專利名稱：：工程化改造酶易感性蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，計(jì)算生物學(xué)領(lǐng)域，且更具體地，涉及通過(guò)理性設(shè)計(jì)來(lái)生成具有升高的酶易感性(enzymaticsusceptihbility)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)工程方法。
背景技術(shù)：
：工業(yè)方法常常需要添加蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)施方法內(nèi)的特定功能。對(duì)具有新的或不同特性的蛋白質(zhì)的需要隨著工業(yè)方法發(fā)展并變得更高效而增長(zhǎng)。一種用于開(kāi)發(fā)具有新特性的蛋白質(zhì)的方法是將當(dāng)前所使用的蛋白質(zhì)工程化改造成含有新特征，且如此創(chuàng)建蛋白質(zhì)的新變體。蛋白質(zhì)工程已經(jīng)聚焦于在多種酶中開(kāi)發(fā)耐熱性。本申請(qǐng)描述了使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)工程化改造蛋白質(zhì)的酶易感性變體?？梢詫?duì)多種蛋白質(zhì)使用所描述的方法。另外，可以使用所描述的方法來(lái)工程化改造對(duì)多種蛋白酶的酶易感性。發(fā)明_既述描述了一種工程化改造具有升高的對(duì)蛋白酶的易感性的蛋白質(zhì)的方法。通過(guò)理性設(shè)計(jì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)工程基于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型及隨后鑒定可以進(jìn)行改變但對(duì)結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)和總體三維結(jié)構(gòu)沒(méi)有不利影響的蛋白質(zhì)域?？梢栽趯?duì)任何蛋白酶的易感性升高方面工程化改造任何蛋白質(zhì)。發(fā)明詳述工業(yè)方法使用蛋白質(zhì)作為制造成分。作為酶的蛋白質(zhì)作為工業(yè)方法中的成分是特別有用的，因?yàn)樗鼈兇呋瘜⒌孜飶囊环N形式轉(zhuǎn)化成另一種的反應(yīng)。蛋白質(zhì)的特征，且特別是酶的活性譜(即最佳溫度、PH、鹽濃度、離子等)促成蛋白質(zhì)對(duì)于一種特定方法的有用性。隨著新的工業(yè)方法發(fā)展，越來(lái)越多地需要具有改變了特性的蛋白質(zhì)。所尋求的新特性可以在蛋白質(zhì)當(dāng)前的特性組之外或者可以牽涉改變特性。蛋白質(zhì)特性可以包括但不限于活性譜的特征、吸水能力、預(yù)防吸水的能力、凝膠化能力等。例如，可能想要用對(duì)蛋白酶消化的易感性增強(qiáng)的額外特性工程化改造展示出耐熱性和酸穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。在這個(gè)例子中，需要在添加新特性(對(duì)蛋白酶的敏感性增強(qiáng))時(shí)維持蛋白質(zhì)的初始特性(耐熱性和酸穩(wěn)定性)。還可以考慮酶的比活，其中酶的“比活”定義為酶在給定的時(shí)間單位里能夠轉(zhuǎn)化或催化的底物量。有數(shù)種可用于使蛋白質(zhì)演化以創(chuàng)建具有改變了的特性的變體的技術(shù)。例如，基于隨機(jī)氨基酸變化或隨機(jī)誘變的技術(shù)包括化學(xué)誘變(Smith，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985))、DirectEvolution(美國(guó)專利No.5，830,696)；基因位點(diǎn)飽和誘變(GSSM)(美國(guó)專利No.6，171，820和6，579，258)、定向進(jìn)化中的外切核酸酶介導(dǎo)的基因裝配(美國(guó)專利No.6，361，974和6，352，842)、定向進(jìn)化中的末端選擇(endselection)(美國(guó)專利No.6，358，709和6，238，884)、基于重組的合成改組(美國(guó)專利No.5，965，408和6，440，668，和澳大利亞專利No.AU724521)、和嗜熱酶的定向進(jìn)化(美國(guó)專利No.5，830，696和6，335，179)。這些技術(shù)產(chǎn)生具有隨機(jī)突變的變體的集合(pool)，然后篩選變體的這種集合以鑒定那些具有想要特性組的個(gè)體變體。隨機(jī)誘變的備選是理性設(shè)計(jì)，其中基于關(guān)于蛋白質(zhì)自身知道什么來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)的特定區(qū)域鑒定改變。理性設(shè)計(jì)摻入三維結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)位置和重要結(jié)合位點(diǎn)位置的知識(shí)來(lái)預(yù)測(cè)可以改變的蛋白質(zhì)區(qū)域。通過(guò)此信息，可以生成具有特定改變的蛋白質(zhì)，并對(duì)其測(cè)試活性。特定的改變可以單獨(dú)地進(jìn)行或者與其它改變組合進(jìn)行以觀察對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)個(gè)改變的組合效果(Fersht等AngewandteChemieInt.Ed.23:467_538(1984))。理性設(shè)計(jì)考慮到蛋白質(zhì)的特性、三維模型和蛋白質(zhì)可以改變的程度之間的關(guān)系是復(fù)雜的。將要在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生的突變定位至三維模型上，并且存在有結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的考慮；此分析意圖增加生成在展示新特性外維持活性的變體的可能性。另外，所篩選的變體數(shù)目與使用隨機(jī)誘變篩選的變體數(shù)目相比相對(duì)較低。通過(guò)了解蛋白質(zhì)的三維模型來(lái)促進(jìn)理性設(shè)計(jì)。三維模型可以通過(guò)在物理上測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法諸如X射線晶體學(xué)和NMR(核磁共振)來(lái)闡明或者可以以計(jì)算機(jī)方式建模。用于在物理上解析(solve)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域中公知的(Schuetz等EMBOJ.254245-4252(2006)；Peterson等Mol.Cell13:665-676(2004)；Allingham等Cell128:1161-1172(2007))。在計(jì)算生物學(xué)中，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)有三種不同預(yù)測(cè)/建模方法；即從頭開(kāi)始(abinitio)、同源性建模和蛋白質(zhì)穿引(proteinthreading)。從頭開(kāi)始或從頭蛋白質(zhì)建模方法設(shè)法“從零開(kāi)始”建造三維蛋白質(zhì)模型，即，基于物理原理而非直接基于先前解析的物理結(jié)構(gòu)。有許多可能的如下規(guī)程，它們或是試圖模擬蛋白質(zhì)折疊或是將一些隨機(jī)方法應(yīng)用于搜索可能的解法(solution)。這些規(guī)程趨于需要大量計(jì)算資源，而且已經(jīng)對(duì)小蛋白質(zhì)實(shí)施過(guò)。同源性建模(modeling)基于合理的假設(shè)，即兩種同源蛋白質(zhì)會(huì)共享極其相似的結(jié)構(gòu)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的折疊比其氨基酸序列在進(jìn)化方面更保守，可以在極其遠(yuǎn)緣的模板上以合理的精確性為靶序列建模，只要靶物與模板之間的關(guān)系可以經(jīng)由序列比對(duì)辨別。已經(jīng)提示了，比較建模的主要瓶頸源于比對(duì)困難，而非源于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，假設(shè)有已知的良好比對(duì)。不令人吃驚的是，同源性建模在靶物和模板具有相似序列時(shí)是最精確的?？梢允褂猛葱越７椒?如由計(jì)算機(jī)程序Modeler(AccelrysInc.)所提供的)來(lái)為同源蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)建模，而不需要通過(guò)X射線或NMR來(lái)解析真實(shí)的結(jié)構(gòu)(Webster"ProteinStructurePrediction,MethodsandProtocols"；MethodsinMolecularBiology；HumanaPress第143卷(2000)及Bourne和ffeissig,"StructuralBioinformatics",Wiley-LissPublisher(2003))。蛋白質(zhì)穿引方法將具有未知結(jié)構(gòu)的靶序列的氨基酸序列穿引通過(guò)分類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊的文庫(kù)。在每種情況中，使用評(píng)分函數(shù)來(lái)評(píng)估序列與結(jié)構(gòu)的相容性，如此選擇最佳的有可能的三維模板來(lái)為靶蛋白質(zhì)建模。此類方法又稱為3D-1D折疊識(shí)別，這是由于其在三維結(jié)構(gòu)與線性蛋白質(zhì)序列之間的相容性分析。此方法還已經(jīng)產(chǎn)生實(shí)施反向折疊搜索的方法，其通過(guò)評(píng)估給定結(jié)構(gòu)與序列的大數(shù)據(jù)庫(kù)的相容性，如此預(yù)測(cè)哪些序列具有生成給定折疊的潛力來(lái)進(jìn)行。一旦創(chuàng)建蛋白質(zhì)的三維模型，這便充當(dāng)用于添加關(guān)于蛋白質(zhì)已知的別的信息的基礎(chǔ)。鑒定已知為基本活性所需要的蛋白質(zhì)區(qū)域諸如結(jié)合域和活性位點(diǎn)是重要的。蛋白質(zhì)的保守區(qū)可提供對(duì)在進(jìn)行修飾時(shí)應(yīng)當(dāng)避免的蛋白質(zhì)區(qū)域的了解。了解活性所需要的蛋白質(zhì)物理結(jié)構(gòu)有助于鑒定可以進(jìn)行修飾的區(qū)域。一般而言，可以進(jìn)行修飾的區(qū)域是那些并不促成結(jié)合域或活性位點(diǎn)形成的。另外，一旦進(jìn)行了改變，選擇進(jìn)行修飾的蛋白質(zhì)區(qū)域不應(yīng)當(dāng)干擾結(jié)合域或活性位點(diǎn)。因此，使用計(jì)算技術(shù)諸如AccelyrsMODELER程序來(lái)將所有對(duì)蛋白質(zhì)的改變定位至三維模型上，以便測(cè)定蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是否得到維持。評(píng)估通過(guò)隨機(jī)誘變或理性設(shè)計(jì)生成的變體蛋白質(zhì)的活性以選擇滿足特定標(biāo)準(zhǔn)的變體。這些特定的標(biāo)準(zhǔn)與蛋白質(zhì)中想要的新特性一致。這些新的特性可以包括但不限于酶催化活性的改變、在較高或較低溫度的活性、在寬的或窄的溫度范圍中的活性、在較高或較低PH的活性、在寬的或窄的pH范圍中的活性、在較高或較低pH對(duì)降解的敏感性、對(duì)蛋白酶消化的易感性升高、或?qū)Φ鞍酌赶目剐陨摺１绢I(lǐng)域中的普通技術(shù)人員會(huì)能夠采用本文中所公開(kāi)的信息，并設(shè)計(jì)和生成一系列具有改變了的蛋白質(zhì)特性或活性的蛋白質(zhì)變體。已經(jīng)采用理性設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)具有特定特性諸如耐受性(Perry和Wetzel，Science226555-557(1984)；Sauer等Biochemistry255992-5998(1986)；Volkin等J.ofBiol.Chem.2622945-2950(1987)；Roesler等ProteinScience91642-1650(2000))、在存在蛋白酶的情況中的穩(wěn)定性(Wyss等AppliedandEnviro.Micro.65359-366(1999))和在低pH的穩(wěn)定性(Kim等AppliedandEnviro.Micro.724397-4403(2006))的蛋白質(zhì)變體。也已經(jīng)采用理性設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)殺昆蟲(chóng)性原毒素，其在暴露于昆蟲(chóng)腸時(shí)受到昆蟲(chóng)腸蛋白酶切割以釋放殺昆蟲(chóng)性毒素(美國(guó)專利申請(qǐng)10/229,346)。本文中描述了出于開(kāi)發(fā)具有增強(qiáng)的對(duì)蛋白酶的易感性的蛋白質(zhì)(其中易感性導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活)的目的而使用理性設(shè)計(jì)技術(shù)的方法。涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的下列因素可促成提高蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性糖基化程度和位置、二硫鍵形成的程度、潛在蛋白酶切割位點(diǎn)和可改變成含有高度有利的蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)環(huán)的位置和序列。糖基化對(duì)酶的特性可以具有許多影響。第一，它對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以具有影響，或者它可以影響催化特性。第二，在酸性碳水化合物修飾的情況中，它可以影響蛋白質(zhì)的pl，而且由此改變純化過(guò)程中的蛋白質(zhì)行為。并且第三，通過(guò)使代謝能量轉(zhuǎn)向，它可以降低酶的表達(dá)水平。(Wyss等AppliedandEnviro.Micro.65:359_366(1999))。對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化牽涉將聚糖鏈添加至蛋白質(zhì)，這能在物理上干擾蛋白酶接觸結(jié)合位點(diǎn)的能力(Bagger等BiOChemiStry4210295-10300(2003))。降低蛋白質(zhì)的糖基化可以通過(guò)展開(kāi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以容許蛋白酶與潛在的結(jié)合位點(diǎn)的相互作用來(lái)提高對(duì)蛋白酶的敏感性。高度穩(wěn)定性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(或蛋白質(zhì)折疊)能阻止蛋白質(zhì)解折疊得足以容許蛋白酶接近三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的潛在切割位點(diǎn)。二硫鍵通過(guò)在蛋白質(zhì)折疊時(shí)在彼此進(jìn)入物理接近的半胱氨酸殘基之間形成橋來(lái)促成三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這些半胱氨酸殘基在檢查蛋白質(zhì)的線性氨基酸序列時(shí)并不必然彼此接近。參見(jiàn)Stryer，Biochemistry第4版，W.H.FreemanandCo,NewYork(1995)。替換特定的半胱氨酸殘基可以降低分子內(nèi)半胱氨酸鍵的程度，這可以使蛋白質(zhì)脫穩(wěn)定化(destabilize)得足以容許蛋白酶接近折疊蛋白質(zhì)內(nèi)部的切割位點(diǎn)ο摻入蛋白酶切割位點(diǎn)可以提高對(duì)蛋白酶的敏感性。可以改變與高親和力蛋白酶切割位點(diǎn)相似的天然蛋白質(zhì)序列以反映高度有利的位點(diǎn)。對(duì)蛋白質(zhì)序列的此類修飾代表對(duì)蛋白質(zhì)的次要修飾?；蛘撸梢詫⒏叨扔欣牡鞍酌盖懈钗稽c(diǎn)從頭引入蛋白質(zhì)中，這代表對(duì)蛋白質(zhì)的主要修飾。在任一種情況，即對(duì)蛋白質(zhì)的次要或主要改變中，使用三維模型來(lái)鑒定折疊蛋白質(zhì)中作為此類修飾候選的區(qū)域。具體地，暴露于周?chē)橘|(zhì)的蛋白質(zhì)環(huán)是改變的候選。另外，這些環(huán)不應(yīng)干擾蛋白質(zhì)中的結(jié)合位點(diǎn)或活性位點(diǎn)。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)耐受極端條件諸如溫度和pH的能力有聯(lián)系。結(jié)構(gòu)特征諸如糖基化和二硫鍵形成促成蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而且還可以促成提高蛋白質(zhì)耐受溫度和PH的極端條件的能力。靶向這些相同的結(jié)構(gòu)特征，即糖基化和二硫鍵形成來(lái)工程化改造酶易感性。在極端條件時(shí)的活性與增強(qiáng)折疊蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的特征的解偶聯(lián)是工程化改造酶易感性蛋白質(zhì)的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。上文所述關(guān)于工程化改造具有增強(qiáng)的對(duì)蛋白酶的易感性的蛋白質(zhì)的考慮導(dǎo)致設(shè)計(jì)影響糖基化、二硫鍵形成和創(chuàng)建高度有利的蛋白酶切割位點(diǎn)的多個(gè)突變。蛋白質(zhì)序列中預(yù)測(cè)的改變可以作為單一改變或者以各種組合產(chǎn)生(Roesler等ProteinScience91642-1650(2000))。例如，有可能的是，發(fā)現(xiàn)多個(gè)糖基化位點(diǎn)存在于特定的蛋白質(zhì)上。這些位點(diǎn)可以每次改變一個(gè)或者它們可以在單一變體中全部改變。作為另一個(gè)例子，可以將糖基化位點(diǎn)和改變二硫鍵組合入單一變體中。實(shí)質(zhì)上，可以認(rèn)為經(jīng)由對(duì)三維模型的分析鑒定的變異是可以任意組合以生成供測(cè)試用的變體的模塊。術(shù)語(yǔ)域和位點(diǎn)在提及蛋白質(zhì)時(shí)可互換使用，可以指蛋白質(zhì)內(nèi)鑒定的線性氨基酸序列或者可以指在蛋白質(zhì)處于折疊狀態(tài)時(shí)存在的結(jié)構(gòu)區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種通過(guò)理性設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)提高酶易感性的方法，其中為蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)建模，隨后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特征鑒定，其選自下組結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、二硫鍵、和暴露于周?chē)橘|(zhì)的蛋白質(zhì)環(huán)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種通過(guò)理性設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)提高酶易感性的方法，其中首先將靶蛋白質(zhì)工程化改造成具有更加穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。可以經(jīng)由理性設(shè)計(jì)或隨機(jī)誘變技術(shù)來(lái)提高穩(wěn)定性。可以通過(guò)蛋白質(zhì)在較高的溫度條件(熱力學(xué)穩(wěn)定性)或極端PH條件下發(fā)揮功能的能力來(lái)測(cè)量穩(wěn)定性。在促成更加緊湊的三維結(jié)構(gòu)(構(gòu)象穩(wěn)定性)的對(duì)折疊結(jié)構(gòu)的改變外，穩(wěn)定性還可以采用許多形式諸如穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用的二硫鍵。用于將熱穩(wěn)定性工程化改造入蛋白質(zhì)中的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的諸如Nosoh等TIBTECH卷816-20(1990)和Imanaka等Nature卷324:695_697(1986)。熱力學(xué)穩(wěn)定性關(guān)于溫度和活性進(jìn)行定義，并通過(guò)比較變體與起始蛋白質(zhì)的活性來(lái)測(cè)定。如下測(cè)定蛋白質(zhì)的溫度最高值，即在規(guī)定的溫度保持蛋白質(zhì)，然后測(cè)量蛋白質(zhì)的活性。溫度最高值定義為蛋白質(zhì)于規(guī)定的溫度保持5分鐘后保留約50%活性所處的溫度。熱穩(wěn)定性變體指其中所述變體于比蛋白質(zhì)的最高溫度高5°C的溫度保持5分鐘時(shí)展示至少50%的活性的。例如，若起始蛋白質(zhì)于45°C保持5分鐘時(shí)保留50%的活性，則熱穩(wěn)定性變體會(huì)是于50°C保持5分鐘時(shí)保留至少50%活性的所有變體。基于上述公開(kāi)內(nèi)容，可以將任何蛋白質(zhì)工程化改造為更加酶易感性的。在工業(yè)方法中具有功能的蛋白質(zhì)充當(dāng)用于靶向工程化改造的良好候選物，因?yàn)榭梢呀?jīng)知道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性。結(jié)構(gòu)和功能信息起基礎(chǔ)的作用，用于進(jìn)一步鑒定要為酶易感性的蛋白質(zhì)。