專利名稱：：方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物學(xué)上重要的乙?；蠓肿拥念I(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及將Ne-乙酰-賴氨酸摻入多肽的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)已將原核生物和真核生物的遺傳密碼擴(kuò)展，從而能夠在體內(nèi)對(duì)琥珀終止密碼子反應(yīng)位點(diǎn)特異性地?fù)饺?0種以上設(shè)計(jì)的非天然氨基酸。通過(guò)賦予生物體改進(jìn)的正交氨酰tRNA合成酶/tRNAGUA對(duì)(aminoacyl-tRNAsynthetase/tRNACUApairs)來(lái)完成所述合成遺傳密碼的擴(kuò)展，其中所述正交氨酰tRNA合成酶/tRNA。UA對(duì)指導(dǎo)對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)位點(diǎn)特異性地?fù)饺敕翘烊话被帷Ｕ话滨RNA合成酶用非天然氨基酸使同源的正交tRNA而非其他細(xì)胞tRNA進(jìn)行氨基?；?aminoacylate)；而正交tRNA是正交合成酶的底物，但基本上不被任何內(nèi)源氨酰tRNA合成酶氨基酰化。使用正交的詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)酪氨酰-tRNA合成酶/RNAota對(duì)的改進(jìn)變體在大腸桿菌(E.coli)中的遺傳密碼擴(kuò)展極大地提高了含非天然氨基酸的蛋白的產(chǎn)量，這是因?yàn)榕c依賴于向細(xì)胞或體外翻譯反應(yīng)物中添加按化學(xué)計(jì)量預(yù)氨基?；囊种菩詔RNA的方法相反，正交tRNAraA被其同源氨酰tRNA合成酶催化再酰化，因此氨基?；恍柘拗品g效率。非天然氨基酸突變的很多潛在應(yīng)用(包括相應(yīng)于在蛋白質(zhì)中多個(gè)位點(diǎn)存在的翻譯后修飾例如乙?；陌被岱g摻入)需要更有效的摻入方法，以生產(chǎn)有用量的蛋白。然而，在天然細(xì)胞的情況下向蛋白中引入生物物理探針和化學(xué)上的精確擾動(dòng)提供了以此前不能實(shí)現(xiàn)的方式理解和控制細(xì)胞功能的令人興奮的可能性。賴氨酸的N、乙?；强赡娴姆g后修飾，并且在真核細(xì)胞中對(duì)競(jìng)爭(zhēng)(rival)磷酸化具有調(diào)控作用η4。尚不存在合成在指定位點(diǎn)包含N、乙酰-賴氨酸的蛋白的通用方法。首次描述了在組蛋白上賴氨酸的N、乙?；?1。賴氨酸的乙?；兔撘阴；謩e由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白脫乙?；?HDAC)介導(dǎo)。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的真核蛋白(除組蛋白之外)受到乙?；{(diào)控，包括多于20%的線粒體蛋白2°。盡管賴氨酸乙?；哂芯薮蟮闹匾裕巧袥](méi)有生產(chǎn)在指定位點(diǎn)包含Ne-乙酰_賴氨酸的均質(zhì)重組蛋白的通用方法。利用天然化學(xué)連接安置Ne-乙酰-賴氨酸的半合成方法被用于證明H4K16在染色質(zhì)解壓實(shí)中的作用^這些研究顯示了生產(chǎn)均質(zhì)乙酰化蛋白的方法對(duì)我們理解乙?；谏飳W(xué)中的分子作用的影響。目前，基于化學(xué)的乙?；椒ㄐ枰铣纱罅康男揎楇牧蝓?，這是一種缺陷。此外，這些已知的方法受到N-末端殘基的限制。一些研究者使用純化的HAT復(fù)合體來(lái)使重組蛋白乙?；?。然而，這通常是不能令人滿意的方案，其原因如下i)可能尚不知道用于特定修飾的HAT;ii)制備活性HAT復(fù)合體通常需要絕妙的技巧；iii)通常難以使得完成HAT介導(dǎo)的反應(yīng)，從而導(dǎo)致異質(zhì)的(heterogeneous)樣品；和iv)HAT可在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行乙?；瑥亩y以確定在任一位點(diǎn)的分子乙?；Y(jié)果。本發(fā)明試圖克服與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容賴氨酸的Ne-乙酰化是具有高度生物學(xué)重要性的翻譯后修飾。在現(xiàn)有技術(shù)中，Ne-乙酰化的研究非常困難。用于生產(chǎn)Ne-乙酰化蛋白的現(xiàn)有技術(shù)依賴于將Ne-乙酰賴氨酸安置到目標(biāo)多肽中的化學(xué)或半合成方法。這些方法中的一些對(duì)技術(shù)的要求很高，而另一些方法具有嚴(yán)重的局限性，例如對(duì)N-末端殘基修飾的限制。已知在現(xiàn)有技術(shù)中，沒(méi)有生產(chǎn)包含Ne-乙酰賴氨酸的均質(zhì)重組蛋白的通用方法。為了可靠地向多肽中的精確設(shè)定位點(diǎn)摻入N、乙酰賴氨酸，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了研究細(xì)胞中天然存在的多肽合成機(jī)制(翻譯機(jī)制)的方法。特別地，本發(fā)明的發(fā)明人研發(fā)出經(jīng)修飾而接受Ne-乙酰賴氨酸，并催化Ne-乙酰賴氨酸摻入轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的tRNA合成酶。因此，本發(fā)明的發(fā)明人創(chuàng)造出此前絕沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的新酶活性。此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)將此新型酶發(fā)展成適合的tRNA合成酶/tRNA對(duì)，其可用于在合成時(shí)以及在操作者選擇的位點(diǎn)處將N、乙酰賴氨酸特異地?fù)饺氲鞍字?。因此，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了新型tRNA合成酶，以及相應(yīng)的用于生產(chǎn)摻入了Ne-乙酰賴氨酸的多肽的新方法。這些新型材料和技術(shù)能夠生產(chǎn)同質(zhì)的多肽樣品，每個(gè)樣品均包含所需的翻譯后修飾。這無(wú)法簡(jiǎn)單地通過(guò)使用基于現(xiàn)有技術(shù)中已知技術(shù)的現(xiàn)有化學(xué)方法而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明是基于這些顯著的發(fā)現(xiàn)。因此，一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶。另一方面，本發(fā)明涉及上述tRNA合成酶，其中所述合成酶包含與MbPylRS氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽。適合地，在至少50個(gè)連續(xù)氨基酸的范圍內(nèi)評(píng)估所述同一性。適合地，在包含對(duì)應(yīng)于MbPylRS的L266至C313氨基酸的區(qū)域內(nèi)評(píng)估所述同一性。另一方面，本發(fā)明涉及上述tRNA合成酶，其中所述tRNA合成酶多肽包含對(duì)應(yīng)于MbPylRS中至少L266至C313的氨基酸序列的氨基酸序列，或與其具有至少90%同一性的序列。適合地，所述多肽包含相對(duì)于野生型MbPylRS序列而言在L266、L270、Y271、L274或C313中的一個(gè)或多個(gè)位置的突變。適合地，所述至少一個(gè)突變(即所述一個(gè)或多個(gè)突變)在L270、Y271、L274或C313位置。適合地，所述至少一個(gè)突變?cè)贚270、L274或C313位置。適合地，所述tRNA合成酶包含Y271L。適合地，所述tRNA合成酶包含Y271F。適合地，所述tRNA合成酶包含L266V。適合地，所述tRNA合成酶包含L270I、Y271L、L274A和C313F。適合地，所述tRNA合成酶包含L266V、L270I、Y271F、L274A和C313F。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼上述多肽的核苷酸序列的核酸。另一方面，本發(fā)明涉及上述多肽在向tRNA負(fù)載(Charge)NE-乙酰賴氨酸中的應(yīng)用。適合地，所述tRNA包含MbtRNAaJS卩，適合地，所述tRNA包含公眾可以獲得的，由MbPylT基因編碼的野生型巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinabarkeri)tRNACUA)。另一方面，本發(fā)明涉及制備包含Νε-乙酰賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括安排翻譯編碼所述多肽的RNA，其中所述RNA包含琥珀密碼子，其中所述翻譯在上述多肽存在下、能夠負(fù)載有N、乙酰賴氨酸的tRNA存在下、且N、乙酰賴氨酸存在下進(jìn)行。適合地，所述翻譯在脫乙?；种苿┐嬖谙逻M(jìn)行。適合地，所述抑制劑包含煙酰胺(NAM)。另一方面，本發(fā)明涉及制備包含N、乙酰賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括修飾編碼所述多肽的核酸，以在對(duì)應(yīng)于所述多肽中需要摻入N、乙酰賴氨酸的位置的一個(gè)或多個(gè)位置提供琥珀密碼子。