌菌株是否能夠具有所需性質(zhì)，并在轉(zhuǎn)化生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的方法中發(fā)揮 作用，并確定可以由此獲得哪些顯著改進(jìn)。本發(fā)明的這些特定試驗(yàn)在下述條件下進(jìn)行培養(yǎng)基D. geothermaliS(D.G.)在50°C和攪拌下培養(yǎng)在好氧培養(yǎng)基中。167培養(yǎng)基用于 維持菌株?；九囵B(yǎng)基用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，特別是用于代謝物的表征。在這種情況下，在用5ml D. G.合生培養(yǎng)物接種后，將500ml培養(yǎng)基在攪拌下在1L錐形瓶中溫育1到7天。167 Thermus 培養(yǎng)基
用naoh調(diào)整到ph 7. 2，在121 °c高溫高壓滅菌15分鐘。將 磷酸鹽緩沖液?jiǎn)为?dú)高溫高壓滅菌，添加到培養(yǎng)基中。 磷酸鹽緩沖液 微量元素溶液 基本培養(yǎng)基MOPS 緩沖液
這些儲(chǔ)存溶液為10X濃縮狀態(tài)，臨用時(shí)稀釋。細(xì)菌漆酶活性的檢測(cè)原理丁香醛連氮+02——> 氧化的丁香醛連氮+2H20漆酶試劑A. lOOmM磷酸鉀緩沖液，在30°C下pH 6. 5B. 0. 216mM丁香醛連氮(在無(wú)水乙醇中配制3ml，丁香醛連氮從Sigma Prod.獲得， No. S-7896)C.酶 在530nm處記錄光密度的增加。
在這些條件下，一單位酶在pH 6. 5和30°C下每分鐘產(chǎn)生0. 001的光密度增加。細(xì)菌纖維素酶活件檢測(cè)原理測(cè)試是基于在纖維素降解過(guò)程中跟蹤NAD向NADH的轉(zhuǎn)化。然后按照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)，在340nm處監(jiān)測(cè)吸光度的增加，說(shuō)明書(shū)可以在下列英特網(wǎng)鏈接上獲得(http://www. sigmaaldrich. com/img/assets/18160/Cellulase. pdf)乙醇牛產(chǎn)的檢測(cè)乙醇使用兩種方法進(jìn)行定量。酶法 該方法基于在存在乙醇和乙醇脫氫酶的情況下跟蹤NAD向NADH的轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)翻譯成340nm處吸光度的增加。對(duì)于該測(cè)量來(lái)說(shuō)，按照制造商的說(shuō)明書(shū)使 用了 Sigma N7160試劑盒，說(shuō)明書(shū)可以在下列英特網(wǎng)鏈接上獲得(http://www. sigmaaldrich. com/sigma/bulletin/N7160BUL. pdf).通過(guò)反相高效液相餼譜法測(cè)量條件HPLC =Gilson,帶有自動(dòng)進(jìn)樣器，通過(guò)折射計(jì)檢測(cè)，柱Phenomenex Rezex R0A, 3OOmmx7. 8mm柱溫65°C流動(dòng)相0·005Ν硫酸流速0. 600ml/min首先，通過(guò)將含有已知濃度乙醇的培養(yǎng)基注入柱子，制作了校正曲線(xiàn)。測(cè)量了在 22. 26min處洗脫的對(duì)應(yīng)于乙醇的峰面積。將校正曲線(xiàn)作圖。接下來(lái)，通過(guò)將培養(yǎng)上清液注射到柱子中測(cè)量了由細(xì)菌生產(chǎn)的乙醇的量。測(cè)量了 在22. 26min處洗脫并對(duì)應(yīng)于乙醇的峰面積。通過(guò)與校正曲線(xiàn)的比較推導(dǎo)出上清液中存在 的乙醇的濃度。按照常規(guī)的分析和評(píng)估方法，可以對(duì)可能以不同比例產(chǎn)生的其他代謝物進(jìn)行檢測(cè) 禾口定量。細(xì)菌是單倍體生物，通過(guò)二分裂繁殖，以環(huán)境中提供的礦物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)為食。它們的氣體、特別是對(duì)于氧氣的需求是可變的，使用的培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)必須根據(jù) 根據(jù)它們是嚴(yán)格好氧、嚴(yán)格厭氧還是兼性好氧_厭氧微生物而進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明有利地需要的纖維素酶活性，參與纖維素的降解，同時(shí)漆酶活性允許或促 進(jìn)了木質(zhì)素的降解。