專利名稱：帶有修飾堿基的寡核苷酸在核酸雜交中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有特異性修飾的DNA堿基的修飾的寡核苷酸的應(yīng)用，用于核酸雜 交、核酸擴(kuò)增(例如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))和siRNA介導(dǎo)的基因沉默(RNAi)。
背景技術(shù)：
寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的應(yīng)用在現(xiàn)代療法中是極為重要的，并已經(jīng)有詳 盡記錄(Uhlmann 等，Antisense oligonucleotides :A newtherapeutic principle. (反義寡核苷酸新的治療原理)Chemical Reviewsl990,90 =543-584 ；Crooke等《反義 石if 究禾口 應(yīng)用》(Antisense Researchand Applications), CRC Press (1993) ；Mesmaekar 等，“Antisenseoligonucleotides “(反義寡核苷酸)，Ace. Chem. Res. 1995, 28 366-374 ；Stein. “ The experimental use of antisense oligonucleotides :a guide for theperplexed.“(反義寡核苷酸的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用困惑指南)J. Clin. Invest. 2001，108， 641-644)。反義多核苷酸與DNA或RNA靶的特異性結(jié)合，可以使核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯失 活，從而提供了用于控制疾病例如癌癥和病毒感染的機(jī)制。因此，反義寡核苷酸與靶的結(jié)合 可用于在各種不同的情況下改變基因表達(dá)，例如干擾病毒的生命周期或癌細(xì)胞的生長。結(jié)合性寡核苷酸的陣列，已經(jīng)成為生物技術(shù)業(yè)和相關(guān)領(lǐng)域中越來越重要的工具。 這些沉積在固相載體表面上的陣列應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括藥物篩選、核酸測序、突變分析寸。例如，核酸雜交已經(jīng)變成鑒定、測量和檢測特定核酸在給定樣品中的存在的越來 越重要的手段。因此，醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)、環(huán)境和食品檢測，都受益于使用核酸雜交作為測試樣 品中給定生物污染物或微生物的存在或不存在的快速、簡單和精確的方式。從機(jī)械上說，核 酸雜交利用了單鏈核酸與具有互補(bǔ)核苷酸序列的核酸鏈的相應(yīng)區(qū)域形成穩(wěn)定的雜交體的 能力。這樣的雜交體通常由雙鏈的雙鏈體組成，盡管三鏈結(jié)構(gòu)也是已知的。在核酸雙鏈體 中，每個堿基對都對穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)。因此，雙鏈體越短，每個單獨(dú)的堿基對對雙鏈體穩(wěn)定性 的相對貢獻(xiàn)越大。因此，對于較短的寡核苷酸來說，完美匹配與錯配之間穩(wěn)定性的差異將較 大。但是，因?yàn)槎痰墓押塑账犭s交弱，可以使用結(jié)合更強(qiáng)的核苷酸來增強(qiáng)它。已經(jīng)開發(fā)了許多方法用于核酸的指數(shù)擴(kuò)增。它們包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶 鏈反應(yīng)(LCR)、自動維持序列擴(kuò)增(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA) 以及使用Q-Beta復(fù)制酶的擴(kuò)增。PCR的成功依賴于與DNA單鏈結(jié)合的引物的效率。同樣， 結(jié)合越強(qiáng)，在給定循環(huán)中擴(kuò)增的DNA越多。目前認(rèn)為，哺乳動物中RNA誘導(dǎo)的基因沉默涉及最少三種不同水平的控制(i)轉(zhuǎn) 錄失活(siRNA指導(dǎo)的DNA和組蛋白甲基化)；(ii)小干擾RNA(siRNA)誘導(dǎo)的mRNA降解； 以及(iii)mRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄弱化。通過siRNA產(chǎn)生的RNA干擾(RNAi)可以在多次細(xì)胞分裂過程中長期持續(xù)和有效。因此，通過siRNA介導(dǎo)的方法評估基因功能以及開發(fā)用于過表 達(dá)基因的療法的能力，代表了激動人心的有價值的工具，將加速基因功能分析、藥物靶驗(yàn)證 和基因組范圍的研究。