專利名稱：在氮限制條件下具有改變的農(nóng)學(xué)特性的植物以及涉及編碼lnt2多肽及其同源物的基因的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率 和/或氮限制條件耐受性的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)非生物脅迫顯著地限制了作物產(chǎn)量。據(jù)評(píng)估這些因素累積地造成平均 70%的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量減少。植物是固著的，必須適應(yīng)它們周邊的主要環(huán)境條件。這已經(jīng)導(dǎo)致它 們發(fā)展出基因調(diào)控、形態(tài)發(fā)生、和代謝的高可塑性。適應(yīng)和防御機(jī)制策略涉及激活編碼對(duì)適 應(yīng)或防御不同脅迫重要的蛋白。植物氮吸收在它們的生長(zhǎng)中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306(2004))。植物從環(huán)境中的無(wú)機(jī)氮合成氨基酸。因此，氮肥已經(jīng)成為提高栽培植物如 玉米和大豆的產(chǎn)量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤(rùn)率，如今農(nóng)民期望減 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高。概 括地說(shuō)，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品種是所期望的?？衫眉せ顦?biāo)記來(lái)鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥屬中使用該方 法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件能夠顯著 激活和/或提高附近內(nèi)源基因的表達(dá)。該方法能被用于鑒定某一性狀(例如植物的氮利用 效率)的受關(guān)注的基因，當(dāng)所述基因經(jīng)轉(zhuǎn)基因進(jìn)入生物中時(shí)能改變?cè)撔誀?。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個(gè)實(shí)施方案中，在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建 體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多 肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行 比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的 對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA構(gòu)建 體包含(a)可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn) 行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；或(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地 連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50% 的序列同一性，或⑶核酸序列(b)⑴㈧的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因 的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或 部分比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽，并且其中在與不包含所述重組構(gòu) 建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào) 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步驟(a)后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含該DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出增 加的氮脅迫耐受性；并且任選地，(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植 物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體，并且在與不包含該DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí) 表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào) 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步驟(a)后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建 體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性；以及任選地，(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子 代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)評(píng)價(jià)該子 代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào) 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步驟(a)后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物 在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)子代植物在與不包含該重組DNA 構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性；在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào) 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步驟(a)后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建 體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變；以及任選地，(d)獲得源自該 轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及任選 地，(e)確定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植 物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào) 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步驟(a)后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物 在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(d)確定所述子代植物任選地在氮限制條件下 與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特征改變的方法，該方法包括(a)將包含至少一個(gè)調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該 調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域 所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多 肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn) 出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變；以及(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含 該抑制DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)確定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特征改變的方法，該方法包括(a)將包含至少一個(gè)調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該 調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域 所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多 肽；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行 比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)性狀的改變；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出 至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。