專利名稱：使用烯醇還原酶酶促還原α-和β-脫氫氨基酸的方法
使用烯醇還原酶酶促還原α-和β-脫氫氨基酸的方法本發(fā)明涉及用于通式⑴和(2)的α-和β-脫氫氨基酸的酶促還原的方法。本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供用于通式(3)和⑷的化合物的酶促制備的方法，特別地具 有高化學(xué)產(chǎn)率和非常好的立體選擇性的方法。發(fā)明_既述上述目的已通過使用還原酶YqjM、0PRl、0PR3和其功能等價(jià)物還原通式⑴和⑵ 的α-脫氫氨基酸來實(shí)現(xiàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于通過在還原酶存在的情況下還原式⑴或(2)的化合物來從通式 (1)或(2)的α _脫氫氨基酸酶促制備通式(3)或(4)的氨基酸的方法 其中R1、R2彼此獨(dú)立地是H、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、任選地取代的碳或雜環(huán)、芳 香或非芳香基，或烷基芳基或羧基(-C00R)，R3是H、甲?；?、乙?；?、丙酰基、芐基、芐氧羰基、B0C, Alloc,R 是 H、C1-C6 烷基、芳基，所述還原酶包含多肽序列SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6中的至少一個(gè)，或具有功能上等價(jià)的多肽序列，所述序列具有與SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6至少80% 的序列同一性。本發(fā)明的方法原則上可用純化的或富集的酶本身和用天然或重組地表達(dá)該酶的 微生物或用來源于其的細(xì)胞勻漿來進(jìn)行。除非另外指出，否則含義是-C1-C6-烷基特別地是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基，和分支1次或多次的相 應(yīng)類似物，例如，異_丙基、異_ 丁基、仲_ 丁基、叔_ 丁基、異_戊基或新戊基，特別優(yōu)選是 所述C1-C4-烷基；
-C2-C6-鏈烯基特別地是上述具有2至6個(gè)碳原子的烷基的單不飽和類似物，特別 地優(yōu)選是相應(yīng)的C2-C4-鏈烯基。-碳-和雜環(huán)芳香或非芳香環(huán)特別是具有3至12個(gè)碳原子和任選地1至4個(gè)雜原 子例如N、S和0，特別是N或0的任選的稠環(huán)?？商峒暗钠鋵?shí)例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、 環(huán)己基、環(huán)庚基、其單不飽和或多不飽和類似物例如環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯 基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚二烯基(cycloh印tadienyl)；苯基和萘基；和具有1至4個(gè)選自0、N和 S的雜原子的5-至7-元飽和或不飽和雜環(huán)基，其中雜環(huán)可任選地融合至另外的雜環(huán)或碳 環(huán)。特別地應(yīng)當(dāng)提及來源于吡咯烷、四氫呋喃、哌啶、嗎啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁 唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、噠嗪、吡嗪、香豆酮、吲哚和喹啉的雜環(huán)基。不僅是環(huán)基(cyclic radical)，而且還有上述烷基和鏈烯基，可任選地被取代1次或多次，例如1、2或3次。應(yīng) 當(dāng)提及作為合適的取代基的實(shí)例是鹵素，特別地F、Cl、Br ；-OH, _SH、-NO2, _NH3、-SO3H, C1-C4-烷基和C2-C4-鏈烯基.C1-C4-烷氧基；和羥基-C1-C4-烷基；其中烷基和鏈烯基是如上 所定義的，并且烷氧基來源于上文定義的相應(yīng)烷基。-BOC是叔丁氧羰基(保護(hù))基團(tuán)-Alloc是烯丙氧基羰基(保護(hù))基團(tuán)上文所列的環(huán)基可以是碳環(huán)(即環(huán)只由碳原子組成)和雜環(huán)(即環(huán)包含雜原子例 如0、S、N)。需要時(shí)，還可對(duì)此類碳環(huán)或雜環(huán)進(jìn)行額外地取代。脫氫丙氨酸和脫氫天冬氨酸的酶促還原是本發(fā)明的特別有利的實(shí)施方案。適合用于本發(fā)明的方法的還原酶(其偶爾也稱為烯醇還原酶)具有SEQID NO=U 2或3中顯示的多肽序列或具有與SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6至少80%，例如至少90%、 或至少95 %，特別地至少97 %、98 %或99 %的序列同一性。