專利名稱：基本上無動物蛋白的重組體弗林蛋白酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及重組體弗林蛋白酶(rFurin)及生產(chǎn)rFurin的方法。更具體地說， 本發(fā)明涉及基本上無動物蛋白的rFurin以及生產(chǎn)基本上無動物蛋白rFurin的方法。
背景技術(shù)：
在生物機(jī)體中活性的或者成熟的蛋白質(zhì)通常存在的量是很低的。因此，它們的前 蛋白或者酶原在體內(nèi)優(yōu)選地通過它們與活化酶(比如蛋白酶)相接觸從而被活化。前蛋白 (或者蛋白前體)是沒有活性的蛋白，它們通過一種或多種的翻譯后修飾以及尤其是通過 將前肽從前蛋白中切除從而變得有活性。前蛋白的例子包括比如胰島素原、凝血酶原、前 馮威勒布蘭特因子(前VWF)等等。馮威勒布蘭特因子(VWF)是涉及凝血的血液糖蛋白。在馮威勒布蘭特病中，WF 是缺乏的或者是有缺陷的，并且VWF涉及其他許多疾病，包括血栓性血小板減少性紫癜、 Heyde' s綜合癥以及有可能的溶血的尿毒癥綜合癥。VWF是以一系列多聚體的形式在血漿 中循環(huán)的糖蛋白，大小范圍從大約500至20000kD。VWF的多聚體形式是由250kD的多肽亞 基組成，這些亞基通過二硫鍵相互連接。VWF介導(dǎo)初始的血小板粘附至受損傷的血管壁的內(nèi) 皮下膜，并且人們認(rèn)為只有大的VWF多聚體才能顯示出止血活性。具有大分子量的VWF多 聚體儲存在內(nèi)皮細(xì)胞的懷布爾-帕拉德體(Weibel-Pallade bodies)中，并且一旦受到刺 激就被釋放出來。釋放出來的VWF然后更進(jìn)一步地被血漿蛋白酶加工以便生成低分子量形 式的VWF。在人類體內(nèi)，前肽的去除幾乎是完全的，然而，在具有高水平的重組體VWF表達(dá)的 哺乳動物細(xì)胞系中，這個過程不是非常有效的。因此，來自于這種重組細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)上 清液中通常包含成熟VWF和VWF前體比如前VWF的混合物。為了獲得成熟的VWF，因此將 VffF前體尤其是前VWF轉(zhuǎn)化為成熟的VWF是必要的。這個過程通常是通過利用蛋白酶將前 肽切除來完成的。當(dāng)前生產(chǎn)成熟的VWF的常規(guī)方法是或者通過將VWF前體與蛋白酶在液相中一起 溫育，借此在游離溶液中呈未結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行自身熟化(即將前肽從前蛋白中切除)；或者如 同例如WO 00/49047所述，通過將蛋白酶固定在固體載體上，蛋白酶與含有前VWF的制品相 接觸并溫育(參見WO 00/49047)。但是，相對于根據(jù)本發(fā)明的方法，這些方法包括了許多缺
點ο工業(yè)上，VffF并且尤其是重組體VWF連同重組體因子VDI (rF VDI) 一起在基因工程 化的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系中被合成和表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，rVWF的共表達(dá)的作 用是用來穩(wěn)定rF VIL在細(xì)胞中rVWF是以前體的形式合成的，包含連接于N末端的大的前 肽。一旦在內(nèi)漿網(wǎng)和高爾基體中成熟，就通過細(xì)胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用將前肽切除，并
3且成熟蛋白質(zhì)以同樣的亞基均聚物形式被分泌出來，均聚物由被表達(dá)蛋白的二聚體組成。 然而，成熟過程一般是不完全的，導(dǎo)致產(chǎn)物包括前VWF和成熟VWF的混合物。以前的出版物已經(jīng)顯示，前VWF可以通過利用弗林蛋白酶或者類似弗林蛋白 酶的蛋白酶在體外加工處理而轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腣WF(Schlokat et al.，Biotechnol. Appl. Biochem. 24 :257-267，1996 ；Preininger et al. ,Cytotechnology 30 1-15，1999 ；以及 EP 0775750A)。尤其是，EP 0775750A建議將弗林蛋白酶和VWF重組地共表達(dá)以致于VWF可以 在原位發(fā)生成熟。通過將精氨酸741-絲氨酸742肽鍵切開，重組弗林蛋白酶(rFurin)將前rVWF(前 重組馮威勒布蘭特因子)轉(zhuǎn)換成rVWF。這個成熟步驟是用于治療馮威勒布蘭特病B型的 rVWF產(chǎn)生過程的一部分，以及是用于重組因子VDI -半衰期(rF VDI -HL)的生產(chǎn)過程的一部 分。弗林蛋白酶屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，并依賴于鈣離子(Ca2+)。弗林蛋白酶特異性地切 斷特定序列中C末端的精氨酸肽鍵，此序列包含1位和4位上的精氨酸。在人的許多蛋白 上都能發(fā)現(xiàn)此序列，表明弗林蛋白酶在許多人類前蛋白的成熟過程中起著重要的作用?；罨鞍椎纳a(chǎn)具有高度的臨床和診斷價值。例如，活性的或者成熟的蛋白比如 成熟的VWF，可以被用于控制血液凝固。本發(fā)明提供了改進(jìn)的基本上無動物蛋白的重組弗林 蛋白酶(rFurin)，用于隨后的活化蛋白的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明提供基本上無動物蛋白 的rFurin，用于將前VWF轉(zhuǎn)化為成熟的VWF。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了基本上無動物蛋白的重組弗林蛋白酶(rFurin)及其生產(chǎn)方法。這 種rFurin是基本上不含那些與rFurin的產(chǎn)生可能正常相關(guān)的其它蛋白，例如血清蛋白和 寄主細(xì)胞蛋白。這種rFurin使得隨后生產(chǎn)出具有高比活性和高純度的成熟蛋白，并且沒有 與rFurin制備中蛋白污染相關(guān)的副作用。更具體地說，此rFurin使得生產(chǎn)出具有高比活 性和高純度的成熟VWF。因此，本發(fā)明提供用于篩選重組寄主細(xì)胞并使之適應(yīng)化學(xué)確定的培 養(yǎng)基、表達(dá)被分泌進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的rFurin、以及細(xì)胞除去后的rFurin純化的方法。本發(fā)明中基本上無動物蛋白的rFurin包括rFurin制品或者組合物，此rFurin制 品或者組合物包括濃度范圍是大約0. 1至0. 6ng之間或以下蛋白/單位弗林蛋白酶活性、 或者大約2至11 μ g之間或以下蛋白/mL的寄主細(xì)胞蛋白，并且基本上沒有來自于培養(yǎng)基 中血清的污染蛋白。在一個實施例中，基本上無動物蛋白的rFurin包括rFurin制品，此 rFurin制品包括濃度范圍是大約O至0. 4pg之間或以下DNA/單位弗林蛋白酶活性、或者大 約O至24ng之間或以下DNA/mL的污染性寄主細(xì)胞DNA，并且基本上沒有來自于培養(yǎng)基中血 清的污染蛋白。本發(fā)明包括組合物，此組合物包含活性至少是10000U弗林蛋白酶/mL的基本上無 動物蛋白的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約11 μ g蛋白/mL的寄主細(xì)胞蛋白。這種組合 物同樣可以包含濃度小于大約l.Ong/U弗林蛋白酶活性的寄主細(xì)胞蛋白。在一個實施例 中，寄主細(xì)胞蛋白是來自于CHO細(xì)胞。在另一個實施例中，本發(fā)明包括組合物，此組合物包含活性至少是10000U弗林蛋 白酶/mL的基本上無動物蛋白的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約14ng DNA/mL的寄主細(xì) 胞DNA。在許多實施例中，這種組合物同樣可以包含濃度小于大約0. 5pg/U弗林蛋白酶活性的寄主細(xì)胞DNA。在一個實施例中，寄主細(xì)胞DNA是來自于CHO細(xì)胞。本發(fā)明也包括組合物，此組合物包含弗林蛋白酶比活性至少是大約100U/μ g的 基本上無動物蛋白的重組弗林蛋白酶和濃度小于大約11 μ g蛋白/mL的寄主細(xì)胞蛋白。這 種組合物同樣可以包含濃度小于大約l.Ong蛋白/U弗林蛋白酶活性的寄主細(xì)胞蛋白。在 一個實施例中，寄主細(xì)胞蛋白是來自于CHO細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步地包括組合物，此組合物包含弗林蛋白酶的比活性至少是大約 IOOU/Ug的基本上無動物蛋白的重組弗林蛋白酶和濃度小于大約14ng DNA/mL的寄主細(xì) 胞DNA。這種組合物同樣可以包含濃度小于大約0. 5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的寄主細(xì)胞 DNA。在一個實施例中，寄主細(xì)胞DNA是來自于CHO細(xì)胞。本發(fā)明同樣包括生產(chǎn)本申請中所述包含基本上無動物蛋白的重組弗林蛋白酶的 組合物的方法。這些方法包括下述步驟使寄主細(xì)胞適應(yīng)生長在逐漸降低血清濃度、直至所 有的血清從培養(yǎng)基中除去的培養(yǎng)基中。在另一個實施例中，此方法包括下述步驟使寄主 細(xì)胞由在含有血清的培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)移至在無血清的培養(yǎng)基中生長。在一個典型的實施例 中，寄主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明包括應(yīng)用本申請中所述的包含基本上無動物蛋白的重組弗林蛋白酶的組 合物的方法。這些應(yīng)用包括下述步驟在可將前肽從前蛋白中切除從而形成成熟蛋白的條 件下使前蛋白與組合物相接觸。rFurin可被用于任何通過弗林蛋白酶切割前蛋白而由前蛋 白形成成熟蛋白。在一個實施例中，此成熟蛋白是馮威勒布蘭特因子。在另一個實施例中， 此成熟蛋白是因子通。此外，本發(fā)明預(yù)期本發(fā)明的rFurin可用于通過rFurin切割的任何 前蛋白的體外和體內(nèi)加工。


根據(jù)附圖本發(fā)明給出更進(jìn)一步的闡述，如在下述圖1-18中所示。圖1描述了在本發(fā)明的一個實施方式中的被表達(dá)的活性rFurin蛋白酶構(gòu)建體。 rFurin構(gòu)建體在C末端的氨基酸577位點處截斷以便除去富含半胱氨酸的貫穿細(xì)胞膜和細(xì) 胞液的結(jié)構(gòu)域。圖2描述了 CHO/rFurin克隆#488-3產(chǎn)生的譜系。圖3顯示了 CHO/rFurin克隆#289-20產(chǎn)生的譜系。圖4描述了在PMCB#01和PMCB#04中的細(xì)胞種群中rFurin產(chǎn)生者的分布圖的比 較。在PMCB#04中80. 74%的細(xì)胞表達(dá)rFurin ；在PMCB#01中74. 06%的細(xì)胞表達(dá)rFurin。圖5顯示了 “Doehlert矩陣”，其中5個溫度與3個pH值組合得到7種溫度和pH 的組合。圖6顯示根據(jù)體積生產(chǎn)率數(shù)據(jù)的表面曲線圖分析。圖6中數(shù)據(jù)的坐標(biāo)被標(biāo)記為點。 表面顯示了假設(shè)的單個數(shù)據(jù)的相關(guān)性。圖7顯示了顯示溫度和PH對體積生產(chǎn)率的影響的等高線圖。圓點表明已經(jīng)通過 實驗測試的條件(pH/溫度)。圖8顯示了三維圖表的表面曲線圖，說明了溫度對體積生產(chǎn)率強(qiáng)烈的影響和pH對 體積生產(chǎn)率的微弱影響。圖9顯示了用三維顯示模型相關(guān)性的表面曲線圖；它表明了平方關(guān)系并且清楚地顯示了在36. 5°C下生長速率的最大值。圖10給出了根據(jù)比生產(chǎn)率的數(shù)據(jù)分析。比生產(chǎn)率與溫度及PH的相關(guān)性與體積生 產(chǎn)率所示的相似。圖11顯示，通過溫度從37°C降低至35. 1°C，體積生產(chǎn)率可以從大約200kU/L/d增 加至 540kU/L/d。圖12顯示了 rFurin的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染情況。0RFU06002和 0RFU07002系列的Capto-MMC洗脫物的條帶模式相互關(guān)聯(lián)度很高；所有樣品在大約60kDa 處顯示了明顯的弗林蛋白酶條帶。在0RFU06002系列的樣品中從MMCO1批次到MMC08批次 可以看見弗林蛋白酶條帶有分子量輕微降低的趨勢(圖12，泳道1-8)。圖13顯示通過使用單克隆抗弗林蛋白酶抗體的樣品的蛋白質(zhì)印跡分析。圖14顯示了 0RFU06002系列的rFurin樣品的等電聚焦((IEF)和隨后的蛋白質(zhì) 印跡法中rFurin特定的條帶模式。圖15顯示了 0RFU07002系列的rFurin樣品的等電聚焦(IEF)和隨后的蛋白質(zhì)印 跡法中rFurin特定的條帶模式。圖16顯示了 0RFU07002系列的rFurin樣品的等電聚焦(IEF)和隨后的蛋白質(zhì)印 跡法中rFurin的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。圖17顯示了弗林蛋白酶的反相HPLC，用于0RFU06002系列(Capto-MMC洗脫物) 的樣品。樣品通過C4RP-HPLC檢測以便建立rFurin的指紋圖譜。圖18顯示了弗林蛋白酶的反相HPLC，用于0RFU07002系列(Capto-MMC洗脫物) 的樣品。樣品通過C4RP-HPLC檢測以便建立rFurin的指紋圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明涉及重組寄主細(xì)胞系的開發(fā)和生產(chǎn)，此寄主細(xì)胞系能夠在無血清培養(yǎng)基中 生長并且分泌活性重組弗林蛋白酶(rFurin)至細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。在一個實施例中，經(jīng)選 擇用于轉(zhuǎn)染編碼重組弗林蛋白酶質(zhì)粒的寄主細(xì)胞系與用于重組因子VDI和重組VWF表達(dá)的 寄主細(xì)胞系相同。生成的rFurin然后被純化，所以rFurin基本上不含動物蛋白。弗林蛋白酶，也已知為比如PACE、PACE4、PC1/PC3、PC2、PC4和PC5/PC6，都屬于枯 草桿菌蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶組，在前蛋白的切割上起重要作用，尤其是在分泌合成中 (Van de Ven et al.，Crit. Rev. Oncogen. 4 :115_136，1993)。前蛋白是通過高爾基體中的 內(nèi)源蛋白酶在翻譯后、胞內(nèi)加工成成熟形式。蛋白酶的切割位點包括具有精氨酸-χ-賴氨 酸/精氨酸_精氨酸的氨基酸序列特征的可識別序列。蛋白酶弗林蛋白酶可特異性地在此 共有序列之后切割前蛋白(Hosaka et al.，J. Biol. Chem. 266 12127-12130，1991)。人和小鼠的弗林蛋白酶的DNA和氨基酸序列、以及具有枯草桿菌蛋白酶樣的蛋 白酶功能的其它蛋白質(zhì)已經(jīng)被鑒定(Roebroek等人，MoI. Biol. Rep. 11 :117_125，1986 ； Roebroek 等人，EMBO J. 5 :2197_2202，1986 ；Barr 等人，DNA Cell Biol. 10 :319_328，1991 ； Van denOuweland ^A, Nucleic Acids Res. 17 7101-7102,1989 ；Van den Ouweland φ 人，NucleicAcids Res. 18 :664，1990 ；Smeekens 等人，1990，J. Biol. Chem. 265 2997-3000 ； Smeekens 等人，Proc. Natl. Acad. ScL USA. 88 ；340-344,1991 ；Kiefer ^ A, DNA Cell Biol. 10 757,1991 ；Nakayama 等人，J. Biol. Chem. 267 5897-5900,1992 ； VX R Hatsuzawa
