專利名稱：核酸擴增的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及選擇性擴增特定核酸序列的方法。擴增的選擇性通過將至少一種經(jīng)修 飾的寡核苷酸引物與其相應的協(xié)助寡核苷酸(facilitatornucleotide) —同使用于熱循 環(huán)(thermocyclic)酶擴增反應來達成。選擇性亦通過所述協(xié)助寡核苷酸所結(jié)合的位于擴 增子內(nèi)的序列來提供。本發(fā)明亦涉及對擴增產(chǎn)物的操作，以及根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的修飾 產(chǎn)物的用途，例如，添加3’單鏈序列，其可用作獨特的核苷酸序列結(jié)合位點。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈式反應(PCR)為迅速合成核酸分子給定區(qū)段大量拷貝的方法(參見，例 如，Mullis et al US Patent Nos. 4683195，4683202 and 4800159)。PCR 技術(shù)極端敏感， 理論上僅需要一個單獨的核酸分子以供擴增。PCR為酶介導的反應，通常將模板分子，一對 寡核苷酸引物與核酸聚合酶摻入反應介質(zhì)中，所述介質(zhì)包含合適的鹽，金屬陽離子，游離核 苷酸與PH緩沖系統(tǒng)。PCR過程為基于雙鏈核酸變性，繼以寡核苷酸引物退火結(jié)合于所述核 酸模板，并通過聚合酶進行引物延伸的反復循環(huán)。所述PCR中所用的寡核苷酸引物設計為 退火結(jié)合于所述模板分子的相反鏈，并定位于側(cè)接(flanking)需擴增的靶序列的。當引物 從其3’末端通過所述聚合酶延伸時，延伸產(chǎn)物提供原先靶序列的拷貝，其可順次作為后繼 擴增輪次的模板分子而起作用。PCR擴增導致個別核酸分子的指數(shù)性增加，以獲取所需量的 擴增核酸產(chǎn)物，其長度由所述寡核苷酸引物的5’末端所限定。雖然大體而言，PCR簡單且具有特異性，但其易受幾種類型的不希望的矯作物的影 響，其對于用戶而言可為成問題的，且可妨礙所述技術(shù)的選擇性與特異性。舉例而言，片段 非特異性擴增可來自所述引物的一個或兩者結(jié)合于靶序列以外的序列，其可產(chǎn)生一個或多 個非所期望產(chǎn)物的片段。引物的非特異性結(jié)合頻繁出現(xiàn)，且可為下述原因?qū)е?，例如，在?核苷酸序列模板上引物結(jié)合序列交替存在，在外源污染分子上相似引物結(jié)合序列的存在和 /或欠佳的引物序列設計。這些非特異性核酸產(chǎn)物可為成問題的，尤其是當含有所述靶序列 的模板核酸以少量拷貝存在時。在一些情況下，引物可能結(jié)合于僅為部分互補的結(jié)合位點，甚至當與其結(jié)合的DNA 的錯配存在于引物3，末端時亦被延伸(例如，參見Kwok et al. 1990, “ Effects of primer template mismatches on the polymerase chain-reaction-human-immunodeficiency-vi rus type-1 model studies. “ Nucleic Acids Researchl8 (4) :999_1005)。由于該原因， 可發(fā)生不希望的非特異性擴增。當拷貝由引導錯誤(mispriming)產(chǎn)生的DNA鏈時，產(chǎn)生了 完全匹配所述引物的引物結(jié)合位點。從而在標準PCR中可出現(xiàn)不希望的產(chǎn)物，且其兩個末 端均具有完全互補于引物的結(jié)合位點。從而一旦該不希望的產(chǎn)物產(chǎn)生，其很可能將以高效 率擴增。換言之，一旦出現(xiàn)引導錯誤，在標準PCR中不再可能具有后繼的特異性。盡管數(shù)種 類型的探針可用于特異性的檢測希望的靶，但若發(fā)生了過多非特異性擴增，所期望產(chǎn)物的 產(chǎn)生可遭阻遏，或減少到使用所述特異性探針無法檢測的水平。該情況最可能在當所述目 標僅僅構(gòu)成總核酸的非常微小部分時發(fā)生。當非特異性擴增發(fā)生在PCR循環(huán)早期輪次時，亦導致其加劇。通常在現(xiàn)有PCR技術(shù)
5中，由所述引物序列產(chǎn)生的特異性僅僅在所述PCR早期輪次中達成。一旦產(chǎn)生了相當量的 產(chǎn)物，無論引物是側(cè)接靶序列的預期位點還是從由引導錯誤產(chǎn)生的非特異性擴增子延伸， 擴增均以相同速率繼續(xù)。換言之，即使當引物可能結(jié)合且延伸自引物僅具有部分互補性的 錯誤位點發(fā)生，所擴增的非特異性產(chǎn)物由于所述PCR技術(shù)摻入了準確的引物結(jié)合序列，且 其在后續(xù)PCR循環(huán)中與含有所述靶序列的核酸模板以相同效率競爭寡核苷酸引物的結(jié)合。 在例如等位基因特異性PCR之類的應用中，通常需要在引物設計中著重注意以及在技術(shù)優(yōu) 化中相當努力以盡可能減少引導錯誤。若希望嘗試限制非特異性產(chǎn)物擴增的發(fā)生，現(xiàn)行PCR技術(shù)可使用經(jīng)修飾的過程針 對性的增加引物結(jié)合于靶核酸的特異性。這可涉及，例如，改變介導引物結(jié)合過程的不同輔 助因子(co-factor)的存在與否或濃度，或者修飾所述PCR方法的熱循環(huán)?；蛘?，可使用嵌 套式(nested)PCR，其涉及在PCR中兩個連續(xù)輪次中使用兩套引物。第一次PCR擴增產(chǎn)生靶， 以及使用第一套引物導致的潛在非特異性產(chǎn)物，而第二個PCR輪次使用新引物以在第一輪 次的靶產(chǎn)物中擴增二次靶(secondary target)，以盡量減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。盡管增加了引物結(jié)合特異性的現(xiàn)行PCR技術(shù)修飾為有用的，其多數(shù)需要大量的反 復嘗試(trial and error)，可為消耗時間的與麻煩的。此外，即使在并用這些技術(shù)后，固有 難以移除的的非特異性產(chǎn)物仍經(jīng)常留存。其結(jié)果，當下存在對改善下述基于PCR方法的需 求，即所述方法可以改善靶核酸序列的選擇性擴增。使用下述方法，本文描述的新發(fā)明包括對位于起始核苷酸序列的引導位點之間的 序列的選擇性，并可在一個單獨反應中提供額外的序列特異性，其通常需使用嵌套PCR與 兩輪PCR獲取。發(fā)明綜述本發(fā)明基于發(fā)明人的下述驚人發(fā)現(xiàn)，即PCR的特異性可通過使用兩個均結(jié)合于靶 序列相同末端的修飾寡核苷酸來增強。這些修飾寡核苷酸之一(本文定名為“協(xié)助寡核苷 酸”)并不充當引物，其3’末端或其附近的修飾阻止延伸。所述協(xié)助寡核苷酸充當模板以 供擴增子序列的再生，且不直接摻入任何擴增產(chǎn)物。另一個修飾寡核苷酸(本文定名為“起 始引物”)經(jīng)如下修飾，即其使得當自引物的聚合酶介導3’延伸為可能時，阻止在相對鏈上 聚合酶的拷貝。在特定實施方案中，該引物可與所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域具有足夠的序 列同一性，從而使得在使用協(xié)助寡核苷酸進行鏈延伸(fllowingstand extension)再生了 所述起始引物結(jié)合位點，從而由此使所述起始引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成。在上述情 況下，所述起始引物具有“協(xié)助寡核苷酸依賴性”，這是因為與擴增核苷酸序列模板的連續(xù) 結(jié)合依賴于所述協(xié)助寡核苷酸充當模板以供再生所述起始引物結(jié)合位點。在所述起始引物 與所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域間缺乏足夠的序列同一性的情況下，所述方法可利用額外的 “協(xié)助寡核苷酸依賴性引物”，其經(jīng)修飾從而使得該修飾的存在過早地(prematurely)終止 互補鏈的合成，且該引物與所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得 使用所述協(xié)助寡核苷酸的鏈合成產(chǎn)生了協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點，從而由此使所 述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成。依照本發(fā)明，協(xié)助寡核苷酸與起 始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物可組合用于需擴增的靶序列的一端或兩端。本發(fā)明的實施方案提供了在含有核酸分子的生物樣品中選擇性擴增特定靶核苷 酸序列的方法。上述方法在此亦總稱為雜交依賴性鏈式反應(hybridisation dependentchain reaction, HDCR)。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了選擇性擴增位于核酸分子內(nèi)靶核苷酸序列的方 法，所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下述物質(zhì)相接觸(i)至少一個協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在3’末端或其附近包含至少 一個修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，以及(ii)兩個或更多寡核苷酸引物，至少其中之一為起始引物，經(jīng)修飾從而使得該修 飾的存在過早地終止互補鏈合成，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物基本上結(jié)合于所述模板核酸分子的相同 或鄰近區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與位于靶序列上所述起始引物結(jié)合位置3’的 序列互補的序列(wherein the facilitatoroligonucleotide and the initiator primer bind to substantially the same or adjacentregions of the template nucleic acid molecule and the facilitator oligonucleotidefurther comprises sequences complementary to the target sequence to thebinding location of the initiator primer)；并實施熱循環(huán)酶擴增反應，從而使得所述特定靶序列選擇性的擴增。