適合地，修飾所述核酸包括將編碼賴氨酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子(TAG)。另一方面，本發(fā)明涉及包含Νε-乙酰賴氨酸的均質(zhì)重組蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)中的蛋白在其N、乙酰賴氨酸含量方面是異質(zhì)的。適合地，所述蛋白由上述方法制備。另一方面，本發(fā)明涉及包含上述核酸的載體。適合地，所述載體還包含編碼所述tRNA合成酶的tRNA底物的核酸序列。適合地，所述tRNA底物由MbPylT基因(見(jiàn)上文)編碼。另一方面，本發(fā)明涉及包含上述核酸，或包含上述載體的細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及還包含失活的脫乙酰化酶基因的上述細(xì)胞。適合地，所述失活的脫乙?；富虬ㄈ笔Щ蚱茐?disruption)的CobB。另一方面，本發(fā)明涉及包含上述載體或包含上述細(xì)胞，和一定量煙酰胺的試劑盒。另一方面，本發(fā)明涉及制備能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶的方法，所述方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的一個(gè)或多個(gè)位置突變編碼親本tRNA合成酶的核酸，和選擇能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的一個(gè)或多個(gè)突變體。具體實(shí)施例方式為了解決現(xiàn)有技術(shù)中用于合成乙酰化蛋白的方法的缺陷，我們?cè)O(shè)想通過(guò)產(chǎn)生正交Ne-乙酰賴氨酰-tRNA合成酶/tRNA對(duì)，以遺傳編碼的方式，對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)高翻譯保真且高功效地將Ne-乙酰賴氨酸摻入蛋白中。本文描述了用于通過(guò)在大腸桿菌(E.coli)中對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)以遺傳學(xué)方式將N、乙酰賴氨酸摻入從而生產(chǎn)位點(diǎn)特異性乙?；闹亟M蛋白的方法和材料。我們還能生產(chǎn)均質(zhì)的此類蛋白，而這對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)是不可能的。我們證明巴氏甲烷八疊球菌吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)/MbtRNAcm對(duì)15_19在大腸桿菌中成正交，并且與此前報(bào)道的有用對(duì)具有相當(dāng)?shù)墓π?。我們改進(jìn)了上述對(duì)用于對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)高翻譯保真且高功效地?fù)饺隢、乙酰賴氨酸。此外，我們還成功地消除了最初觀察到的翻譯后脫乙?；?。這些策略在破解乙酰化在推測(cè)的染色質(zhì)修飾的表觀遺傳編碼中的作用2’3以及更深入地理解N、乙?；募?xì)胞作用2°方面具有廣泛的應(yīng)用。定義應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有”具有其在本領(lǐng)域的通常含義，即包括所述的特征或特征組，但此術(shù)語(yǔ)不排除任何其他的所述特征或特征組的存在。通過(guò)復(fù)制前體基因(progenitorgene)，隨后在復(fù)制拷貝中獲得新功能來(lái)改進(jìn)生物體中分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)。本文描述了人工模擬產(chǎn)生正交分子的自然過(guò)程的方法，所述正交分子即這樣的分子，其能夠與其前體平行地處理信息而沒(méi)有前體與復(fù)制分子之間的串?dāng)_。使用這些方法，可以從很多自然命運(yùn)中選擇出復(fù)制分子對(duì)的進(jìn)化命運(yùn)，從而獲得復(fù)制分子與衍生出所述復(fù)制分子的前體分子之間的預(yù)定關(guān)系。在本文中，其體現(xiàn)于產(chǎn)生能夠與野生型tRNA合成酶和tRNA平行地處理信息但沒(méi)有野生型與正交分子之間串?dāng)_的正交tRNA合成酶-正交tRNA。在一些實(shí)施方式中，tRNA本身可保持其野生型序列。在這些實(shí)施方式中，適合地，在異源背景，即不同于其天然存在的野生型宿主細(xì)胞的背景或宿主細(xì)胞中，使用保持其野生型序列的所述實(shí)體。這樣，野生型實(shí)體可在功能意義上是正交的，而無(wú)需結(jié)構(gòu)上的改變。下文更詳細(xì)地討論了正交性及其可接受的標(biāo)準(zhǔn)。巴氏甲烷八疊球菌PylS基因編碼MbPylRStRNA合成酶蛋白。巴氏甲烷八疊球菌PylT基因編碼MbtRNACUAtRNA。序列同源性/同一性盡管也可將序列同源性視為功能類似性(即具有類似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本文中，優(yōu)選通過(guò)序列同一性表示同源性?？赏ㄟ^(guò)肉眼進(jìn)行序列比對(duì)，但更常借助于可容易獲得的序列比對(duì)程序進(jìn)行。這些公用的和可商購(gòu)的計(jì)算機(jī)程序能夠計(jì)算兩條或多條序列之間的同源性百分比(例如，同一性百分比)?？捎?jì)算連續(xù)序列的同一性百分比，即將一條序列與另一條序列比對(duì)，且將一條序列中的每個(gè)氨基酸與另一條序列中的對(duì)應(yīng)氨基酸直接比較，每次比較一個(gè)殘基。這被稱作“無(wú)空位”比對(duì)。此類無(wú)空位比對(duì)通常僅在相對(duì)較短的殘基數(shù)量范圍(例如小于50個(gè)連續(xù)氨基酸)內(nèi)進(jìn)行。盡管這是非常簡(jiǎn)單且可靠的方法，但其沒(méi)有考慮在進(jìn)行全局比對(duì)(在完整序列上進(jìn)行比對(duì))時(shí)，例如在其他方面相同的序列對(duì)中，一個(gè)插入或缺失將導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基無(wú)法比對(duì)，這樣潛在地導(dǎo)致同源性百分比(同一性百分比)大幅下降。因此，大多數(shù)序列比對(duì)方法經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以產(chǎn)生最佳比對(duì)，其考慮可能的插入和缺失，而不是過(guò)度地對(duì)整體同源性(同一性)進(jìn)行罰分。這通過(guò)在序列比對(duì)中插入“空位”以設(shè)法使局部同源性/同一性最大化來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些更加復(fù)雜的方法為比對(duì)中出現(xiàn)的每個(gè)空位給出“空位罰分”，這樣對(duì)于數(shù)量相等的相同氨基酸，空位較少的序列比對(duì)(反映出兩條比較序列之間較高的關(guān)聯(lián)性)所得的分?jǐn)?shù)將高于空位很多的序列比對(duì)?！胺律淇瘴涣P分”通常用于對(duì)空位的存在給出相對(duì)高的罰分，而對(duì)空位中的每個(gè)后續(xù)殘基給出較小的罰分。這在空位罰分系統(tǒng)中最為常用。顯然，高空位罰分將產(chǎn)生空位較少的最佳比對(duì)。大多數(shù)比對(duì)程序允許更改空位罰分。然而，在使用此類軟件進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，優(yōu)選使用默認(rèn)值。例如，在使用GCGWisconsinBestfit軟件包(見(jiàn)下文)時(shí)，氨基酸序列的默認(rèn)空位罰分是空位-12分，而每個(gè)延伸_4分。因此，計(jì)算最大同源性百分比首選需要在考慮空位罰分的情況下生成最佳比對(duì)。適合進(jìn)行此類比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(UniversityofWisconsin,U.S.A；Devereuxetal.，1984，NucleicAcidsResearch12:387)。能夠進(jìn)行序列比對(duì)的其他軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST軟件包、FASTA(Altschuletal.，1990，J.MoI.Biol.215403-410)和比對(duì)工具組GENEW0RKS。盡管就同一性方面可測(cè)量最終的同源性百分比，但是比對(duì)程序本身通常并不是基于全或無(wú)的成對(duì)比較。作為替代，通常使用分級(jí)的類似性記分矩陣，其基于化學(xué)類似性或進(jìn)化距離給出每個(gè)成對(duì)比較的分?jǐn)?shù)。此類常用矩陣的實(shí)例是BL0SUM62矩陣，其是BLAST程序組的默認(rèn)矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公用的默認(rèn)值，或者在有提供的情況下使用定制符號(hào)比較表格(customsymbolcomparisontable)。對(duì)于GCG軟件包優(yōu)選使用公用的默認(rèn)值，或者在其他軟件的情況下，使用如BL0SUM62的默認(rèn)矩陣。一旦由軟件產(chǎn)生最佳比對(duì)，即可計(jì)算同源性百分比，優(yōu)選計(jì)算序列同一性百分比。