專利名稱：預(yù)測基因毒性的制作方法
預(yù)測基因毒性本發(fā)明一般涉及毒理學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及預(yù)測基因毒性的方法以及 篩選潛在基因毒性化合物的方法。小核測驗(yàn)(“MNT”)是制藥業(yè)中常規(guī)使用的檢測染色體損傷的普通實(shí)驗(yàn)。當(dāng)有絲 分裂完成后完整染色體或染色體片段沒有整合入子核時即形成微核。分別導(dǎo)致染色體丟失 /獲得和斷裂的化合物_致非整倍原和斷裂劑使微核形成顯著增加，因此能使用該實(shí)驗(yàn)進(jìn) 行檢測。因此，微核是染色體損傷的生物標(biāo)志，小核測驗(yàn)是檢測致非整倍原化合物和/或斷 裂劑化合物的靈敏方法。小核測驗(yàn)在制藥業(yè)中廣泛用作基因毒性(或無基因毒性)的證據(jù)。然而，進(jìn)行小核測驗(yàn)費(fèi)力且耗時，當(dāng)以細(xì)胞毒劑量測試時還會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，同 時進(jìn)行該測驗(yàn)還需要大量的物品(細(xì)胞、細(xì)胞系維持試劑和化合物)。激酶負(fù)責(zé)磷酸化底物并傳遞胞間和胞內(nèi)信號，這些信號包括在有絲分裂過程中的 染色體復(fù)制起始、倍增和終止。由于已知許多信號級聯(lián)在多種疾病中具有作用，制藥公司經(jīng) 常靶向抑制激酶。經(jīng)常開發(fā)小分子激酶抑制劑(SMKI)來競爭性結(jié)合激酶ATP結(jié)合口袋，阻 滯酶磷酸化底物的能力。由于在激酶組內(nèi)ATP結(jié)合口袋高度保守，SMKI除抑制所期望的靶 標(biāo)外還經(jīng)常抑制許多激酶，因此需要注意伴隨該類型藥物化合物而來的非靶標(biāo)激酶抑制的 毒性。更具體而言，正如陽性微核結(jié)果所證實(shí)的，分裂中期后的遺傳毒性是SMKI通常的毒 理傾向?，F(xiàn)在，通過使用較快、試劑用量較少、易于自動化的方法，我們發(fā)明了預(yù)測小核測 驗(yàn)中何種化合物將呈現(xiàn)陽性(即基因毒性)結(jié)果的方法。通過檢測給定化合物和大量激酶間的相互作用(激酶結(jié)合和/或抑制)，本發(fā)明提 供了快速測定給定化合物在MNT實(shí)驗(yàn)中將展現(xiàn)基因毒性的可能性的方法。由于能快速且使 用自動方法測定激酶抑制和/或結(jié)合，本發(fā)明的方法能針對基因毒性(或無基因毒性)高 通量篩選化合物。實(shí)際上，能使用本領(lǐng)域已知方法測定結(jié)合和抑制。例如參見M. A. Fabian等，Nature Biotechnol (2005) 23 :329_36(以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。本發(fā)明的一個方面是預(yù)測化合物基因毒性的方法，該方法包含步驟提供測試化 合物；測定該化合物抑制至少10種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由CDK2(Seq. Id. 1)、CLKl (Seq. Id. 2)、DYRKlB (Seq. Id. 3)、ERK8(Seq. Id. 4)、GSK3A(Seq. Id. 5)、 GSK3B (Seq. Id. 6)、PCTKl (Seq. Id. 7)、PCTK2 (Seq. Id. 8)、STK16 (Seq. Id. 9)、TTK (Seq. Id. 10)、CLK2 (Seq. Id. 11)、ERK3 (Seq. Id. 12)和 PRKR (Seq. Id. 13)組成的組，或選自由 CDK2、CLKl、DYRK1B、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTKl、PCTK2、STK16、TTK、CDK7 (Seq. Id. 64)、CLK4 (Seq. Id. 68)和PCTK3 (Seq. Id. 69)組成的組，其中至少5種所述激酶被抑制 至少50%活性表明所述測試化合物可能具有基因毒性。在一個實(shí)施方案中，以大約10 μ M濃度測試所述測試化合物。在另一個實(shí)施方案中，測試了化合物抑制選自所述組的至少12種激酶的激酶活 性的能力。在另一個實(shí)施方案中，測定了化合物抑制所述組中全部13種激酶的激酶活性的 能力。