存在對(duì)工業(yè)方法具有重要性的多種蛋白質(zhì)，包括促成增值性狀的酶或蛋白質(zhì)、在轉(zhuǎn)基因植物中賦予對(duì)疾病或有害生物的抗性的蛋白質(zhì)、對(duì)轉(zhuǎn)基因植物賦予除草劑耐受性的蛋白質(zhì)或酶。賦予或促成增值性狀的基因的例子包括但不限于分解植酸鹽(即一種在基于谷物的動(dòng)物飼料中的非營(yíng)養(yǎng)元素)的肌醇六磷酸酶。例如，參見(jiàn)VanHartingsveldt等，Gene127:87(1993)，其關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開(kāi)內(nèi)容。可以引入降低植酸鹽含量的基因。在玉蜀黍中，這可以例如如下實(shí)現(xiàn)，即克隆與對(duì)特征為低水平植酸的玉蜀黍突變體負(fù)責(zé)的單一等位基因有關(guān)的DNA，然后將其再導(dǎo)入。參見(jiàn)Raboy等，Maydica35:383(1990)。通過(guò)例如用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見(jiàn)Shiroza等，J.Bacteriol.170:810(1988)(變異鏈球菌(Sti^ptococcusmutans)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)、Steinmetz等，MolGen.Genet.200=220(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)、Pen等，Bio/Technology10=292(1992)(生成表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物)、Elliot等，PlantMolec.Biol.21515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)、S.o-gaard等，J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)、及Fisher等，PlantPhysiol.1021045(1993)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II)。改變食物味道的蛋白質(zhì)諸如蛋白質(zhì)甜蛋白(brrazein)。也可以將賦予對(duì)有害生物或疾病的基因工程化改造為酶易感性的。植物防御常常受到植物中的疾病抗性基因產(chǎn)物與病原體中的相應(yīng)無(wú)毒力基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物以工程化改造對(duì)特定病原體菌株有抗性的植物。參見(jiàn)例如Jones等，Science266789(1994)(克隆關(guān)于對(duì)葉霉菌(Cladosporiumfulvum)的抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等，Science2621432(1993)(關(guān)于對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性的番茄Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等Cell781089(1994)(關(guān)于對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性的擬南芥(Arabidopsis)RSP2基因)。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或模仿其的合成多肽。參見(jiàn)例如Geiser等，Gene48:109(1986)，其披露了Btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA分子可以以例如ATCC編號(hào)40098、67136、31995和31998購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(Rockville,Md.)。存在蘇云金芽孢桿菌蛋白的許多例子，包括但不限于Cry1A、CrylB,Cry3A、Cry4A、和Cry9C。如由VanDamme等，PlantMolec.Biol.2425(1994)(其披露了數(shù)種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列)所描述的凝集素。如PCT申請(qǐng)US93/06487(其教導(dǎo)了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對(duì)昆蟲(chóng)有害生物的殺幼蟲(chóng)劑的用途)中所描述的維生素結(jié)合蛋白諸如抗生物素蛋白。酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑，例如Abe等，J.Biol.Chem.26216793(1987)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)、Huub等，PlantMolec.Biol.21985(1993)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)、和Sumitani等，Biosci.Biotech.Biochem.571243(1993)(硝孢鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)χ-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)。昆蟲(chóng)特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的有害生物的生理學(xué)。例如參見(jiàn)Regan，J.Biol.Chem.269:9(1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲(chóng)利尿激素受體的DNA)和Pratt等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1631243(1989)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鑒定出抑咽側(cè)體神經(jīng)肽(allostatin))的公開(kāi)內(nèi)容。還可參見(jiàn)美國(guó)專利No.5，266，317，其披露了編碼昆蟲(chóng)特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。本質(zhì)上由蛇、黃蜂等生成的昆蟲(chóng)特異性毒液。例如參見(jiàn)Pang等，Gene116:165(1992)，關(guān)于編碼蝎昆蟲(chóng)毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開(kāi)內(nèi)容。對(duì)生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)中牽涉的酶，例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合物、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，無(wú)論是天然的還是合成的。參見(jiàn)以Scott等名義的PCT申請(qǐng)WO93/02197，其披露了纖維二糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有幾丁質(zhì)酶編碼序列的DNA分子可以例如以編號(hào)39637和67152獲自ATCC。還可參見(jiàn)Kramer等，InsectBiochem.Molec.Biol.23691(1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草鉤蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，PlantMolec.Biol.21673(1993)(其提供了歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見(jiàn)Botella等，PlantMolec.Biol.24=757(1994)(其關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等，PlantPhysiol.104=1467(1994)(其提供了玉蜀黍鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開(kāi)內(nèi)容。膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑，例如參見(jiàn)Jaynes等，PlantSci.8943(1993)的公開(kāi)內(nèi)容，其關(guān)于異源表達(dá)殺菌肽-β-溶解酶類似物以給予對(duì)茄假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植物。病毒侵入性蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素(complextoxin)。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的積累賦予對(duì)由衍生外殼蛋白基因的病毒以及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見(jiàn)Beachy等，Ann.Rev.Phytopathol.28451(1990)。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予針對(duì)苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、煙草蝕斑病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。自其衍生的昆蟲(chóng)特異性抗體或免疫毒素。如此，靶向昆蟲(chóng)腸中至關(guān)重要的代謝功能的抗體會(huì)使受影響的酶失活，殺死昆&。JiLTaylor,，才商胃#497，SeventhInt'1SymposiumOnMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland,1994)(在轉(zhuǎn)基因煙草中經(jīng)由單鏈抗體片段的生成的酶促失活)。病毒特異性抗體。參見(jiàn)例如Tavladoraki等，Nature366:469(1993)，其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物免于病毒攻擊。本質(zhì)上由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白。如此，真菌a-l，4_D-內(nèi)聚半乳糖醛酸酶通過(guò)使植物細(xì)胞壁同-a-l，4-D-半乳糖醛酸酶溶解來(lái)促進(jìn)真菌定殖和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見(jiàn)Lamb等，Bio/Technology101436(1992)。Toubart等，PlantJ.2=367(1992)描述了編碼豆內(nèi)聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。本質(zhì)上由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemarm等，Bio/Technology10=305(1992)已經(jīng)顯示了，表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物具有升高的對(duì)真菌疾病的抗性。也可以將例如賦予對(duì)除草劑的抗性的基因工程化改造為酶易感性的。例如，介導(dǎo)對(duì)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑諸如咪唑啉酮(imidazalinone)或磺酰脲(sulfonylurea)的耐受性的蛋白質(zhì)。在此種類中的例示性基因編碼突變型ALS和AHAS酶，如分別由例如Lee等，EMBOJ.71241(1988)和Miki等，Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。草甘膦(分別由突變型5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合醇(5-enolpyruvl-3-phosphikimatesynthase,EPSP)禾口aroA基因貝武予的抗性)和其它膦酰基化合物諸如草丁磷(glufosinate)(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)和吸水鏈霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar)基因)、和吡啶氧(pyridinoxy)或苯氧丙酸類和環(huán)己烷類(cycloshexone)(ACC酶抑制劑編碼基因)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4，940，835，其披露了能賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以以ATCC編號(hào)39256獲得，而突變型基因的核苷酸序列披露于美國(guó)專利No.4，769，061。歐洲專利申請(qǐng)No.0333033和美國(guó)專利No.4，975，374披露了賦予對(duì)除草劑諸如L-膦絲菌素的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。歐洲申請(qǐng)No.0242246中提供了膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。DeGreef等，Bio/Technology761(1989)描述了表達(dá)編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的生成。賦予對(duì)苯氧丙酸類和環(huán)己烷類諸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子是由Marshall等，Theor.Appl.Genet.83=435(1992)所描述的Accl-Sl、Accl-S2和Accl-S3基因。抑制光合作用的除草劑諸如三嗪(psbA和gs+基因)和苯基氰(benzonitrile)(腈水解酶基因)。Przibilla等，PlantCell3169(1991)描述了用編碼突變型psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(chóng)(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于美國(guó)專利No.4，810,648，而含有這些基因的DNA分子以ATCC編號(hào)53435、67441和67442可獲得。Hayes等，BiochemJ.285173(1992)描述了編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)。可以工程化改造酶易感性以使蛋白質(zhì)對(duì)任何蛋白酶易感。蛋白酶指水解肽鍵的酶(Barrett,等HandbookofProteolyticEnzymes,AcademicPress,SanDiego,SanFrancisco,NewYork,Boston,London,Sydney,Tokyo(1998))。蛋白酶可稱為肽酶,而且一般落入絲氨酸肽酶、半胱氨酸肽酶、天冬氨酸肽酶、和金屬肽酶的種類之一中。特定的蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰內(nèi)肽酶、組織蛋白酶G、類胰凝乳蛋白酶(chymase)、類胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶、胱天蛋白酶-1、和二肽酶E。蛋白酶的廣泛列表可參見(jiàn)上文所提及的HandbookofProteolyticEnzymes。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與至少一種調(diào)控元件諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列，或其任何組合，和任選地，與信號(hào)序列(其將酶易感性蛋白質(zhì)引導(dǎo)至特定的細(xì)胞位置，例如液泡、糊粉、胚或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))可操作連接。表達(dá)盒還可以包含表達(dá)酶易感性蛋白質(zhì)需要或選擇的任何別的元件。此類元件包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外部序列諸如內(nèi)含子、病毒序列、和意圖用于將基因產(chǎn)物靶向特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的序列?？刹僮鬟B接的指作為同一核酸分子中合適地定位和定向的一部分連接的。在調(diào)控元件的情況中，調(diào)控元件的定向(即有義或反義)不能影響調(diào)控元件影響轉(zhuǎn)錄的能力。啟動(dòng)子的代表性例子包括但不限于已知在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。原核細(xì)胞定義為沒(méi)有細(xì)胞核的細(xì)胞，并且意圖包括最近鑒定的古細(xì)菌種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含細(xì)菌啟動(dòng)子。細(xì)菌啟動(dòng)子的例子包括但不限于大腸桿菌Iac或trp、噬菌體入卩[啟動(dòng)子、1肌1、1肌233、174扒和APro真核啟動(dòng)子包括但不限于CMV即時(shí)早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR、和小鼠金屬硫蛋白-I。原核和真核啟動(dòng)子一般記載于Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,(1987)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與能夠在酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。能夠在酵母宿主中表達(dá)的任何啟動(dòng)子可以作為啟動(dòng)子使用。例子包括糖酵解途徑中的己糖激酶等基因的啟動(dòng)子和諸如gal1啟動(dòng)子、gal10啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、MFa-I啟動(dòng)子和CUP1啟動(dòng)子等啟動(dòng)子。酵母啟動(dòng)子的例子可參見(jiàn)MacPherson等Micro,andMolec.Bio.Revs.70583-604(2006)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與能夠在絲狀真菌中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接?？梢允褂媚軌蛟诮z狀真菌中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。例子是來(lái)自曲霉屬(Aspergillus)的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶(DeVries等Micro,andMolec.Bio.Revs.65=497-522(2001))或來(lái)自木霉屬(Trichoderma)的纖維素酶(纖維二糖水化酶)的啟動(dòng)子、糖酵解途徑中的酶諸如磷酸甘油酸酯激酶(Pgk)和甘油醛3-磷酸脫氫酶(gpd)等的啟動(dòng)子。絲狀真菌中表征的啟動(dòng)子的例子可參見(jiàn)Lorang等Appl.andEnviro.Micro.671987-1994(2001)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與能夠在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。要在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的選擇會(huì)決定酶易感性蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中的空間和時(shí)間表達(dá)樣式。選定的啟動(dòng)子會(huì)在優(yōu)選的細(xì)胞類型(諸如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮層細(xì)胞)中或在優(yōu)選的組織或器官(例如根、葉或花)中或在優(yōu)選的植物發(fā)育階段(例如花發(fā)育、葉發(fā)育或植物的生長(zhǎng)階段)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且選擇應(yīng)當(dāng)反映基因產(chǎn)物想要的積累位置。或者，選定的啟動(dòng)子可以在多種誘導(dǎo)條件下驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子在其強(qiáng)度，即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力方面有所變化。根據(jù)所利用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用眾多合適的啟動(dòng)子之任一種，包括基因的天然啟動(dòng)子。對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)有用的啟動(dòng)子包括那些誘導(dǎo)型的，病毒的、合成的、組成性的、時(shí)間調(diào)節(jié)性的、空間調(diào)節(jié)性的、組織特異性的、和時(shí)空調(diào)節(jié)性的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與能夠在植物中表達(dá)的組成性啟動(dòng)子可操作連接。