軟件通常將其作為序列比對(duì)的一部分進(jìn)行，并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。在本文中，同源氨基酸序列是指在氨基酸水平包含至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少95%或98%同一性的氨基酸序列。適合地，使用本文公開(kāi)的相關(guān)多肽序列在至少50或100，優(yōu)選200、300或更多氨基酸的范圍內(nèi)評(píng)估此同一性，最適合地，使用全長(zhǎng)前體(親本)tRNA合成酶序列進(jìn)行評(píng)估。適合地，應(yīng)考慮那些已知對(duì)蛋白功能所必須的區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)序列而不是非必須的相鄰序列的同源性。這在考慮來(lái)自遠(yuǎn)緣關(guān)系生物的同源序列時(shí)特別重要。最適合地，至少應(yīng)在MbPylRS氨基酸序列中從L266至C313的連續(xù)區(qū)域內(nèi)，或其他tRNA合成酶的對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)評(píng)價(jià)序列同一性。相同的考慮因素也適用于核酸核苷酸序列，例如tRNA序列。參照序列當(dāng)使用數(shù)字標(biāo)記指示具體氨基酸殘基時(shí)，使用MbPylRS(巴氏甲烷八疊球菌吡咯賴氨酰-tRNA合成酶)的氨基酸序列作為參照序列(即，由公知的野生型巴氏甲烷八疊球菌PyIS基因編碼)進(jìn)行編號(hào)。本領(lǐng)域充分理解其用于目標(biāo)殘基的定位。這不總是嚴(yán)格的計(jì)數(shù)工作，還須注意上下文內(nèi)容。例如，如果目標(biāo)蛋白的長(zhǎng)度略有不同，那么在此序列中對(duì)應(yīng)于(例如)Y271的正確殘基的定位可能需要比對(duì)序列并選出等價(jià)或?qū)?yīng)的殘基，而不能簡(jiǎn)單地選擇目標(biāo)序列的第271位殘基。這很好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。突變具有其在本領(lǐng)域中的通常含義，并且可以指取代、截短或缺失所涉及的殘基、基序或域。突變可在多肽水平上進(jìn)行，例如通過(guò)合成具有突變序列的多肽；或者也可以在核苷酸水平上進(jìn)行，例如通過(guò)制備編碼突變序列的核酸，隨后翻譯所述核酸以產(chǎn)生突變多肽。在沒(méi)有氨基酸被指定作為給定突變位點(diǎn)的替換氨基酸的情況下，合適地使用所述位點(diǎn)的隨機(jī)化，例如，如本文中有關(guān)本發(fā)明的tRNA合成酶改進(jìn)和改造所描述的那些。可使用丙氨酸(A)作為默認(rèn)突變。適合地，在具體位點(diǎn)使用的突變?nèi)绫疚乃?。片段的長(zhǎng)度適合地為至少10個(gè)氨基酸，適合地為至少25個(gè)氨基酸，適合地為至少50個(gè)氨基酸，適合地為至少100個(gè)氨基酸，適合地為至少200個(gè)氨基酸，適合地為至少250個(gè)氨基酸，適合地為至少300個(gè)氨基酸，適合地為至少313個(gè)氨基酸，或適合地為目標(biāo)tRNA合成酶多肽的大部分。本發(fā)明的多肽適合地，包含Ne-乙酰賴氨酸的多肽是核小體或核小體多肽。適合地，包含Ne-乙酰賴氨酸的多肽是染色質(zhì)或與染色質(zhì)相關(guān)的多肽?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸加入重組的可復(fù)制載體中。載體可用于在相容的宿主細(xì)胞8中復(fù)制核酸。因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法，其中通過(guò)將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將此載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使所述載體發(fā)生復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞?？蓮乃鏊拗骷?xì)胞中回收所述載體。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，例如大腸桿菌。優(yōu)選本發(fā)明多核苷酸在載體中與控制序列可操作地連接，其中所述控制序列能夠通過(guò)宿主細(xì)胞提供編碼序列的表達(dá)，即所述載體是表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指所述組分之間的關(guān)系使其能夠以預(yù)期的方式發(fā)揮其作用。按照一定方式連接與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)控序列，從而在與控制序列相容的條件下完成編碼序列的表達(dá)?？蓪⒈景l(fā)明的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入所述的適合的宿主細(xì)胞，以提供本發(fā)明蛋白的表達(dá)。此方法可包括在一定條件下培養(yǎng)由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以通過(guò)編碼所述蛋白的編碼序列的載體提供表達(dá)，并且任選地回收所表達(dá)的蛋白。所述載體可以是，例如質(zhì)?；虿《据d體，所述載體帶有復(fù)制起點(diǎn)、任選的用于表達(dá)所述多核苷酸的啟動(dòng)子和任選的所述啟動(dòng)子的調(diào)控子。載體可包含一個(gè)或多個(gè)選擇性的標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒的情況下包含氨芐青霉素抗性基因。載體可以用于，例如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。與編碼本發(fā)明蛋白的序列可操作地連接的控制序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)?？蛇x擇與設(shè)計(jì)使用表達(dá)載體的宿主細(xì)胞相容的那些控制序列。術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包含大小和復(fù)雜性不同的核酸區(qū)域，其涉及從最小啟動(dòng)子到包含上游元件和增強(qiáng)子的啟動(dòng)子。蛋白的表達(dá)和純化可使用包含本發(fā)明多核苷酸的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的蛋白?？稍谠试S表達(dá)本發(fā)明蛋白的適合條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？梢越M成型地表達(dá)本發(fā)明蛋白以使其連續(xù)生產(chǎn)；或者是誘導(dǎo)型的，此時(shí)需要刺激以啟動(dòng)表達(dá)。在誘導(dǎo)型表達(dá)的情況下，蛋白生產(chǎn)當(dāng)需要時(shí)可通過(guò)例如向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物質(zhì)，例如地塞米松或IPTG來(lái)啟動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)從宿主細(xì)胞提取本發(fā)明的蛋白，包括酶解、化學(xué)和/或滲透裂解，和物理破裂。優(yōu)化通過(guò)使用包含RF-I的熱滅活突變體的S30提取物能夠提高體外翻譯反應(yīng)中非天然氨基酸的摻入。RF-I的溫度敏感突變體能夠瞬時(shí)提高體內(nèi)的整體(inglobal)琥珀型抑制。提高tRNA。UA基因的拷貝數(shù)量以及從基本培養(yǎng)基到豐富培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化也可改進(jìn)摻入了非天然氨基酸的蛋白在大腸桿菌中的產(chǎn)量。工業(yè)應(yīng)用Ne-乙酰化調(diào)控不同的細(xì)胞進(jìn)程。多個(gè)組蛋白上賴氨酸殘基的乙酰化調(diào)節(jié)染色質(zhì)凝集S可能是作為組蛋白密碼一部分的表觀標(biāo)記2，以及通過(guò)正在開(kāi)始破解的途徑3組織招募參與轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、重組和基因組穩(wěn)定性的因子。包括腫瘤抑制因子P534在內(nèi)的60多種轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子是乙酰化的，并且乙?；€調(diào)控轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)和重組機(jī)制的組分之間的相互作用5’6。乙?；瘜?duì)于調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)、組織免疫突觸和刺激驅(qū)動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)都非常重要7’8。乙酰化還是葡萄糖、氨基酸和能量代謝的重要調(diào)控因子，并且多種關(guān)鍵酶包括組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、乙酰輔酶A合酶、激酶、磷酸9酶和泛素連接酶鼠雙微體(ubiquitinligasemurinedoubleminute)的活性均由乙?