6等人，J. Biol. Chem. 265 =22075-22078,1990)。人的弗林蛋白酶基因編碼由794個氨基酸 組成的蛋白質(zhì)，特定的功能被分配至各個特征性區(qū)域催化中心，中間結(jié)構(gòu)域，富含胱氨酸 區(qū)域，跨膜結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Van de Ven et al.，Crit. Rev. Oncogen. 4 :115_136， 1993)。在一個實施例中，被陳述的人弗林蛋白酶多肽的GenBank登錄號是EAX02111(國 立生物技術(shù)信息中心，美國國家醫(yī)學(xué)圖書館，Bethesda，馬里蘭州)。然而，本領(lǐng)域中技術(shù)人 員會理解，任何具有弗林蛋白酶生物活動性即切割前蛋白的能力(比如前VWF生成成熟的 VffF)的蛋白，都能通過本文描述的方法來生產(chǎn)。完整的弗林蛋白酶被吞進(jìn)入高爾基體的薄膜系統(tǒng)，在此它在是有功能活性的。被 過量表達(dá)的75-80kD的天生的弗林蛋白酶的截斷形式能夠作為分泌性蛋白在細(xì)胞上清液 中被檢測出來(Wise et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9378-9382,1990)。這種自然 分泌的弗林蛋白酶被認(rèn)為是“棚式(shed)弗林蛋白酶”(Vidricaire et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 195 :1011_1018，1993)并在N末端被切除貫穿細(xì)胞膜的部分。通過基因工程被截斷的弗林蛋白酶，其中貫穿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的 編碼部分被刪除，也可以相應(yīng)地被表達(dá)和被分泌。已經(jīng)描述過這種N-末端缺失氨基 酸 714-794 (Leduc 等人，J. Biol. Chem. 267 14304-14308，1992，Molloy 等人，J.Biol. Chem. 267 16396-16402，1992)；氨基酸 716-794( 〃 SoI-PACE 〃)(Wasley 等人，J. Biol. Chem. 268 :8458_8465，1993 ；以及 Rehemtulla 等人，Blood 79 :2349_2355，1992)；氨基酸 705-794 (Hatsuzawa 等人，J. Biol. Chem. 267 16094-16099,1992)。另外也描述過包括刪 除富含胱氨酸區(qū)域的弗林蛋白酶變異體(Hatsuzawa等人，J. Biochem. 101 =296-301,1992 ； Creemers 等人，J. Biol. Chem. 268 :21826_21834，1993)。弗林蛋白酶的內(nèi)切蛋白酶活性和它對于堿性氨基酸的選擇性首先是在使用前馮 威勒布蘭特因子(前VWF)的實驗中被確定。前vWF由具有741個氨基酸的前多肽和具有 2050個氨基酸的成熟馮威勒布蘭特因子(vWF)組成(Verweij等人，EMBO J. 5 1839-1847， 1986)。從前vWF中釋放的成熟vWF源于在精氨酸763之后的蛋白水解切割。前vWF cDNA在 真核表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)染結(jié)果是在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中生成相同量的360kD的前vWF和260kD 的成熟vWF。VWF在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可能通過內(nèi)源生成的弗林蛋白酶被加工成它的成熟型 (Wise 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :9378_9382，1990，Van de Ven 等人，MoI. Biol. Rep. 14 265-275,1990)。在其它的可通過弗林蛋白酶或者枯草桿菌蛋白酶樣的酶切割的前蛋白中，分別有 激素和生長因子系列(如前活化素A、肝細(xì)胞生長因子)，血漿蛋白(白蛋白、因子ΥΠ、因子 IX、因子X )，受體(胰島素前受體)，病毒蛋白(如HIV-lgpl60、流感病毒血細(xì)胞凝集素)以 及細(xì)菌蛋白(白喉毒素、炭疽毒素)(Decroly等人，J. Biol. Chem. 269 =12240-12247,1994 ； Stieneke-Grober 等人，EMBO J. 11 :2407_2414，1992 ；Barr, Ce//66 :1_3，1991，Wasley 等人，J. Biol. Chem. 268 :8458_8465，1993 ；Klimpel 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 10277-10281，1992 ；Tsuneoka 等人，J. Biol. Chem. 268 :26461_26465，1993 ；Bresnahan 等 人，J. Cell. Biol. Ill :2851_2859，1990 ；Hosaka 等人，J. Biol. Chem. 266 12127-12130， 1991 ；以及 Vey 等人，J. Cell. Biol. 127 1829-1842，1994)。本發(fā)明中的 rFurin 被預(yù)期也 是用于切割這些前蛋白。通過在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中共表達(dá)編碼完整的弗林蛋白酶和一種前蛋白的核酸序列，在體內(nèi)可以獲得提高的前蛋白加工。這已經(jīng)可以得到證明，比如前因子IX (Wasley等 人，J. Biol. Chem. 268 :8458_8465，1993)和前 vffF(W0 91/06314 ；Van de Ven 等人，MoI. Bio. Rep. 14 :265_275，1990 ；和 Rehemtulla 等人，Blood 79 :2349_2355，1992)。本發(fā)明預(yù) 期本發(fā)明的rFurin可用于體外和體內(nèi)通過rFurin切割的任何前蛋白的加工。除了完整的弗林蛋白酶和前蛋白共表達(dá)，截斷的弗林蛋白酶也能和前蛋白一起 表達(dá)。當(dāng)弗林蛋白酶缺失突變體在體內(nèi)共表達(dá)和被分泌時已經(jīng)被證明是有酶活性的；這 種缺失突變體的酶活性尤其可以在前因子IX的加工中被檢測出來(Wasley等人，J.Biol. Chem. 268 :8458_8465，1993)和前 vffF (Rehemtulla 等人，Blood 79 :2349_2355，1992)。弗 林蛋白酶缺失突變體的共表達(dá)實驗已經(jīng)表明，弗林蛋白酶的貫穿細(xì)胞膜和胞質(zhì)的部分對于 催化功能不是必需的(Rehemtulla 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8235_8239，1992)。W091/06314公開了在原核和真核細(xì)胞中弗林蛋白酶的重組表達(dá)，弗林蛋白酶融 合蛋白、缺失突變體和片段的制品，重組制備的弗林蛋白酶的純化以及純化的弗林蛋白酶 通常用于體外前蛋白加工的潛在用途。WO 92/09698描述了 PACE(弗林蛋白酶)的表達(dá)， 和蛋白質(zhì)無活性前體比如前vWF的共表達(dá)，以及融合蛋白的制備。Stieneke-Grober等人 (EMBO J. 11 =2407-2414,1992)描述了體外通過純化的弗林蛋白酶切割流感病毒HA蛋白。 Decroly等人(J. Biol. Chem. 269 :12240_12247，1994)描述了體外通過弗林蛋白酶切割HIV gp 160。在利用C末端縮短的弗林蛋白酶的實驗中，在體外已經(jīng)成功地進(jìn)行了前白蛋白 和補(bǔ)體前 C3 (Oda 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 189 1353-1361，1992)、炭疽毒素 (Klimpel 等人，Proc. Natl. Acad. ScL USA 89 :10277_10281，1992)、白喉毒素(Tsuneoka 等 人，J. Biol. Chem. 268 :26461_26465，1993)和前因子IX (Wasley 等人，J. Biol. Chem. 268 8458-8468,1993, Bristol et al. , Biochemistry 33:14136-14143,1994)的切割。因此如上所述本發(fā)明中的rFurin被預(yù)期用于這些前蛋白的體內(nèi)和體外加工。在 一個實施例中，本發(fā)明的rFurin在前vWF和前因子IX的體外加工中是尤其有用的。然而， 不能認(rèn)為它的使用僅局限于上述蛋白的加工。在進(jìn)一步的一個實施例中，本發(fā)明的rFurin 在重組前蛋白的體外加工中是尤其有用的。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是表達(dá)前vWF和rFurin的細(xì)胞的共培養(yǎng)。因此細(xì)胞培養(yǎng)上 清液中的前vWF被同樣存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的rFurin在體外切割成其活性形式。如 同在美國專利No. 6，210，929中所述的那樣，其被并入本文以供參考，被加工的vWF隨后從 培養(yǎng)物中被分離出來并且被純化。對于共培養(yǎng)，可以使用所有常用的表達(dá)系統(tǒng)，也可以將表 達(dá)前vWF和rFurin的不同系統(tǒng)互相組合起來使用。在一個實施例中，使用一種表達(dá)系統(tǒng)， 其中前vWF和rFurin兩者都可在相同來源的寄主細(xì)胞中表達(dá)。術(shù)語“寄主細(xì)胞”指的是已經(jīng)被核酸序列轉(zhuǎn)化，或者能夠被該核酸序列轉(zhuǎn)化，然后 表達(dá)經(jīng)選擇的正在研究中的基因的細(xì)胞。該術(shù)語包括親代細(xì)胞的后代，只要被選擇的基因 還存在于細(xì)胞中，無論后代在形態(tài)學(xué)上或者在基因組成上是否與最初的親本一樣。本發(fā)明包括任何寄主細(xì)胞或者在本領(lǐng)域中任何已知的用于重組蛋白產(chǎn)物 的寄主。因此，本發(fā)明的細(xì)胞可以來自于任何來源。在一個實施例中，本發(fā)明包括 真核的和原核的寄主細(xì)胞。在另一個實施例中，本發(fā)明包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、魚 類細(xì)胞、兩棲動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在一個實施例中，典型的酵母細(xì)胞包括畢赤氏酵母屬，比如嗜甲醇畢赤酵母；和酵母屬比如釀酒酵母；以及 裂殖酵母屬(Schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces),比如 K.Zactis, K.fragilis, K.bulgaricus, K.wickeramii, K. waltii, K.drosophilarum, K. thernotolerans 禾口 K. marxianus,K. yarrowia ；李氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糖鏈 抱霄，許旺酵母(Schwanniomyces),比如 Schwanniomyces occidentalis ；鏈抱霄；青霄屬； 彎頸霉(Totypocladium)，曲菌屬，構(gòu)巢曲霉，黑曲霉，漢遜酵母(Hansenula)，念珠菌屬，克 勒克酵母屬，球擬酵母病和薔微色酵母屬。典型的昆蟲細(xì)胞包括苜宿銀紋夜蛾和草地貪夜 蛾(Spodoptera frugiperda)以及果蠅。在進(jìn)一步的實施例中，寄主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，包括主要的上皮細(xì)胞(如角質(zhì) 形成細(xì)胞，頸的上皮細(xì)胞，支氣管的上皮細(xì)胞，氣管的上皮細(xì)胞，腎臟上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜的 上皮細(xì)胞)和被建立的細(xì)胞系以及它們的菌株(比如293胚腎細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa頸的上 皮細(xì)胞和PER-C6枧網(wǎng)膜細(xì)胞、MDBK(NBL-I)細(xì)胞、911細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CHO細(xì) 胞、Beffo細(xì)胞、Chang細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞、Hela229細(xì)胞、Hela S3細(xì)胞、H印_2細(xì)胞、 KB 細(xì)胞、LS180 細(xì)胞、LS 174T 細(xì)胞、NCI-H-548 細(xì)胞、RPMI 2650 細(xì)胞、SW-13 細(xì)胞、T24 細(xì) 胞、WI-28VA13、2RA 細(xì)胞、WISH 細(xì)胞、BS-C-1 細(xì)胞、LLC-MK2 細(xì)胞、克隆 M-3 細(xì)胞、1-10 細(xì) 胞、RAG細(xì)胞、TCMK-I細(xì)胞、Y-I細(xì)胞、LLC-PKi細(xì)胞、PK (15)細(xì)胞、GHl細(xì)胞、GH3細(xì)胞、L2 細(xì)胞、LLC-RC 256細(xì)胞、MHlCi細(xì)胞、XC細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、VSff細(xì)胞和TH-I，Bl細(xì)胞，或者 它們的衍生物)，來自于任何組織或者器官的成纖維細(xì)胞(包括但不限于心臟、肝臟、腎臟、 結(jié)腸、腸管、食管，胃部、神經(jīng)組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動脈、靜脈、毛細(xì)管)、淋巴組 織(淋巴腺、腺的、扁桃體、骨髓和血液)、脾臟和成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞類似細(xì)胞系(比 如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、TRG-2細(xì)胞、IMR-33細(xì)胞、Don細(xì)胞、GHK-21細(xì)胞、瓜胺酸血癥 (citrullinemia)細(xì)胞、Dempsey 細(xì)胞、Detroit 551 細(xì)胞、Detroit 510 細(xì)胞、Detroit 525 細(xì)胞、Detroit 529 細(xì)胞、Detroit 532 細(xì)胞、Detroit 539 細(xì)胞、Detroit 548 細(xì)胞、Detroit 573 細(xì)胞、HEL 299 細(xì)胞、IMR-90 細(xì)胞、MRC-5 細(xì)胞 WI-38 細(xì)胞、WI-26 細(xì)胞、MiCh 細(xì)胞 CV-I 細(xì)胞、COS-I 細(xì)胞、C0S-3 細(xì)胞、C0S-7 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞、DBS_FrhL_2 細(xì)胞、BALB/3T3 細(xì)胞、F9 細(xì)胞、SV-T2 細(xì)胞、M-MSV-BALB/3T3 細(xì)胞、K-BALB 細(xì)胞、BLO-11 細(xì)胞、NOR-10 細(xì)胞、C. sub. 3H/ 10TI/2細(xì)胞、HSDM1C3細(xì)胞、KLN205細(xì)胞、McCoy細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、Strain2071 (小鼠L)細(xì) 胞、L-M菌株(小鼠L)細(xì)胞、L-MTK (小鼠L)細(xì)胞、NCTC克隆2472及2555,SCC-PSAl細(xì)胞、 Swiss/3T3 細(xì)胞、Indian muntjac 細(xì)胞、SIRC 細(xì)胞、C. sub. 11 細(xì)胞和 Jensen 細(xì)胞，或者它 們的衍生物。)典型的哺乳動物細(xì)胞包括各種CHO、BHK、HEK-293、NSO, YB2/3、SP2/0和人的細(xì)胞 如 PER-C6 或 HT1080,以及 VERO, HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat, Saos, PC-12、HCT 116、 L929、LIk-, WI38、CVU TM4、W138、Hep G2、MMT,白血病細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞或者受精卵細(xì)胞。 在本發(fā)明的一個實施例中，典型的寄主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，培養(yǎng)基被 用于在懸浮液中培養(yǎng)CHO細(xì)胞。寄主細(xì)胞可以用本領(lǐng)域中各種已知的方法被工程化來表達(dá)蛋白質(zhì)，這些方法包 括，但不限于插入編碼想要的蛋白的外源核酸，可選擇地作為表達(dá)載體的一部分；插入外 源表達(dá)控制序列，以致于能引起寄主細(xì)胞中編碼想要的蛋白的內(nèi)源基因的表達(dá)增加；或者 活化寄主細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)控制序列，以便增加編碼想要的蛋白的內(nèi)源基因的表達(dá)。