該方法可包含下列步驟(a)使所述模板核酸分子變性；(b)將所得變性模板核酸分子與至少一種起始引物接觸，并自此起始第二鏈合成， 從而由此將所述修飾從所述起始引物導入新合成的鏈中；(c)將上述產(chǎn)生的雙鏈分子變性，并由位于所述起始引物結(jié)合的靶核苷酸序列相 反末端的引物起始反向鏈合成，由此反向鏈合成由于步驟(b)導入的修飾而過早終止；(d)將所得新合成的雙鏈分子變性，將所述協(xié)助寡核苷酸結(jié)合于步驟(C)產(chǎn)生的 不完整反向鏈，并自此起始鏈延伸，以由此完成所述反向鏈；以及(e)任選地(optionally)重復步驟(a)到(d) 一個或多個額外循環(huán)。在實施方案中，所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物具有足夠的序列同一 性，從而使得在所述協(xié)助寡核苷酸起始鏈延伸再生了所述起始引物結(jié)合位點，從而由此使 所述起始引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成。在另一個可選實施方案中，所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物不具有足 夠的序列同一性，從而使得所述起始引物結(jié)合位點在所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈合成后未再生。依照該另一種可選實施方案，所述方法可進一步使用協(xié)助寡核苷酸依賴性引物， 經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且該引物與所述協(xié)助寡核苷酸的5’ 區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得使用所述協(xié)助寡核苷酸的鏈合成產(chǎn)生了協(xié)助寡核苷 酸依賴性引物結(jié)合位點，從而由此使所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物得以起始后續(xù)輪次的鏈 合成。該方法可用于改善對所期望靶序列擴增的特異性，隨之基本上減少或消除了非期 望的非靶序列擴增。所述核酸分子可存在于任何合適的生物樣品中，包括，例如，組織，細胞和/或提 取物。在實施依照本發(fā)明的擴增方法前，可從所述生物樣品中提純所述核酸分子。所述核酸分子可為DNA或RNA或可包括脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和/或天然
7核苷酸類似物的組合。通常，阻斷所述協(xié)助寡核苷酸3’延伸的所述至少一種修飾包括在3’末端或其附 近摻入一個或多個不可延伸部分(moiety)或核苷酸類似物，例如單獨的3’末端不可延伸 的堿基或堿基類似物，3’末端不可延伸的堿基與靠近所述寡核苷酸3’末端一個或多個核 苷酸錯配的組合，或在所述寡核苷酸3’末端附近摻入脫堿基位點(abasive site)。所述 不可延伸的堿基可選自，例如，2’，3’ 二脫氧核苷酸，3’ C3，C18或其它長度間隔區(qū)(length spacer)，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸(peptide nucleic acid) ”堿基，“鎖定核酸(locked nucleic acid，LNA) ”堿基，核苷酸胺衍生物，經(jīng)尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡萄糖基酶處理的尿嘧啶，RNA 或2’ 0-甲基核苷酸，或上述的組合。所述起始引物和/或所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物可經(jīng)修飾包含，例如，一個或 多個間隔區(qū)，脫堿基位點或修飾核苷酸，例如2’-0_甲基核苷酸。通常在起始引物和/或協(xié) 助寡核苷酸依賴性引物中的修飾位于足夠靠近所述引物的3，端，從而使得雖然所述引物保 留起始3’延伸的能力，但當在其引物序列中包含所述修飾的延伸產(chǎn)物被拷貝時，其互補鏈 過早地遭截短(truncated)從而阻止了后續(xù)擴增循環(huán)中引物的結(jié)合。舉例而言，在特定實 施例中，所述修飾可位于距所述引物的3’末端約10個堿基，9個堿基，8個堿基，7個堿基， 6個堿基，5個堿基或4個堿基處。所述協(xié)助寡核苷酸的5’末端可與所述起始引物和/或所述協(xié)助寡核苷酸依賴性 引物的 5’ 末端相符或位于其中(The 5' terminus of the facilitatoroligonucleotide may coincide with or fall within the 5' terminus of the initiatorprimer and/or the facilitator oligonucleotide-dependent primer)?；蛘?，所述協(xié)助寡核苷酸可包含 額外的5 ’序列。上述額外序列可用作可檢測的標記或標簽，或可協(xié)助附加所述標記或標簽。在實施方案中，兩個引物(正向與反向引物)均為起始引物。在此情況下，使用 兩個協(xié)助寡核苷酸，其中之一結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰近的區(qū)域作為 正向起始引物，而另一個結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰近的區(qū)域作為反向起 始弓I物(one of which binds to substantiallythe same or adjacent region of the template nucleic acid molecule as the forwardinitiator primer and the other binds to substantially the same or adjacent regionof the template nucleic acid molecule as the reverse initiator primer)0根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了改善熱循環(huán)酶擴增反應特異性的方法，所述反 應使用至少兩個側(cè)接位于核酸分子中目標的靶核苷酸序列的核苷酸引物，其中所述引物中 的至少一個經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且所述反應進一步使用 至少一個非引發(fā)(non-priming)的協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在其3’末端或其 附近包含至少一個修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，且其中所述協(xié)助 寡核苷酸與所述修飾引物基本上結(jié)合于所述模板核酸分子上相同或鄰近的區(qū)域，且所述協(xié) 助寡核苷酸進一步包括與靶序列上3’于所述修飾引物結(jié)合位置的序列互補的序列。所述熱循環(huán)酶擴增反應的特異性通常由消除不包括所述目標的靶核苷酸序列的 擴增產(chǎn)物或減少其量來確定。依照上述方面與實施方案所述的方法可用于，例如，DNA甲基化分析和/或診斷受 試者的疾病或病狀，或者預報其針對該疾病或病狀的易感性，其中該疾病或病狀以變體基因序列為特征，或與其相關(guān)。所述變體序列可包含添加，缺失或取代一個或多個核苷酸，或 對一個或多個核苷酸的修飾，例如改變的甲基化狀態(tài)。相應的，本發(fā)明的第三個方面提供檢測變體核苷酸序列的方法，所述方法包括選 擇性的擴增位于核酸分子內(nèi)并包含所述變體序列的靶核苷酸序列，其中所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下述物質(zhì)相接觸(i)至少一個協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在3’末端或其附近包含至少 一個修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，以及(ii)兩個或多個寡核苷酸引物，至少其中之一為起始引物，經(jīng)修飾從而使得該修 飾的存在過早地終止互補鏈合成，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物基本上結(jié)合于所述模板核酸分子的相同 或鄰近區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與位于靶序列上所述起始引物結(jié)合位置3’ 的序列互補的3’序列，且其中所述3’序列使所述協(xié)助寡核苷酸得以優(yōu)選結(jié)合于所述包 含所述變體序列的靶核苷酸序列，而非其相應的非變體序列(comprises 3' sequences complementary to the targetsequence to the binding location of the initiator primer and wherein said 3 ' sequences enable preferential binding of the facilitator oligonucleotide to thetarget nucleotide sequence comprising the variant sequence rather than tocorresponding nonvariant sequence)；實施熱循環(huán)酶擴增反應，從而使得所述特定靶序列選擇性的擴增；以及將所得擴增產(chǎn)物的核苷酸序列與所述非變體序列相應的序列相比較，以檢測所述 變體核苷酸序列。在實施方案中，所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物具有足夠的序列同一 性，從而使得在自所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈延伸再生了所述起始引物結(jié)合位點，從而由 此使所述起始引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成。在另一個實施方案中，所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物的相應區(qū)域不 具有足夠的序列同一性，從而使得所述起始引物結(jié)合位點在自所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈 合成后未再生。依照該另一種實施方案，所述方法可進一步使用協(xié)助寡核苷酸依賴性引物，該引 物與所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸起 始的鏈合成產(chǎn)生了協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點，從而由此使所述協(xié)助寡核苷酸依賴 性引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成。所述變體序列包括添加，缺失或取代一個或多個核苷酸，或針對在所述靶序列內(nèi) 一個或多個核苷酸的修飾，例如改變的甲基化狀態(tài)。附圖的簡短描述在此就附圖僅以非限定示例的方式描述本發(fā)明。

