專利名稱：用于生成樹(shù)突細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生成和遺傳工程化改造樹(shù)突細(xì)胞(DC)的方法及其用途。
背景技術(shù)：
在過(guò)去多年期間，已經(jīng)認(rèn)可樹(shù)突細(xì)胞(DC)為免疫的中心調(diào)節(jié)物。人DC是通過(guò)在 存在生長(zhǎng)因子(通常為白介素(IL)4和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))的情況 中從造血干細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的體外分化生成的。最近的證據(jù)提示，DC具有柔性 地(flexibly)響應(yīng)微生物、外傷、或代謝應(yīng)激遭遇的能力。如此，DC不僅分化成能履行特 定功能(例如活化或耐受性，1型或2型T輔助淋巴細(xì)胞(Thl，Th2)極化)的一種亞型，而 且還以適合于給定環(huán)境中遭遇的考驗(yàn)的時(shí)間-動(dòng)力學(xué)方式呈現(xiàn)獨(dú)特的功能狀態(tài)(

圖1)。單核細(xì)胞離開(kāi)血流而進(jìn)入各種組織，并變?yōu)橥ǔ７Q為未成熟DC(iDC)的細(xì)胞。這 些iDC是通過(guò)從細(xì)胞外液以及來(lái)自生理學(xué)瀕死細(xì)胞的凋亡體吸收材料來(lái)對(duì)其環(huán)境取樣，進(jìn) 行加工，并在不進(jìn)行共刺激的情況中以耐受性誘導(dǎo)形式將此材料呈遞給T淋巴細(xì)胞的哨兵 (sentinel)?？梢哉J(rèn)為耐受性誘導(dǎo)iDC表型是DC的缺省狀態(tài)。此狀態(tài)得到維持，直至iDC遭 遇危險(xiǎn)信號(hào)，該危險(xiǎn)信號(hào)可以是由toll樣受體(TLR)傳送的病原體相關(guān)分子樣式(PAMP)、 炎性細(xì)胞因子、或T淋巴細(xì)胞衍生的信號(hào)傳導(dǎo)(最主要由⑶40/⑶40L相互作用介導(dǎo))。此 過(guò)程稱為DC成熟，其與功能改變的順序一致。這些功能改變?cè)谝欢渭s2天的時(shí)間里發(fā)生， 之后DC達(dá)到稱為成熟DC (mDC)的狀態(tài)。最顯著地，DC開(kāi)始上調(diào)共刺激分子諸如B7家族成 員⑶80和⑶86。這使DC能夠向攜帶能與抗原性肽相互作用的T細(xì)胞受體的T淋巴細(xì)胞投 遞活化性而非抑制性信號(hào)，所述抗原性肽與DC膜上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子復(fù) 合。在此階段，還發(fā)生刺激物依賴性極化，其中DC分泌IL-12以及IL-12家族細(xì)胞因子，其 有利于1型免疫應(yīng)答，隨后支持由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。IL-12分泌 一般由TLR與其配體結(jié)合(例如TLR4與LPS結(jié)合)觸發(fā)，但是也通過(guò)可溶性或細(xì)胞膜結(jié)合 的⑶40L分子與DC上的⑶40的相互作用觸發(fā)。比較而言，IL-12釋放的缺乏觸發(fā)2型極 化，其通過(guò)支持B淋巴細(xì)胞來(lái)啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答。在沒(méi)有IL-12分泌的情況中啟動(dòng)DC成熟 是通過(guò)iDC與細(xì)胞因子混合物(通常含有TNF- α和PG-E2以及多種炎性細(xì)胞因子，包括但 不限于I型和II型干擾素、IL-1、或IL-6)的暴露實(shí)現(xiàn)的。IL-12釋放在約24小時(shí)后停止，指明DC與T淋巴細(xì)胞之間的相遇需要在該時(shí)間窗 內(nèi)發(fā)生以容許有效的1型極化和CTL活化。比較而言，共刺激分子的表達(dá)在2天后達(dá)到其 最大值。因?yàn)榘凑斩x，成熟的DC僅在表型方面而不在功能方面以共刺激分子的最大限度 表達(dá)表征，所以釋放IL-12的1型極化DC稱為半成熟的(sm)DC。約2天后，DC達(dá)到所謂成熟的階段。它分化的第二天期間，DC免除其免疫刺激能 力，并通過(guò)上調(diào)介導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)反饋環(huán)的分子來(lái)獲得免疫抑制特性(圖1)。此分化階段的生物 學(xué)意義是在嚴(yán)格控制下保持免疫應(yīng)答的必然性?；罨拿庖呒?xì)胞(特別是實(shí)現(xiàn)殺死其它細(xì) 胞的CTL)對(duì)生物體形成相當(dāng)大的威脅。這以避開(kāi)其控制的免疫應(yīng)答的病理學(xué)后果自身免 疫性疾病諸如I型糖尿病或多發(fā)性硬化例示。因此，遇到成熟信號(hào)后第1天期間引發(fā)免疫 應(yīng)答的同一 DC會(huì)在其分化過(guò)程的第2天期間使此相同的免疫應(yīng)答衰減。因此，成熟的DC實(shí)際上并不是如最初認(rèn)為的免疫刺激細(xì)胞而是免疫抑制細(xì)胞，因此不足以進(jìn)行目的在于免 疫刺激的治療性干預(yù)，諸如其在癌癥免疫療法或治療微生物疾病中的用途。辨別未成熟的(耐受性維持)、半成熟的DC(免疫刺激性)、和成熟的(免疫抑制 性)DC是重要的(圖1)。如上文所概述的iDC維持針對(duì)自身抗原的耐受性。smDC已經(jīng)遇 到上文所述成熟刺激物之一，而且已經(jīng)不可逆地在約2天內(nèi)分化成mDC。重要的是，僅在那 2天的第一天期間，其實(shí)現(xiàn)IL-12釋放，啟動(dòng)I型免疫極化，和隨后支持CTL介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答。一旦成熟的DC在一天后進(jìn)入分化的第二階段，它便獲得免疫抑制特性。免疫學(xué)家能常 規(guī)地通過(guò)膜分子諸如⑶80、⑶83、或⑶86的表達(dá)來(lái)表征mDC。然而，與在幾小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大 限度表達(dá)，并在24小時(shí)后喪失的IL-12相比，這些膜分子僅在48小時(shí)后達(dá)到其最大限度表 達(dá)。為了清楚地辨別本文中所描述的IL-12分泌DC與以名稱成熟DC常規(guī)了解的細(xì)胞，選 擇術(shù)語(yǔ)半成熟的DC。非常重要的是，這不應(yīng)暗示一些種類的功能缺陷，而僅僅是圖1中按時(shí) 間動(dòng)力學(xué)比例的某個(gè)分化階段。smDC在功能上與iDC以及mDC有所不同。WO 2007/117682涉及用編碼⑶40L的mRNA分子轉(zhuǎn)染的成熟樹(shù)突細(xì)胞。Koya R. C.等(J Immunoth. 26 (2003) :451_460)描述了用編碼 CD40L 的病毒轉(zhuǎn)染 未成熟的樹(shù)突細(xì)胞。需要CD40L來(lái)使這些樹(shù)突細(xì)胞成熟。在Liu Y.等(Cancer Gene Therapy 9(2002) :202_208)中，披露了用編碼 CD40L 的病毒轉(zhuǎn)染未成熟的樹(shù)突細(xì)胞。本發(fā)明的目的在于提供一種基于遺傳工程來(lái)生成樹(shù)突細(xì)胞的方法?？梢允褂眠@些 樹(shù)突細(xì)胞來(lái)制備藥物制劑。本發(fā)明涉及一種包含部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞的藥物制劑，其通過(guò)包括下列步驟的方
法可獲得a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞或其前體細(xì)胞或部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞，所述部分成熟的 樹(shù)突細(xì)胞如下可獲得，即使未成熟的樹(shù)突細(xì)胞與至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸來(lái)生成部分 成熟的樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定義的b)操作步驟a)的所述細(xì)胞，特別是步驟a)的釋放IL_12的所述部分成熟的樹(shù)突 細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)過(guò)表達(dá)能夠使以連續(xù)的IL-12分泌表征的樹(shù)突細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞刺激能力，并 且選自⑶40L的至少一種免疫分子維持至少24小時(shí)，優(yōu)選至少48小時(shí)，其通過(guò)導(dǎo)入編碼所 述至少一種分子的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN-γ的樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)起作用或自 暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN-γ的樹(shù)突細(xì)胞釋放，并選自白介素10 (IL-10)和吲哚胺2， 3_加雙氧酶(IDO)的至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子，諸如表3、4和/或5中給出的至少一 種基因的表達(dá)，其如下實(shí)現(xiàn)，即敲除表達(dá)所述至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的基因或其片 段或?qū)胗靡砸种苹蜃柚乖谒鰳?shù)突細(xì)胞內(nèi)有活性或從所述樹(shù)突細(xì)胞投遞至T細(xì)胞的至 少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的表達(dá)的核酸分子，優(yōu)選核糖核酸分子，并c)任選地，添加物質(zhì)來(lái)將樹(shù)突細(xì)胞的前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成樹(shù)突細(xì)胞。依照本發(fā)明的藥物制劑包含通過(guò)本文中所公開(kāi)的方法可獲得的樹(shù)突細(xì)胞。進(jìn)行目 的在于過(guò)表達(dá)促成免疫刺激的分子諸如CD40L的遺傳工程，或目的在于敲除免疫抑制分子 諸如IL-10或ID0，和下文表3、4和5中所列新鑒定分子(其在DC中顯示與IL-10和IDO類似的表達(dá)動(dòng)力學(xué))表達(dá)的遺傳工程的樹(shù)突細(xì)胞。可以對(duì)任何DC或前體細(xì)胞(如造血干 細(xì)胞)實(shí)施遺傳工程，不管這些樹(shù)突細(xì)胞是暴露于成熟劑諸如TLR配體、炎性細(xì)胞因子的混 合物、或T細(xì)胞衍生的信號(hào)諸如CD40L介導(dǎo)的信號(hào)，還是進(jìn)行目的在于觸發(fā)從未成熟的向成 熟的DC進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換的另一種規(guī)程，或者它們可以處于未成熟階段?？梢栽诒┞队诔墒齑?激物前或后實(shí)施(基因)操作。優(yōu)選地，應(yīng)用成熟刺激物(或成熟刺激物的組合)僅持續(xù) 一段短暫的時(shí)間，例如不長(zhǎng)于24小時(shí)，12小時(shí)，但是特別優(yōu)選6小時(shí)，而且小于6小時(shí)。短 暫的(至少2小時(shí))成熟刺激物向DC的有利應(yīng)用確保接種入患者中后的DC免疫藥物保留 了高效率啟動(dòng)T細(xì)胞刺激的能力。對(duì)DC的遺傳工程化改造目的在于改善該基本免疫刺激 能力，而并不意圖替換它。必須將用于生成本發(fā)明藥物制劑的樹(shù)突細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成樹(shù)突細(xì) 胞。其實(shí)現(xiàn)手段和方法是本領(lǐng)域已知的?！皹?shù)突細(xì)胞前體細(xì)胞”包括單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于生成樹(shù)突細(xì)胞的方法，包括下列步驟a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞，b)使所述未成熟的樹(shù)突細(xì)胞與至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸來(lái)生成部分成熟的 樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定義的，并c)操作步驟b)的釋放IL-12的所述部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)， 以便(i)過(guò)表達(dá)能夠使以連續(xù)的IL-12分泌表征的樹(shù)突細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞刺激能力維 持至少24小時(shí)，優(yōu)選至少48小時(shí)或更長(zhǎng)的至少一種免疫分子，并且所述至少一種免疫分子 選自CD40L，其通過(guò)導(dǎo)入編碼所述至少一種分子的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN- γ的所述樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)起作用 或自暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN-γ的樹(shù)突細(xì)胞釋放，并且選自白介素10 (IL-10)和吲 哚胺2，3-加雙氧酶(IDO)的至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子，諸如表3和4中給出的至少 一種基因的表達(dá)，其如下實(shí)現(xiàn)，即敲除表達(dá)所述至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的基因或其 片段或?qū)胗靡砸种苹蜃柚乖谒鰳?shù)突細(xì)胞內(nèi)有活性或從所述樹(shù)突細(xì)胞投遞至T細(xì)胞的 至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的表達(dá)的核酸分子，優(yōu)選核糖核酸分子。