專利名稱：用于生產(chǎn)乙醇酸的固定的微生物腈水解酶的改進的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及有機酸的合成和微生物學領域。更具體地，提供了一種方法以改進 具有腈水解酶活性的脫水酶催化劑在重新水化之后將乙醇腈水解為乙醇酸的比活性。特 別地，提供了一種方法，在進行脫水之前以戊二醛預處理具有腈水解酶活性的酶催化 齊U、將戊二醛預處理的細胞固定并將固定的細胞進行化學交聯(lián)。在重新水化之后，相 對于那些經(jīng)過脫水和重新水化但沒有進行過所述過程的具有腈水解酶活性的酶催化劑來 說，本發(fā)明的酶催化劑顯示出改進的腈水解酶比活性。
背景技術：
乙醇酸(HOCH2COOH ； CAS注冊號為79-14-1)是羧酸的α -羥基酸家族的 最簡單的成員。乙醇酸的性質(zhì)使其具有理想的廣范圍的消費和工業(yè)應用，包括用于水井 復原、皮革工業(yè)、油氣工業(yè)、洗衣和紡織工業(yè)、作為單體制備聚乙醇酸(PGA)，以及作 為個人護理產(chǎn)品的成分。乙醇酸還是多種工業(yè)上的清潔劑(奶制品和食品加工設備清潔 齊U，家居和機構清潔劑，工業(yè)清潔劑[用于運輸設備、石工技術、印刷電路板、不銹鋼 鍋爐和處理設備、冷卻塔/熱交換器]和金屬加工[用于金屬酸洗、銅的拋光、蝕刻、電 鍍、電解法拋光])的主要成分。也有報道指出乙醇酸可作為氣體屏障材料(即顯示出高 度的氧氣屏障特性)用于包裝食物和碳酸飲料(WO 2005/106005 Al)。但是，乙醇酸的 傳統(tǒng)化學合成產(chǎn)生大量的雜質(zhì)，在使用前必須除去這些雜質(zhì)。工業(yè)界迫切需要商業(yè)化生 產(chǎn)乙醇酸的新技術，特別是以低成本生產(chǎn)高純度乙醇酸的新技術。微生物酶催化劑能夠使用腈水解酶(EC 3.5.5.7)將腈(例如乙醇腈)直接水解為 相應的羧酸(例如乙醇酸)，其中不產(chǎn)生相應的酰胺中間體(反應式1)；或者可通過腈水 合酶(EC 4.2.1.84)與酰胺酶(EC 3.5.1.4)的組合將腈(例如乙醇腈)水解為相應的羧酸 (例如乙醇酸)，其中腈水合酶(NHase)首先將腈轉(zhuǎn)化為酰胺，然后酰胺被酰胺酶轉(zhuǎn)化成 相應的羧酸(反應式2)
腈水解酶
⑴ HOCH2CN 2^0* HOCH2CO2H + NH3
NH
(2)HOCH2CN 二HOCH2CONH2 ——^ HOCH2CO2H + NH3
Μ2 H2O用于商業(yè)目的的腈至乙醇酸的酶法水解需要通過發(fā)酵產(chǎn)生高體積的酶催化劑。 這些體積中多數(shù)來源于發(fā)酵液中的水含量。由于所述的高體積發(fā)酵液的緣故，所以包含 酶催化劑的發(fā)酵液的儲存以及(在很多情況下)運輸引起物流和經(jīng)濟上的問題。提供酶催化劑的儲存和運輸上的簡便性的原理是將酶從發(fā)酵液中分離出來，將酶催化劑固定(例 如，通過角叉菜膠凝膠截留)，并將固定的酶催化劑脫水。在用于生產(chǎn)乙醇酸之前可以將 固定的酶催化劑重新水化。但是，脫水和重新水化經(jīng)常引起嚴重的酶活性的損失。以前已經(jīng)描述過固定的細胞催化劑的脫水或干燥。US 5,998,180描述了產(chǎn)生干 燥的固定的微生物腈水解酶的方法，其中含有所述腈水解酶的紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 40757或NCIMB 408333細胞在固定于交聯(lián)的聚丙烯酰胺珠子以后 保留了其至少80%的初始活性；在60°C將交聯(lián)的聚丙烯酰胺珠子干燥至12%的濕度以 后，所產(chǎn)生的固定的細胞腈水解酶保留了其至少90%的初始固定活性。B.DeGiuli0等 人(World J.Microbiol.Biotechnol.21 739-746，(2005))描述了藻酸鈣中的乳酸細菌的固 定，然后將產(chǎn)生的固定的細胞催化劑凍干，其中至少72%的細胞在凍干后保留了代謝活 性。US 5,846,762描述了含有共價固定的纖維二糖酶的明膠珠子的脫水，在第6欄第9_11 行記載一旦脫水之后，藻酸鈣和κ-角叉菜膠珠子一般不能被重新水化。上文剛剛描述的將固定的酶催化劑脫水或凍干然后重新水化的方法中沒有一個 報道重新水化之后回收的酶活性的改進，或者當所產(chǎn)生的重新水化的酶催化劑應用于將 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的反應時，酶活性的穩(wěn)定性的改進(與不是通過戊二醛預處理的細胞制 備的可比較的重新水化的固定的酶催化劑相比)。除了由于酶催化劑處理導致酶催化劑活性損失之外(例如在脫水/重新水化的情 況下)乙醇腈至乙醇酸的酶法水解通常需要實質(zhì)上純的形式的乙醇腈。以前曾經(jīng)報道過 通過甲醛和氰化氫的水溶液的反應合成乙醇腈的方法(US 2,175,805 ； US 2,890,238 ；和 US 5,187,301 ；反應式 3)。
(3) HCN + HCHO = HOCH2CN但是，這些方法通常產(chǎn)生水性的乙醇腈反應產(chǎn)物，其需要進行深度純化(例如 蒸餾純化)，因為很多雜質(zhì)和/或反應的副產(chǎn)物(包括多余的反應物甲醛)可能干擾乙醇 腈至乙醇酸的酶法轉(zhuǎn)化，包括抑制催化劑活性(即降低比活性)。特別地，眾所周知甲 醛能夠通過與來自N-末端氨基酸殘基和精氨酸、半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基的側(cè)鏈 的氨基基團發(fā)生反應而在蛋白中產(chǎn)生不想要的修飾(Metz等人，J.Biol.Chem.，279(8) 6235-6243(2004))。催化劑活性的抑制降低催化劑的總體生產(chǎn)力(即每克催化劑形成的 乙醇酸的總克數(shù))，這顯著增加了總體過程的成本，使得與化學合成相比酶法生產(chǎn)可能在 經(jīng)濟上不可行。因此，需要這樣的反應條件其能夠保護酶活性以抵抗那些降低催化劑 活性的不想要的雜質(zhì)。已經(jīng)報道了通過在乙醇腈合成反應之前將甲醛進行加熱處理從而產(chǎn)生高純度乙 醇腈的方法(US 11/3143865和US 11/314905 ；反應式3)。但是，乙醇腈能夠可逆地分 解成甲醛和氰化氫。因此，仍然需要保護腈水解酶活性以抵抗由乙醇腈分解產(chǎn)生的甲醛 和氰化氫的不良效應。US 5,508,181還描述了將腈化合物轉(zhuǎn)化為α -羥基酸時與酶催化劑的迅速滅活 相關的類似困難。具體地，US 5,508,181記載根據(jù)分解平衡，α-羥基腈化合物部分 分解為相應的醛。據(jù)報道，這些醛通過與蛋白結(jié)合而在短時間內(nèi)將酶滅活，因此難以 從α-羥基腈以高生產(chǎn)力獲得高濃度的α-羥基酸或α-羥基酰胺(第2欄，第16_29行)。作為防止由于醛的累積而使酶滅活的手段，向反應混合物中加入磷酸鹽或次磷酸鹽 離子。