已經(jīng)描述過(guò)的一些組成性啟動(dòng)子的例子包括稻肌動(dòng)蛋白1(Wang等，Mol.Cell.Biol.,123399(1992)；美國(guó)專利No.5，641，876；McElroy等PlantCell2163-171(1990))。CaMV35S(Odell等，Nature313:810(1985))、CaMV19S(Lawton等，Mol.Cell.Biol.7:335(1987))、蔗糖合酶、和泛素啟動(dòng)子(Binet等PlantScience7987-94(1991)；Christensen等PlantMolec.Biol.12:619_632(1989)；Norris等，PlantMol.Biol.21895-906(1993))。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與誘導(dǎo)型植物啟動(dòng)子可操作連接。已經(jīng)描述過(guò)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括ABA和膨壓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子(Schwob等，PlantJ.4:423(1993))、UDP葡萄糖類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Ralston等，Genetics,119185(1988))、MPI蛋白酶抑制劑啟動(dòng)子(Cordero等，PlantJ.6:141(1994))、和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子(Kohler等，PlantMo.Biol.291293(1995)；Quigley等，J.Mol.Evol.29:412(1989)；Martinez等，J.Mol.Biol，208551(1989))；美國(guó)專利No.5，614，395中描述的化學(xué)誘導(dǎo)型PR-Ia啟動(dòng)子；PR-Ia啟動(dòng)子還是傷口誘導(dǎo)型的(Lebel等，PlantJ.16:223_233(1998))?？梢圆捎枚喾N化學(xué)調(diào)節(jié)劑來(lái)誘導(dǎo)選定的多核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，包括美國(guó)專利No.5，523，311和5，614，395中所披露的水楊酸化合物、苯并噻二唑、和異煙酸。此類啟動(dòng)子是例如來(lái)自構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的alcA基因啟動(dòng)子(Caddick等Nat.Biotechnol16:177-180(1998))。在構(gòu)巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，其表達(dá)在存在化學(xué)誘導(dǎo)的情況中受到AlcR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。還可以使用糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua(1997)ThePlantJournal11:605_612)。傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也可適合于基因表達(dá)。已經(jīng)描述了多種此類啟動(dòng)子(例如Xu等PlantMolec.Biol.22:573_588(1993)，Logemann等PlantCell1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，PlantMolec.Biol.22:783_792(1993)，F(xiàn)irek等PlantMolec.Biol.22129-142(1993)，Warner等PlantJ.3191-201(1993))。數(shù)種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中已知的。許多記載于綜述Gatz，CurrentOpinioninBiotechnology7168(1996)(還可參見(jiàn)Gatz,AnnualRev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol48:891997)。例子包括四環(huán)素阻抑物系統(tǒng)、Lac阻抑物系統(tǒng)、銅誘導(dǎo)型系統(tǒng)、水楊酸鹽誘導(dǎo)型系統(tǒng)(諸如I3Rla系統(tǒng))、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型(AoyamaT.等，N_HPlantJournal,11=605(1997))和蛻皮激素誘導(dǎo)型系統(tǒng)(專利申請(qǐng)WO01/52620)。還包括苯磺酰胺誘導(dǎo)型(美國(guó)專利No.5364，780)和乙醇誘導(dǎo)型(WO97/06269、WO97/06268和WO02/061102)系統(tǒng)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子和WO02/061102中所描述的嵌合昆蟲(chóng)激素和受體系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其中酶易感性蛋白質(zhì)與能夠在植物中表達(dá)的組織優(yōu)選性啟動(dòng)子可操作連接。已經(jīng)描述過(guò)的組織優(yōu)選性啟動(dòng)子的例子包括但不限于凝集素(Vodkin,Prog.Glin.Bio.Res.，13887(1983)；Lindstrom等，Der.Genet.，(1990))、玉米醇脫氫酶1(Vogel等，EMBOJ.，11:157(1989)；Dennis等，NucleicAcidsRes.,12:3983(1984))、玉米集光復(fù)合物(Simpson,PlantMo.Bio.，19699(1986)；Bansal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:3654(1992))、玉米熱休克蛋白(Odell等，Nature,313810(1985))、豌豆小亞基RuBP羧化酶(Poulsen等，Mol.Gen.Genet.205193(1986))、Ti質(zhì)粒甘露堿合酶(Langridge等，Cell34:1015(1989))、Ti質(zhì)粒胭脂堿合酶(Langridge等，Cell34:1015(1989))、矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(vanTunen等，EMBOJ.71257(1988))、豆富含甘氨酸的蛋白質(zhì)l(Keller等，EMBOJ.81309(1989))、截短的CaMV35s(Odell等，Nature313:810(1985))、馬鈴薯Patatin(Wenzler等，PlantMol.Biol.13:347(1989))、根細(xì)胞(Yamamoto等，NucleicAcidsRes.18:7449(1990))、玉蜀黍玉米醇溶蛋白(ReinaNucleicAcidsRes.187449(1990)；KrizMol.Gen.Genet207:90(1987))；Wandelt等，NucleicAcidsRes.17:2354(1989)；Langridge等，Cell34:1015(1983)；Reina等，NucleicAcidsRes.18:7449(1990))、球蛋白-1(Belanger等，Genetics129863(1991))、α-微管蛋白、cab(Sullivan等，Mol.Gen.Genet.215:431(1989))、PEPC酶(Hudspeth等，PlantMo.Bio.,12:579(1989))、R基因復(fù)合物有關(guān)的啟動(dòng)子(Chandler等，PlantCelll:1175(1989))、和查耳酮合酶啟動(dòng)子(Franken等，EMBOJ.10:2605(1991))。這些包括例如rbcS啟動(dòng)子，優(yōu)選用于綠色組織；0CS、n0S和mas啟動(dòng)子，它們?cè)诟蚴軅娜~組織中具有較高的活性；指導(dǎo)根中的表達(dá)增強(qiáng)的截短的(-90至+8)35S啟動(dòng)子、指導(dǎo)根中的表達(dá)的α-微管蛋白基因和指導(dǎo)胚乳中的表達(dá)的自玉米醇溶蛋白貯存蛋白基因衍生的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是胚乳優(yōu)選性啟動(dòng)子，諸如玉蜀黍Y-玉米醇溶蛋白谷蛋白-2啟動(dòng)子，或玉蜀黍27-KDY-玉米醇溶蛋白谷蛋白_2啟動(dòng)子(Woo等ThePlantCell13=2297-2317(2001))或玉蜀黍ADP-葡萄糖焦磷酸化酶啟動(dòng)子(Brangeon，等PlantPhysiol.Biochem.35:847_858(1997))。啟動(dòng)子可以是胚特異性啟動(dòng)子諸如玉蜀黍球蛋白1或玉蜀黍油質(zhì)蛋白18KD啟動(dòng)子(Qu等J.ofBiol.Chem.265:2238-2243(1990)。在多細(xì)胞生物體的情況中，啟動(dòng)子還可以是對(duì)特定組織、器官或發(fā)育階段特異性的。此類啟動(dòng)子的例子包括但不限于玉蜀黍(Zeamays)ADP-gpp(Greene等Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513342-13347(1998))和玉蜀黍Y-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(Woo等ThePlantCell13:2297-2317(2001))。已經(jīng)報(bào)告了植物中的數(shù)種組織特異性調(diào)節(jié)性基因和/或啟動(dòng)子。這些包括但不限于編碼種子貯存蛋白(諸如油菜籽蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)、和菜豆蛋白)、玉米醇溶蛋白或油體蛋白(諸如油質(zhì)蛋白)的基因、或脂肪酸生物合成(包括?；d體蛋白、硬脂酰-ACP去飽和酶、和脂肪酸去飽和酶(fad2-1))中牽涉的基因、和胚發(fā)育期間表達(dá)的其它基因(諸如Bce4，參見(jiàn)例如EP255378和Kridl等，SeedScienceResearchl:209(1991))。對(duì)于種子特異性表達(dá)也有用的是豌豆豌豆球蛋白啟動(dòng)子(Czako等，Mol.Gen.Genet.，23533(1992)；還可參見(jiàn)美國(guó)專利No.5，625，136))。對(duì)于在成熟的葉中表達(dá)有用的其它啟動(dòng)子是那些在衰老開(kāi)始時(shí)開(kāi)啟的，諸如來(lái)自擬南芥的SAG啟動(dòng)子(Gan等，Science270:1986(1995))。根優(yōu)選性啟動(dòng)子包括由deFramond(FEBS290103-106(1991))所描述的和還記載于美國(guó)專利No.5，466，785的玉蜀黍金屬硫蛋白樣(MTL)基因的啟動(dòng)子。專利申請(qǐng)WO93/07278描述了玉蜀黍trpA基因(其優(yōu)先在木髓細(xì)胞中表達(dá))的分離。Hudspeth等(PlantMolecBiol12:579-589(1989))已經(jīng)描述了編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉蜀黍基因?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，使用此基因的啟動(dòng)子來(lái)在轉(zhuǎn)基因植物中以葉特異性方式驅(qū)動(dòng)任何基因的表達(dá)。W093/07278描述了花粉細(xì)胞中表達(dá)的玉蜀黍鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶(CDPK)基因的分離。在開(kāi)花至果實(shí)發(fā)育(至少直至開(kāi)始成熟)時(shí)或此期間表達(dá)的一類果實(shí)特異性啟動(dòng)子記載于U.S.4，943，674。已經(jīng)分離出棉纖維中優(yōu)先表達(dá)的CDNA克隆(John等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5769(1992))。在果實(shí)發(fā)育期間展示差別表達(dá)且來(lái)自番茄的CDNA克隆已經(jīng)進(jìn)行過(guò)分離和表征(Mansson等，Gen.Genet.，200356(1985),Slater等，PlantMol.Biol.5:137(1985))。多聚半乳糖醛酸酶基因的啟動(dòng)子在果實(shí)成熟中是有活性的。多聚半乳糖醛酸酶基因記載于美國(guó)專利No.4，535，060、美國(guó)專利No.4，769，061、美國(guó)專利No.4，801，590、和美國(guó)專利No.5，107，065，而成熟增強(qiáng)型番茄多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子記載于Bird等，PlantMolecularBiology11:651(1988)。組織特異性啟動(dòng)子的其它例子包括那些在對(duì)葉損害(例如嚼食昆蟲(chóng)造成的)后在葉細(xì)胞中、在塊莖(例如Patatin基因啟動(dòng)子)中、和在纖維細(xì)胞(發(fā)育調(diào)節(jié)性纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)的例子是E6(John等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895769(1992))中指導(dǎo)表達(dá)的。E6基因在纖維中最具活性，雖然在葉、胚珠和花中找到低水平的轉(zhuǎn)錄物。一些“組織特異性”或“組織優(yōu)選性”啟動(dòng)子的組織特異性可能不是絕對(duì)的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用白喉毒素序列來(lái)測(cè)試。也可以通過(guò)組合不同組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)具有“滲漏”表達(dá)的組織優(yōu)選性表達(dá)(Beals等，PlantCell9:1527(1997))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以分離其它組織優(yōu)選的啟動(dòng)子(參見(jiàn)U.S.5，589，379)。組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子并不意圖解釋為僅在特定的組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。組織特異性或組織優(yōu)選性指促進(jìn)特定組織進(jìn)行表達(dá)但對(duì)組織類型的這種促進(jìn)并不總是絕對(duì)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其包含與靶向序列可操作連接的酶易感性蛋白質(zhì)。靶向序列指將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的特定基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄物引導(dǎo)至或?qū)⒌鞍踪|(zhì)引導(dǎo)至特定的胞內(nèi)或胞外環(huán)境的任何序列。術(shù)語(yǔ)靶向序列、分揀(sorting)序列和信號(hào)序列可互換。靶向序列包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽或保留序列，它們可以是不同肽序列或者可以組合使用，或是直接連接在一起或是單獨(dú)地或多重地與酶易感性蛋白質(zhì)連接。一般而言，會(huì)通過(guò)將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)序列的DNA序列連接至特定基因的多核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向。可以在酶易感性肌醇六磷酸酶的氨基端(N端)或在酶易感性肌醇六磷酸酶的羧基端(C端)連接轉(zhuǎn)運(yùn)序列。所得的轉(zhuǎn)運(yùn)肽分別會(huì)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的胞內(nèi)、或胞外目的地，然后可以在翻譯后除去。轉(zhuǎn)運(yùn)肽通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)胞內(nèi)膜(例如液泡、小泡、質(zhì)體和線粒體膜)來(lái)起作用，或者引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過(guò)胞外膜。在植物中，信號(hào)序列可以將由多核苷酸編碼的多肽靶向至植物內(nèi)的特定區(qū)室。此類靶物的例子包括但不限于液泡、造粉體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、質(zhì)外體或淀粉粒。信號(hào)序列的例子包括用于靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌入質(zhì)外體中的玉蜀黍Y-玉米醇溶蛋白N端信號(hào)序列(Torrent等，PlantMol.Biol.34139(1997))。另一種信號(hào)序列是用于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保留多肽的氨基酸序列SEKDEUMunro等Cell48:899(1987))。也可以通過(guò)與蠟樣造粉體靶向肽融合(Klosgren等，Mol.Gen.Genet.203=237(1986))將多肽靶向至造粉體或淀粉粒。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種包含如下核酸分子的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物部分或植物，所述核酸分子編碼包含與信號(hào)序列可操作連接的酶易感性蛋白質(zhì)的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含包含與酶易感性蛋白質(zhì)可操作連接的Y-玉米醇溶蛋白N端信號(hào)序列的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含包含與酶易感性蛋白質(zhì)的C端可操作連接的SEKDEL的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含包含與酶易感性蛋白質(zhì)可操作連接的N端蠟樣造粉體靶向肽的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含包含與酶易感性蛋白質(zhì)的C端可操作連接的蠟樣淀粉包囊域的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其包含酶易感性蛋白質(zhì)，而且進(jìn)一步包含用于基因表達(dá)的增強(qiáng)子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多序列增強(qiáng)自轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，并且這些序列可以與編碼酶易感性蛋白質(zhì)的多核苷酸一起使用以提高其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。內(nèi)含子已經(jīng)表明了用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的潛力。例如Callis等GenesandDevelop.1=1183(1987)描述了來(lái)自玉米醇脫氫酶基因的內(nèi)含子，其能夠在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。類似地，Vasil等Mol.Microbiol.3:371(1989)描繪了具有類似增強(qiáng)活性的來(lái)自玉米蔗糖合酶基因的內(nèi)含子。已經(jīng)在許多不同轉(zhuǎn)基因作物中在增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)方面廣泛使用稻肌動(dòng)蛋白1內(nèi)含子。(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231=150(1991))增強(qiáng)子指能刺激啟動(dòng)子活性，而且可以作為啟動(dòng)子固有元件或?yàn)樵鰪?qiáng)特定啟動(dòng)子的水平或組織優(yōu)選性而插入的異源元件的DNA序列。增強(qiáng)子能夠以兩種取向(相對(duì)于感興趣多核苷酸序列基因的5’至3’和3’至5’)起作用，而且能夠甚至在啟動(dòng)子上游或下游移動(dòng)時(shí)發(fā)揮功能。增強(qiáng)子元件的例子是ocs增強(qiáng)子元件。此元件首次鑒定為一種來(lái)自土壤桿菌(Agrobacterium)章魚(yú)堿合酶(ocs)基因的16bp回文增強(qiáng)子(Ellis等，EMBOJ.63203(1987))，而且存在于至少10種其它啟動(dòng)子中(Bouchez等，EMBOJ.8:4197(1989))。增強(qiáng)子元件諸如ocs元件，且特別是多拷貝元件的使用會(huì)起作用來(lái)提高自鄰近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。還已知自病毒衍生的許多非翻譯前導(dǎo)序列增強(qiáng)表達(dá)，而且這些在雙子葉細(xì)胞中是特別有效的。具體地，已經(jīng)顯示了來(lái)自煙草花葉病毒01^，“1-序列”)、玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(MCMV)、和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列在增強(qiáng)表達(dá)方面是有效的(例如Gallie等Nucl.AcidsRes.158693-8711(1987)；Skuzeski等PlantMolec.Biol.1565-79(1990))。