在所有上述領(lǐng)域中，已經(jīng)嘗試了通過使用修飾的核苷酸來增加效率。因此，已經(jīng)構(gòu) 建了許多在含氮堿基處具有修飾的寡核苷酸衍生物，包括將腺苷6位的氨基用氫取代產(chǎn)生 嘌呤；將鳥苷的6-酮基氧用氫取代產(chǎn)生2-氨基嘌呤，或用硫取代產(chǎn)生6-硫代鳥苷，以及將 胸苷的4-酮基氧用硫或氫取代，分別產(chǎn)生4-硫代胸苷或4-氫胸苷。所有這些核苷酸類似 物可以用作反應(yīng)試劑來合成寡核苷酸。同樣地，已經(jīng)報道了許多核苷酸衍生物具有呋喃核 糖或呋喃脫氧核糖部分的修飾。大多數(shù)含有這樣的修飾堿基的寡核苷酸的配制，是著眼于 增加細(xì)胞攝入、核酸酶抗性和/或增加底物的結(jié)合。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有修飾的核堿基的寡核苷酸，這增加了它們與互補(bǔ)核酸結(jié)合的能 力，并可以增加它們與核酸互補(bǔ)鏈的雜交。依賴于所公開的化合物的寡核苷酸部分中修飾 的核堿基的數(shù)量性質(zhì)，化合物與互補(bǔ)靶核酸的結(jié)合能力，與典型的互補(bǔ)寡核苷酸相比，可以 顯著增加。本發(fā)明的主題是在核酸的雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和siRNA介導(dǎo)的基因沉默 (RNAi)中這樣的修飾的寡核苷酸類似物的應(yīng)用。本發(fā)明的一個方面是用作核酸雜交的標(biāo)記 探針的寡核苷酸類似物。該雜交尤其包括將探針與DNA雜交(例如Southern雜交)、與RNA 雜交(例如Northern雜交)，將探針與結(jié)合在芯片上的任何核酸序列雜交等。本發(fā)明的另 一方面是在PCR反應(yīng)過程中用作PCR引物的一種寡核苷酸類似物或一對或多對寡核苷酸類 似物。這些PCR反應(yīng)包括例如常規(guī)PCR、實(shí)時PCR、反向錄PCR等，概括地說包括下述的所有 不同反應(yīng)，所述反應(yīng)中發(fā)生磷酸二酯鍵的重復(fù)催化合成，通過用高溫變性先前合成的雙鏈 核酸鏈來打斷合成。本發(fā)明的另一方面是寡核糖核苷酸類似物，其與未修飾的寡核糖核苷 酸或可以選擇與另一個修飾的寡核糖核苷酸一起使用，以退火短干擾RNA(SiRNA)，并使用 該退火的siRNA來沉默與相應(yīng)siRNA互補(bǔ)的核酸序列。所提到的siRNA可以使用轉(zhuǎn)染、微 注射、轟擊、病毒載體或其他技術(shù)，導(dǎo)入到細(xì)胞中。所提到的沉默意味著例如靶核酸的序列 特異性降解或靶核酸的序列特異性翻譯抑制。有鑒于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸超常的結(jié)合力，本發(fā)明的一個方面是抑制靶核酸 表達(dá)的方法，包括將已知序列的靶核酸與具有與所述靶核酸的鏈至少部分互補(bǔ)的核堿基序 列的修飾的寡核苷酸，在允許修飾的寡核苷酸與靶核酸的鏈雜交的條件下相接觸，其中雜 交的修飾的寡核苷酸抑制了靶核酸的表達(dá)，其中修飾的寡核苷酸包含5到150個核堿基，其 中修飾的寡核苷酸的至少一個核堿基是修飾的核堿基，選自5_巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧 唳，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基 鳥嘌呤。一個方面，靶核酸的表達(dá)被抑制至少20 %。在某些方面，靶核酸是RNA，在其他方 面修飾的寡核苷酸本質(zhì)上是單鏈的。在某些方面，修飾的寡核苷酸與另一個寡核苷酸一起 使用，并且是雙鏈的，其中兩條鏈中的至少一條鏈?zhǔn)呛兄辽僖粋€修飾的核堿基的修飾的 寡核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及細(xì)胞中的靶核酸，以及修飾的寡核苷酸與靶核酸的接觸，包括將修飾的寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中。在這些方面的一些中，接觸選自用修飾的寡核苷酸 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在其他方面，靶核酸在生物體的細(xì)胞中，接觸包括向生物體施用含有修飾的寡核 苷酸和可藥用載體的組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物還包含投送載體，例如脂質(zhì)體。在 各種不同方面，生物體是哺乳動物，在其他方面是人類。