類似地，US 5,326,702描述了使用亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽或連二亞硫酸鹽離子捕 獲醛并防止酶滅活，但是其得出結(jié)論即使使用這樣的添加物，所產(chǎn)生和積累的α-羥 基酸的濃度也不足以滿足多數(shù)商業(yè)目的。 此外，U.S.6,037,155教導α -羥基酸產(chǎn)物的低積累與分解的醛的積累造成的短 時間內(nèi)的酶滅活有關。這些發(fā)明人提示在氰化氫(在水以及相應的醛或酮中α-羥基腈部 分分解產(chǎn)生氰化氫(Mowry，David T., Chemical Reviews, Vol.42, 189-283 頁(1948))) 存在時酶活性被抑制(Asano 等人，AgriculturalBiological Chemistry，Vol.46, 1165-1174 頁(1982))。發(fā)明人通過使用微生物(其酶活性可以通過向反應混合物中加入氰物質(zhì)而被 改進)而解決了醛誘導的酶滅活的問題。氰物質(zhì)的加入限制了 α-羥基腈向醛和氰化氫 的分解。雖然這個策略對系統(tǒng)提供了益處，但是其僅解決了與乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸中的 酶滅活相關的一個方面，即，如上所述，已知乙醇腈可逆地分解為氰化氫和甲醛，二者 均已知對酶催化劑活性具有消極效應。已經(jīng)開發(fā)了一種單獨的方法以在存在甲醛的情況下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時 保護具有腈水解酶活性的酶催化劑的比活性(參見同一申請人的美國專利申請XX/ XXXXXX(CL3584),通過引用并入本文)，其中通過向反應混合物中加入胺保護劑或者 通過將腈水解酶催化劑固定于基質(zhì)(含有胺保護劑，例如ΡΕΙ、聚烯丙胺、PVOH/聚乙 烯胺等)中或基質(zhì)上而獲得了催化劑活性和穩(wěn)定性的顯著改進。在該系統(tǒng)中，改進了甲 醛存在時的催化劑的比活性。雖然上面描述的方法很多都改進了腈水解酶催化劑對于乙醇酸的生產(chǎn)力，但是 在所述催化劑用于水解乙醇腈的水解反應時(例如，在具有催化劑循環(huán)的連續(xù)批式反應 中，或在啟動連續(xù)攪拌槽式反應(CSTR)或固定床柱式反應器的初始階段)通常仍然觀察 到固定的微生物腈水解酶的初始酶活性的顯著下降。通過在固定于角叉菜膠之前以戊二 醛預處理微生物催化劑部分解決了乙醇腈水解過程中初始的腈水解酶活性顯著下降的問 題(如同一申請人的美國專利申請XX/XXXXXX(CL3888)中所描述，通過引用并入本 文)，其中在乙醇腈水解為乙醇酸(作為銨鹽)的過程中保留了顯著較高百分率的初始固 定的微生物腈水解酶比活性(每克催化劑每分鐘水解的乙醇腈的ymole數(shù))。U.S.4,288,552記載(第1欄，第46-49行和第2欄，第50-55行)戊二醛敏感 性酶(例如巰基酶(例如腈水解酶)和其它在酶分子的活性位點或非常接近活性位點的地 方具有SH基團的酶)被巰基反應性試劑例如戊二醛滅活。因此，不僅不能預見在固定之 前以戊二醛預處理具有腈水解酶活性的酶催化劑不會引起微生物腈水解酶活性的顯著降 低，反而驚奇地發(fā)現(xiàn)以戊二醛進行預處理對于酶催化劑活性是有益的，特別是在用于將 乙醇腈水解為乙醇酸之前，將固定的酶催化劑脫水然后又重新水化時。本發(fā)明的方法防 止脫水/重新水化步驟中顯著的活性損失，并產(chǎn)生重新水化的固定的酶催化劑，該酶催 化劑具有初始活性以及在后續(xù)將重新水化的固定的酶活性用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸之 時酶催化劑活性的后續(xù)穩(wěn)定性。這個益處引入本文描述的方法——其解決了商業(yè)過程的 需要，包括脫水步驟，用于產(chǎn)生具有改進的比活性(用于在重新水化后生產(chǎn)乙醇酸)的酶 催化劑。因此，待解決的問題是需要一種商業(yè)上可行的方法以用于產(chǎn)生具有腈水解酶活性的酶催化劑，用于以改進的比活性將乙醇腈水解為乙醇酸。更具體地，需要一種商 業(yè)上可接受的方法以使用具有腈水解酶活性的酶催化劑將乙醇腈水解為乙醇酸，使由于 使用前的脫水和重新水化以及由于雜質(zhì)或反應物的分解造成滅活而引起的酶活性的損失 最小化。 發(fā)明概述目前的問題通過提供用于產(chǎn)生在重新水化后具有改進的比活性的脫水的固定酶 催化劑并將所述酶催化劑用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的方法而獲得解決，所述方法包 括(a)通過發(fā)酵產(chǎn)生具有腈水解酶活性的酶催化劑；(b)以戊二醛預處理所述酶催化劑；(c)任選地在戊二醛預處理之后以亞硫酸氫鹽將未反應的戊二醛滅活；(d)從(b)或(C)回收酶催化劑并將所述酶催化劑固定于角叉菜膠中；(e)以戊二醛和聚乙烯亞胺將(d)中產(chǎn)生的角叉菜膠-固定的酶催化劑進行交 聯(lián)；和(f)將步驟(e)中產(chǎn)生的交聯(lián)的固定的酶催化劑脫水。本發(fā)明的另一個方面是在水溶液中將以上步驟(f)的脫水的固定的催化劑重新水 化。另外，在水溶液中將所述重新水化的酶催化劑與乙醇腈接觸，從而產(chǎn)生乙醇酸。在 另一個方面，從所述水溶液中回收乙醇酸。當用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸(作為銨鹽)的時候，相對于那些在固定、交聯(lián)、 脫水和重新水化之前沒有使用戊二醛將酶催化劑進行預處理而制備的固定的酶催化劑來 說，通過以上的步驟a)至f)的方法產(chǎn)生的固定的酶催化劑保留了顯著較高百分率的其初 始比活性(每克催化劑每分鐘水解的乙醇腈的ymole數(shù))。本發(fā)明的另一個方面在于脫水的酶催化劑作為改進的具有腈水解酶活性的酶 催化劑。所述脫水的酶催化劑在重新水化后保留其比活性的至少大約70%、至少大約 75%,至少大約80%、至少大約85%或至少大約90%。附圖、序列表和生物保藏說明可以從附圖、序列表、生物保藏和一起構成本申請的詳細說明書更全面地理解 本發(fā)明。MM