；苯诱{(diào)控9。乙?；前閭H蛋白功能1(1、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和折疊"、stat3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)12和凋亡13的關(guān)鍵調(diào)控因素。綜上所述，可見(jiàn)N、乙?；菍?duì)抗磷酸化的具有多種不同作用和功能重要性的修飾14。因此，本文公開(kāi)的方法和材料在生產(chǎn)可銷售產(chǎn)品以及促進(jìn)對(duì)上述基本生物進(jìn)程的研究方面具有明顯的效用和工業(yè)實(shí)用性。其他應(yīng)用可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合方法抑制脫乙?；浮＿m合地，通過(guò)內(nèi)源脫乙酰化酶的基因缺失或破壞進(jìn)行抑制。適合地，所述被破壞/缺失的脫乙?；甘荂obB。適合地，通過(guò)抑制表達(dá)，例如抑制內(nèi)源脫乙酰化酶的翻譯進(jìn)行抑制。適合地，通過(guò)添加如煙酰胺的外源抑制劑進(jìn)行抑制。—方面，本發(fā)明涉及將Ne-乙酰賴氨酸加入生物體例如大腸桿菌的遺傳密碼中。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在合成在特定組蛋白的指定位點(diǎn)帶有Ne-乙酰賴氨酸的核小體和/或染色質(zhì)的具體應(yīng)用。此類應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例是用于測(cè)定指定修飾對(duì)核小體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響工’26。可將MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)進(jìn)一步改進(jìn)以通過(guò)遺傳方式摻入單_、雙-和/或三-甲基賴氨酸，從而研究這些修飾對(duì)組蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及其在表觀遺傳密碼中的作用14。此外，本文所述的方法還可應(yīng)用于通過(guò)遺傳方式摻入不同官能團(tuán)衍生化的賴氨酸殘基和/或?qū)⑸镂锢硖结槗饺氪竽c桿菌的蛋白中。由于MbPylRS不識(shí)別MbtRNAcm的反密碼子18，還可以將改進(jìn)的MbPylRS/MbtRNA對(duì)與其他改進(jìn)的正交氨酰tRNA合成酶/tRNA。UA對(duì)，和/或帶有改進(jìn)的解碼性質(zhì)的正交核糖體組合27，從而指導(dǎo)在單個(gè)蛋白中有效地?fù)饺攵鄠€(gè)不同的有用非天然氨基酸。圖1顯示證明了MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)對(duì)肌紅蛋白基因中的琥珀終止密碼子反應(yīng)而有效且特異地?fù)饺隢e-環(huán)戊氧羰基-L-賴氨酸(Cyc)的照片和圖。A.由Myo4TAG-PylT產(chǎn)生肌紅蛋白取決于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在的Cyc。通過(guò)Ni2+-親和層析純化在MjTyrRS/MjtRNA·存在下表達(dá)的肌紅蛋白(第1道)，或ImMCyc存在或不存在且MbTyrRS/MbtRNAeuA存在下表達(dá)的肌紅蛋白(第2道和第3道)，通過(guò)SDS-PAGE分析并用考馬斯亮藍(lán)染色。B.對(duì)MjTyrRS/MjtRNAcm產(chǎn)生的肌紅蛋白的ESI-MS分析顯示18433.2Da的質(zhì)量(預(yù)期為18431.2Da)，而由MbTyrRS/MbtRNACUA(Cyc)產(chǎn)生的肌紅蛋白具有18510.7Da的質(zhì)量。預(yù)期的質(zhì)量差異(m(Cyc)-m(Tyr)=258.3Da_181.2Da=77.IDa)與所觀察的質(zhì)量差異(77.5Da)對(duì)應(yīng)良好。圖2顯示了說(shuō)明設(shè)計(jì)用于遺傳摻入Ne-乙酰賴氨酸的MbTyrRS的分子結(jié)構(gòu)。A.賴氨酸(1)、吡咯賴氨酸⑵和Ne-乙酰賴氨酸(3)的結(jié)構(gòu)。B.與吡咯賴氨酸結(jié)合的MbTyrRS的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。顯示了形成吡咯賴氨酸的疏水結(jié)合口袋并在文庫(kù)中突變成常見(jiàn)20種氨基酸中的每一種的氨基酸殘基。此圖像是使用PyMoIνΘ.99(www,pymol.on)和PDBID2Q7H產(chǎn)生的。圖3顯示證明改進(jìn)的氨酰tRNA合成酶對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)而有效地將N、乙?；嚢彼釗饺氲鞍字械恼掌蛨D片。A.在MjTyrRS/MjtRNACUA存在下產(chǎn)生的肌紅蛋白(第1道)，或ImMNe-乙?；嚢彼岽嬖诨虿淮嬖谇褹cKRS-2存在下產(chǎn)生的肌紅蛋白(第2道和第3道)，或在ImM乙酰賴氨酸和50mM煙酰胺(NAM)存在下產(chǎn)生的肌紅蛋白(第4道)。通過(guò)Ni2+-親和層析純化蛋白，通過(guò)SDS-PAGE分離，用考馬斯亮藍(lán)染色，或者轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜，并用抗體檢測(cè)六組氨酸標(biāo)簽或乙酰賴氨酸。B.純化乙?；〖t蛋白的ESI-MS分析。在煙酰胺不存在下(綠色，-NAM)表達(dá)的肌紅蛋白產(chǎn)生兩個(gè)質(zhì)量峰18397.6(b)和18439.2Da(a)，其分別對(duì)應(yīng)于脫乙?；鸵阴；募〖t蛋白(預(yù)期質(zhì)量分別為=18396.2和18438.2Da)。在50mM煙酰胺存在下(藍(lán)色，+NAM)表達(dá)的肌紅蛋白時(shí)，僅觀察到乙?；鞍椎姆?C)。下文將通過(guò)實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。這些實(shí)施例用于說(shuō)明，而非限制本發(fā)明的權(quán)利要求。實(shí)施例-概述某些產(chǎn)甲烷細(xì)菌，包括巴氏甲烷八疊球菌(Mb)，對(duì)存在于多種甲基轉(zhuǎn)移酶基因中的UAG密碼子15’16反應(yīng)摻入吡咯賴氨酸。對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)，吡咯賴氨酸在巴氏甲烷八疊球菌中的摻入受到吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)及其同源琥珀抑制基因MbtRNAatt的指導(dǎo)17。MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)在大腸桿菌中發(fā)揮作用，但MbtRNAem不是大腸桿菌中內(nèi)源氨酰tRNA合成酶的有效底物16’18。因此，MbPylRS/MbtRNACUA似乎滿足了關(guān)于內(nèi)源氨酰tRNA合成酶和tRNA成正交性的三條標(biāo)準(zhǔn)中的兩條22。結(jié)合有關(guān)乙酰賴氨酸是吡咯賴氨酸基礎(chǔ)的理解，這些觀察促使我們研究將MbPylRS/MbtRNACUA改進(jìn)成Νε-乙?；嚢滨?tRNA合成酶/tRNACUA對(duì)以用于將乙酰賴氨酸遺傳性摻入在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白。實(shí)施例-通用方法質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pMyo4TAG-PyIT編碼受阿拉伯糖啟動(dòng)子控制的肌紅蛋白基因，其中第4個(gè)密碼子被琥珀密碼子取代。其還包含帶有Ipp啟動(dòng)子和rrnC終止子的PylT基因。PMyo4TAG-PylT通過(guò)連接兩個(gè)PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。使用pBADJYAMB4TAG22作為PCR反應(yīng)中的模板生成一個(gè)PCR產(chǎn)物，其中在所述PCR反應(yīng)中擴(kuò)增除MjtRNAm基因之外的整個(gè)載體。此PCR使用引物pMyoNotF(5'-CAAGCGGCCGCGAATTCAGCGTTACAAGTATTACA-3')和pMyoPstR(5'-GACCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCT-3‘)。通過(guò)使用引物PYLTPST13(5'-GCGACGCTGCAGTGGCGGAAACCCCGGGAATC_3')和PYLTNOT15(5'-GGAAACCGCGCGGCCGCGGGAACCTGATCATGTAGATCG-3‘)從pREP-PylT擴(kuò)增PylT基因，從而生成第二個(gè)PCR產(chǎn)物。使用NotI和PstI酶切兩個(gè)PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶連接形成pMyo4TAG-PylT。pREP-PylT衍生自pREP(2)YC-JYCUA22，28通過(guò)Quickchange突變?cè)噭┖?Stratagene)缺失pREP(2)YC-JYCUA中的MjtRNAcm基因，在Ipp啟動(dòng)子下游產(chǎn)生獨(dú)特的BglII和SpeI位點(diǎn)。