本領(lǐng)域中已知的其它前導(dǎo)序列包括但不限于小RNA病毒前導(dǎo)，例如EMCV前導(dǎo)(腦心肌炎5，非編碼區(qū))(Elroy-Stein，0.，F(xiàn)uerst,T.R.，和Moss，B.PNASUSA866126-6130(1989))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)，例如TEV前導(dǎo)(煙草蝕斑病毒)；MDMV前導(dǎo)(玉米矮縮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)，(Macejak等，Nature35390-94(1991)；來(lái)自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的未翻譯前導(dǎo)，(Jobling等，Nature325:622_625(1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)(TMV)，(Gallie,D.R.等，MolecularBiologyofRNA，第237頁(yè)-第256頁(yè)(1989)；和玉米褪綠斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)(MCMV)(Lommel等，Virology81:382-385(1991)。還可參見(jiàn)Della-Cioppa等，PlantPhysiology84:965-968(1987)。INPACT是可用于提高基因表達(dá)的另一種方法(W001/72996)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種表達(dá)盒，其包含與轉(zhuǎn)錄終止子可操作連接的酶易感性蛋白質(zhì)。多種轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)于在表達(dá)盒中的使用是可用的。轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)終止超出轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和正確的mRNA多聚腺苷酸化負(fù)責(zé)。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中發(fā)揮功能的，并且包括但不限于CaMV35S終止子、tml終止子、自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)行生的月因月旨喊合醇終止子(Bevan等Nucl.AcidsRes.，11369(1983))和豌豆rbcSE9終止子、來(lái)自根癌土壤桿菌章魚(yú)堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄物的終止子、和來(lái)自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3’端。若想要的話可以進(jìn)一步包括調(diào)控元件諸如Adh內(nèi)含子l(Callis等，GenesandDevelop.，11183(1987))、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，PlantPhysiol.911575(1989))或TMVω元件(Gallie，等，PlantCell1:301(1989))。方便的植物終止區(qū)可獲自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒，諸如章魚(yú)堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還可參見(jiàn)Guerineau等，Mol.Gen.Genet.，262141(1991)；Mogen等，PlantCell,21261(1990)；Munroe等，Gene，91151(1990)；Ballas等，NucleicAcidsRes.,177891(1989)Joshi等，NucleicAcidRes.,15:9627(1987)。這些可以在單子葉植物和雙子葉植物兩者中使用。另外，可以使用基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子。其它調(diào)控元件包括那些可以由內(nèi)源劑或外源劑(例如鋅指蛋白，包括天然存在的鋅指蛋白或嵌合鋅指蛋白)調(diào)節(jié)的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5，789，538，WO99/48909；WO99/45132；WO98/53060；WO98/53057；WO98/53058；W000/23464；WO95/19431；及WO98/54311。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是適合于轉(zhuǎn)化細(xì)菌的包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化載體。典型地，細(xì)菌表達(dá)載體含有(1)編碼細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的原核DNA元件和提供表達(dá)載體在細(xì)菌宿主中擴(kuò)增和選擇的抗生素抗性基因；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件諸如啟動(dòng)子；(3)控制對(duì)轉(zhuǎn)錄物加工的DNA元件；(4)增強(qiáng)子元件；和(5)與控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件可操作連接的感興趣基因。所使用的表達(dá)載體可以是能夠在上述宿主中自主復(fù)制的(諸如在質(zhì)粒中)或者能夠整合入染色體中的表達(dá)載體，其最初在使編碼酶易感性蛋白質(zhì)的連接基因能夠轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)處含有啟動(dòng)子。舉例而言，合適的載體包括對(duì)于細(xì)菌，PQE70、pQE60、pQE_9(Qiagen)，pBluescriptII(Stratagene)，pTRC99a、pKK223_3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)。此類商品化載體包括例如PKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)禾口GEMl(PromegaBiotec,Madison,Wis.，USA)。然而，可以使用任何其它質(zhì)?；蜉d體，只要它們?cè)谒拗髦锌蓮?fù)制且能維持下去。作為合適的細(xì)菌宿主的代表性例子，可以提及細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌、鏈霉菌(Str印tomyces)、枯草芽孢桿菌；和埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鏈霉菌(Streptomyces)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、和葡萄球菌屬(Staphylococcus)內(nèi)的各種物種，雖然還可以選擇采用其它。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是能夠轉(zhuǎn)化真菌的包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化載體?？梢砸勒誈onni等Agric.Biol.Chem.，51:2549(1987)來(lái)實(shí)現(xiàn)真菌的轉(zhuǎn)化。作為合適真菌宿主的代表性例子，可以提及真菌細(xì)胞諸如屬于曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、脈抱菌屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)等的真菌細(xì)胞，諸如屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、絲孢酵母(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)等的酵母。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是能夠轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化載體。許多真核細(xì)胞系(包括動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞)可用作可進(jìn)行轉(zhuǎn)化以表達(dá)酶易感性蛋白質(zhì)的宿主。昆蟲(chóng)細(xì)胞諸如果蠅(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9；動(dòng)物細(xì)胞諸如CH0、COS或Bowes黑素瘤、C127、3T3、CH0、HeLa和BHK細(xì)胞系。可以使用任何宿主，只要它能表達(dá)感興趣的基因。美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(http://驟w.atcc.org/)維持來(lái)自極其多種來(lái)源的細(xì)胞系，并且可以使用許多這些培養(yǎng)物來(lái)產(chǎn)生能夠表達(dá)酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。適合于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化載體是商品化的，諸如pXTl、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVLSV40(Pharmacia)。用于轉(zhuǎn)化和選擇轉(zhuǎn)基因真核細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是能夠轉(zhuǎn)化植物的包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化載體。植物轉(zhuǎn)化載體、表達(dá)盒和報(bào)告基因的一般描述可參見(jiàn)Gruber，等，MethodsinPlantMolecularBiology&Biotechnology，Glich等編，第89頁(yè)-第119頁(yè)，CRCPress(1993)在某些實(shí)施方案中，預(yù)期可以希望在單子葉植物轉(zhuǎn)化中采用有復(fù)制能力的病毒載體。此類載體包括例如小麥矮縮病毒(WDV)“穿梭”載體諸如pWl-11和pWl-GUS(Ugaki等，Nucl.AcidsRes.,19:371(1991))。這些載體能夠在玉蜀黍細(xì)胞以及大腸桿菌中自主復(fù)制，并且因此可以提供升高的關(guān)于檢測(cè)向轉(zhuǎn)基因細(xì)胞投遞的DNA的靈敏性。復(fù)制型載體對(duì)于投遞側(cè)翼有來(lái)自轉(zhuǎn)座元件諸如Ac、Ds、或Mu的DNA序列的基因也可以是有用的。還預(yù)期轉(zhuǎn)座元件對(duì)于導(dǎo)入缺乏在細(xì)菌中選擇和維持質(zhì)粒載體所必需的元件(例如抗生素抗性基因和DNA復(fù)制起點(diǎn))的DNA片段會(huì)是有用的。還提出轉(zhuǎn)座元件諸如Ac、Ds、或Mu的使用會(huì)積極地促進(jìn)想要的DNA的整合，并且因此增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的頻率。考慮到本公開(kāi)內(nèi)容，可以與本發(fā)明一起采用的載體構(gòu)建會(huì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)(1989)；Gelvin等，PlantMolecularBiologyManual(1990))。制備和使用編碼酶易感性蛋白質(zhì)的核酸分子(多核苷酸)的方法有記載。本領(lǐng)域已知的是，可以通過(guò)針對(duì)宿主的密碼子優(yōu)選優(yōu)化基因的編碼區(qū)來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)。對(duì)于微生物宿主細(xì)胞諸如酵母、細(xì)菌、真菌等中的表達(dá)，對(duì)ORF進(jìn)行密碼子優(yōu)化以進(jìn)行微生物表達(dá)可能是必要的。因而，植物中優(yōu)選的密碼子選擇不同于某些微生物中優(yōu)選的密碼子選擇?？寺〉奈⑸颫RF內(nèi)的密碼子選擇與植物基因(且特別是來(lái)自靶植物的基因)中的選擇的比較會(huì)實(shí)現(xiàn)ORF內(nèi)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選改變的密碼子的鑒定。典型地，植物進(jìn)化已經(jīng)趨向于在單子葉植物的第三個(gè)堿基位置中強(qiáng)烈優(yōu)選核苷酸C和G，而雙子葉植物常常在此位置處使用核苷酸A或T。通過(guò)修飾基因來(lái)?yè)饺胩囟ò修D(zhuǎn)基因物種優(yōu)選的密碼子選擇，可以克服與植物中的高效基因表達(dá)有關(guān)的許多問(wèn)題。簡(jiǎn)言之，獲得指明靶生物體使用的最佳密碼子的密碼子選擇表，并選擇最佳的密碼子來(lái)替換那些在靶多核苷酸中的，然后化學(xué)合成經(jīng)過(guò)優(yōu)化的序列。玉蜀黍優(yōu)選的密碼子記載于美國(guó)專利No.5，625，136。用于將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞宿主中的多種技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可獲得的且是已知的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種轉(zhuǎn)基因宿主，其中宿主維持編碼酶易感性蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。宿主可以選自下組細(xì)菌、真核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物。可以經(jīng)由使用聚乙二醇、氯化鈣、病毒感染、DEAE右旋糖苷、噬菌體感染、電穿孔和本領(lǐng)域中已知的其它方法來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌和許多真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^(guò)包括電穿孔、使用原生質(zhì)球、乙酸鋰等的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)重組載體向酵母中的導(dǎo)入?？梢允褂媚軌?qū)NA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中的任何方法例如電穿孔、磷酸鈣、脂轉(zhuǎn)染等。可以使用桿狀病毒將表達(dá)盒插入昆蟲(chóng)細(xì)胞中(參見(jiàn)例如BaculovirusExpressionVectors,ALaboratoryManual(1992))。例如，可以與桿狀病毒一起將其中已經(jīng)導(dǎo)入重組基因的載體導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞中，從而在培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞的上清液中獲得重組病毒。然后用重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，由此可以表達(dá)蛋白質(zhì)。在此方法中使用的基因?qū)胼d體可以包括例如pLV1392、pVL1393、和pBlueBacIII(它們都是Invitrogen的產(chǎn)物)。桿狀病毒可以是例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒，其是感染某些蛾昆蟲(chóng)的病毒。昆蟲(chóng)細(xì)胞可以是來(lái)自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的卵巢細(xì)胞Sf9和Sf21和作為來(lái)自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢細(xì)胞的High5(Invitrogen)等。為了將具有重組基因的載體和桿狀病毒兩者共導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞中以制備重組病毒，可以使用磷酸鈣或脂轉(zhuǎn)染方法。供轉(zhuǎn)化使用的宿主植物可以來(lái)自任何植物物種，包括但不限于玉米(玉蜀黍)、蕓苔(Brassicasp.)(例如歐洲油菜(B.napus)、蕪青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))；特別是那些作為種子油來(lái)源有用的蕓苔物種諸如蕓苔(canola)；苜蓿(紫苜蓿(Medicagosativa))、禾苗(禾苗(Oryzasativa))、漂麥(漂麥(Secalecereale))、高梁(sorghum)(高粱(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghumvulgare))、黍(millet)(例如珍珠粟(pearlmillet，Pennisetumglaucum)、稷(prosomillet，Panicummiliaceum)、梁(foxtailmillet,Setariaitalica)Λ(fingermillet,Eleusinecoracana))Λ(π]日葵(sunflower,Helianthusannuus)、紅花(safflower,Carthamustinctorius)、小麥(wheat)(普通小麥(Triticumaestivum))、大豆(soybean,Glycinemax)、煙草(tobacco，Nicotianatabacum)、馬鈴暮(potato，Solanumtuberosum)、花生(peanuts)(落花生(Arachishypogaea))、棉(cotton)(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘暮(sweetpotato，Ipomoeabatatus)、木暮(cassava,Manihotesculenta)、咖啡(coffee，Cofeaspp·)、椰子(coconut，Cocosnucifera)、鳳梨(pineapple，Ananascomosus)、柑橘樹(shù)(citrustrees)(柑橘(Citrusspp·))、可可(cocoa，Theobromacacao)、茶(tea，Camelliasinensis)、香舊(banana，Musaspp·)、魚(yú)萼梨(avocado,Perseaamericana)、無(wú)花果(fig,Ficuscasica)、番石檔(guava,Psidiumguajava)、芒果(mango，Mangiferaindica)、撤攬(olive)(油撤攬(Oleaeuropaea))、蕃木瓜(papaya,Caricapapaya)、腰果(cashew，Anacardiumoccidentale)、澳大利亞堅(jiān)果(macadamia，Macadamiaintegrifolia)、杏(almond，Prunusamygdalus)、舌甘菜(sugarbeets，Betavulgaris)、甘庶(sugarcane，Saccharumspp.)、燕麥(oat)、大麥(barley)、蔬菜(vegetable)、觀賞植物(ornamental)、和松桕類(conifer)。蔬菜包括番前(tomatoes,Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如萵苣(Lactucasativa))、綠豆(greenbean)(菜豆(Phaseolusvulgaris))、利馬豆(limabeans，Phaseoluslimensis)、豌豆(pea)(山黧豆(Lathyrusspp.))、禾口黃瓜屬(Cucumis)成員諸如黃瓜(cucumber,C.sativus)、羅馬舌甘瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)、禾口香瓜(muskmelon，C.melo)。觀賞植物包括杜轉(zhuǎn)(azalea，Rhododendronspp·)、繡球(hydrangea,Macrophyllahydrangea)、木樓(hibiscus)(朱樓(Hibiscusrosasanensis))、薔藏/玫瑰(rose)(薔薇(Rosaspp·))、郁金香(tulips，Tulipaspp.)、水仙(daffodils，Narcissusspp.)、_UH(petunias,Petuniahybrida)λ^^tt(carnation,Dianthuscaryophyllus)、一品紅(poinsettia，Euphorbiapulcherrima)、禾口菊(chrysanthemum)。可以釆用的松桕類包括例如松(pine)諸如火炬松(loblollypine,Pinustaeda)、濕地豐公(slashpine,Pinuselliotii)、西黃豐公(ponderosapine,Pinusponderosa)、扭卩十松(lodgepolepine，Pinuscontorta)、禾口福身寸松(Montereypine，Pinusradiata)、花方萁松(Douglas-fir,Pseudotsugamenziesii)；西部鐵杉(Westernhemlock)(力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis))；西特卡云杉(Sitkaspruce)(白云杉(Piceaglauca))；紅杉(redwood)(北美紅杉(Sequoiasempervirens))；冷杉(truefir)諸如銀杉(silverfir)(溫哥華冷杉(Abiesamabilis))和香脂冷杉(balsamfir,Abiesbalsamea)；禾口雪松(cedar)諸如北美喬桕(Westernredcedar，Thujaplicata)和阿拉斯加黃扁桕(Alaskayellow-cedar,Chamaecyparisnootkatensis)。