從生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)生物能產(chǎn)物例如特別是乙醇和/或其它代謝物，按照操作條件 進(jìn)行，這些操作條件隨后被調(diào)整以適應(yīng)于反復(fù)測(cè)試本發(fā)明的條件和技術(shù)參數(shù)，它們具體來(lái) 說(shuō)是細(xì)菌培養(yǎng)基的量，溫度和/或壓力操作條件，以及好氧、厭氧或微需氧發(fā)酵的選擇。在上面描述的特定測(cè)試和分析后，按照本發(fā)明的方法實(shí)施選擇的天然或遺傳修飾菌株。實(shí)施例2 在存在Deinococcus geothermalis的情況下生產(chǎn)乙醇在含有IOOml處于50°C的基本培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，在50°C下加入IOiq個(gè) D. geothermalis (DG)的接種物。將培養(yǎng)物置于攪拌下以促進(jìn)通氣。
然后準(zhǔn)備該培養(yǎng)物用于常規(guī)的生物質(zhì)發(fā)酵罐中，其中在最佳條件下，可以在55°C 下以出色的產(chǎn)率獲得乙醇和其他代謝物。在有待處理生物質(zhì)的反應(yīng)器中1到7天后，通過(guò)HPLC定量上面提到的乙醇和代謝 物的存在(按照前面描述的方案)。觀察到了葡萄糖的消失和伴隨的乙醇的產(chǎn)生，其濃度通 過(guò)分析加以估計(jì)。檢測(cè)到了其他關(guān)注的代謝物。在培養(yǎng)基中用木糖取代葡萄糖也允許細(xì)菌 生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)。在本實(shí)施例的實(shí)施方案的一個(gè)變體中，通過(guò)在相同的罐中同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和發(fā) 酵，可以獲得類(lèi)似的結(jié)果。實(shí)施例3 乙醇和丁醇對(duì)Deinococcus geothermalis的殺細(xì)菌劑效應(yīng)材料和方法本方法可以評(píng)估有機(jī)溶劑對(duì)生長(zhǎng)或靜止期中的細(xì)菌的殺細(xì)菌劑效應(yīng)。測(cè)試的溶劑 是乙醇和丁醇。測(cè)試的細(xì)菌屬于奇球菌屬-在40到70V之間生長(zhǎng)-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線(xiàn)，由干燥，由酶的作用，由超聲或由化學(xué)脅迫造成。試驗(yàn)在測(cè)試的菌株的最適生長(zhǎng)溫度下進(jìn)行。從富集培養(yǎng)基中處于靜止期的預(yù)培養(yǎng) 物，以ν/ν接種IOml富集培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基含有蛋白胨2g/l，酵母提取物5g/l和 葡萄糖10g/l ；將溶液通過(guò)高溫高壓(120°C，20分鐘)進(jìn)行滅菌。向該溶液中添加下列溶 液M0PS 緩沖液(IOX) pH7 [酸 MOPS 400mM, NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl2 5. 28mM]；微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 20mM中；K2HPO4 lg/1 ；將溶液過(guò)濾(45 μ m)除菌。將200μ 1培養(yǎng)物分配在96孔微孔板上。為了避免任何溶劑蒸發(fā)現(xiàn)象，將微孔板
用不透性無(wú)菌薄膜覆蓋。一旦達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期(600nm處光密度為0.5)后或一旦達(dá)到靜止期(平臺(tái))后， 加入溶劑。測(cè)試的含量是乙醇0到31%，丁醇0到2.5%。然后將培養(yǎng)物在攪拌下溫育1 小時(shí)。計(jì)數(shù)在溫育結(jié)束時(shí)，對(duì)于每種溶劑濃度，將20 μ 1培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微孔板 上，并連續(xù)稀釋(以1/10連續(xù)稀釋9個(gè)孔)。稀釋培養(yǎng)基是富集培養(yǎng)基。將5 μ 1每種稀釋 液的三份平行樣鋪設(shè)在PGY瓊脂培養(yǎng)基上。蛋白胨5g/l，酵母提取物2. 5g/l，葡萄糖0. 5g/ 1，瓊脂14g/l ；培養(yǎng)基通過(guò)在120°C高溫高壓滅菌20分鐘進(jìn)行滅菌。一旦允許其生長(zhǎng)后，對(duì) 于被測(cè)溶劑的各百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以評(píng)估有機(jī)溶劑對(duì)菌株的影響。MM被我們視為細(xì)菌存活力喪失時(shí)的溶劑濃度，對(duì)應(yīng)于我們觀察到相對(duì)于對(duì)照來(lái)說(shuō)損失一個(gè)對(duì)數(shù)時(shí)的最低溶劑濃度。從在發(fā)酵罐中的工業(yè)應(yīng)用前景來(lái)看，測(cè)試的菌株(圖1到4)表現(xiàn)出令人滿(mǎn)意的溶 劑耐受性。實(shí)施例4 細(xì)菌在存在C3、C5和C6碳源情況下的生長(zhǎng)