上文所述方法的步驟b)的經(jīng)遺傳工程化改造的IL-12釋放DC過(guò)表達(dá)能夠延長(zhǎng)T 淋巴細(xì)胞刺激時(shí)間窗和/或完全阻止其在24小時(shí)后關(guān)閉的至少一種分子，其特征在于使分 泌維持得長(zhǎng)于24小時(shí)，這通過(guò)導(dǎo)入編碼所述至少一種免疫刺激分子的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)；或 者顯示暴露于任何有效的成熟刺激物后從T淋巴細(xì)胞刺激時(shí)間窗進(jìn)入成熟后24小時(shí)開(kāi)始 打開(kāi)的T淋巴細(xì)胞抑制時(shí)間窗的DC正常發(fā)育過(guò)程中所牽涉的至少一種分子的表達(dá)受到抑 制或下調(diào)；和/或抑制或阻止已經(jīng)發(fā)育成呈現(xiàn)免疫抑制表型的DC表達(dá)在介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞抑 制方面履行功能的至少一種分子。這是如下實(shí)現(xiàn)的，即敲除編碼所述至少一種分子的基因 或其片段和/或?qū)胗靡砸种苹蜃柚垢蓴_暴露于成熟刺激物后從免疫刺激性向免疫抑制 性表型的DC正常發(fā)育的至少一種分子的表達(dá)的核酸分子，優(yōu)選核糖核酸分子；和/或干擾 從DC向T細(xì)胞投遞的信號(hào)，引起抑制此T細(xì)胞的活性，如此抑制免疫應(yīng)答。本發(fā)明的樹(shù)突 細(xì)胞使T淋巴細(xì)胞刺激(特別是CTL活化)最大化，其通過(guò)使用遺傳工程來(lái)加寬約24小時(shí) 的刺激時(shí)間窗或完全阻止24小時(shí)后此刺激時(shí)間窗的關(guān)閉。作為IL-10或IDO的備選，可以使用暴露于任何成熟刺激物后約24小時(shí)開(kāi)始的DC免疫抑制功能中所牽涉的其它分子(表 3、4、和5)。在制備經(jīng)遺傳工程化改造的免疫刺激性DC中優(yōu)先靶向的會(huì)正是這些分子。特 別優(yōu)選的是，使用在所呈現(xiàn)的DNA微陣列數(shù)據(jù)中顯示兩倍過(guò)表達(dá)(表3和4)，更優(yōu)選至少六 倍過(guò)表達(dá)的分子。表3和4中給出的數(shù)目顯示了倍數(shù)過(guò)表達(dá)，如各自欄的標(biāo)題中所標(biāo)示的。 特別優(yōu)選的是，敲除表現(xiàn)出牽涉免疫抑制的分子在DC免疫藥物中的表達(dá)，如圖9中所描繪 的例子所表明的。通過(guò)反轉(zhuǎn)上文所概述的策略，有可能設(shè)計(jì)經(jīng)遺傳工程化改造的T淋巴細(xì)胞抑制性 DC免疫藥物，用于在例如變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性疾病，以及干細(xì)胞和器官移植中治療免疫 系統(tǒng)的病理學(xué)反應(yīng)過(guò)度。免疫抑制在生理學(xué)上是由在暴露于任何成熟刺激物后已經(jīng)分化超 過(guò)24小時(shí)的DC介導(dǎo)的。如下增強(qiáng)此類DC的免疫抑制能力，即干擾DC分化的前24小時(shí)期 間的T淋巴細(xì)胞刺激分子的表達(dá)；和/或過(guò)表達(dá)賦予T淋巴細(xì)胞抑制的分子，其通過(guò)依照上 文所概述的策略遺傳工程化改造DC來(lái)實(shí)現(xiàn)。smDC作為基因操作靶物的用途是本發(fā)明中心的且至關(guān)重要的部分。過(guò)去發(fā)表的 mDC的免疫刺激性效果主要由于實(shí)施許多這些實(shí)驗(yàn)的高度人為的實(shí)驗(yàn)背景，例如使用本質(zhì) 上不存在的合成肽替換DC的真實(shí)靶物天然的蛋白質(zhì)抗原分子或者甚至全細(xì)胞，這兩者都 需要完全不同的DC攝取和加工的機(jī)制。許多其他調(diào)查人員使用鼠系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行他們的研究， 而且人與小鼠之間有引起大量混淆的至關(guān)重要的差異。然而，現(xiàn)在普遍接受的是，mDC具有 免疫抑制特性。令人驚訝的是，證明了用依照本發(fā)明的方法獲得的樹(shù)突細(xì)胞展現(xiàn)出更寬的 刺激窗(即IL-12表達(dá)的升高和延長(zhǎng))。發(fā)現(xiàn)將半成熟(sm)DC-即如下的DC，其中生理學(xué) 分化過(guò)程通過(guò)暴露于能夠觸發(fā)自DC進(jìn)行IL-12分泌，但是不過(guò)優(yōu)選在2至12小時(shí)后，更優(yōu) 選在6小時(shí)后消除的任何成熟刺激物啟動(dòng)_遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)CD40L分子具有將其 T淋巴細(xì)胞刺激能力維持至少24小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)，而且甚至達(dá)5天或甚至10天的能力。 此外，優(yōu)選的是，在含有IFN-Y的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此類經(jīng)遺傳工程化改造的DC。此類DC通過(guò) 通常6小時(shí)暴露于Toll樣受體(TLR)配體，優(yōu)選但不排他的是脂多糖(LPS)，再次優(yōu)選在存 在IFN- γ的情況中-參見(jiàn)表1-并遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)⑶40L來(lái)給予smDC，呈現(xiàn)如下 表型，其特征在于連續(xù)的IL-12分泌持續(xù)至少1天，優(yōu)選3天，且甚至達(dá)5天，而且在異基因 混合白細(xì)胞反應(yīng)(alloMLR)中的免疫刺激能力維持至少24小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)，但是多至5 天。應(yīng)用于DC免疫藥物設(shè)計(jì)，這確認(rèn)DC分化的早期免疫刺激窗和較晚的免疫抑制窗的存 在及相關(guān)功能。因此，開(kāi)發(fā)刺激性DC免疫藥物的一般原則可以加寬早期免疫刺激窗，以便 更有效地觸發(fā)免疫活化，并降低或關(guān)閉較晚的免疫抑制窗，或者對(duì)于設(shè)計(jì)抑制性DC免疫藥 物反之亦然(圖1)。一般而言，為了生成免疫刺激性DC藥物(“DC免疫藥物”;“免疫藥物”)來(lái)治療例 如癌癥或傳染病，初始的成熟刺激物諸如LPS/IFN- γ需要被應(yīng)用于DC，以便啟動(dòng)從iDC成 為smDC的生理學(xué)分化。其它TLR配體(表1)可以達(dá)到與LPS相同的目的；TLR配體的組 合可以給予更強(qiáng)的但沒(méi)有性質(zhì)差異的信號(hào)。若T淋巴細(xì)胞刺激性DC免疫藥物的刺激潛力 僅基于基因轉(zhuǎn)移的人工操作而沒(méi)有初始暴露于TLR配體介導(dǎo)的成熟刺激物(例如通過(guò)對(duì)未 成熟DC的直接遺傳工程化改造)，則會(huì)喪失對(duì)DC功能的重要作用，并且T淋巴細(xì)胞刺激性 DC免疫藥物不能達(dá)到其完全的潛力。依照本發(fā)明的經(jīng)遺傳工程化改造的DC免疫藥物與通 過(guò)僅暴露于成熟劑或其組合(例如LPS/IFN-γ (smDC))制備的DC免疫藥物的重要差異在
8于對(duì)于后一種，在DC分化相應(yīng)的短暫窗期間應(yīng)用smDC免疫藥物是至關(guān)重要的。因此，此類 刺激性DC免疫藥物不得不在暴露于成熟刺激物后不久便進(jìn)行應(yīng)用，而遺傳工程(例如通過(guò) 過(guò)表達(dá)CD40L)目的在于加寬DC分化的免疫刺激時(shí)間，這容許應(yīng)用時(shí)間的重要程度降低，但 是最重要的是，阻止DC從免疫刺激性向免疫抑制性表型的發(fā)育(圖1)?？梢匀缦聦?shí)現(xiàn)對(duì) DC的免疫刺激能力的相當(dāng)大的改善，即敲除懷疑為免疫抑制中有重要牽涉的分子，如通過(guò) 與已知的免疫抑制分子IL-10或IDO表達(dá)類似的表達(dá)譜(expression profile)所指明的 (圖3、4和5中所列的)；或者已經(jīng)顯示為牽涉免疫抑制的分子，因?yàn)樵贒C中將它們敲除導(dǎo) 致工程化改造DC的T細(xì)胞刺激能力改善(圖9)。還有，較舊的smDC免疫藥物的免疫刺激 時(shí)間窗在24小時(shí)后關(guān)閉，而新型的經(jīng)遺傳工程化改造的DC免疫藥物會(huì)使其T淋巴細(xì)胞刺 激潛力再維持至少1天，優(yōu)選3天，但多至5天。相當(dāng)?shù)乃枷脒m用于T淋巴細(xì)胞抑制性DC 免疫藥物。未成熟的DC首先需要被暴露于常規(guī)的成熟刺激物，諸如LPS/IFN- γ，以便啟動(dòng) 朝向與DC分化的T淋巴細(xì)胞抑制窗對(duì)應(yīng)的mDC表型的分化。可以在未成熟的DC成熟前通 過(guò)成熟刺激物諸如LPS/IFN- γ，而且在靶向DC前體細(xì)胞諸如來(lái)自外周血的單核細(xì)胞，或造 血干細(xì)胞和前體細(xì)胞時(shí)，特別但不排他的是在使用導(dǎo)致穩(wěn)定整合入基因組中的基因轉(zhuǎn)移方 法諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移時(shí)完成從DC免疫藥物遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)T-淋巴細(xì)胞抑 制分子。在暴露于成熟刺激物前進(jìn)行的遺傳工程外，可以在通過(guò)例如LPS/IFN-γ啟動(dòng)成熟 后6小時(shí)和多至48小時(shí)完成遺傳工程。在未成熟的DC被工程化改造成過(guò)表達(dá)免疫抑制分 子時(shí)，暴露于成熟刺激物后長(zhǎng)于24小時(shí)的DC的生理學(xué)T淋巴細(xì)胞抑制活性的重要作用會(huì) 喪失，關(guān)于其原因，我們提出對(duì)DC的遺傳工程化改造僅與這些DC在遺傳工程前(甚至處于 前體細(xì)胞水平)或之后暴露于成熟刺激物諸如LPS/IFN-γ組合。在不對(duì)T淋巴細(xì)胞抑制 性DC免疫藥物進(jìn)行遺傳工程化改造的情況中，此類抑制性DC免疫藥物的應(yīng)用不得不在DC 分化的所述抑制窗期間完成，而遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)介導(dǎo)抑制T淋巴細(xì)胞活性的分子 的T淋巴細(xì)胞抑制性DC免疫藥物容許對(duì)患者的施用有多得多的靈活性。表1:TLR 配體 通過(guò)遺傳工程化改造在遺傳工程前或之后還接受LPS/IFN- γ或類似成熟刺激物 的DC以過(guò)表達(dá)T淋巴細(xì)胞刺激分子和阻止免疫刺激窗關(guān)閉的分子，DC分化會(huì)有可能加寬 DC分化的免疫刺激時(shí)間窗。它被選擇用于通過(guò)使用CD40L基因轉(zhuǎn)移來(lái)證明本發(fā)明的可行 性，因?yàn)樽訢C表達(dá)的⑶40與自活化T淋巴細(xì)胞表達(dá)的⑶40L的相互作用向DC投遞有力的 活化和成熟信號(hào)。優(yōu)選地，在存在IFN-Y (其在DC成熟中是至關(guān)重要的輔因子)的情況中 實(shí)施此類實(shí)驗(yàn)，并且在存在IFN- γ的情況中完成實(shí)施例中報(bào)告的用CD40L轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行 的所有實(shí)驗(yàn)?？梢詫⑴cCD40L基因轉(zhuǎn)移相同的原則應(yīng)用于向DC賦予改善的刺激能力的其它 分子?；蛘撸梢匀缦略O(shè)計(jì)T淋巴細(xì)胞抑制性DC免疫藥物，即敲除分子諸如CD40或IL-12 或類似分子的表達(dá)，或自DC免疫藥物過(guò)表達(dá)賦予T淋巴細(xì)胞抑制的分子。通過(guò)干擾T-淋巴細(xì)胞抑制分子的表達(dá)和/或功能，可以使DC分化的免疫抑制 窗關(guān)閉或者變窄或者移動(dòng)至較晚的時(shí)間點(diǎn)。如下證明此方法的可行性，即敲除干擾DC進(jìn) 行T淋巴細(xì)胞活化的分子的表達(dá)。實(shí)施例部分中顯示了 T淋巴細(xì)胞功能的改善，其通過(guò)敲 除DC衍生的T淋巴細(xì)胞抑制信號(hào)(如例如酶ID0，其將活化的T淋巴細(xì)胞重度依賴的色氨 酸代謝成對(duì)活化T淋巴細(xì)胞具有促凋亡效果的犬尿氨酸)來(lái)實(shí)現(xiàn)。作為第二個(gè)例子，靶向 IL-10 (其被認(rèn)為原型免疫抑制分子，并且它在免疫抑制分化時(shí)間窗期間由DC表達(dá))的表達(dá)。為了敲除靶分子的表達(dá)，優(yōu)選使用RNA干擾，但是其他技術(shù)諸如單鏈單克隆抗體或反義 RNA的胞內(nèi)表達(dá)可以達(dá)到相同的目的?；蛘?，所述分子(例如IDO或IL-10)或類似分子的 過(guò)表達(dá)可以用來(lái)基于早熟的smDC設(shè)計(jì)T淋巴細(xì)胞抑制性DC免疫藥物。實(shí)施例部分中的結(jié) 果(圖9)顯示了，敲除與IL-10和/或IDO具有相當(dāng)表達(dá)動(dòng)力學(xué)的分子的表達(dá)也導(dǎo)致遺傳 工程化改造的DC的T細(xì)胞刺激能力改善。DC的結(jié)構(gòu)和特性需要以考慮DC發(fā)育階段的動(dòng)力學(xué)方式進(jìn)行描述。這些中每個(gè)階 段可以以某些標(biāo)志分子的存在與否來(lái)表征。這還指明，DC的分子特征依賴于此DC分化的 特定階段和引起DC采用某種分化途徑的條件。DC的發(fā)育可塑性還解釋使用所謂半成熟1 型DC(smDCl)(“以釋放白介素12表征的T細(xì)胞活化性樹(shù)突細(xì)胞”)有利的原因。