豆禾斗植物包括豆(bean)禾口豌豆(pea)ο豆包括瓜爾豆(guar)、槐豆(locustbean)、葫戸巴(fenugreek)、大豆(soybean)、青刀豆(gardenbean)、豆工豆(cowpea)、綠豆(mungbean)、禾丨J馬豆、蠶豆(favabean)、小扁豆(lentil)、鷹嘴豆(chickpea)等。豆科作物包括但不限于落花生(Arachis)(例如落花生(peanut)、野豌豆(Vicia)(例如廣布野豌豆(crownvetch)、毛苕子(hairyvetch)、赤豆(adzukibean)、綠豆(mungbean)、和鷹嘴豆)、羽扇豆(Lupinus)(例如羽扇豆(lupine)、車(chē)軸草(trifolium))、菜豆(Phaseolus)(例如菜豆(commonbean)和利馬豆)、豌豆(Pisum)(例如蕓豆(fieldbem))、草木犀(Melilotus)(例如三葉草(clover))、苜蓿(Medicago)(例如苜蓿)、蓮(Lotus)(例如車(chē)軸草(trefoil))、小扁豆(lens)(例如小扁豆(lentil))，和馬棘(falseindigo)。作為宿主植物使用的草料和草皮草包括但不限于、里予#(orchardgrass)(tallfescue)、黑胃胃(perennialryegrass)>匍匍剪股穎(creepingbentgrass)、柳枝稷(switchgrass,Panicumvirgatum)、芒屬(Miscanthus)禾口小糖草(redtop)。宿主植物包括但不限于作物植物或或用于產(chǎn)生食物或飼料的植物，例如玉蜀黍、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉、向日葵、紅花、落花生、高粱、小麥、燕麥、黑麥、黍、番茄、大麥、稻、番茄、馬鈴薯、南瓜、甜瓜(melon)、甘蔗、豆類作物(例如豌豆、豆和大豆)、和含淀粉塊莖/根(例如馬鈴薯、甘薯、木薯、芋、美人蕉(carma))、和甜菜等。供植物用的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)牽涉原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這可以通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、顆粒轟擊介導(dǎo)的投遞、或顯微注射來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些技術(shù)的例子記載于Paszkowski等，EMBOJ3:2717_2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)，Reich等，Biotechnology41001-1004(1986)，及Klein等，Nature32770-73(1987)。使用土壤桿菌進(jìn)行的單子葉植物轉(zhuǎn)化也已經(jīng)有記載。參見(jiàn)WO94/00977和美國(guó)專利No.5，591，616。在每種情況中，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成全植物。許多載體可用于使用根癌土壤桿菌進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。這些通常攜帶至少一種T-DNA邊界序列，并且包括諸如pBIN19(Bevan，Nucl.AciesRes.11=369(1984))等載體。二元載體PCIBlO含有編碼供植物中選擇用的卡那霉素抗性的基因和T-DNA右側(cè)和左側(cè)邊界序列和來(lái)自廣泛宿主范圍的質(zhì)粒PRK252的容許其在大腸桿菌和土壤桿菌兩者中復(fù)制的摻入序列(incorporatesequence)(Rothstein等Gene53:153-161(1987))。通過(guò)重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化靶植物物種通常牽涉土壤桿菌與來(lái)自植物的外植體的共培養(yǎng)，并且遵循本領(lǐng)域公知的方案。在選擇性培養(yǎng)基上再生如下的經(jīng)轉(zhuǎn)化組織，其攜帶二元質(zhì)粒T-DNA邊界間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)志物。用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一種辦法牽涉在植物組織和細(xì)胞處推進(jìn)惰性或有生物學(xué)活性的顆粒。此技術(shù)披露于美國(guó)專利No.4，945，050、5，036，006、和5，100，792。一般而言，此規(guī)程牽涉在有效穿過(guò)細(xì)胞外膜的條件下在細(xì)胞處推進(jìn)惰性或有生物學(xué)活性的顆粒。專利申請(qǐng)EP0292435、EP0392225和WO93/07278描述了如下技術(shù)，即從玉蜀黍的良種近交系制備愈傷組織(callus)和原生質(zhì)體，使用PEG或電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，并自經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉蜀黍植株。Gordon-Kamm等PlantCell2603-618(1990)和Fromm等Biotechnology8:833-839(1990)已經(jīng)發(fā)表了關(guān)于使用顆粒轟擊來(lái)轉(zhuǎn)化A188衍生的玉蜀黍系的技術(shù)。此外，W093/07278和Koziel等Biotechnology11194-200(1993)描述了關(guān)于通過(guò)顆粒轟擊來(lái)轉(zhuǎn)化玉蜀黍良種近交系的技術(shù)。使用顆粒轟擊來(lái)轉(zhuǎn)化質(zhì)體已經(jīng)有描述(Svab等PNAS90:913_917(1993)；Svab等PNAS87:8526-8530(1990)；McBride等PNAS91:7301-7305(1994))?？梢栽诓恍枰?xì)胞核基因組轉(zhuǎn)化的情況中使用質(zhì)體轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生表達(dá)酶易感性蛋白質(zhì)的植物。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域公知的。通過(guò)使用與編碼酶易感性蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作連接的抗生素或除草劑選擇標(biāo)志來(lái)促進(jìn)經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。對(duì)于某些靶物種，可以優(yōu)選不同抗生素或除草劑選擇標(biāo)志。轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)志包括nptll基因，其賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(Messing等Gene19:259-268(1982)；Bevan等，Nature304184-187(1983))；bar基因，其賦予對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性(White等，Nucl.AcidsRes18:1062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet79:625_631(1990))；hph基因，其賦予對(duì)抗生素潮霉素的抗性(Blochinger等MolCellBiol4:2929-2931)；和dhfr基因，其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)=1099-1104(1983))；EPSPS基因，其賦予對(duì)草甘膦的抗性(美國(guó)專利No.4，940，835和5，188，642)；和甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶基因(在本文中也稱為磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因)，其提供代謝甘露糖的能力(美國(guó)專利No.5，767，378和5，994，629)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種轉(zhuǎn)基因宿主，其中編碼酶易感性蛋白質(zhì)的多核苷酸序列是染色體整合的。染色體整合指外來(lái)基因或DNA構(gòu)建體通過(guò)共價(jià)鍵整合入宿主DNA中。染色體整合的DNA是遺傳穩(wěn)定的，而且經(jīng)由連續(xù)世代由后代可遺傳。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中編碼酶易感性肌醇六磷酸酶的多核苷酸是瞬時(shí)表達(dá)的?；虻乃矔r(shí)表達(dá)指沒(méi)有整合入宿主染色體中，但是獨(dú)立地發(fā)揮功能的基因(或是作為自主復(fù)制型質(zhì)粒的一部分或是表達(dá)盒)的表達(dá)。用酶易感性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的宿主植物可以使編碼酶易感性蛋白質(zhì)的多核苷酸序列增殖進(jìn)入同一物種的其它品種(特別包括商業(yè)品種)中，其使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)(PlantBreedingReviews卷14，JulesJanick編，JohnWiley&SonsPublisher(1997))。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是在其它轉(zhuǎn)基因序列外還包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。可以使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)來(lái)將包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物與其它轉(zhuǎn)基因植物一起育種以將一種或多種轉(zhuǎn)基因性狀疊加入單一植物或雜種中。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，酶易感性蛋白質(zhì)在植物的種子中積累。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物種子。包含酶易感性蛋白質(zhì)的宿主植物可以采用多種形式。宿主植物可以是經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；宿主植物可以是克隆轉(zhuǎn)化體(例如轉(zhuǎn)化成含有表達(dá)盒的所有細(xì)胞)；宿主植物可以包含經(jīng)轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的組織的嫁接物(例如，嫁接至未轉(zhuǎn)化接穗即柑橘物種的經(jīng)轉(zhuǎn)化根莖)。可以通過(guò)多種手段，諸如通過(guò)克隆增殖或經(jīng)典的育種技術(shù)來(lái)繁殖宿主植物。例如，可以使第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化植物自交以給出純合第二代(或T2)轉(zhuǎn)化植物，并經(jīng)由經(jīng)典的育種技術(shù)來(lái)進(jìn)一步繁殖T2植物?？梢詫@性選擇標(biāo)志(諸如nptII)與表達(dá)盒聯(lián)合以幫助育種。證明了如上文所概述的用于蛋白質(zhì)工程的理性設(shè)計(jì)技術(shù)，其使用肌醇六磷酸酶，即Nov9X生成對(duì)蛋白酶胃蛋白酶具有敏感性的酶易感性肌醇六磷酸酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。Nov9X是一種自針對(duì)高度熱穩(wěn)定性以及玉蜀黍優(yōu)化植物表達(dá)修飾的大腸桿菌appA基因衍生的肌醇六磷酸酶。術(shù)語(yǔ)“肌醇六磷酸酶”指將植酸鹽(肌醇六磷酸鹽)催化成肌醇和無(wú)機(jī)磷酸鹽的廣泛種類的酶。已經(jīng)在原核和真核生物體的多種來(lái)源(即無(wú)花果曲霉(Aspergillusficuum)、釀酒酵母(Sacchoromycescerevisiae)、大腸桿菌等)中鑒定出肌醇六磷酸酶。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是由一項(xiàng)SEQIDNO:1-33的多肽序列或與一項(xiàng)SEQIDN0:1_33的多肽序列具有98%同一性的多肽或一項(xiàng)SEQIDNO:1_33的多肽序列的保守變體編碼的酶易感性肌醇六磷酸酶。對(duì)于序列比較，通常一種序列充當(dāng)與測(cè)試序列比較的參照序列。在使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參照序列輸入計(jì)算機(jī)中，若必要的話指定隨后的坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?；谥付ǖ某绦騾?shù)，序列比較算法然后為測(cè)試序列計(jì)算相對(duì)于參照序列的百分比序列同一性。可以如下進(jìn)行比較序列的最佳比對(duì)，例如Smith和Waterman，Adv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48=443(1970)的同源性比對(duì)算法，Pearson和Lipman，Proc.Nat'1.Acad.Sci.USA852444(1988)的搜索相似性方法，這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(威斯康星遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)，或者目視檢查。適合于測(cè)定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，其記載于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403410(1990)。用于實(shí)施BLAST分析的軟件是公眾經(jīng)由國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可獲得的。此算法牽涉首先通過(guò)鑒定詢問(wèn)序列中長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSP)，所述短字(shortword)在與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿足一些得正值的閾值得分Τ。T稱為鄰近字得分閾值(Altschul等，J.Mol.Biol215:403-410(1990))。這些起始鄰近字命中起種子(seed)作用，用于啟動(dòng)搜索以尋找含有它們的較長(zhǎng)HSP。然后沿每種序列以兩個(gè)方向延伸字命中，只要累積的比對(duì)得分可以增加。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)賞得分；總是大于0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是小于0)來(lái)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，使用評(píng)分舉證來(lái)計(jì)算累積得分。在累積的比對(duì)得分自其最大獲得值減少數(shù)量X，由于一項(xiàng)或多項(xiàng)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的積累而導(dǎo)致累積得分變成零或以下，或者達(dá)到任一序列的末端時(shí)停止每一方向的字命中延伸。BLAST算法參數(shù)W、T、和X決定比對(duì)的靈敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用作為缺省值的字長(zhǎng)(W)11，期望值伍)10，截留100^=5力=-4，和兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用作為缺省值的字長(zhǎng)(W)3，期望值(E)10，和BL0SUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))。在計(jì)算百分比序列同一性外，BLAST算法還實(shí)施對(duì)兩種序列間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見(jiàn)例如Karlin和Altschul，Proc.Nat'1.Acad.Sci.USA90:58735787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小和概率(P(N))，其提供兩種核苷酸或氨基酸序列間的匹配會(huì)偶然發(fā)生的概率的示數(shù)(indication)。例如，若測(cè)試核酸序列與參照核酸序列的比較中的最小和概率小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，且最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為測(cè)試核酸序列與參照序列相似。含有酶易感性肌醇六磷酸酶的制備物可以采用許多形式，包括但不限于干的制備物、液體制備物、含有轉(zhuǎn)基因植物材料的制備物等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括分離酶易感性肌醇六磷酸酶。自表達(dá)肌醇六磷酸酶的任何宿主分離酶易感性肌醇六磷酸酶。宿主可以是轉(zhuǎn)基因的或者可以瞬時(shí)表達(dá)酶易感性肌醇六磷酸酶。宿主細(xì)胞選自下組細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲(chóng)和植物。植物宿主細(xì)胞可以是單子葉的，諸如玉蜀黍或小麥細(xì)胞或者雙子葉的，諸如大豆細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是來(lái)自含有酶易感性肌醇六磷酸酶的宿主的提取物。對(duì)于制備重組肌醇六磷酸酶，轉(zhuǎn)化合適的宿主和宿主生長(zhǎng)后，可以通過(guò)合適的手段(例如溫度變動(dòng)或化學(xué)誘導(dǎo))來(lái)誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間來(lái)產(chǎn)生重組酶。然后通常通過(guò)離心來(lái)收獲細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)手段來(lái)破壞，并保留所得的粗制提取物來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步純化?？梢酝ㄟ^(guò)任何方便的方法來(lái)破壞蛋白質(zhì)表達(dá)中所采用的細(xì)胞，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞、或使用細(xì)胞溶解劑，此類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢酝ㄟ^(guò)如下方法自重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收酶，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)重折疊步驟，若必要的話。最后，可以采用高效液相層析(HPLC)來(lái)進(jìn)行最終的純化步驟。酶的回收指用于自宿主收集酶的任何方法。回收的酶制備物可以含有來(lái)自宿主的污染物諸如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和DNA。回收的酶制備物也可以是高度純化的酶制備物，其大于95%的純蛋白質(zhì)。含有酶易感性肌醇六磷酸酶的提取物可以是化學(xué)合成規(guī)程的產(chǎn)物，或者是通過(guò)重組技術(shù)自宿主生成的。宿主可以是原核宿主諸如細(xì)菌或真核宿主諸如高等植物。可以出于任何目的而采用含有酶易感性肌醇六磷酸酶的提取物，其中此類酶活性是必要的或想要的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料的方法，其中采用酶易感性肌醇六磷酸酶來(lái)催化動(dòng)物飼料中的植酸鹽水解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述酶來(lái)催化食物中的植酸鹽水解。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有酶易感性肌醇六磷酸酶的液體組合物。液體組合物不需要含有多于肌醇六磷酸酶的任何物。然而，可以添加穩(wěn)定劑諸如甘油、山梨糖醇或丙二醇。液體組合物還可以包含其它添加劑，諸如鹽、糖、防腐劑、PH調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)、和植酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)。典型的液體組合物是水性或基于油的漿體?？梢栽谌芜x的對(duì)飼料成分造粒之前或之后將液體組合物添加至食物或飼料。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有酶易感性肌醇六磷酸酶的干的組合物。干的組合物可以是冷凍干燥的或噴霧干燥的組合物，在此情況中組合物不需要含有多于處于干燥形式的肌醇六磷酸酶的任何物。干的組合物可以是顆粒狀的，其可以容易地與例如食物或飼料成分混合，或形成預(yù)混合物的成分。酶顆粒的顆粒大小與混合物的其它成分的顆粒大小相容。這提供了一種將肌醇六磷酸酶摻入例如加工后的食物或動(dòng)物飼料中的安全且方便的手段。例如，可以如下制備穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶酶配制劑，即冷凍液體酶溶液與膨脹劑諸如磨碎的大豆餐的混合物，然后凍干混合物。