圖1 依照本發(fā)明實施方案雜交依賴性鏈式反應中步驟的概略表示。圖2 反向引物(AluRev)，正向起始引物(InAluPrf)與協(xié)助寡核苷酸 (InAluFol 15)的序列與其針對源自人類Alu重復序列的靶核酸序列模板的結(jié)合位置。Δ 代表脫堿基位點；I代表次黃苷(inosine)。序列在UDG處理后顯示。圖3:實時HDCR擴增曲線(在兩次重復實驗中)顯示依照本發(fā)明實施方案的雜交依賴性鏈式反應的擴增Alu產(chǎn)物的量(通過熒光測定)，包含起始引物(FD引物) InAluPrf自身；InAluFol 15協(xié)助寡核苷酸(foligo)自身；或者FD引物InAluPr3與foligo InAluFol 15 的組合。圖4 突變核酸模板序列(MUTB)與正常核酸模板序列(NORB)的序列同一性與比 對。癌基因型的T到A突變(V600E)在所述突變序列中(MUTB)以下劃線表示。所示序列 的中間區(qū)域(包括所述T到A突變)源自v-raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物(homolog) Bl (BRAF)。圖5 反向引物(CommR3G)，起始引物(BRF2)與協(xié)助寡核苷酸(BFol3)的序列與 其針對突變(MUTB)與正常(NORB)靶核酸序列模板的結(jié)合位置。在下劃線序列中的缺口 (gap)代表與協(xié)助寡核苷酸(BFol3)或在起始引物(BRF2)中脫堿基位點(△)錯配的靶核 酸序列。I代表次黃苷；ddG代表二脫氧鳥嘌呤核苷。圖6 實時HDCR擴增曲線(在兩次重復實驗中)顯示在兩個退火溫度，68°C與72°C 下，依照本發(fā)明實施方案的雜交依賴性鏈式反應所產(chǎn)生的正常BRAF基因靶序列(圓形)與 含有點突變的BRAF基因靶序列(三角形)擴增產(chǎn)物的量(通過熒光測定)，如圖4所示。圖7 源自hMLHl基因甲基化(M)與未甲基化⑶核苷酸序列模板的序列同一性與 比對。下劃線序列指明所述hMLHl基因的亞硫酸氫鹽處理區(qū)域，而粗體的區(qū)域指明在M與 U序列模板間的核苷酸差異，并且顯示了其在所述協(xié)助寡核苷酸上的相應位置。圖8 反向引物(CommR3G)，起始引物(MLH20)與協(xié)助寡核苷酸(MLHFl)的序列與 其針對如圖7所示來自hMLHl基因的甲基化(M)與未甲基化(U)靶核酸序列模板的結(jié)合位 置。Δ代表脫堿基位點(d-間隔區(qū))。u代表2’ -0-甲基-尿嘧啶。下劃線序列指明在M 與U序列模板間的核苷酸差異，并且顯示了其在所述協(xié)助寡核苷酸上的相應位置。圖9:A與B。實時HDCR擴增曲線(在兩次重復實驗中)顯示中間熱循環(huán)加熱步 驟(74°C )⑶對來自hMLHl基因的甲基化(M)與未甲基化⑶靶序列模板所擴增產(chǎn)物(由 熒光測定)的作用。圖10 :TMEFF2與hMLHl基因供自亞硫酸氫鹽處理DNA擴增的靶序列。對來自用 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換引發(fā)位點區(qū)域的序列與的相應的TMEFF2的起始寡核苷酸，TMEFInLl與 TMEFInRl，及協(xié)助寡核苷酸 TMEFLdS170 與 TMEFRdS133，hMLHl 的起始引物 MLHInit2 與 MLHInitl，及協(xié)助寡核苷酸RMLH170與13IhMLHFoldS2，以及共同的外部協(xié)助寡核苷酸依賴 性引物MCD4與MCD6進行序列比對。ddG表示使用末端轉(zhuǎn)移酶(在寡核苷酸合成之后)添 加的二脫氧G。下劃線的堿基為可與添加的ddG —同減少或消除延伸的錯配。Δ表示d-間 隔區(qū)；“5”表示5-甲基胞嘧啶(當其在寡核苷酸中存在于C的位置上時)；而R表示A與G 的混合物。后續(xù)序列的存在由一表示。圖11 實時HDCR擴增曲線(每個均為在兩次重復實驗中)顯示來自甲基化(M)或 未甲基化(U)的亞硫酸氫鹽處理模板DNA的甲基化TMEFF2(小圖A)或hMLHl (小圖B)的 擴增。在左邊小圖所述甲基化產(chǎn)物的擴增通過特定HEX標記的TaqMan探針檢測，而在右邊 小圖中總擴增DNA使用SYBR綠(SYBR green)檢測。圖12 實時HDCR擴增曲線(每個均為在兩次重復實驗中)顯示自甲基化，亞硫酸 氫鹽處理模板DNA擴增甲基化hMLHl。個別寡核苷酸指明忽略。在左邊小圖所述甲基化產(chǎn) 物的擴增用特定HEX標記TaqMan探針檢測，而右邊小圖中總擴增DNA使用SYBR綠檢測。
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詳細描述貫穿本說明書及其所附的權(quán)利要求，除非上下文另行宣稱，詞語“包括 (comprise) ”，以及其變體“包括(comprises) ”或“包括(comprising) ”，應理解為意指包含 確定的整體(integer)或步驟或者整體或步驟的集合，但不排除任何其它整體或步驟或者 整體或步驟的集合。冠詞“一個(a)”與“一個(an)”在本文中用于指一個或多于一個該冠詞限定的語 法對象。舉例說明，“一個要素(an element)”意指一個要素或多于一個要素。如本發(fā)明背景下所用的術(shù)語“擴增”指通過熱循環(huán)酶反應制成一個或多個拷貝 的靶核苷酸序列，并且包括但不僅限于，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增核酸分子。如 本文所用術(shù)語“聚合酶鏈式反應”(PCR)指下述技術(shù)，即其通過在熱循環(huán)過程中所述的寡 核苷酸引物引導的酶擴增反應以產(chǎn)生大量拷貝的核酸序列特定區(qū)段。不同PCR技術(shù)的 示例括但不僅限于逆轉(zhuǎn)錄PCR，嵌套PCR，同源基因特異性(Allele-Specific)PCR，定量 PCR，大范圍(LongRange)PCR，快速擴增多態(tài)性 DNA 分析(Rapid Amplified Polymorphic DNAAnalysis)，快速擴增 cDNA 末端(Rapid Amplification of cDNA ends)，差異顯示 (Differential Display)PCR，連接反應介導(Ligation-Mediated)PCR，甲基化特異性 (Methylation specif ic) PCR，頭環(huán)(Headloop)PCR 與重甲基(HeavyMethyl) PCR。除 DNA 的 指數(shù)擴增外，PCR亦可指線性，非指數(shù)DNA擴增，而本領域技術(shù)人員將了解任一形式的擴增 對本發(fā)明的目的均為合適的。如本文所使用的術(shù)語“核酸”，“寡核苷酸”與“引物”指任何基于核酸的分子，包括 DNA, cDNA, RNA, mRNA, cRNA, PNA或其任意組合。因此，核酸分子，寡核苷酸與引物可包含天 然出現(xiàn)的核苷酸，非天然出現(xiàn)的核苷酸或其組合。如本文所使用的術(shù)語“寡核苷酸”指單鏈序列的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿 基，天然核苷酸的已知類似物，或其混合物。寡核苷酸通常為短(例如，長度小于50個核苷 酸)序列，可通過任何合適方法制備，包括，例如，直接化學合成或克隆并限制性酶切合適 的序列。通常在本發(fā)明的背景下，寡核苷酸被設計為識別并結(jié)合特異的互補的核苷酸序列。 核苷酸序列位于更大的核酸分子中。所述寡核苷酸可以能夠或不能夠充當聚合酶介導延伸 反應的引物。寡核苷酸中并非所有堿基需與該寡核苷酸設計用來結(jié)合的序列互補；所述寡 核苷酸只需包含足夠的互補堿基以使所述寡核苷酸得以識別并結(jié)合于該序列即可。寡核苷 酸亦可包含額外的堿基。所述寡核苷酸序列可為未修飾的核苷酸序列或可為如本文所述通 過多種方法經(jīng)化學修飾或偶聯(lián)的。如本發(fā)明背景下所用的術(shù)語“互補鏈合成”指通過酶反應使用變性擴增子序列作 為模板產(chǎn)生互補核苷酸序列。如本文所使用的術(shù)語“擴增子”指摻入至少一個側(cè)接靶序列的引物的擴增核苷酸 序列產(chǎn)物。如本文所使用的術(shù)語“引物”指下述寡核苷酸，其結(jié)合于單鏈模板核酸分子的特定 區(qū)域，并通過酶反應起始核酸合成，從所述引物的3’末端延伸并與所述模板分子的序列互 補。習慣上，引物通常稱為“正向”與“反向”引物，其中一個與核酸鏈互補，而另一個與該 鏈的互補鏈互補。如本文所使用的術(shù)語“靶序列”指需擴增的特定核苷酸序列。依照本發(fā)明方法的寡核苷酸序列擁有至少與位于所述靶序列5’與3’末端的核酸序列具有的實質(zhì)序列互補性。如本文所使用的術(shù)語“在3’末端或其附近”指所述3’末端緊接著的5’區(qū)域，以 及從3’末端的5’區(qū)域延伸的核酸分子，通常包括末端核苷酸。如本發(fā)明背景下所用的術(shù)語“阻斷3’延伸”指所述協(xié)助寡核苷酸實際上缺乏3’延 伸，從而使得所述擴增反應無法繼續(xù)，或以無實用價值的速率繼續(xù)。如本文所使用的術(shù)語“基本上相同或鄰近區(qū)域”在供協(xié)助寡核苷酸，與起始引物和 /或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物的結(jié)合位點的背景下意指所述寡核苷酸/引物能夠結(jié)合于所 述模板分子的相同大致區(qū)域，但無需為所述模板的相同核苷酸序列。舉例而言，協(xié)助寡核苷 酸可結(jié)合于所述模板的區(qū)域，其3’(下游)于由起始引物結(jié)合的區(qū)域，但仍舊基本上位于所 述模板的相同區(qū)域內(nèi)。在此情況下，所述協(xié)助寡核苷酸的結(jié)合發(fā)生于鄰近所述起始引物結(jié) 合序列鄰近的序列。術(shù)語“鄰近”無需所述序列為直接鄰接或“Btt連(abutting)”，但涵蓋 “鄰近”序列間有一個或多個插入或相符核苷酸的情況。如本文所使用的的術(shù)語“樣品”指任何包含核酸分子的生物樣品，通常包含DNA和 /或RNA。樣品可為組織，細胞或其提取物，或可為核酸分子的純化樣品。使用術(shù)語“樣品” 并不必然意指在所述樣品中存在的核酸分子內(nèi)存在靶序列。本發(fā)明的擴增方法，在本文中亦總稱為雜交依賴性鏈式反應(HDCR)，提供了高度 的特異性以供擴增任何靶核酸，其隨之戲劇性的減少或消除了非特異性擴增產(chǎn)物。本文所描述的方法使所期望的靶在擴增反應中可以保持多個循環(huán)，迥異于標準的 現(xiàn)有技術(shù)PCR。甚至在所期望靶的擴增效率僅僅略微佳于不希望的產(chǎn)物時，在大量循環(huán)下 保持該差異的積累效應導致對所期望靶的高選擇性。該選擇性通過使用特定引物(在本文 中稱為“起始引物”與“協(xié)助寡核苷酸依賴性引物”)來達成，所述引物包含阻止其受完全拷 貝的修飾。除非引物結(jié)合位點可經(jīng)再生以允許后繼結(jié)合與延伸，無法獲得顯著的擴增。