除了上述之外，作為另外的情況，本發(fā)明包括了使用修飾的寡核苷酸檢測靶核酸 的方法，包括將靶核酸與修飾的寡核苷酸，在允許修飾的寡核苷酸與所述靶核酸(可以具 有1、2條或更多的鏈，通常為1或2條鏈)的鏈雜交的條件下相接觸，其中修飾的寡核苷酸 包含與靶核酸鏈的序列至少部分互補(bǔ)的核堿基序列，并且其中修飾的寡核苷酸的至少一個 核堿基是修飾的核堿基，選自5_巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌 呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤；并且通過檢測與靶核 酸鏈雜交的修飾的寡核苷酸來檢測靶核酸。在某些方面，靶核酸被固定化到固相載體上。在其他方面，固定化的靶核酸是DNA 或RNA。在某些上述的方面，檢測在本質(zhì)上是定量的。例如，雜交的測量為靶核酸的量提供 了絕對或相對的量度。本發(fā)明的另一方面是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，包括將模板核酸與修飾的寡核苷 酸相接觸，所述修飾的寡核苷酸包含與模板核酸的一部分充分互補(bǔ)的序列，從而允許修飾 的寡核苷酸與模板核酸在PCR退火條件下雜交，其中雜交的修飾的寡核苷酸在PCR擴(kuò)增條 件下用作PCR引物，以產(chǎn)生第一條PCR產(chǎn)物鏈，并且其中修飾的寡核苷酸包含5到150個核 堿基，其中至少一個核堿基是修飾的核堿基，選自5_巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基 鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。在某些方面，PCR包括制備含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶、模板核酸、修飾的寡核苷酸和 核苷酸(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的反應(yīng)混合物。在PCR反應(yīng)中使用的試劑，包括 MgCl2、緩沖液等，是眾所周知的。在其他方面，PCR反應(yīng)混合物還包含第二種寡核苷酸，它含有與靶核酸鏈的一部分 或第一條PCR產(chǎn)物鏈的一部分之一互補(bǔ)的核苷酸序列。在各種不同方面，第二種寡核苷酸 是修飾的寡核苷酸，其中修飾的寡核苷酸含有5到150個核堿基，其中至少一個核堿基是修 飾的核堿基，選自5_巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基 胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。在某些方面，模板核酸是DNA，而 在其他方面模板核酸是RNA。本發(fā)明還提供了其中擴(kuò)增產(chǎn)物被實(shí)時定量的方法。在其他方面，聚合酶鏈反應(yīng)包含使模板核酸變性、將修飾的寡核苷酸與模板核酸 在退火條件下退火、以及通過延伸退火的修飾的寡核苷酸合成聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的重復(fù)的步驟。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸包含可檢測的標(biāo)記。在某些方面，本發(fā)明的方法提供的雜交條件包括4到10之間的pH。在其他方面， 雜交條件包括4到6之間的pH。在本發(fā)明的某些變體中，預(yù)期本發(fā)明提供的修飾的寡核苷酸具有10到100個核堿 基的長度。在各種不同的方面，修飾的寡核苷酸的長度為10到50個核堿基。在其他方面，修飾的寡核苷酸的長度為20到30個核堿基。在某些方面，修飾的寡核苷酸中0. 5%到40%的核堿基是巰基-或羥基-核堿基。除了上述之外，作為其他方面，本發(fā)明包括了以任何方式在范圍上比上面具體提 到的變體更窄的本發(fā)明的所有實(shí)施方案。例如，盡管出于簡要的目的，本發(fā)明的情況已經(jīng)可 以用類屬或值的范圍進(jìn)行描述作為參考，但應(yīng)該理解，類屬的每個成員和范圍內(nèi)的每個值 或子范圍都旨在作為本發(fā)明的方面。同樣地，本發(fā)明的各種不同方面和特點(diǎn)可以組合，產(chǎn)生 旨在處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)的其他方面。以單數(shù)形式(包括使用不帶數(shù)量指示的名詞形式)描述的本發(fā)明的方面，應(yīng)該被 理解為包括了包含一或一以上的實(shí)施方案，除非上下文明顯需要較狹義的解釋。術(shù)語“包 含”旨在允許附加的要素或特點(diǎn)。盡管申請人發(fā)明了隨附的權(quán)利要求書的整個范圍，但隨附的權(quán)利要求書不打算在 其范圍內(nèi)包含其他人的現(xiàn)有技術(shù)的工作。因此，在專利局或其他團(tuán)體或個人就權(quán)利要求范 圍內(nèi)法定的現(xiàn)有技術(shù)提請申請人注意的情況下，申請人保留在可適用專利法規(guī)下行使修改 權(quán)來重新限定所述權(quán)利要求的主題內(nèi)容，以便從這樣的權(quán)利要求范圍內(nèi)具體排除這些法定 現(xiàn)有技術(shù)或法定現(xiàn)有技術(shù)的明顯變體的權(quán)利。由這樣的修改的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的 變體也打算作為本發(fā)明的方面。附圖簡述