具有SEQ ID NO 1的多肽稱為來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的YqjM。 (UniprotKB/Swissprot 條目 P54550) ·具有SEQ ID NO 2的多肽由蕃茄OPRl基因編碼。(UniprotKB/Swissprot條目 Q9XG54).具有SEQ ID NO :3的多肽由蕃茄0YPR3基因編碼。(UniprotKB/Swissprot條目 Q9FEW9)·具有SEQ ID NO :4 的多肽稱為卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis) OYEl(Genbank Q02899)。具有SEQ ID NO :5的多肽由來自面包酵母的0YE2基因編碼(釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) SSj^ YHR179W) (Genbank Q03558)。具有SEQ ID NO :6的多肽由來自面包酵母的0YE3基因編碼(釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)基因座 YPL171C) (Genbank P 41816)。為了本文中描述的目的,將使用 University of Wisconsin 的 GeneticsComputer Group (GCG)的“GAP”計(jì)算機(jī)程序確定序列同一性，并且將應(yīng)用使用由GCG推薦的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù) 的版本10. 3?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的靶向或隨機(jī)誘變方法從SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6開 始獲得此類還原酶。然而，備選可能性則是也在微生物中，優(yōu)選下列屬的微生物中搜尋還原 酶交替單胞茵屬(Alishewanella)、交替球菌屬(Alterococcus) >Aquamonas>Aranicola>殺雄菌屬(Arsenophonus)、Azotivirga^布赫納氏菌屬(Brenneria)、蚜蟲內(nèi)共生菌 (Buchnera)(蚜蟲(aphid)內(nèi)共生菌(P-endosymbionts))、水生布戴約維采菌(Budvicia)、 布丘氏菌屬(Buttiauxella)、CandidatusPhlomobacter>MJ&M^M (Cedecea)、梓様酸桿 菌屬(Citrobacter)、Dickeya、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、 歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、愛文氏菌屬(Ewingella)、 Grimontella、Hafnia、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、克呂沃爾菌屬(Kiuyvera)、勒 克菌屬(Leclercia)、勒米諾氏菌屬(Leminorella)、米勒菌屬(Moellerella)、摩根 菌屬(Morganella)、月巴桿菌屬(Obesumbacterium)、泛菌屬(Pantoea)、果膠桿菌屬 (Pectobacterium)、發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、布拉格菌屬 (Pragia)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、拉恩菌屬(Rahnella)、 勞爾特氏菌屬(Raoultella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙門氏菌屬(Samsonia)、沙雷 氏菌屬(Serratia)、志賀菌屬(Shigella)、Sodalis、塔特姆菌屬(Tatumella)、特布爾 西氏菌屬(Trabulsiella)、Wigglesworthia、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、耳口爾辛氏菌屬 (Yersinia)、約克菌屬(Yokenella)或發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，所述還原酶催化上述模 型反應(yīng)并且其氨基酸序列已具有所需的對(duì)SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6的序列同一性或通過誘 變方法獲得。還原酶可以以純化的或部分純化的形式或以微生物本身的形式使用。