9任何已知的方法來制備，培養(yǎng)寄主細(xì)胞和回收 細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(無論是從細(xì)胞或者培養(yǎng)基中)的方法也是本領(lǐng)域中已知的。這種培 養(yǎng)方法可以包括向培養(yǎng)基中添加用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的化學(xué)誘導(dǎo)劑。典型的寄主細(xì)胞和步驟如 下文所述。編碼弗林蛋白酶多肽的核酸通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)被插入合適的表達(dá) 載體中。在一個實施例中，GenBank登錄號EAX02111 (國家生物技術(shù)信息中心，美國醫(yī)藥國 家圖書館，Bethesda, MD)所顯示的核酸編碼人類弗林蛋白酶多肽。然而，本領(lǐng)域中技術(shù)人 員會理解，任何具有弗林蛋白酶生物活動性(即切割前VWF生成成熟的VWF)的蛋白都能通 過本文描述的方法來生產(chǎn)。在進(jìn)一步的實施例中，通過刪除編碼氨基酸578至794的包含 富含胱氨酸結(jié)構(gòu)域、貫穿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域的核苷酸，設(shè)計出C末端截斷的、被充 分分泌的rFurin。在甚至更進(jìn)一步的實施例中，可能添加氨基酸的尾部，以便有助于純化過 程。在另一個實施例中，含10個組氨酸殘基的尾部被添加在氨基酸577之后，無論有或者 沒有中間的4個甘氨酸殘基作為彈性連結(jié)物。表達(dá)載體可選擇地包括啟動子、一個或多個增強(qiáng)子序列、復(fù)制起點、轉(zhuǎn)錄終止序 列、包含供體和受體剪接位點的完整的內(nèi)含子序列、編碼用于多肽分泌的引導(dǎo)或者信號序 列的序列、核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼待表達(dá)的多肽的核酸的多接頭 區(qū)域、和/或選擇性標(biāo)記元件。每一個序列敘述如下。可選擇地，載體可以包含編碼“標(biāo)記物”的序列，即位于弗林蛋白酶多肽編碼序列 5'或3'末端的寡核苷酸序列；編碼多聚組氨酸(如六聚組氨酸)或者另一種市場上可買 到其抗體的“標(biāo)記物”如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或真菌(myc)的寡核苷酸分子。 在多肽剛表達(dá)后這種標(biāo)記物一般就被融合于該多肽，并且可以用作檢測或者親和純化來自 于寄主細(xì)胞的弗林蛋白酶多肽的手段。合適的載體包括，但不限于，粘端質(zhì)粒、質(zhì)?；蛘咝揎椷^的病毒，但是應(yīng)理解這個 載體系統(tǒng)必須適合被選擇的寄主細(xì)胞。在一個實施例中，載體是質(zhì)粒。在進(jìn)一步的一個實施 例中，質(zhì)粒是基于puc的克隆載體。可以被用于發(fā)明的其它載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、 探針生成載體、序列載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本發(fā)明預(yù)期的載體包括，但不限于用重組噬 菌體、質(zhì)粒、噬菌?；蛘哒扯速|(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的酵母；用病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(如花椰 菜花葉病毒、豇豆蚜傳花葉病毒、煙草花葉病毒、TMV)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者甚至動物 細(xì)胞系統(tǒng)。哺乳動物表達(dá)載體一般包含復(fù)制起點、合適的啟動子以及任何必要的核糖體結(jié)合 位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和5'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。來源于 SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起始點、早期啟動子、增強(qiáng)子、剪接和聚腺苷酸化位 點可以被用于提供要求的表達(dá)控制元件。典型的真核載體包括pcDNA3、pffLneo, pSV2cat、 pOG44、PXTI、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL 和 pVITRO。核酸可以通過本領(lǐng)域中任何已知的方法被轉(zhuǎn)移至寄主細(xì)胞中，比如通過脂質(zhì)體介 導(dǎo)轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(配體-DNA復(fù)合體)、電穿孔、微量注射DNA、細(xì)胞融合、二乙氨基乙 基葡聚糖、氯化鈣、磷酸鈣沉淀、微粒轟擊、利用病毒載體感染、脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染或者同源重組。此處使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)染”指的是寄主細(xì)胞經(jīng)過修飾含有外源的多核苷
10酸，此多核苷酸可以并入寄主細(xì)胞的染色體中或者作為游離的元件被保留。預(yù)期在提供的 方法的某些實施例中，寄主細(xì)胞在“轉(zhuǎn)染步驟”被轉(zhuǎn)染。該方法可以包含多重轉(zhuǎn)染步驟。此 外，本領(lǐng)域中其它已知的用于將外源的多核苷酸導(dǎo)入寄主細(xì)胞的方法包括，比如，電穿孔法 和細(xì)胞融合。出描述目的，它們并不是技術(shù)上地“轉(zhuǎn)化”，而是在術(shù)語“轉(zhuǎn)化”的定義范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了用于培養(yǎng)的方法，即在可引起rFurin蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)寄 主細(xì)胞。這些方法包括將寄主細(xì)胞產(chǎn)生的rFurin從培養(yǎng)基中回收的步驟。在一個典型的 實施例中，寄主細(xì)胞是在化學(xué)限定的、無血清的培養(yǎng)基中生長。因為血清是生物化學(xué)上不明 確的物質(zhì)，包含許多并沒有被充分鑒定的成分，批次和批次之間也有差別，并且經(jīng)常被微生 物例如病毒和支原體污染，所以在重組rFurin的生產(chǎn)中是不希望有血清的存在。此外，培 養(yǎng)基中血清的動物蛋白的存在需要冗長的提純步驟。因此本發(fā)明提供生物化學(xué)限定的培養(yǎng)基，基本上沒有動物蛋白，用于培養(yǎng)被人的 弗林蛋白酶基因重組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。培養(yǎng)基成分大部分是無機(jī)的、合成的或者重配的，并且不 是直接從任何動物來源中獲得的。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含一種或多種替代化合物，也可以包含一種或多種可 以與金屬結(jié)合的代替化合物，并且/或者包含一種或多種包含一種或多種替代化合物的復(fù) 合體。在一些實施方式中，培養(yǎng)基可以包含一種或多種復(fù)合體，上述復(fù)合體包含一種或多種 過渡元素或者其鹽或離子，它們與可以結(jié)合金屬的一種或多種替代化合物相復(fù)合。在一些 實施方式中，培養(yǎng)基能夠在體外支持細(xì)胞培養(yǎng)并且允許其中培養(yǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，過渡元素優(yōu)選地選自于由下述元素組成的組鈧、鈦、釩、 鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、釔、鋯、鈮、鉬、锝、銣、銠、鈀、銀、鎘、鑭、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、銀、 金、汞和錒，或者其鹽和離子，并且優(yōu)選是鐵鹽。合適的鐵鹽包括但不限于FeCl3、Fe(NO3)3 或者FeSO4或者其它含有Fe+++或Fe++離子的化合物。培養(yǎng)基中結(jié)合金屬的化合物包括任何可以與過渡元素相互作用或者與其結(jié)合、并 且促進(jìn)細(xì)胞對它們的攝取的大分子。這種作用/結(jié)合在自然界中可以是共價的或者非共 價的。在本發(fā)明的一個實施例中使用的金屬結(jié)合化合物優(yōu)選地選自由下述化合物所組成 的組多元醇、羥基吡啶派生物、1，3，5-N，N'，N"-三(2，3-二羥基苯酰)氨基-甲苯、 乙二胺-N，N'-四亞甲基磷酸、翠蘇素(trisuccin)、酸性糖類(如葡萄糖酸亞鐵)、糖胺 聚糖、二亞乙基三胺戊酸、尼克酸-N-氧化物、2-羥基-尼克酸、單取代2，2 ‘ - 二吡啶、雙 取代2，2' _ 二吡啶、三取代2，2' _ 二吡啶、氧肟酸鹽(hydroxamate)衍生物(如乙酰羥 肟酸)、氨基酸衍生物、去鐵胺、鐵草氨菌素(ferrioxamine)、鐵基卟吩和它的衍生物、DOTA 賴氨酸、泰薩卟啉(texaphyrin)、薩普卟啉(sapphyrin)、多氨基羧酸、α-羥基羧酸、聚乙 烯氨基甲酸鹽、乙基麥芽酚、3-羥基-2-吡啶和IRC011。在一個實施例中，結(jié)合金屬的化 合物是多元醇例如山梨醇或者葡聚糖，尤其是山梨醇。在一個相關(guān)的實施例中，結(jié)合金屬 的化合物是羥基吡啶衍生物，如2-羥基吡啶-N-氧化物、3-羥基-4-吡喃酮、3-羥基哌吡 啶-2-酮(3-hydroxypypyrid-2-one)、3-輕基吡啶-2-酮(3-hydroxypyrid-2_one)、3-羥 基吡啶-4-酮、1-羥基吡啶-2-酮、1，2- 二甲基-3-羥基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羥基吡 啶-2-酮、3-羥基-2 (IH)-羥基吡啶酮、乙基麥芽酚或者吡哆醛異煙堿基腙。本發(fā)明的結(jié)合 金屬的化合物也可以結(jié)合二階陽離子例如Ca++和Mg++。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以包含一種或多種成分，此成分選自由下述成分所組成的組腺嘌呤、乙酸胺、D-葡萄糖、肝素緩沖劑、氫化可的松、胰島素、亞油酸、硫辛酸、苯酚礦酞、磷 酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲腺氨酸、胸腺嘧啶核苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬 酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組胺酸、L-異亮氨酸、 L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、N-乙酰-半胱氨酸、生物素、氯化膽堿、D-Ca++泛酸、葉酸、肌 醇、尼克酰胺、吡哆醇、核黃素、硫胺、維他命B12、Pluronic F68、重組胰島素、鈣鹽、CuSO4, FeSO4, FeCl3、Fe (NO3) 3、KCl、鎂鹽、錳鹽、鉬鹽、NaCl,NaHC03> Na2HPO4, Na2SO4、釩鹽、鎳鹽、錫 鹽、ZnCl2、ZnSO4或者其他鋅鹽，其中每個成分添加的量能支持體外細(xì)胞的培養(yǎng)。在一種實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以選擇性地進(jìn)一步包括一種或多種補(bǔ)充 物，此補(bǔ)充物選自下組一種或多種細(xì)胞因子、大豆蛋白胨、一種或多種酵母肽和一種或多 種植物肽(大部分優(yōu)選一種或多種大米、蘆薈真皮、大豆、玉米、小麥、豌豆、南瓜、菠菜、胡 蘿卜、馬鈴薯、紅薯、木薯、油梨、大麥、椰子和/或青豆、和/或一種或多種其它植物)，比如 參見國際申請No. PCT/US97/18255，公布號是W098/15614。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以優(yōu)選地包括一種或多種緩沖劑以便維持一個最佳的pH。合適 的緩沖劑包括但不限于N-[2-羥乙基]-哌嗪-N' -[2-乙烷磺酸](HEPES)、M0PS、MES、磷 酸鹽、重碳酸鹽和其他適合用于細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用的緩沖劑。合適的緩沖劑是可以提供緩沖 能力并且基本上對培養(yǎng)的細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的緩沖劑。選擇合適的緩沖劑是在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng) 域中的常規(guī)技術(shù)范圍內(nèi)。當(dāng)上述的培養(yǎng)基成分在溶液中混和在一起時，形成了本發(fā)明的完全培養(yǎng)基。完全 培養(yǎng)基適用于各種哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)，在本文中會更加詳細(xì)地描述。根據(jù)本文獲得的信 息和本領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)的知識，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以不用做很多實驗就能獲得可操作的
培養(yǎng)基配方。最初并且在適應(yīng)在化學(xué)限定的無血清的培養(yǎng)基中生長之前，寄主細(xì)胞可以在 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)基通常包含所有必要的用于細(xì)胞生 長和存活的營養(yǎng)物質(zhì)。用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的合適培養(yǎng)基是=Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養(yǎng)基 1640 (RPMI1640)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)、和 / 或 Dulbecco ‘ s Modified Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM/F12和ExCeII325培養(yǎng)基，所有的培養(yǎng)基都可以添加 血清和/或生長因子，如同在培養(yǎng)特定的細(xì)胞系時所顯示的那樣。然而，值得注意的是，本 發(fā)明提供了將培養(yǎng)基中的血清從培養(yǎng)物中除去以便得到可以在無血清培養(yǎng)基中生長的寄 主細(xì)胞的方案。因此，本發(fā)明提供了在無血清狀態(tài)下的最佳培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)寄主細(xì)胞，得 到最大產(chǎn)量的rFurin。在一個進(jìn)一步的實施例中，細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)基中生長。 本文的實施例部分提供了本發(fā)明中不同的培養(yǎng)基配方。在一個方面，抗生素或者其他可用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性生長的化合物被作為補(bǔ)充物 被添加至培養(yǎng)基中。待使用的化合物被存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒上的選擇性標(biāo)記元素指示。 賦予對特定的通常對于動物細(xì)胞有毒性的藥物抗性的選擇性標(biāo)記可被用于本發(fā)明的方法 和組合物中。例如，當(dāng)選擇性標(biāo)記元件是抗卡那霉素時，被加到培養(yǎng)基中的化合物是卡那 霉素。其它用于選擇性培養(yǎng)的化合物包括氨芐西林、四環(huán)素、遺傳霉素、新霉素、佐奧霉素 (zeomycin(zeo))；嘌呤霉素(PAC)；殺稻瘟菌素(BIaS)和GPT。附加的選擇性標(biāo)記在本領(lǐng) 域中是已知的，并且在本發(fā)明的組合物和方法中是有用的。