以及任選地，(e)確定所述轉(zhuǎn)基因植物任選地在氮限制條件下與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)編碼 多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列和SEQID NO :18、24、或26的氨基酸序列 基于 Clustal V 比對(duì)方法具有至少 85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92 %、93 %、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ) 序列，其中所述核苷酸序列及其互補(bǔ)序列包含相同數(shù)目的核苷酸并且是100%互補(bǔ)的。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO :18、24、或26的氨基酸序列，并且該核苷酸序列包 含SEQ ID NO :17、23、或25的核苷酸序列。附圖簡(jiǎn)沭圖表以及序列表根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描 述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。

圖1示出pHSbarENDs2活化標(biāo)記構(gòu)建體的圖譜，該構(gòu)建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO 1)ο圖 2 示出載體 pDONR Zeo (SEQ ID NO 2)，GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl 位 點(diǎn)位于核苷酸570-801 ；attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754-2985 (互補(bǔ)鏈)。圖 3 示出載體 pDONR 221 (SEQ ID NO 3)，GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl 位 點(diǎn)位于核苷酸570-801 ；attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754-2985 (互補(bǔ)鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建擬南芥屬表 達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸11276-11399(互補(bǔ)鏈)；attR2位點(diǎn)位于核苷 酸9695-9819 (互補(bǔ)鏈)。圖5示出載體PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建大豆表達(dá)載體 的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點(diǎn)位于核苷酸8890-9014。圖6示出載體PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建Gaspe Flint 來(lái)源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點(diǎn)位 于核苷酸2899-3023。圖7示出載體PHP10523 (SEQ ID NO :7)的圖譜，該載體是存在于農(nóng)桿菌菌 株 LBA4404 中的質(zhì)粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用標(biāo)識(shí)符 59797027)。圖8示出PHP23235(SEQ ID NO 8)的圖譜，它是用于構(gòu)建目的載體PHP23236的載體。圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO 9)的圖譜。圖10示出目的載體PHP22655(SEQ ID NO 10)的圖譜。圖11示出用于篩選的五個(gè)品系(標(biāo)記為1至5，每個(gè)品系有^一個(gè)個(gè)體)，加上 野生型對(duì)照品系Cl (九個(gè)個(gè)體)的典型網(wǎng)格圖案。圖12示出通過(guò)圖像分析測(cè)定的若干個(gè)不同硝酸鉀濃度對(duì)植物顏色的效應(yīng)。綠色區(qū)(色調(diào)50至66)對(duì)氮?jiǎng)┝康捻憫?yīng)證明該區(qū)能被用于指示氮同化作用。圖13為實(shí)施例18中用于半水栽玉米生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。圖 14A 禾口 14B 示出擬南芥 LNT2 多肽(SEQ ID NO 28)和 LNT2 同源物(SEQ ID NO 18、20、24、26、30、32、33、和34)的全長(zhǎng)氨基酸序列的多重比對(duì)。圖15示出圖14A和14B中顯示的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值 的圖表。圖16示出在氮減少條件下(ImM KNO3)和最佳氮(6. 5mM KNO3)條件下篩選Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系的結(jié)果。評(píng)估四個(gè)包含PHP29689的事件的多個(gè)性狀。事件平均值與 分離無(wú)效植物的平均值比較。使用P值< 0. 1作為臨界值。圖17示出在氮減少條件下(ImM KNO3)和最佳氮(6. 5mM KNO3)條件下篩選Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系的結(jié)果。分析中考慮了所有包含PHP29689的事件。將每個(gè)變量的構(gòu) 建體平均值和無(wú)效構(gòu)建體的平均值比較。使用P值0. 1作為臨界值。圖18示出包含PHP28840的植物在低氮條件下的產(chǎn)量試驗(yàn)。用灰色顯示的產(chǎn)量值 代表顯著的增加，用黑色顯示的產(chǎn)量值代表顯著的減少。剩余的值代表非顯著的差異。圖19示出包含PHP28841的植物在低氮條件下的產(chǎn)量試驗(yàn)。用灰色顯示的產(chǎn)量值 代表顯著的增加，用黑色顯示的產(chǎn)量值代表顯著的減少。剩余的值代表非顯著的差異。圖20示出包含PHP28840的植物在標(biāo)準(zhǔn)氮條件下的產(chǎn)量試驗(yàn)。用灰色顯示的產(chǎn)量 值代表顯著的增加，用黑色顯示的產(chǎn)量值代表顯著的減少。剩余的值代表非顯著的差異。圖21示出包含PHP28841的植物在標(biāo)準(zhǔn)氮條件下的產(chǎn)量試驗(yàn)。用灰色顯示的產(chǎn)量 值代表顯著的增加，用黑色顯示的產(chǎn)量值代表顯著的減少。剩余的值代表非顯著的差異。圖 22 示出包含 PHP28840 (表達(dá)盒=lnt2_3)或 PHP28841 (表達(dá)盒=lnt2_2)的 植物的NUE幼苗測(cè)定結(jié)果。序列描述以及相關(guān)聯(lián)的序列表遵循如37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的管理 專利申請(qǐng)中的核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的規(guī)則。序列表包含核苷酸序列字符的單字 母碼以及氨基酸的三字母碼，如遵照IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的，該標(biāo)準(zhǔn)在Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中描述，將這兩 篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. § 1.822中示出的規(guī)則。表1列出了本文所述的某些多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO:)。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