這使用引物pREPDtf(5‘-CTAGATCTATGACTAGTATCCTTAGCGAAAGCTAA-3')和pREPDtr(5'-ATACTAGTCATAGATCTAGCGTTACAAGTATTACA-3‘)進(jìn)行。通過(guò)引物pylTbegf(5'-GCTAGATCTGGGMCCTGATCATGTAGATCGMTGGACTCTAMTCCGTTCAGCC-3')和pylTendr(5'-GATACTAGTTGGCGGAAACCCCGGGAATCTAACCCGGCTGAACGGATTTAGAGTC-3')經(jīng)PCR產(chǎn)生PylT基因，并將其克隆到中間載體中的BglII和SpeI之間。使用與從pREP(2)YC-JYCUA產(chǎn)生pREP_PylT相同的策略和引物，從pY0BB2衍生出pBAR-PylT(其包含受阿拉伯糖啟動(dòng)子控制，在Q2和D44位置帶有琥珀密碼子的毒性barnase基因，和Ipp啟動(dòng)子上的PylT)。文庫(kù)構(gòu)建合成根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化過(guò)的MbPylS基因(Geneart)。將此ORF克隆到pBK-JYRS22中的Ndel和Pstl位點(diǎn)之間，以取代MjTyrRS基因并產(chǎn)生pBK-PylS。在此模板上進(jìn)行3輪反向PCR以使L266、L270、Y271、L274、C313和W383的密碼子隨機(jī)化，將前一輪的產(chǎn)物作為后一輪的模板。在各輪PCR反應(yīng)中使用以下引物(第1輪)PylSC313f(5'-GCGCAGGAAAGGTCTCAAACTTTNNKCAAATGGGCAGCGGCTGCACCCGTGAAAAC_3')和PylSC313r(5'-GCGCAGAGTAGGTCTCAAGTTAACCATGGTGAATTCTTCCAGGTGTTCTTTCff)；(第2輪)PylSL266f(5'-GCGCAGGTCTCACCGATGNNKGCCCCGACCNNKNNKAACTATNNKCGTMACTGGATCGTATTCTGCCGGGTC_3')和PylSL266r(5'-GCGCAGAGTAGGTCTCATCGGACGCAGGCACAGGTTTTTATCCACGCGGAAAATTTG-3')；(第3輪)PylSW383f2(5'-GCGCAGGAAAGGTCTCAAAACCGNNKATTGGCGCGGGTTTTGGCCTGGAACGTCTGCTG_3')和PylSW383r2(5'-GCGCAGAGTAGGTCTCAGTTTATCAATGCCCCATTCACGATCCAGGCTAACCGGAC-3')。在100μL試樣中制備酶促反向PCR反應(yīng)物，其包含帶有MgCl2的IXPCR緩沖液(Roche)、每種dNTP各200μΜ、每種引物各0.8μM、IOOng模板和7UExpand高保真聚合酶(Roche)。使用以下溫度程序在50μ1試樣中進(jìn)行PCR反應(yīng)95°C2分鐘，9X(95V20秒；65°C[_1°C/循環(huán)]20秒，68°C4分鐘)，31X(950C20秒，580C20秒，68°C4分鐘)，68°C9分鐘。如上所述29，使用DpnI和BsaI酶切純化的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，連接，沉淀并用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)的DHlOB細(xì)胞。如上所述3°，為了增加最后一輪酶促反向PCR后獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體的數(shù)量，使用Phi29DNA聚合酶在500μ1反應(yīng)中擴(kuò)增沉淀的連接產(chǎn)物。最后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約IO8個(gè)突變體的文庫(kù)。通過(guò)對(duì)隨機(jī)選擇的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)文庫(kù)的質(zhì)量，其顯示在隨機(jī)位點(diǎn)摻入的核苷酸沒(méi)有偏差。選擇Ne-乙酰賴氨酸特異性氨酰tRNA合成酶使用突變合成酶克隆文庫(kù)轉(zhuǎn)化帶有質(zhì)粒PREP-PylT的大腸桿菌DH10B，產(chǎn)生IO9個(gè)轉(zhuǎn)化體。在補(bǔ)充有12.5μgmr1四環(huán)素和25μgπιΓ1卡那霉素(LB-KT)的IOOmLLB中培養(yǎng)細(xì)胞(16h，37°C，250r.p.m.)。將2mL此培養(yǎng)物以150的比例稀釋到包含ImMNe-乙酰賴氨酸(Bachem)的新鮮LB-KT中，并培養(yǎng)(3_4h，37°C，250r.p.m.)。將0.5ml培養(yǎng)物平鋪到補(bǔ)充有ImM乙酰賴氨酸和50μgmr1氯霉素的LB-KT平板(24cmχ24cm)。培養(yǎng)(48h，37°C)后，從平板上剝下細(xì)胞，并分離質(zhì)粒。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳從報(bào)告質(zhì)粒分離合成酶質(zhì)粒，并使用Qiagen凝膠純化試劑盒提取。為了選擇指導(dǎo)對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)摻入天然氨基酸的合成酶，使用在此陽(yáng)性選擇中分離的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化包含PBar-PylT的DH10B。電穿孔后，使細(xì)胞在SOB培養(yǎng)基中恢復(fù)(3h，37°C，250r.p.m.)。將約IO7個(gè)細(xì)胞平鋪到補(bǔ)充有0.2%阿拉伯糖、25μgπιΓ1卡那霉素和25ygπιΓ1氯霉素的LB-瓊脂平板(24cmχ24cm)。將平板在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。收集來(lái)自所得菌落的細(xì)胞，并按上文所述分離合成酶質(zhì)粒。按照與第1輪相同的方式進(jìn)行第3輪篩選，只是不是收集合成酶質(zhì)粒的集合，我們挑出單個(gè)菌落并使其平行地生長(zhǎng)在ImLLB-KT中。在生長(zhǎng)過(guò)夜后，以110的比例將200μL每種培養(yǎng)物稀釋到新鮮LB-KT中，并分成由單個(gè)菌落獲得的兩等份ImL培養(yǎng)物。向一份培養(yǎng)物中添加ImMNe-乙酰賴氨酸，而另一份不添加。在培養(yǎng)(5h，37°C，250r.p.m.)后，將細(xì)胞挑到含有或不含ImMNe-乙酰賴氨酸且包含濃度提高的氯霉素的LB-KT平板上。由顯示強(qiáng)N、乙酰賴氨酸依賴性的氯霉素抗性的24個(gè)克隆分離總質(zhì)粒DNA。將此DNA用HindIII(其不酶切pBK-PylS，但酶切pREP-PylT)酶切，并用于轉(zhuǎn)化DH10B。為了驗(yàn)證所觀察到的表型不是細(xì)胞基因組突變或報(bào)告質(zhì)粒突變的結(jié)果，使用分離的PBK-PylS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化包含pREP-PylT的細(xì)胞，并檢測(cè)其在2mMNE-乙酰賴氨酸存在或不存在下，在濃度提高的氯霉素中的生長(zhǎng)能力。此外，我們還通過(guò)在StormPhosphoimager(MolecularDynamics)上掃描不含氯霉素的平板來(lái)分析GFP的表達(dá)。通過(guò)琥珀型抑制表達(dá)和純化肌紅蛋白使用pBKPylS、AcKRS-I或AcKRS-2和pMyo4TAG_PylT轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。在LB-KT中培養(yǎng)細(xì)胞(16h，37°C，250r.p.m.)。向1升補(bǔ)充有ImMNe-乙酰賴氨酸或Cyc(Sigma)的LB-KT中接種50mL此過(guò)夜培養(yǎng)物。在37°C培養(yǎng)2小時(shí)后，向培養(yǎng)物中補(bǔ)充50mM煙酰胺(Sigma)，并再培養(yǎng)30分鐘。通過(guò)添加0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。3小時(shí)后，收集細(xì)胞并用PBS清洗。通過(guò)在25°C下振搖補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)UmMPMSF、50mM煙酰胺和約ImgπιΓ1溶菌酶的30mLBugBuster(Novagen)，以提取蛋白。通過(guò)離心(15分鐘，2500g，4°C)凈化提取物，并補(bǔ)充20mM咪唑和50mMTris(pH8.0)至40ml的總體積。向提取物中添加0.3mlNi2+-NTA珠(Qiagen)，并在4°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將珠傾入柱中，并用40ml清洗緩沖液(50mMTris、20mM咪唑、200mMNaCl)清洗。將蛋白洗脫到補(bǔ)充有200mM咪唑的Iml清洗緩沖液中，并立即使用S印hadexG25柱將其重新緩沖到IOmM碳酸銨(pH7.5)中。通過(guò)4-20%SDS-PAGE分析純化的蛋白。