在規(guī)定的條件下可以讓細(xì)胞存活或者誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的代謝酶類可以被用于本 發(fā)明的方法和組合物中。其例子包括但不限于二氫葉酸還原酶(DHFR)；單純性皰疹病 毒胸苷激酶(TK)、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HGPRT)和腺苷酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶 (APRT)，這些基因可以分別被應(yīng)用于缺乏TK、HGPRT或者APRT的細(xì)胞中。然而，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的rFurin產(chǎn)物基本上不含這些添加的蛋白質(zhì)。培養(yǎng)基可以被用于培養(yǎng)任何寄主細(xì)胞或者在本領(lǐng)域中任何已知的用于重組蛋白 生產(chǎn)的寄主。在本發(fā)明的一個實施例中，典型的寄主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在本發(fā)明進(jìn)一步的 實施例中，培養(yǎng)基被用于以懸浮方式培養(yǎng)CHO細(xì)胞。當(dāng)所研究的重組蛋白被寄主細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中時，培養(yǎng)基可以被周期性地收 獲，以致于可以使用相同的寄主細(xì)胞經(jīng)過幾個收獲周期。培養(yǎng)基可以在分批過程中被添加， 比如培養(yǎng)基在單個批次中被一次性添加至細(xì)胞，或者在分批補(bǔ)料過程被添加。分批補(bǔ)料過 程中周期性地添加小批量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)結(jié)束時或者在培養(yǎng)期間分幾次來收 集。連續(xù)灌注式生產(chǎn)過程同樣在本領(lǐng)域中是已知的，并包括連續(xù)補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基進(jìn)入培養(yǎng) 液中，同時相同體積的培養(yǎng)基連續(xù)地從反應(yīng)器中排出。灌注培養(yǎng)通常會比分批培養(yǎng)達(dá)到更 高的細(xì)胞密度，并且在重復(fù)收獲下可以維持幾周或者幾個月。因此，恒化培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培 養(yǎng)(batch reefed culture)兩者都適用于rFurin的大量生產(chǎn)，如同本領(lǐng)域中其他已知的 培養(yǎng)方法。本領(lǐng)域中各種已知的培養(yǎng)系統(tǒng)包括T燒瓶、轉(zhuǎn)瓶和搖瓶、滾瓶和攪拌罐式生物反 應(yīng)器。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)通常是通過將細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)瓶中，轉(zhuǎn)瓶被培養(yǎng)基部分地填充(如10-30%的 體積)并緩慢地旋轉(zhuǎn)，使得細(xì)胞附著于瓶子的側(cè)面并生長至匯合。通過將上清液慢慢倒出 來收獲細(xì)胞培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基代替上清液。可以在微載體比如聚合球體上培養(yǎng)貼壁 依賴性細(xì)胞，在被攪拌罐式生物反應(yīng)器中微載體被維持懸浮狀態(tài)?？蛇x擇地，細(xì)胞在單細(xì)胞 懸浮液中生長。寄主細(xì)胞產(chǎn)生的rFurin的量可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來測定。這些方法包 括，但不限于蛋白質(zhì)印跡分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、高壓液相色 譜(HPLC)分離、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附試驗和/或活性測試?yán)鏒NA結(jié)合凝膠位移測試。 本發(fā)明同樣預(yù)期使用本領(lǐng)域中已知的和本文所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法來測定rFurin的比生產(chǎn)率 (被表示為蛋白量/細(xì)胞/天)。“基本上無動物蛋白的rFurin”被定義為包括rFurin制品，此rFurin制品包括濃 度范圍是大約0. 1至0. 6ng之間或以下蛋白/單位弗林蛋白酶活性或者大約2至11 μ g之 間或以下蛋白/mL的寄主細(xì)胞蛋白，并且基本上沒有來自于培養(yǎng)基中血清的污染蛋白。在 一個實施例中，基本上無動物蛋白的rFurin包括rFurin制品，此rFurin制品包括濃度范 圍是大約0. 1至0. 4pg之間或以下DNA/單位弗林蛋白酶活性或者大約0至24ng之間或以 下DNA/mL的寄主細(xì)胞DNA，并且基本上沒有來自于培養(yǎng)基中血清的污染蛋白。在一個實施 例中，表達(dá)rFurin的寄主細(xì)胞是在化學(xué)限定的、無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可選擇地，細(xì)胞可 以在有血清的培養(yǎng)基中生長并且根據(jù)本文提供的方法而被純化。表達(dá)rFurin的寄主細(xì)胞在恒化條件下被懸浮培養(yǎng)在不含動物(包括人)衍生物 的培養(yǎng)基中。細(xì)胞通過過濾被除去，含有rFurin的細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過超濾被濃縮并通過 離子交換層析被純化，生成的rFurin溶液具有的活性至少大約是1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、 50000,55000,60000,65000,70000,75000,80000,85000,90000,95000,100000,120000, 140000、160000、180000、200000、500000 單位 /ml 和直至超過 500000U/ml。在另一個實施例中，本發(fā)明的重組弗林蛋白酶的被純化的溶液的比活性至少大 約是:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、 500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000υ/μ g 蛋白。在另一個實施方式中，本發(fā)明的rFurin的被純化的溶液包含的寄主細(xì)胞蛋白的 濃度小于大約20. 0,19. 0,18. 0,17. 0,16. 0,15. 0,14. 0,13. 0,12. 0,11. 0,10. 5,10. 0,9. 5、 9. 0、8· 5、8· 0、7· 5、7· 0、6· 5、6· 0、5· 5、5· 0、4· 5、4· 0、3· 5、3· 0、2· 5、2· 0、1· 5、1· 0、0· 5、0· 4、 0. 3,0. 2,0. 1 和 0μ g/ml。在另一個實施例中，本發(fā)明的rFurin的被純化的溶液包含的寄主細(xì)胞蛋白的濃 度小于大約1. 0,0. 95,0. 90,0. 85,0. 80,0. 75,0. 70,0. 65,0. 60,0. 55,0. 50,0. 45,0. 40、 0. 35,0. 30,0. 25,0. 20,0. 15,0. 10,0. 05,0. 04,0. 03,0. 02,0. 01 和 Ong 蛋白 /U rFurin 下面的實施例表明了本發(fā)明使用CHO寄主細(xì)胞來生產(chǎn)rFurin，然而，技術(shù)人員可 以理解，任何寄主細(xì)胞都可以相似地適用于本發(fā)明的rFurin的生產(chǎn)。CHO細(xì)胞被廣泛地應(yīng) 用于重組蛋白的生產(chǎn)中，被工程化的CHO細(xì)胞(在這些細(xì)胞中CHO細(xì)胞系被產(chǎn)物基因和選 擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染)通常在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然而，血清的使用引起了許多問題。 血清是昂貴的商品，并不能容易地得到用于工業(yè)生產(chǎn)的所需要的量。血清同樣是生化上不 確定的物質(zhì)，包含了許多沒有被充分鑒定的并且功能沒有被確定的成分。血清批次之間是 不同的，可能需要通過檢測來確定各種成分的水平和它們對細(xì)胞的影響。此外，血清通常會被微生物如病毒和支原體污染，在這些微生物中有許多可能是 有害的，但仍然代表了另外一種不明因素。此外，培養(yǎng)基中動物蛋白的存在可能會需要冗 長的提純步驟。尤其是，牛血清白蛋白(BSA)中?？贵w的存在使得被重組CHO細(xì)胞系表達(dá) 的想要的抗體的純化變得非常困難。在使用前將?？贵w除去是有可能的，但是這個除去過 程和除去后所需要的額外的產(chǎn)物測試給產(chǎn)品的生產(chǎn)增加了很多成本。因此，使用沒有動物 成分的培養(yǎng)基是有益處的，并且此培養(yǎng)基可以維持細(xì)胞尤其是CHO細(xì)胞生長。當(dāng)CHO細(xì)胞 不能容易地在無血清狀態(tài)下生長時，本發(fā)明提供了可以在無血清狀態(tài)下生長的CHO細(xì)胞的 rFurin。工程化的CHO細(xì)胞同樣是很難在懸浮液中生長。當(dāng)使用細(xì)胞來表達(dá)類似于rFurin 的產(chǎn)物時，非常期望能在懸浮液中生長。對于大規(guī)模地生產(chǎn)這樣的生物蛋白質(zhì)，能夠在相當(dāng) 大的發(fā)酵罐中維持生長是很理想的。需要合適的培養(yǎng)基來維持細(xì)胞以致于它們能在大規(guī)模 生產(chǎn)的條件下生長。這種合適的培養(yǎng)基在本文的實施例中被描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理 解，本領(lǐng)域中任何能培養(yǎng)細(xì)胞的方法都可以用于培養(yǎng)含有rFurin的寄主細(xì)胞，正如本發(fā)明 中所陳述的那樣。本文的實施例提供了培養(yǎng)方法的非限制性的例子。本發(fā)明也提供了細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后進(jìn)行的純化方法，以便從 rFurin中去除CHO細(xì)胞蛋白。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本領(lǐng)域中任何已知的蛋白純化的 方法都可以用于從培養(yǎng)基中純化rFurin。本文的實施例提供了純化方法的非限制性的例 子。因此，可以生產(chǎn)出基本上沒有所有動物來源蛋白的rFurin?；旧蠜]有動物蛋白的 rFurin可選擇地被冷凍儲存直至被使用。
實施例本發(fā)明的其他方面和細(xì)節(jié)可以從下面的實施例中顯現(xiàn)出來，實施例是用于說明而 不是用于限制本發(fā)明。實施例1描述了 rFurin表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染；實施例 2描述了使表達(dá)rFurin的CHO細(xì)胞克隆適應(yīng)于在無血清狀態(tài)下生長的方法；實施例3描述 優(yōu)化在無動物蛋白的培養(yǎng)基中生產(chǎn)rFurin的方法；實施例4描述了 rFurin的純化；實施例 5陳述了下游過程(濃縮和純化)以及大規(guī)模生產(chǎn)rFurin的分析；而實施例6證明了安全 性、無菌性和穩(wěn)定性試驗，進(jìn)行這些試驗以便測定和維持寄主細(xì)胞庫的質(zhì)量。實施例1 重組弗林蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染用于構(gòu)建rFurin表達(dá)質(zhì)粒#556的弗林蛋白酶起源質(zhì)粒的詳細(xì)說明在表1中被列 出。在組成型巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的控制下被表達(dá)的成熟的rFurin包含催化結(jié)構(gòu)域、 P結(jié)構(gòu)域和胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域的一小部分，而位于C-末端至氨基酸577的區(qū)域被去除，生成 了完全分泌的活性蛋白酶。作為選擇質(zhì)粒的DHFR-載體的構(gòu)建的詳細(xì)說明在表2中被描述。為了發(fā)展命名為 #488-3和#289-20的穩(wěn)定表達(dá)CHO/rFurin的細(xì)胞克隆，通過使用磷酸鈣共沉淀法，缺乏功 能性內(nèi)源DHFR基因的CHO細(xì)胞被質(zhì)粒#556和#73共轉(zhuǎn)染。使用DHFR/MTX選擇系統(tǒng)，經(jīng)過 幾輪的亞克隆和擴(kuò)增，挑選出高水平地分泌rFurin的克隆。表1.弗林蛋白酶質(zhì)粒產(chǎn)生的描述 表2. DHFR質(zhì)粒產(chǎn)生的描述 被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在DHFR培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DHFR培養(yǎng)基由DMEM NUT MIX F12(l 1) 組成，沒有次黃嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸，添加了 HepeS、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素和5% 或10%被透析的、γ輻射的FBS( = 5% DHFR，10% DHFR)。經(jīng)透析和Y輻射的FBS購自 生命技術(shù)公司，具有完整的分析、來源和輻射證書。Y-胰蛋白酶溶液(lmg/ml)的制備是在 奧地利Orth的巴克斯特由培養(yǎng)基配制/PPC部門進(jìn)行的。圖2描述了 CHO/rFurin克隆#488-3產(chǎn)生的譜系?？寺H0/rFurin#488_3是由 初始的克隆得到的，它在進(jìn)入擴(kuò)增(添加了 IOOnM MTX的選擇性培養(yǎng)基中)之前，經(jīng)過了兩輪的在10% DHFR選擇性培養(yǎng)基中的亞克隆，其中一輪的亞克隆是在MTX濃度沒有變化的培 養(yǎng)基中進(jìn)行的?？寺?448-3被擴(kuò)增用于冷凍。CHO/rFurin克隆#289-20同樣地被制備和 擴(kuò)增。然而，克隆#289-20來源于克隆#488-3的后繼克隆。圖3描述了 CHO/rFurin克隆 #289-20產(chǎn)生的譜系。在克隆要求的培養(yǎng)基中檢測弗林蛋白酶活性，克隆在沒有血清的DHFR培養(yǎng)基中 培養(yǎng)了 24小時。顯示高弗林蛋白酶活性(每24小時U/106個細(xì)胞)的細(xì)胞克隆被選中。 被選中的高產(chǎn)量的克隆被擴(kuò)增用于冷凍儲存安瓿的制備，并用于下一輪克隆的分流。進(jìn)行 高產(chǎn)量細(xì)胞克隆的分離和識別。使用Casy細(xì)胞計數(shù)器來分析細(xì)胞密度。對于克隆#488-3， 可以達(dá)到直至每24小時200-300U/106個細(xì)胞的弗林蛋白酶表達(dá)量。對于克隆#289-20，可 以達(dá)到直至每24小時400U/106個細(xì)胞的弗林蛋白酶表達(dá)量。實施例2 使表達(dá)重組弗林蛋白酶的細(xì)胞克隆適應(yīng)于無血清狀態(tài)下的培養(yǎng)細(xì)胞系適應(yīng)和篩選的策略是，通過逐漸地逐步稀釋或者突然地，使細(xì)胞系適應(yīng)成 無血清和蛋白的細(xì)胞系。此項研究的目的是發(fā)現(xiàn)可以在無血清狀態(tài)下生長的CHO細(xì)胞種 群，并且能穩(wěn)定得生成rFurin。CHO細(xì)胞克隆#488-3被用作起始材料。表達(dá)rFurin的細(xì) 胞克隆#488-3在三個平行進(jìn)行的適應(yīng)中被改變成無血清的狀態(tài)，詳細(xì)描述如下。去除血清的過程開始于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，通過使用微載體以便發(fā)現(xiàn)保留細(xì)胞的方法， 因為在那個階段時細(xì)胞通常表現(xiàn)為緩慢生長。通過使用此方法，可以避免在隨后的培養(yǎng)基 變化期間，將細(xì)胞稀釋到生長被抑制的濃度。內(nèi)部研發(fā)的三種不同的培養(yǎng)基BAP、BAS和BCS(如表3所示)在此研究的過程中