圖1描繪了濃度為Ipmol的修飾的寡核苷酸的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖2描繪了濃度為5pmol的修飾的寡核苷酸的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖3描繪了修飾的寡核苷酸與Ing DNA的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖4描繪了修飾的寡核苷酸與5ng DNA的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖5描繪了修飾的寡核苷酸在雜交中的效率。圖6描繪了修飾的寡核苷酸與1. 25ng互補(bǔ)mRNA的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖7描繪了修飾的寡核苷酸與2. 5ng互補(bǔ)mRNA的相對結(jié)合效率的多項(xiàng)式擬合。圖8描繪了對于不同靶濃度來說，寡核苷酸fl在不同PH值下相對結(jié)合效率的多 項(xiàng)式擬合。圖9描繪了對于不同靶濃度來說，寡核苷酸f2在不同pH值下相對結(jié)合效率的多 項(xiàng)式擬合。圖10描繪了修飾的寡核苷酸在PCR中的利用。顯示了帶有修飾堿基的寡核苷酸 相對于PCR中增加的退火溫度的適用性和效率。圖11描繪了修飾的siRNAs對eGFP轉(zhuǎn)入基因表達(dá)的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了含有寡核苷酸的新的化合物，它具有用于反義和其他使用寡核苷酸 的方法的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物包括具有一個或多個修飾的核堿基的反義和其他寡核苷 酸，它們與天然核堿基具有高的結(jié)合效率。包含修飾的寡核苷酸的化合物可用于核酸的雜 交、PCR和siRNA介導(dǎo)的基因沉默(RNAi)。寡核苷酸在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“寡核苷酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA) 的寡聚物或多聚物，或其模擬物、嵌合體、類似物和同系物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿
7基、糖和共價的核苷間(骨架)連鍵組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷 酸，這些非天然存在的部分在例如與靶核酸雜交或與互補(bǔ)寡核苷酸相互作用時，以類似天 然存在的寡核苷酸的方式發(fā)揮作用。這樣的修飾的或取代的寡核苷酸與天然形式相比往往 是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兙哂衅谕男再|(zhì)，例如細(xì)胞攝入增強(qiáng)、對靶核酸的親和性增加和在存在 核酸酶情況下穩(wěn)定性增加。本發(fā)明的化合物與生物學(xué)配對物(例如RNA和/或DNA)結(jié)合的增強(qiáng)的效率，是通 過摻入修飾的核堿基或其他具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類似物來獲得的。本發(fā)明的 化合物有至少一個核堿基具有修飾的核堿基或其他具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類 似物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的核堿基是選自5-羥基胞嘧啶和8-羥基鳥嘌呤的羥基核堿 基，或選自5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥嘌呤和8-巰基腺嘌呤的巰基核堿基。 正如在引為參考的美國專利公布US20070259830和國際專利公布WO 2007/125173中證明 的，在羥基核堿基或巰基核堿基與靶核酸的核堿基之間可以發(fā)生更穩(wěn)定的氫鍵結(jié)合，因此 它們可以被認(rèn)為與互補(bǔ)核酸鏈更有效地結(jié)合。修飾的核堿基中酸性互變異構(gòu)基團(tuán)可以是任何其他的酸性基團(tuán)，例 如-SH、-C00H、-SO3H 等。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸包含5-羥基尿嘧啶陰離子的一種或多種互變異構(gòu) 形式。