在另一個實(shí)施方案中，除了上述13種激酶的組外，也可測試至少一種下述的其他 激酶。化合物與一種或更多種這些其他激酶(除了大多數(shù)已鑒定的13種激酶外)的高親合 力與較高可能的基因毒性相關(guān)。這些其他激酶是MKNK2(Seq. Id. 14)、SgK085(Seq. Id. 15)、 PIM2 (Seq. Id. 16)、TNNI3K(Seq. Id. 17)、KIT(Seq. Id. 18)、MELK (Seq. Id. 19)、AURKA (Seq. Id. 20)、CLK3 (Seq. Id. 21)、AAKl (Seq. Id. 22)、DCAMKL3 (Seq. Id. 23)、LIMKl (Seq. Id. 24)、 FLTl (Seq. Id. 25)、MAP2K4 (Seq. Id. 26)、PIM3 (Seq. Id. 27)、AURKB (Seq. Id. 28)、ERK2 (Seq. Id. 29)、CSNK1A1L (Seq. Id. 30)、DAPK3 (Seq. Id. 31)、MLCK (Seq. Id. 32)、CLK3 (Seq. Id. 33)、PFTKl (Seq. Id. 34)、PRKD3 (Seq. Id. 35)、AURKC (Seq. Id. 36)、ERK5 (Seq. Id. 37)、 STK17A(Seq. Id. 38)、MST4 (Seq. Id. 39)、CDK3 (Seq. Id. 40) ,MYLK (Seq. Id. 41)、CDC2L1 (Seq. Id. 42)、QIK (Seq. Id. 43)、CDKll (Seq. Id. 44)、PLKl (Seq. Id. 45)、PDGFR β (Seq. Id. 46)、 PRKCM (Seq. Id. 47)、MAPK4 (Seq. Id. 48)、PIP5K2B (Seq. Id. 49)、CSNKlD (Seq. Id. 50)、 RPS6KA1 (KDl) (Seq. Id. 51)、CDK5 (Seq. Id. 52)、PLK3 (Seq. Id. 53)、BIKE (Seq. Id. 54)、 PLK4(Seq. Id. 55)、CAMK2A(Seq. Id. 56)、STK3 (Seq. Id. 57)、CSNK2A1 (Seq. Id. 58)、 STK17B(Seq. Id. 59)、CDK8 (Seq. Id. 60)、MAP2K6 (Seq. Id. 61)、PIMl (Seq. Id. 62)、 MAP2K3 (Seq. Id. 63)、CDK7 (Seq. Id. 64)、IKK 8 (Seq. Id. 65)、TGFBR2 (Seq. Id. 66)、 CDK9 (Seq. Id. 67)、CLK4 (Seq. Id. 68)和 PCTK3 (Seq. Id. 69)。本發(fā)明的另一個方面是篩選候選潛在基因毒性化合物的方法，該方法包括步驟 提供多種化合物；測定每一種化合物抑制多種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由 CDK2、CLK1、DYRK1B、ERK8、GSK3A、GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、TTK、CLK2、ERK3 和 PRKR 組成 的組，或可選自由 CDK2、CLKl、DYRKIB、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、 TTK、⑶K7、CLK4和PCTK3組成的組，其中抑制至少5種所述激酶活性的至少50%或特異性 結(jié)合至少5種所述激酶的至少50%表明所述測試化合物可能具有基因毒性。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，該方法進(jìn)一步包含拒絕具有可能的基因毒性的化合物的步驟。一般而言，化合物與給定激酶的結(jié)合親合力與該化合物抑制該激酶活性的能力密 切相關(guān)，因此結(jié)合親合力是抑制的活性的可靠替代物。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物 抑制激酶活性的能力通過測量該化合物與所述激酶的結(jié)合親合力而測定?？墒褂帽绢I(lǐng)域已 知的多種方法測定結(jié)合親合力；例如通過使用固定的化激酶(或固定的測試化合物，或固 定的競爭性配體，任何這些物質(zhì)也可被標(biāo)記)的競爭性測定測定結(jié)合親合力?