被使用。表3 BAP, BAS和BCS的內(nèi)部培養(yǎng)基配方 1BCS中L-谷氨酸鹽的濃度0. 900g/kg2BCS 中 Synperonic F68 的濃度1. 00g/kg取決于各個實驗的目的，利用不同的補(bǔ)充劑提供這些不同的培養(yǎng)基，如表4中所 列。表4 培養(yǎng)基和它們的補(bǔ)充劑 1 二鹽酸腐胺2L-谷氨酰胺3Synperonic F684硫酸鐵(II)七水合物5硫酸鋅(II)七水合物下面的表格給出了用于此研究過程中的培養(yǎng)基和試劑的總覽。表5概括了用于建 立前主細(xì)胞庫克隆PMCB#01和PMCB#04的培養(yǎng)基和試劑。表5.用于建立PMCB#01和PMCB#04的培養(yǎng)基和試劑 1 只應(yīng)用于 PMCB#014 只應(yīng)用于 PMCB#04表6概括了用于亞克隆和建立亞克隆#488-3/CJ06-19/5F10(5F10)和#488-3/ CJ06-19/1E8(1E8)的相應(yīng)的評估細(xì)胞庫(ECBs)過程的培養(yǎng)基和試劑。表6.用于建立亞克隆5F10和1E8的培養(yǎng)基和試劑的批號 所有的被添加到培養(yǎng)基的補(bǔ)充劑的批號都被引用在相應(yīng)培養(yǎng)基的合適的生產(chǎn)流 程中。其它培養(yǎng)基添加劑在表7中被列出。表7.其它培養(yǎng)基添加劑 1動物來源材料用于涉及附錄的證明2 "10% DHFR培養(yǎng)基”的成分，只被用于實驗SF05-80的初期在T燒瓶或者在旋轉(zhuǎn)燒瓶中進(jìn)行無血清條件的適應(yīng)，同時通過使細(xì)胞脫離胎牛血 清來進(jìn)行細(xì)胞維持(離心等等)。T燒瓶中的懸浮培養(yǎng)物在36士2°C和7. 5士 1. 0% CO2下被溫育。旋轉(zhuǎn)燒瓶中的培 養(yǎng)在Techne和Bellco旋轉(zhuǎn)瓶中沒有載體時進(jìn)行，分別在36 士 2°C和80rpm、130rpm下進(jìn)行。CHO/rFurin細(xì)胞克隆#488-3的亞克隆，在適應(yīng)無血清的培養(yǎng)基條件后，得到了可 在無血清的室內(nèi)培養(yǎng)基的懸浮液中生長的CHO細(xì)胞克隆，可穩(wěn)定地大量生產(chǎn)rFurin。此工 藝是基于被限制的稀釋法。簡言之，細(xì)胞懸浮液被稀釋以致于100 μ 1的懸浮液包含一個細(xì) 胞。96孔板的孔中用100 μ 1懸浮液填充。理論上，每個孔含有一個細(xì)胞用于克隆發(fā)育。當(dāng) 這些單細(xì)胞開始生長時，克隆發(fā)育。因此，每個新產(chǎn)生的細(xì)胞可以追溯到孔中第一個原始細(xì) 胞?？寺≡?4孔板上、接著在Τ25燒瓶中、然后在Τ75燒瓶中、然后在Τ175燒瓶中擴(kuò)增。培養(yǎng)期間，進(jìn)行過程控制(IPC)來監(jiān)測培養(yǎng)條件并測定rFurin的表達(dá)。使用Casy 儀器來測定培養(yǎng)期間的細(xì)胞密度。在CTX提取后Nucleo計數(shù)儀被應(yīng)用于檢測細(xì)胞核。解 凍后細(xì)胞密度和存活率的測定是通過臺盼藍(lán)排斥法使用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行的。細(xì)胞密度和 存活率同樣可以通過Cedex儀器進(jìn)行的自動臺盼藍(lán)排斥法來分析。細(xì)胞培養(yǎng)的上清液被用于確定表達(dá)的rFurin的數(shù)量和活性。熒光激活細(xì)胞分類 術(shù)(FACS)分析被用于測定在特定的細(xì)胞種群中生產(chǎn)細(xì)胞與非生產(chǎn)細(xì)胞的比值。細(xì)胞形態(tài) 學(xué)和生長行為通過光控制來確測定。另外，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液同樣被檢測用于監(jiān)測培養(yǎng)基 條件，比如測定pH值和葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和銨基的殘余濃度。這些分析通過NOVA儀 器進(jìn)行。在研究期間，生產(chǎn)了兩個前主細(xì)胞庫(PMCBs) PMCB#01和PMCB#04并建立了兩個細(xì) 胞系，如下所示。也產(chǎn)生了評估細(xì)胞庫(ECB)(參見表15)。PMCB#01的制備和QC試驗將一小瓶CH0/rFurin#488-3 (ECB#01)在BAS培養(yǎng)基中解凍，BAS培養(yǎng)基包含添加 劑(Put、Glut、Synp和Fe)和5% FBS0細(xì)胞在T175中被培養(yǎng)了 5天。然后將細(xì)胞適應(yīng)無 血清條件，如下所示。細(xì)胞在150ml生長培養(yǎng)基(具有Put、Glut、Synp和Fe的BAS)中制備，培養(yǎng)基中 含有5%FBS，0.2g/l。Cytopore 2載體用于適應(yīng)無血清條件。接種了 5天的細(xì)胞懸液導(dǎo)致 起始細(xì)胞密度是大約2. OxlO5細(xì)胞/ml，在第一個小時內(nèi)細(xì)胞附著在多孔載體上。因此細(xì)胞 維持在旋轉(zhuǎn)燒瓶中，同時分兩個步驟交換生長培養(yǎng)基以便減少血清濃度，從5%至3. 8%， 在第5天至0%。在接下來的培養(yǎng)期間，細(xì)胞習(xí)慣于無血清培養(yǎng)條件。細(xì)胞從載體表面脫離 并在懸浮液中繼續(xù)生長。懸浮細(xì)胞的細(xì)胞密度和存活率連續(xù)地增加。每兩至三天懸浮細(xì)胞 以1 2的比率被分流。
然后制備評估細(xì)胞庫(ECB)。在培養(yǎng)第28天，存活率大于60%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至 新的實驗中。培養(yǎng)物在沒有載體的Bellco旋轉(zhuǎn)器中200-300ml的BAS培養(yǎng)基(具有Put， Glut，Synp和Fe)中生長。根據(jù)測定的CASY細(xì)胞密度，每兩至三天懸浮培養(yǎng)液被分流至開 始的細(xì)胞密度大約是2. OxlO5細(xì)胞/ml。16天后，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到存活率大于80%時，產(chǎn)生 了由6個小瓶組成的評估細(xì)胞庫(ECB)。一小瓶ECB在新實驗中被解凍。細(xì)胞在T175中在具有Put，Glut, Synp, Fe和Zn 的BAS培養(yǎng)基中被培養(yǎng)四天。然后細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至Bellco旋轉(zhuǎn)器中，旋轉(zhuǎn)器包含最多600ml 的具有Put，Glut, Synp, Fe和Zn的BAS培養(yǎng)基。再次，每兩至三天懸浮培養(yǎng)液被分流至開 始的細(xì)胞密度大約是2. OxlO5細(xì)胞/ml。在培養(yǎng)第13天，143ml的細(xì)胞懸浮液被移出用于 PMCB#01的制備，由20個小瓶組成。細(xì)胞被擴(kuò)增，并且在PMCB#01上進(jìn)行質(zhì)量控制試驗。PMCB#04的制備和QC試驗一小瓶CH0/rFurin#488-3 (ECB#01)在BAS培養(yǎng)基中解凍，BAS培養(yǎng)基包含Put、 Glut,Synp和Fe以及5% FBS0六天的培養(yǎng)物的一半被轉(zhuǎn)移至新的實驗用于適應(yīng)無血清條 件。這里，對無血清的適應(yīng)不是逐步進(jìn)行的，而是突然進(jìn)行的。Bellco旋轉(zhuǎn)燒瓶通過 BAS培養(yǎng)基(添加Put，Glut，Synp和Fe)來制備，培養(yǎng)基中不含F(xiàn)BS和載體。細(xì)胞被接種， 開始的細(xì)胞密度是大約2. 5x10s細(xì)胞/ml。由于突然的無血清條件，細(xì)胞的加倍時間減少至 相當(dāng)?shù)偷乃?。為了避免稀釋?xì)胞至生長可能被抑制的濃度，通過旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸浮液來改變 培養(yǎng)基。細(xì)胞顆粒在新鮮的生長培養(yǎng)基中再懸浮。當(dāng)細(xì)胞密度大于4. OxlO5細(xì)胞/ml時， 進(jìn)行培養(yǎng)物分開。在培養(yǎng)第15天達(dá)到大約50%的最小存活率之后，細(xì)胞開始恢復(fù)。并且 從培養(yǎng)第32天以及之后，存活率增加至在85-90%之間。在培養(yǎng)第61天，適應(yīng)的細(xì)胞被冷 凍，作為由15個小瓶組成的ECB。在新的實驗中，一小瓶ECB被解凍在不含血清的BAS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中包含Put， Glut, Synp和Fe。培養(yǎng)物在T175燒瓶中被培養(yǎng)七天，被轉(zhuǎn)移至Bellco旋轉(zhuǎn)器，在其內(nèi)細(xì)胞 又培養(yǎng)了兩天。然后，檢測添加的Zn。大約IOOml離心的細(xì)胞懸浮液被再懸浮在無血清的 BAS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有Put，Glut，Synp，F(xiàn)e和Zn。懸浮液在Bellco旋轉(zhuǎn)器中被培養(yǎng)。根 據(jù)測定的CASY細(xì)胞密度，每兩至三天懸浮培養(yǎng)液被分流至開始的細(xì)胞密度大約是2. OxlO5 細(xì)胞/ml。為了接種物制備并能夠生產(chǎn)出大量的同源細(xì)胞懸浮液用于生成PMCB#04，在 Bellco旋轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)放大至1000ml。在培養(yǎng)第2天，465ml的細(xì)胞懸浮液被用于生產(chǎn) PMCB#04,由20個安瓿組成。細(xì)胞被擴(kuò)增，并且質(zhì)量控制試驗在PMCB#04上進(jìn)行。圖4描述了在PMCB#01和PMCB#04細(xì)胞群落中rFurin生產(chǎn)者的分布圖比較。 PMCB#04 中 80. 74% 的細(xì)胞表達(dá) rFurin。PMCB#01 中 74. 06% 的細(xì)胞表達(dá) rFurin。然后產(chǎn)生CH0/rFurin#488-3 亞克隆 CJ06-19/5F10 和 CJ06-19/1E8。一安瓿 CHO/ rFurin克隆#488-3被解凍，并且培養(yǎng)物在T175燒瓶中被傳代。在培養(yǎng)第17天，三個不同 的培養(yǎng)基被檢測BAP培養(yǎng)基(由巴克斯特研發(fā))、⑶-CHO (由Gibco提供)和ExCeII325PF CHO(由JRH提供)，每個都含有5% FBS。在T175燒瓶中生長四天后，在ExCeII培養(yǎng)基中 生長的細(xì)胞被適應(yīng)無血清條件。細(xì)胞從血清中一點一點地被移出。整個步驟包括三個實驗。首先，貼壁依賴性細(xì)胞在T175燒瓶中最初被培養(yǎng)在含有5%的FBS的ExCeII325PF CHO中。然后在培養(yǎng)第13 天血清被減少至0. 5%。在下一個培養(yǎng)的13天期間，進(jìn)行兩次分流，其中血清濃度進(jìn)一步地 被減少至0. 25%并且存活率減少至小于70%。細(xì)胞喪失了它們的貼壁依賴性行為，顯示越 來越多球形并開始在懸浮液中生長。血清減少的最后步驟發(fā)生在Techne旋轉(zhuǎn)瓶的ExCeII325PF CHO培養(yǎng)中，培養(yǎng)基含 有5%FBS，不含載體。在23天培養(yǎng)期之后，血清濃度達(dá)到0%。細(xì)胞被分流，并且被培養(yǎng) 至所有的相關(guān)參數(shù)維持在特定的范圍內(nèi)。細(xì)胞密度在0. 15和0.9xl06細(xì)胞/ml之間浮動。 在第一個星期存活率降至小于40%，不過然后恢復(fù)至大于90%的值。在培養(yǎng)第42天，被適 應(yīng)的細(xì)胞被冷凍在ECB/CJ06-20中，由20個小瓶組成。然后細(xì)胞被亞克隆。懸浮液用預(yù)處理的ExCeII325PF CHO稀釋至100 μ 1的懸浮液 理論上含有0.5-1.0個細(xì)胞。亞克隆實驗中，五個96孔板被100 μ 1細(xì)胞懸浮液填充。在 細(xì)胞接種后的當(dāng)天，在顯微鏡下尋找孔中的單細(xì)胞。包含一個細(xì)胞的孔被標(biāo)記并被進(jìn)一步 地觀察。必要時，進(jìn)行預(yù)處理的ExCeII325PF CHO的添加和交換。當(dāng)細(xì)胞死亡或者在下兩 個星期中沒有細(xì)胞分裂，相應(yīng)的孔被排除于實驗之外。兩個單細(xì)胞顯示了生長。發(fā)展的克隆，達(dá)到合適的大小時，被轉(zhuǎn)移至24孔板的孔 中。這里，根據(jù)生長和培養(yǎng)的要求同樣可以進(jìn)行預(yù)處理的ExCeII 325PF CHO的交換。在培 養(yǎng)第7天和第10天亞克隆CJ06-19/5F10和CJ06-19/1E8被分別轉(zhuǎn)移至T25燒瓶中。在ExCell培養(yǎng)基中制備ECB。這些ECB代表了用于涉及兩個亞克隆的進(jìn)一步研究 中的起始材料，該研究是例如從購買昂貴的培養(yǎng)基適應(yīng)至更加經(jīng)濟(jì)的由巴克斯特自己研發(fā) 的配方。亞克隆CJ06-19/5F10、CJ06-42的ECB在ExCeII325PF CHO培養(yǎng)基中從T25擴(kuò)增 至T75，再至T175，然后轉(zhuǎn)至Bellco旋轉(zhuǎn)器中。在第21天來自于T175培養(yǎng)的由10個小瓶 組成的 ECB/CJ06-63 被冷凍。亞克隆 CJ06-19/1E8、CJ06-43 的 ECB 也在 ExCeII325PFCH0 培養(yǎng)基中擴(kuò)增。培養(yǎng)物從T25擴(kuò)增至T75，再至T175，然后轉(zhuǎn)至Bellco旋轉(zhuǎn)器中。在第18 天，來自于T175培養(yǎng)的由10個小瓶組成的ECB/CJ06-64被冷凍。使ECB(亞克隆5F10和1E8)適應(yīng)BCS，如下所示。在實驗CJ06-66中ECB克隆 CJ06-19的亞克隆CJ06-19/5F10被解凍，然后將體積逐漸增加的BCS培養(yǎng)基加至ExCeII培 養(yǎng)基中，細(xì)胞脫離ExCeII培養(yǎng)基，獲得能在BCS培養(yǎng)基中生長的能力。按類似方式使ECB 克隆CJ06-19的亞克隆CJ06-19/1E8同時適應(yīng)BCS培養(yǎng)基。表8顯示了所有的在本研究期間被制備的無血清細(xì)胞庫。表8 表達(dá)rFurin的CHO細(xì)胞克隆#488_3的無血清細(xì)胞庫的總結(jié) PMCB#01、PMCB#04、亞克隆5F10和1E8的比較如表9所示。表9 :PMCB#01、PMCB#04、亞克隆 5F10 和 1E8 的比較 在CJ06-69以及SK06-49和SK06-63試驗中，培養(yǎng)的細(xì)胞種群代表用于PMCB細(xì)胞系的前體培養(yǎng)物。細(xì)胞在BAS培養(yǎng)基中(添加有Put、Glut、Synp.Fe和Zn)生長并分別作 為PMCB#01和PMCB#04被冷凍。亞克隆5F10和1E8在市場上可買到的JRH產(chǎn)的培養(yǎng)基ExCeII 325PFCH0中培養(yǎng)。 因為在基于BAS配方的培養(yǎng)基中的生長能力是優(yōu)選的，PMCB#01和PMCB#04被選中用于進(jìn) 一步的rFurin的生產(chǎn)。如表10中所示，PCMB#04與PCMB#01相比顯示了更好的生長現(xiàn)象。PMCB#04的存 活率和生長速率比較高，世代加倍時間較短。貫穿整個評估時段rFurin的細(xì)胞特異性以及 體積產(chǎn)量比率也比較大。在進(jìn)一步的實驗中，關(guān)于存活率的數(shù)據(jù)被確定。每個PMCB的一個 安瓿被解凍在含有BCS培養(yǎng)基的T175的燒瓶中，并用Zn作為添加劑。如表10中所顯示， PMCB#04的存活率再次比PMCB#01的大。