濕度降低和肌醇六磷酸酶與膨脹劑的結(jié)合相互作用保護(hù)酶免于復(fù)合飼料制備過(guò)程中經(jīng)歷的外部環(huán)境因素，諸如溫度極值。干的配制劑可以通過(guò)使?jié)撛诘鞍姿饷傅幕钚宰钚』瘉?lái)進(jìn)一步增強(qiáng)穩(wěn)定性，所述潛在蛋白水解酶可以作為用于制備靶酶的液體發(fā)酵混合物中的副產(chǎn)物存在。所得的干燥酶-大豆粉混合物能耐受高的溫度極值。配制的酶混合物可以作為供家禽和豬生產(chǎn)中使用的食物補(bǔ)充物使用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有酶易感性肌醇六磷酸酶的植物或植物部分。植物或植物部分可以作為關(guān)于酶的投遞機(jī)制使用。植物可以選自下組玉蜀黍、小麥、大豆和這些中任一種植物的谷物。完整的谷物保護(hù)靶酶免于外部環(huán)境因素?？梢詫⒐任锖械拿柑砑又撂幱谒榉N子、磨碎種子形式，或者處于更精制形式的動(dòng)物飼料。或者，可以自種子制備蛋白質(zhì)提取物，并且可以通過(guò)凍干或噴霧干燥將該提取物進(jìn)一步加工成穩(wěn)定化的液體或干燥狀態(tài)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性肌醇六磷酸酶的組合物。組合物的例子是團(tuán)聚顆粒。使用團(tuán)聚技術(shù)在高剪切混合器中制備團(tuán)聚顆粒，在此期間填充材料和酶被共團(tuán)聚以形成顆粒。通過(guò)使載體材料的核心吸附酶/被酶包被來(lái)制備吸附顆粒。組合物或團(tuán)聚顆粒還可以含有填充材料。典型的填充材料是鹽諸如硫酸二鈉。其它填充劑包括高嶺土、滑石、硅酸鎂鋁和纖維素纖維。任選地，粘合劑諸如糊精也包括在團(tuán)聚顆粒中。組合物或團(tuán)聚顆粒還可以含有載體材料。典型的載體材料包括淀粉，例如處于木薯、玉米、馬鈴薯、稻和小麥形式。也可以使用鹽。任選地，用涂層混合物包被顆粒。此類混合物包含涂層劑，優(yōu)選疏水性涂層劑，諸如氫化的棕櫚油和牛脂，和若想要的話，其它添加劑諸如碳酸鈣或高嶺土。另外，組合物可以含有其它取代物(substituent)諸如著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定齊U、維生素、礦物質(zhì)、其它飼料或食物增強(qiáng)酶等。這對(duì)于所謂的預(yù)混合物特別如此。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性肌醇六磷酸酶的預(yù)混合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性熱耐受性肌醇六磷酸酶的食物或飼料添加劑。食物或飼料添加劑是意圖或適合于添加至食物或飼料的基本上純的化合物或多成分組合物。它是一種按其預(yù)期用途變?yōu)槭澄锘蝻暳袭a(chǎn)物的成分或者影響食物或飼料產(chǎn)物的任何特征的物質(zhì)。如此，酶易感性肌醇六磷酸酶添加劑理解為指不是主要飼料或食物物質(zhì)的天然成分或者不以它在主要飼料或食物物質(zhì)中的天然濃度存在的肌醇六磷酸酶，例如，將酶易感性肌醇六磷酸酶與飼料物質(zhì)分開(kāi)地添加至飼料(單獨(dú)地或與其它飼料添加劑組合地)，或者酶易感性肌醇六磷酸酶是飼料物質(zhì)之一的完整部分，但是已經(jīng)通過(guò)重組DNA技術(shù)在其中生成。一種典型的添加劑通常包含一種或多種化合物諸如維生素、礦物質(zhì)或飼料增強(qiáng)酶和適合的載體和/或賦形劑。準(zhǔn)備好使用的酶易感性肌醇六磷酸酶添加劑在本文中定義為不是在動(dòng)物飼料或加工過(guò)的食物中原位產(chǎn)生的添加劑。準(zhǔn)備好使用的酶易感性肌醇六磷酸酶添加劑可以直接飼喂給人或動(dòng)物，或者優(yōu)選的是，在與其它飼料或食物成分混合后直接飼喂。例如，飼料添加劑可以與其它飼料成分組合以產(chǎn)生飼料。此類其它飼料成分包括一種或多種其它酶補(bǔ)充物、維生素飼料添加劑、礦物質(zhì)飼料添加劑和氨基酸飼料添加劑。然后可以以合適量將所得的(組合的)飼料添加劑(可能包括數(shù)種不同類型的化合物)與其它飼料成分諸如谷類和蛋白質(zhì)補(bǔ)充物混合以形成動(dòng)物飼料?？梢允褂媚壳笆褂玫募庸て餍抵T如復(fù)式造粒器(double-pelletingmachine)、蒸氣制粒機(jī)(steampelleter)、膨脹器(expander)或擠壓機(jī)(extruder)來(lái)將這些成分加工成動(dòng)物飼料。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性肌醇六磷酸酶的食物添加劑，其進(jìn)一步包含其它食物成分以產(chǎn)生加工過(guò)的食物產(chǎn)物。此類其它食物成分包括一種或多種其它酶補(bǔ)充物、維生素食物添加劑和礦物質(zhì)食物添加劑。然后可以以合適量將所得的(組合的)食物添加劑(可能包括數(shù)種不同類型的化合物)與其它食物成分諸如谷類和植物蛋白質(zhì)補(bǔ)充物混合以形成加工過(guò)的食物產(chǎn)物?？梢允褂媚壳笆褂玫募庸て餍抵我环N來(lái)將這些成分加工成加工過(guò)的食物產(chǎn)物。在飲食(diet)前或者與飲食同時(shí)向動(dòng)物補(bǔ)充動(dòng)物飼料添加劑。酶易感性肌醇六磷酸酶可以僅在制備過(guò)程中有活性，而在最終的食物或飼料產(chǎn)物中可以沒(méi)有活性。此方面在例如和面和烘焙及其它即食的基于谷類的產(chǎn)物的生產(chǎn)中是特別相關(guān)的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是創(chuàng)建酶易感性酶。本文中術(shù)語(yǔ)“酶”指的是催化底物由一種形式向另一種形式轉(zhuǎn)化的任何蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是創(chuàng)建涉及飼料、食物或燃料的增強(qiáng)的酶易感性酶。這里這些“增強(qiáng)酶”指的是選自下組的蛋白質(zhì)肌醇六磷酸酶α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、其它肌醇六磷酸酶、β-葡聚糖酶，特別是β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶和β-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖酶，纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶(galactanase)，特別是阿拉伯半乳聚糖1，4-β-內(nèi)切半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖1，3_β-內(nèi)切半乳糖苷酶，內(nèi)切葡聚糖酶，特別是1，2-β-內(nèi)切葡聚糖酶、1，3-α-內(nèi)切葡聚糖酶、和1，3-β-內(nèi)切葡聚糖酶，果膠降解酶、果膠酶、果膠酯酶(pectinesterase)、果膠裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonanacetylesterase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果膠酸裂合酶、和α-半乳糖醛酸酶(galacturonisidase)、甘露聚糖酶(marmanase)、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanase)和脂肪分解酶諸如脂肪酶、磷脂酶、角質(zhì)酶(cutinase)、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡聚糖酶、淀粉酶、α-葡糖苷酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、新支鏈淀粉酶(neo-pullulanase)、異支鏈淀粉酶、支鏈淀粉酶(amylopullulanase)、纖維素酶、1，4-β-外切纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、1，3_β-D-外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、L-阿拉伯糖酶、α-阿拉伯糖苷酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶(marmanase)、甘露糖苷酶(marmosidase)、木聚糖酶、木糖苷酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、肌醇六磷酸酶、和脂肪酶。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是另外包含有效量的一種或多種增強(qiáng)酶的酶易感性肌醇六磷酸酶組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可能想要?jiǎng)?chuàng)建具有降低的胃穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)實(shí)施模擬胃液(SGF)消化率測(cè)定法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的胃穩(wěn)定性，如記載于Thomas等，RegulatoryToxicologyandPharmacology39:87_98(2004))和本申請(qǐng)的實(shí)施例9的。展現(xiàn)出胃穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)在SGF中通常穩(wěn)定至少10、15、20、30、60分鐘或更長(zhǎng)。穩(wěn)定性蛋白質(zhì)指分子量沒(méi)有減少的蛋白質(zhì)，如SGF分析中在蛋白質(zhì)凝膠上目視指明的，其中將SGF分析實(shí)施至少10、15、20、30、60分鐘或更長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種生產(chǎn)包含酶易感性肌醇六磷酸酶的人或動(dòng)物飼料的方法?？梢杂妹敢赘行约〈剂姿崦该复偬幚碇付槿耸澄锏墓攘：兔娣垡越档筒牧系闹菜徕}鎂含量。植酸鈣鎂的水平降低通過(guò)提高必需礦物質(zhì)諸如鐵、鈣、和鋅的營(yíng)養(yǎng)物利用度來(lái)增強(qiáng)食物質(zhì)量。在提高食物的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量外，食物加工過(guò)程中所使用的酶易感性肌醇六磷酸酶可以改善食物生產(chǎn)方法的總體效率。例如，在大豆蛋白質(zhì)分離制備過(guò)程中，向白色的大豆粕添加酶易感性肌醇六磷酸酶能顯著提高可提取蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量。在食物制備過(guò)程中，酶易感性肌醇六磷酸酶僅在制備和加工過(guò)程中有活性，而在最終的食物產(chǎn)物中沒(méi)有活性。此方面在例如和面和烘焙中是相關(guān)的。類似地，可以用酶易感性肌醇六磷酸酶預(yù)加工動(dòng)物飼料谷粒諸如烤大豆粉或蕓苔粉(canolameal)，之后進(jìn)行復(fù)合飼料制備。除去動(dòng)物飼料成分中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，之后進(jìn)行復(fù)合飼料制備產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量較高且更有價(jià)值的動(dòng)物飼料成分。在此加工方法中，酶易感性肌醇六磷酸酶在飼料制備過(guò)程中有活性，而在對(duì)經(jīng)處理的飼料消化后在動(dòng)物的消化道中可以有活性或者可以沒(méi)有活性。用于向動(dòng)物飼料和加工后的食物添加酶易感性肌醇六磷酸酶的另一種可能性是向飼料添加含有酶易感性肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)基因植物材料或種子。表達(dá)酶易感性肌醇六磷酸酶的植物部分(例如轉(zhuǎn)基因植物的種子或其它植物材料諸如根、莖、葉、木、花、樹(shù)皮、和/或果實(shí))可以包括在動(dòng)物飼料中(或是同樣地或是在進(jìn)一步加工后)。在基于谷物的飼料或食物中，谷物優(yōu)選是小麥、大麥、玉蜀黍、高粱、黑麥、燕麥、黑小麥或稻。也可以在單胃動(dòng)物以及多胃動(dòng)物，特別是幼年小牛中有利地使用酶易感性肌醇六磷酸酶。魚(yú)和甲殼類的飲食也可以補(bǔ)充有酶易感性肌醇六磷酸酶以進(jìn)一步改善飼料轉(zhuǎn)化率，并降低集約生產(chǎn)系統(tǒng)排泄的磷水平。也可以給動(dòng)物諸如家禽例如火雞、鵝、鴨、以及豬、馬、牛、綿羊、公山羊、犬和貓科，以及魚(yú)和甲殼類提供飼料。也可以給豬或家禽(包括但不限于肉雞、母雞、下蛋母雞、火雞和鴨)提供飼料。可以對(duì)單胃或多胃動(dòng)物使用動(dòng)物飼料。動(dòng)物飼料可以喂養(yǎng)家禽，或豬，或小牛，或伙伴動(dòng)物諸如犬或貓或馬。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含酶易感性肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料。酶易感性熱耐受性肌醇六磷酸酶能夠耐受飼料配制過(guò)程中在商業(yè)制粒機(jī)(pelletmill)中遇到的熱條件化步驟，如此描述了一種制備包含酶易感性肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料(例如硬粒狀飼料顆粒)的方法。為了制備飼料，可以將配制好的酶易感性肌醇六磷酸酶與飼料成分混合，混合物蒸汽在制粒機(jī)中進(jìn)行條件化(condition)，使得保留至少50%的預(yù)加熱處理的酶活性，并將飼料擠出通過(guò)顆粒染色。如此，在與維生素、礦物質(zhì)、其它飼料酶、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物(例如麥麩(wheatmiddlings)或玉米麩質(zhì)粉(glutenmeal))一起使用外，酶易感性肌醇六磷酸酶可以單獨(dú)地作為動(dòng)物飼料中的補(bǔ)充物使用。該酶還可以將添加至糊狀飲食(mashdiet)，即還沒(méi)有通過(guò)造粒機(jī)(pelletizer)的飲食。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于制備動(dòng)物飼料的方法，其中所述制備包括在大于50°C的溫度用熱處理酶易感性肌醇六磷酸酶，從而產(chǎn)生經(jīng)熱處理的動(dòng)物飼料混合物。酶易感性肌醇六磷酸酶制備物可以是轉(zhuǎn)基因植物材料。轉(zhuǎn)基因植物材料可以是玉米谷粒、碎玉米、玉米粉、或自玉米制備的酶提取物。集約動(dòng)物生產(chǎn)操作旨在限制生產(chǎn)的動(dòng)物的糞便中含有的磷酸鹽污染。飲食中存在的磷酸鹽量和飲食中的磷酸鹽對(duì)動(dòng)物的利用度是影響動(dòng)物糞便中存在的排泄磷酸鹽的主要因素。目前，大豆粉、玉米谷粒(和其它飼料)中存在的植物或谷粒衍生的磷酸鹽的利用度較低，因?yàn)榱姿猁}主要處于植酸形式。為了使動(dòng)物的生長(zhǎng)效率最大化，向飼料添加無(wú)機(jī)磷酸鹽，導(dǎo)致含有足夠水平的可利用磷酸鹽的飼料組成。然而，這些飼料配方含有太多的總磷酸鹽，并且導(dǎo)致磷酸鹽污染。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種動(dòng)物飼料組合物，其包含酶易感性肌醇六磷酸酶，而且進(jìn)一步包含基本上降低的無(wú)機(jī)磷水平。飼料組合物包含典型的飼料成分、微量營(yíng)養(yǎng)物、維生素等和有效量的酶易感性肌醇六磷酸酶及無(wú)機(jī)磷酸鹽，其中酶易感性肌醇六磷酸酶和磷的量在每kg飼料50-20，000個(gè)單位的酶易感性肌醇六磷酸酶的水平之間和小于0.45%的無(wú)機(jī)磷；在每kg飼料100-10，000個(gè)單位的酶易感性肌醇六磷酸酶的水平之間和小于0.225%的無(wú)機(jī)磷；在每kg飼料150-10，000個(gè)單位的肌醇六磷酸酶的水平之間和小于0.15%的無(wú)機(jī)磷，或在每kg飼料250-20，000個(gè)單位的肌醇六磷酸酶的水平之間和沒(méi)有外源添加的無(wú)機(jī)磷。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是使用酶易感性肌醇六磷酸酶來(lái)改善與家畜生產(chǎn)有關(guān)的重量增加和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的方法。本發(fā)明的酶易感性肌醇六磷酸酶容許重量增加和FCR改善。關(guān)于重量增加和FCR改善的方法還可以包括無(wú)機(jī)磷酸鹽較低的飲食。經(jīng)由低的無(wú)機(jī)磷酸鹽飲食來(lái)改善FCR或重量增加的方法，其通過(guò)給動(dòng)物喂養(yǎng)包含酶易感性肌醇六磷酸酶和在0.45%水平或低于0.45%水平的無(wú)機(jī)磷酸鹽水平的飲食來(lái)進(jìn)行。方法可以包括喂養(yǎng)含有酶易感性肌醇六磷酸酶和小于0.225%的無(wú)機(jī)磷酸鹽的飲食，或者方法包括喂養(yǎng)含有酶易感性肌醇六磷酸酶和沒(méi)有添加的無(wú)機(jī)磷的飲食。描述了一種改善加工過(guò)的谷粒產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法或一種加工谷粒的方法，包括在谷粒加工過(guò)程中以足以改善飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的量向谷粒產(chǎn)物添加酶易感性肌醇六磷酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，谷粒是玉米，谷粒加工方法是濕磨，加工的產(chǎn)物是玉米麩質(zhì)飼料、玉米麩質(zhì)、和玉米淀粉。在其它實(shí)施方案中，谷粒是玉米、小麥、大豆、蕓苔、和甘蔗。在其它實(shí)施方案中，谷粒是含油種子，諸如大豆或蕓苔或含油種子油菜，而加工過(guò)的谷粒產(chǎn)物是油籽粉。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含編碼酶易感性肌醇六磷酸酶的多核苷酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是種子、谷粒或果實(shí)。產(chǎn)物可以是植物，且特別是雜種植物或近交植物。產(chǎn)物還可以是包含本發(fā)明的熱耐受性肌醇六磷酸酶的谷粒加工產(chǎn)物，諸如本文中先前所描述的玉米谷粒加工產(chǎn)物和含油種子谷粒加工產(chǎn)物或含有種子加工產(chǎn)物。本發(fā)明范圍內(nèi)的動(dòng)物包括多胃動(dòng)物(例如小牛)以及單胃動(dòng)物諸如豬、家禽(例如雞、火雞、鵝、鴨、雉、松雞、鵪鶉和鴕鳥(niǎo))、馬、綿羊、公山羊、犬和貓科，以及魚(yú)和甲殼類。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括作為家禽或豬飼料制備的飼料或動(dòng)物飼料。通過(guò)提及將所有出版物、專利和專利申請(qǐng)收入本文。雖然在上述說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已經(jīng)關(guān)于其某些優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行過(guò)描述，而且許多詳情已經(jīng)出于例示目的提出，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明對(duì)別的實(shí)施方案適用，而且本文中所描述的某些詳情在不偏離本發(fā)明基本原理的前提下可以發(fā)生顯著變化。實(shí)施例本發(fā)明會(huì)通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步地描述，所述實(shí)施例并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:Nov9X的蛋白質(zhì)建模選擇Nov9X作為用于蛋白質(zhì)建模的肌醇六磷酸酶分子。已經(jīng)解析了6種大腸桿菌肌醇六磷酸酶晶體結(jié)構(gòu)，并以PDBID:1DKL、1DKM、1DKN、1DK0、1DKP、1DKQ存儲(chǔ)入結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)石if究合作實(shí)驗(yàn)室(ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformation)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中。為了為蛋白質(zhì)建模Nov9X選擇合適的模板，自PDB選取所有肌醇六磷酸酶晶體結(jié)構(gòu)。選擇結(jié)構(gòu)1DKM(分辨率2.25埃)作為建模Nov9X的模板。通過(guò)來(lái)自Accelrys，Inc.的InsightII包內(nèi)的軟件程序Modeler來(lái)創(chuàng)建5種優(yōu)化的模型，并選擇具有最低目標(biāo)函數(shù)的模型。選定的Nov9X模型與IDKM非常類似，關(guān)于主鏈C-αRMS僅具有0.23埃的差異。借助于軟件SwissPdbViewer(Guex,N.禾口Peitsch，Μ·C.SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer:Anenvironmentforcomparativeproteinmodeling.Electrophoresis,18,2714-2723(1997))結(jié)構(gòu)檢查、表面分析和圖形創(chuàng)建來(lái)為去糖基化、消除潛在分子內(nèi)二硫鍵和引入胃蛋白酶切割位點(diǎn)的突變建模。表1、表2、表3、表4、和表9中記錄了用于創(chuàng)建變體的對(duì)Nov9X進(jìn)行的氨基酸改變。改變的氨基酸位置相對(duì)于SEQIDN0:34中所描述的Nov9X蛋白中的位置。Nov9X蛋白始于氨基酸“A”。創(chuàng)建沒(méi)有“A”的變體肌醇六磷酸酶分子，而且另外，肌醇六磷酸酶變體可以始于第1位的任何氨基酸或無(wú)氨基酸。變體肌醇六磷酸酶的第一氨基酸的這種變異性在序列列表中概述，并由氨基酸序列起始處的“X”標(biāo)示。