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn) 方法固定化合物和激酶，例如通過生物素化和捕獲在包被有鏈霉抗生物素的底物上而進(jìn)行 固定。因此，人們可以制備例如具有多種固定的激酶的測試底物，優(yōu)選包含此處鑒定的 13 種激酶CDK2、CLKl、DYRK1B、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTKl、PCTK2、STK16、TTK、 CLK2、ERK3和PRKR(或其他鑒定的激酶)。可將激酶直接(即通過吸附、共價鍵或生物素-抗 生物素蛋白結(jié)合，等)或間接(例如通過結(jié)合到已固定在表面上的配體，所述固定通過吸 附、共價鍵、生物素-抗生物素蛋白結(jié)合或其他連接而實(shí)現(xiàn))固定到表面。然后，將激酶與 測試化合物接觸并測定親合力(或酶活性抑制)，例如通過測量結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記化合物或損 失的經(jīng)標(biāo)記競爭物測定親合力。測量每種化合物針對至少10種經(jīng)鑒定的或可選擇的經(jīng)鑒定的激酶的激酶親合 力，且最優(yōu)選針對全部13種鑒定的激酶使用較大數(shù)目的激酶(至多13種)產(chǎn)生的基因毒性預(yù)測具有較高置信度。具有高的總活性(例如表現(xiàn)出具有針對13種激酶中至少5種激 酶，優(yōu)選8種或更多種激酶的高親合力)的化合物具有高可能性的基因毒性預(yù)測該化合物 在MNT基因毒性測試中呈陽性。預(yù)測具有低的總活性(例如僅對鑒定的激酶具有低親合力 或僅對1-4種鑒定的激酶具有高親合力)的化合物在MNT中測試呈陰性。一般將在本發(fā)明的測定中測試呈陽性的候選藥物(即預(yù)測在MNT中為基因毒性的 藥物)鑒定為“基因毒性的”或“潛在基因毒性的”，并從進(jìn)一步的開發(fā)中拒絕掉或撤銷。在 高通量篩選應(yīng)用的情況下，可將這樣的化合物標(biāo)記為“毒性的”(例如，在自動化高通量系統(tǒng) 的情況下，通過管理系統(tǒng)的軟件實(shí)現(xiàn))，因此能盡早做出決定。因此，部分基于化合物的潛在基因毒性，人們能使用本發(fā)明的方法來區(qū)分優(yōu)先次 序并選擇候選的用于藥物開發(fā)的化合物。例如，假如某人已經(jīng)制備了許多具有針對選定靶 標(biāo)的相似活性的化合物(例如50種或更多)并期望為進(jìn)一步的開發(fā)區(qū)分優(yōu)先次序或選擇 所述化合物的亞集，他可以在本發(fā)明的方法中測試整組化合物并丟掉或拒絕掉所有那些基 因毒性測試呈陽性的化合物。通過早期鑒定毒性的重要來源降低了藥物開發(fā)的費(fèi)用，以及 選來開發(fā)的任何化合物的研究數(shù)量。由于本發(fā)明的方法快速且易于自動化，巨量化合物的 篩選現(xiàn)在成為可能，否則其不可能或者不切合實(shí)際。也可使用本發(fā)明的方法鑒定環(huán)境污染物等，在這種情況下，典型地鑒定這樣的化 合物以進(jìn)一步研究它們的毒性。在本發(fā)明方法的該應(yīng)用中，人們可使用已知方法(例如層 析)分級環(huán)境樣品(例如懷疑被污染的土壤、水或空氣)，并用本發(fā)明的方法研究所述組分。 然后，將顯示基因毒性信號的組分進(jìn)行進(jìn)一步分級，并(使用本發(fā)明的方法)鑒定起作用的 毒性劑?？蛇x地，人們可使用懷疑為環(huán)境污染物的純化合物或純化的化合物進(jìn)行本發(fā)明的 方法，以測定其潛在的基因毒性。由于本發(fā)明的方法快速且易于自動化，巨量化合物的篩選 現(xiàn)在成為可能，否則其不可能或者不切合實(shí)際。所有在此公開文本中引用的出版文獻(xiàn)以其整體引入這里作為參考。除非另有說明，在本申請(包括說明書和權(quán)利要求)中使用的下列術(shù)語給出定義 如下。必須指出的是，除非上下文另有明確說明，在說明書和附加權(quán)利要求書中所用的單數(shù) 形式的“ a”、“ an ”及“ the ”包括復(fù)數(shù)對象。在此使用的術(shù)語“基因毒性”指產(chǎn)生染色體畸變的化合物，包括斷裂(斷裂劑)或 異?？截悢?shù)(致非整倍原)。在該上下文中，“基因毒性”指小核測驗(yàn)中的陽性結(jié)果?！盎?