用于從微生 物獲得和純化脫氫酶的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。使用還原酶進(jìn)行的對(duì)映選擇性還原(enantioselective reduction)優(yōu)選在適 當(dāng)?shù)妮o因子(也稱為協(xié)同底物)存在的情況下發(fā)生。通常用于酮的還原的輔因子是NADH 和/或NADPH。還原酶此外還可作為本身包含輔因子的細(xì)胞系統(tǒng)使用，或可加入備選的氧 化還原介體(A. Schmidt, F. Hollmann 和 B. Buhler "Oxidation of Alcohols” 于 K. Drauz 禾口 H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,第 III 卷，991-1032, ffiley-VCH, ffeinheim)。此外，使用還原酶進(jìn)行的對(duì)映選擇性還原優(yōu)選地在合適的還原劑存在下發(fā)生，所 述還原劑在還原過程中再生被氧化的輔因子。合適的還原劑的實(shí)例是糖，特別地己糖例如 葡萄糖、甘露糖、果糖和/或可氧化的醇，特別地乙醇、丙醇或異丙醇，以及甲酸、亞磷酸或 分子氫。為了氧化該還原劑，并且與之相伴地，再生輔酶，可以加入第二脫氫酶例如，葡萄糖 脫氫酶(當(dāng)葡萄糖用作還原劑時(shí))或甲酸脫氫酶(當(dāng)甲酸用作還原劑時(shí))。這可以以游離 或固定化酶的形式，或以游離或固定化細(xì)胞的形式使用?？煞珠_地或通過在(重組)還原 酶菌株中共表達(dá)來進(jìn)行其制備。所主張的方法的優(yōu)選實(shí)施方案是通過酶系統(tǒng)再生輔因子，在所述酶系統(tǒng)中使用第 二脫氫酶，特別優(yōu)選葡萄糖脫氫酶。還可進(jìn)一步有利地加入另外的促進(jìn)還原的添加劑，例如金屬鹽或螯合劑例如 EDTA0根據(jù)本發(fā)明使用的還原酶可以以游離或固定化的形式使用。固定化酶意指被固定 在惰性載體上的酶。合適的載體材料和固定在其上的酶公開于EP-A-1149849、EP-A-1 069 183和DE-A 100193773，以及其中引用的參考資料中。在這一點(diǎn)上，此類公開案的公開內(nèi) 容以其全文通過引用合并入本文。合適的載體材料包括例如粘土、粘土礦物例如高嶺石、硅藻土、珍珠巖、二氧化硅、氧化鋁、碳酸鈉、碳酸鈣、纖維素粉、陰離子交換劑材料(anion exchanger material)、合成聚合物例如聚苯乙烯、丙烯酸樹脂類、苯酚-甲醛樹脂、聚氨基 甲酸酯類和聚烯烴例如聚乙烯和聚丙烯。載體材料通常以精細(xì)分離的顆粒形式(優(yōu)選多孔 形式)用于制備載體結(jié)合酶。載體材料的顆粒大小通常不超過5mm，特別地不超過2mm(分 級(jí)曲線(grading curve))。類似地可以在作為全細(xì)胞(whole-cell)催化劑的脫氫酶的使 用上選擇游離或固定化形式。載體材料的實(shí)例是藻酸鈣和角叉菜膠。還可將酶和細(xì)胞用 戊二醛直接交聯(lián)(交聯(lián)以產(chǎn)生CLEA)。相應(yīng)的和另外的固定方法描述于例如J.Lalonde和 A. Margolin “Immobilization ofEnzymes，，于 K. Drauz 禾口 H. Waldmann, Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis 2002，第 III 卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim 中?？稍谒曰蚍撬苑磻?yīng)介質(zhì)中或在2相系統(tǒng)或(微)乳劑中進(jìn)行反應(yīng)。水性反應(yīng) 介質(zhì)優(yōu)選是通常具有4至8，優(yōu)選5至8的pH的緩沖溶液。除了水以外，水性溶劑還可以額 外地包含至少一種醇，例如乙醇或異丙醇或二甲基亞砜。非水性反應(yīng)介質(zhì)意指包含按重量計(jì)算(基于液體反應(yīng)介質(zhì)的總重量)低于1%，優(yōu) 選按重量計(jì)算低于0. 5%的水的反應(yīng)介質(zhì)。可以特別地在有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)。合適的有機(jī)溶劑是例如脂肪族烴，優(yōu)選具有5至8個(gè)碳原子的脂肪族烴，例如戊 烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷或環(huán)辛烷、鹵代脂肪族烴，優(yōu)選具有1或2個(gè)碳原子，例 如二氯甲烷、氯仿、四氯甲烷、二氯乙烷或四氯乙烷、芳香烴類例如苯、甲苯、二甲苯類、氯苯 或二氯苯、脂肪族非環(huán)和環(huán)狀的醚或醇，優(yōu)選具有4至8個(gè)碳原子，例如乙醇、異丙醇、二乙 醚、甲基三丁基乙醚、乙基叔丁醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、四氫呋喃或酯類，例如乙酸乙 酯或乙酸正丁酯，或酮類，例如甲基異丁基甲酮或二噁烷或其混合物。