材料與方法預(yù)培養(yǎng)在含有蛋白胨(2g/l)、酵母提取物(5g/l)、葡萄糖(10g/l)的培養(yǎng)基A中 或在PGY培養(yǎng)基中進(jìn)行。在將培養(yǎng)基離心后，將細(xì)菌沉淀用基本培養(yǎng)基A洗滌兩次，以消除 所有接種物中的營(yíng)養(yǎng)物源。用該接種物接種(1/66)含有(w/v)下列碳源之一的培養(yǎng)基 A(200 μ 1) :D(+)葡萄糖，D⑴纖維二糖，蔗糖，淀粉，D⑴木糖，來(lái)自樺木的木聚糖，甘油， 丙酮酸鈉。在菌株DRH07、DRH39、DRH08和DRHlO的情況下，將谷氨酸(IOmM)添加到培養(yǎng)基 中。細(xì)菌生長(zhǎng)在45°C下，在96孔微孔板上，在攪拌下進(jìn)行，然后使用分光光度計(jì)(Chameleon 多標(biāo)記物檢測(cè)平臺(tái)板，ScienceTec)在544nm處，或使用spectrostar OMEGA微孔板讀板器 (BMG Labtech)在600nm處測(cè)量光密度。使用的碳源參比物來(lái)自樺木的木聚糖(95588，F(xiàn)luka)，纖維二糖(22150， Fluka)，D (+)木糖(95730，F(xiàn)luka)，葡萄糖(G8270-1KG，Sigma)，蔗糖(S9378-1KG，Sigma)， 淀粉(S9765-500G, Sigma)，甘油(453752，CarloErba)，丙酮酸鈉(Sigma)。培養(yǎng)基的組成和制備PGY培養(yǎng)基蛋白胨(10g/l)，葡萄糖(lg/Ι)，酵母提取物(5g/l)，將混合物在 120°C高溫高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)基A 用于制備培養(yǎng)基A的各種不同溶液從過(guò)濾除菌的儲(chǔ)液制備-溶液(pH7)，含有酸MOPS 緩沖液 40mM，NH4Cl 20mM, KOH 1 OmM, NaOH IOmMjCaCl2 0· 5 μ M，Na2SO4 0. 276mM, MgCl2O. 528mM。-微量營(yíng)養(yǎng)物溶液(pH5): (NH4)6(MO7)O24 3nM，H3BO3 400nM, CoCl2 30nM, CuSO4 IOnM,MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM0-維生素溶液，pH4，(每種lyg/l):D-生物素，煙酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl， 維生素B12。-磷酸源=K2HPO45. 7mM。-FeCl3 20 μ M (制備在檸檬酸鈉溶液中，然后過(guò)濾)。MM表2 (下文)中列出的細(xì)菌能夠在含有C6糖類(lèi)例如葡萄糖、蔗糖、纖維二糖和淀粉 作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基(培養(yǎng)基Α)中繁殖。應(yīng)該指出，菌株DRH37和DRH06也能夠在 存在甘油和丙酮酸鈉(C3碳水化合物)的情況下生長(zhǎng)。表3中列出的細(xì)菌也能夠在含有C5糖類(lèi)(木糖或木聚糖)作為唯一碳源的基本 培養(yǎng)基中繁殖；例外是菌株DRH06和DRH07，它們分別不能在存在木聚糖和木糖的情況下生 長(zhǎng)。表2 在各種不同的D. geothermalis和D.murrayi菌種上進(jìn)行的各種不同C6和C3 碳源的同化試驗(yàn)-ΔΟ < 0. 2 ；+AOD = 0. 2 ；++0. 3 彡 Δ OD > 0. 4 ；+++0. 4 彡 Δ OD 彡 0. 5 ； ++++ Δ OD彡0. 6。Δ OD對(duì)應(yīng)于在生長(zhǎng)起始時(shí)間TO和時(shí)間Τ196小時(shí)(大約8天)544nm處 OD值之間的差值。