毒性的可能性”具體指預(yù)測所討論的化合物在MNT中以至少75%置信度證明為基因毒性。術(shù)語“測試化合物”指將要測定其基因毒性的物質(zhì)。測試化合物可以是候選藥物 或先導(dǎo)化合物、化學(xué)中間體、環(huán)境污染物、化合物混合物等。術(shù)語“激酶”指能附加給蛋白質(zhì)或分子磷酸基和/或從蛋白質(zhì)或分子移除磷酸基 的酶?！耙种萍っ富钚浴敝富衔锝档突蚋蓴_這樣的磷酸酶活性的能力。由于小分子與給定 激酶的結(jié)合親合力與所述分子抑制激酶活性的能力密切相關(guān)，認(rèn)為結(jié)合親合力是此處所述 的激酶活性的同義詞，認(rèn)為高結(jié)合親合力等同于高激酶抑制活性。結(jié)合親合力和激酶抑制 間的相關(guān)性由M. A.Fabian等，Nature Biotechnol (2005) 23 :329_36(以全文引入此處作為 參考)描述。術(shù)語“鑒定的激酶”指下述激酶的集:CDK2 (Seq. Id. 1)、CLKl (Seq. Id. 2)、 DYRKlB (Seq. Id. 3)、ERK8 (Seq. Id. 4)、GSK3A (Seq. Id. 5)、GSK3B (Seq. Id. 6)、PCTKl (Seq.Id. 7)、PCTK2 (Seq. Id. 8)、STK16 (Seq. Id. 9)、TTK (Seq. Id. 10)、CLK2 (Seq. Id. 11)、 ERK3 (Seq. Id. 12)和 PRKR(Seq. Id. 13)?！捌渌b定的激酶”指由 CDK2、CLKl、DYRK1B、 ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTKl、PCTK2、STK16、TTK、CDK7、CLK4 和 PCTK3 組成的激酶 集。優(yōu)選的激酶是序列表中標(biāo)明的人類激酶。然而，也可在本方法中使用來源于任何其他 生物的激酶。此處述及的所有專利和出版物均以其整體并入本文作為參考。 實(shí)施例為了鑒定指示測試化合物呈基因毒性的可能性的激酶集，進(jìn)行了下述分析。首先， 選擇54種合適的小分子激酶抑制劑(“SMKI”)以形成訓(xùn)練集。其次，訓(xùn)練集中的每一種化 合物均需獲得針對290種激酶的體外MNT結(jié)果和單點(diǎn)抑制譜(single point inhibition profile)。然后進(jìn)行統(tǒng)計分析，以(1)建立使用所述單點(diǎn)激酶抑制譜的模型以預(yù)測所述MNT 結(jié)果及(2)鑒定與MNT結(jié)果相關(guān)的激酶。最后，使用未用于訓(xùn)練的其他33種SMKI的集驗(yàn) 證該模型。先前已詳細(xì)地描述了體外小核測驗(yàn)(M.Fenech，Mutation Res (2000) 455 (1-2) 81-95)。該實(shí)驗(yàn)使用了已建立的懸浮生長的永生小鼠淋巴瘤細(xì)胞系L5178Y tkv_(ATCC CRL 9518)。通常，以至少12個濃度水平且最高達(dá)500 μ g/mL的濃度測試化合物。一般選擇最 高評估劑量來觀察可接受的毒性(相對細(xì)胞計數(shù)(RCC)降低少于50%)或水性介質(zhì)中明顯 的沉淀現(xiàn)象。假如該化合物可溶且無毒則設(shè)定5000 μ g/mL的最高劑量。為了評估細(xì)胞毒 性，計算相對細(xì)胞計數(shù)(RCC，&%陰性對照表示)。通過設(shè)定細(xì)胞密度為大約IX IO6個細(xì) 胞/mL并使用細(xì)胞離心涂片器(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)離心到干凈的玻片上而制備玻片。 在冰冷的甲醇中(_20°C，至少4小時)固定和儲存細(xì)胞。用Η33258(1 μ g/mL PBS/CMF)孵 育玻片5分鐘并用IOyL antifade封片以用于熒光顯微鏡檢查。在裝備有適當(dāng)濾光片組 的落射熒光顯微鏡的幫助下分析最少3個濃度水平以確定微核化細(xì)胞的存在。假如與并行 的陰性對照相比，一個或更多個濃度顯示了至少2倍增加的微核化細(xì)胞數(shù)目，則認(rèn)為該化 合物具有斷裂劑/致非整倍原活性?；诙鄠€標(biāo)準(zhǔn)(包括選擇性激酶抑制譜、冗余度極小化和化學(xué)多樣性)將54個化 合物選擇包括在訓(xùn)練集中。