使用抗六組氨酸標(biāo)簽的抗體(Qiagen)和Ne-乙酰賴氨酸的抗體(SantaCruz)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。質(zhì)譜以11的比例將重新緩沖到IOmM碳酸銨(pH7.5)的蛋白與含1%甲酸的50%甲醇混合。在帶有電噴霧電離的LCT時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(Micromass)上確定總質(zhì)量。以IOmlHiirT1注射樣品，并在陽(yáng)離子模式下使用馬心臟肌紅蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)60-90個(gè)掃描進(jìn)行平均，通過(guò)使用MassLynx4.1版(Micromass)對(duì)多電荷蛋白質(zhì)譜進(jìn)行退卷積(deconvoluting)，從而獲得分子質(zhì)量。使用Protparam(http//us.expasv.org/tools/protparam.html)計(jì)算野生型蛋白的理論質(zhì)量，并人工調(diào)整包含非天然氨基酸的蛋白的理論質(zhì)量。實(shí)施例1WbPylRS/MbtRNA·對(duì)的選擇和應(yīng)用為了確認(rèn)MbPylRS/MbtRNAeuA對(duì)在大腸桿菌中的活性以及MbtRNAem與細(xì)胞氨酰tRNA合成酶的正交性，我們檢查了分別編碼MbPylRS和MbtRNAem的PylS和PylT基因指導(dǎo)對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)摻入吡咯賴氨酸類似物Ne-環(huán)戊氧羰基-L-賴氨酸(Cyc，此前證明是MbPylRS的有效底物19)的能力。用pBK-PylS(編碼MbPylRS)和pREP-PylT(編碼MbtRNAcm，氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的琥珀突變體，T7RNA聚合酶基因的琥珀突變體和T7啟動(dòng)子上的綠色熒光蛋白基因)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在Cyc存在下，在150μgml—1氯霉素下存活并顯示綠色的熒光。在不向培養(yǎng)基中添加Cyc或pBK-PylS時(shí)，細(xì)胞不能在高于20μgπιΓ1的氯霉素下存活，并且沒(méi)有顯示綠色熒光。這些結(jié)果證實(shí)MbtRNAatt基本上沒(méi)有被大腸桿菌中的內(nèi)源性氨酰tRNA合成酶氨基乙酰化，并且證實(shí)MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)在大腸桿菌中介導(dǎo)Cyc依賴性琥珀型抑制。為了證明MbPylRS/MbtRNA對(duì)能夠支持與此前用于遺傳編碼擴(kuò)增的對(duì)水平相當(dāng)?shù)牡鞍妆磉_(dá)，我們構(gòu)建了包含編碼MbtRNAcm和抹香鯨肌紅蛋白的基因(其帶有替代4位絲氨酸密碼子的琥珀密碼子和C-末端六組氨酸標(biāo)簽)的表達(dá)構(gòu)建體(Myo4TAG-PylT)。包含Myo4TAG-PylT，pBK-PylS和ImMCyc的細(xì)胞產(chǎn)生全長(zhǎng)的肌紅蛋白(圖1)，其純化產(chǎn)量為每升培養(yǎng)物2mg(在使用詹氏甲烷球菌(Mj)酪氨酰-tRNA合成酶tRNA^^MjTyrRS/MjtRNA·)對(duì)對(duì)相同肌紅蛋白基因中的琥珀密碼子反應(yīng)而插入酪氨酸時(shí)，獲得了相當(dāng)?shù)募〖t蛋白產(chǎn)量)(圖1)。此數(shù)據(jù)證實(shí)MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)以相當(dāng)于此前用于遺傳編碼擴(kuò)增的對(duì)的效率指導(dǎo)氨基酸摻入。如果不向細(xì)胞添加Cyc或MbPylRS，那么通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色僅檢測(cè)到痕量的全長(zhǎng)肌紅蛋白，這表明內(nèi)源氨酰tRNA合成酶對(duì)MbtRNAcm的氨基乙?；椒浅５汀?shí)施例2:定量摻入為了檢查MbPylRS對(duì)細(xì)胞tRNA的正交性，以及證明MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)定量地?fù)饺隒yc，我們獲取了包含Cyc的純化肌紅蛋白的電噴霧質(zhì)譜(圖1)。質(zhì)譜顯示了對(duì)應(yīng)于編碼摻入的Cyc的單個(gè)峰。此數(shù)據(jù)證實(shí)了沒(méi)有對(duì)有意密碼子反應(yīng)以可測(cè)定的程度摻入Cyc(即MbPylRS在功能上是正交的)，并且在Cyc存在下沒(méi)有對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)以可測(cè)定的程度摻入天然氨基酸。綜上所述，表型數(shù)據(jù)、蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明MbPylRS/MbtRNACUA對(duì)在大腸桿菌中是具有高度活性、特異性和正交性的對(duì)。實(shí)施例3:Νε_(tái)乙酰賴氨酸活性的評(píng)估在此實(shí)施例中，闡述了用于制備能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶的方法。此方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的至少一個(gè)或多個(gè)位置突變編碼親本tRNA合成酶序列的核酸。在此實(shí)施例中，突變上述殘基中的每一個(gè)。在突變后，選擇能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的突變體。突變?yōu)榱碎_(kāi)始改進(jìn)出用于對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)而摻入Ne-乙酰賴氨酸的MbPylRS/MbtRNAcm正交對(duì)，我們制備了IO8個(gè)MbPylRS突變體的文庫(kù)，在所述突變體中，有6個(gè)殘基(Leu266、Leu270、Tyr271、Leu274、Cys313、Tip383)被隨機(jī)化(圖2)。基于與吡咯賴氨酸復(fù)合的MbPylRS的結(jié)構(gòu)選擇這些殘基23，并且在吡咯賴氨酸的結(jié)合吡咯環(huán)6人之內(nèi)。選擇為了選擇指導(dǎo)遺傳摻入Nε-乙酰賴氨酸的突變MbPylRS/MbtRNA。UA對(duì)，我們進(jìn)行了三輪篩選(陽(yáng)性、陰性、陽(yáng)性)。在陽(yáng)性篩選中，使用氨酰tRNA合成酶文庫(kù)和pREP-PylT轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并將細(xì)胞在存在ImMNe-乙酰賴氨酸和50μgml—1氯霉素的條件下生長(zhǎng)以選擇活性合成酶22。通過(guò)使用pBARPylT(其包含PylT和毒性核酸酶barnase的基因，在該barnase的基因中有兩個(gè)密碼子轉(zhuǎn)化為琥珀密碼子)共轉(zhuǎn)化，在不存在N、乙酰賴氨酸的條件下對(duì)存活的合成酶克隆進(jìn)行陰性篩選。此步驟除去了使用天然氨基酸作為底物的氨酰tRNA合成酶。在三輪陽(yáng)性和陰性篩選后，分離存活的氨酰tRNA合成酶克隆，并用pREP-PylTR化。根據(jù)Ne-乙酰賴氨酸依賴性氯霉素抗性和GFP熒光篩選96個(gè)克隆。其中22個(gè)克隆在存在和不存在2mMNe-乙酰賴氨酸的條件下分別賦予大腸桿菌耐受高達(dá)150μgπιΓ1和20-30μgπιΓ1氯霉素的氯霉素抗性；這些克隆還顯示出氨基酸依賴性GFP熒光。在…-乙14酰賴氨酸存在和不存在下氯霉素抗性的巨大差異表明，與在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的所有20種常見(jiàn)氨基酸相比，所選擇的合成酶具有對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)插入N、乙酰賴氨酸的高度體內(nèi)特異性。測(cè)序表明22個(gè)克隆對(duì)應(yīng)于兩個(gè)不同的氨酰tRNA合成酶序列，我們將其分別命名為AcKRS-I和AcKRS-2。相對(duì)于MbPylRS，AcKRS-I具有5個(gè)突變(L266V、L270I、Y271F、L274A、C313F)，而AcKRS-2具有4個(gè)突變(L270I、Y271L、L274A和C313F)。盡管不希望被理論限制，但可能MbPylRS中結(jié)合吡咯環(huán)的疏水腔被重排以結(jié)合乙?；鶊F(tuán)，并且通過(guò)改進(jìn)的合成酶中突變氨基酸的較大體積補(bǔ)償了吡咯賴氨酸和N、乙酰賴氨酸之間的體積差異。實(shí)施例4包含Ne-乙酰賴氨酸的多肽的制備方法在此實(shí)施例中，產(chǎn)生包含N、乙酰賴氨酸的多肽。這通過(guò)安排翻譯編碼所述多肽的RNA進(jìn)行。此RNA包含琥珀密碼子。在如本發(fā)明實(shí)施例3中所述的多肽，即AcKRS-I或AcKRS-2存在的條件下進(jìn)行翻譯。還在能夠負(fù)載有Ne-乙酰賴氨酸的tRNA(在此實(shí)施例中為PylT)存在下，且Ne-乙酰賴氨酸存在下進(jìn)行翻譯。因此，為了證明對(duì)琥珀密碼子反應(yīng)摻入乙酰賴氨酸的保真性和功效，使用包含Myo4TAG-PylT、AcKRS-I或AcKRS-2和ImMNe-乙酰賴氨酸的細(xì)胞產(chǎn)生全長(zhǎng)肌紅蛋白。