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包括羥基堿基5-羥基胞嘧啶。在另一個實(shí)施 方案中，羥基堿基是8-羥基腺嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)形式。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案 提供了由8-羥基鳥嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)形式修飾的本發(fā)明的化合物。這些核堿基 的互變異構(gòu)形式在WO 2007/125173中更詳細(xì)地描述，該專利在此引為參考。本文中考慮到的其他修飾的核堿基包括巰基修飾的核堿基。巰基修飾的嘧啶和嘌 呤的合成在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見例如《雜環(huán)化合物化學(xué)嘧啶》，增補(bǔ)本1，第16冊 (Chemistry of HeterocyclicCompounds :The Pyrimidines, Supplement 1, Volume 16), D. J. Brown 主編，John ffiley&Sons, Inc. , 1970, pp. 202-229 ；以及 Khalyullin 等“縮合的嘌 Πφ" (Condensed purines), Pharmaceutical Chemistry Journal，1992，26 :270_284)?？?慮到的巰基核堿基包括5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥嘌呤和8-巰基腺嘌呤。在本文中使用時，每個羥基核堿基當(dāng)與相對的核堿基穩(wěn)定地形成氫鍵時，被認(rèn)為 與該核堿基互補(bǔ)。因此，在某些情況下，5-羥基尿嘧啶與腺嘌呤互補(bǔ)，5-羥基胞嘧啶與鳥嘌 呤互補(bǔ)，8-羥基腺嘌呤與尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互補(bǔ)，8-羥基鳥嘌呤與胞嘧啶互補(bǔ)。羥基 核堿基與靶核酸的核堿基可以發(fā)生其他穩(wěn)定的氫鍵鍵合，因此羥基核堿基被認(rèn)為同與其發(fā) 生穩(wěn)定的氫鍵鍵合的靶核酸的核堿基互補(bǔ)。在本發(fā)明的給定化合物中，羥基核堿基和/或巰基核堿基的數(shù)量，是化合物的寡 核苷酸部分的核堿基總數(shù)的至少到最高100%。在本發(fā)明的化合物中存在一種以上羥 基核堿基或巰基核堿基的情況下，羥基核堿基或巰基核堿基可以是相同的或不同的(以不 同堿基和/或修飾類型的任何組合)。預(yù)期在本文描述的寡核苷酸中，10%到90%、20%到 80%,30%到70%、40%到60%或50%的核堿基是修飾的核堿基。此外，預(yù)期10、20、30、40、 50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%的核堿基是修飾的核堿基。本發(fā)明的化合物優(yōu)選包含大約5到大約150個核堿基(即從大約5到大約150 個連接的核苷)。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明包含了長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149和150個核堿基的化合物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長度為10到100個核堿基。本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這包含了長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99或100個核堿基的化合物。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長度為10到50個核堿基。本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這包含了長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50個核堿基的化合物。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長度為20到30個核堿基。本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這包含了長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個 核堿基的化合物。