11I ι I 克隆命名 ISEQ ID NO 核苷酸 I■酸I LNT2 樣cpglc.pk013.o6:fis j1718I LNT2 樣rcaln.pk001.f6:fis |19 I20I LNT2 樣I sfllnl.pk002.jl |21 II LNT2 樣I sdslf.pk001.k5 |22 ISEQ ID NO :1是pHSbarENDs2激活標(biāo)記載體(圖1)的核苷酸序列。SEQ ID NO 2是pD0NR Zeo構(gòu)建體的核苷酸序列(圖2)。SEQ ID NO 3是pD0NR 221構(gòu)建體的核苷酸序列(圖3)。SEQ ID NO 4是pBC-yellow載體(圖4)的核苷酸序列。SEQ ID NO 5是PHP27840載體(圖5)的核苷酸序列。SEQ ID NO :6是目的載體PHP23236的核苷酸序列(圖6)。SEQ ID NO 7是PHP10523載體(圖7)的核苷酸序列。SEQ ID NO 8是PHP23235載體的核苷酸序列(圖8)。SEQ ID NO 9是PHP20234載體的核苷酸序列(圖9)。SEQ ID NO 10是目的載體PHP22655的核苷酸序列(圖10)。SEQ ID NO 11是用于替代在pHSbarENDs2的位點(diǎn)5775處的PacI限制性位點(diǎn)的 多接頭核苷酸序列。SEQ ID NO 12是attBl序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 13是attB2序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 14是入門克隆PHP23112的核苷酸序列。SEQ ID NO 15是實(shí)施例5中的正向引物VC062。SEQ ID NO 16是實(shí)施例5中的反向引物VC063。SEQ ID NO 17-22 (參見(jiàn)表 1)。SEQ ID NO :23是重疊群的共有核苷酸序列，本文稱為PS0415619，它包含 BI316280(NCBI 通用標(biāo)識(shí)號(hào) 14990607)、CD401485 (NCBI 通用標(biāo)識(shí)號(hào) 31459457)和 sfllnl. pk002. jl(SEQ ID NO :21)。SEQ ID NO :24是由PS0415619(SEQ ID NO 23)編碼的多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO :25是重疊群的共有核苷酸序列，本文稱為PS0415620，它包含 CX548557 (NCBI 通用標(biāo)識(shí)號(hào) 57575582)和 sdslf. pkOOl. k5 (SEQID NO 22)。SEQ ID NO 26是由PS0415620 (SEQ ID NO 25)編碼的多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO 27 是編碼擬南芥“unknown 蛋白”(LNT2) (At5g50930 ；NCBI 通用標(biāo)識(shí) 號(hào)145359102)的基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 28 是擬南芥“unknown 蛋白” (LNT2) (At5g50930 ；NCBI 通用標(biāo)識(shí)號(hào) 15241317)的氨基酸序列。SEQ ID NO 29是At5g50930的選擇性剪接變體(本文稱為“l(fā)nt2_2” )的核苷酸序列。
SEQ ID NO :30是由lnt2_2 (SEQ ID NO :29)編碼的多肽的氨基酸序列，本文稱為 “LNT2-2”。SEQ ID NO :31是At5g50930的第二選擇性剪接變體(本文稱為“l(fā)nt2_3” )的核
苷酸序列。SEQ ID NO :32是由lnt2_3 (SEQ ID NO :29)編碼的多肽的氨基酸序列，本文稱為 “LNT2-3”。SEQ ID NO :32基于Clustal V比對(duì)方法，使用預(yù)設(shè)參數(shù)與EP1033405中的SEQ ID NO :52198進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果100%相同。SEQ ID NO :33是水稻“unknown蛋白”(NCBI通用標(biāo)識(shí)號(hào)38347162)的氨基酸序 列。SEQ ID NO 34是葡萄“假定蛋白” (NCBI通用標(biāo)識(shí)號(hào)147791927)的氨基酸序列。SEQ ID NO :35是At5g50930_5，attB正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :36是At5g50930_3，attB反向引物的核苷酸序列。其它實(shí)施方案的具體描述本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容的全文均以引用的方式并入本文。如本文所用的并在所附權(quán)利要求書(shū)中的單數(shù)形式“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義， 除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株該類植物?！耙粋€(gè) 細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，等等。如本文所用“氮限制條件”指其中可用氮總量(例如來(lái)自硝酸鹽、氨、或其它已知氮源的氮)不 足以維持植物的最佳生長(zhǎng)和發(fā)育的條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)識(shí)別其中總可用氮足以維 持植物最佳生長(zhǎng)和發(fā)育的條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)識(shí)別什么組成足夠量的總可用氮， 什么組成用于向植物提供氮的土壤、培養(yǎng)基和肥料輸入。取決于許多因素，氮限制條件將發(fā) 生變化，包括但不限于特定的植物和環(huán)境條件。“農(nóng)學(xué)特性”是可測(cè)量的參數(shù)，包括但不限于綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí) 的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng) 組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種 子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白 質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏抗性、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、和穗長(zhǎng)?！笆斋@指數(shù)”指粒重除以總株重?！發(fā)nt2” 指擬南芥基因位點(diǎn) At5g50930(SEQ ID NO :27)。"LNT2”指由 SEQ ID NO: 27編碼的蛋白(SEQ ID N0:28)?！癐nt2-2，，(SEQ ID NO 29)和“ lnt2_3，，(SEQ ID NO 31)是天然存在的 At5g50930 基因的選擇性剪接變體。“LNT2-2”(SEQ ID NO 30)和“LNT2-3”(SEQ ID NO 32)指分別 由“ lnt2-2 ”和“ lnt2-3 ”編碼的蛋白?！發(fā)nt2樣”指擬南芥“l(fā)nt2”位點(diǎn)At5g50930(SEQ ID NO 28)的來(lái)自不同物種的核 苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列SEQ ID N0:17、19、 23、和 25?！癓NT2樣”指擬南芥“LNT2” (SEQ ID NO 28)的來(lái)自不同物種的蛋白同源物，如玉 米和大豆，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列SEQ ID N0:18、20、24、和26。