實(shí)施例2:Nov9X變體的理性設(shè)計(jì)糖基化位點(diǎn)以計(jì)算方式以及通過(guò)對(duì)畢赤酵母(Pichia)和玉米胚乳中表達(dá)的Nov9X的蛋白質(zhì)變體的質(zhì)譜分析來(lái)鑒定Nov9X中的兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。選擇真核表達(dá)系統(tǒng)中在表達(dá)期間被糖基化的這兩個(gè)蛋白質(zhì)位點(diǎn)進(jìn)行修飾。這些糖基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于Nov9X(SEQIDNO34)的氨基酸殘基139-161和氨基酸殘基318-320。表1概述了鑒定為產(chǎn)生SEQIDNO:1_3中所描述的多肽的在糖基化域中進(jìn)行的氨基酸改變。表1基于糖基化對(duì)Nov9X的修飾實(shí)施例3:Nov9X變體的理性設(shè)計(jì)二硫鍵自Nov9X的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)信息鑒定Nov9X肌醇六磷酸酶中的特定半胱氨酸殘基(Lim等Nature，7(2)108-113(2000))。靶向參與分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基進(jìn)行改變。另外，靶向潛在參與分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基進(jìn)行改變。將對(duì)二硫鍵形成的改變定位至蛋白質(zhì)的三維模型上以避免對(duì)總體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊成正確構(gòu)象的能力進(jìn)行改變。改變Nov9X中的半胱氨酸氨基酸以產(chǎn)生SEQIDNO:4_14中所描述的序列。表2中概述了特定的氨基酸變化。表2基于二硫鍵對(duì)Nov9X的修飾實(shí)施例4:Nov9X變體的理性設(shè)計(jì)潛在的胃蛋白酶切割位點(diǎn)分析Nov9X的三維結(jié)構(gòu)模型以鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中作為用潛在的胃蛋白酶切割位點(diǎn)工程化改造的候選的環(huán)。對(duì)修飾鑒定的特定環(huán)必須滿足數(shù)項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，包括1)環(huán)不被埋藏在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)，2)環(huán)在蛋白質(zhì)的表面上，并且如此在蛋白質(zhì)正確折疊時(shí)暴露于周?chē)橘|(zhì)，而且是蛋白酶能接近的，3)環(huán)不牽涉形成酶的活性位點(diǎn)或底物或產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)，和4)環(huán)含有與有利胃蛋白酶切割位點(diǎn)類似的氨基酸序列，從而便于在氨基酸序列中進(jìn)行次要改變(改變一個(gè)或兩個(gè)殘基)以便將有利的胃蛋白酶切割位點(diǎn)引入環(huán)中。此辦法沒(méi)有改變環(huán)的長(zhǎng)度，而且以最低限度水平保持突變，以便避免對(duì)折疊蛋白質(zhì)的局部和總體結(jié)構(gòu)的干擾。鑒定出滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)環(huán)，并且這些環(huán)對(duì)應(yīng)于Nov9X(SEQIDNO34)中的下列氨基酸殘基33_46、105-137、172-177、229-240、281_293、316-330、和364-373。將這些中一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)的潛在胃蛋白酶切割位點(diǎn)工程化改造成含有已知更容易被胃蛋白酶攻擊的氨基酸序列。表3中概述了酶易感性肌醇六磷酸酶，并對(duì)應(yīng)于SEQIDNO15-25中所描述的氨基酸序列。表3基于潛在的蛋白酶切割位點(diǎn)對(duì)Nov9X的修飾實(shí)施例5:Nov9X變體的理性設(shè)計(jì)高度有利的胃蛋白酶切割位點(diǎn)的插入通過(guò)完全插入環(huán)序列中或者替換環(huán)序列來(lái)修飾實(shí)施例4中所鑒定的蛋白質(zhì)環(huán)。用高度有利的胃蛋白酶切割位點(diǎn)序列的序列替換環(huán)序列(KeilB.,SpecificityofProteolysis.Springer-VerlagBerlin-Heidelber-NewYork第335頁(yè)(1992))。對(duì)Nov9X蛋白的修飾由于插入長(zhǎng)度為數(shù)個(gè)氨基酸的完整新序列而是適度的。表4概述了對(duì)Nov9X進(jìn)行的氨基酸修飾，并對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:26-33中所描述的氨基酸序列。表4基于高親和力胃蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)對(duì)Nov9X的修飾實(shí)施例6供細(xì)菌表達(dá)的變體的密碼子優(yōu)化將酶易感性肌醇六磷酸酶的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)變成多核苷酸序列。修飾多核苷酸序列以使得用于翻譯成氨基酸的密碼子反映大腸桿菌中使用的最佳密碼子。合成如SEQIDNO:35_67中所描述的大腸桿菌優(yōu)化的多核苷酸序列，并將其亞克隆入GeneArt，Regensburg，德國(guó)的pFLEXHX大腸桿菌表達(dá)載體中。最終的載體含有如下的表達(dá)盒，其包含與添加N端His標(biāo)簽的序列連接的經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的酶易感性肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。為了容易參照，表5概述了序列列表中含有的多肽與多核苷酸序列之間的關(guān)系。表5經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列和多肽序列實(shí)施例7供細(xì)菌表達(dá)用的載體構(gòu)建將實(shí)施例6中所描述的經(jīng)過(guò)細(xì)菌密碼子優(yōu)化的表達(dá)盒克隆入表達(dá)載體pET24a(Invitrogen)中。將含有SEQIDNO:35、36、和38中所描述的多核苷酸序列的表達(dá)盒作為NdeI/XhoI片段克隆。將含有SEQIDNO:37、39_43、和59中所描述的多核苷酸序列的表達(dá)盒作為NdeI/NotI片段克隆。遵循標(biāo)準(zhǔn)的方案實(shí)施用于生成載體和插入片段的限制性消化(Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork(1989))。通過(guò)在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳來(lái)分開(kāi)消化產(chǎn)物，并自凝膠切出正確的條帶，并使用來(lái)自Qbiogene的GeneClean旋轉(zhuǎn)試劑盒來(lái)純U。MMiSfflJfe自Novagen白勺Clonables^jfegEpicentreBiotechnologies白勺T4DNA連接酶遵循制造商的方案將純化的插入物和載體片段連接在一起。然后遵循制造商規(guī)定的方案將連接的載體轉(zhuǎn)化入來(lái)自Invitrogen的TOP10大腸桿菌細(xì)胞中，并在Luria瓊脂+卡那霉素(50μg/ml)平板上選擇。通過(guò)用SEQIDNO:68中所描述的正向引物和SEQIDNO:69中所描述的反向引物進(jìn)行的菌落PCR來(lái)篩選平板上生長(zhǎng)的菌落以確認(rèn)正確質(zhì)粒的存在。如下建立PCR2.Spmol每種引物、來(lái)自Sigma的2xPCRJumpstart混合物、作為模板的大腸桿菌菌落和至5μ1最終反應(yīng)體積的水。使用下列循環(huán)條件94°C的初始變性達(dá)3分鐘，接著是94°C達(dá)30秒，55°C達(dá)30秒和72°C達(dá)60秒的25個(gè)循環(huán)，接著是72°C達(dá)10分鐘的最終延伸步驟。然后將具有想要的質(zhì)粒的菌落在Luria培養(yǎng)基+卡那霉素(50ug/ml)中于37°C，260rpm培養(yǎng)過(guò)夜，并使用Qiagen小量制備試劑盒來(lái)提取質(zhì)粒DNA。對(duì)所得的質(zhì)粒DNA中的插入基因進(jìn)行測(cè)序以完全確認(rèn)正確的構(gòu)建體已經(jīng)得到制備。以Bsgl/AscI片段將含有酶易感性肌醇六磷酸酶(其多核苷酸序列記載于SEQIDNO44-54)的表達(dá)盒克隆入載體pFLEXHXT7中。使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)用來(lái)自pET24a的T7啟動(dòng)子替換pFLEXHX啟動(dòng)子來(lái)生成pFLEXHXT7。實(shí)施例8自細(xì)菌分離蛋白質(zhì)的方法將含有包含如實(shí)施例7中所描述的多核苷酸序列的表達(dá)盒的PET24載體和pFLEXHXT7載體轉(zhuǎn)化入BL21[DE3]大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中。用來(lái)自轉(zhuǎn)化平板的菌落接種IOml等分試樣的含有卡那霉素(50μg/ml)(Sigma)的LB培養(yǎng)基，并于30°C在搖動(dòng)情況中溫育過(guò)夜。將5-10ml這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至IL搖瓶中的500ml等分試樣的含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基。于37°C在搖動(dòng)的情況中溫育燒瓶，直至達(dá)到約0.6的0D600。將搖瓶轉(zhuǎn)移至15°C的培養(yǎng)箱。添加IPTG(Sigma)以給出0.ImM的終濃度，并在搖動(dòng)的情況中溫育燒瓶過(guò)夜。通過(guò)以24，OOOXg離心15分鐘來(lái)收獲細(xì)胞生物量。收獲時(shí)的細(xì)胞密度在2.5至3.5個(gè)OD6tltl的范圍。于_20°C冷凍細(xì)胞生物量。融化細(xì)胞生物量樣品，并將其在50ml提取緩沖液(20mMTris、25mM咪唑、500mMNaCl，pH7.5)中重懸。通過(guò)以25，OOOpsi使懸浮液流過(guò)ConstantSystems細(xì)胞破碎儀來(lái)溶解細(xì)胞，并用25ml提取緩沖液沖洗樣品。通過(guò)以24，OOOXg離心30分鐘，接著過(guò)濾流過(guò)0.22μm真空濾器裝置(MilliporeSteritop)來(lái)除去不溶性材料。在冰上保持澄清的溶胞物。用提取緩沖液平衡HisTrapFF5ml柱(GEHealthcare,Ni-SepharoseFF樹(shù)脂，1.6cm床直徑)。以4ml/分鐘加載43ml澄清的溶胞物樣品。用提取緩沖液以4ml/分鐘使未結(jié)合的材料清洗流過(guò)柱。用洗脫緩沖液(20mMTris、500mM咪唑、500mMNaCl,ρΗ7.5)以4ml/分鐘洗脫親和純化的蛋白質(zhì)，并收集A28tlIim洗脫峰。使用IOkDaMWCO離心濃縮器(MillporeAmiconUltra-15)將所收集的洗脫液進(jìn)行緩沖液交換成20mMTrispH7.5，并在同一裝置中濃縮至約3ml。以3700Xg離心樣品達(dá)10分鐘以除去任何沉淀物。使用比消光系數(shù)通過(guò)A28ciIim來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)濃度。濃度在4-15mg/ml的范圍，而產(chǎn)量通常為來(lái)自500ml培養(yǎng)液的15_30mg。于-80°C貯存樣品。實(shí)施例9模擬胃液(SGF)中的穩(wěn)定性實(shí)施蛋白質(zhì)樣品的模擬胃液消化率，基本上如記載于Thomas等，RegulatoryToxicologyandPharmacology39:87-98(2004)的。如實(shí)施例8中所描述的那樣純化每種測(cè)試蛋白質(zhì)。使用Pierces的BCA試劑盒來(lái)測(cè)定每種樣品的蛋白質(zhì)濃度。依照如下方案來(lái)制備G-Con溶液通過(guò)混合將200mg氯化鈉在90mlmilli_Q水中溶解。使用6NHCl將此溶液滴定至pH1.2，并添加milli-Q水至100ml的終體積。為每種測(cè)試蛋白質(zhì)制備具有胃蛋白酶的模擬胃液(IXSGF)以在反應(yīng)溶液中給出每Ig測(cè)試蛋白質(zhì)10個(gè)單位的胃蛋白酶。如此，貫穿整項(xiàng)研究使用10U胃蛋白酶活性/Ig測(cè)試蛋白質(zhì)的比率。胃蛋白酶以單批購(gòu)自SigmaChemical(St.Louis，MO)，具有如由Sigma分析的3460U/mg蛋白質(zhì)。在IOOmlmilli-Q水中用1.68gNaHCO3制備200mMNaHCO3，并用HCl滴定至pHll.0。在三種不同反應(yīng)混合物中于37°C在熱板上溫育每種測(cè)試蛋白質(zhì)達(dá)60分鐘。將含有G-Con或SGF的每管于37°C溫育2分鐘，之后添加測(cè)試蛋白質(zhì)。如下制備反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物1:400μ1總體積，含有SGF(每1μg在G-Con中的測(cè)試蛋白質(zhì)10個(gè)單位胃蛋白酶的比率的胃蛋白酶)和測(cè)試蛋白質(zhì)溶液反應(yīng)混合物2150μ1總體積，含有ρΗ1.2的G-Con(稀釋的HCl，IOOmMNaCl)禾口測(cè)試蛋白質(zhì)溶液(0.135mg/ml終濃度)；這是在沒(méi)有胃蛋白酶情況中反應(yīng)緩沖液中的測(cè)試蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的對(duì)照樣品反應(yīng)混合物3:150μ1SGF和水；這是胃蛋白酶自身消化(沒(méi)有測(cè)試蛋白質(zhì)情況中的胃蛋白酶)的對(duì)照樣品在0和60分鐘時(shí)從反應(yīng)混合物1和3(對(duì)照)，而在0.5、2、5、10、20、30、和60分鐘時(shí)從反應(yīng)混合物2(測(cè)試)取出50μ1樣品。將每種這些樣品轉(zhuǎn)移入含有35μ1200mMNaHCO3(ρΗ11.0)和4XBio-RadXT加載緩沖液兩者的終止溶液中。通過(guò)在添加測(cè)試蛋白質(zhì)前在溶液中淬滅胃蛋白酶來(lái)制備零時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)消化樣品。將所有樣品在70°C水浴中溫育5分鐘來(lái)停止反應(yīng)，然后使用SDS-PAGE來(lái)分析。在XTMOPS運(yùn)行緩沖液(Biorad)中在4-12%Bis-Tris凝膠(Biorad)上分析20μ1每種樣品。每道加載的蛋白質(zhì)總量為1.9ygo使用SeeBluePluS2預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen)作為分子量標(biāo)志物。電泳后，用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)對(duì)凝膠染色。通過(guò)在電泳后目視檢查經(jīng)染色的蛋白質(zhì)條帶來(lái)分析消化樣品。表6中概述了所生成的酶易感性肌醇六磷酸酶變體在模擬胃液中的穩(wěn)定性。每種蛋白質(zhì)的SGF穩(wěn)定性以時(shí)間長(zhǎng)度(按分鐘計(jì))指明，蛋白質(zhì)或其肽片段在SDS-PAGE后通過(guò)對(duì)凝膠的染色是目視可檢出的。表6酶易感性肌醇六磷酸酶的SGF穩(wěn)定性ISGF穩(wěn)定性(分鐘)I聚合物的存在~Mutl60+^Mut260+1Mut360+^Mut460+^Mut5<20^Mut660+^Mut7<20^有可獲得的如下矛盾信息，其關(guān)于肌醇六磷酸酶是否發(fā)揮單體蛋白質(zhì)功能或者它們是否發(fā)揮多聚體功能。自黑曲霉、土曲霉(Aspergillusterreus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、構(gòu)巢裸胞殼(Emericellanidulas)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)禾口Talaromycesthermophilus分離的肌醇六憐酸醇(Wyss等Appl.AndEnvior.Micro.65359-366(1999))發(fā)揮單體蛋白質(zhì)功能。另外，來(lái)自大豆種子(Gibson等Arch.Biochem.Biophys.260:503_513(1988))、大腸桿菌和土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)(Greiner,等Arch.Biochem.Biophys.303107-113(1993)；Greiner,等Arch.Biochem.Biophys.341:201_206(1997))、和枯草芽孢桿菌(Schimizu,Biosci.Biotechnol.Biochem.56:1266_1269(1992))的肌醇六磷酸酶表現(xiàn)為單體。在來(lái)自土曲(Aspergillusoryzae)>SchwanniomycescastelliiWIilIlTn^SlBlΦ聚體形成的證據(jù)已經(jīng)得到Hubel，等PlantPhysiol1121429-1436(1996)；Segueilha,等J.Ferment.Bioeng.74:7_11(1992)；SchimizuBiosci.Biotechnol.Biochem,571364-1365(1993)和Yamamoto等Agric.Biol.Chem.362097-2103證明。在對(duì)SGF測(cè)定法的SDS-PAGE分析中觀察到酶易感性肌醇六磷酸酶的多聚體形成。在SEQIDNO:4-9中所描述的半胱氨酸變體中在SGF測(cè)定法中沒(méi)有觀察到多聚體。實(shí)施例10突變型蛋白質(zhì)在pH范圍里的肌醇六磷酸酶活性遵循由Engelen等JournalofAOACInt.77(3):760_764(1994)所描述的測(cè)定方法來(lái)實(shí)施肌醇六磷酸酶活性測(cè)定法。在水中將酶(濃度范圍為0.5-10mg/ml的Nov9X或酶易感性肌醇六磷酸酶變體)稀釋10000至50000倍，之后在不同pH進(jìn)行測(cè)定法。如下制備具有植酸鹽底物的緩沖溶液甘氨酸-HC1緩沖液-對(duì)pH值2.0、2.5、3.0、和3.5使用含有3mM植酸的100mM甘氨酸。乙酸鹽緩沖液-對(duì)pH值4.0、4.5、5.0、和5.5使用含有3mM植酸的100mM乙酸鹽。Mes緩沖液-對(duì)pH值6、6.5、和7.0使用含有3mM植酸的100mMMes。用具有150u1稀釋的植酸鹽底物的300u1緩沖液一式兩份實(shí)施在不同pH的測(cè)定反應(yīng)。于37°C實(shí)施溫育達(dá)10分鐘和20分鐘，接著同時(shí)淬滅，并比色檢測(cè)。無(wú)機(jī)磷酸鹽產(chǎn)物與鉬酸根和釩酸根離子形成絡(luò)合物，導(dǎo)致顏色形成。在415nm波長(zhǎng)測(cè)量黃色釩鉬磷酸(vanadomolybdophosphoricacid)(其濃度與反應(yīng)混合物中的磷酸根離子濃度成比例)的吸光度。使用所測(cè)量的吸光度來(lái)測(cè)定磷酸根離子濃度，其通過(guò)與磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)校正曲線比較來(lái)實(shí)現(xiàn)。表7中概述了在pH4.5于37°C在存在3mM植酸鹽的情況中的相對(duì)肌醇六磷酸酶活性。相對(duì)活性表示為Nov9X活性的百分比。表7中概述了在pH2.5于27°C在存在3mM植酸的情況中的相對(duì)肌醇六磷酸酶活性活性。相對(duì)活性表示為在pH4.5的Nov9X活性的百分比。表7酶易感性肌醇六磷酸酶變體的相對(duì)活性實(shí)施例11突變型蛋白質(zhì)的熱耐受性比較將測(cè)試蛋白質(zhì)在lOOmM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)(含有0.01%Tween20)中稀釋，之后進(jìn)行熱處理。使用梯度PCR循環(huán)儀在40-95°C(每次溫育5°C增量)熱處理100yl每種稀釋的酶溶液達(dá)5分鐘。立即放置熱休克酶，并在冷卻條件中保持，直至完成測(cè)定稀釋液。在lOOmM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)(含有3mM植酸底物和0.01%Tween20)中進(jìn)行10000至50000倍稀釋后使用標(biāo)準(zhǔn)化的肌醇六磷酸酶測(cè)定法來(lái)評(píng)估熱休克酶級(jí)分中殘留的肌醇六磷酸酶活性。于37°C溫育肌醇六磷酸酶反應(yīng)混合物達(dá)15-40分鐘。在96深孔塊中一式兩份完成每份熱處理級(jí)分的測(cè)定法，并通過(guò)將比色反應(yīng)的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽曲線比較來(lái)評(píng)估所釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽量。通過(guò)與未處理的酶級(jí)分中觀察的活性比較來(lái)計(jì)算殘留的肌醇六磷酸酶活性。從殘留肌醇六磷酸酶活性對(duì)預(yù)處理溫度的曲線圖測(cè)定酶易感性肌醇六磷酸酶的相對(duì)熱耐受性。表8中所顯示的數(shù)值代表熱處理5分鐘會(huì)導(dǎo)致與未處理的酶相比肌醇六磷酸酶活性損失50%所處的溫度。表8酶易感性熱耐受性肌醇六磷酸酶的相對(duì)熱耐受性實(shí)施例12突變組合基于實(shí)施例9-11中所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，選擇特定的變體組合進(jìn)行分析。表9中描述了這些組合。