D. geothermalisD. murrayi1% (w/v)碳源 DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39 DRH08 DRHlO單一 C6碳水化合物D_(+)_ 葡萄糖 +++ + ++ ++ +++ +++ + +D_(+)_ 纖維二糖 ++ - +++ +++ ++ +++ ++ -蔴糖+++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ -淀粉+++ ++ ++ ++ +++ - ++ -單一 C3碳水化合物甘油- --++----丙酮酸鈉_+______表3 在各種不同的D. geothermalis菌種上進(jìn)行的各種不同C5和C6碳源的 同化試驗(yàn)-Δ OD < 0. 2 ;+ Δ OD = 0. 2 ；++0. 3 ^ Δ OD > 0. 4 ；+++0. 4 ^ Δ OD ^ 0. 5 ； ++++ Δ OD彡0. 6。Δ OD對(duì)應(yīng)于在生長(zhǎng)起始時(shí)間TO和時(shí)間Τ64小時(shí)(大約2. 5天)600nm處 OD值之間的差值。1% (w/v)碳源 DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39D_(+)_ 葡萄糖 +++ ++ + ++++ +++ +++木聚糖+++ -+++++ ++++ ++++木糖+++ +++ -++++ +++ +實(shí)施例5 細(xì)菌在高乙醇濃度中的生長(zhǎng)材料與方法本方法能夠評(píng)估微生物在存在高濃度乙醇的情況下生長(zhǎng)的能力。測(cè)試的細(xì)菌屬于 Deinococcus geothermalis 菌禾中-在40到70V之間生長(zhǎng)-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線(xiàn)，由干燥，由酶的作用，由超聲或由化學(xué)脅迫造成。試驗(yàn)在測(cè)試的菌株的最適生長(zhǎng)溫度下進(jìn)行。對(duì)于每種待測(cè)試的乙醇含量，從富集 培養(yǎng)基中處于靜止期的預(yù)培養(yǎng)物，以ν/ν接種20ml富集培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基含有蛋 白胨2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l ；將溶液通過(guò)高溫高壓(120°C，20分鐘)進(jìn) 行滅菌。向該溶液中添加下列溶液=MOPS緩沖液(10X)pH7[酸MOPS緩沖液400mM，NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2S042. 76mM, MgCl2 5. 28mM]；微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) (10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 2OmM 中；K2HPO4 lg/1 ；將溶液過(guò)濾(45 μ m)除菌。在TO時(shí)加入乙醇，含量在0到31%之間不等。對(duì)于每種測(cè)試的乙醇含量進(jìn)行生長(zhǎng) 的跟蹤。使用分光光度計(jì)(uv Light XS5,SEC0MAM)在600nm處讀取0D。在下列時(shí)間取出 Iml 等份培養(yǎng)物:T0, Τ0+1Η, Τ0+3Η, Τ0+18Η, Τ0+20Η, Τ0+22Η, Τ0+24Η。當(dāng)必須讀數(shù)時(shí)，將培養(yǎng)物在富集培養(yǎng)基中稀釋十倍。對(duì)于每種測(cè)試的乙醇含量可以畫(huà)出生長(zhǎng)曲線(xiàn)。在溫育期結(jié)束時(shí)，對(duì)于每種測(cè)試的乙醇含量，進(jìn)行計(jì)數(shù)以評(píng)估乙醇對(duì)菌株 的影響。結(jié)果測(cè)試的某些菌株，例如Deinococcus geothermalis DSM11300，能夠在含有乙 醇的 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖5)。某些菌株，例如Deinococcusgeothermalis DSM11300，在具有 高乙醇含量的培養(yǎng)基中顯示出抗性(參見(jiàn)圖6A)。實(shí)施例6 通過(guò)Deinococcus murrayi生產(chǎn)目的代謝物材料與方法本方法能夠評(píng)價(jià)微生物從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物生產(chǎn)重要代謝物(由甘油，丁二 醇，丙二醇和乙酸，丙酸，丙酮酸和丁酸組成)的能力。IH式的細(xì)菌屬于 Deinococcus geothermalis 菌禾中-在40到70V之間生長(zhǎng)-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線(xiàn)，由干燥，由酶的作用，由超聲或由化學(xué)脅迫造成。