本文所用的“選擇性剪接變體”指由基因轉(zhuǎn)錄的RNA的供選擇的替代形式。剪接 變體作為供選擇的位點(diǎn)在單個(gè)轉(zhuǎn)錄RNA分子內(nèi)或在分開(kāi)轉(zhuǎn)錄的RNA分子之間被剪接的結(jié)果 天然發(fā)生，并且可導(dǎo)致從相同基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的若干個(gè)不同形式。因此，剪接不同可編碼 具有不同氨基酸序列的多肽，它們?cè)谏矬w內(nèi)可具有相似功能也可不具有相似功能?！暗{迫耐受性”是植物的性狀，指植物在氮限制條件下存活的能力。植物“提高的氮脅迫耐受性”相對(duì)于參照或?qū)φ罩参镞M(jìn)行測(cè)量，并意指植物的氮脅 迫耐受性在與參照或?qū)φ罩参镞M(jìn)行比較時(shí)提高的任何量或量度。“氮脅迫耐受性植物”是指表現(xiàn)出氮脅迫耐受性的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中氮脅迫 耐受性植物是在氮限制條件下相對(duì)于對(duì)照植物至少在一種農(nóng)學(xué)特性上表現(xiàn)出提高的植物?！碍h(huán)境條件”指植物生長(zhǎng)的條件，例如水的可用性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(例如氮)的可用性或 者昆蟲(chóng)或病害的存在?！稗D(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何 細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的 轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)有性雜交或無(wú)性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋 通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重 組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組) 改變?！盎蚪M”在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括 存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器DNA?！爸参铩卑ㄕ麄€(gè)植株、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植株的子 代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組 織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子?！白哟卑ㄖ参锏娜魏魏罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中， 將異源多核苷酸穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組內(nèi)以便該多核苷酸連續(xù)傳代。異源多核苷酸可單獨(dú)地 或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。針對(duì)序列而言的"異源"意指來(lái)自外來(lái)物種的序列，或者如果來(lái)自相同物種，則 指通過(guò)蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列?！岸嗪塑账帷?、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且指作為單 鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。-核苷酸 (通常以它們的5'-單磷酸形式存在)通過(guò)如下它們的單個(gè)字母名稱來(lái)指代“A”為腺苷 酸或脫氧腺苷酸(分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥(niǎo)苷酸或 脫氧鳥(niǎo)苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶 (C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚 合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類 似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“氨基酸 序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的 Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA) ”指無(wú)內(nèi)含子并且可以通過(guò)細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。“cDNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是單鏈的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。“表達(dá)序列標(biāo)簽”(“EST”)是得自cDNA文庫(kù)的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄 的序列。EST通常通過(guò)cDNA插入序列單程測(cè)序獲取。將完整的cDNA插入序列稱為“全長(zhǎng) 插入序列”(“FIS”)?！爸丿B群”序列是由選自，但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個(gè)或更 多個(gè)序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)， 該序列能得自FIS或重疊群?！俺墒臁钡鞍踪|(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任 何前肽或原肽的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級(jí)產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原 肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)?！胺蛛x的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中 通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸 可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得 分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M體”指(例如)通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段 來(lái)實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合?！爸亟M體”也包括指已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸 而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事 件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對(duì)細(xì)胞或載體的改變，例如沒(méi)有蓄意人為干擾而 發(fā)生的那些?！爸亟MDNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重 組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來(lái)源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語(yǔ)“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”和“調(diào)控元件”可互換使用，并且指位于編碼序列的上游(5'非編碼 序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或 者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸 化識(shí)別序列。“啟動(dòng)子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段?！霸谥参镏杏泄δ艿膯?dòng)子”指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無(wú)論其是否 來(lái)源于植物細(xì)胞?！