表10 :PMCB#01 和 PMBC#04 的解凍實驗 因此，PMCB#04被選中作為用于rFurin主細(xì)胞庫(MCB)的進(jìn)一步生產(chǎn)和所有進(jìn) 一步的工作細(xì)胞庫(WCB)的原材料。根據(jù)當(dāng)前的良好組織規(guī)范建立由20個小瓶組成的 PMCB#04。根據(jù)ICH指南Q5D進(jìn)行質(zhì)量管理(QC)檢驗。在生產(chǎn)過程中PMCB#04被選中用于 生產(chǎn) rFurin。生長培養(yǎng)基不含人的或者動物的衍生物質(zhì)并且是自身發(fā)展的。通過過濾將細(xì)胞去 除，包含rFurin的上清液通過超濾濃縮。純化后通過交換色譜法，rFurin溶液的活性的目 標(biāo)至少是200單位rFurin/mL·進(jìn)行支原體、病毒、外來因子、無菌和表達(dá)效力的檢驗。用于選則的標(biāo)準(zhǔn)是高弗林 蛋白酶活性(比如弗林蛋白酶蛋白，酶聯(lián)免疫吸附試驗)和在免疫熒光(FACS)中的細(xì)胞種 群的均一性，分別在不同的亞克隆上進(jìn)行與初始的克隆#488-3和#289-20的比較。此外， 雜質(zhì)分布被定性地比較(比如通過反相HPLC后的紫外峰圖式或者通過SDS-PAGE/考馬斯 亮藍(lán)技術(shù))。實施例3 在無動物蛋白培養(yǎng)基中生產(chǎn)重組弗林蛋白酶的最優(yōu)化這個實施例描述了用于表達(dá)rFurin的CHO克隆#488-3培養(yǎng)的發(fā)展和優(yōu)化過程。 進(jìn)行關(guān)于氨基酸、葡萄糖和NaHCO3濃度的特定培養(yǎng)基的優(yōu)化，導(dǎo)致細(xì)胞生長速度的增加 和發(fā)酵過程中產(chǎn)率的提高。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方對于p02(10%、20%和50%)進(jìn)行在 線控制過程參數(shù)的優(yōu)化，以及進(jìn)行因子試驗確定最佳的pH(范圍7. 1-7. 3)和溫度(范圍 35. I0C -37. 90C )，導(dǎo)致了在較低的溫度35°C _36°C之間進(jìn)行發(fā)酵時CHO克隆#488-3產(chǎn)量 的顯著增加。作為可能的生產(chǎn)模式，比較恒化培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)，表明兩個過程類型都適合 rFurin的生產(chǎn)，并且在相同的參數(shù)設(shè)置下給出了類似的產(chǎn)量。進(jìn)行特定的實驗以便研究在不同生物反應(yīng)器設(shè)置中的攪拌類型和速度的影響。研究顯示，比生長速率和表達(dá)速率、細(xì)胞 密度以及因此的體積產(chǎn)率都會因生物反應(yīng)器設(shè)置的不同而受到強(qiáng)烈的影響，并且在增加攪 拌速度的情況下產(chǎn)量可能會顯著地增加?？偠灾瑀Furin上游過程的主要參數(shù)的影響關(guān) 于它們的作用被很好地檢定，并且高產(chǎn)量過程可能被轉(zhuǎn)移至中試，用于臨床前和臨床生產(chǎn)。 細(xì)節(jié)如下所示。亞克隆#488-03被在內(nèi)部開發(fā)，并被適應(yīng)于無血清和無胰島素的培養(yǎng)基。在作為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方的無FBS和無胰島素的培養(yǎng)基(BACD培養(yǎng)基)(參見表11)中進(jìn)行以下實 驗。表11 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分(BA⑶培養(yǎng)基) 為了加快細(xì)胞生長和提供用于細(xì)胞增殖的最佳條件，進(jìn)行恒化培養(yǎng)上清液的氨基 酸分析(參見表12)。結(jié)果是，三個必需氨基酸被加到培養(yǎng)基中，是甲硫氨酸(10mg/L)、亮 氨酸(40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L)。在37°C、pH 7. 15以及20%的p02下的1. 5L的生物 反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵。表12 通過HPLC進(jìn)行氨基酸分析 BACD_24_06_014_026...基礎(chǔ)培養(yǎng)基(材料和方法)FUR 06/10M04K06...發(fā)酵批次，培養(yǎng)第 6 天FUR_06/10_M04_K07...發(fā)酵批次，培養(yǎng)第 7 天基礎(chǔ)培養(yǎng)基的HPLC圖中各自的氨基酸的峰面積被調(diào)整至100%。通過比較恒化培 養(yǎng)第6天和第7天獲得的峰面積，確定各個氨基酸的減少。由于培養(yǎng)上清液中的谷氨酰胺濃度低，谷氨酰胺被添加至培養(yǎng)基(300mg/L)中以 便給出最終的谷氨酰胺濃度在900mg/L。在添加谷氨酰胺至培養(yǎng)基后，生長速率從0. 55CT1 增加至0. 67CT1 (參見表13和14)。通過添加上述三個氨基酸(甲硫氨酸(10mg/L)、亮氨酸 (40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L))至培養(yǎng)基中，細(xì)胞的生長速率可能被再次提高(0. 69(1’
27(參見表15)。體積產(chǎn)率上升至大約267kU/L/d( = +13%),并且比生產(chǎn)率顯示了 16%的提 高。培養(yǎng)基中谷氨酰胺、甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的添加顯示了在細(xì)胞生長、體積和比 活性上的積極作用，因此被保留用于進(jìn)一步的培養(yǎng)基配制。表13 從培養(yǎng)第6天至第9天，恒化培養(yǎng)FUR_06/10_M04的發(fā)酵數(shù)據(jù) 表14 在第12天補(bǔ)充300mg/L谷氨酰胺至培養(yǎng)基后恒化培養(yǎng)FUR_06/10_M04的
發(fā)酵數(shù)據(jù) 表15 在第22天添加甲硫氨酸(10mg/L)、亮氨酸(40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L) 至培養(yǎng)基后恒化培養(yǎng)FUR_06/10-M04的發(fā)酵數(shù)據(jù)。
為了檢測在培養(yǎng)基中補(bǔ)充的氨基酸的量是否足夠，進(jìn)行了另一種恒化培養(yǎng)(IOL) 的氨基酸分析。300mg/L谷氨酰胺和三個氨基酸的各自的量被補(bǔ)加至培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)第 7天和第15天抽取樣品，并且培養(yǎng)條件與上述的類似。結(jié)果(參見表16，只顯示了甲硫氨 酸、亮氨酸和苯丙氨酸的數(shù)據(jù))確證了有足夠量的被補(bǔ)充的氨基酸存在于發(fā)酵液中。
表16 在補(bǔ)充了谷氨酰胺(300mg/L)、甲硫氨酸(10mg/L)，亮氨酸(40mg/L)苯丙 氨酸(10mg/L)的恒化培養(yǎng)物(FUR06/17_F04)中甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的相對含量。 NaHCO3濃度的減少和葡萄糖濃度的增加。細(xì)胞培養(yǎng)物中高度溶解的CO2濃度對 生長和產(chǎn)率的影響被研究。由于在生物反應(yīng)器中大規(guī)模的生產(chǎn)，可以預(yù)期CO2的濃度比在 2. 5-32L的生物反應(yīng)器中的濃度要大。因此，平行進(jìn)行兩個發(fā)酵流程，一個流程的CO2濃度 大約是7.5%，另一個CO2濃度大約是12%。通過改變液面上部氣流中CO2的組分進(jìn)行CO2 濃度的調(diào)整。通過用NOVA儀器分析抽取的樣品，細(xì)胞培養(yǎng)的CO2濃度被測定。在37°C、pH 7. 15和20%的p02下進(jìn)行發(fā)酵。11-12%的CO2濃度對細(xì)胞生長和產(chǎn)量具有負(fù)面影響。在這個CO2濃度下，間隔12 天，在細(xì)胞計數(shù)是1. lxio6、并且稀釋率是0. 30CT1時，達(dá)到的生長速率是0. 29CT1。在CO2大 約7. 5%的發(fā)酵流程中，在相同的時間間隔下，在細(xì)胞計數(shù)是1.49xl06細(xì)胞/mL和稀釋率是 0.53CT1時，達(dá)到的生長速率是0. 52CT1。在高CO2濃度下，與7. 5% C02的95. 9%相比，存活 率減少至86. 1%。另外，體積生產(chǎn)率減少至大約36%并且比生產(chǎn)率減少至50%。由于高 CO2濃度，特定的葡萄糖攝入率也減少(-39%)。提高的CO2濃度(11-12%)對細(xì)胞生長和 產(chǎn)率的負(fù)面影響是非常明顯的，因此在7. 5% CO2下進(jìn)行時最佳的。如上所述，實驗顯示，在1000L生物反應(yīng)器中當(dāng)CO2濃度增加至12%時，可以預(yù)期 CHO-弗林蛋白酶克隆488-3的性能的劇烈下降。因此，可以決定將培養(yǎng)基中NaHCO3濃度從 2g/L減少至1.5g/L。培養(yǎng)基中較少量的NaHCO3也降低了培養(yǎng)基的緩沖能力。因此，比較 兩個發(fā)酵流程(IOL)，一個培養(yǎng)基中是3. 15g/L葡萄糖和2g/L的NaHCO3 (FURJ^/^LFOl)， 而另一個培養(yǎng)基中是4. 65g/L葡萄糖和1. 5g/L的NaHCO3 (FUR_06/26_F04)。為了模擬大規(guī)模生物反應(yīng)器(1000L)的條件，通過將CO2恒定地吹入至液面上 部，發(fā)酵期間具有2g/L NaHCO3的發(fā)酵液中溶解的CO2濃度調(diào)整至7-8% ；并且具有1. 5g/ LNaHCO3的發(fā)酵液中溶解的CO2濃度調(diào)整至6-7%。兩個培養(yǎng)物的生長速率是相似的(0.58 和0. 56CT1)，并且培養(yǎng)顯示了類似的體積產(chǎn)率和存活率。然而，在低NaHCO3濃度的培養(yǎng)中特 定的葡萄糖攝入率稍高(0. 83mg/106細(xì)胞/d對0. 67mg/106細(xì)胞/d)。因此，4. 65g/L的葡 萄糖濃度被認(rèn)為是合理的，并被保留在進(jìn)一步的培養(yǎng)基配制中。在弗林蛋白酶培養(yǎng)基中的Synperonic F68濃度的研究。細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中
SynperonicF68的常規(guī)濃度被設(shè)為0. 25g/L。培養(yǎng)基中Synperonic F68的目的是保護(hù)細(xì)胞
免于由于浸沒氧化而造成的損害。因此，在2X10L的生物反應(yīng)器中進(jìn)行一個實驗，在其中增加的Synperonic F68濃度是1. Og/L與常規(guī)的0. 25g/L濃度相比較地研究。在35. 8°C、 PH 7. 30和20%的p02下進(jìn)行發(fā)酵。隨著增加的Pluronic濃度(Synperonic F68)，有可能達(dá)到比較高的比生長速率 和細(xì)胞密度。因此，由于增加的比生產(chǎn)率，可以達(dá)到與278kU/L/d相比相應(yīng)更高的體積產(chǎn)率 365kU/L/d。收集這些實驗中的上清液，并用深度過濾器(Cimo Cart. Z08P4A30SP 4個盤片) 和隨后的膜過濾器(Pall Fluorodyne Il KA2DFLP2)過濾。被過濾的上清液通過超濾 (Sartorius30S 1463901E—SG PSU 10KD，0. 2m2)被濃縮，并用弗林蛋白酶滲濾緩沖液進(jìn) 行滲濾。無菌的被過濾的濃縮物(Sartorius Sartobran P 523130748-000. 45/0. 2 μ )在 Capto MMC柱上被純化。從純化實驗的結(jié)果顯示，增加Synperonic F68并沒有對純化的 rFurin的性質(zhì)和/或純度造成有害的影響。在Capto MMC柱子的洗脫物中沒有發(fā)現(xiàn)增加的 Synperonic F68濃度，在兩個洗脫物中都是< 0. 15mg/mL。盡管有這些結(jié)果，在rFurin培養(yǎng)基中的Synperonic F68濃度保持著初始濃度 0. 25g/L。然而，由于浸沒氧化以防萬一出現(xiàn)的放大問題，可以考慮增加Synperonic濃度直 至1. Og/L，可能會增加產(chǎn)量，并且不對最終的弗林蛋白酶產(chǎn)品存在有害的影響。最終的培養(yǎng)基組合物用于發(fā)酵中的rFurin生產(chǎn)。根據(jù)培養(yǎng)基優(yōu)化試驗，顯示下面 的培養(yǎng)基組合物對于在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中用于rFurin生產(chǎn)的CHO克隆488-3的發(fā)酵是最 佳的。表17 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分 不同的p02設(shè)置點對于生長速率和產(chǎn)率的影響也被研究。測定三個不同的PO2設(shè) 定值，即10%、20%和50%。在1.5L生物反應(yīng)器中通過將氣體吹過液面上部進(jìn)行實驗。在 35. l°C、pH 7. 20下進(jìn)行所有發(fā)酵流程。在10、20和50% p02下發(fā)酵流程的比較顯示，隨著 PO2設(shè)定值的提高，生長速率也稍有提高(0. 59、0. 62和0. 65CT1)。同樣地，在p0250%下體 積產(chǎn)率也是最高的。不同發(fā)酵的平均細(xì)胞計數(shù)是非常相似的。因此，體積產(chǎn)率的增加是生 長速率增加的結(jié)果。因此，50%的？02設(shè)定值似乎對生長速率有積極的作用，并且其結(jié)果是，體積產(chǎn)率 比標(biāo)準(zhǔn)條件(=20%的p02)高出約4%。沒有觀察到對存活率的影響。因此，可以確定p02 =20%的設(shè)定值和10% -50%的調(diào)節(jié)范圍適合于CHO克隆#488-3的發(fā)酵。優(yōu)化溫度和pH以便使的體積產(chǎn)率最大化。研究了 pH和溫度對CHO-弗林蛋白酶 克隆性能的影響。通過使用“實驗方法設(shè)計”，不同的溫度與不同的PH值相結(jié)合來確定導(dǎo)致 最大體積產(chǎn)率的條件。根據(jù)“Doehlert矩陣”，五個溫度與三個pH值相結(jié)合，得到了溫度和 PH的七個組合，如圖5所示。36. 5°C和pH 7. 20的組合被選中作為中心點，被應(yīng)用于兩個發(fā)酵批次中。表18給 出了用于不同發(fā)酵批次的培養(yǎng)條件。表18 =Doehlert矩陣的實驗設(shè)定不同發(fā)酵批次的培養(yǎng)條件 表 19 發(fā)酵 FUR_06/40-B01、-B03、-B04、-B06、-B08 以及 FUR_06/43-B02、-B05、-B07的發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值