再 生引物結(jié)合位點通過使用在本文中稱為協(xié)助寡核苷酸的寡核苷酸來達成，所述寡核苷酸設 計為識別所期望靶中，在所述起始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點下游的序 列。當發(fā)生引導錯誤時，該區(qū)域不太可能與所述協(xié)助寡核苷酸上相應的區(qū)域充分匹配以允 許所述引物結(jié)合位點的再生。從而可減少或消除非特異性的擴增。進一步，所述系統(tǒng)可用 于選擇特定的序列變體，例如在所述引物結(jié)合位點下游區(qū)域中的突變。在此情況下，即使與 所述協(xié)助寡核苷酸存在錯配，仍可再生引物結(jié)合位點，但該情況以較低效率發(fā)生，且由于選 擇可在大量循環(huán)下保持(取決于添加入反應物中靶的量)，可針對所期望序列變體進行強 選擇。亦描述了現(xiàn)有技術(shù)中亦允許在大量循環(huán)中進行選擇的方法。這些包括使用阻斷 寡核苷酸(blocking oligonucleotide)(如描述于，例如，Cottrell et al. 2004，“ A real-time PCR assay for DNA-methylation using methyIation-specificblockers. " N ucleic Acids Research 32(1))和 headloop DNA 擴增(描述于 US2005221312)。在這些 方法中，特異性的改善是由于阻抑具有特定序列的產(chǎn)物。當可能出現(xiàn)多種不同不希望的潛 在產(chǎn)物時，將需要多個阻斷寡核苷酸以阻止不希望的擴增。此外，在頭環(huán)DNA擴增時，僅僅 一個不希望的序列可受選擇排除(against)。與之相對，本文所描述的現(xiàn)行方法提供對所期 望序列的正向選擇，并導致阻抑所有不希望的產(chǎn)物，甚至包括其序列未知的產(chǎn)物。在PCR中，擴增的特異性取決于引物結(jié)合的特異性，而在現(xiàn)行技術(shù)中，PCR方法的特異性來自設計合適的，與靶序列有互補序列的正向與反向引物。然而，引物序列導致的 特異性僅僅在PCR的早期輪次中有效。一旦產(chǎn)生了足夠量的產(chǎn)物，無論引物是自正確的側(cè) 接所述靶序列的位點還是自由引導錯誤產(chǎn)生的非特異性擴增子延伸，擴增都以相同速率繼續(xù)。與之相反，在本發(fā)明所述的擴增方法中，選擇性在擴增的每個循環(huán)中都得到保持。 該高特異性是通過使擴增依存于在正向與反向引物中一個或兩者的引發(fā)區(qū)域(priming region)下游存在正確的靶序列來達成的。本方面所述方法在所述靶序列的一個(或兩個) 末端使用至少一種修飾寡核苷酸引物，以及相應的協(xié)助寡核苷酸以增加擴增的特異性。在 本文所述方法最廣泛的形式下，所述修飾引物在本文中稱為起始引物，其經(jīng)修飾使得所述 修飾妨礙(impede)反向鏈合成。在本發(fā)明所述的方面中，避免了現(xiàn)有技術(shù)PCR方法中導致 不希望的擴增產(chǎn)物的引導錯誤，由于所述協(xié)助寡核苷酸將不會識別位于引導錯誤位點下游 (3’ )的核苷酸序列。相應的，本發(fā)明的一個方面提供了選擇性擴增位于核酸分子內(nèi)靶核苷酸序列的方 法，所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下述物質(zhì)相接觸(i)至少一個協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在3’末端或其附近包含至少 一個修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，以及(ii)兩個或更多寡核苷酸引物，至少其中之一為起始引物，經(jīng)修飾從而使得該修 飾的存在過早地終止互補鏈合成，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物基本上結(jié)合于所述模板核酸分子的相同 或鄰近區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與位于靶序列上所述起始引物結(jié)合位置3’的 序列互補的序列；并實施熱循環(huán)酶擴增反應，從而使得所述特定靶序列選擇性的擴增。依照本發(fā)明的實施方案，選擇性在擴增的每個循環(huán)中均得到保持。特異性不僅來 自引物結(jié)合，亦來自需要在所述引物結(jié)合位點下游具有“正確的”序列。照此，得以保持令 人驚訝的高度選擇性，尤其是當擴增包含多于一種修飾引物與協(xié)助寡核苷酸時，由此大幅 度的減少或消除了由引導錯誤導致的不希望的產(chǎn)物的產(chǎn)生。所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域可能與所述起始引物具有足夠的同一性，從而使得所 述起始引物結(jié)合位點在由所述協(xié)助寡核苷酸起始的(followingstrand extension)鏈延伸 再生，從而使所述起始引物得以起始后續(xù)輪次的鏈合成?；蛘?，所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū) 域與所述起始引物不具有足夠的序列同一性，從而使得所述起始引物結(jié)合位點在使用所述 協(xié)助寡核苷酸作為模板的鏈合成后未再生。在后一情況下，所述方法通常將進一步使用協(xié) 助寡核苷酸依賴性引物，經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且其與所 述協(xié)助寡核苷酸5’區(qū)域具有足夠的同一性，從而使得使用所述協(xié)助寡核苷酸的鏈合成產(chǎn)生 協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點從而使所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物得以起始后續(xù)輪 次的鏈合成。本發(fā)明的進一步方面提供了改善熱循環(huán)酶擴增反應特異性的方法，所述反應使用 側(cè)接位于核酸分子內(nèi)目標的靶核苷酸序列的至少兩個寡核苷酸引物，其中所述引物中至少 一個經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且所述反應進一步使用至少一 種非起始協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在其3’末端或其附近包含至少一個修飾，
13從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸受阻斷，且其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述修飾引物 基本上結(jié)合于所述模板核酸分子上相同或鄰近區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括所述 靶序列上3’于所述修飾引物結(jié)合位置序列的互補序列。本發(fā)明所述方法可用于改善擴增任何所期望靶序列的特異性，隨之基本上減少或 消除了不期望的非靶序列的擴增。本領域技術(shù)人員應理解本方法可用于任何熱循環(huán)酶擴增 反應，只要期望其具有對特定擴增子的特異性與選擇性。僅舉例而言，本發(fā)明所述方法在DNA甲基化分析中有應用前景，例如，在甲基化特 異性PCR技術(shù)中改善檢測甲基化核苷酸的特異性。本發(fā)明所述方法亦在檢測點突變中有 應用前景，例如在疾病診斷中。在一些情況下，多個不同點突變可與特定疾病相聯(lián)系(例 如K-ras基因中的致癌性突變)，需要多重化(multiplexing)PCR來檢測。本發(fā)明的方 法適于多重化。本領域技術(shù)人員應理解本發(fā)明所述方法的應用并非限定，且該方法可用 于任何需要高度選擇性與特異性的熱循環(huán)酶擴增反應。上述應用包括但不僅限于檢測包 括病毒與細菌的病原生物，檢測基因組中的多態(tài)性和/或突變，基因指紋分析(genetic fingerprinting)，法醫(yī)人類學(forensic anthropology)，分子系統(tǒng)學(molecular systematics)，家系調(diào)查(genealogical investigation)，遺傳疾病檢測，基因組測序，識 別控制目標性征的基因以及檢測DNA甲基化的不同狀態(tài)。本領域技術(shù)人員應容易的理解可使用阻斷自所述協(xié)助寡核苷酸3’末端延伸的任 何合適方法。合適的阻斷修飾包括但不僅限于在所述3’末端或其附近摻入一個或多個不可 延伸的部分或核苷酸類似物，例如，單獨的3’末端不可延伸的堿基或堿基類似物，3’末端不 可延伸的堿基與一個或多個靠近所述寡核苷酸3’末端的核苷酸錯配的組合，或在靠近所述 核苷酸3’末端摻入脫堿基位點。所述不可延伸的堿基可選自，例如，2’，3’ 二脫氧核苷酸， 3’ C3，C18或其它長度間隔區(qū)，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸”堿基，“鎖定核酸(LNA) ”堿基，核 苷酸胺(amine)衍生物，經(jīng)尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡萄糖基酶處理的尿嘧啶，RNA或2’ 0-甲基核苷 酸，或上述的組合。類似的，可在所述協(xié)助寡核苷酸引物中使用多種合適的修飾以終止反向鏈合成。 舉例而言，所述修飾可包括但不僅限于，包含一個或多個錯配，脫堿基位點和/或修飾核苷 酸，例如2’ -0-甲基核苷酸。通常在起始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物中的修飾的 位置足夠靠近所述引物的3’端，從而使得雖然所述引物保留起始3’延伸的能力，但當在所 述引物充當互補鏈合成的模板時，其擴增序列產(chǎn)物遭截短從而導致后續(xù)擴增循環(huán)中缺乏引 物結(jié)合。舉例而言，在特定實施例中，所述修飾可位于距所述引物的3’末端約10個堿基，9 個堿基，8個堿基，7個堿基，6個堿基，5個堿基或4個堿基處。所述協(xié)助寡核苷酸包括互補于所述靶核酸序列中下游于所述起始引物和/或協(xié) 助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點的序列。所述協(xié)助寡核苷酸亦可包括互補于靶序列的序 列，所述序列亦為所述起始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物所識別與結(jié)合。所述協(xié)助 寡核苷酸的5’末端可與所述起始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物的5’末端相符或在 其內(nèi)，或者其可包含獨特序列的5’延伸，如期望，所述序列可用于在擴增產(chǎn)物上產(chǎn)生標簽 的獨特序列結(jié)合位點。上述標簽結(jié)合位點可能用于，例如，捕獲或檢測特定擴增子(舉例而 言，檢測突變)，或克隆擴增產(chǎn)物。