在內(nèi)部SMKI數(shù)據(jù)庫中，僅考慮具有選擇性激酶抑制譜的化合物， 其中選擇性化合物是在單點(diǎn)抑制6種或較少種激酶的抑制值大于95 %，及抑制11種或較少 種激酶的抑制值大于85%的化合物。使用M. A.Fabian等，Nature Biotechnol (2005) 23 329-36所述的方法測定激酶抑制。在大量化合物選擇性抗許多相同激酶時，僅選擇這些化 合物中的一種，以最小化那些激酶的冗余度或重復(fù)表現(xiàn)度(over-r印resentation)。在這些 過濾步驟后，基于物理性質(zhì)(包括AlogP、分子量、氫供體和受體數(shù)目、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目、原子 數(shù)、環(huán)數(shù)、芳香環(huán)數(shù)及片段數(shù))選擇化學(xué)多樣性集。在SciTegic's Pipeline Pilot 6.0.2 中基于最大相異性方法并使用“多樣性分子”濾子(“Diverse Molecules"filter)定義多 樣性。獲取訓(xùn)練集中每種化合物抗290種激酶的抑制譜和體外MNT結(jié)果(N = 54)。針 對MNT結(jié)果獲得了 3個不同的讀數(shù)陰性(N = 22)，陽性(N = 26)和弱陽性(N = 6)?；?于進(jìn)行抑制譜的濃度上的％麗細(xì)胞將6個弱陽性分配為陰性標(biāo)簽或陽性標(biāo)簽。這使6種化合物中的5種被重新分配為陰性，給出了總共27個陰性和27個陽性化合物。在所有抑制譜集的范圍中首先進(jìn)行預(yù)處理，以移除不提供信息的或偏倚的激酶。 將在整個54種化合物的集中均沒有差異的激酶移除，因?yàn)樗鼈儾惶峁┬畔?。將JNK和p38 同種型移除，以減少開發(fā)來靶向那些激酶的訓(xùn)練集中大量化合物的偏倚。為確保移除JNK 和p38同種型未引入不同形式的偏倚，我們進(jìn)行了額外的分析，借此我們僅考慮了那些未 被開發(fā)用于這些激酶靶標(biāo)的訓(xùn)練集化合物，并發(fā)現(xiàn)JNK和p38同種型均與MNT結(jié)果無關(guān)。為了建立該模型，在多個階段進(jìn)行了特征選擇(FS)和模式識別(PR)。對于所有分 析，使用交叉效度分析評估該模型在多個試驗(yàn)中的表現(xiàn)。每個試驗(yàn)將原始數(shù)據(jù)隨機(jī)分為訓(xùn) 練集和測試集；使用訓(xùn)練集建立臨時模型，使用測試集預(yù)測結(jié)果，然后檢驗(yàn)表現(xiàn)。使用特征 選擇方法測定哪種激酶或“特征”可能與MNT結(jié)果最相關(guān)。在每一個試驗(yàn)中，將抗所選特征 的抑制值用作模式識別方法的輸入值，其然后預(yù)測了陽性或陰性結(jié)果。在第一個階段，將特征選擇方法分為兩組能處理大量輸入數(shù)據(jù)集的方 法(FSl)，和以較少數(shù)據(jù)較好執(zhí)行的方法(FS2)。使用10個5倍交叉效度測驗(yàn)、在 多個試驗(yàn)分析中測試了 FSI、FS2和ra的不同組合。選擇具有最低平均錯誤率的方 法組合用于下一階段的分析。這些組合包括用于FSI的柯爾莫諾夫-斯米爾諾夫/ T測驗(yàn)混合算法，用于FS2的隨機(jī)森林算法和用于I3R的支持向量機(jī)(T. Hastie等， "The Elements of StatisticalLearning，，(2001, Springer-Verlag) ；R. 0. Duda 等，“Pattern Classification,第 二 版，，(2000, Wiley-Interscience)；禾口 "Feature Extraction-Foundationsand Applications，，(2006, Springer-Verlag, I. Guyon等編輯))。將第一階段選擇的方法組合進(jìn)行調(diào)整以獲得最佳表現(xiàn)。優(yōu)化了多個參數(shù)，包括模 型中使用的激酶數(shù)。調(diào)整過程顯示，在多個試驗(yàn)中，當(dāng)在FSl和FS2后選取為顯著的激酶數(shù) 為13時平均錯誤率最低。因此，以最優(yōu)參數(shù)調(diào)整了該模型，然后特定選擇13個最顯著特征 作為I3R的輸入值。然后通過進(jìn)行50個5倍交叉效度分析評估了使用該特征選擇和模式識別方法組 合的模型的準(zhǔn)確性、特征數(shù)和最佳調(diào)整參數(shù)。