特別優(yōu)選使用上述 醚，特別是四氫呋喃?？梢岳缭谒杂袡C(jī)反應(yīng)介質(zhì)，例如以任何混合比例(例如1 99至99 1或 10 90至90 10)配制的水/異丙醇中，或水性反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行使用還原酶的還原。底物(1)或⑵優(yōu)選以0. lg/Ι至500g/l，特別優(yōu)選lg/Ι至50g/l的濃度用于酶 促還原，并且可連續(xù)或間斷地進(jìn)料。底物(1)或(2)可以以E/Z混合物和同分異構(gòu)上純的形式使用。酶促還原通常在低于使用的還原酶的失活溫度和高于-10°C的反應(yīng)溫度下發(fā)生。 其特別優(yōu)選在O至100°C，特別地，15至60°C和特別地20至40°C的范圍內(nèi)，例如在大約 30 "C?？赡艿姆椒ɡ缡抢缤ㄟ^攪拌或搖動(dòng)將底物(1)或(2)與還原酶、溶劑和輔酶 (如果適當(dāng))、第二脫氫酶(如果適當(dāng))(以再生輔酶)和/或另外的還原劑充分混合。然 而，還可以將還原酶固定在反應(yīng)器例如柱中，和將包含底物和輔酶(如果適當(dāng))和/或協(xié)同 底物的混合物通過反應(yīng)器。為了該目的，可以將混合物循環(huán)通過反應(yīng)器直至達(dá)到期望的轉(zhuǎn) 化。通常進(jìn)行還原直至轉(zhuǎn)化為至少70%，特別優(yōu)選至少85%和特別地至少95% (基于 存在于混合物中的底物)。反應(yīng)的進(jìn)展，即雙鍵的相繼還原后在此處可進(jìn)行常規(guī)方法例如氣 相色譜或高壓液相色譜進(jìn)行。明確公開的酶的“功能等價(jià)物”或類似物在本發(fā)明的說明書中是與其不同并且仍 然具有期望的生物學(xué)活性例如底物特異性的多肽。因此，“功能等價(jià)物”意指例如催化模型反應(yīng)并且具有包含SEQ ID NO :1、2或3下所列的氨基酸序列之一的酶的活性至少20%，優(yōu) 選50%，特別優(yōu)選75%，非常特別優(yōu)選90%的酶。功能等價(jià)物另外優(yōu)選在pH 4至10之間 是穩(wěn)定的并且有利地具有pH 5至8之間的最適pH和20°C至80°C范圍內(nèi)的最適溫度。
根據(jù)本發(fā)明“功能等價(jià)物”還特別地指在上述氨基酸序列的至少一個(gè)序列位點(diǎn)上 具有與具體提及的氨基酸不同的氨基酸，但卻具有上述生物學(xué)活性之一的突變體?！肮δ艿?價(jià)物”因此包括可通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、置換、缺失和/或倒位(inversions)獲得 的突變體，所述修飾可在任何序列位點(diǎn)上發(fā)生，只要它們導(dǎo)致具有根據(jù)本發(fā)明的性質(zhì)譜的 突變體。特別地當(dāng)反應(yīng)性模式在性質(zhì)上于突變體和未修飾多肽之間一致時(shí)，即例如以不同 的速率轉(zhuǎn)化相同的底物，功能等價(jià)性也存在。合適的氨基酸取代的實(shí)例見于下表
原始?xì)埢〈鷮?shí)例
AlaSer
ArgLys
AsnGln ；His
AspGlu
CysSer
GlnAsn
GluAsp
GlyPro
HisAsn ；Gln
IleLeu ；Val
LeuIle ；Val
LysArg ；Gln ；Glu
MetLeu ；Ile
PheMet ；Leu ；Tyr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp ；Phe
ValIle ；Leu
上述意義上的“功能等價(jià)物”也是所述多肽的“前體”和“功能衍生物”。
在這--點(diǎn)上，“前體”是具有或不具有期望的生物學(xué)活性的、天然或合成的多肽的前體。
同樣可借助于已知的技術(shù)在功能性氨基酸側(cè)鏈基上或在它們的N-或C-末端上制
備本發(fā)明的多肽的“功能衍生物”。此類衍生物包括例如，羧酸基團(tuán)的脂肪簇酯、可通過與氨 或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得的羧酸基團(tuán)的酰胺；通過與?；磻?yīng)制備的游離氨基的N-?；?衍生物；或通過與酰基反應(yīng)制備的游離羥基的0-?；苌?。 在其中蛋白質(zhì)糖基化是可能的情況下，本發(fā)明的“功能等價(jià)物”包括以去糖基化或 糖基化形式和可通過改變糖基化模式獲得的修飾形式存在的上述指定的類型的蛋白質(zhì)。