D通過形成單個生產(chǎn)率的平均值來計算5天培養(yǎng)的平均體積和平均比生產(chǎn)率。利用表面響應(yīng)方法(RSM)，使用“Minitab”軟件來統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。RSM研究了在數(shù) 個解釋性變量與一個或多個反應(yīng)變量之間的關(guān)系。RSM的要旨是使用一組設(shè)計實驗來獲得 最佳響應(yīng)。分析集中在體積和比生產(chǎn)率以及生長速率上。關(guān)于體積產(chǎn)率的數(shù)據(jù)分析。作為第一步，繪制表面曲線圖(圖6)。圖6中數(shù)據(jù)的 坐標(biāo)被標(biāo)記為點。表面顯示了假設(shè)的單個數(shù)據(jù)的相關(guān)性。表面曲線圖認(rèn)為參數(shù)溫度/pH和響應(yīng)的體積產(chǎn)率之間線性相關(guān)。圖表顯示，隨著 溫度降低，體積產(chǎn)率增加。圖表認(rèn)為PH的影響是微弱的。隨后的計算顯示了數(shù)據(jù)的線性相 關(guān)性(沒有顯示計算方法)。通過方差分析，產(chǎn)生的方程描述了 pH、溫度和體積產(chǎn)率之間的 相關(guān)性P = 7693. 1-162. 4 X 溫度-202. 8 X pH基于數(shù)學(xué)模型產(chǎn)生的等高線圖(圖7)顯示了溫度和pH對體積產(chǎn)率的影響。這些 點顯示了已經(jīng)進(jìn)行過實驗測試的條件(pH/溫度)。等高線圖顯示，預(yù)期體積產(chǎn)率最大的區(qū)域是在35. 1°C和大約pH7. 10處。兩個值都 在實驗設(shè)計的邊緣處，這意味著實際的最大值甚至可能在這些數(shù)值以下被發(fā)現(xiàn)。此外，等高 線圖pH對體積產(chǎn)率的影響是邊緣性的，并且在低pH值時影響稍高。表面曲線圖(圖8)是三維顯示的數(shù)學(xué)模型，給出的結(jié)果與等高線圖相同溫度對 體積產(chǎn)率強(qiáng)烈的影響和PH對體積產(chǎn)率的微弱影響。關(guān)于生長速率μ的數(shù)據(jù)分析。生長速率與溫度、PH的相關(guān)性在二次方程中被描 述。再次發(fā)現(xiàn)溫度的強(qiáng)烈影響和PH的微弱影響。生長速率劇烈變化妨礙數(shù)學(xué)模式的設(shè)計。 方差分析和回歸給出了下列方程式P = -103. 539+5. 706 X 溫度-0. 079 X 溫度 2_0. 233 X ρΗ_0. 020 X pH2pH對于生長速率的影響在統(tǒng)計上是不能確定的，正如通過高P值所顯示的用于PH-術(shù)語，被計算是0. 99 (沒有顯示計算方法)。表面曲線圖(圖9)顯示了三維方法的模型相關(guān)性，表明了平方關(guān)系式并且顯示了 在36. 5°C下生長速率的最大值。數(shù)據(jù)分析顯示了比生產(chǎn)率與溫度及PH的相關(guān)性，其與體積產(chǎn)率(圖10)所示的相 關(guān)性相似。通過線性方程描述該相關(guān)性。PH的影響通過方差分析再次被證明是低的(沒有 顯示計算方法)qP = 4261. 40-93. 35 X 溫度-93. 77XpH。總之，用于溫度和pH優(yōu)化的實驗和隨后的數(shù)據(jù)分析給出了完全清楚的結(jié)果。最 高的體積產(chǎn)率，被認(rèn)為是最重要的過程優(yōu)化的參數(shù)，通過在最低的溫度(35. rc )和最低的 PH(7. 10)下培養(yǎng)可以達(dá)到。pH的影響在統(tǒng)計學(xué)上不是顯著的，在7. 10和7. 30之間的pH 值給出了非常相似的結(jié)果。通過將溫度從37°C降低至35. 1°C，體積產(chǎn)率可以從大約200kU/ 17(1增加至540奶/1/(1，高2.7倍(圖11)。根據(jù)這些結(jié)果，對于恒化模式中的CHO-弗林蛋 白酶克隆的培養(yǎng)，溫度和PH的新設(shè)定值被確定為35. 1°C和7. 15。恒化模式與分批補(bǔ)料模式的比較。低溫(35. I0C )下恒化模式中的CHO-弗林蛋 白酶克隆的培養(yǎng)物導(dǎo)致了小試(1.5L、2.5L、10L和32L)中的高產(chǎn)率，并被認(rèn)為是用于生產(chǎn) rFurin的大規(guī)模培養(yǎng)的合適培養(yǎng)方法。然而，大規(guī)模(在PPl工廠中的1200L生物反應(yīng)器) 的初始發(fā)酵流程顯示了在恒化模式下生長速率的急劇下降。作為另一種方式，為了獲得高 生產(chǎn)速率，在大規(guī)模發(fā)酵中設(shè)定分批補(bǔ)料模式。在IOL生物反應(yīng)器中進(jìn)行實驗，用于比較恒 化模式和分批補(bǔ)料模式的生長和產(chǎn)率。在36. 5°C、pH 7. 15和20%的p02下培養(yǎng)細(xì)胞。每 隔一天將分批培養(yǎng)液分流成細(xì)胞計數(shù)為0. 6-0. 7x IO6細(xì)胞/mL。恒化和分批補(bǔ)料發(fā)酵是平行進(jìn)行的，使用相同的細(xì)胞培養(yǎng)物作為接種物。以恒化 模式培養(yǎng)細(xì)胞直至第6天。然后將一個發(fā)酵流程轉(zhuǎn)變成分批補(bǔ)料模式(FUR_06_50-F03)， 同時另一個繼續(xù)為恒化模式(FUR_06_51-F04)。在分批補(bǔ)料模式中的培養(yǎng)導(dǎo)致了在批次結(jié) 束時平均細(xì)胞計數(shù)是2. 22xl06細(xì)胞/mL，生長速率是0. 64CT1 (表20)。在恒化模式中，獲得 了 0. 50CT1的生長速率并且平均細(xì)胞計數(shù)是1. 67xl06細(xì)胞/mL。由于在分批補(bǔ)料模式中的 較高細(xì)胞計數(shù)和生長速率，體積產(chǎn)率也較高(238對197kU/L/d)。數(shù)據(jù)顯示，對于IOL規(guī)模中的CHO-弗林蛋白酶克隆而言，分批補(bǔ)料模式是優(yōu)選的 培養(yǎng)方法，其得到了比恒化模式更高的體積產(chǎn)率(在36. 5°C和pH7. 15下)。然而，在分批 補(bǔ)料模式中，收獲和進(jìn)一步的下游處理受限于特定的間隔期。而在恒化模式下，收獲可以連 續(xù)地進(jìn)行。因此，每個方法都有其優(yōu)勢。在批次結(jié)束時，沒有像優(yōu)化細(xì)胞計數(shù)那樣進(jìn)行分批 補(bǔ)料模式參數(shù)的優(yōu)化實驗或者最佳分流比的優(yōu)化實驗。 表20 來自發(fā)酵流程FUR_06_51-F04 (恒化器)和Fur_06_50_F03 (分批補(bǔ)料)發(fā)
酵數(shù)據(jù)的平均值
1)在每個批次結(jié)束時(2個批次)的細(xì)胞計數(shù)的平均值2)在每個批次結(jié)束時(2個批次)的產(chǎn)率的平均值放大實驗研究。在不同的攪拌速度下比較Rushton類型和ball類型攪拌器。研 究攪拌器類型對于生長速率和產(chǎn)率的影響。在用于CHO-弗林蛋白酶克隆實驗的生物反應(yīng) 器中使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置包括Rushton攪拌器和四個擋板。用于rFurin生產(chǎn)的1000L生物反 應(yīng)器配備有三對ball攪拌器，沒有任何擋板。因此，在IOL生物反應(yīng)器中進(jìn)行實驗來測試 三個不同的設(shè)置一個反應(yīng)器配備標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置；另一個反應(yīng)器配備兩對ball攪拌器，沒有擋 板；第三個反應(yīng)器的配備與標(biāo)準(zhǔn)的相似，但是攪拌速度從170rpm減小至90rpm。表21給出了生物反應(yīng)器設(shè)置的綜述。60rpm的攪拌速度和ball攪拌器給出了與 rushton攪拌器在90rpm下相似的端速(參見表21)。然而，由于攪拌器的幾何形狀(形狀、 直徑)不同，端速不可能互相等同。表21 用于攪拌器/攪拌速度實驗的IOL生物反應(yīng)器設(shè)置 發(fā)酵條件如下37°C、pH7.15、20% 的？02和6_7% 的 pC02。(培養(yǎng)基4. 65g/L Glc,1.5g/L NaHCO3)。發(fā)酵數(shù)據(jù)比較顯示，在具有標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的生物反應(yīng)器中的性能，即配備 有rushton攪拌器并在170rpm的速度下攪拌，相比在具有另一個設(shè)置的反應(yīng)器中要高(表 22)。Ball攪拌器在60rpm下的使用，與rushton攪拌器在170rpm下的使用相比，導(dǎo)致了稍 微低的生長速率(0. 57對0. 61CT1)、較低的體積生產(chǎn)率(197對227kU/L/D)。使用rushton 攪拌器的攪拌式生物反應(yīng)器，攪拌速度是90rpm而不是170rpm，可以明顯地降低生長速率 (0. 54對0. 6Id"1)、體積生產(chǎn)率(175對227kU/L/D)和細(xì)胞比生產(chǎn)率(115對138U/106細(xì)胞 /天)。來自這個實驗的數(shù)據(jù)顯示，ball攪拌器在60rpm下與rushton攪拌器在減小的攪 拌速度下，兩者與rushton攪拌器在170rpm下相比，都導(dǎo)致了 CHO-弗林蛋白酶克隆的性 能的下降。不過，結(jié)果也顯示，使用ball攪拌器用于CHO-弗林蛋白酶克隆的培養(yǎng)是可能 的。在這些被測試的設(shè)置中，rushton攪拌器在170rpm下加上四個擋板的設(shè)置顯示為最差 的設(shè)置。然而值得注意的是，在這些條件下沒有觀察到細(xì)胞存活率的下降，顯示了被研究的 CHO-弗林蛋白酶克隆的較高機(jī)械耐受力。表22 在不同設(shè)置(攪拌器類型、擋板)下的生物反應(yīng)器中CHO-弗林蛋白酶克隆 的三個發(fā)酵流程的發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值 在32L生物反應(yīng)器中使用斜葉攪拌器(pitched blade impeller)，比較不同的攪 拌速度。對于PPl中GMP流程系列0RFURFB07002，生物反應(yīng)器(工作體積950L)配備有斜 葉攪拌器類型(2片，d = 700mm)而不是以前使用的ball類型攪拌器。在這個系列期間，進(jìn)行2天的分批補(bǔ)料循環(huán)。為了評估與以前系列相比較下的改 變，配置了 32L生物反應(yīng)器，具有相似類型的斜葉攪拌器(1片，d = 140mm)，并且使用來自 于PPl工廠的細(xì)胞懸浮液和培養(yǎng)基以便保證使用類似的材料。進(jìn)行相似的分批補(bǔ)料工藝，其中開始2-3個連續(xù)的兩天分批循環(huán)，起始細(xì)胞密度 是0. 5xl0E06細(xì)胞/mL。以2個不同的攪拌速度即55rpm和120rpm進(jìn)行實驗。培養(yǎng)條件與 在PPl中使用的培養(yǎng)條件相同PH-SP 7. 15，溫度-SP 35. 5°C，p02_SP 20%。在適應(yīng)了各 自的攪拌條件后，比較來自于最后批次的數(shù)據(jù)。表23 在32L生物反應(yīng)器中使用斜葉攪拌器的流程FUR_07/06_F07的各批次的生 長速率、細(xì)胞計數(shù)和體積生產(chǎn)率 1)每個批次結(jié)束時的細(xì)胞計數(shù)2)理論分流比被應(yīng)用于2個分批補(bǔ)料過程分流比=θΛ(2χμ)3)體積生產(chǎn)率的計算P= (1-(1/分流比))χ產(chǎn)物滴度/2天實驗再次表明攪拌條件對CHO克隆#488-3的比生長率的影響。當(dāng)采用相同的 起始細(xì)胞密度時，提高的生長速率導(dǎo)致了批次結(jié)束時的更高的最終細(xì)胞密度。體積產(chǎn)率 從276kU/L/D增加至445kU/L/D(+61% )，然而最終的細(xì)胞密度增加了 30% (1.95比上 1. 5xl0E06細(xì)胞/ml)。這些結(jié)果表明，增加攪拌速度對細(xì)胞比生產(chǎn)率有積極影響。同樣可以得出結(jié)論，導(dǎo)致平均產(chǎn)率大約是200kU/L/D的發(fā)酵流程主要是采用了低 攪拌速率20rpm的結(jié)果，而不是由于攪拌器設(shè)計本身造成的。在此可以得出結(jié)論，如果相應(yīng) 地調(diào)整攪拌速度，則斜葉攪拌器可以導(dǎo)致產(chǎn)量> 400kU/L/D。實施例4 重組弗林蛋白酶的純化(rFurin)這個實施例提供了用于過濾和純化rFurin的方法。被收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液首 先在深度過濾器(Cimo Zetaplus過濾器)上被過濾，使得它們無細(xì)胞和無顆粒，繼之以在 OjSymPVDF過濾器(PALL Fluorodyne II)上進(jìn)行膜過濾。被過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液含有 rFurin，然后在 Sartorius 產(chǎn)的 IOK PES UF 盒中(Sartocon PESU IOkDa)通過超濾濃縮， 濃縮倍數(shù)范圍是10-50。弗林蛋白酶濃縮物(弗林蛋白酶活性范圍是290-1700單位/ml) 在<-60°C下以等分被儲存。在致力于得到更加均一的rFurin制品用于VWF熟化過程的應(yīng)用中，進(jìn)行實驗的目 的在于部分純化來自于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的rFurin。部分純化的rFurin試劑易于使用于
39表征和釋放測試。它也導(dǎo)致了在VWF成熟過程中CHO寄主細(xì)胞蛋白的減少。開發(fā)了在陰離子交換樹脂上純化的工藝，需要< 5mS/cm(RT)的加樣電導(dǎo)率用于 有效的rFurin結(jié)合。然后進(jìn)行洗脫作為一個離子濃度大約是500-300mM NaCl的步驟，并且 在篩選階段期間，應(yīng)用梯度洗脫直至300mM的NaCl (參見表24綜述)。緩沖液由最初的pH 6. 7增加至7. 5以便提高加樣期間rFurin的結(jié)合，尤其是在高蛋白加樣下和高線性流速下 (參見表25相關(guān)的緩沖液綜述)。在EMD TMAE (Merk)和CaptoQ(GE Healthcare)陰離子交 換樹脂上進(jìn)行純化實驗，陰離子交換樹脂在填充穩(wěn)定性和操作的最大流速上是不同的。在 表26中概括的分析數(shù)據(jù)顯示，rFurin可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清液被濃縮直至362倍，產(chǎn)率范圍 為20-71%。取決于被采用的加樣，在洗脫層中的rFurin活性在639單位/ml和27651單 位/ml之間。發(fā)現(xiàn)洗脫物中CHO雜質(zhì)水平的范圍為10-134ng CHO蛋白/單位rFurin，并且 減少速率直至12. 3，比用CaptoQ樹脂發(fā)現(xiàn)的CHO減少有更好的表現(xiàn)?？傊?，通過陰離子交換色譜分離法純化rFurin被證明是用于濃縮的一種選擇，其 對于在< _60°C下儲存rFurin試劑是重要的。此外，CHO輕微減少3_12倍對于降低VWF制 備中CHO蛋白的濃度是重要的。表24 在陰離子交換樹脂上純化rFurin的大致工藝。對于EMD TMAE (Merck)，被 運用的流速是 150-75cm/h ；對于 CaptoQ (GE Healthcare)，流速是 600/300 表25 在陰離子交換樹脂上純化弗林蛋白酶的緩沖液 表26 在陰離子交換樹脂上弗林蛋白酶相關(guān)純化實驗的綜述。使用Bradford測 試法確定總蛋白含量。CHO減少速度計算為加樣的CHO蛋白除以在洗脫收集液中發(fā)現(xiàn)的總 CHO蛋白。
實施例5 :rFurin濃度、純化和分析此實施例描述了用于大規(guī)模rFurin濃縮和純化(即下游過程)的其他方法。這 些加工方法包括超濾、滲濾和capto-MMC色譜分離法，在基本上無動物蛋白的rFurin的生 產(chǎn)中進(jìn)行這些方法。還描述了分析蛋白濃度、比活性以及被寄主細(xì)胞蛋白和DNA污染的方法。超濾。上清液(在恒化系列中大約是800_1200kg，在RFB系列中大約是 550-700kg)從細(xì)胞中分離，并通過超濾濃縮至最終體積35-45L。濃縮步驟中的超濾/滲濾 系統(tǒng)(UFS)的參數(shù)和設(shè)定值列于表27中。表27 濃縮步驟的操作參數(shù)和設(shè)定值 滲濾。在完成濃縮步驟之后，立即開始滯留物的滲濾。滲濾步驟中的UFS的參數(shù) 和設(shè)定值列于表28中。表28 滲濾步驟的操作參數(shù)和設(shè)定值 當(dāng)滯留物的電導(dǎo)率降至2mS/cm以下(用UFS在線的導(dǎo)電探針測定)時，此加工 步驟結(jié)束。需要低導(dǎo)電率以便確保在隨后的純化步驟中rFurin與色譜膠的定量結(jié)合。滲 濾產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移，并且通過添加IM醋酸溶液調(diào)整滲濾產(chǎn)物的pH值至6. 0。產(chǎn)物在被施加至 Capto-MMC柱之前，被儲存在室溫下(RT)。Capto-MMC色譜分離法。Capto-MMC凝膠，一種多峰陽離子交換劑，被用于結(jié)合rFurin并去除滲濾產(chǎn)品中的大多數(shù)污染物。在色譜膠平衡后，滲濾產(chǎn)物被加樣至柱子上。 0. 22 μ m的過濾管被安裝以便進(jìn)行滲濾產(chǎn)品的在線過濾。表29中詳細(xì)列出進(jìn)一步的色譜分 離步驟。表29 =Capto-MMC色譜分離步驟 DCV =柱體積在色譜柱中填充樹脂的體積在下游過程中，沒有觀察到結(jié)果。下游步驟(過濾、超濾、滲濾)進(jìn)行的條件可以 與針對恒化培養(yǎng)中的收獲物使用的條件相同。平均總rFurin活性產(chǎn)量可以達(dá)到91% (系 列0RFU06002)、66% (系列0RFU07001)和84% (系列0RFU07002)。唯一的小改變是以下 的這個事實用于超濾步驟的起始體積與連續(xù)培養(yǎng)相比有點低。但是這個改變對純化產(chǎn)品 的質(zhì)量沒有影響。(參見總活性、寄主細(xì)胞DNA、寄主細(xì)胞蛋白數(shù)據(jù)；參見表30)。