圖1中圖板A-G是各種腈水解酶序列的CLUSTALW比對(版本1.83，使用缺省 參數(shù))。以灰色陰影標出了催化劑半胱氨酸殘基周圍的保守性催化劑標志(signature)序 列。用下劃線標出了代表催化三元組(triad) (G1u48、Lys130和Cys164 ；編號基于SEQ ID NO 4的氨基酸序列)的氨基酸。序列表以下序列描述和所附序列表符合37C.F.R. § 1.821-1.825列出的關于專利申請中 的核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則規(guī)定。序列描述中對于核苷酸序列符號使用單字 母代碼，對于氨基酸使用三字母代碼，符合IUPAC-IYUB標準(如Nucleic Acids Research 13: 3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219 (No.2) 345-373 (1984)所描述，通過引 用并入本文)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式符合37C.F.R. § 1.822.列出的規(guī)定。SEQ ID NO 1是包含腈水解酶的必需半胱氨酸殘基的催化標志基序的氨基酸序 列(式1)。SEQ ID NO 2是包含腈水解酶的必需半胱氨酸殘基的優(yōu)選催化劑標志基序的氨 基酸序列(式2)。SEQ ID NO 3是敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) 72W腈水解酶編碼序列的核苷 酸序列，其中包含起始密碼子從TTG至ATG的改變以促進在大腸桿菌中的重組表達。SEQ ID NO 4是敏捷食酸菌72W腈水解酶(ATCC 55746)的推導氨基酸序列。SEQ ID NO 5 是固氮糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis) JM3 腈水解酶( GENBANK BAA02684.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 6是紫紅紅球菌Jl腈水解酶(GENBANK Q03217)的氨基酸序列。 SEQ ID NO 7是紫紅紅球菌K22腈水解酶(GENBANK Q02068)的氨基酸序列。SEQ ID NO 8 是諾卡氏菌屬(Nocardia sp.) C-14-1 腈水解酶(GENBANK AAX18182.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 9 是支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica) RB50 腈水解酶 (GENBANK NP_887662.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 10 是擬南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶(GENBANK AAB60275.1 和 AAA19627.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 11 是細長聚球藻(Synechococcus elongatus) PCC 7942 腈水解酶( GENBANK YP_399857.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 12 是細長聚球藻 PCC 6301 腈水解酶(GENBANK YP_171411.1)的氨基酸序列。SEQ IDNO 13 是集胞藻屬(Synechocystis sp.)PCC 6803 腈水解酶( GENBANK NP_442646.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 14 是嗜蟲假單胞菌(Pseudomonas entomophila) L48 腈水解酶( GENBANK ΥΡ_6090481.ι)的氨基酸序列。SEQ ID NO 15是運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas moblis)腈水解酶的氨基酸序列 (GENBANK YP—162942.1)。SEQ ID NO 16 是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) OxB-I 腈水解酶(GENBANK BAA90460.1)的氨基酸序列。 SEQ ID NO 17 是睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)腈水解酶( GENBANK AAA82085.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 18 是藍細菌屬(Synechococcus sp.) CC9605 腈水解酶( GENBANK YP_381420.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 19 是熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) Pf-5 腈水解酶( GENBANK YP_260015.I)的氨基酸序列。SEQ ID NO 20 是鼻疽諾 卡菌(Nocardia farcinica) IFM 10152 腈水解酶(GENBANK YP_119480.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 21 是固氮糞產(chǎn)堿菌 1650 腈水解酶(GENBANK AAY06506.1)
的氨基酸序列。SEQ ID NO 22 是丁 香假單胞桿菌 丁香致病變種(Pseudomonas syringaepv. syringae)B728a 腈水解酶(GENBANK AAY35081.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 23 是慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium sp.) BTAil 腈水解酶( GENBΑΝΚ ΖΡ_00859948.1)的氨基酸序列。SEQ ID NO 24 是紫紅紅球菌 NCIMB 11216 腈水解酶(GENBΑΝΚ CAC88237)的氨基酸序列。SEQ ID NO 25是紫紅紅球菌ATCC 39484的氨基酸序列。SEQ ID NO 26是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201Q ； Leu — Gln)。SEQ ID NO 27是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 26)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Gin)。SEQ ID NO 28是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201A ； Leu — Ala)。SEQ ID NO 29是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 28)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Ala)。SEQ ID NO 30是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201C ； Leu — Cys)。SEQ ID NO 31是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 30)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Cys)。SEQ ID NO 32是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201T ； Leu — Thr)。