為了啟 動(dòng)從耐受性維持功能向免疫刺激階段的轉(zhuǎn)換，DC需要被暴露于成熟刺激物(樹(shù)突細(xì)胞成熟 劑)。這打開(kāi)免疫刺激時(shí)間窗，在此期間最重要的是，DC釋放IL-12作為對(duì)向DC制備培養(yǎng) 基添加的LPS和IFN-Y或類似試劑的組合的響應(yīng)。IL-12經(jīng)由輔助T淋巴細(xì)胞上的特定受 體起作用，并引起它們呈現(xiàn)Thl表型，從而支持溶細(xì)胞性免疫。為了容許此DC/T淋巴細(xì)胞 相互作用和溶細(xì)胞性免疫的形成，優(yōu)選地，在免疫刺激窗期間的早期時(shí)間點(diǎn)時(shí)將DC接種入 生物體(例如人)中。特別優(yōu)選的是，在成熟刺激物后6小時(shí)注射所述DC。明顯地，接種 與除去含有樹(shù)突細(xì)胞成熟劑(例如刺激分子LPS和IFN-γ)的DC培養(yǎng)物有關(guān)。如下將充 分可持續(xù)的信號(hào)傳送入DC中，即2小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)，更優(yōu)選6小時(shí)暴露于所述成熟劑(例 如LPS和IFN- γ )，從而在所述暴露后，DC不可逆地完成成熟過(guò)程，而且不再依賴于配體，即 DC成熟劑的存在。然而，在形式上，在應(yīng)用的時(shí)候，DC尚沒(méi)有完成其成熟過(guò)程，其花費(fèi)1-2 天。smDCl設(shè)計(jì)最佳地利用啟動(dòng)成熟后和免疫抑制時(shí)間窗打開(kāi)并開(kāi)始下調(diào)免疫響應(yīng)前的前 24小時(shí)期間的免疫刺激時(shí)間窗。在暴露于成熟刺激物諸如LPS/IFN- γ后的早期階段，DC擁有強(qiáng)烈的免疫活化特 性(活化窗，圖1)，而在其發(fā)育的較遲階段，它們進(jìn)入免疫抑制階段(抑制窗，圖1)。T細(xì)胞 活化的分子機(jī)制是充分研究和了解的。啟動(dòng)負(fù)調(diào)節(jié)反饋環(huán)的事件的分子性質(zhì)被研究得少得 多。如此，依照本發(fā)明的DC免疫藥物的設(shè)計(jì)目的在于加寬免疫刺激窗以增強(qiáng)免疫活化，并 按比例縮減或關(guān)閉免疫抑制窗，如此在DC中阻斷負(fù)調(diào)節(jié)反饋環(huán)。這是通過(guò)如下遺傳工程化 改造DC實(shí)現(xiàn)的，即在遺傳工程前或之后將它們暴露于DC成熟劑(諸如LPS/IFN- γ )外過(guò) 表達(dá)免疫刺激基因，或者使用RNA干擾來(lái)敲除免疫抑制基因?？梢宰裱嗤幕驹瓌t來(lái) 調(diào)節(jié)眾多免疫刺激或免疫抑制基因的表達(dá)。在實(shí)施例部分中顯示了此辦法的可行性，其通 過(guò)過(guò)表達(dá)免疫刺激性CD40L分子或者通過(guò)敲除免疫抑制性分子IL-10和IDO來(lái)進(jìn)行。過(guò)表 達(dá)和敲除的組合能增強(qiáng)DC免疫藥物的潛力，但是遵循相同的基本邏輯?？梢耘cT淋巴細(xì)胞 刺激性DC免疫藥物類似地設(shè)計(jì)用于治療免疫系統(tǒng)的病理學(xué)反應(yīng)過(guò)度的T淋巴細(xì)胞抑制性 DC免疫藥物，其如下實(shí)現(xiàn)，即遺傳工程化改造最初暴露于成熟刺激物(諸如LPS/IFN-γ)的 DC,將所得smDC遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)免疫抑制性分子和/或在DC中敲除免疫刺激分 子。依照基于本發(fā)明中所描述的遺傳工程得到的新型T淋巴細(xì)胞刺激性或抑制性DC 免疫藥物，如下操作部分成熟的smDC，即將編碼至少一種免疫刺激性或免疫抑制性分子的 核酸分子和/或用以抑制或阻止至少一種免疫抑制性或免疫刺激分子表達(dá)的核酸分子，優(yōu) 選核糖核酸分子(例如siRNA)導(dǎo)入所述DC中。
可以通過(guò)多種方法來(lái)影響或誘導(dǎo)免疫刺激性以及免疫抑制性分子在DC中的表 達(dá)，由此優(yōu)選的是，通過(guò)導(dǎo)入核酸分子來(lái)調(diào)控所述表達(dá)，如上文所概述的。例如，可以用慢病 毒基因轉(zhuǎn)移載體以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)核酸分子轉(zhuǎn)移。然而，相同的原則在采用其它 病毒載體諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒，或非病毒載體諸如基因槍或聚陽(yáng)離子技術(shù)時(shí)或者在采 用任何其它基因轉(zhuǎn)移時(shí)可適用。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)種策略來(lái)將外來(lái)基因?qū)爰?xì)胞中，包括直接注射質(zhì)?；駾NA脂質(zhì)體 復(fù)合物和用經(jīng)修飾的病毒進(jìn)行感染。然而，安全和功效是開(kāi)發(fā)使用此類基因轉(zhuǎn)移方法的治 療方案的重要考慮因素。例如，在一種組織的背景中治療性的蛋白質(zhì)在另一種中可能是有 害的。因而，能限制治療性序列向合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的轉(zhuǎn)錄靶向載體是特別想要的。此 外，在一些情況中，某些蛋白質(zhì)可以有治療窗，從而某些閾值下或上的表達(dá)水平分別可以是 無(wú)效的或毒性的。因此，還會(huì)想要?jiǎng)?chuàng)建構(gòu)建體和設(shè)計(jì)容許外源控制表達(dá)的方法，使得治療性 蛋白質(zhì)的水平可以隨著治療需要而提高或降低。可以使用常規(guī)的基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法來(lái)將編碼各自分子的核 酸或者，備選地，抑制所述分子轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸(諸如siRNA或反義RNA)導(dǎo)入本 發(fā)明的DC中。非病毒載體投遞系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸核酸、和與投遞載體諸如脂質(zhì) 體復(fù)合的核酸。病毒載體投遞系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，它們?cè)谕哆f至細(xì)胞后具有 附加型或整合的基因組。關(guān)于基因投遞規(guī)程的綜述，參見(jiàn)Anderson，Science 256 808-813(1992) ；Nabel 和 Feigner, TIBTECH 11 211-217(1993) ；Mitani 和 Caskey， TIBTECH 11 162-166(1993) ；Dillon, TIBTECH 11 :167_175(1993) ；Miller, Nature 357 455-460(1992) ；VanBrunt, Biotechnology 6(10) 1149-1154(1988) ；Vigne, Restorative Neurologyand Neuroscience 8:35-36(1995) ；Kremer 禾口 Perricaudet, British Medical Bulletin51 (1) 31-44(1995) ；Haddada 等，ψ Current Topics in Microbiology andlmmunology Doerfler and Bohm(編)(1995)；及Yu等，Gene Therapy 1 :13_26 (1994)。也可以使用小干擾RNA分子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，長(zhǎng)dsRNA( > 30nt)的導(dǎo)入常常 啟動(dòng)有力的抗病毒響應(yīng)，其以對(duì)蛋白質(zhì)合成和RNA降解的非特異性抑制所例示。RNA干擾 現(xiàn)象在例如 Bass，Nature 411 :428_29 (2001) ；Elbahir 等，Nature 411 494-98 (2001)；及 Fire等，Nature 391 806-11 (1998)中進(jìn)行描述和討論，其中還討論了制備干擾RNA的方 法。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的siRNA序列小于100個(gè)堿基對(duì)，通常為30bp或更短，并且通過(guò) 本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制備。依照本發(fā)明的例示性siRNA可以具有多至29bp、25bp、22bp、 2 Ibp、20bp、19bp、15bp、IObp、5bp或在其上下或其間的任何整數(shù)。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用于制備未成熟DC的前體獲自皮膚、脾、骨 髓、胸腺、淋巴結(jié)、臍帶血或，最優(yōu)選獲自外周血。依照本發(fā)明的方法中使用的DC可以直 接分離自各自的來(lái)源或者衍生自祖細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種方法。例如，可以通 過(guò)收集抗凝固外周血、造血干細(xì)胞，通過(guò)白細(xì)胞單采血液成分術(shù)、或者通過(guò)制備暗黃覆蓋 層、玫瑰花結(jié)(resetting)、離心、密度梯度離心(例如使用Ficoll (諸如FIC0LLPAQUE)、 PERC0L0(用非可透析聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被的膠體二氧化硅顆粒(15-30nm直徑)、蔗 糖等)、差別溶解細(xì)胞、過(guò)濾等來(lái)分離DC前體和未成熟DC。在某些實(shí)施方案中，可以如下制 備白細(xì)胞群體，諸如例如自受試者收集血液，使其脫纖維蛋白，除去血小板，并使紅細(xì)胞溶 胞?？梢允褂肈C前體、單核細(xì)胞、或髓樣祖細(xì)胞或干細(xì)胞來(lái)區(qū)分iDC。任選地，可以如下自外周血富集單核細(xì)胞，即例如利用其附著至塑料表面的能力，經(jīng)由密度梯度進(jìn)行離心，單克 隆抗體淘選、逆流離心等。若使用通過(guò)依照本發(fā)明的方法可獲得的DC來(lái)治療個(gè)體，則iDC 可以獲自要治療的個(gè)體或者獲自與要治療的個(gè)體HLA匹配的健康個(gè)體?？梢詫C祖先在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和分化。合適的組織培養(yǎng)基包括例如RPMI 1640和DMEM。組織培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有人自身或合并的供體血清但不是任何牛來(lái)源的血清、 氨基酸、維生素、細(xì)胞因子諸如GM-CSF和IL-4或IL-13，或IFN- γ，和二價(jià)陽(yáng)離子以促進(jìn)細(xì) 胞分化。優(yōu)選地，也可以將祖細(xì)胞在無(wú)血清的臨床級(jí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。與樹(shù)突細(xì)胞培養(yǎng)基一 起使用的典型細(xì)胞因子組合包含GM-CSF和IL-4或IL-13，或IFN-γ。為了將成熟刺激物應(yīng)用于DC，使有效量的至少一種DC成熟劑與iDC接觸，所述成 熟刺激劑驅(qū)動(dòng)它們進(jìn)入smDC分化狀態(tài)(遺傳工程前或后或者處于DC前體細(xì)胞諸如單核細(xì) 胞或造血干細(xì)胞或前體細(xì)胞的狀態(tài))，其是本發(fā)明DC免疫藥物的優(yōu)選狀態(tài)。優(yōu)選地，至少 一種DC成熟劑選自下組熱滅活的或福爾馬林處理的卡介苗(BCG)，優(yōu)選BCG的細(xì)胞壁成 分、BCG衍生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大腸桿菌衍生的脂多糖(LPS)、或滅活的革 蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性微生物、咪唑喹啉化合物，優(yōu)選咪唑喹啉-4-胺化合物，特別是4-氨 基-2-乙氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪 唑[4，5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物(參見(jiàn)例如W000/47719)、合成的雙鏈多核糖核苷酸， 優(yōu)選多聚I :C、天然的雙鏈RNA或RNA病毒或RNA片段、或合成的類似物、或包含未甲基化 的CpG基序的合成的或天然的核酸分子。大多數(shù)這些化合物是TLR激動(dòng)劑(參見(jiàn)表1進(jìn)行 比較)。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用LPS作為樹(shù)突細(xì)胞成熟劑。然而，原則上，單獨(dú)地或與 IFN-Y組合地使用任何TLR激動(dòng)劑也是可行的。原則上，也有可能將iDC暴露于供成熟用 的細(xì)胞因子混合物(其通常包括但不限于腫瘤壞死因子α (TNF-a)、IL-l、IL-6、和前列腺 素E6)或該組合的部分。此外，有可能觸發(fā)CD40/CD40L信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這可以是如下完成 的，即使iDC與處于可溶形式或固定化在表面(例如培養(yǎng)皿或納米顆粒)上的重組CD40L 分子或由CD40L域與另一種蛋白質(zhì)組成的融合蛋白質(zhì)諸如IgG-Fc，或者與遺傳工程化改造 成表達(dá)⑶40L的原代細(xì)胞或細(xì)胞系，或者與生理學(xué)上上調(diào)⑶40L表達(dá)的活化T淋巴細(xì)胞接 觸?？梢耘cTLR激動(dòng)劑、炎性細(xì)胞因子任意組合地應(yīng)用⑶40/⑶40L信號(hào)。當(dāng)然，可以依照 本發(fā)明使用至少兩種所述成熟劑的任意組合。優(yōu)選地，在存在IFN-Y的情況中使至少一種 (優(yōu)選至少2、3、5、10種)樹(shù)突細(xì)胞成熟劑與樹(shù)突細(xì)胞接觸。