僅為舉例，而非限定本發(fā)明的范圍，依照本發(fā)明的實施方案進行的擴增反應的通常步驟示于圖1A。注意為簡潔起見，在圖IA中僅描述了參與所述擴增反應的靶核苷酸序列 的一個末端。該圖概略性的顯示了起始引物(10)(在此為“正向"PCR引物)與協(xié)助寡核苷 酸(60)在本發(fā)明的實施方案中的作用。在圖IA中未顯示的所述靶核苷酸序列的末端處， 可使用任何合適的反向引物，或者可使用第二個起始引物與相應的第二個協(xié)助寡核苷酸?；氐綀DIA的概略，在起始的雙鏈模板序列變性步驟后，冷卻反應物以允許起始引 物結(jié)合于單鏈模板(20)上(步驟1)。所述起始引物(10)在該引物的3’末端或其附近包含 修飾(15)。正向鏈合成自所述起始引物的3’末端起始(步驟2)，由此產(chǎn)生新核酸鏈(30)。 在第二次變性步驟后，反向鏈合成(40)由反向引物(未顯示)起始，并以摻入了起始引物 的新合成鏈(30)作為模板(步驟3)。然而，當在存在于所述新模板上的，由所述起始引物 (10)提供的所述修飾(15)的存在阻斷拷貝時，反向鏈(40)的合成過早終止(50)。在后續(xù) 的變性步驟后，協(xié)助寡核苷酸(60)較之所述起始引物(10)優(yōu)選的雜交于步驟3產(chǎn)生的不 完整的反向鏈(40)，這是由于所述協(xié)助寡核苷酸(60)的3’末端較之所述起始引物(10)的 3’末端具有更強的序列結(jié)合能力(步驟4)。所述協(xié)助寡核苷酸(60)在該寡核苷酸3’末端 或其附近包含修飾(65)。所述協(xié)助寡核苷酸(60)隨即充當模板以供反義鏈(40)的延伸， 從而使反義鏈的完成與所述起始引物的完整結(jié)合位點的再生得以實現(xiàn)(步驟4)。此時，任 選地可添加下述步驟，即將反應物加熱到將所述協(xié)助寡核苷酸(60)從所述模板(40)上移 除，但不至于使全長雙鏈材料全部或大部變性的溫度。隨即冷卻該反應物以允許起始引物 (10)結(jié)合并進行后續(xù)輪次的正向鏈(80)合成(步驟5)。另一種可選實施方案的示例見于圖1B。在起始的雙鏈模板序列變性步驟后，冷卻 反應物以允許起始引物結(jié)合于單鏈模板(20)上(步驟1)。所述起始引物(10)在該引物的 3’末端或其附近包含修飾(15)。正向鏈合成自所述起始引物的3’末端起始(步驟2)，由 此產(chǎn)生新核酸鏈(30)。在第二次變性步驟后，反向鏈合成(40)由反向引物(未顯示)起 始，并以摻入了起始引物的新合成鏈(30)作為模板(步驟3)。然而，當在存在于所述新模 板上的，由所述起始引物(10)提供的所述修飾(15)的存在阻斷拷貝時，反向鏈(40)的合 成過早終止(50)。在后續(xù)的變性步驟后，具有基本上相似于協(xié)助寡核苷酸依賴性引物(11) 的5’區(qū)協(xié)助寡核苷酸(61)較之所述起始引物以及協(xié)助寡核苷酸依賴性引物優(yōu)選的雜交于 步驟3產(chǎn)生的不完整的反向鏈(40)，這是由于所述協(xié)助寡核苷酸(61)的3’末端較之所述 起始引物(10)或所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物(11)的3’末端具有更強的序列結(jié)合能力 (步驟4)。所述協(xié)助寡核苷酸(61)在該寡核苷酸3’末端或其附近包含修飾(65)。所述協(xié) 助寡核苷酸(61)隨即充當模板以供反義鏈(40)的延伸，從而使反義鏈的完成(71)與所述 起始引物的完整結(jié)合位點的再生得以實現(xiàn)(步驟4)。此時，任選地可添加下述步驟，即將反 應物加熱到將所述協(xié)助寡核苷酸(61)從所述模板(40)上移除，但不至于使全長雙鏈材料 全部或大部變性的溫度。隨即冷卻該反應物以允許起始引物(11)結(jié)合并進行后續(xù)輪次的 正向鏈(80)合成(步驟5)。本領域技術(shù)人員應理解所述起始引物上的修飾(15)與所述協(xié) 助寡核苷酸依賴性引物上的修飾(15)可相同或不同。使用擴增子模板序列的正向鏈合成需要所述起始引物或協(xié)助寡核苷酸依賴性引 物在由所述協(xié)助寡核苷酸再生反向鏈的3’末端后退火結(jié)合于完整合成的反向鏈。在擴增 循環(huán)的這一階段，優(yōu)選最小化所述起始引物或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物與所述協(xié)助寡核苷 酸間的序列結(jié)合競爭。在一個實施方案中，可通過使用低濃度的協(xié)助寡核苷酸和/或在所
15述寡核苷酸序列中摻入修飾來使所述起始引物或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物的結(jié)合較之所 述協(xié)助寡核苷酸的結(jié)合更加有利。舉例而言，所述起始引物或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物的 結(jié)合可通過在所述引物序列使用本領域技術(shù)人員已知的修飾來增強，所述修飾可舉出用5 甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，使用INA或PNA，或者在5’末端附加小溝結(jié)合物(minor groove binder)。此外，協(xié)助寡核苷酸序列結(jié)合的穩(wěn)定性可通過使用替代性堿基，例如用次黃苷或 脫氮鳥嘌呤替代鳥嘌呤來減少。在另一個實施方案中，若所述靶序列具有需特異性擴增的序列改變(例如，突 變)，可通過使擴增反應依存于協(xié)助寡核苷酸針對該區(qū)域的序列特異性雜交來達成。例如， 該原理可應用于檢測突變以及在亞硫酸氫鹽處理后選擇性擴增不同程度甲基化的DNA。即 使在擴增反應的一個單獨步驟中僅達成相對較小的選擇性，由于該選擇性存在于所述擴增 的整個期間，在所述反應的全過程中選擇性顯著增強。在進一步的實施方案中，使用本發(fā)明所述方法使例如添加和/或延伸之類的操作 結(jié)果得以摻入擴增產(chǎn)物中。舉例而言，當將所述協(xié)助寡核苷酸的5’尾做成較之摻入了所述 起始引物或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物的擴增子模板序列的3’末端更長時，所得最終擴增產(chǎn) 物將具有3’單鏈延伸。該序列延伸可隨即用作，例如，獨特序列結(jié)合位點以供引物/探針 結(jié)合和/或?qū)⑺鰯U增產(chǎn)物附加到不同底物上。通常依照本發(fā)明需進行分析的核酸分子包括DNA。然而本領域技術(shù)人員將容易理 解本發(fā)明所述方法，若提供合適的試劑，亦可應用于其它核酸分子，例如RNA，所述試劑可舉 出RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶為例，只需其適用于擴增或拷貝RNA。如同其它擴增方法，本發(fā)明方法中所用條件，例如退火時間，延伸時間，擴增循環(huán) 數(shù)以及使用的溫度取決于特定的序列，并需要個別優(yōu)化。上述優(yōu)化屬于本領域技術(shù)人員擁 有的技巧與能力，且無需超過僅為常規(guī)的實驗探索(參見，例如，Sambr00k，J.and Russell, D. W Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Edition,2001, and Dieffenbach, C. W. and Dveksler, G. S. (eds. )PCR Primer :A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 2003 ；其公開以 全文引用的方式包含于本文中)。此外，本發(fā)明的方法可使用任何合適的酶，只要其催化合 成作為引物延伸產(chǎn)物的核苷酸序列?？色@取多種聚合酶且其適于依照本發(fā)明的應用，且上 述聚合酶對本領域技術(shù)人員為已知的。在特定實施方案中所述聚合酶為DNA聚合酶。所述 DNA聚合酶可，例如，選自下組大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片 段，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，T. Iitoralis DNA聚合酶，以及熱穩(wěn)定性聚合酶，例如Taq， Tth，Pfu，Vent，深海火山口(de印vent)與UlTma聚合酶，以及其變體與衍生物。如同其它其中共通序列添加到需擴增核酸分子末端的方法，本發(fā)明的擴增方法可 方便的改用于多重PCR(multiplex PCR)。依照本發(fā)明進行的擴增反應產(chǎn)物可通過本領域技術(shù)人員眾所周知的標準方法來 檢測，包括但不僅限于，凝膠電泳，使用非特異性核酸結(jié)合染料例如SYBR綠的實時監(jiān)控，序 列特異性熒光探針或與點陣(array)雜交。本領域技術(shù)人員應理解在標準PCR方法中與寡核苷酸引物設計相關(guān)的限制。類似 的限制亦適用于設計可用于檢測PCR擴增子的寡核苷酸探針。探針通常必須設計為較之引 物具有較佳雜交能力，從而使得所述探針能夠結(jié)合于單鏈靶。從而探針通常須較長，或者具
16有修飾從而使其較之引物能夠在相對較高溫度結(jié)合。為了使用較短探針，必須修飾PCR以 允許以允許在所述PCR中生成單鏈核酸分子_指數(shù)性擴增僅僅發(fā)生于限定數(shù)量的循環(huán)中， 繼以線性擴增。這通常通過限制一種引物的濃度，或通過使用不同結(jié)合溫度的引物并在PCR 過程中使用增加的退火溫度來達成。這些限制可使用依照本發(fā)明實施方案的擴增方法來克 服，其允許使用3’單鏈標簽進行的指數(shù)性擴增-所述標簽可在延伸期后使用熒光探針來結(jié) 合。此外，在延伸期后(例如，72°C )，可測定在選定溫度(例如，40°C，5(TC與60°C )結(jié)合 的寡核苷酸探針。通過將不同的熒光染料與不同的熔解探針/標簽組合相組合，可達成大 量反應的多重化?；蛘撸墒褂盟鰳撕灲Y(jié)合位點開發(fā)新型檢測技術(shù)。依照本發(fā)明的實施 方案，3’延伸的存在允許開發(fā)，例如，類分子信標(molecular beacon-like)探針，其僅于 經(jīng)3’單鏈標簽延伸所拷貝后發(fā)出熒光。本領域技術(shù)人員應理解特定序列的合適協(xié)助寡核 苷酸，起始引物與協(xié)助寡核苷酸依賴性引物需根據(jù)靶核酸序列的序列與使用本方法的特定 應用而進行優(yōu)化。涉及合適的寡核苷酸與引物序列屬于本領域技術(shù)人員的能力范圍，并無 需超過僅為常規(guī)的實驗探索。在本說明書中任何在先公開出版物(或由其來源的信息)，或任何已知事物的引 用，均不認為，并不應認為是對該在先公開出版物(或由其來源的信息)或已知事物構(gòu)成本 說明書相關(guān)技術(shù)領域中通常一般知識一部分的承認或認同，或者任何形式的暗示。本發(fā)明將參照下列特定實施例進行描述，其不應認定為以任何方式對本發(fā)明的范 圍進行限定。