SEQ ID NO 33是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 32)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Thr)。SEQ ID NO 34是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201G ； Leu — Gly)。SEQ ID NO 35是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 34)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Gly)。SEQ ID NO 36是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201H ； Leu — His)。SEQ ID NO 37是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 36)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — His)。SEQ ID NO 38是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201K ； Leu — Lys)。SEQ ID NO 39是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 38)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Lys)。SEQ ID NO 40是敏捷食酸 菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201N ； Leu — Asn)。SEQ ID NO 41是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 40)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Asn)。SEQ ID NO 42是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 201位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(L201S ； Leu — Ser)。SEQ ID NO 43是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 42)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位殘基含有單一氨基酸取代(Leu201 — Ser)。SEQ ID NO 44是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(F168K ； Phe — Lys)。SEQ ID NO 45是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 44)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位殘基含有單一氨基酸取代(Phel68 — Lys)。SEQ ID NO 46是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(F168M ； Phe — Met)。SEQ ID NO 47是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 46)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位殘基含有單一氨基酸取代(Phel68 — Met)。SEQ ID NO 48是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(F168T ； Phe — Thr)。SEQ ID NO 49是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 48)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位殘基含有單一氨基酸取代(Phel68 — Thr)。SEQ ID NO 50是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(F168V ； Phe — Val)。SEQ ID NO 51是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 50)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位殘基含有單一氨基酸取代(Phel68 — Val)。SEQ ID NO 52是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(T210A ； Thr — Ala)。SEQ ID NO 53是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 52)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的210位殘基含有單一氨基酸取代(Thr210 — Ala)。SEQ ID NO 54是敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其包含引起 168位殘基上單一氨基酸取代的密碼子改變(T210C ； Thr — Cys)。SEQ ID NO 55是突變的腈水解酶(SEQ ID NO 54)的推導氨基酸序列，其在 敏捷食酸菌72W腈水解酶的210位殘基含有單一氨基酸取代(Thr210 — Cys)。SEQ ID NO 56是在大腸桿菌菌株SSlOOl (ATCC PTA-1177)中 表達的敏捷食酸 菌72W腈水解酶的核苷酸序列。SEQ ID NO 57是在大腸桿菌菌株SSlOOl (ATCC PTA-1177)中表達的敏捷食酸 菌72W腈水解酶的推導氨基酸序列。生物保藏根據(jù)國際承認用于專利程序目的的微生物保存布達佩斯條約的條款作出以下生 物保藏保藏者鑒別參考國際保藏機構指定保藏日期敏捷食酸菌72W ATCC 55746 1996年3月8日 大腸桿菌 SSlOOl ATCC PTA-1177 2000 年 1 月 11 日本文所用的“ATCC” 是指位于 ATCC，10801 University Blvd.，Manassas, VA 20110 2209, USA 的 American Type Culture Collection International Depository Authority。