特別優(yōu)選的化合物是從大約10到大約50個核堿基的寡核苷酸，更優(yōu)選是含有大 約20到大約30個核堿基的寡核苷酸，在樣品測試中用作抗病毒劑的化合物由21或23個 核堿基構(gòu)成。正如上面陳述的，寡核苷酸可以包含100%修飾的核堿基。照此，依賴于寡核苷酸 的長度，寡核苷酸可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 或 150 個修飾的核堿基， 其中修飾的堿基是巰基核堿基或羥基核堿基。本發(fā)明的化合物任選還包含螯合性部分。螯合性部分起到金屬配體的作用。它們 能夠穩(wěn)定地螯合金屬離子。某些金屬配體復(fù)合物已被顯示能夠有效地切開磷酸二酯鍵。在 具有反義活性的寡核苷酸中引入螯合性部分，由于其降解或切開靶核酸的一個或多個磷酸 二酯鍵的能力，增加了寡核苷酸抑制靶核酸的功效。因此，本發(fā)明的化合物進(jìn)一步包含了能 夠螯合金屬離子的螯合性部分。金屬離子選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、 銩、鐿和镥。在一個方面，優(yōu)選的離子是銪或鑭離子。金屬離子可以是任何穩(wěn)定的離子，例 如 +1、+2、+3、+4 或 +5 離子。優(yōu)選的離子是 La (III)、Eu (III)、Ho (III)和 Ce ( IV )。
考慮到的螯合性部分包括由下面描述的式所表示的螯合性部分其中R是寡核苷酸的其余部分；
權(quán)利要求
一種抑制靶核酸表達(dá)的方法，所述方法包括將已知序列的靶核酸和具有與所述靶核酸的鏈至少部分互補(bǔ)的核堿基序列的修飾的寡核苷酸，在允許所述修飾的寡核苷酸與所述靶核酸的鏈雜交的條件下相接觸，其中雜交的修飾的寡核苷酸抑制靶核酸的表達(dá)，其中修飾的寡核苷酸包含5到150個核堿基，并且其中修飾的寡核苷酸的至少一個核堿基是修飾的核堿基，所述修飾的核堿基選自5 巰基胞嘧啶，5 巰基尿嘧啶，8 巰基鳥嘌呤，8 巰基腺嘌呤，5 羥基胞嘧啶，5 羥基尿嘧啶，8 羥基腺嘌呤和8 羥基鳥嘌呤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)被抑制至少20%。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中修飾的寡核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其中RNA是單鏈的。
5.權(quán)利要求3的方法，其中RNA是雙鏈的，并且其中RNA的至少一條鏈包含至少一個修 飾的核堿基。
6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中靶核酸在細(xì)胞中，并且接觸包括將修飾的寡核苷 酸導(dǎo)入到細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求6的方法，其中接觸選自用修飾的寡核苷酸轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中靶核酸在生物體的細(xì)胞中，并且其中接觸包括向 生物體施用含有修飾的寡核苷酸和可藥用載體的組合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中生物體是哺乳動物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中生物體是人類。
11.一種使用修飾的寡核苷酸檢測靶核酸的方法，所述方法包括 將靶核酸與修飾的寡核苷酸在允許所述修飾的寡核苷酸與所述靶 核酸的鏈雜交的條件下相接觸，其中修飾的寡核苷酸包含與靶核酸鏈的序列至少部分互補(bǔ)的核堿基序列，以及 其中修飾的寡核苷酸的至少一個核堿基是修飾的核堿基，所述修飾的核堿基選自 5-巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧 啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤；并且通過檢測與靶核酸鏈雜交的修飾的寡核苷酸來檢測靶核酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中靶核酸被固定到固相載體上。
13.權(quán)利要求12的方法，其中固定化的靶核酸是DNA。
14.權(quán)利要求12的方法，其中固定化的靶核酸是RNA。
15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中檢測是定量的。
16.一種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，所述方法包括將模板核酸與修飾的寡核苷酸相接觸，所述修飾的寡核苷酸包含與模板核酸的一部分 充分互補(bǔ)的序列，從而允許所述修飾的寡核苷酸與所述模板核酸在PCR退火條件下雜交，其中雜交的修飾的寡核苷酸用作PCR引物，用于在PCR擴(kuò)增條件下產(chǎn)生第一條PCR產(chǎn) 物鏈，以及其中修飾的寡核苷酸包含5到150個核堿基，其中至少一個核堿基是修飾的核堿基，所 述修飾的核堿基選自5_巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。