實施例方法與材料修飾寡核苷酸引物終止引物延伸的引物修飾示例如下所示2’_0甲基核苷酸-小寫字母(例如，U表 示2’0尿嘧啶核苷)，次黃苷-1，脫堿基位點_ Δ，和/或+ddG- 二脫氧鳥嘌呤核苷，其使用 末端轉(zhuǎn)移酶添加到寡核苷酸末端。脫堿基位點通過在寡核苷酸合成期間摻入d-間隔區(qū)或 脫氧尿嘧啶核苷引入。在后一情形下，將尿嘧啶通過在5 μ M(亦即lnmole)下用4單位尿 嘧啶-DNA 糖基化酶(NewEngland Biolabs)在 200 μ L TEX 緩沖液(IOmM Tris HCl, 0. ImM EDTA，0. 01% Triton-XlOO)中在37°C下處理2小時從而轉(zhuǎn)換為脫堿基位點。核苷酸序列模板核苷酸靶序列模板自對應于所述靶區(qū)域的合成單鏈核酸分子制備。標準PCR擴增 用于擴增并產(chǎn)生雙鏈靶序列模板。擴增產(chǎn)物隨即以1 10000稀釋，并用作靶區(qū)域模板以 供HDCR擴增。擴增條件HDCR(25 μ 1中)的標準條件如下述進行l(wèi)x Platinum Taq緩沖液 [20mMTris-HCl (pH8. 4)及 50mM KCl]，4mM MgCl2,0. 2mM 每種 dNTP，25000 倍稀釋的 SYBR 綠 與來自Invitrogen的0. 5U Platinum Taq DNA聚合酶(熱啟動)，其中寡核苷酸濃度與循 環(huán)條件具體描述于每個實施例中。實施例1-用于成功擴增的起始引物與協(xié)助寡核苷酸的依賴件該實施例說明依照本發(fā)明所述實施方案的HDCR擴增技術(shù)依存于起始引物與協(xié)助寡核苷酸兩者的存在。HDCR用于擴增如圖2所示的人類Alu重復序列的區(qū)域。顯示了略去所述起始引物 與所述協(xié)助寡核苷酸之一的作用。所有反應均重復兩次。圖2顯示所述靶區(qū)域的序列，起 始引物InAluPr3，協(xié)助寡核苷酸InAluFo 15與反向引物AluRev。所述起始引物包含脫堿基 位點，且所述協(xié)助寡核苷酸3’末端含有兩個脫堿基位點以及兩個與所述靶核酸序列的錯配 (T/T錯配與G/T錯配)，從而阻止其起始。所述協(xié)助寡核苷酸亦含有額外的脫堿基位點以 減少在該協(xié)助寡核苷酸上引導錯誤造成的背景。包含1 μ L 1 10000倍稀釋的核酸模板的復制擴增在Corbett Rotor-Gene3000Real-time PCR機器上進行。起始引物InAluPr3與協(xié)助寡核苷酸 InAluFol5以濃度為200nM使用，且所述反向引物AluRev為40nM。熱循環(huán)條件如下所述 95°C下2分鐘，繼以40循環(huán)的95°C下1秒，60°C下20秒，80°C下1秒與60°C下20秒。在 最后的60°C步驟測定SYBR綠的熒光。如圖3所指明，所述起始引物與協(xié)助寡核苷酸擴增產(chǎn) 物在大約17個循環(huán)后觀測到，而單獨使用起始引物或協(xié)助寡核苷酸的反應在40個循環(huán)處 仍未超過檢測閾值。實施例2-使用HDCR方法的詵擇件擴增該實施例說明可能對彼此間以單獨堿基對相異的核酸模板達成選擇性擴增。示于 圖4的所述序列中央?yún)^(qū)域?qū)趘-raf鼠類肉瘤癌基因同源物Bl (BRAF)基因的部分序列。 下劃線的堿基顯示常見的致癌性T到A突變V600E(MUTB序列)與正常序列(NORB)相比較 的位置?？客獾男蛄信c所用寡核苷酸引物相匹配。如圖5所示，正向起始引物BRF2距其3’ 末端7個堿基包含脫堿基位點。協(xié)助寡核苷酸BFol3的3’末端包含6個與靶DNA的錯配， 且終止于脫氧GTP以阻止其延伸。所述協(xié)助寡核苷酸包含鄰近于所述BRF2引物的19堿基 區(qū)域，其與所述突變序列完全匹配，但包含與正常BRAF序列的單一堿基錯配(下劃線所示 的間隔)。所述協(xié)助寡核苷酸亦在等價于所述起始引物的區(qū)域中一些鳥嘌呤的位置包含次 黃苷(參見圖5)以減少協(xié)助寡核苷酸/延伸的反向鏈雙鏈體的穩(wěn)定性。復制HDCR擴增使用Bio-Rad I Cycler Real-time PCR機器進行。正向起始引物 BRF2以200nM加入，協(xié)助寡核苷酸BFol3以20nM加入，而反向引物CommR3G以40nM加入； MgCl2以2mM的濃度使用。熱循環(huán)條件如下所述95°C下2分鐘，繼以60循環(huán)的95°C下5 秒，68°C或72°C下15秒，83°C下10秒與68°C或72°C下15秒。在每個循環(huán)的最后一步測定 SYBR綠熒光。如圖6所見，當在68°C下進行退火/延伸熱循環(huán)步驟時，突變序列擴增產(chǎn)物的量相 對于正常序列擴增產(chǎn)物僅僅略多。然而，當在72°C下進行所述退火/延伸熱循環(huán)時，匹配的 正常模板擴增產(chǎn)物的數(shù)量較之突變模板擴增產(chǎn)物劇烈減少。所述協(xié)助寡核苷酸針對所述突 變序列較之所述正常(錯配)序列選擇性雜交的顯著溫度依賴性可由選擇性溫度下所見的 較大差異所顯示(圖6)。實施例3-使用HDCR方法選擇性擴增以及改善擴增效率該實施例說明使用HDCR擴增以供在亞硫酸氫鹽處理后選擇性擴增不同甲基化程 度的DNA的潛能，以及在溫度循環(huán)中中間加熱步驟對改善反向鏈兩步合成效率的益處。圖 7顯示制備了具有模仿由用亞硫酸氫鹽處理經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的hMLHl基因區(qū)域的所產(chǎn)生 序列的中央?yún)^(qū)域(下劃線所示)的不同核酸序列模板。兩個序列均由相同的供寡核苷酸引物結(jié)合的區(qū)域所側(cè)接。模板M模仿甲基化的DNA，其中CpG 二核苷酸中的胞嘧啶在亞硫酸氫 鈉處理后仍為C。模板U模仿未甲基化的DNA，其中所有的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶(且隨后在 擴增后變?yōu)門)。核酸模板通過PCR制備，且稀釋100倍以供添加至HDCR反應擴增中。所述 起始引物，協(xié)助寡核苷酸與反向引物CommR2G的序列示于圖8.起始引物MLH20具有四個2’0_甲基核苷酸(小寫u)以阻止其在缺乏協(xié)助寡核苷 酸時起始指數(shù)性擴增。協(xié)助寡核苷酸MLHFl具有內(nèi)部d-間隔區(qū)(脫堿基位點)，其協(xié)助阻 止協(xié)助寡核苷酸的引導錯誤導致的背景擴增。亦在3’末端由兩個d-間隔區(qū)，期望其與3’ 錯配一同干擾所述協(xié)助寡核苷酸的延伸。所述協(xié)助寡核苷酸的剩余部分完全對應于所述甲 基化核酸序列，但亦與所述等價的未甲基化的核酸序列有三個錯配(圖8)。復制HDCR 擴增在 Corbett Rotor-Gene 3000Real_time PCR 機器中進行。HDCR 反 應混合物包含200nM FD寡核苷酸引物MLH20，20nM協(xié)助寡核苷酸MLHFl與40nM反向寡核苷 酸引物CommR2G。熱循環(huán)條件如下所述95°C下2分鐘，繼以60循環(huán)的95°C下5秒與65°C 下40秒(圖9A)或95°C下5秒，65°C下20秒，74°C下10秒與65°C下20秒(圖9B)。比較 了包含與不包含中間加熱步驟的反應。在兩個條件下較之來自U模板的，來自M模板的擴 增均強烈有利，但添加所述中間加熱步驟后反應動力學得到很大改善，由此使得自M模板 的擴增提前了 5到10個循環(huán)(圖9B)。甚至額外的74°C下10秒的步驟較之自預期機理所 預測的增加了 HDCR效率。該步驟將所述協(xié)助寡核苷酸從雜交與延伸的靶DNA上移除，從而 一旦在溫度足夠降低后允許所述起始引物的雜交。實施例4-供摻入常見外起始位點(outer priming site)的HDCR該實施例說明如何使用HDCR建立有效的多重化系統(tǒng)。盡管選擇性擴增在不同試 管中進行，同樣的“外(outer)”引物用于兩個反應。所選兩個用于該研究的CpG島在癌癥 研究中受矚目，這是因為其在許多癌癥，例如結(jié)腸直腸癌中變得超甲基化，而在正常組織， 包括血液中仍為未甲基化的。圖10顯示TMEFF2與hMLHICpG島內(nèi)的靶序列(分別為hgl8 chr2 :192，767，556-192，767，775 (-strand)與 hgl8 chr3 :37，010，130-37，010，262)，以及 引物與協(xié)助寡核苷酸相對于源自亞硫酸氫鹽處理甲基化DNA的排列。模板DNAU與M分別為或者正常血液DNA或經(jīng)SssI甲基酶處理的血液DNA，已知所 述甲基酶在CpG的環(huán)境下將胞嘧啶轉(zhuǎn)換為5-甲基胞嘧啶(5mC)。5mC對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換有 抗性，而期待未甲基化的C轉(zhuǎn)換為U(并之后在含有dTTP的擴增中轉(zhuǎn)換為T)。在亞硫酸氫 鹽處理后，期待測試區(qū)域內(nèi)的所有未甲基化的C由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換為U，且之后由PCR轉(zhuǎn)換 為T。盡管該亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的DNA稱為“U”，應指出在實驗進行之前在該特定血液DNA中 所選區(qū)域的準確甲基化狀態(tài)不得而知。顯示了在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后，hMLHlCpG 島(在 hgl8chr3 :37，010，130-37,010， 262 內(nèi))區(qū)域的甲基化版本以及 TMEFF2CpG 島(在 hgl8 chr2 192, 767, 556-192, 767, 775 內(nèi))區(qū)域的甲基化版本的選擇性擴增，使用HDCR與“外”依賴性引物。HDCR的該變體的關(guān)鍵是起始引物的使用(圖10)。這些引物設計為能夠雜交于靶 序列，并能夠穿過目標區(qū)域延伸。然而其含有修飾，在此為d-間隔區(qū)，其將阻止其受完全拷 貝。這導致靶過早終止于所述起始引物上修飾反側(cè)或附近，從而使得通常的鏈式反應無法 進行。在此情況下，所述協(xié)助寡核苷酸具有與所述起始引物的5’尾不匹配的5’尾，但卻與 其它存在于反應物中的依賴性引物的5’區(qū)域相匹配。所述協(xié)助寡核苷酸具有3’雜交部分，其識別所述起始引物啟動(priming)區(qū)域3’的區(qū)域。過早終止的靶分子，若其具有允 許雜交于所述協(xié)助寡核苷酸的序列，可拷貝所述協(xié)助寡核苷酸的5’尾。這生成了“外”協(xié) 助寡核苷酸依賴性引物的引物結(jié)合位點。因為這些依賴性引物亦包含阻止完全拷貝的修飾 (d-間隔區(qū))，擴增依賴于在每一循環(huán)中，由拷貝所述協(xié)助寡核苷酸引起的所述依賴性引物 結(jié)合位點的連續(xù)再生。在此所給出的實施例中，所述起始引物設計為能夠啟動其靶的M與 U變體兩者。換言之，啟動設計為特定于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換序列，但并不給予M或U變體之一 任何特異性。為此，盡一切可能避免了其中存在甲基化變體的CpG序列。當CpG位置確實 位于所述起始物的結(jié)合位點內(nèi)時，在所述起始物中使用C與T的混合(或G與A，取決于所 靶向的鏈)，從而使得其可結(jié)合于M與U兩者。