“國際保藏機構指定”是ATCC保藏的培養(yǎng)物的編號。所列的保藏將在指明的國際保藏機構保持至少三十(30)年，在公開這些保藏的 專利授權之后公眾可以獲得這些保藏。保藏的獲得不構成實施本發(fā)明(損害由政府行為 授予的專利權)的許可證。發(fā)明詳述提供了一種改進具有腈水解酶活性的脫水的固定的和交聯(lián)的用于在重新水化之 后將乙醇腈水解為乙醇酸的酶催化劑的比活性的方法。特別地，提供了一種方法，以戊 二醛預處理具有腈水解酶活性的酶催化劑、將戊二醛預處理的細胞固定并將固定的細胞 進行化學交聯(lián)，然后脫水。在重新水化之后，戊二醛預處理的固定的和交聯(lián)的酶催化劑 相對于那些經(jīng)過脫水和重新水化但沒有進行過所述過程的具有腈水解酶活性的固定的和 交聯(lián)的酶催化劑來說，顯示出改進的腈水解酶比活性。定義在本公開中使用了一些術語和縮寫。除非另有特別指明，否則適用以下定義。本文所用的術語“包含”意思是存在如權利要求中提到的指明的特征、整體、 步驟或成分，但是不排除另外的一個或多個其它特征、整體、步驟、成分或其組合的存在。本文所用的修飾本發(fā)明所用的成分或反應試劑的數(shù)量的術語“大約”是指數(shù)值 量的差異，所述差異可以來自于，例如，在客觀世界中配制濃度或使用溶液時的典型的 測量和液體操作程序；這些程序中不經(jīng)意的錯誤；制備組合物或?qū)嵤┓椒〞r所用的成分 的生產(chǎn)商、來源或純度；等等。術語“大約”還包括由來自特定的初始混合物的組合物 的不同平衡條件所產(chǎn)生的數(shù)量上的差異。不論是否以術語“大約”進行修飾，權利要求 均包括數(shù)量的等同物。在一個實施方式中，術語“大約”意思是在報告的數(shù)值的10%以 內(nèi)，優(yōu)選在報告的數(shù)值的5%以內(nèi).本文所用的術語“乙醇腈”縮寫為“GLN”，其與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥 甲基腈和CAS注冊號107-16-4的所有其它同義物是同義的。本文所用的術語“乙醇酸”縮寫為“GLA”，其與羥基乙酸 (hydroxyaceticacid)、羥基乙酸(hydroxyethanoic acid)和 CAS 注冊號 79_14_1 的所有其它 同義物是同義的。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的乙醇酸可以是質(zhì)子化羧酸和/或相應的銨鹽 的形式。本文所用的術語“乙醇酸銨”縮寫為“NH4GLA”。本文所用的術語“羥乙酰胺”是氨與乙醇酸反應產(chǎn)生的酰胺，指具有CAS注冊 號598-42-5的化合物的所有其它同義物。本文所用的術語“乙交酯”是指CAS注冊號502-97-6的化合物。本文所用的術語“甲酸”縮寫為“FA”，其與蟻醛、甲基醛、氧甲烷和CAS 注冊號50-00-0的所有其它同義物是同義的。商售的甲醛通常包含單體甲醛(“自由甲醛”)和各種甲醛與一些甲醇的寡聚物(通常為大約lwt%至大約15wt% )。本文所用的術語“氰化氫”與氰酸、氫氰酸和CAS注冊號200-821-6的所有其 它同義物是同義的。本文所用的 術語“戊二醛”縮寫為“GA”，其與戊二醛(pentanedial)、1， 5-戊二酸(1, 5-pentanedial)、1，5-戊二酮(1, 5-pentanedione)、戊二酸(diglutaric aldehyde)、戊二酸(glutaral)、戊二酸(glutardialdehyde)、戊二 酸二酸(glutaric acid dialdehyde)、戊二醛(glutaric dialdehyde)和CAS注冊號111-30-8的所有其它同義物是同 義的。本文所用的術語“亞硫酸氫鹽”或“亞硫酸氫鈉”與亞硫酸鈉鹽、亞硫酸單鈉 鹽、亞ilt 酸氧 內(nèi)(hydrogen sodium sulfite)、亞lit 酸氧 內(nèi)(hydrogensulfite sodium)、亞lit 酸 單鈉、酸式亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、硫酸氫鈉(sodium bisulphate)、亞 硫酸氫鈉(sodium hydrogen sulfite)、亞硫酸鈉(sodium sulfite) (NaHS03)禾Π CAS 注冊號
7631-90-5的所有其它同義物是同義的。本文所用的術語“回收”意思是分離、純化或轉(zhuǎn)移通過本發(fā)明的方法形成的產(chǎn) 物。從反應混合物中分離和純化產(chǎn)物的方法在本領域是熟知的，包括但不限于選擇性 沉淀、結(jié)晶、過濾、反應性溶劑提取、離子交換、電滲析、聚合化、蒸餾、熱分解、醇 解、柱層析及其組合。在一個實施方式中，術語“回收”還可以包括將產(chǎn)物混合物(通 常在過濾掉酶催化劑之后)轉(zhuǎn)移至另一個反應以產(chǎn)生一個或多個另外的產(chǎn)物。在優(yōu)選的 實施方式中，使用離子交換來回收乙醇酸。本文所用的術語“酶催化劑”、“腈水解酶催化劑”或“微生物細胞催化劑” 是指這樣的催化劑，其特征在于具有將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸和氨的腈水解酶活性(即包 含至少一個具有腈水解酶活性的多肽)。腈水解酶將腈(優(yōu)選為脂肪族的腈)直接轉(zhuǎn)化 為相應的羧酸，不形成相應的作為中間體的酰胺(見反應式1)。腈水解酶共同具有幾個 本領域已知的保守性標志結(jié)構域，包括在本文中稱為“催化標志序列”或“標志序列” 的標志結(jié)構域。該區(qū)域包含必需的半胱氨酸殘基(例如SEQ ID NO 4的Cys164)。因 此，可以通過是否存在催化結(jié)構域標志序列(SEQ ID NO: 1)而鑒定具有腈水解酶活性的 多肽。在優(yōu)選的實施方式中，標志序列是SEQ ID NO: 2。酶催化劑可以是整個微生物 細胞或透化的(permeabilized)微生物細胞的形式。本文所用的“循環(huán)使用的酶催化劑” 是指在批式或連續(xù)反應中作為酶催化劑重新使用的酶催化劑。取決于本文描述的產(chǎn)生或 使用酶催化劑的方法的步驟，酶催化劑可以是戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的和脫水或重 新水化的。本文所用的術語“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌 (A.facilis) ”可替換使用，是指保藏于American Type Culture Collection (—個國際保藏機