試驗(yàn)在測(cè)試的菌株的最適生長(zhǎng)溫度下進(jìn)行。從在富集培養(yǎng)基中制備的預(yù)培養(yǎng)物 (處于靜止期)，接種20ml富集培養(yǎng)基以1 % ν/ν接種。富集培養(yǎng)基含有蛋白胨2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l ；將溶液通過(guò) 高溫高壓(120°C，20分鐘)進(jìn)行滅菌。向該溶液中添加下列溶液MOPS緩沖液(IOX) pH7 [酸 MOPS 400mM, NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl25. 28mM]；微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3B034mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 2OmM 中；K2HP04 lg/1 ； 將溶液過(guò)濾(45 μ m)除菌。將培養(yǎng)物在45°C下，在攪拌下留在培養(yǎng)箱中，直到它達(dá)到其靜止期。一旦靜止期達(dá) 到后，將培養(yǎng)物以4000rpm離心10分鐘。將上清液倒入另一個(gè)管中，置于-80°C下。HPLC UV分析和折射計(jì)(離子交換柱(H+) Biorad,流動(dòng)相H2S045mM，流動(dòng)相流速0. 6ml/min,等強(qiáng) 度狀態(tài))能夠鑒定目的代謝物。MM測(cè)試的某些菌株產(chǎn)生了某些尋找的目的代謝物(表4)。表4 由 Deinococcus murrayi DSMl 1305 產(chǎn)生的代謝物(以 g/Ι 表示) 材料與方法菌株在不同pH下的PGY培養(yǎng)基中在45°C下培養(yǎng)。pH使用NH3 10% (ν/ν)或HCl ION調(diào)整。通過(guò)使用spectrostar微孔板讀板器0MEGA，BMG Labtech，在600nm處測(cè)量光密 度，來(lái)追蹤生長(zhǎng)。MM
四株菌株(D. geothermalis)能夠在5到8之間的pH范圍內(nèi)繁殖(參見(jiàn)圖6A、6B、 6C 禾口 6D)。實(shí)施例8 從自然環(huán)境分離UV抗性嗜熱細(xì)菌熱水樣品的處理將熱水樣品通過(guò)經(jīng)0. 22 μ m硝酸纖維素濾器(Millipore，F(xiàn)rance)過(guò)濾來(lái)進(jìn)行濃 縮，然后懸浮在IOml無(wú)菌水中。然后將過(guò)濾過(guò)的溶液超聲大約60秒，以重新懸浮細(xì)菌。木材和卵石樣品的處理將木材和卵石樣品浸泡在無(wú)菌水中，然后渦旋并超聲大約60秒。石頭、苔蘚、地衣、泥、沉積物、生物膜、土壤和動(dòng)物排泄物樣品的處理將苔蘚、地衣、泥、土壤和動(dòng)物排泄物樣品在無(wú)菌水中懸浮(V/V)，然后渦旋。然后 將樣品超聲大約60秒。分離UV抗性嗜熱細(xì)菌在超聲后，將500 μ 1到2ml之間的懸液鋪于高溫高壓滅菌(120°C20分鐘)的固體 PGY瓊脂富集培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含有葡萄糖(Sigma-Aldrich，F(xiàn)rance)lg/l，蛋白胨(Fluka， France) 10g/l和酵母提取物(Fluka，F(xiàn)rance) 5g/L·然后將接種的培養(yǎng)基使用4mJ/cm2的 BLX-E254 biolink(Vilber-Lourmat, France)進(jìn)行3次UV處理，每次進(jìn)行的時(shí)間間隔為4 小時(shí)。在45°C溫育3到4天后，可以看見(jiàn)目的嗜熱菌落。實(shí)施例9通過(guò) Deinococcus cellulosilyticus消化纖維素材料與方法D. cellulosilyticus菌株的預(yù)培養(yǎng)在富集培養(yǎng)基(組成參見(jiàn)下文)中進(jìn)行。該預(yù) 培養(yǎng)物用于將IOml富集培養(yǎng)基接種(1% ν/ν)到含有羧甲基纖維素(CM-纖維素)的基本 培養(yǎng)基，或不含碳源的該同樣的培養(yǎng)基中。細(xì)菌的生長(zhǎng)在30°C下，在50ml Falcon管中，在攪拌下(IlOrpm)進(jìn)行，通過(guò)使用分 光光度計(jì)(WPA Biowave，細(xì)胞密度計(jì))在600nm處測(cè)量光密度來(lái)跟蹤。富集培養(yǎng)基蛋白胨2g/l ；酵母提取物5g/l ；葡萄糖10g/l ；含有下列物質(zhì)的溶液 (pH7)酸 MOPS 40mM, NH4Cl 20mM, KOH IOmM, NaOH IOmM, CaCl2 0. 