僅有的對M序列變體的特異性存在于所述協(xié) 助寡核苷酸的雜交區(qū)域內(nèi)，其匹配所述M序列但非所述U序列。用于針對TMEFF2靶的HDCR的寡核苷酸序列(5’到3’ )及其濃度為250nM TMEFInLl TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGT Δ GTTTTT250nM TMEFInRl CCRAACAACRAACTACTAA Δ CATCCC40ηΜ TMEFLdS170TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTGTΔTTTCGCGTTTTCGGCM ddG40ηΜ TMEFRdS 133CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAΔCCCGCGAACGACGGA ddG500ηΜ MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TG Δ TTTGCT500ηΜ MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTG Δ TCTTGTIOOnM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGTTAMRA而對hMLHl 靶250ηΜ MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔ TTGGTA250ηΜ MLHInitl CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC40ηΜ 13IhMLHFoldS2CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTAAAAΔCGTATCCGCGCCAGG-ddG40ηΜ RMLHl70TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔTACGGAGGGAGTCGCC-ddG500ηΜ MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TG Δ TTTGCT500ηΜ MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTG Δ TCTTGTIOOnM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCGTAACCCT BHQl其中Δ =d-間隔區(qū)，5=甲基胞嘧啶，ddG=用末端轉(zhuǎn)移酶導入的二脫氧鳥嘌呤， R = A 與 G 的混合物，HEX =六氯-6-羰基熒光素(hexachloro-6-carboxyfluorescein)， TAMRA = 6-羧基四甲基羅丹明(6-carboxytetramethylrhodamine)，BHQ 1 = Black Hole Quencher 1。下劃線堿基=與添加的ddG —同減少或消除延伸的錯配。重復實驗的HDCR在10微升反應體積中進行，其包含Ix Platinum Taq緩沖液 [20mM Tris-HCl(pH8. 4)與 5OmM KCl],4mM MgCl2,0. 2mM dATP,0. 2mM dCTP,0. 2mM dGTP, 0. 4mM dUTP，1/25000倍稀釋的SYBR綠，IOnM熒光素與來自Invitrogen的0. 4單位的 Platinum Taq DNA聚合酶(熱啟動)。將1納克人類血液DNA，其在體外經(jīng)使用SssI甲基 酶甲基化并隨即經(jīng)亞硫酸氫鹽處理(M)，與同樣的血液DNA，其亦經(jīng)亞硫酸氫鹽處理但未經(jīng)SssI甲基酶處理(U)，相比較。循環(huán)使用RotorGene 3000 (72管轉(zhuǎn)子(tube rotor))與下述 程序進行90°C下5秒，95°C下2分鐘，隨即10循環(huán)的90°C下5秒，95°C下15秒，50°C下2分 鐘，80°C下10秒，60°C下2分，隨即單獨培育于60°C下15秒并在FAM/SYBR頻道(channel) 下讀數(shù)(從而可在該溫度下進行自動校正)，隨即60循環(huán)的90°C下15秒，50°C下1分鐘， 80°C下10秒，60°C下1分，并在90°C下在JOE頻道下閱讀(以檢測HEX TaqMan探針的水 解)，并在60°C下在FAM/SYBR頻道下閱讀(以檢測雙鏈DNA的產(chǎn)生)。加入了 90°C下5秒 的步驟以阻止在變溫(ramp)到下一步驟95°C時任何的溫度過沖(overshooting)。在早期 的實驗中發(fā)現(xiàn)當在所述RotorGene3000中使用例如10微升的體積時從更低溫度直接變溫 到95°C可為有害的。針對兩個不同靶，TMEFF2(小圖A)與hMLHl (小圖B)甲基化序列的成功擴增示 于圖11。由于水解探針水解而產(chǎn)生的HEX熒光指明所述甲基化版本的成功擴增。這發(fā)生 于TMEFF2與hMLHl靶兩者。SYBR綠的存在允許檢測任何其它擴增DNA?？梢姺前行蛄性?TMEFF2的情況下擴增非常不良，而在hMLHl的情況下完全不擴增。d_間隔區(qū)包括在該實施 例中每個協(xié)助寡核苷酸的雜交區(qū)域內(nèi)。其一個益處為其降低了所述協(xié)助寡核苷酸的熔解溫 度從而降低了其結(jié)合于經(jīng)修復的靶的能力。第二個可能的益處為通過自非靶分子延伸來阻 止所述協(xié)助寡核苷酸5’區(qū)域的拷貝，所述非靶分子有可能部分或全部匹配于所述協(xié)助寡核 苷酸雜交區(qū)域3’于所述d-間隔區(qū)的區(qū)域。在兩個情況下均使用同樣的依賴性引物，從而指 明了達成下述多重HDCR系統(tǒng)的可能性，即在所述系統(tǒng)中針對特定靶的特異性通過使用起 始物與協(xié)助寡核苷酸，以及能夠擴增存在的靶全部或部分的單獨一對依賴性引物來達成。實施例5-HDCR的寡核苷酸依賴性該實施例使用hMLHl靶，顯示所有三種寡核苷酸(僅考慮所述靶的一個末端)均 需用于HDCR。緩沖液與循環(huán)條件與之前針對hMLHl的實施例中所用的相同，但在此情況下 所有反應物包含1納克的經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的SssI甲基化DNA(M)。為確立成功的HDCR對 寡核苷酸的需求，在一些重復實驗中缺乏特定的寡核苷酸。HEX (水解探針)與SYBR綠均于 包含50個循環(huán)的階段中60°C步驟時讀數(shù)。所得結(jié)果示于圖12。在使用水解探針與SYBR 綠所得的曲線之間幾乎無甚區(qū)別，表明所述hMLHl靶受特異性擴增。當所有三種測試的寡 核苷酸存在時，緊接著循環(huán)20后首次檢測到了擴增。當MLHInit2，其為起始物之一，從反應 物中略去時，對其中一個反應僅在循環(huán)35后方可檢測到擴增。在其它重復實驗中，未檢測 到擴增。略去協(xié)助寡核苷酸RMLH170，或外依賴性引物MCD6導致非常遲的擴增。這顯示成 功的HDCR依賴于包含所有三種寡核苷酸。在所有這些反應中在所述靶另一末端引導的相 應寡核苷酸均存在。
2權(quán)利要求
一種選擇性擴增位于核酸分子內(nèi)的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下述物質(zhì)相接觸(i)至少一個協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在其3’末端或其3’末端附近包含至少一個修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，和(ii)兩個或更多寡核苷酸引物，其中至少一個為起始引物，該起始引物經(jīng)修飾從而使得該修飾的存在過早地終止互補鏈合成，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰近的區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與位于靶序列上所述起始引物結(jié)合位置3’的序列互補的序列；和實施熱循環(huán)酶擴增，從而使得所述特定靶序列選擇性地擴增。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使所述模板核酸分子變性；(b)將所述變性模板核酸分子與至少一種起始引物接觸，并自此起始第二鏈合成，從而 由此將所述修飾從所述起始引物導入新合成的鏈中；(c)將上述所產(chǎn)生的雙鏈分子變性，并由位于所述起始引物結(jié)合的靶核苷酸序列相反 末端的引物起始反向鏈合成，由此反向鏈合成由于步驟(b)導入的修飾而過早終止；(d)將所述新合成的雙鏈分子變性，將所述協(xié)助寡核苷酸結(jié)合于步驟(c)產(chǎn)生的不完 整反向鏈，并自此起始鏈延伸，以由此完成所述反向鏈；以及(e)任選地重復步驟(a)到(d)—個或多個額外循環(huán)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物具 有足夠的序列同一性，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸起始鏈延伸再生所述起始引物結(jié)合位 點，從而由此使所述起始引物能起始后續(xù)輪次的鏈合成。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物不具 有足夠的序列同一性，從而使得所述起始引物結(jié)合位點自所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈合成 未再生。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述方法進一步使用協(xié)助寡核苷酸依賴性引物，所述 引物經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且該引物與所述協(xié)助寡核苷酸 的5’區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈合成生成了協(xié)助 寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點，從而由此使所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物能夠起始后續(xù)輪 次的鏈合成。
6.權(quán)利要求1到5任一所述的方法，其中所述方法用于改善所期望靶序列擴增的特異 性，隨之基本上減少或消除了非期望的非靶序列的擴增。
7.權(quán)利要求1到6任一所述的方法，其中所述模板核酸分子存在于選自下組的生物樣 品中組織，細胞和/或其提取物。