構)的保藏號為55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。以前已經(jīng)報道了源自敏 捷食酸菌72W的突變的腈水解酶，其特征在于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時具有改進的腈水 解酶活性(見同一申請人擁有的美國專利7,198,927)。這些源自敏捷食酸菌72W的突變的 腈水解酶的例子由 SEQ IDNO 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、 51、53和55提供。本文所用的術語“大腸桿菌(Escherichia coli) ”和“大腸桿菌(E.coli) ”可替換使用。本文描述了適合用于重組表達的幾個大腸桿菌菌株，包括但不限于，國際保藏號為ATCC 47076的大腸桿菌MG1655、國際保藏號為ATCC53911的大腸桿菌FM5、 國際保藏號為ATCC 27325的大腸桿菌W3110、國際保藏號為ATCC 35695的大腸桿菌 MC4100、國際保藏號為ATCC 12435的大腸桿菌W1485。在一個實施方式中，合適的大 腸桿菌菌株包括大腸桿菌FM5 (ATCC 53911)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076)。本文所用的術語“大腸桿菌SS1001”或“SS1001”是指ATCC保藏號 為PTA-1177的表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(見美國專利 6,870,038，通過引用全文并入本文)。重組表達的大腸桿菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 57)與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO 4)相比具有兩個微小序列改變。起 始密碼子從GTG變?yōu)锳TG以促進重組表達，并且在克隆時引入了引起接近C-末端的單 一氨基酸改變(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人造物。本文所用的術語“合適的水性乙醇腈反應混合物”和“合適的水性反應混合 物”是指材料(包括至少一種胺保護劑)和水，其中乙醇腈和酶催化劑相互接觸。本文 提供了合適的水性反應混合物的成分，本領域技術人員將認識到適合于本方法的成分變 化的范圍。本文所用的術語“水性乙醇酸銨溶液”、“包含乙醇酸銨的水溶液”和“乙醇 酸銨的水溶液”用于描述包含乙醇酸銨的水溶液，所述乙醇酸銨在通常的酶反應條件下 (即大約6至大約8的pH范圍)通過乙醇腈酶法水解產(chǎn)生。乙醇酸銨的水溶液包含濃度 為至少大約0.1重量％ (wt%)至大約99wt%的乙醇酸銨。在另一個實施方式中，乙醇酸 銨的水溶液包含至少大約10wt%至大約75wt%的乙醇酸銨。在另一個實施方式中，乙醇 酸銨的水溶液包含至少大約20wt%至大約50wt%的乙醇酸銨。乙醇酸銨的水溶液的pH 可以是大約2至大約12，優(yōu)選為5至大約10，更優(yōu)選為6至大約8?？梢栽趩优c從乙 醇酸銨的水溶液中回收乙醇酸(酸或鹽的形式)相關的方法步驟之前根據(jù)需要調(diào)整pH。本文所用的術語“催化劑生產(chǎn)力”和“酶催化劑生產(chǎn)力”是指每克酶催化劑干 細胞重產(chǎn)生的產(chǎn)物的總量。在本發(fā)明中，酶催化劑包含腈水解酶(EC3.5.5.7)，形成的產(chǎn) 物是乙醇酸和/或乙醇酸銨(取決于反應的pH)。一般地，與產(chǎn)生乙醇酸相關的生產(chǎn)過 程在基本上中性pH的條件下進行，從而產(chǎn)生的乙醇酸主要是相應的乙醇酸鹽的形式(即 乙醇酸銨)。一般地，在具有催化劑循環(huán)的批式反應中，催化劑活性隨著每個循環(huán)反應的 進行而降低(酶滅活)。本文所用的術語“單位體積生產(chǎn)力”是指反應中乙醇酸的單位體積產(chǎn)量，其表 示為單位時間內(nèi)每體積的反應混合物所產(chǎn)生的乙醇酸的克數(shù)。通常來講，單位體積生產(chǎn) 力表示為乙醇酸克數(shù)/L/h。術語“腈水解酶活性”或“比活性”是指將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸(或相應的 乙醇酸銨)時，每單位質(zhì)量(例如毫克)的蛋白、干細胞重或珠子重量(固定的催化劑) 的酶活性。腈水解酶活性的比較根據(jù)干細胞重或珠子重量成比例地測定。本文所用的術語“一單位的酶活性”或“一單位的腈水解酶活性”或“U”定 義為在指定溫度(例如25V )每分鐘生產(chǎn)Iymol的乙醇酸產(chǎn)物所需要的酶活性的數(shù)量 (GLA U/g干細胞重或珠子重量)。本文所用的術語“相對腈水解酶活性”、“改進的腈水解酶活性”和“腈水解酶活性的相對改進”是指以參考(對照)腈水解酶活性的倍數(shù)(或分數(shù))表示的腈水解酶 活性。本文描述的腈水解酶相對于原態(tài)(native)敏捷食酸菌72W腈水解酶中觀察到的腈 水解酶活性顯示出顯著性改進的腈水解酶活性。相對腈水解酶活性的“顯著性改進”是 指在相同反應條件下相對于對照的腈水解酶活性至少提高1.5倍的腈水解酶活性的改進。 在另一個實施方式中，改進是指在相同反應條件下相對于對照的腈水解酶活性至少提高2 倍的腈水解酶活性。在另一個實施方式中，改進是指在相同反應條件下相對于對照的腈 水解酶活性至少提高4倍的腈水解酶活性。本文所用的術語“初始反應速率”是在指定的反應條件下乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸 的速率的度量，其中在最初向反應混合物中加入乙醇腈后開始測定反應速率，并且在反 應過程中乙醇腈的濃度保持在約(ca.)50毫摩(mM)的時間段內(nèi)測定反應速率。按照單 位時間內(nèi)產(chǎn)生的乙醇酸的濃度變化來測定反應速率(例如乙醇酸摩爾數(shù)/L/分鐘或乙醇酸 毫摩爾數(shù)/小時)。本文所用的術語“初始比活性的改進的保留”是指在指定的反應條件下將 乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的過程中，在脫水和重新水化之后，戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的 酶催化劑與未經(jīng)戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的酶催化劑(二者均具有腈水解酶活性)的 比較，以每分鐘每克酶催化劑的干細胞重所產(chǎn)生的乙醇酸的微摩爾數(shù)或每分鐘每克固定 的交聯(lián)的酶催化劑所產(chǎn)生的乙醇酸的微摩爾數(shù)表示，其中，對于一個或多個后續(xù)反應而 言，戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的酶催化劑在重新水化之后的第一個或“初始”反應中 測定的比活性比未經(jīng)戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的酶催化劑的保留程度高。本文描述的 最顯著的改進是緊接初始的批式反應之后的那個反應所保留的活性數(shù)量，在具有催化劑 循環(huán)的一個或多個后續(xù)批式反應中測定。本文描述的第二顯著的改進是經(jīng)過脫水和重 新水化的戊二醛預處理的固定的交聯(lián)的酶催化劑的每克干細胞重產(chǎn)生至少40g乙醇酸之 后，在連續(xù)攪拌槽式反應器(CSTR)或固定床活塞流反應器或流化床或半流化床反應器 中的反應進行過程中所保留的活性數(shù)量。本文所用的術語“重組生物”、“轉(zhuǎn)化的宿主”、“轉(zhuǎn)化子”、“轉(zhuǎn)基因生物”