5 μ Μ, Na2SO4 0. 276mM, MgCl2 0. 528mM ；微量營(yíng)養(yǎng)物溶液(pH5) (NH4) 6 (Mo7) O24 3nM, H3BO3 400nM, CoCl230nM, CuSO4 10nM，MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM ；維生素溶液，pH4(各 1 μ g/1) :D-生物素，煙酸，吡哆 醛-HCl，硫胺素-HCl，維生素 B12 ；磷酸源=K2HPO4 5. 7mM ；FeCl3 20 μ M0基本培養(yǎng)基含有下列物質(zhì)的溶液(PH7) :M0PS酸40mM，MjCl 2OmM，KOH IOmM, NaOH IOmM, CaCl2 0. 5 μ Μ, Na2SO4 0. 276mM, MgCl2 0. 528mM ；微量營(yíng)養(yǎng)物溶液(pH5) (NH4) 6 (Mo7) O24 3nM，H3BO3 400nM, CoCl2 30nM, CuSO4 IOnM, MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM ；維生 素溶液，pH4(各lyg/l) :D-生物素，煙酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl，維生素B12 ；磷酸源 K2HPO4 5. 7mM ；FeCl3 20 μ Μ。結(jié)果證明7 DSMZ 引用號(hào)為 DSM 18568T (ffeon 等，2007)的 D. cellulosilyticus 菌 株具有 CM-纖維素活性(Weon 等，2007，international journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,57,1685-1688.)。如圖7中所示，D. cellulosilyticus能夠在含有CM-纖維素作為唯一碳源的培養(yǎng)基中繁殖；在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 天后，eoonm處光密度的變化(ADO6tltlnm = O. 5)與 對(duì)照培養(yǎng)物(不含碳源的培養(yǎng)基；(ADO6tltlnm = O. 18))相比是顯著的。該結(jié)果表明， D. cellulosilyticus不僅能夠降解(解聚)CM-纖維素，而且能夠同化從該降解產(chǎn)生的產(chǎn)物 (纖維二糖和葡萄糖)。
權(quán)利要求
生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物的方法，包括將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物接觸奇球菌屬(Deinococcus)細(xì)菌或在由脅迫造成破壞時(shí)具有完全或部分地重新裝配其基因組的能力的細(xì)菌，或其提取物。
2.權(quán)利要求1的方法，包括下列步驟a)在好氧和/或厭氧條件下培養(yǎng)和/或生長(zhǎng)所述細(xì)菌，b)使用含有所述細(xì)菌或其提取物的組合物，將生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾成生物能產(chǎn) 物或代謝物，以及c)收集從所述生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的修飾產(chǎn)生的至少一種生物能產(chǎn)物或代謝物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟a)、b)和c)同時(shí)或相繼進(jìn)行。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)菌是奇球菌屬細(xì)菌。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中生物質(zhì)是有機(jī)物質(zhì)，優(yōu)選為木材和木材殘余料，林 業(yè)殘余料，制造廠(chǎng)殘余料，農(nóng)業(yè)作物，農(nóng)業(yè)殘余料，可食用和/或不可食用植物或其部分，稻 草，園藝廢料，水生植物，動(dòng)物廢料，家畜經(jīng)營(yíng)殘余料，糞肥，有機(jī)城市廢料和/或工業(yè)有機(jī) 廢料。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中生物質(zhì)衍生物是植物性生物質(zhì)衍生物，優(yōu)選為木 質(zhì)素、纖維素、半纖維素、木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚 糖、淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和/ 或果糖。