重要的是，在每一個交叉效度分析倍數(shù)內(nèi)進(jìn)行 特征選擇和模式識別。產(chǎn)生的模型具有80% 士4%的準(zhǔn)確性S卩，該模型平均在80%的情 況下正確預(yù)測了 MNT結(jié)果。也使用50個5倍交叉效度分析來測定與MNT結(jié)果相關(guān)的激酶。基于250個試驗(yàn) 中(50個5倍交叉效度分析)激酶被選為顯著的次數(shù)選擇激酶。原始的290種激酶中的55 種被至少一次選為顯著。選擇以大于50%的頻率(N = 13)被選擇的那些激酶包括在最終 的模型中。在多輪測試后，發(fā)現(xiàn)抗該13種激酶的激酶抑制譜在至少50%的預(yù)測真實(shí)MNT結(jié) 果的情況下是顯著的。即，具有陽性體外MNT結(jié)果的SMKI傾向于具有高水平的抗該13種 激酶的抑制活性。對于每一種SMKI，該模型由抗下述13種激酶的單點(diǎn)激酶抑制譜組成⑶K2、CLK1、 DYRK1B.ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTKl、PCTK2、STK16、TTK、CLK2、ERK3 和 PRKR。此外， 也包括進(jìn)行激酶篩選時所選濃度的體外MNT測定結(jié)果?；诙拷Y(jié)合常數(shù)的第二模型包 含第二 (重疊)集的 13 種激酶CDK2、CLKl、DYRK1B、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTKl、 PCTK2、STK16、TTK, CDK7、CLK4和PCTK3。兩個模型所選的激酶高度相似，這證明了單點(diǎn)激 酶抑制模型的穩(wěn)健性。
為了評估該最終模型的有效性，將另外集的33種化合物用作驗(yàn)證集。這33種化 合物未包括在最初的54種化合物的集中，但每一種化合物均包括抗所述13種模型激酶的 單點(diǎn)抑制值以及體外MNT結(jié)果。假如給出了驗(yàn)證數(shù)據(jù)，該模型能準(zhǔn)確預(yù)測所有化合物的MNT 結(jié)果，因此以76%的準(zhǔn)確性進(jìn)行，該準(zhǔn)確性處于我們根據(jù)交叉效度分析估計的模型準(zhǔn)確性 范圍之內(nèi)。本發(fā)明已經(jīng)通過參考其具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到， 在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出若干變動及可以用等同物進(jìn)行替換。此 外，可以進(jìn)行多種修改來使特殊的環(huán)境、材料、物品成分、方法、過程步驟或步驟適應(yīng)于本發(fā) 明的目標(biāo)精神和范圍。所有這樣的修改確定為落入在此所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種預(yù)測化合物基因毒性的方法，所述方法包含a)提供測試化合物；b)測定該化合物抑制至少10種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由CDK2、CLK1、DYRK1B、ERK8、GSK3A、GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、TTK、CLK2、ERK3和PRKR組成的組，其中至少5種所述激酶被抑制至少50％活性表明所述測試化合物具有基因毒性。
2.一種預(yù)測化合物基因毒性的方法，所述方法包含a)提供測試化合物；b)測定該化合物抑制至少10種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由CDK2、CLKU DYRKIB、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、TTK、CDK7、CLK4 和 PCTK3 組成 的組，其中至少5種所述激酶被抑制至少50%活性表明所述測試化合物具有基因毒性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟b)進(jìn)一步包含測定該化合物抑制至少1 種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由MKNK2、SgK085、PIM2、TNNI3K、KIT、MELK、AURKA、 