和“轉(zhuǎn)化的微生物宿主”是指經(jīng)過異源或外源DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明的重組生 物表達外源編碼序列或編碼活性腈水解酶的基因。“轉(zhuǎn)化”是指將DNA片段轉(zhuǎn)移進入 宿主生物。轉(zhuǎn)移的DNA片段可以整合入宿主生物的染色體或以非染色體方式進入宿主生 物(即通過載體)。本文所用的術語“轉(zhuǎn)化盒”是指含有一組遺傳元件(其進行方便的 排列以插入宿主細胞)的特異性DNA片段，通常是作為質(zhì)粒的一部分。本文所用的術 語“表達盒”是指含有一組遺傳元件(其方便的排列以插入宿主細胞)的特異性DNA片 段，通常是作為質(zhì)粒的一部分，還允許宿主中增強的基因表達。本文所用的術語“核酸片段”和“核酸分子”是指可以編碼整個基因的DNA 分子、編碼序列和/或編碼序列前面(5’，上游)或后面(3’，下游)的調(diào)控序列。在 一個方面，本發(fā)明的核 酸分子編碼具有腈水解酶活性的多肽。本文所用的術語“基因”是指表達特定蛋白的核酸分子。如本文所用，基因可 以包括或不包括編碼序列前面的調(diào)控序列(5’非編碼序列)和編碼序列后面的調(diào)控序列 (3’非編碼序列)。“嵌合基因”是指任何不是原態(tài)的基因，其包含不一起存在于原態(tài) 中的調(diào)控和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或來自相同來源但是按照與原態(tài)中發(fā)現(xiàn)的排列方式不同的方式排列的調(diào)控序列和編碼序 列。“內(nèi)源基因”是指位于生物基因組的天然位置的原態(tài)基因?！巴庠础被蚴侵竿?常不存在于宿主生物中，但是通過基 因轉(zhuǎn)移被導入宿主生物中的基因。外源基因可以包 含插入非原態(tài)生物的原態(tài)基因，或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化程序被導入基因組 的基因。本文所用的術語“編碼序列”是指編碼特異氨基酸序列的DNA序列。本文所 用的“合適的調(diào)控序列”是指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、編碼序列內(nèi)，或編 碼序列下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響轉(zhuǎn)錄、RNA的加工或穩(wěn)定性，或相 連的編碼序列的翻譯。調(diào)控序列可以包括啟動子、翻譯引導序列、內(nèi)含子、多腺苷化識 別序列、RNA加工位點、效應子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構?！皢幼印笔侵改軌蚩刂凭幋a序列或功能性RNA的表達的DNA序列。一般 地，編碼序列位于啟動子序列的3’端。啟動子可以以完整形式來源于原態(tài)基因，或者由 源自天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，甚至可以包含合成的DNA片段。在多數(shù)細 胞類型中在多數(shù)時候或多數(shù)環(huán)境條件下引起基因表達的啟動子通常被稱為“組成型啟動 子”。僅在特定化合物或環(huán)境條件存在時引起基因表達的啟動子通常被稱為“可誘導啟 動子”。由于在多數(shù)情況下調(diào)控序列的精確邊界已經(jīng)被完全確定，所以不同長度的DNA 片段可以具有相同的啟動子活性。本文所用的術語“可操作地連接”是指單個核酸分子上的核酸序列按照一個序 列的功能被另一個所影響的方式連接。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時(即 編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，啟動子與編碼序列是可操作地連接。編碼序列可以 按照正義或反義方向與調(diào)控序列可操作地連接。本文所用的術語“3’非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括 多腺苷化識別序列(通常限于真核細胞)和其它編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的 調(diào)控信號的序列。多腺苷化信號(通常限于真核細胞)的特征通常是影響向mRNA前體 的3’末端添加多腺苷酸束。本領域技術人員完全明白在使用核苷酸密碼子指定給定的氨基酸時特異的宿主 細胞顯示出的“密碼子偏向性”。因此，當為了在宿主細胞中改進的表達而合成基因 時，需要將該基因設計為其密碼子的使用反映宿主細胞中優(yōu)選的密碼子偏向性。對于源 自宿主細胞的基因的調(diào)查(其中序列信息是可以獲得的)可以確定其密碼子偏向性。密碼 子的最優(yōu)化是本領域熟知的，已經(jīng)描述了對于各種系統(tǒng)中的密碼子的最優(yōu)化，包括但不 限于酵母(Outchkourov等人，Protein Expr Purif，24(1) 18-24(2002))和大腸桿菌(Feng 等人，Biochemistry，39(50) 15399-15409(2000))。具有腈水解酶活件的酶催化劑所有的腈水解酶(EC 3.5.5.7)均具有保守性催化三元組(Glu，Lys和Cys) (Chauhan 等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.6l 118-122(2003) ； Pace, H.andBrenner, C., Genome Biol.[online computer file]2(l) reviewsOOOl.1-0001.9 (2001))。 所有已 知的腈水解酶均在酶活性位點具有親核的半胱氨酸(Cowan等人，Extremophiles，2 207-216(1998) ； Pace, H.andBrenner，C.,見上；和 Chauhan 等人，見上)并且都對巰 基反應劑的滅活敏感(l.OmM濃度的氯化銅、硝酸銀、醋酸汞或氯化鐵每個均引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性的大幅下降)。半胱氨酸殘基還能夠被不可逆地氧化為亞磺 酸，導致酶活性的損失。雖然腈水解酶對各種滅活機制有敏感性，但是固定的敏捷食酸 菌72W細胞是強壯的(robust)，能夠在多個循環(huán)反應后保留其大部分腈水解酶活性(US 6,870,038 ； U.S.7,148,051 ； U.S.7,198,927 ；和 Chauhan 等人，見上)。也已經(jīng)顯示源自敏 捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶催化劑催化α -羥基腈(即乙醇腈)向α -羥基羧酸 (即乙醇酸)的轉(zhuǎn)化(參見 US 6,383,786 ； US6,416,980 ；和 U.S.7,198,927)。