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌在存在毒性劑，特別是存在有機(jī)溶劑例 如乙醇的情況下是可存活的。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌在從大約40到70°C，優(yōu)選從50°C到 60°C的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌在大約3到9.5，優(yōu)選4到8之間的pH 范圍內(nèi)是能存活的或使用。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述奇球菌屬細(xì)菌能夠轉(zhuǎn)化C6和/或C5糖類(lèi)， 和/或促進(jìn)纖維素的消化以產(chǎn)生葡萄糖，和/或促進(jìn)半纖維素的消化以產(chǎn)生木糖。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌選自奇球菌屬菌種，優(yōu)選自 Deinococcus geothermalis、耐福身寸奇球菌(Deinococcusradiodurans)、Deinococcus murrayi 禾口 Deinococcus cellulosilyticus。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)菌選自保藏號(hào)為DSM11300、DSM11301、 DSM11302、HAMBI2480、HAMBI2481、HAMBI2411 的 Deinococcus geothermalis 菌株，或 保藏號(hào)為 DSM11303、DSM11305 的 Deinococcus murrayi 菌株，或保藏號(hào)為 DSM185681 的 Deinococcuscellulosilyticus菌株，或基本上與其相似的菌株或其突變株。
13.權(quán)利要求2-12的方法，其中所述組合物還包含一種或多種消泡劑和/或營(yíng)養(yǎng)劑。
14.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌通過(guò)加速進(jìn)化，或通過(guò)DNA改組技術(shù)， 或通過(guò)插入真核生物、原核生物或合成的非奇球菌DNA，或通過(guò)插入另一種奇球菌菌株DNA 而進(jìn)行修飾，所述修飾影響所述細(xì)菌的存活力、生長(zhǎng)或功能，以便促進(jìn)生物質(zhì)的修飾。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中使用轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的反應(yīng)器。
16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，用于生產(chǎn)生物燃料，例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇或丙二醇。
17.權(quán)利要求1到15任一項(xiàng)的方法，用于生產(chǎn)化學(xué)上重要的有機(jī)酸，例如乙酸、丙酸、丙 酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸。
18.奇球菌屬的細(xì)菌或其提取物在從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物生產(chǎn)生物能產(chǎn)物或代謝物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物能的組合物和方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及使用奇球菌屬(Deinococcus)和/或相關(guān)屬的細(xì)菌進(jìn)行生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物修飾，以生產(chǎn)生物能產(chǎn)物和代謝物。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101861395SQ200880116274
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者伊萬(wàn)·馬蒂科, 讓-保羅·萊奧內(nèi)蒂 申請(qǐng)人:德諾芙公司;法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心