依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，使遺傳工程步驟c)前的iDC與有效量的至 少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸至少2小時(shí)，優(yōu)選至少6小時(shí)，特別是至少12小時(shí)，且最大達(dá) 24小時(shí)。成熟時(shí)間取決于多個(gè)參數(shù)(例如DC成熟劑)。必須選擇使得iDC僅部分成熟為 smDC的接觸時(shí)間和其它參數(shù)，其使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行?？梢栽诒绢I(lǐng)域熟悉的測(cè)定 法諸如流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)中檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志。還可以對(duì)細(xì)胞監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子生成 (例如通過(guò)ELISA，即一種免疫測(cè)定法，或通過(guò)利用寡核苷酸陣列或蛋白質(zhì)陣列)。優(yōu)選地，能夠介導(dǎo)iDC成熟為IL-12釋放smDC的至少一種分子選自在存在IFN- γ 的情況中的LPS，以便為遺傳工程步驟準(zhǔn)備好DC以制備具有改善特征的新型T淋巴細(xì)胞刺 激性或抑制性DC免疫藥物。能夠使DC能維持其免疫刺激性表型(其特征在于例如IL-12 分泌超過(guò)約24小時(shí)的生理學(xué)免疫刺激窗)，如此與smDC相比賦予它們卓越的特征的至少一 種分子是⑶40L，通常但不必需在存在IFN-γ的情況中。本文我們選擇使用基于使smDC能夠人工表達(dá)CD40L (在正常情況下它們并不表達(dá))的辦法，其使用上文所概述的遺傳工程來(lái) 進(jìn)行。然而，不從DC自身而是從輔助原代細(xì)胞或細(xì)胞系，即活化T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD40L，或 者使用可溶性或固定化重組CD40L分子或融合蛋白是可想象的。依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案，干擾介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞抑制活性的DC分子表達(dá)的至少一種分子選自下組白介 素IO(IL-IO)和吲哚胺2，3_加雙氧酶(ID0)。介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞抑制活性的分子還可以選自 實(shí)施例部分的表2和表3中所列的分子，由此在DNA微陣列表達(dá)譜分析(profiling)數(shù)據(jù) 方面顯示兩倍過(guò)表達(dá)的分子是優(yōu)選的，但是顯示六倍或更高過(guò)表達(dá)的分子是特別優(yōu)選的。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，至少一種抗原選自下組a)腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原體；或b)引起變態(tài)反應(yīng)的環(huán)境抗原、免疫應(yīng)答啟動(dòng)所針對(duì)的且引起疾病的自身抗原、或 移植抗原。為了生成基于smDC的具有改善特征的新型T淋巴細(xì)胞刺激性或抑制性DC免疫 藥物(其能夠針對(duì)個(gè)體中的抗原誘導(dǎo)特異性增強(qiáng)型免疫應(yīng)答或增強(qiáng)型免疫抑制)，優(yōu)選地， 用至少一種抗原加載iDC，之后使它們與優(yōu)選的LPS/IFN-γ刺激物接觸以制備smDC，接著 進(jìn)行遺傳工程。抗原加載對(duì)于指示T淋巴細(xì)胞針對(duì)什么抗原(正是它們必須變?yōu)榛钚缘? 或者哪種抗原(正是認(rèn)為它們耐受的)是必需的。供DC裝載的抗原可以衍生自患病組織， 諸如腫瘤抗原或來(lái)自病毒感染細(xì)胞的病毒抗原。它們可以是整個(gè)死的或活的微生物或者死 的或活的原核人或動(dòng)物細(xì)胞，例如人或動(dòng)物腫瘤細(xì)胞或其片段?？乖梢允侵亟M蛋白、或合 成肽、編碼抗原的基于DNA的病毒或非病毒重組表達(dá)載體或者天然的或合成的RNA。或者， 抗原可以是已經(jīng)觸發(fā)免疫功能障礙諸如變態(tài)反應(yīng)的環(huán)境抗原、已經(jīng)引起疾病的生理性自身 免疫應(yīng)答所針對(duì)的自身抗原、或決定器官或干細(xì)胞移植排斥的抗原諸如MHC分子。值得注 意的是，在供針對(duì)異基因移植的耐受性誘導(dǎo)用的T淋巴細(xì)胞抑制性DC免疫藥物的情況中， 加載不可能是必要的，因?yàn)槠鞴倩蚋杉?xì)胞供體DC攜帶與移植物相同的MHC分子。明顯地， 在這些后者的情況中，會(huì)以如下方式設(shè)計(jì)DC免疫藥物，所述方式使其抑制針對(duì)變態(tài)反應(yīng)、 移植抗原、或自身抗原的免疫。為了將抗原投遞至DC，可以使用多種方法，諸如容許DC吞 噬蛋白質(zhì)或肽抗原的被動(dòng)暴露，抗原性蛋白質(zhì)復(fù)合物、表達(dá)抗原或抗原性肽的細(xì)胞或細(xì)胞 膜、腫瘤細(xì)胞胞外體(texosome)、含有抗原或抗原性肽的脂質(zhì)體、編碼抗原或抗原性肽的核 酸(可能整合在質(zhì)?；虿《据d體中)、或來(lái)自腫瘤細(xì)胞的總RNA。這些方法已經(jīng)披露于例如 W099/03499中。此類載體可以是病毒或非病毒起源的或者可以是納米顆粒?？乖梢阅[ 瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原等，更一般地，尋求的免疫應(yīng)答或反應(yīng)所針對(duì)的任何肽或多肽。 在這方面，可以依照本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)使DC對(duì)一種或數(shù)種抗原致敏。術(shù)語(yǔ)“致敏” 指明抗原或其部分被暴露在DC (優(yōu)選與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的分子復(fù)合)的表面 上。原則上，可以在沒(méi)有用抗原進(jìn)行在先加載的情況中將DC接種入患者中，并且實(shí)現(xiàn)體內(nèi) 攝取抗原，例如通過(guò)直接注射入腫瘤中或進(jìn)入其周圍中，進(jìn)入轉(zhuǎn)移中，或者進(jìn)入引流淋巴系 統(tǒng)(包括淋巴結(jié)和一級(jí)和/或二級(jí)淋巴組織)中。實(shí)質(zhì)上，僅抗原的存在及其向T淋巴細(xì)胞 的呈遞決定DC免疫藥物，而不是抗原到達(dá)DC的方式。DC加載技術(shù)的綜述參見(jiàn)RM Steinman 和JBanchereau (Nature，卷449/2007年9月27日，第419頁(yè)-第426頁(yè))及其中的參考文 獻(xiàn)?？梢栽诙喾N免疫學(xué)功能障礙中使用本發(fā)明的抗原加載的且經(jīng)過(guò)遺傳改造的DC來(lái)
14治療性調(diào)控免疫應(yīng)答，這取決于向所述細(xì)胞中加載的抗原以及DC所處的生理學(xué)功能狀態(tài)， 其通過(guò)使用多種信號(hào)傳導(dǎo)分子諸如DC成熟劑，或通過(guò)對(duì)DC進(jìn)行遺傳功能化改造來(lái)實(shí)現(xiàn)。此 類功能障礙可以包括但不限于癌癥，其可以描述為免疫系統(tǒng)不能排斥經(jīng)轉(zhuǎn)化的和突變的細(xì) 胞；傳染病，例如在嚴(yán)重和在其它方面不可治療的微生物感染的語(yǔ)境中或者在免疫受損的 個(gè)體中，特別在器官或干細(xì)胞移植過(guò)程中?？梢杂纱祟怐C免疫藥物治療的其它免疫功能障 礙可以源自于免疫學(xué)活性過(guò)強(qiáng)(例如針對(duì)環(huán)境抗原)，導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)，或者在免疫系統(tǒng)攻擊 其宿主的情況中，引起自身免疫性疾病。最后，可以基于本發(fā)明的方法來(lái)設(shè)計(jì)DC免疫藥物， 其干擾器官或干細(xì)胞/前體細(xì)胞移植物(包括通過(guò)遺傳工程化改造其它細(xì)胞所生成的誘導(dǎo) 祖細(xì)胞(iPS))的排斥，如此促進(jìn)其宿主對(duì)移植物的接受。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案，至少一種抗原選自下組腫瘤抗原、病毒抗原、和細(xì)菌抗原?？梢杂脗€(gè)體中應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)、抑 制、或預(yù)防的免疫應(yīng)答所針對(duì)的任何抗原加載依照本發(fā)明的經(jīng)過(guò)遺傳工程化改造的DC。特 別優(yōu)選腫瘤抗原?？梢匀缦卤２匾勒毡景l(fā)明的具有改善的T淋巴細(xì)胞刺激性或抑制能力的新型遺 傳工程化改造DC免疫藥物，例如在對(duì)患者施用前在成熟為iDC前，部分成熟為smDC后， 遺傳工程化改造為改善的DC前或后進(jìn)行深低溫保藏?？梢允褂玫纳畹蜏乇２貏┌ǖ?限于二甲亞砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、清蛋白、右旋糖苷、蔗糖、乙二醇、 i-赤藻糖醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化膽堿、氨基酸、甲 醇、乙酰胺、甘油單乙酸酯和無(wú)機(jī)鹽。本發(fā)明的別的方面涉及一種藥物組合物，其包含依照本發(fā)明的具有改善的T淋巴 細(xì)胞刺激或抑制能力的新型遺傳工程化改造DC免疫藥物。可以使用熟練技術(shù)人員公知的 方法和組成來(lái)將本發(fā)明的DC與生理學(xué)可接受載體、賦形劑、緩沖劑、和/或稀釋劑一起配 制?？梢灾苯訉?duì)需要免疫調(diào)控的受試者施用具有改善的T淋巴細(xì)胞刺激或抑制能力 的新型遺傳工程化改造DC免疫藥物。典型地，將約IO2至約IOltl個(gè)細(xì)胞在生理學(xué)可接受載 體中懸浮。若治療患有癌癥的個(gè)體，優(yōu)選地，將細(xì)胞注射入沒(méi)有疾病的淋巴結(jié)中，優(yōu)選地，進(jìn) 入腹股溝區(qū)中，但是任何沒(méi)有腫瘤或攜帶腫瘤(轉(zhuǎn)移性)的淋巴結(jié)會(huì)達(dá)到該目的，直接進(jìn)入 腫瘤中或者進(jìn)入與腫瘤或腫瘤床接近、鄰近、或循環(huán)或淋巴接觸的區(qū)域中，或者進(jìn)入轉(zhuǎn)移性 疾病中。可以將DC免疫藥物皮下或真皮內(nèi)應(yīng)用于皮膚中以容許遷移入淋巴結(jié)中。原則上， 還有可能將DC免疫藥物注射入血流中，作為單一注射或者作為在較長(zhǎng)的一段時(shí)間里的輸 注，進(jìn)入外周血中或者經(jīng)由導(dǎo)管進(jìn)入供給患病器官或身體區(qū)域的血管(動(dòng)脈或靜脈)，或門 靜脈或肺靜脈或動(dòng)脈等中?？梢允褂萌缦碌闹踩脶尫叛b置，其將DC藥物的連續(xù)流投遞入腫 瘤或轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)、血流、或皮膚中。可以通過(guò)適合于施用配方和模式的任何手段來(lái)施用本發(fā)明的具有改善的T淋巴 細(xì)胞刺激或抑制能力的新型遺傳工程化改造DC免疫藥物。例如，可以將細(xì)胞與藥學(xué)可接受 載體組合，并用注射器、導(dǎo)管、插管等來(lái)施用。如上述的，可以在緩慢釋放基質(zhì)中配制細(xì)胞。 在以此方式施用時(shí)，可以通過(guò)適合于所使用的基質(zhì)的手段來(lái)施用配制劑。對(duì)本發(fā)明可適用 的其它施用方法和模式是熟練技術(shù)人員公知的?？梢栽谥委焸€(gè)體中單獨(dú)使用本發(fā)明的組合物，或者可以與任何其它用于治療腫瘤 的方法組合地使用該組合物。例如，在放射療法和/或化學(xué)療法(細(xì)胞毒性藥物、凋亡劑、抗體等)；冷凍療法；近程放射治療；其它形式的免疫療法(離體擴(kuò)充的腫瘤抗原特異性T 淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子、腫瘤抗原特異性抗體、或靶向?qū)δ[瘤細(xì)胞存活至 關(guān)重要的腫瘤組織的結(jié)構(gòu)諸如血管等)；使用病毒或非病毒載體進(jìn)行的基因療法等之前、 同時(shí)、或之后與腫瘤的手術(shù)切割術(shù)組合使用本發(fā)明的方法。此外，本發(fā)明的DC免疫藥物可 以與另一種藥劑共施用，所述藥劑充當(dāng)佐劑來(lái)使樹(shù)突細(xì)胞成熟和/或加工腫瘤或腫瘤附近 或鄰近區(qū)域內(nèi)的抗原。還可以以任意組合使用任何和所有這些方法。聯(lián)合治療可以是同時(shí) 的或序貫的，而且可以以任何次序施用，如由治療醫(yī)生所確定的。本發(fā)明的另一方面涉及使用依照本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)制備藥物以治療和/或預(yù) 防癌癥和/或微生物或寄生物感染；或者以治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、或 干細(xì)胞或器官移植排斥。優(yōu)選地，可以在癌癥預(yù)防和/或癌癥治療中采用依照本發(fā)明的部 分成熟的樹(shù)突細(xì)胞。在此類情況中，用至少一種腫瘤抗原加載樹(shù)突細(xì)胞。例如，但不限于， 可以將細(xì)胞直接施用入腫瘤中，手術(shù)除去或切除腫瘤后以腫瘤旁進(jìn)入腫瘤床中，進(jìn)入與腫 瘤直接接觸的引流淋巴結(jié)中，進(jìn)入引起或喂養(yǎng)腫瘤或受腫瘤所累的器官的血管或淋巴導(dǎo)管 (例如門靜脈或肺靜脈或動(dòng)脈等)中?？梢栽谀[瘤的其它治療諸如化學(xué)療法或放射療法同時(shí)或之后應(yīng)用本發(fā)明的部分 成熟的樹(shù)突細(xì)胞的施用。