8.權(quán)利要求1到7任一所述的方法，其中至少一個阻斷所述協(xié)助寡核苷酸3’延伸的修 飾包含在3’末端或其附近摻入一個或多個不可延伸的部分或核苷酸類似物。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中至少一種修飾包括單獨的3’末端不可延伸的堿基或堿 基類似物，3’末端不可延伸的堿基和一個或多個所述寡核苷酸3’末端附近的核苷酸錯配的 組合，和/或在所述寡核苷酸3’末端附近摻入脫堿基位點。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述不可延伸的堿基選自下組2’，3’二脫氧核苷酸， 3’ C3，C18或其它長度間隔區(qū)，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸”堿基，“鎖定核酸(LNA) ”堿基，核 苷酸胺衍生物，經(jīng)尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡萄糖基酶處理的尿嘧啶，RNA或2’0_甲基核苷酸，或上述 的組合。
11.權(quán)利要求1到10任一所述的方法，其中所述起始引物和/或所述協(xié)助寡核苷酸依 賴性引物經(jīng)下述修飾包含一個或多個間隔區(qū)，脫堿基位點或修飾核苷酸例如2’ -0-甲基 核苷酸。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中在起始引物和/或協(xié)助寡核苷酸依賴性引物中的修 飾位于足夠靠近所述引物的3’端，從而使得雖然所述引物保留起始3’延伸的能力，但當在 其引物序列中包含所述修飾的延伸產(chǎn)物被拷貝時，其互補鏈過早地截短從而阻止了后續(xù)擴 增循環(huán)中引物的結(jié)合。
13.權(quán)利要求1到12任一所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’末端與所述起始引 物的5’末端相符，或位于(fall within)所述起始引物內(nèi)。
14.權(quán)利要求5到12任一所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’末端與所述協(xié)助寡 核苷酸依賴性引物的5’末端相符，或位于所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物內(nèi)。
15.權(quán)利要求1到12任一所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸包括延伸的5’尾，其包 括除存在于所述起始引物5’末端之外的序列。
16.權(quán)利要求5到12任一所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸包括延伸的5’尾，其包 括除存在于所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物5’末端之外的序列。
17.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’尾便于附接可檢測的 標記或標簽。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中側(cè)接所述靶序列的兩個寡核苷酸引物均為起始引物 和所述方法使用兩個協(xié)助寡核苷酸，其中之一結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰 近的區(qū)域作為正向起始引物，而另一個結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰近的區(qū) 域作為反向起始引物。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中至少一個協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與其相應的起始引 物具有足夠的序列同一性，從而使得在自所述至少一種協(xié)助寡核苷酸起始鏈延伸再生所述 起始引物結(jié)合位點，從而由此使所述相應的起始引物能起始后續(xù)輪次的鏈合成。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中至少一個協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與其相應起始引物 不具有足夠的序列同一性，從而使得所述相應的起始引物結(jié)合位點在自所述至少一種協(xié)助 寡核苷酸起始的鏈合成未再生。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述方法進一步使用至少一個協(xié)助寡核苷酸依賴性 引物，所述引物經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在過早終止互補鏈合成，且該引物與所述相 應的協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸起始的 鏈合成生成了協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點，由此使所述協(xié)助寡核苷酸依賴性引物能 起始后續(xù)輪次的鏈合成。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述方法使用兩個協(xié)助寡核苷酸依賴性引物，其中 之一結(jié)合于所述模板核酸分子上的基本上相同或鄰近的區(qū)域作為一個協(xié)助寡核苷酸，而另 一個結(jié)合于所述模板核酸分子上的基本上相同或鄰近的區(qū)域作為另一個協(xié)助寡核苷酸。
23.一種改善熱循環(huán)酶擴增反應特異性的方法，所述反應使用至少兩個側(cè)接位于核酸 分子內(nèi)目的靶核苷酸序列的核苷酸引物，其中所述引物中的至少一個經(jīng)修飾從而使得所述 修飾的存在過早終止互補鏈合成，且所述反應進一步使用至少一個非起始的協(xié)助寡核苷 酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在其3’末端或其3’末端附近包含至少一個修飾，從而使得自所 述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，且其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述修飾引物結(jié)合于所述模 板核酸分子的基本上相同或鄰近的區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與靶序列上于所 述修飾引物結(jié)合位置3’的序列互補的序列。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熱循環(huán)酶擴增反應的特異性通過消除不包括所 述目標靶核苷酸序列的擴增產(chǎn)物或減少其量來確定。
25.一種檢測變體核苷酸序列的方法，所述方法包括選擇性的擴增位于核酸分子內(nèi)和 包含所述變體序列的靶核苷酸序列，其中所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下述物質(zhì)相接觸(i)至少一個協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在3’末端或其附近包含至少一個 修飾，從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸的3’延伸遭阻斷，以及( )兩個或更多寡核苷酸引物，其中至少一個為起始引物，所述起始引物經(jīng)修飾從而 使得該修飾的存在過早地終止互補鏈合成，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物結(jié)合于所述模板核酸分子的基本上相同或鄰 近區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與位于靶序列上所述起始引物結(jié)合位置3’的序列 互補的3’序列，且其中所述3’序列使所述協(xié)助寡核苷酸能優(yōu)選結(jié)合于所述包含所述變體 序列的靶核苷酸序列，而非結(jié)合于相應的非變體序列；實施熱循環(huán)酶擴增反應，從而使得所述特定靶序列選擇性的擴增；以及將所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列與所述非變體靶序列相應的序列相比較，以檢測所述變 體核苷酸序列。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物具有足 夠的序列同一性，從而使得在自所述協(xié)助寡核苷酸起始的鏈延伸再生所述起始引物結(jié)合位 點，從而由此使所述起始引物能起始續(xù)輪次的鏈合成。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域與所述起始引物的相應 區(qū)域不具有足夠的序列同一性，從而使得所述起始引物結(jié)合位點在自所述協(xié)助寡核苷酸起 始的鏈合成未再生。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法可進一步使用協(xié)助寡核苷酸依賴性引物， 該引物與所述協(xié)助寡核苷酸的5’區(qū)域具有足夠的序列同一性，從而使得自所述協(xié)助寡核苷 酸起始的鏈合成產(chǎn)生了協(xié)助寡核苷酸依賴性引物結(jié)合位點，從而由此使所述協(xié)助寡核苷酸 依賴性引物能起始后續(xù)輪次的鏈合成。
29.權(quán)利要求25到28任一所述的方法，其中所述變體序列包括添加，缺失或取代一個 或多個核苷酸，或針對在所述靶序列內(nèi)一個或多個核苷酸的修飾，如改變的甲基化狀態(tài)。
30.權(quán)利要求1到29任一所述的方法，其中所述方法用于DNA甲基化分析和/或診斷 受試者的疾病或病癥，或者預報針對受試者中該疾病或病癥的易感性，其中所述疾病或病 癥以基因序列的改變?yōu)樘卣?，或與基因序列的改變相關(guān)。
全文摘要
本文提供了一種選擇性擴增位于核酸分子內(nèi)的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括將所述核酸分子(“模板”分子)與下列物質(zhì)相接觸(1)至少一種協(xié)助寡核苷酸，其中所述協(xié)助寡核苷酸在其3′末端或其附近具有至少一個修飾從而使得自所述協(xié)助寡核苷酸3′的延伸受阻斷，以及(ii)兩個或更多寡核苷酸引物，至少其中一個為起始引物，經(jīng)修飾從而使得所述修飾的存在使互補鏈合成過早終止，其中所述協(xié)助寡核苷酸與所述起始引物結(jié)合于實施模板核酸分子上基本上相同或鄰近的區(qū)域，且所述協(xié)助寡核苷酸進一步包括與所述靶序列上3′于所述起始引物結(jié)合位置的序列互補的序列；并實施熱循環(huán)酶擴增從而使得特定靶序列選擇性的被擴增。
文檔編號C12Q1/68GK101889096SQ200880119335
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月4日
發(fā)明者基思·N·蘭德 申請人:聯(lián)邦科學及工業(yè)研究組織