“功能等價(jià)物”當(dāng)然也包括可從其他生物獲得的多肽和天然發(fā)生的變體。例如，可 以通過序列的比較確定同源序列區(qū)域的范圍，和基于本發(fā)明的特殊需求確定等價(jià)酶?！肮δ艿葍r(jià)物”同樣地包括本發(fā)明的多肽的片段，優(yōu)選個(gè)體結(jié)構(gòu)域或序列基序，其 具有例如期望的生物學(xué)功能。此外“功能等同物”是融合蛋白，所述融合蛋白包含一個(gè)上述多肽序列或來源于其 的功能等價(jià)物和至少一個(gè)另外的異源序列，所述另外的異源序列在其功能性N或C末端連 接上與其不同(即具有融合蛋白的部分的可忽略的相互功能性缺損)。此類異源序列的非 限定性實(shí)例是例如信號(hào)肽或酶。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的同源物可通過篩選突變體(例如截短突變體)的組合文庫來 鑒定。例如，可通過例如通過合成的寡核苷酸的混合物的酶促連接在核酸水平上進(jìn)行組合 誘變來產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的多樣化文庫。存在許多可用于從簡并寡核苷酸序列制備潛在同 源物的文庫的方法?？稍谧詣?dòng)DNA合成儀上進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成的 基因連接入合適的表達(dá)載體。一組簡并基因的使用使得可以在一個(gè)混合物中提供編碼期 望的潛在蛋白質(zhì)序列組的所有序列。用于合成簡并寡核苷酸的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說是已知(例如 Narang，S. Α. (1983)Tetrahedron 39 3 ；Itakura 等人(1984)Annu. Rev. Biochem. 53 323 ；Itakura等人，(1984) Science 198 1056 ；Ike 等人(1983) Nucleic Acids Res. 11 477)。用于篩選通過點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物和用于篩選具有選擇的 特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫的幾種技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。此類技術(shù)可適合于快 速篩選通過本發(fā)明的同源物的組合誘變產(chǎn)生的基因文庫。用于篩選大基因文庫的最常用 技術(shù)(用于高通量分析)包括將基因文庫克隆入可復(fù)制表達(dá)載體，用所得的載體文庫轉(zhuǎn) 化合適的細(xì)胞，然后在這樣的條件下(在所述條件下期望的活性的檢測(cè)促進(jìn)分離編碼其 產(chǎn)物已被檢測(cè)到的基因的載體)表達(dá)組合基因?？蓪⑦f歸集合誘變(Recursiveensemble mutagenesis) (REM)(增加文庫中功能性突變體的頻率的技術(shù))與篩選檢測(cè)一起使用來鑒 定同源物(Arkin 和 Yourvan(1992)PNAS89 :7811-7815 ；Delgrave 等人· (1993)Protein Engineering6(3) :327_331)。本發(fā)明還涉及編碼具有根據(jù)本發(fā)明的還原酶活性的酶的核酸序列(單鏈和雙鏈 DNA和RNA序列例如cDNA和mRNA)。編碼例如SEQ ID NO :1、2或3中顯示的氨基酸序列的 核酸序列或其特征部分序列是優(yōu)選的。以本身已知的方式通過化學(xué)合成例如通過雙螺旋的個(gè)體交疊的互補(bǔ)核酸構(gòu)建塊 (building block)的片段縮合(fragment condensation)從核苷酸構(gòu)建塊制備本文中提及 的所有核酸序列?？梢砸岳缫阎姆绞酵ㄟ^亞磷酰胺法(VoetJoet，第2版，Wiley Press New York，896-897頁)進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。合成寡核苷酸的添加和使用DNA聚合酶 Klenow片段進(jìn)行的缺口填充和連接反應(yīng)以及一般克隆方法描述于Sambrook等人(1989)， Molecular Cloning :A laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press 中。用于進(jìn)行本發(fā)明的酶促還原法的另外的實(shí)施方案本發(fā)明的方法中的pH最好保持在pH 4至12之間，優(yōu)選pH 4. 5至9之間，特別優(yōu) 選PH 5至8之間。得到最小的98% ee。對(duì)于本發(fā)明的方法可使用包含編碼還原酶的核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長細(xì)胞。