此外，本發(fā)明的部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞可以與另一種藥劑共施用，所 述藥劑充當(dāng)佐劑來(lái)使樹(shù)突細(xì)胞成熟和/或加工腫瘤或腫瘤附近或鄰近區(qū)域內(nèi)的抗原。還可 以以任意組合使用任何和所有這些方法。聯(lián)合治療可以是同時(shí)的或序貫的，而且可以以任 何次序施用，如由治療醫(yī)生所確定的。另外，還可以將樹(shù)突細(xì)胞配制或混合入緩慢釋放基質(zhì) 中以植入腫瘤或腫瘤床中或周圍的區(qū)域中，使得細(xì)胞被緩慢釋放入腫瘤或腫瘤床中，以便 與腫瘤抗原接觸。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在放射療法和/或抗腫瘤或抗微生物化學(xué)療 法、或目的在于治療變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、或干細(xì)胞或器官移植排斥的任何療法前、 同時(shí)、或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物?？梢耘c其它癌癥療法組合采用依照本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞 以便實(shí)現(xiàn)甚至更有益的效果。本發(fā)明的另一方面涉及依照本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞用于制備藥物的用途，所述藥物用 于治療和/或預(yù)防由免疫系統(tǒng)針對(duì)環(huán)境抗原(諸如變態(tài)反應(yīng))，或針對(duì)自身免疫性疾病過(guò)程 中的自身抗原的生理性反應(yīng)過(guò)度引起的免疫學(xué)疾病。優(yōu)選地，在目的在于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性疾病的其它藥征前、同時(shí)、 或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物。本發(fā)明的別的方面涉及依照本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞用于制備藥物的用途，所述藥物用 于治療和/或預(yù)防異基因干細(xì)胞移植的免疫學(xué)排斥(優(yōu)選地，在治療血液學(xué)惡性腫瘤中使 用)，或者用于治療和/或預(yù)防異基因器官移植的排斥。優(yōu)選地，在目的在于治療或預(yù)防異基因干細(xì)胞或器官移植排斥的其它藥征 (modality)前、同時(shí)、或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物。本發(fā)明通過(guò)以下各圖和實(shí)施例進(jìn)一步例示，然而，不限于此。圖1在DC分化過(guò)程的動(dòng)力學(xué)圖示中顯示了 DC的發(fā)育可塑性。圖2顯示了 smDCl基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的質(zhì)量對(duì)照。圖3顯示了⑶40L基因轉(zhuǎn)移的結(jié)果。
圖4顯示了 IL-12和IL-10分泌的數(shù)量和質(zhì)量。圖5顯示了溶細(xì)胞活性的潛力(正方形，⑶40L轉(zhuǎn)基因DC ；菱形，GFP轉(zhuǎn)基因DC ； 三角形，對(duì)照DC)。圖6顯示了敲除IL-10表達(dá)的LPS活化DC的免疫刺激能力。圖7顯示了具有沉默的IDO表達(dá)的LPS活化DC的免疫刺激能力。圖8顯示了 DC表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。圖9a顯示了使用RNA干擾敲除DC中在表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)中鑒定的靶分子的表達(dá)后 的增殖響應(yīng)改善的例子。圖9b顯示了如下基因的別的例子，所述基因在用siRNA敲除其在 DC中的表達(dá)后導(dǎo)致此類經(jīng)遺傳工程化改造的DC對(duì)異基因淋巴細(xì)胞的刺激能力改善，如與 對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的DC相比所指明的，如所標(biāo)示的。實(shí)施例通過(guò)遺傳工程制備T淋巴細(xì)胞刺激性或抑制性DC免疫藥物的方法。白細(xì)胞單采血液成分術(shù)使用Amicus白細(xì)胞單采血液成分術(shù)裝置(Baxter，Deerfield, IL)從健康志愿者 和在得到負(fù)責(zé)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的臨床試驗(yàn)背景中治療的患有各種瘤形成的患者收 集白細(xì)胞。依照世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(World Medical Association)赫爾辛基宣言，所有個(gè)體均 對(duì)這些研究給予他們的知情同意。在Sysmex細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Sysmex，Bornbarch，德國(guó))上和 /或通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目和子集。單核細(xì)胞富集使用補(bǔ)充有1 %人合并AB血漿(Octaplas, Octapharma, Vienna,奧地利)的 AIM-V(Invitrogen, Carlsbad, CA)或 CellGro 培養(yǎng)基(CellGenix，F(xiàn)reiburg，德國(guó))通過(guò)塑 料粘著來(lái)富集單核細(xì)胞，如先前所描述的。對(duì)于線內(nèi)規(guī)程，我們遵循制造商提供的指令。使 用Elutra細(xì)胞分離器(Gambro BCT，Lakewood，C0)，通過(guò)在維持2400rpm的離心速度時(shí)加載 入淘析室中來(lái)從白細(xì)胞單采血液成分術(shù)產(chǎn)物富集單核細(xì)胞。此后，離心速度和淘析培養(yǎng)基 (PBS/HSA Baxter, NewJersey, NJ)流動(dòng)保持不變以進(jìn)行細(xì)胞分級(jí)。或者，用CliniMACS細(xì)胞 選擇系統(tǒng)(Miltenyi，Bergisch Gladbach，德國(guó))完成對(duì)單核細(xì)胞的選擇，所述CliniMACS 細(xì)胞選擇系統(tǒng)使用經(jīng)CD14包被的磁珠在磁性柱中保留單核細(xì)胞。用于單核細(xì)胞富集的另 一種選項(xiàng)是使用Isolex 300 磁性細(xì)胞選擇器(Nexel 1, Irvine, CA)來(lái)完成T和B淋巴細(xì) 胞的消減以富集單核細(xì)胞。如下在磁性柱中保留淋巴細(xì)胞，即使它們與經(jīng)CD2和CD19包被 的磁珠接觸，并收集流過(guò)液。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)表征所有富集規(guī)程的最終產(chǎn)物。流式細(xì)胞術(shù)使用 Trucount 系統(tǒng)(Becton Dickinson, New Jersey, NJ)分另Ij 通過(guò)用抗 CD45-FITC、抗 CD3-PerCP、抗 CD19-APC、抗 CD14-APC、和抗 CD15_FITC(BD Pharmingen San Diego, CA)標(biāo)記的抗體對(duì)白細(xì)胞單采血液成分術(shù)和單核細(xì)胞富集產(chǎn)物分析總體淋巴細(xì) 胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、和粒細(xì)胞。在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上分析經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞。合適的同種型對(duì)照抗體包括在分析 中。DC 制備以IxlO6個(gè)單核細(xì)胞/cm2的密度在補(bǔ)充有2%合并人AB血漿的AIM-V培養(yǎng)基中或 者在CellGro培養(yǎng)基中于37°C在濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)通過(guò)上文所述的各種富集規(guī)程分離的單核細(xì)胞達(dá)6天。培養(yǎng)基補(bǔ)充有1000U/ml人GM-CSF和300U/ml人IL-4 (均來(lái)自CellGenix， Freiburg，德國(guó))，并在第3天用相同體積的AIM-V/^2% OP或CellGro加上GM-CSF和IL-4 替換。在第 6 天時(shí)如下實(shí)施成熟，即將 50ng/ml IFN- y (Boehringer Ingelheim, Vienna, 奧地利)和脂多糖(LPS，大腸桿菌菌株0111 :B4, Calbiochem, San Diego, CA, USA)(范圍 為1-lOOOng/ml)添加至培養(yǎng)物達(dá)6小時(shí)以生成半成熟(sm)DC，隨后將其冷凍；用臨床級(jí) LPS (US藥典，Bethesda, MD)制備患者的DC疫苗。DC免疫表型分析使用下列抗體來(lái)測(cè)定DC的成熟狀態(tài)抗CD86_APC(BD Pharmingen, SanDiego, CA)、抗 CD80-PE(Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA)、抗 CD83-APC(三種都 來(lái)自 BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗 MHC I-PE、抗 MHC II-FITC(兩者都來(lái)自 Dako 〇7切1118“011，〇8獷？土1^61~土8，。八)、禾口抗〇045- 61^ (80 Pharmingen，San Diego，CA)。通過(guò)鵬 化丙啶染色(Sigma，St. Louis，M0)來(lái)測(cè)量DC的成活力。使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀來(lái) 分析細(xì)胞。合適的同種型對(duì)照抗體包括在分析中。通過(guò)ELISA進(jìn)行的IL-12檢測(cè)如先前所描述的那樣測(cè)量DC培養(yǎng)物的上清液中的IL-12濃度。異基因混合的白細(xì)胞反應(yīng)通過(guò)梯度離心自外周血分離異基因應(yīng)答PBMC。一式三份將刺激性DC(10000個(gè)、 2000個(gè)、或400個(gè))與IO5個(gè)應(yīng)答細(xì)胞在96孔圓底平板上在200 μ 1補(bǔ)充有2%合并人血 漿的AIM-V培養(yǎng)基中放置在一起。對(duì)于陽(yáng)性參照，用lOOng/ml葡萄球菌腸毒素A/B(SEA/ SEB, Toxin Technologies Inc.，Sarasota，F(xiàn)L)刺激 IO5 個(gè)應(yīng)答細(xì)胞。在第 4 天，將共培養(yǎng) 物與1 μ Ci氚胸苷溶液(NEN LifeScience Products,Boston,MA) 一起再溫育18小時(shí)。最 后，用 Skatron(Lier，Norway)收集器收獲細(xì)胞。使用 Trilux 讀板儀(Wallac 0y, Turku, 芬蘭)來(lái)計(jì)算摻入的氚胸苷。或者，用CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR)標(biāo)記異基因 PBMC，并以Ι/δ,Ι/ΚΚΙΛ ΚΙΛΟ、和1/80的比率與DC混合。對(duì)于對(duì)照，沒(méi)有添加DC或SEA/ SEB0最后，用抗⑶3-PerCP標(biāo)記PBMC，并使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀來(lái)分析。測(cè)定⑶3 陽(yáng)性CFSE陰性T淋巴細(xì)胞的百分比。向smDC中進(jìn)行慢病毒基因轉(zhuǎn)移使用ViraPower 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(來(lái)自Invitrogen)，通過(guò)與編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白、 聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的PLP質(zhì)粒(pLP/VSVG、pLP-1、pLP-2)和含有GFP或⑶40L的質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 染293FT生產(chǎn)細(xì)胞系來(lái)生成慢病毒顆粒。共轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收獲所有上清液，并通過(guò)超離 心濃縮ΙΟΟχ。在上文所概述的條件下培養(yǎng)DC，并使其成熟。分別在啟動(dòng)成熟后48小時(shí)或6 小時(shí)收獲DC。然后用與6μ g/mlPolybrene (來(lái)自Sigma-Aldrich)加上標(biāo)準(zhǔn)濃度的IL-4、 GM-CSFJP IFN-Y組合的慢病毒顆粒(250 μ 1 IOOx濃縮的慢病毒上清液/IxlO6個(gè)DC)轉(zhuǎn) 導(dǎo)早熟的smDC。對(duì)于IL-12質(zhì)量對(duì)照，在24小時(shí)后采集上清液，并在48小時(shí)后遵循標(biāo)準(zhǔn)規(guī) 程來(lái)測(cè)量GFP/⑶40L的表達(dá)。DC中的RNA干擾依照上文所概述的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來(lái)制備DC。在第6天，使用轉(zhuǎn)染試劑(Dharmacon)依照 制造商的指令用IOOpmol基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染IO6個(gè)DC。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，用LPS/IFN-γ 刺激DC達(dá)6小時(shí)。所有應(yīng)用均與上文所概述的方法類似。