純化肌紅蛋白，其產(chǎn)量為每升培養(yǎng)物1.5mg(圖3)，其與報(bào)道使用活性最高的MjTyriRS/MjtRNA。UA對(duì)變體摻入非天然氨基酸的產(chǎn)量相當(dāng)22。如果不向細(xì)胞添加Ne-乙酰賴氨酸，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色或?qū)-末端His-6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)印跡僅檢測(cè)到痕量的肌紅蛋白。對(duì)Ne-乙酰賴氨酸的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了肌紅蛋白中摻入了所述氨基酸。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了所選擇的氨酰tRNA合成酶對(duì)Ne-乙酰賴氨酸的選擇性非常高。實(shí)施例5包含Ne-乙酰賴氨酸的多肽的制備方法在此實(shí)施例中，在抑制脫乙酰化酶的條件下產(chǎn)生多肽。首先根據(jù)實(shí)施例4生產(chǎn)多肽。從包含AcKRS-2、Myo4TAG-PyIT和Νε-乙酰賴氨酸的細(xì)胞中純化的肌紅蛋白的電噴霧電離質(zhì)譜給出了兩個(gè)峰(圖3):—個(gè)峰對(duì)應(yīng)于摻入的Ne-乙酰賴氨酸，而第二個(gè)峰的質(zhì)量少42Da。我們將第二個(gè)峰歸屬于帶有賴氨酸而非Νε-乙酰賴氨酸的肌紅蛋白。我們的推論是，由于從Myo4TAG-PylT表達(dá)肌紅蛋白依賴于向細(xì)胞添加Ne-乙酰賴氨酸，而包含賴氨酸的肌紅蛋白必然是由大腸桿菌中翻譯后脫乙?；苌鴣?lái)的。大腸桿菌具有單個(gè)表征的脫乙酰化酶CobB屬于sirtuin家族的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶24’25。由于已知煙酰胺有效地抑制sirtuin家族的酶，我們根據(jù)實(shí)施例4，但另外還存在此抑制劑下進(jìn)行蛋白表達(dá)。從包含煙酰胺的細(xì)胞中產(chǎn)生的肌紅蛋白的電噴霧電離質(zhì)譜給出了對(duì)應(yīng)于乙酰化蛋白的單個(gè)峰(圖3)，沒(méi)有觀察到脫乙?；鞍椎姆?。我們的結(jié)論是煙酰胺完全抑制了大腸桿菌中遺傳摻入乙酰賴氨酸的翻譯后脫乙?；?shí)施例部分的總結(jié)綜上所述，我們證實(shí)了MbtRNA。UA對(duì)大腸桿菌中細(xì)胞氨酰tRNA合成酶的正交性，證明了MbPylRS對(duì)大腸桿菌中細(xì)胞tRNA的正交性，還證明了此正交對(duì)在大腸桿菌中的功效。我們還開(kāi)發(fā)了用于指導(dǎo)N、乙酰賴氨酸高翻譯保真和高有效地?fù)饺氪竽c桿菌中表達(dá)的蛋白中的MbPylRS/MbtRNA-正交對(duì)。此外，我們還開(kāi)發(fā)了基于抑制劑的策略，以徹底消除最初觀察到的在大腸桿菌中共翻譯摻入N、乙酰賴氨酸的翻譯后脫乙?；?。因此，本文所述的材料和技術(shù)可用于生產(chǎn)位點(diǎn)特異性乙?；闹亟M蛋白。參考文件1.Shogren-Knaak,M.etal.HistoneH4-K16acetylationcontrolschromatinstructureandproteininteractions.Science311，844-847(2006)·2.Jenuwein,T.&Allis，CD.Translatingthehistonecode.Science293，1074-1080(2001).3.Kouzarides,T.Chromatinmodificationsandtheirfunction.Cell128，693-705(2007).4.Gu,W.&Roeder,R.G.Activationofp53sequence-specificDNAbindingbyacetylationofthep53C_terminaldomain.Cell90，595-606(1997)·5.Groth,A.，Rocha，W.，Verreault，A.&Almouzni,G.ChromatinchallengesduringDNAreplicationandrepair.Cell128，721-733(2007)·6.Peterson,CL.&Cote,J.CellularmachineriesforchromosomalDNArepair.GenesDev18，602-616(2004)·7.Hubbert,C.etal.HDAC6isamicrotubule-associateddeacetylase.Nature417，455-458(2002).8.Serrador,J.M.etal.HDAC6deacetylaseactivitylinksthetubulincytoskeletonwithimmunesynapseorganization.Immunity20，417-428(2004)·9.Yang,XJ.&Gregoire，S.Metabolism,cytoskeletonandcellularsignallinginthegripofproteinNepsiIon—and0-acetylation.EMBORep8，556-562(2007).10.Scroggins，B.T.etal.AnacetylationsiteinthemiddledomainofHsp90regulateschaperonefunction.MoICell25，151-159(2007)·11.Bannister,A.J.，Miska，E.A.，Gorlich，D.&Kouzarides,Τ.Acetylationofimportin-alphanuclearimportfactorsbyCBP/p300.CurrBiol10,467-470(2000).12.Yuan，Z.L，Guan,Y.J.，Chatterjee,D.&Chin，Y.E.Stat3dimerizationregulatedbyreversibleacetylationofasinglelysineresidue.Science307，269-273(2005).13.Cohen,H.Y.etal.AcetylationoftheCterminusofKu70byCBPandPCAFcontrolsBax-mediatedapoptosis.MoICell13,627-638(2004).14.Kouzarides，T.Acetylation:aregulatorymodificationtorivalphosphorylation？EmboJ19，1176—1179(2000).15.Hao,B.etal.AnewUAG-encodedresidueinthestructureofamethanogenmethyltransferase.Science296，1462-1466(2002)·16.Srinivasan，G.，James，CM.&Krzycki,J.A.PyrrolysineencodedbyUAGinArchaea:chargingofaUAG-decodingspecializedtRNA.Science296，1459-1462(2002).17.Blight,S.K.etal.DirectchargingoftRNA(CUA)withpyrrolysineinvitroandinvivo.Nature431，333—335(2004)·18.Ambrogelly,A.etal.PyrrolysineisnothardwiredforcotranslationalinsertionatUAGcodons.ProcNatlAcadSdUSA104,3141-3146(2007).19.Polycarpo,CR.etal.Pyrrolysineanaloguesassubstratesforpyrrolysyl-tRNAsynthetase.FEBSLett580，6695-6700(2006).20.Kim,S.Cetal.Substrateandfunctionaldiversityoflysineacetylationrevealedbyaproteomicssurvey.MoICell23,607-618(2006).21.Allfrey,V.G.，F(xiàn)aulkner,R.&Mirsky，A.E.AcetylationandMethylationofHistoriesandTheirPossibleRoleintheRegulationofRnaSynthesis.ProcNatlAcadSdUSA51,786-794(1964).22.Chin,J.W.，Martin,A.B.，King,D.S.，Wang,L.&Schultz，P.G.AdditionofaphotocrosslinkingaminoacidtothegeneticcodeofEscherichiacoli.ProcNatlAcadSdUSA99，\\020_11024(2002).23.Kavran,J.M.etal.Structureofpyrrolysy1-tRNAsynthetase,anarchaealenzymeforgeneticcodeinnovation.ProcNatlAcadSdUSA104,11268-11273(2007).24.Blander,G.&Guarente,L.TheSir2familyofproteindeacetylases.AnnuRevBiochem73，417-435(2004).25.Schwer,B.,Bunkenborg,J.,Verdin"R.0.,Andersen,J.S.