CLK3、AAK1、DCAMKL3、LIMK1、FLT1、MAP2K4、PIM3、AURKB、ERK2、CSNK1A1L、DAPK3、MLCK、CLK3、 PFTK1、PRKD3、AURKC、ERK5、STK17A、MST4、CDK3、MYLK、CDC2L1、QIK、CDK11、PLK1、PDGFR β、 PRKCM、MAPK4、PIP5K2B、CSNK1D、RPS6KA1. Kin. Dom. 1、CDK5、PLK3、BIKE、PLK4、CAMK2A、STK3、 CSNK2A1、STK17B、CDK8、MAP2K6、PIM1、MAP2K3、CDK7、IKK ε、TGFBR2、CDK9、CLK4 和 PCTK3 組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3所述的方法，其中所述測試化合物在大約10μ M的濃度進(jìn)行測試ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4所述的方法，其中步驟b)包含測定該化合物抑制選自所述組的 至少12種激酶的激酶活性的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4所述的方法，其中步驟b)包含測定該化合物抑制所述組中全部 13種激酶的激酶活性的能力。
7.篩選潛在基因毒性化合物的方法，所述方法包含a)提供大量測試化合物；b)測定每一種化合物抑制至少10種激酶的激酶活性的能力，所述激酶選自由CDK2、 CLKl、DYRK1B、ERK8、GSK3A、GSK3B、PCTKl、PCTK2、STK16、TTK、CLK2、ERK3 和 PRKR 組成的 組，或選自由 CDK2、CLK1、DYRK1B、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、TTK、 ⑶K7、CLK4和PCTK3組成的其他組；其中至少5種所述激酶被抑制至少50%活性表明所述測試化合物具有基因毒性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包含c)拒絕證明可能具有基因毒性的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8所述的方法，其中該化合物抑制激酶活性的能力通過測量該化 合物與所述激酶的結(jié)合親合力進(jìn)行測定。
10.一種測試底物，其包含固相支持物；及固定在所述固相支持物上的激酶CDK2、CLKU DYRK1B、ERK8、GSK3A、GSK3B、PCTKU PCTK2、STK16、TTK、CLK2、ERK3 和 PRKR，或激酶 CDK2、CLK1、DYRK1B、ERK8 (MAPK15)、GSK3A、 GSK3B、PCTK1、PCTK2、STK16、TTK、CDK7、CLK4 和 PCTK3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的測試底物，進(jìn)一步包含固定在所述固相支持物上的激酶，所述激酶選自由MKNK2、SgK085、PIM2、TNNI3K、KIT、 MELK, AURKA, CLK3、AAKl、DCAMKL3、LIMKl、FLTl、ΜΑΡ2Κ4、ΡΙΜ3、AURKB, ERK2、CSNK1A1L、 DAPK3、MLCK, CLK3、PFTKl、PRKD3、AURKC, ERK5、STK17A、MST4、CDK3、MYLK, CDC2L1、QIK、 CDKl 1、PLKl、PDGFR β、PRKCM、ΜΑΡΚ4、ΡΙΡ5Κ2Β、CSNK1D、RPS6KA1. KDl、CDK5、PLK3、BIKE、 PLK4、CAMK2A、STK3、CSNK2A1、STK17B、CDK8、ΜΑΡ2Κ6、ΡΙΜ1、ΜΑΡ2Κ3、CDK7、IKK ε、TGFBR2、 CDK9、CLK4和PCTK3組成的組。
12.實(shí)質(zhì)上如上所述，特別是參照前述實(shí)施例的方法和測試底物。
全文摘要
通過化合物抑制至少5種來自選定組的激酶的能力預(yù)測該化合物在小核測驗(yàn)中顯示基因毒性的可能性。
文檔編號C12Q1/48GK101903774SQ200880120541
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者A·J·奧拉哈斯基, D·M·戈爾茨坦, H·M·L·比特, K·L·科拉雅, N·貢扎路多, S·基希納 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司