結(jié)果目前使用中的DC免疫藥物采用單核細(xì)胞衍生的DC，其加載有任何性質(zhì)的抗原，如 介紹中所概述的，并暴露于具有觸發(fā)IL-12從DC釋放的能力的成熟刺激物。以IL-12分泌 表征的DC表型具有誘導(dǎo)支持溶細(xì)胞免疫的1型免疫系統(tǒng)極化的能力。這暗示刺激性DC免 疫藥物需要在IL-12分泌的時(shí)間窗期間應(yīng)用于患者以容許抗原在存在IL-12的情況中從DC 呈遞至T淋巴細(xì)胞(圖1)。具有改善的T淋巴細(xì)胞刺激或抑制能力的新型遺傳工程化改 造DC免疫藥物克服此限制，因?yàn)閷?duì)DC的遺傳操作容許免疫刺激窗保持開(kāi)放達(dá)較長(zhǎng)的時(shí)間 期限。在以下實(shí)施例中，已經(jīng)制備和研究經(jīng)遺傳工程化改造的DC免疫藥物。使用慢病毒 基因轉(zhuǎn)基因或基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染來(lái)將DNA或RNA投遞入DC中，但是可以假設(shè)，任何核酸投 遞技術(shù)可以在所述能力中起作用。作為免疫刺激基因在DC免疫藥物中過(guò)表達(dá)的例子，使用 慢病毒基因轉(zhuǎn)移來(lái)工程化改造DC以表達(dá)⑶40L分子。功能研究確認(rèn)，此類工程化改造DC 免疫藥物具有增強(qiáng)的刺激免疫應(yīng)答的潛力。此外，證明了敲除免疫抑制性分子IL-10和IDO 也增強(qiáng)刺激能力，其通過(guò)用設(shè)計(jì)用于RNA干擾IL-10和IDO的siRNA分子工程化改造DC來(lái) 實(shí)現(xiàn)。為了鑒定牽涉免疫抑制反饋環(huán)的別的DC分子，使用DNA微陣列進(jìn)行全基因組DNA表 達(dá)譜分析?；跒榕cIL-10或IDO的基因表達(dá)譜具有類似表達(dá)譜的基因分組的簇分析，發(fā) 現(xiàn)基因列表具有負(fù)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的潛力。如此，在DC免疫藥物中敲除這些基因會(huì)改善其免 疫刺激能力。因此，為了容許對(duì)規(guī)定的免疫系統(tǒng)成分進(jìn)行特定調(diào)控而遺傳工程化改造的DC 免疫藥物實(shí)現(xiàn)相關(guān)免疫系統(tǒng)功能障礙的治療。最后，顯示了使用RNA干擾敲除DC表達(dá)譜分 析實(shí)驗(yàn)中以與IL-10或IDO類似的動(dòng)力學(xué)表達(dá)的靶基因的功能后果的例子。在與異基因T 淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)物中，觀察到此類經(jīng)遺傳工程化改造的DC觸發(fā)增殖的能力改善，指明增 強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞刺激。圖2顯示了用于遺傳工程的smDCl基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的質(zhì)量對(duì)照。DC免疫藥物必須滿足 規(guī)定的質(zhì)量對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。小圖A顯示了自外周血單核細(xì)胞制備的DC的純度、成活力、和產(chǎn)量。 通過(guò)白細(xì)胞單采血液成分術(shù)來(lái)收集此類單核細(xì)胞，并通過(guò)逆流離心(淘析)來(lái)富集單核細(xì) 胞。在存在IL-4和GM-CSF的情況中，單核細(xì)胞在6天內(nèi)在體外分化成iDC。用抗原加載 iDC，隨后暴露于由LPS和IFN-γ組成的成熟刺激物達(dá)6小時(shí)，并將其冷凍。在此階段。它 們稱作半成熟的，因?yàn)殡m然它們不可逆地繼續(xù)其成熟，但是它們尚未顯示mDC的典型表型 和功能特征。最重要地，在所述階段(免疫刺激窗，啟動(dòng)成熟后約0-24小時(shí)，圖1)，DC觸 發(fā)成熟，反之在較晚的階段(免疫抑制窗，啟動(dòng)成熟后約24-48小時(shí)，圖1)。然而，在臨床 應(yīng)用中，在此分化階段將它們注射入患者中，在那里它們完成其成熟，并觸發(fā)免疫應(yīng)答(24 小時(shí)前)，但是隨后(在約24小時(shí)時(shí))也進(jìn)入_依照其由成熟刺激物觸發(fā)的生理學(xué)發(fā)育程 序_免疫抑制階段(我們旨在通過(guò)遺傳工程化改造DC免疫藥物來(lái)阻止)。對(duì)于質(zhì)量對(duì)照，將一等分試樣的DC免疫藥物融化，并再培養(yǎng)2天以便讓DC完成其 成熟過(guò)程。這兩天期間，它們分泌細(xì)胞因子，最重要的是IL-12(成熟后早期)和IL-10(成 熟后晚期)(小圖B ；顯示了來(lái)自三個(gè)個(gè)體的均值士SEM)。還有，它們顯示了至關(guān)重要的DC 膜分子的表達(dá)樣式的變化(小圖C)。最后，通過(guò)以指定的比率與經(jīng)CFSE標(biāo)記的異基因PBMC 共培養(yǎng)(其觸發(fā)與CFSE的稀釋度和熒光降低有關(guān)的細(xì)胞分裂)來(lái)對(duì)DC進(jìn)行alIoMLR潛力 測(cè)試(小圖D)。柱形圖顯示了來(lái)自三個(gè)個(gè)體的增殖細(xì)胞的均值士SEM百分比。
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初始刺激物對(duì)于啟動(dòng)免疫抑制反饋環(huán)也是必要的。一般而言，響應(yīng)特定刺激物的 活化越強(qiáng)，反饋信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)越強(qiáng)，以便將免疫活化下調(diào)至其基線水平，由此阻止免疫應(yīng)答失 去控制和引起自身免疫性疾病。如此，發(fā)現(xiàn)成熟刺激物L(fēng)PS/IFN-γ導(dǎo)致最高量的IL-12釋 放，而且導(dǎo)致最高量的IL-10釋放。表2 供癌癥接種用的smDCl的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的規(guī)格 經(jīng)由過(guò)表達(dá)⑶40L分子增強(qiáng)的刺激性DC免疫藥物的描述。為了加寬以分泌IL-12表征的DC的免疫刺激窗(圖1)，將DC遺傳工程化改造成 過(guò)表達(dá)⑶40L。此分子通常自活化T淋巴細(xì)胞表達(dá)，并與DC上的⑶40相互作用，將至關(guān)重 要的活化信號(hào)傳送入DC中。將此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為將活化分子轉(zhuǎn)移入DC免疫藥物中的一個(gè)例子。 然而，原則上，可以對(duì)其它刺激分子使用相同的規(guī)程或者，為了設(shè)計(jì)抑制性DC免疫藥物，可 以自DC過(guò)表達(dá)免疫抑制性分子。具體地，⑶40L基因轉(zhuǎn)移入DC中的基本原理是(i)容許DC變?yōu)榕c活化T淋巴細(xì)胞無(wú)關(guān)以將⑶40L信號(hào)投遞至DC ；(ii)在本實(shí)驗(yàn)中假設(shè)并發(fā)現(xiàn)，由于在DC自身上通過(guò)從組成性活性啟動(dòng)子的表達(dá) 實(shí)現(xiàn)⑶40L的連續(xù)存在，使DC能夠分泌IL-12達(dá)如下的時(shí)間期限，其比在DC受到常規(guī)成熟 刺激物諸如LPS/IFN-γ時(shí)長(zhǎng)得多；(iii)與單獨(dú)的LPS/IFN- γ或CD40L/IFN- γ刺激物相比自DC分泌的IL-12總量 是高得相當(dāng)多，并且IL-12分泌的動(dòng)力學(xué)在性質(zhì)上已經(jīng)有所不同，在應(yīng)用刺激物后更早開(kāi) 始，如此加寬DC分化的免疫刺激窗；(iv)暴露于LPS/IFN-γ后甚至48小時(shí)，此時(shí)DC已經(jīng)耗盡其分泌IL-12的能力， ⑶40L基因轉(zhuǎn)移使DC能夠開(kāi)始IL-12分泌的第二階段(圖3)。
圖3顯示了⑶40L基因轉(zhuǎn)移。在小圖A中，顯示了慢病毒基因轉(zhuǎn)移后在6小時(shí)smDC 和48小時(shí)mDC中的GFP或⑶40L表達(dá)。將早熟的DC暴露于慢病毒載體后48小時(shí)完成本 文顯示的所有實(shí)驗(yàn)。與iDC、暴露于單獨(dú)的LPS/IFN- γ的DC、或經(jīng)GFP工程化改造的6小 時(shí)smDC和48小時(shí)mDC相比自DC表達(dá)CD40L引起IL-12的分泌增強(qiáng)(小圖B)。GFP基因轉(zhuǎn) 移后增強(qiáng)的IL-12釋放可能是由病毒雙鏈RNA引起的，所述病毒雙鏈RNA經(jīng)由6小時(shí)smDC 中但不再在48小時(shí)LPS/IFN-YmDC中表達(dá)的TLR(參見(jiàn)表1)發(fā)信號(hào)。通過(guò)向DC(黑色直 方圖，未成熟的DC ；白色直方圖，mDC)中進(jìn)行慢病毒基因轉(zhuǎn)移沒(méi)有改變功能上重要的DC膜 分子的表達(dá)譜(小圖C)。細(xì)胞因子IL-12和IL-10的分泌在暴露于LPS/IFN-γ、⑶40L/IFN-Y、或兩者的組 合的DC中在質(zhì)量和數(shù)量方面有所不同(圖4)。與單獨(dú)的CD40L/IFN-Y刺激物相比，IL-12 的分泌在應(yīng)用組合刺激物時(shí)高幾乎兩倍，而且與單獨(dú)的LPS/IFN-γ刺激物相比也是高得 相當(dāng)多的。另外，來(lái)自暴露于LPS/IFN-γ/⑶40L組合刺激物的DC的IL-12分泌在12小時(shí) 后已經(jīng)明顯地以相當(dāng)大的量可檢出，而LPS/IFN-γ和⑶40L/IFN-Y僅在暴露于初始成熟 信號(hào)后12和24小時(shí)之間觸發(fā)生物學(xué)相關(guān)水平的IL-12分泌。這種觀察與加寬DC分化的 免疫刺激窗以便改善DC免疫藥物的刺激能力的本發(fā)明目的一致。IL-10的最大限度表達(dá)在 DC暴露于LPS/IFN- γ /⑶40L或單獨(dú)的⑶40L/IFN- γ時(shí)是相似的，但是在僅對(duì)DC成熟使用 LPS/IFN- γ時(shí)較低。然而，免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10在⑶40L/IFN-Y信號(hào)傳導(dǎo)后12小 時(shí)后已經(jīng)以生物學(xué)相關(guān)水平可檢測(cè)，而組合刺激物L(fēng)PS/IFN- γ /⑶40L顯示與那些僅LPS/ IFN-y成熟的DC的動(dòng)力學(xué)類似的動(dòng)力學(xué)。CD40L/IFN-Y刺激后的IL-10早期釋放負(fù)干擾 DC分化的免疫刺激窗，并且應(yīng)當(dāng)(在設(shè)計(jì)免疫刺激性DC藥物的情況中)避免。推斷與應(yīng)用 單獨(dú)的LPS/IFN- γ或CD40L/IFN- γ相比，組合刺激物L(fēng)PS/IFN- y /CD40L的免疫刺激能力 與免疫抑制能力間平衡的凈效果(考慮IL-12和IL-10的分泌樣式)明顯朝向改善的免疫 刺激能力。與較早的出版物形成對(duì)照，本文所使用的DC會(huì)接受成熟刺激物的組合。在生理 學(xué)上，DC能活化T淋巴細(xì)胞的階段(以IL-12分泌表征)和DC會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞活性的 第二階段(以IL-10分泌和由酶IDO活性引起的色氨酸消減表征)會(huì)通過(guò)使iDC與足夠的 成熟刺激物諸如LPS/IFN- γ接觸來(lái)觸發(fā)(圖1)。本文證明了初始暴露于LPS/IFN- γ (或 者在存在IFN- γ的情況中的另一種TLR激動(dòng)劑)，接著將DC遺傳工程化改造成過(guò)表達(dá)諸如 ⑶40L等分子維持能夠T淋巴細(xì)胞活化的DC表型，并阻止DC呈現(xiàn)抑制表型(圖4)。IL-12 的分泌在存在IFN- γ的情況中經(jīng)由TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的初始成熟后6小時(shí)或48小時(shí) 完成遺傳工程時(shí)維持得長(zhǎng)于20-24小時(shí)的生理學(xué)時(shí)間窗。圖4顯示了 IL-12和IL-10分泌的數(shù)量和質(zhì)量。在存在IFN- γ的情況中將DC暴 露于指定的成熟刺激物。在指定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量IL-12和IL-10在培養(yǎng)物上清液中的濃度。在遺傳工程化改造T淋巴細(xì)胞刺激性DC免疫藥物的本設(shè)計(jì)中特別重要的是IL-12 分泌DC具有經(jīng)由1型免疫應(yīng)答極化觸發(fā)溶細(xì)胞免疫的能力。如此，通過(guò)分析粒酶B在CD8 陽(yáng)性CTL中的含量來(lái)進(jìn)一步調(diào)查暴露于CD40L轉(zhuǎn)基因DC的T淋巴細(xì)胞觸發(fā)溶細(xì)胞免疫應(yīng) 答的潛力(圖5)。確實(shí)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照GFP轉(zhuǎn)基因DC或未轉(zhuǎn)導(dǎo)mDC相比，CTL與⑶40L轉(zhuǎn)基 因DC的共培養(yǎng)導(dǎo)致粒酶B表達(dá)明顯增強(qiáng)。這是此類CTL的溶細(xì)胞潛力改善的一項(xiàng)強(qiáng)烈指 標(biāo)，如此提供來(lái)自DC免疫藥物的CD40L表達(dá)具有改善的免疫刺激能力的證據(jù)。圖5顯示了溶細(xì)胞活性的潛力。與GFP轉(zhuǎn)基因DC(菱形)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的mDC(三角形)相比，CTL的總百分比在將PBMC與⑶40L轉(zhuǎn)基因DC(左側(cè)小圖，正方形)共培養(yǎng)時(shí)僅略 微升高。