還可使用靜息或破裂的細(xì)胞。破裂的細(xì)胞意指例如通過用例如溶劑處理使其可通透的 細(xì)胞，或通過酶處理，通過機(jī)械處理(例如，弗細(xì)胞壓碎或超聲)或通過任何其他方法破裂 的細(xì)胞。由此獲得的粗制提取物有利地適合于本發(fā)明的方法。還可將純化的或部分純化的 酶用于該方法。固定的微生物或酶同樣是適合的并且可有利地用于反應(yīng)。可通過分批發(fā)酵法、半分批發(fā)酵法或連續(xù)地進(jìn)行本發(fā)明的方法?？稍诶鏐iotechnology, H 3卷，第2版，Rehm等人編(1993)特別地第II章中 描述的生物反應(yīng)器中有利地進(jìn)行所述方法?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法從反應(yīng)介質(zhì)中分離在本發(fā)明的方法中制備的 產(chǎn)物以及如果期望，純化所述產(chǎn)物。所述方法包括蒸餾法、色譜法、提取法和結(jié)晶法。依需 要，可通過組合多個(gè)此類方法將產(chǎn)物純化至顯著更高的水平。下列實(shí)施例意欲舉例說明本發(fā)明，然而不對(duì)其進(jìn)行限定。在這一點(diǎn)上參考附圖
。實(shí)驗(yàn)部分關(guān)于不對(duì)稱生物還原的一般方案按照下列一般方案，使用分離的酶YqjM、OPRU 0PR3和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)還原酶進(jìn)行底物的不對(duì)稱生物還原。向具有輔因子NADH或NADPH(15mM)的Tris緩沖液，50mM pH 7. 5 (0. 8ml)中的底 物(5mM)的溶液中加入酶制劑(100-200 μ g)，然后在30°C下在搖動(dòng)(140rpm)的情況下進(jìn) 行反應(yīng)。48小時(shí)后，使用乙酸乙酯提取反應(yīng)混合物，通過GC(氣相色譜)分析產(chǎn)物當(dāng)使用輔因子再循環(huán)系統(tǒng)時(shí)選擇下列方法NADH/FDH 系統(tǒng)向Tris緩沖液50mM pH 7. 5 (0. 8ml)中的氧化的輔因子NAD+(100 μ M)、甲酸 銨(20mM)的底物(5mM)的混合物中，加入FDH(IOu)，在加入酶(100-200 μ g)之后，在 300C (140rpm)下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行48小時(shí)。NADH/⑶ H向Tris緩沖液50mM pH 7. 5 (0. 8ml)中的氧化的輔因子NADP+(100 μ Μ)、葡萄糖 (20mM)的底物(5mM)的混合物中，加入(D)-GDH(IOu)，在加入酶(100-200 μ g)之后，在 300C (140rpm)下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行48小時(shí)。NADPH/G6PDH向Tris緩沖液50mM pH 7. 5(0. 8ml)中的氧化的輔因子NADP+(10 μ Μ)、葡萄糖-6 磷酸(20mM)的底物(5mM)的混合物中，加入G6PDH(10u)，在加入酶(100-200 μ g)之后，在 300C (140rpm)下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行48小時(shí)。ADH向含有底物2-乙酰氨基丙烯酸鹽/酯(5mM)、協(xié)同底物2-丙醇(3_60mM、 0. 6-12mol等價(jià)物)和氧化的輔因子NAD+(100 μ Μ)的Tris-HCl-緩沖溶液(0.8ml，50mM， pH 7. 5)中加入OPRl的等份。加入ADH-A (大約2-3U)，以120rpm在30°C下攪拌混合物42 小時(shí)。用乙酸乙酯(2x0.5ml)提取產(chǎn)物，在Na2SO4I方干燥組合的有機(jī)相，通過非手性GC 分析獲得的樣品。在大腸桿菌BL21 (DE3)(載體pETv22b)中表達(dá)ADH_A。在65°C下熱休克20分鐘 后，在無任何進(jìn)一步純化的情況下使用ADH溶液。