&Verdin,E.Reversiblelysineacetylationcontrolstheactivityofthemitochondrialenzymeacetyl-CoAsynthetase2.ProcNatlAcadSdUSA103，10224-10229(2006)·26.Luger,K.,Mader,A.W.,Richmond,R.K.,Sargent,D.F.&Richmond，T.J.CrystalstructureofthenucIeosomecoreparticleat2.8Aresolution.Nature389，251-260(1997).27.Wang,K.,Neumann,H.,Peak-Chew,S.Y.&Chin,J.W.Evolvedorthogonalribosomesenhancetheefficiencyofsyntheticgeneticcodeexpansion.NatBiotechnol25，770-777(2007).28.Santoro,S.W.，Wang,L.，Herberich,B.，King,D.S.&Schultz，P.G.Anefficientsystemfortheevolutionofaminoacy1-tRNAsynthetasespecificity.NatBiotechnol20，1044-1048(2002).29.Rackham,0.&Chin,J.W.AnetworkoforthogonalribosomeχmRNApairs.NatChemBiol1,159-166(2005).30.Christ,D.,Famm,K.&Winter,G.Tappingdiversitylostintransformations-invitroamplificationofligationreactions.NucleicAcidsJt0S34，el08(2006).以上說(shuō)明書(shū)中提到的所有公開(kāi)物均通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明描述的各方面和實(shí)施方式的各種改變和變體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是顯而易見(jiàn)的，而不脫離本發(fā)明的范圍。盡管已就具體優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍絕不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施方式。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的實(shí)施本發(fā)明所述方式的各種改變都落入權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求tRNA合成酶，其能夠結(jié)合Nε乙酰賴氨酸。2.如權(quán)利要求1所述的tRNA合成酶，其中所述合成酶包含與MbPylRS氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽。3.如權(quán)利要求2所述的tRNA合成酶，其中所述tRNA合成酶包含對(duì)應(yīng)于MbPylRS中至少L266至C313的氨基酸序列或與其具有至少90%同一性的氨基酸序列。4.如權(quán)利要求3所述的tRNA合成酶，其中所述多肽包含相對(duì)于野生型MbPylRS序列而言在L266、L270、Y271、L274或C313中的一個(gè)或多個(gè)位置的突變。5.如權(quán)利要求4所述的tRNA合成酶，其中所述至少一個(gè)突變?cè)贚270、Y271、L274或C313位置。6.如權(quán)利要求5所述的tRNA合成酶，其中所述至少一個(gè)突變?cè)贚270、L274或C313位置。7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的tRNA合成酶，其包含Y271L。8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的tRNA合成酶，其包含Y271F。9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的tRNA合成酶，其包含L266V。10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的tRNA合成酶，其包含L270I、Y271L、L274A和C313F。11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的tRNA合成酶，其包含L266V、L270I、Y271F、L274A和C313F。12.一種核酸，其包含編碼前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽的核苷酸序列。13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多肽向tRNA負(fù)載Ne-乙酰賴氨酸的應(yīng)用。14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中所述tRNA包含MbtRNAeuA。15.制備包含N、乙酰賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括安排翻譯編碼所述多肽的RNA，其中所述RNA包含琥珀密碼子，其中所述翻譯在權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多肽存在下、能夠負(fù)載Ne-乙酰賴氨酸的tRNA存在下、且N、乙酰賴氨酸存在下進(jìn)行。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述翻譯在脫乙酰化抑制劑存在下進(jìn)行。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抑制劑包含煙酰胺(NAM)。18.制備包含N、乙酰賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括修飾編碼所述多肽的核酸，以在對(duì)應(yīng)于所述多肽中需要摻入N、乙酰賴氨酸的位置的一個(gè)或多個(gè)位置提供琥珀密碼子。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中修飾所述核酸包括將編碼賴氨酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子(TAG)。20.一種均質(zhì)重組蛋白，其包含Νε-乙酰賴氨酸。21.如權(quán)利要求20所述的均質(zhì)重組蛋白，其中所述蛋白通過(guò)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)所述的方法制備。22.—種載體，其包含權(quán)利要求12所述的核酸。23.如權(quán)利要求22所述的載體，其中所述載體還包含編碼所述tRNA合成酶的tRNA底物的核酸序列。24.如權(quán)利要求23所述的載體，其中所述tRNA底物由MbPylT基因編碼。25.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求12所述的核酸，或包含權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的載體。26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞，其還包含失活的脫乙?；富颉?7.如權(quán)利要求26所述的細(xì)胞，其中所述失活的脫乙?；富虬ㄈ笔Щ蚱茐牡腃obB028.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的載體或包含權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，和一定量的煙酰胺。29.制備能夠結(jié)合Ne-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶的方法，所述方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的一個(gè)或多個(gè)位置突變編碼親本tRNA合成酶的核酸，和選擇能夠結(jié)合『_乙酰賴氨酸的一個(gè)或多個(gè)突變體。30.基本如本文所述的大分子或方法。全文摘要本發(fā)明涉及能夠結(jié)合Nε-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶。特別地，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合Nε-乙酰賴氨酸的tRNA合成酶，其中所述合成酶包含與MbPylRS氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。本發(fā)明還涉及制備包含Nε-乙酰賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括安排翻譯編碼所述多肽的RNA，其中所述RNA包含琥珀密碼子，其中所述翻譯在權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多肽存在下、能夠負(fù)載有Nε-乙酰賴氨酸的tRNA存在下、且Nε-乙酰賴氨酸存在下進(jìn)行。文檔編號(hào)C12P21/00GK101910403SQ200880123295公開(kāi)日2010年12月8日申請(qǐng)日期2008年10月27日優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日發(fā)明者海因茨·諾伊曼,賈森·欽申請(qǐng)人:醫(yī)藥研究委員會(huì)