在分析與CD40L轉(zhuǎn)基因DC共培養(yǎng)的CTL中的粒酶B表達(dá)時(shí)，與GFP轉(zhuǎn)基因DC (菱 形)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)mDC(三角形)相比，發(fā)現(xiàn)明顯升高(右側(cè)小圖，正方形)。通過(guò)敲除免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)的工程化改造得到的具有改善的T淋 巴細(xì)胞刺激能力的DC免疫藥物的描述基于其中敲除介導(dǎo)免疫抑制的分子表達(dá)的DC免疫藥物的假設(shè)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)阻斷 DC中的IL-10基因表達(dá)，其通過(guò)使用4種靶物特異性siRNA的集合進(jìn)行RNA干擾來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖 6)。這導(dǎo)致LPS/IFN-γ活化DC中非常一致且可再現(xiàn)的IL-10表達(dá)敲除，與對(duì)照沉默的mDC 相比導(dǎo)致較高的IL-12分泌。此觀察暗示自分泌途徑，其基于自DC分泌的IL-10結(jié)合同一 DC上的IL-10受體，導(dǎo)致下調(diào)的IL-12生成。不同于發(fā)現(xiàn)經(jīng)遺傳工程化改造的與正常的DC 之間沒(méi)有免疫表型差異，如通過(guò)⑶80、⑶86、MHC I類、和II類表達(dá)所評(píng)估的。最重要的是， 在alloMLR中，觀察到與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，為了抑制IL-10分泌以活化T淋巴細(xì)胞而工程化改 造的DC免疫藥物的大得相當(dāng)多的潛力。另外，⑶25+FoxP3+細(xì)胞在⑶4+T細(xì)胞群體(推測(cè)為抑制免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞(Tregs)群體)中的百分比降低，可能是由于LPS/IFN-γ活化的DC中的IL-10沉默。圖6顯示了通過(guò)遺傳工程阻斷IL-10表達(dá)的LPS/IFN- γ活化DC的免疫刺激能力。 用LPS/IFN- γ活化前12小時(shí)，用4種IL-10特異性siRNA的集合或非特異性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn) 染DC。然后用6小時(shí)LPS成熟的DC (mDC)(或是IL-10 (黑色柱形)或是對(duì)照沉默的(白色 柱形))以1 3 = DC T細(xì)胞比率刺激分離的異基因⑶3+T細(xì)胞。使用Trucount系統(tǒng)和 FACS LSRII流式細(xì)胞儀在共培養(yǎng)的第6天分析CD4+、CD8+、(小圖Α)和CD4+CD25+FoxP3+T 細(xì)胞(小圖B)。LPS/IFN- γ活化后48小時(shí)分別通過(guò)流式細(xì)胞儀和ELISA來(lái)測(cè)量免疫表型 以及IL-10和IL-12分泌(小圖C)。免疫表型分析在IL-10沉默的DC(小圖D)或?qū)φ粘?默的DC(小圖E)中比較LPS/IFN-γ活化的DC(白色直方圖)與iDC(黑色直方圖)。為了敲除免疫抑制性酶IDO的表達(dá)而工程化改造的T淋巴細(xì)胞刺激性DC免疫藥 物的描述使用siRNA來(lái)敲除已知的免疫抑制性效應(yīng)分子IDO的表達(dá)(圖7)。為了優(yōu)化siRNA 轉(zhuǎn)染和IDO敲除的效率，首先使用用IFN-Y活化的HeLa細(xì)胞。隨后，在經(jīng)優(yōu)化的條件下轉(zhuǎn) 染DC。在HeLa細(xì)胞和DC兩者中，可以沉默IDO的表達(dá)，如Western印跡實(shí)驗(yàn)中所表明的。 在alloMLR潛力測(cè)定法中使用IDO沉默的DC、用雜混的對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的DC、和iDC作為 刺激物。觀察到與用混雜的siRNA轉(zhuǎn)染的DC或iDC相比IDO沉默的DC的刺激潛力是大得 相當(dāng)多的。這適用于⑶8+CTL以及⑶4+Th細(xì)胞。圖7顯示了具有沉默的IDO表達(dá)的LPS/IFN- γ活化DC的免疫刺激能力。首先， 使用Western印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)證明在HeLa細(xì)胞(小圖A)以及DC(小圖B)中有效的IDO敲除。 為了調(diào)查IDO沉默的DC對(duì)⑶8+CTL(小圖C)和⑶4+Th淋巴紐胞(小圖D)的刺激潛力，將 PBMC與IDO沉默的DC (正方形)、對(duì)照沉默的DC (菱形，sera =序列混雜的)、或iDC (三角 形)共培養(yǎng)。在所有情況中，IDO沉默的DC的刺激能力優(yōu)于對(duì)照。免疫抑制分子使用全基因組DNA微陣列來(lái)產(chǎn)生暴露于成熟刺激物L(fēng)PS/IFN- γ、⑶40L/IFN- γ信 號(hào)傳導(dǎo)、或LPS/IFN- y /CD40L信號(hào)傳導(dǎo)的組合，以及合適的對(duì)照的DC的表達(dá)譜(圖8)。
圖8顯示了 DC表達(dá)譜分析。將DC暴露于指定的成熟刺激物或者維持未成熟。在 指定的時(shí)間點(diǎn)提取RNA，并使用全基因組DNA微陣列來(lái)進(jìn)行表達(dá)譜分析。使用CarmaWeb (基 于全面 R 的微陣列分析，Bioinformatics Graz and theTyrolean Cancer Research Institute，奧地利)來(lái)分析表達(dá)譜分析的結(jié)果。將所有數(shù)據(jù)分成20個(gè)簇，其使用CarmaWeb 軟件平臺(tái)的基本算法，并鑒定含有IDO和IL-IO的簇。在這些簇中的基因與兩種已知免疫 抑制性DC分子具有類似的表達(dá)譜，這得出如下結(jié)論，即它們?cè)贒C的免疫調(diào)節(jié)中具有也是免 疫抑制性的功能(表3和表4)。表3 :ID0表達(dá)簇。依照CarmaWeb算法，所列基因具有的表達(dá)譜類似于IDO(基因 名稱IND0)的表達(dá)譜，提示與IDO功能類似的功能(數(shù)目是相對(duì)于未成熟DC的log，其中底
數(shù)為2)。
6小時(shí)LPS 12 小吋 LPS 24小時(shí)LPS48小時(shí) LPS
IFN- y 對(duì)6 小 CD40LIFN-y CD40LIFN-y CD40LIFN-y
獨(dú)特的ID 名稱時(shí)iDCM 對(duì)12/J、時(shí)iDC M對(duì)24小時(shí)iDC M對(duì)48小對(duì)iDC M
210118_s_atILIA12，571238512，65636311，6254899828246
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-0，00254589
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47069atPRR50
52255—s—atC0L5A30
223503—atDKFZP566N0340
在本DNA微陣列中，還鑒定出在LPS/:
1， 1068798 0， 14466353 -0，03585563 6
0，35803238 0，042725943 -0，00170695 6
0，08784416 -0，30954257 2，9138856 0，001206623
2，099443 0，72832346
0，69854295 1，2584826 2，1449049
2，8572736 3,8997574 1，9246503 3,5991492 0，010989565
3,164012 5，1735163
4， 18631 3,8403585 3,0019956
4，300132 2，944381 5，094549 5，075999 4，3298063
誘導(dǎo)，且牽涉調(diào)節(jié)基因IL-10、TSLP, IND0, IL2RA、CSF-2和CSF-3 (已知它們都具有免疫抑 制效果)的基因。為了鑒定免疫調(diào)節(jié)的潛在的主開(kāi)關(guān)，用Pathway Studio軟件使用Resnet 5 (第1. 2版，2007年1月)(自PubMed和44份開(kāi)架閱覽期刊獲得的哺乳動(dòng)物途徑和分子 相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù))產(chǎn)生那些基因的調(diào)節(jié)物的網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)將來(lái)自差別活化DC的微陣列數(shù)
據(jù)上載至調(diào)節(jié)網(wǎng)離1，然后可以選擇使DC成熟中誘導(dǎo)的潛在主調(diào)節(jié)物
表5:免疫調(diào)節(jié)的主開(kāi)關(guān)。
免疫調(diào)節(jié)Affymetrix 索弓|
STAT6ILlO201332_s_at
LITAFILlO200706_s_at
IL10, INDO, IL2RA,
STATlCSF3232375_at
IRF4IL10, CSF2204562_at
IRFlIL10, I NDO, IL2RA202531_at
IRF2未知203275_at
RELILlO206035_at
NFKBlIL10, IL2RA239876_at
STAT3IL2RA235680_at
RELAIL10, IL2RA209878_s_at
JUNBIL10, CSF2201473_at
CEBPBIL10, CSF3212501_at
TBX21IL10, IL2RA220684_at
JUNCSF2201465_s_at
STAT5BIL2RA205026_at
STAT5AIL2RA, CSF2203010_at
STAT4未知206118_at
ETV6CSF2205585_at
EGRlIL2RA227404 s at
NFATClILlO210162_s_at
CREBlCSF2214513_s_at
JAKlTSLJP，CSF3155261l_a_at
JAK3IL10, TSLP, CSF2227677_at
LYNILlO202626_s_at
MAPKA
PK2IL10201460_at
MAP21IL10, IL2RA, CSF2202670_at
CD274未知223834_at
PDL2ILlO224399_at
PTGR4IL10, IL2RA204896_s_at
ITGAXILlO210184_at
ADORA
2AILlO205013_s_at
SerpinAlILlO202833_s_at
SerpinElCSF2202627_s_at
AREGCSF2205239_at
OSMCSF3, CSF2230170_at
S0CS3未知206359_at
IFNGINDO, IL2RA210354_at
圖9顯示了使用RNA干擾敲除DC中在表達(dá)譜分析中
的增殖響應(yīng)的例子。顯示了，展現(xiàn)出與IL-10、IDO類似的DC表達(dá)動(dòng)力學(xué)，或者屬于免疫調(diào)節(jié)的 主開(kāi)關(guān)簇的基因牽涉負(fù)調(diào)節(jié)免疫抑制反饋環(huán)。設(shè)計(jì)與那些使用RNA干擾敲除IL-10或IDO表 達(dá)的實(shí)驗(yàn)類似的實(shí)驗(yàn)。用對(duì)來(lái)自表3、4、或5的基因特異性的siRNA轉(zhuǎn)染DC。圖9中顯示了基 因 MAPKAPK2、IRF2、PHFlU IRF4、JAKU CEBPB、和 ETV6。通過(guò)用 LPS/IFN-g 暴露 6 小時(shí)來(lái)啟動(dòng)成 熟后，將經(jīng)過(guò)工程化改造的DC與異基因T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)6天。用CFSE(即一種進(jìn)入細(xì)胞、結(jié) 合蛋白質(zhì)，并被保留在細(xì)胞內(nèi)部的熒光染料)標(biāo)記異基因T淋巴細(xì)胞；洗掉過(guò)量的CFSE。隨著 每次細(xì)胞分裂，T淋巴細(xì)胞的熒光強(qiáng)度被平分，這容許在共培養(yǎng)第6天時(shí)評(píng)估T淋巴細(xì)胞增殖。 作為對(duì)照，使用未轉(zhuǎn)染的DC或用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的DC。經(jīng)工程化改造的DC刺激異基因T淋巴 細(xì)胞的能力改善提供關(guān)于siRNA靶向的基因牽涉負(fù)調(diào)節(jié)反饋環(huán)的證據(jù)。此外，這指明與常規(guī)的 免疫治療劑相比，為了敲除此類基因而遺傳工程化改造的DC免疫藥物會(huì)具有改善的治療效果。結(jié)論本發(fā)明提供了如下證據(jù)，即DC免疫藥物的特征可以通過(guò)遺傳工程進(jìn)行調(diào)控。證明 了免疫刺激分子在DC中的過(guò)表達(dá)以及阻斷免疫抑制性分子導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫刺激能力。這 可以獲得作為DC癌癥疫苗或抗感染DC免疫藥物的應(yīng)用，其中給DC加載腫瘤衍生的抗原或 自微生物衍生的抗原，將其暴露于成熟刺激物，并進(jìn)行工程化改造，如所描述的。另外，本文 所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)暗示可以如下設(shè)計(jì)免疫抑制性DC藥物，即敲除免疫刺激分子和過(guò)表達(dá)免疫 抑制性分子。此類抑制性DC免疫藥物可以在變態(tài)反應(yīng)或自身免疫中，而且在移植藥物中具 有應(yīng)用，以便使移植接收者的免疫系統(tǒng)對(duì)所移植的組織變成無(wú)反應(yīng)性(tolerise)。
權(quán)利要求