17.權(quán)利要求16的方法，其中PCR包括制備含有熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、模板核酸、修飾的寡核苷酸和核苷酸的反應(yīng)混合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中PCR反應(yīng)混合物還包含第二種寡核苷酸，它含有與靶核酸 鏈的一部分或第一條PCR產(chǎn)物鏈的一部分之一互補(bǔ)的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中第二種寡核苷酸是修飾的寡核苷酸，其中修飾的寡核苷 酸含有5到150個核堿基，其中至少一個核堿基是修飾的核堿基，所述修飾的核堿基選自 5-巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧 啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。
20.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中模板核酸是DNA。
21.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中模板核酸是RNA。
22.權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增產(chǎn)物被實(shí)時定量。
23.權(quán)利要求16-22任一項(xiàng)的方法，其中聚合酶鏈反應(yīng)包含下列重復(fù)的步驟將模板核 酸變性，將修飾的寡核苷酸與模板核酸在退火條件下退火，以及通過延伸退火的修飾的寡 核苷酸而合成聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中修飾的寡核苷酸包含可檢測的標(biāo)記。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的方法，其中雜交條件包括pH在4到10之間。
26.權(quán)利要求25的方法，其中pH在4到6之間。
27.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中修飾的寡核苷酸具有10到100個核堿基的長度。
28.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中修飾的寡核苷酸具有10到50個核堿基的長度。
29.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中修飾的寡核苷酸具有20到30個核堿基的長度。
30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法，其中修飾的寡核苷酸中0.5%到40%的核堿基包括 巰基核堿基或羥基核堿基。
31.在靶核酸的擴(kuò)增方法中的改進(jìn)，所述方法包括將與靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的 寡核苷酸引物退火至靶核酸，所述改進(jìn)包括使用修飾的寡核苷酸作為寡核苷酸引物，其中 修飾的寡核苷酸包含一個或多個修飾的核堿基，所述修飾的核堿基選自5_巰基胞嘧啶， 5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌 呤和8-羥基鳥嘌呤。
32.權(quán)利要求31的改進(jìn)，其中擴(kuò)增方法是指數(shù)擴(kuò)增方法。
33.權(quán)利要求31的改進(jìn)，其中擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制靶核酸的表達(dá)，或者檢測靶核酸或者靶核酸的PCR擴(kuò)增，包括將修飾的至少部分互補(bǔ)的寡核苷酸與所述靶核酸的鏈雜交，其中的寡核苷酸包括下列修飾的核堿基中的一種5-巰基胞嘧啶，5-巰基尿嘧啶，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基腺嘌呤，5-羥基胞嘧啶，5-羥基尿嘧啶，8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。
文檔編號C12N15/113GK101983241SQ200880123480
公開日2011年3月2日 申請日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日
發(fā)明者埃蘭·奧斯佩特, 埃爾基·特魯維, 塞西莉亞·薩米恩托, 馬特·薩爾瑪, 馬蒂·卡拉爾森 申請人:波羅的科技發(fā)展有限公司