向含有底物2-乙酰氨基丙烯酸酯/鹽(5mM)和輔因子NADH或NADPH(IOmM)的 Tris-HCl-緩沖溶液(0. 8ml,50mM, pH 7.5)中加入分離的酶的等份。以120rpm在30°C下 攪拌反應(yīng)混合物64小時(shí)。用乙酸乙酯(2x0. 5ml)提取產(chǎn)物，在Na2SO4上方干燥組合的有機(jī) 相，通過非手性GC分析獲得的樣品。通過共注射入GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)和非手性GC將產(chǎn)物與可靠的 獨(dú)立合成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比較來鑒定所述產(chǎn)物。使用6%氰丙基苯基相毛細(xì)管柱(Varian CP-1301，30m，0. 25mm, 0. 25 μ m)、檢測(cè)器溫度240°C、注射器溫度250。C、分流比30 1來測(cè) 定轉(zhuǎn)化。用于2-乙酰氨基丙烯酸甲酯和N-乙?；?丙氨酸甲酯的溫度程序120°C下進(jìn) 行2分鐘，IO0C /分鐘至1600C，30°C /分鐘至200°C，持續(xù)2分鐘。保留時(shí)間4. 89分鐘和 5. 12分鐘。使用改良的環(huán)糊精毛細(xì)管柱(ChiraldeX B-TA，40m，0.25mm)測(cè)定對(duì)映體過 量。檢測(cè)品溫度200°C，注射器溫度180°C，分流比20 1。溫度程序130°C下進(jìn)行5分鐘， 2°C /分鐘至135°C，15°C /分鐘至180°C，持續(xù)2分鐘。保留時(shí)間(R/S)_和(S/R)-各自 5. 18和5. 35分鐘。絕對(duì)構(gòu)型是通過與可信樣品相比較鑒定的“S”。表3
權(quán)利要求
用于通過在還原酶存在的情況下還原式(1)和(2)的化合物，而從通式(1)或(2)的α 脫氫氨基酸酶促制備通式(3)或(4)的氨基酸的方法其中R1、R2彼此獨(dú)立地是H、C1 C6烷基、C2 C6鏈烯基、任選地取代的碳環(huán)或雜環(huán)、芳香或非芳香基，或烷基芳基或羧基( COOR)，R3是H、甲酰基、乙酰基、丙?；⑵S基、芐氧羰基、BOC、Alloc，R是H、C1 C6烷基、芳基，所述還原酶(i)包含多肽序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6中的至少一個(gè)，或(ii)具有功能上等價(jià)的多肽序列，所述序列具有與SEQ ID NO1、2、3、4、5、6至少80％的序列同一性。FPA00001155473800011.tif
2.權(quán)利要求1中的方法，其中使用NADPH或NADH作為輔因子進(jìn)行還原。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中所使用的輔因子是酶促再生的。
4.權(quán)利要求3中的方法，其中通過葡萄糖脫氫酶或甲酸脫氫酶或仲醇再生輔因子。
5.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法，其中在水性、水性-醇或醇反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行 還原。
6.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法，其還原酶以固定狀態(tài)存在。
7.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法，其中酶選自枯草桿菌還原酶和番茄
8.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法，其中使式(1)的化合物反應(yīng)，其中 R1是H，R2是H，R3是乙?；?。
9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法，其中在0至45°C的范圍內(nèi)的溫度下和/或在 6至8的范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行反應(yīng)。
10.由前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所述的方法制備的式(3)或(4)的化合物作為化學(xué)或 酶促活性劑合成的中間體的用途。(Lycopers icum esculentum)還原酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過在還原酶存在的情況下還原式(1)或(2)的化合物來從通式(1)或(2)的α-脫氫氨基酸酶促制備通式(3)或(4)的氨基酸的方法其中R1、R2彼此獨(dú)立地是H、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、任選地取代的碳基或雜環(huán)、芳香基或非芳香基，或烷基芳基，或羧基(-COOR)，R3是H、甲?；?、乙酰基、丙?；?、芐基、芐氧羰基、BOC、Alloc，R是H、C1-C6烷基、芳基。
文檔編號(hào)C12P13/04GK101903528SQ200880120171
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者B·豪爾, C·斯蒂克勒, K·費(fèi)伯, M·哈爾, R·施蒂默爾, T·弗里德里希 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司