產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌表達(dá)優(yōu)化的多核苷酸序列密碼子以編碼表9中所描述的多肽變體，基本上如實(shí)施例6中所描述的。然后將經(jīng)細(xì)菌密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列摻入細(xì)菌表達(dá)載體中，基本上如實(shí)施例7中所描述的，并且基本上如實(shí)施例8中所描述的那樣純化酶易感性肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)。表5中提及經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列和相應(yīng)的組合突變體多肽序列以概述序列列表中含有的多肽與多核苷酸序列之間的關(guān)系。表9酶易感性肌醇六磷酸酶變體的組合實(shí)施例13組合肌醇六磷酸酶變體在模擬胃液(SGF)中的穩(wěn)定性對(duì)組合肌醇六磷酸酶變體的純化蛋白質(zhì)分析對(duì)胃蛋白酶的敏感性，基本上如實(shí)施例9中所描述的。表10中概述了SGF穩(wěn)定性。表10組合肌醇六磷酸酶變體的SGF穩(wěn)定性ND沒(méi)有產(chǎn)生數(shù)據(jù)實(shí)施例14組合變體在pH4.5的相對(duì)肌醇六磷酸酶活性對(duì)自組合肌醇六磷酸酶變體純化的蛋白質(zhì)分析在pH4.5的活性，基本上如實(shí)施例10中所描述的。表11中概述了組合肌醇六磷酸酶變體在pH4.5的相對(duì)活性結(jié)果。表11組合變體在pH4.5的相對(duì)肌醇六磷酸酶活性ND沒(méi)有產(chǎn)生數(shù)據(jù)實(shí)施例15組合肌醇六磷酸酶變體的熱耐受性對(duì)自組合肌醇六磷酸酶變體純化的蛋白質(zhì)分析熱耐受性，基本上如實(shí)施例11中所描述的。表12中概述了關(guān)于組合肌醇六磷酸酶變體的熱耐受性數(shù)據(jù)。表11中所顯示的數(shù)值代表熱處理5分鐘會(huì)導(dǎo)致與未處理的酶相比肌醇六磷酸酶活性損失50%所處的溫度。表12組合肌醇六磷酸酶變體的相對(duì)熱耐受性ND:沒(méi)有產(chǎn)生數(shù)據(jù)實(shí)施例16供植物表達(dá)的變體的密碼子優(yōu)化將酶易感性肌醇六磷酸酶的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)變成多核苷酸序列。修飾多核苷酸序列以使得密碼子反映玉蜀黍中最佳的密碼子。合成如SEQIDNO:70-102中所描述的玉蜀黍優(yōu)化的多核苷酸序列，并將其亞克隆入GeneArt，Regensburg，德國(guó)的pFLEXHX大腸桿菌表達(dá)載體中。最終的載體含有如下的表達(dá)盒，其包含與添加N端His標(biāo)簽的序列連接的經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的酶易感性肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。為了容易參照，表5概述了序列列表中的多肽與多核苷酸序列之間的關(guān)系。實(shí)施例17制備植物轉(zhuǎn)化載體和創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物的方法在兩步中構(gòu)建供玉蜀黍轉(zhuǎn)化用的二元載體。在第一步中，融合三種片段以生成表達(dá)盒。表達(dá)盒由與包括SEKDELER保留序列的BamHI-SacI盒(含有感興趣的基因)融合的Hindlll-BamHI稻谷蛋白啟動(dòng)子盒組成。然后將此盒與SacI_KpnICMV35s終止子盒融合。終止子盒包括反向PEPC內(nèi)含子。然后以Hindlll-Kpnl片段將表達(dá)盒轉(zhuǎn)移入二元載體PN0V2117中，所述二元載體PN0V2117含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因，其容許用甘露糖選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞?；旧先鏝egrotto等，PlantCellReports19:798-803(2000)中所描述的那樣實(shí)施未成熟玉蜀黍胚的轉(zhuǎn)化。可以替換其中所描述的各種培養(yǎng)基成分。將含有植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的土壤桿菌菌株LBA4404(Invitrogen)在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l瓊脂，pH6.8)固體培養(yǎng)基上于28°C培養(yǎng)2至4天。將約0.8X109個(gè)土壤桿菌在補(bǔ)充有100mM乙酰丁香酮(As)的LS_inf培養(yǎng)基(LSA培養(yǎng)基)中懸浮(Negrotto等，PlantCellRep19:798_803(2000))。在此培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)細(xì)菌達(dá)30-60分鐘。從8-12日齡穗切出來(lái)自玉蜀黍系，即A188或其它合適的玉蜀黍基因型的未成熟胚，進(jìn)入液體LS-inf+lOOmMAs(LSA)中。將胚渦旋振蕩5秒，并用新鮮的感染培養(yǎng)基漂洗一次。除去感染培養(yǎng)基，然后添加土壤桿菌溶液，將胚渦旋振蕩30秒，容許與細(xì)菌一起沉淀5分鐘。然后將胚以盾片側(cè)向上轉(zhuǎn)移至LSA培養(yǎng)基，并在黑暗中培養(yǎng)2至3天。隨后，將每培養(yǎng)板20和25個(gè)之間的胚轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有頭孢噻肟(250mg/l)和硝酸銀(1.6mg/l)的LSD培養(yǎng)基(Negrotto等，PlantCellRep19:798_803(2000))，并在黑暗中于28°C培養(yǎng)10天。將產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織的未成熟胚轉(zhuǎn)移至LSD1M0.5S培養(yǎng)基(具有替換麥草畏(Dicamba)的0.5mg/l2，4_D、10g/l甘露糖、5g/l蔗糖，而沒(méi)有硝酸銀的LSD)。在此培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)物6周，在3周時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)步驟。將存活的愈傷組織轉(zhuǎn)移至要放大(bulkup)的LSD1M0.5S培養(yǎng)基或Regl培養(yǎng)基(如記載于Negrotto等，PlantCellRep19:798-803(2000)的)。在光亮(16小時(shí)光亮/8小時(shí)黑暗方案)中培養(yǎng)后，然后將綠色組織轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的Reg2培養(yǎng)基(如記載于Negrotto等，PlantCellRep19798-803(2000)的)，并溫育1_2周。將小植物轉(zhuǎn)移至裝有Reg3培養(yǎng)基(如記載于Negrotto等2000的)的MagentaGA-7盒(MagentaCorp,Chicago111.)，并在光亮中栽培。將在酶易感性肌醇六磷酸酶表達(dá)盒方面為PCR陽(yáng)性的植物轉(zhuǎn)移至土壤，并在溫室中栽培。通過(guò)+/-PCR測(cè)定法或通過(guò)Taqman拷貝數(shù)測(cè)定法來(lái)測(cè)定酶易感性肌醇六磷酸酶基因的存在。通過(guò)Taqman拷貝數(shù)測(cè)定法來(lái)測(cè)定pmi選擇標(biāo)志的存在。通過(guò)+/-PCR測(cè)定法來(lái)測(cè)定壯觀霉素抗性基因選擇標(biāo)志的存在。實(shí)施例18對(duì)表達(dá)酶易感性肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)基因玉蜀黍植物的分析會(huì)將轉(zhuǎn)基因種子在裝備有2.0讓篩的？吐切113100錘式粉碎機(jī)中磨碎，如此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米粉。在50mMTris-HCl(pH8.0)UOOmMNaCl、2mM中于環(huán)境溫度在攪動(dòng)的情況中提取來(lái)自PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因事件的面粉樣品(1克)達(dá)1小時(shí)。提取體積是100ml。通過(guò)離心來(lái)使提取物澄清，并用乙酸鈉緩沖液(PH5.5)稀釋。在一系列pH測(cè)量肌醇六磷酸酶活性，基本上如實(shí)施例10中所描述的。在微量板中在1ml的最終反應(yīng)體積實(shí)施測(cè)定法。實(shí)施例19動(dòng)物飼養(yǎng)研究會(huì)將微生物表達(dá)的肌醇六磷酸酶(8種變體)預(yù)混合至多項(xiàng)肉雞飼養(yǎng)研究中包括的小麥載體上。會(huì)以約3，500個(gè)FTU/g預(yù)混合物標(biāo)準(zhǔn)化肌醇六磷酸酶預(yù)混合物。預(yù)混合的肌醇六磷酸酶會(huì)包括在典型的基于玉米-SBM的定量(ration)中，所述基于玉米-SBM的定量配制用于滿足幼年的、生長(zhǎng)中的肉雞的所有需要(除磷之外)。會(huì)將肌醇六磷酸酶添加至起子定量，導(dǎo)致每kg最終定量250至600個(gè)FTU的肌醇六磷酸酶活性的最終濃度。會(huì)任意地以漿狀或顆粒狀形式給重復(fù)的數(shù)(4至10)組5至8只圈養(yǎng)在環(huán)境受控房間的層架式雞籠中的雞喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用飲食。在含有實(shí)驗(yàn)用酶的飲食外，會(huì)給類似的重復(fù)組的雞飼料喂養(yǎng)陽(yáng)性對(duì)照(磷足夠的)、陰性對(duì)照(磷缺乏的)和逐步添加的磷(標(biāo)準(zhǔn)曲線)以容許分析酶響應(yīng)。會(huì)使用性能特性(喂養(yǎng)期間里的飼料攝取、體重增加和飼料與增加的比率)和使用喂養(yǎng)期結(jié)束時(shí)雞的脛骨灰分含量來(lái)測(cè)定酶評(píng)估和表征。會(huì)使用性能和脛骨灰分?jǐn)?shù)據(jù)的斜率比、標(biāo)準(zhǔn)曲線(standcurvehANOVA和受保護(hù)LSD比較的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)酶效用的分析。實(shí)施例20造粒研究會(huì)將微生物表達(dá)的肌醇六磷酸酶(8種變體)預(yù)混合至多項(xiàng)高溫飼料造粒研究中包括的小麥載體上。會(huì)以約3，500個(gè)FTU/g預(yù)混合物標(biāo)準(zhǔn)化肌醇六磷酸酶預(yù)混合物。預(yù)混合的肌醇六磷酸酶會(huì)包括在典型的基于玉米-SBM的定量(ration)中，所述基于玉米-SBM的定量配制用于滿足幼年的、生長(zhǎng)中的肉雞的所有需要(除磷之外)。會(huì)將肌醇六磷酸酶添加至起子定量，導(dǎo)致每kg最終定量250至750個(gè)FTU的肌醇六磷酸酶活性的最終度。會(huì)使用代表本研究飼料加工機(jī)的研磨機(jī)(mill)和方法來(lái)對(duì)完全混合的含有實(shí)驗(yàn)用肌醇六磷酸酶的糊狀飲食造粒。對(duì)飲食造粒的溫度會(huì)有所變化以包括70和100°C之間采用的顆粒狀飼料樣品。會(huì)跨越多天對(duì)飲食造粒，并分析殘留的肌醇六磷酸酶活性，并且會(huì)表示為自漿狀(造粒前)樣品殘留的百分比活性。會(huì)使用AN0VA和受保護(hù)LDS分析來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)殘留酶活性的分析。實(shí)施例21制備酶易感性木聚糖酶的方法可以使用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究合作實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中以PBDID:1XXN、2DCY、1BW、2Z79可獲得的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)為木聚糖酶基因(諸如那些作為來(lái)自US專利號(hào)7，291，493的SEQID14或16列出的)建模，如實(shí)施例1中所描述的?？梢允褂脕?lái)自ACCelryS，InC.的InsightII包內(nèi)的軟件程序Modeler來(lái)創(chuàng)建木聚糖酶計(jì)算模型，并會(huì)選擇具有最低目標(biāo)函數(shù)的模型?？梢允褂肧wissPdbViewer(Guex,N.禾口Peitsch，M.C.SWISS—MODELandtheSwiss-PdbViewer:Anenvironmentforcomparativeproteinmodeling.Electrophoresis,18,2714-2723(1997))來(lái)為去糖基化、消除潛在分子內(nèi)二硫鍵和引入胃蛋白酶切割位點(diǎn)的突變建模。然后可以使用理性設(shè)計(jì)來(lái)修飾木聚糖酶變體，如實(shí)施例2-5中所描述的?？梢砸杂?jì)算方式以及通過(guò)對(duì)畢赤酵母和玉米胚乳中表達(dá)的蛋白質(zhì)變體的質(zhì)譜分析來(lái)鑒定木聚糖酶的N-糖基化位點(diǎn)?？梢孕揎椣鄳?yīng)的糖基化氨基酸殘基以除去木聚糖酶突變體中的糖基化位點(diǎn)?？梢詮膩?lái)自US專利號(hào)7，291，493的SEQID14或16的氨基酸序列鑒定木聚糖酶中的特定半胱氨酸殘基。會(huì)靶向參與分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基進(jìn)行改變。還可以靶向參與分子間二硫鍵的木聚糖酶半胱氨酸殘基進(jìn)行改變?？梢詫⒏淖兌ㄎ恢聊揪厶敲傅鞍踪|(zhì)的三維模型上以避免對(duì)蛋白質(zhì)總體結(jié)構(gòu)及其折疊成正確構(gòu)象的能力進(jìn)行改變?？梢詮哪揪厶敲傅娜S結(jié)構(gòu)模型鑒定木聚糖酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的環(huán)。特定的環(huán)會(huì)需要滿足與實(shí)施例4中鑒定的相同的三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。然后可以通過(guò)用高度有利的胃蛋白酶切割位點(diǎn)序列完全插入環(huán)中或者替換環(huán)來(lái)修飾所鑒定的環(huán)(KeilB.，SpecificityofProteolysis.Springer-VerlagBerlin-Heidelber-NewYork第335頁(yè)(1992))。然后可以通過(guò)以計(jì)算機(jī)方式將蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)變成多核苷酸序列來(lái)針對(duì)細(xì)菌表達(dá)優(yōu)化變體。然后可以針對(duì)大腸桿菌表達(dá)優(yōu)化多核苷酸序列。然后可以合成大腸桿菌優(yōu)化的多核苷酸序列，并將其亞克隆入GeneArtRegensburg，德國(guó)的pFLEXHX大腸桿菌表達(dá)載體中。最終的載體會(huì)含有如下的表達(dá)盒，其包含與N端His標(biāo)簽連接的經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的酶易感性肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。然后可以將來(lái)自pFLEXHX的經(jīng)過(guò)細(xì)菌密碼子優(yōu)化的含有酶易感性木聚糖酶的表達(dá)盒克隆入pET24a(Invitrogen)和pFLEXHXT7表達(dá)載體中，如實(shí)施例7中所描述的。然后可以將含有表達(dá)盒的pET24和pFLEXHXT7載體轉(zhuǎn)化入BL21[DE3]大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中，并在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB培養(yǎng)基中成長(zhǎng)，如實(shí)施例8中所描述的?？梢宰赃@些大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分離木聚糖酶，如實(shí)施例8中所描述的。會(huì)基本上如記載于Thomas等，RegulatoryToxicologyandPharmacology3987-98(2004)的那樣和如實(shí)施例9中所描述的那樣實(shí)施木聚糖酶蛋白質(zhì)樣品的模擬胃液消化率。可以使用如PCT專利公開(kāi)文本號(hào)W02007/146944中所披露的木聚糖酶測(cè)定方法在多個(gè)pH范圍里分析木聚糖酶活性，聚合和熱耐受性，如實(shí)施例10-11中所描述的?；趶淖约?xì)菌表達(dá)和分離的木聚糖酶突變體產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，會(huì)使用來(lái)自PCT專利公開(kāi)文本號(hào)W02007/146944的木聚糖酶測(cè)定方法選擇特定的變體組合進(jìn)行分析，如實(shí)施例12-15中所描述的。會(huì)針對(duì)植物表達(dá)對(duì)選定的木聚糖酶變體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將其合成，并亞克隆入pFLEXHX大腸桿菌表達(dá)載體中，如實(shí)施例16中所描述的?？梢曰旧先鐚?shí)施例17中所描述的那樣構(gòu)建含有突變型木聚糖酶基因的植物轉(zhuǎn)化載體。會(huì)使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化來(lái)創(chuàng)建表達(dá)酶易感性木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物，如實(shí)施例16中所描述的。然后可以使用PCT專利公開(kāi)文本號(hào)W02007/146944中所披露的木聚糖酶方法來(lái)分析表達(dá)酶易感性木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因玉蜀黍植物。權(quán)利要求一種提高蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性的方法，包括下列步驟a)創(chuàng)建熱力學(xué)穩(wěn)定性升高的變體；b)為所述蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)建模；c)鑒定所述三維模型的域；d)通過(guò)改變所述三維模型的域來(lái)創(chuàng)建所述蛋白質(zhì)的變體；e)選擇具有至少等于所述蛋白質(zhì)的活性的變體；并f)測(cè)試所述變體對(duì)蛋白酶的敏感性，其中敏感性導(dǎo)致在暴露于所述蛋白酶時(shí)消化所述變體。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述活性選自下組熱耐受性、酸性PH活性、堿性pH活性和比活性。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述建模選擇下組X射線晶體學(xué)、核磁共振和計(jì)算建模。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述域選自下組糖基化域、半胱氨酸殘基、和暴露于周?chē)橘|(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的環(huán)。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶選自下組胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰內(nèi)肽酶、組織蛋白酶G、類胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胱天蛋白酶-1、彈性蛋白酶、羧肽酶和二肽酶E。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是酶。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是增強(qiáng)酶。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)展現(xiàn)出在SGF中持續(xù)至少10分鐘的穩(wěn)定性。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述酶是肌醇六磷酸酶。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述肌醇六磷酸酶源自原核生物體。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述肌醇六磷酸酶源自大腸桿菌。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述肌醇六磷酸酶是Nov9X。全文摘要本發(fā)明提供了一種合成的肌醇六磷酸酶多肽，其編碼一種酶易感性肌醇六磷酸酶。還提供了包含酶易感性肌醇六磷酸酶的飼料或食物產(chǎn)品，和表達(dá)所述酶易感性肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。進(jìn)一步提供了用于制備和使用酶易感性肌醇六磷酸酶的方法，例如在飼料和食物加工中使用酶易感性肌醇六磷酸酶的方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK101883500SQ200880119079公開(kāi)日2010年11月10日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日發(fā)明者夏伊布·S·巴蘇,張生生申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司