包含部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞的藥物制劑，其通過(guò)包括下列步驟的方法可獲得a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞或其前體細(xì)胞或部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞，所述部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞如下可獲得，即使未成熟的樹(shù)突細(xì)胞與至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸來(lái)生成部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL 12的能力所定義的，b)操作步驟a)的所述細(xì)胞，特別是步驟a)的釋放IL 12的所述部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)過(guò)表達(dá)能夠使以連續(xù)的IL 12分泌表征的樹(shù)突細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞刺激能力維持至少24小時(shí)，優(yōu)選至少48小時(shí)，且選自CD40L的至少一種免疫分子，其通過(guò)導(dǎo)入編碼所述至少一種分子的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN γ的樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)起作用或自暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN γ的樹(shù)突細(xì)胞釋放，并且選自白介素10(IL 10)和吲哚胺2，3 加雙氧酶(IDO)的至少一種T 淋巴細(xì)胞抑制分子，諸如表3、4和/或5中給出的至少一種基因的表達(dá)，其如下實(shí)現(xiàn)，即敲除編碼所述至少一種T 淋巴細(xì)胞抑制分子的基因或其片段或?qū)胗靡砸种苹蜃柚乖谒鰳?shù)突細(xì)胞內(nèi)有活性或從所述樹(shù)突細(xì)胞投遞至T細(xì)胞的至少一種T 淋巴細(xì)胞抑制分子的表達(dá)的核酸分子，優(yōu)選核糖核酸分子，并c)任選地，添加物質(zhì)來(lái)將樹(shù)突細(xì)胞的前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成樹(shù)突細(xì)胞。
2.依照權(quán)利要求1的制劑，其特征在于所述未成熟樹(shù)突細(xì)胞的前體，特別是單核細(xì)胞 或造血干細(xì)胞，或所述未成熟的樹(shù)突細(xì)胞獲自皮膚、脾、骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、臍帶血、或外周 血。
3.依照權(quán)利要求1或2的制劑，其特征在于所述至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑選自下組 TLR激動(dòng)劑諸如熱滅活的或經(jīng)福爾馬林處理的卡介苗(BCG)，優(yōu)選BCG的細(xì)胞壁成分、BCG衍 生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大腸桿菌衍生的脂多糖(LPS)、或滅活的革蘭氏陽(yáng)性 或革蘭氏陰性微生物、咪唑喹啉化合物，優(yōu)選咪唑喹啉-4-胺化合物，特別是4-氨基-2-乙 氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物，合成的雙鏈多核糖核苷酸，優(yōu)選多聚I:C、天然的雙鏈RNA或 RNA病毒或RNA片段、或合成的類似物、或包含未甲基化的CpG基序的合成的或天然的核酸 分子、細(xì)胞因子組合，優(yōu)選腫瘤壞死因子α (TNF- α )、IL-U IL_6或前列腺素E6、⑶40L，優(yōu) 選重組⑶40L或包含⑶40L域的融合蛋白，或遺傳工程化改造成表達(dá)⑶40L的原代細(xì)胞或 細(xì)胞系，或在生理學(xué)上上調(diào)⑶40L表達(dá)的活化T淋巴細(xì)胞諸如T淋巴細(xì)胞。
4.依照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的制劑，其特征在于在所述操作步驟b)前，使所述未成 熟的樹(shù)突細(xì)胞與所述至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸至少2小時(shí)，優(yōu)選至少4小時(shí)，更優(yōu)選至 少6小時(shí)，特別是至少12小時(shí)，最多24小時(shí)，以便給出部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞。
5.依照權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的制劑，其特征在于所述未成熟的或所述部分成熟的樹(shù) 突細(xì)胞加載有至少一種抗原。
6.依照權(quán)利要求5的制劑，其特征在于所述至少一種抗原選自下組a)腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原體；或b)引起變態(tài)反應(yīng)的環(huán)境抗原、啟動(dòng)的免疫應(yīng)答所針對(duì)的且引起疾病的自身抗原、或移 植抗原。
7.用于生成樹(shù)突細(xì)胞的方法，包括下列步驟a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞，b)使所述未成熟的樹(shù)突細(xì)胞與至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸來(lái)生成部分成熟的樹(shù)突 細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定義的，并c)操作步驟b)的釋放IL-12的所述部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)過(guò)表達(dá)能夠使以連續(xù)的IL-12分泌表征的所述樹(shù)突細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞刺激能力維持至少24小時(shí)，優(yōu)選至少48小時(shí)，且選自⑶40L的至少一種免疫分子，其通過(guò)導(dǎo)入編碼所 述至少一種分子的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)；和/或( )抑制或阻止在暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN-γ的所述樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)起作用或自 暴露于初級(jí)成熟劑諸如LPS/IFN- γ的樹(shù)突細(xì)胞釋放，并且選自白介素10 (IL-10)和吲哚胺 2，3_加雙氧酶(IDO)的至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子，諸如表3、4和/或5中給出的至少 一種基因的表達(dá)，其如下實(shí)現(xiàn)，即敲除表達(dá)所述至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的基因或其 片段或?qū)胗靡砸种苹蜃柚乖谒鰳?shù)突細(xì)胞內(nèi)有活性或從所述樹(shù)突細(xì)胞投遞至T細(xì)胞的 至少一種T-淋巴細(xì)胞抑制分子的表達(dá)的核酸分子，優(yōu)選核糖核酸分子。
8.依照權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述未成熟樹(shù)突細(xì)胞的前體或所述未成熟的樹(shù) 突細(xì)胞或部分成熟的樹(shù)突細(xì)胞獲自皮膚、脾、骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、臍帶血、或外周血。
9.依照權(quán)利要求7或8的方法，其特征在于所述至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑選自下組 TLR激動(dòng)劑諸如熱滅活的或經(jīng)福爾馬林處理的卡介苗(BCG)，優(yōu)選BCG的細(xì)胞壁成分、BCG衍 生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大腸桿菌衍生的脂多糖(LPS)、或滅活的革蘭氏陽(yáng)性 或革蘭氏陰性微生物、咪唑喹啉化合物，優(yōu)選咪唑喹啉-4-胺化合物，特別是4-氨基-2-乙 氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物，合成的雙鏈多核糖核苷酸，優(yōu)選多聚I:C、天然的雙鏈RNA或 RNA病毒或RNA片段、或合成的類似物、或包含未甲基化的CpG基序的合成的或天然的核酸 分子、細(xì)胞因子組合，優(yōu)選腫瘤壞死因子α (TNFa)UL-UIL-B或前列腺素Ε6、⑶40L，優(yōu)選 重組⑶40L或包含⑶40L域的融合蛋白，或遺傳工程化改造成表達(dá)⑶40L的原代細(xì)胞或細(xì) 胞系，或在生理學(xué)上上調(diào)⑶40L表達(dá)的活化T淋巴細(xì)胞諸如T淋巴細(xì)胞。
10.依照權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)的方法，其特征在于在所述操作步驟C)前，使所述未成 熟的樹(shù)突細(xì)胞與所述至少一種樹(shù)突細(xì)胞成熟劑接觸至少2小時(shí)，優(yōu)選至少4小時(shí)，更優(yōu)選至 少6小時(shí)，特別是至少12小時(shí)，最多24小時(shí)。
11.依照權(quán)利要求7至10任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述未成熟的或所述部分成熟的 樹(shù)突細(xì)胞加載有至少一種抗原。
12.依照權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述至少一種抗原選自下組a)腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原體；或b)引起變態(tài)反應(yīng)的環(huán)境抗原、啟動(dòng)的免疫應(yīng)答所針對(duì)的且引起疾病的自身抗原、或移 植抗原。
13.通過(guò)依照權(quán)利要求7至12任一項(xiàng)的方法可獲得的樹(shù)突細(xì)胞。
14.包含依照權(quán)利要求13的樹(shù)突細(xì)胞的藥物組合物。
15.依照權(quán)利要求13的樹(shù)突細(xì)胞或依照權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的制劑用于制備藥物的 用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或微生物或寄生物感染；或用于治療和/或預(yù) 防變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、或干細(xì)胞或器官移植排斥。
16.依照權(quán)利要求15的用途，其特征在于在放射療法和/或抗腫瘤或抗微生物化學(xué)療 法、或目的在于治療變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、或干細(xì)胞或器官移植排斥的任何療法前、 同時(shí)、或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物。
17.依照權(quán)利要求13的樹(shù)突細(xì)胞或依照權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的制劑用于制備藥物的 用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防由免疫系統(tǒng)針對(duì)環(huán)境抗原諸如變應(yīng)原，或針對(duì)自身免 疫性疾病過(guò)程中的自身抗原的病理學(xué)反應(yīng)過(guò)度引起的免疫學(xué)疾病。
18.依照權(quán)利要求17的用途，其特征在于在目的在于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)或自身免疫 性疾病的其它藥征前、同時(shí)、或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物。
19.依照權(quán)利要求13的樹(shù)突細(xì)胞或依照權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的制劑用于制備藥物的 用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防異基因干細(xì)胞移植(優(yōu)選在治療血液學(xué)惡性腫瘤中使 用)的免疫學(xué)排斥，或者用于治療和/或預(yù)防異基因器官移植的排斥。
20.依照權(quán)利要求19的用途，其特征在于在目的在于治療或預(yù)防所述異基因干細(xì)胞或 器官移植排斥的其它藥征前、同時(shí)、或之后對(duì)個(gè)體施用所述藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生成樹(shù)突細(xì)胞的方法及其在藥物中的用途，這通過(guò)目的在于在功能上改善其在治療癌癥、微生物感染、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病或器官和干細(xì)胞移植排斥中的治療功效的遺傳工程來(lái)實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N5/0784GK101896601SQ200880120431
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者亞歷山大·M·多納爾, 托馬斯·菲爾茲曼 申請(qǐng)人:特里梅德生物有限責(zé)任公司