已經(jīng)報道了敏捷食酸菌72W腈水解酶與其它細菌腈水解酶的序列比較(US 6,870,038 ； Chauhan等人，見上)。72W腈水解酶具有幾個保守性標志結(jié)構域，包括靠 近氨基末端處的16個氨基酸的區(qū)域(SEQ ID NO 4的氨基酸殘基40-55)和含有必需的 半胱氨酸殘基的12個氨基酸的催化區(qū)域(SEQ IDNO 4的氨基酸殘基160-171)。這個 必需的半胱氨酸殘基(SEQ ID NO 4的Cys164)以及保守性的谷氨酸(SEQ ID NO 4的 Glu48)和賴氨酸殘基(SEQID NO : 4的Lys1J構成在所有腈水解酶中發(fā)現(xiàn)的催化三元組 基序(Pace, H., and Brenner, C.,見上)。每個催化三元組殘基周圍的區(qū)域是高度保守的，特別是催化性半胱氨酸殘基周 圍的區(qū)域。必需的催化性半胱氨酸殘基位于被稱為“催化標志基序”或“標志基序” 的高度保守性區(qū)域內(nèi)。因此，本方法可用于保護包含式1(粗體代表嚴格保守性氨基酸殘 基，斜體殘基是顯示極小可變性的殘基[即3個或更少的氨基酸殘基的極小變化]，催化 性半胱氨酸殘基以下劃線標出)定義的催化標志基序的任意腈水解酶的酶活性式1(SEQID NO: 1)Gly-Xaa1-Xaa9-Xaa^-Cvs-Trp-Glu-Xaa4 ~Xaa^~XaaR-Xaa7-Xaas其中Xaal = Ala 或 Gly ；Xaa2 = Leu, Val 或 Ala ；Xaa3 = Ala, Asn, lie, Cys，Val 或 Gln ；Xaa4 = His 或 Asn ；Xaa5 = Leu, Tyr, Phe, Ala, Met, Lys，Val, Thr 或 Arg ；Xaa6 = Asn, Gin, Met, Leu 或 Ser ；Xaa7 = Pro 或 Thr ；禾口Xaa8 = Leu 或 Val。在優(yōu)選的實施方式中，式1的腈水解酶標志基序是Xaa1 = Ala或Gly ； Xaa2 = Leu ； Xaa3 = Ala, Asn, lie, Cys, Val 或 Gln ； Xaa4 = His ； Xaa5 = Leu, Tyr, Phe, Ala, Met, Lys, Val, Thr 或 Arg ; Xaa6 = Ser, Gin, Asn 或 Met; Xaa7 = Pro ；禾口 Xaa8 = Leu；從而產(chǎn)生由下式代表的催化標志基序Gly-Xaa1-Leu-Xaa3-Cys-Trp-Glu-His-Xaa5-Xaa6-Pro-Leu (SEQ ID NO 2)。在表1中提供了腈水解酶的例子，包括相應的催化標志基序序列的序列和位置。表1.保守性催化性半胱 氨酸區(qū)域_催化標志基序
權利要求
1.一種方法，用于產(chǎn)生具有改進的比活性的脫水的酶催化劑，所述酶催化劑具有腈 水解酶活性，所述方法包括(a)通過發(fā)酵產(chǎn)生具有腈水解酶活性的酶催化劑；(b)以戊二醛預處理所述酶催化劑；(c)任選地在戊二醛預處理之后以亞硫酸氫鹽將未反應的戊二醛滅活；(d)從(b)或(c)回收酶催化劑并將所述酶催化劑固定于角叉菜膠中；(e)以戊二醛和聚乙烯亞胺將(d)中產(chǎn)生的角叉菜膠-固定的酶催化劑進行交聯(lián)；和(f)將步驟(e)中產(chǎn)生的交聯(lián)的固定的酶催化劑脫水。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，還包括步驟(g)在水溶液中將步驟(f)的酶催化劑重新水化。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，還包括步驟(h)在合適的反應條件下，在水溶液中 將權利要求2的重新水化的酶催化劑與乙醇腈接觸，從而產(chǎn)生乙醇酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，還包括步驟⑴回收步驟(h)中產(chǎn)生的乙醇酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中(a)的酶催化劑包含氨基酸序列標志基序SEQID NO 1 或 SEQ ID NO 2。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述酶催化劑包含具有選自SEQIDN0: 4、5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55 和 57 的氨基酸序列的 多肽。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述酶催化劑是敏捷食酸菌72W。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述酶催化劑包含多肽，所述多肽具有選自SEQ ID NO 51和與SEQ ID NO 51具有至少95%同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在以戊二醛進行預處理的過程中pH保持在5.0 至 9.0。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(b)中以戊二醛進行預處理包括向步驟(a) 產(chǎn)生的發(fā)酵液中加入大約3g/L(0.025gGA/()D55(1)至大約5g/L (0.042g GA/OD55(1)的戊二醛。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(b)中以戊二醛進行預處理包括以50mg/ L/h至500mg/L/h的速率向步驟(a)產(chǎn)生的發(fā)酵液中加入戊二醛。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法產(chǎn)生的脫水的酶催化劑。
13.根據(jù)權利要求12所述的酶催化劑，其中所述催化劑在重新水化之后保留其至少大 約70%的將乙醇腈水解為乙醇酸的比活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，用于改進具有腈水解酶活性的脫水的用于在重新水化之后將乙醇腈水解為乙醇酸的酶催化劑的比活性。特別地，提供了一種方法，其包括，在脫水之前以戊二醛預處理具有腈水解酶活性的酶催化劑，將戊二醛預處理的酶催化劑固定并將酶催化劑進行化學交聯(lián)。在重新水化之后，酶催化劑相對于那些經(jīng)過脫水和重新水化但沒有進行過本文所述過程的的具有腈水解酶活性的酶催化劑來說，顯示出改進的腈水解酶比活性。
文檔編號C12N11/00GK102016018SQ200880124119
公開日2011年4月13日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權日2007年10月31日
發(fā)明者A·本-巴薩特, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司