這三個系列中寄主細(xì)胞蛋白和寄主細(xì)胞DNA含量的平均值顯示了相當(dāng)?shù)偷钠骄?值分別是 8. 55 μ g/ml (范圍是 2. 2-10. 4 μ g/ml)和 13. 48ng/ml (范圍是 0. 0-23. 9ng/ ml)(參見表30)。色譜分離步驟能降低特定的污染物至低的平均值0.35ng CHO蛋白/U rFurin活性(范圍是0. 13-0. 52ng CHO蛋白/U)和0. 148pg寄主細(xì)胞DNA/U rFurin活性 (范圍是 0. 0-0. 365pg DNA/U rFurin 活性)。表30 =Capto-MMC色譜分離雜質(zhì)結(jié)果-系列比較 弗林蛋白酶表征。通過下面的生物化學(xué)/生物物理方法對rFurin的性質(zhì)和功能 進(jìn)行評估(表31)。表31 用于rFurin的分析方法 弗林蛋白酶活性測試。純化的rFurin批次(Capto-MMC洗脫收集液)被用于檢測 弗林蛋白酶的酶活性。底物是短合成肽，其包含附著于熒光氨甲基香豆素(AMC)基團(tuán)的二 堿基識別序列，在切割后被釋放出來(B0C-RVRR-AMC)。釋放的熒光基團(tuán)可以通過在380nm 處激發(fā)并隨后在435nm處測定發(fā)射光而被檢測出來。一個活性單位定義為在30°C下每分鐘 釋放IpMol的AMC。取決于發(fā)酵和純化有效性，rFurin活性的測定值在大約10000U/ml直到大于大約 100000U/ml的范圍內(nèi)，平均值為大約69000U/ml (表32、表32和表34)。注意到RFB模式 系列的rFurin活性的增加，尤其是當(dāng)恒化系列0RFU06002 (47737U/ml)平均值與RFB系列 0RFU07001 (77653U/ml)和 0RFU07002 (93178U/ml)平均值比較。(總體來說，rFurin 活性 范圍是大約10000至大于100000U/ml ；沒有顯示所有的數(shù)據(jù))。弗林蛋白酶比活性表示為活性U/ μ g蛋白(參見表32-34)。系列0RFU06002平均 比活性是269U/ μ g蛋白。分別地，0RFU07001增加至500U/ μ g和0RFU07002增加至563U/ yg。(總體來說，比活性范圍是124-620U/yg蛋白；沒有顯示數(shù)據(jù))。因此，兩個RFB系列 的比活性加倍，與恒化模式生產(chǎn)的批次比較，RFB rFurin的結(jié)果是酶活性較高。表32 :0RFU06002 系列 Capto-MMC 洗脫收集液
45
平均值47737180 269表33 :0RFU07001 系列 Capto-MMC 洗脫物
平均值77653165 SOO表34 :0RFU07002 系列 Capto-MMC 洗脫物
平均值93178167 563 弗林蛋白酶-應(yīng)用-活性試驗。設(shè)計弗林蛋白酶_應(yīng)用-試驗用來定量rFurin 處理前VWF成為成熟的rVWF的有效性。熟化有效性被表示為熟化1個VWF抗原單位所需 要的弗林蛋白酶單位的量(U弗林蛋白酶/U VWF)。底物是前VWF/VWF制品，此制品根據(jù)當(dāng) 前的制造工序在中試規(guī)模中被純化，但是省略了弗林蛋白酶熟化和最后在Superose 6上 純化的步驟。rVWF底物濃度是100U抗原/ml (F8HL 24 01 UF02-R)。
四個樣品稀釋物在Iml的微量離心管中被檢測，覆蓋了特定的弗林蛋白酶濃度 比如0. 25-2. OU/U VffF0反應(yīng)和稀釋緩沖液是IOOmM的HEPES、lmM CaCl2、pH 7. 0并且熟化 實驗在輕微攪拌下在37°C下進(jìn)行16個小時。在溫育后通過添加SDS-樣品緩沖液并且在 > 90°C下加熱樣品5分鐘來終止酶反應(yīng)。通過SDS-PAGE在8%的凝膠上使用銀染法將分 離的多肽染色來分析樣品。得到>95%的熟化有效性所需要的弗林蛋白酶比活性可以通過 凝膠的目測檢查來評估(前VEF條帶應(yīng)當(dāng)小于成熟VWF條帶的5% )，然后被報導(dǎo)并被用作 被檢測的rFurin的質(zhì)量屬性。表35 :0RFU06002 系列 Capto-MMC 洗脫收集液 表36 :0RFU07001 系列 Capto-MMC 洗脫收集液 表37 :0RFU07002 系列 Capto-MMC 洗脫收集液 發(fā)現(xiàn)所有檢測的rFurin批次對于前VWF具有好的和一致的熟化活性。這些系列的 平均值在1.0U弗林蛋白酶/U VWF:抗原以下，并且在任何情況中成熟度都超過95%。(表 35-37)。就系列0RFU06002、0RFU07001和0RFU07002的計算平均值而言，所有rFurin批次 的熟化活性都是類似的，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)恒化模式生產(chǎn)的rFurin和RFB模式生產(chǎn)的rFurin 之間的差異。弗林蛋白酶SDS-PAGE和銀染。所有的rFurin批次都進(jìn)行了 8 % SDS-PAGE和 銀染及蛋白質(zhì)印跡分析，以便確保一致的質(zhì)量并使雜質(zhì)程度目視化。如圖12所示，系列 0RFU06002和0RFU07002的Capto-MMC洗脫物的條帶模式相互關(guān)聯(lián)度很高；所有樣品在大 約60kDa處顯示了明顯的弗林蛋白酶條帶。在0RFU06002系列的樣品中從MMCOl批次到 MMC08批次可以看見弗林蛋白酶條帶有分子量輕微降低的趨勢(圖12，泳道1-8)。那些批 次的樣品被去糖基化，造成了這個趨勢在隨后的SDS-PAGE和銀染中不再可目測(沒有顯示 數(shù)據(jù))，這就支持了如下假說在系列0RFU06002期間，在正在進(jìn)行的發(fā)酵過程中rFurin糖 基化稍有不同或者差異程度更小。在RFB系列0RFU07002中沒有觀察到這個趨勢，表明在 整個系列中rFurin恒定的糖基化。批次0RFU06002至0RFU07002中的雜質(zhì)幾乎完全相同； 然而，RFB模式系列0RFU07002中的樣品在40kDa區(qū)域(在系列0RFU06002的樣品中特別 強(qiáng)烈富集的多肽)顯示了不明顯的區(qū)帶。SDS-PAGE蛋白質(zhì)印跡。使用單克隆抗弗林蛋白酶抗體對所有的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(圖13)。在約60kDa處的主要條帶可以被鑒定為弗林蛋白酶條帶，并在所有的樣 品中被發(fā)現(xiàn)。樣品的相似性很高。條帶強(qiáng)度上的細(xì)微差別是由于樣品中弗林蛋白酶濃度不 同?？傮w來說，SDS-PAGE分析描繪了恒化模式和RFB模式生產(chǎn)的rFurin的相似性。為了支持常規(guī)的SDS-PAGE，在系列0RFU06002和0RFU07002的樣品上進(jìn)行等電聚 焦(IEF)。使用垂直IEF在pH 7.0和pH 3. 0之間進(jìn)行IEF。通過考馬斯染色和蛋白質(zhì)印 跡分析使多肽可視化。系列0RFU06002 rFurin樣品的IEF和隨后的蛋白質(zhì)印跡法提供了 弗林蛋白酶特定的條帶圖形(參見圖14)。在pH 4. 5至pH 5. 5的區(qū)域可以確定多達(dá)七個 分開的條帶，在所有的樣品中至少有五個條帶存在。使用考馬斯著色和蛋白質(zhì)印跡分析對系列0RFU07002樣品進(jìn)行IEF用于目測。所 有樣品的考馬斯染色顯示了特定的條帶模式，顯示在PH 4. 5至pH 5. 5范圍內(nèi)至少五個分 開的條帶，可以確定多達(dá)八個條帶(參見圖15，泳道3)。蛋白質(zhì)印跡分析(參見圖16)確證了這些結(jié)果，有些樣品顯示在考馬斯凝膠上并 非所有條帶都是可見的(參見圖17)，可能由于蛋白從凝膠到印跡膜上不完全的轉(zhuǎn)移。弗林蛋白酶反相HPLC。來自于系列0RFU06002和0RFU07003 (Capto-MMC洗脫物) 的樣品通過C4RP-HPLC進(jìn)行檢測，以便建立用于rFurin的指紋圖譜。比較了兩個系列的樣 品的峰圖譜(參見圖17和圖18)。所以被檢測的樣品的色譜在大約13分鐘的保留時間處顯示了特征性主峰，可以 被認(rèn)定是弗林蛋白酶。峰高度與樣品中弗林蛋白酶的濃度很好地相關(guān)。在8分鐘至17分 鐘的范圍內(nèi)可以看見其它蛋白雜質(zhì)以較小的峰出現(xiàn)。來自系列0RFU07002的所有樣品比來 自0RFU06002的樣品顯示了明顯少的和小的雜質(zhì)峰。這個事實與RFB模式系列0RFU07002 的SDS-PAGE結(jié)果充分一致，因為在RFB模式系列0RFU07002中發(fā)現(xiàn)較小數(shù)量且數(shù)量減少的 雜質(zhì)。從上述討論的檢定方法中獲得的分析數(shù)據(jù)證明了在恒化模式和RFB模式兩者中 產(chǎn)生的rFurin具有很好的相似性。從得到的數(shù)據(jù)中沒有檢測出rFurin性質(zhì)上的差異，然 而，以RFB模式生產(chǎn)的rFurin批次比以恒化模式生產(chǎn)的rFurin有更高的比活性和更少的 雜質(zhì)。色譜分離步驟統(tǒng)計了在大體積制劑物質(zhì)(Bulk Drug Substance,BDS)中非常低的寄 主細(xì)胞蛋白和寄主細(xì)胞DNA含量。至少包括RFB發(fā)酵和整個下游加工過程(過濾、超濾/ 滲濾、Capto-MMC色譜分離法)的完整生產(chǎn)過程是可能容易實現(xiàn)的，以用于rFurin的工業(yè) 生產(chǎn)，比如在單個使用的生物反應(yīng)器(SUB)系統(tǒng)中。實施例6 安全性、無菌性和穩(wěn)定性試驗這個實施例描述了安全性、無菌性和穩(wěn)定性試驗，進(jìn)行這些試驗以便測定和維持 CHO細(xì)胞庫的質(zhì)量。根據(jù)ICH指南Q5D的要求進(jìn)行無菌/菌原體檢測。細(xì)胞庫的質(zhì)量得通 過測定解凍細(xì)胞的平均存活率和細(xì)胞密度和隨后的培養(yǎng)的生長速率來檢測。細(xì)胞進(jìn)行病毒安全性檢測(表38)、遺傳穩(wěn)定性檢測(表39)和同一性檢測(表 40)。細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)是無菌的，不含菌原體、外來因子、逆轉(zhuǎn)錄病毒，對于MVM病毒、外來病毒、 嚙齒類動物病毒是呈陰性的，不含豬和牛病毒、Cache Vallley病毒(CW)。通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)分析來檢測細(xì)胞庫的弗林蛋白酶生產(chǎn)者/非生產(chǎn)者比 率。還測試它們的長期穩(wěn)定性(一段時間內(nèi)生產(chǎn)弗林蛋白酶的能力)。更進(jìn)一步地，還得研 究在無血清條件下生產(chǎn)的被分泌的弗林蛋白酶的產(chǎn)生的同工型。所有的數(shù)據(jù)顯示，使用這
49些細(xì)胞庫可以完成穩(wěn)定生長和弗林蛋白酶的生產(chǎn)。在整個生產(chǎn)過程中來自于MCB/WCB的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)顯示穩(wěn)定生長和弗林蛋白酶表達(dá)。表38.病毒安全性項目 在MEPC由其制備的WCB上沒有進(jìn)行病毒測定。
表39.遺傳穩(wěn)定性項目 表40.同一性項目 本發(fā)明已經(jīng)描述了已發(fā)現(xiàn)的或者打算做的具體的實施方式，以便包括優(yōu)選方式用 于以后發(fā)明的實驗操作。根據(jù)本文的公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在不違背本發(fā)明范圍 的情況下，本發(fā)明具體實施方式
能夠具有各種修飾和改變。因此，本發(fā)明附后的權(quán)利要求覆 蓋了本發(fā)明范圍內(nèi)的所有的這些等效的變型。
權(quán)利要求
一種包含基本上無動物蛋白的重組體弗林蛋白酶的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約10000U弗林蛋白酶 /mL的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約11 μ g蛋白/mL的CHO寄主細(xì)胞蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約10000U弗林蛋白酶 /mL的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約1. Ong蛋白/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主細(xì)胞蛋 白。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約10000U弗林蛋白酶 /mL的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約14ng DNA/mL的CHO寄主細(xì)胞DNA。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約10000U弗林蛋白酶 /mL的重組體弗林蛋白酶和濃度小于大約0. 5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主細(xì)胞 DNA。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約100U/μg的重組體 弗林蛋白酶和濃度小于大約11 μ g蛋白/mL的CHO寄主細(xì)胞蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約100U/μg的重組體 弗林蛋白酶和濃度小于大約1. Ong蛋白/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主細(xì)胞蛋白。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約100U/μg的重組體 弗林蛋白酶和濃度小于大約14ng DNA/mL的CHO寄主細(xì)胞DNA。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包含活性至少是大約100U/μg的重組體 弗林蛋白酶和濃度小于大約0. 5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主細(xì)胞DNA。
10.一種制造基本上無動物蛋白的重組體弗林蛋白酶的方法，包括以下步驟在無血 清培養(yǎng)基中在允許弗林蛋白酶分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)用編碼弗林蛋白酶的多核苷 酸轉(zhuǎn)化的或者轉(zhuǎn)染的寄主細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，包括下述步驟使寄主細(xì)胞適應(yīng)在血清濃 度逐漸降低、直至血清從培養(yǎng)基中被除去的培養(yǎng)基中生長。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，包括使寄主細(xì)胞由在含有血清的培養(yǎng)基 中生長轉(zhuǎn)移至在無血清的培養(yǎng)基中生長。
13.如權(quán)利要求11或者12所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
14.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述組合物的方法，包括下述步驟在可將前肽從前蛋白中 切除從而形成成熟蛋白的條件下使前蛋白與所述組合物相接觸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述成熟蛋白是馮威勒布蘭特因子。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述成熟蛋白是因子VIL
全文摘要
本發(fā)明涉及重組體弗林蛋白酶(rFurin)及生產(chǎn)rFurin的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及基本上無動物蛋白的rFurin以及生產(chǎn)基本上無動物蛋白rFurin的方法。
文檔編號C12P21/02GK101910401SQ200880124083
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月31日
發(fā)明者利奧波德·格里爾博格, 巴巴拉·普萊莫爾, 曼弗雷德·賴特爾, 梅因哈德·哈希拉徹, 羅蘭·蓋伊爾, 西蒙·馮菲爾克斯, 阿圖爾·米特雷爾 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司