敖M織特異性啟動(dòng)子”和“組織優(yōu)選啟動(dòng)子”可以互換使用，并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達(dá)，但是也可以在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子?！鞍l(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能 受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子與該核 酸片段進(jìn)行了可操作地連接?！氨磉_(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達(dá)可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！氨硇汀笔侵讣?xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特征。有關(guān)將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn) 化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以 整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時(shí) 表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化細(xì)胞”是將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體)引入其中的任何細(xì)胞。本文所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引起基 因表達(dá)而沒(méi)有基因穩(wěn)定遺傳?！暗任换颉笔钦紦?jù)染色體上給定位點(diǎn)的基因的幾種供選擇形式的其中一種。當(dāng)二 倍體植物中一對(duì)同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時(shí)，該植物在該基因座處 是純合的。如果二倍體植物中一對(duì)同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同，則該 植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中一對(duì)同源染色體中的其中之 一上，則該植物在該基因座處是半合子的。序列比對(duì)和同一性百分比可用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源序列的多種比較方法來(lái)確定， 這些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息計(jì)算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 Megalign .程序。除非另外說(shuō)明，本文提供的序列的多重比對(duì)用Clustal V比對(duì)方法 (Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 :151_153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰 分=10)執(zhí)行。用Clustal V方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的同一性百分比計(jì)算的默認(rèn) 參數(shù)為 KTUPLE = 1、空位罰分(GAP PENALTY) = 3、窗口(WINDOW) = 5 禾口 DIAGONALS SAVED =5。而對(duì)于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE = 2，空位罰分=5，窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比對(duì)序列后，可通過(guò)查看同一程序中的“序列距離”表來(lái)獲得“同一性 百分比”和“趨異度”值。除非另外說(shuō)明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以 該方式計(jì)算。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中 有更全面的描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, Τ. , Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring HarborLaboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文稱為 “Sambrook” )?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)向若干個(gè)實(shí)施方案其它實(shí)施方案包括分離的多核苷酸和多肽、重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu) 建體的組合物(例如植株或種子)以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。其它的分離的多核苷酸和多肽本發(fā)明包括如下其它分離的多核苷酸和多肽分離的多核苷酸，包括(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,
1666%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；其 中(i)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。多肽可 以是LNT2或LNT2樣蛋白。分離的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%, 57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序 列同一性。多肽可以能是LNT2或LNT2樣蛋白。分離的多核苷酸，包括(i)基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ IDNO 17、19、23、 25、27、29、或 31 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性的 核酸序列；或(ii) (i)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā) 明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。所述分離的多核苷酸可以編碼LNT2或 LNT2樣蛋白。其它重組DNA構(gòu)建體和抑制DNA構(gòu)建體在一個(gè)方面，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如， 在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序 列編碼的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn) 行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100%的序列同一性，或(ii)⑴核酸序列 的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如， 在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序 列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 17、19、23、25、27、29、或31進(jìn)行比較時(shí)，具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)⑴核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。圖14A禾口 14B示出以下氨基酸序列的多重比對(duì)SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、 32、33、和 34。用 LASERGENE 生物信息計(jì)算包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)的 MEGALIGN 程序進(jìn)行序列多重比對(duì)；具體地講，使用Clustal V比對(duì)方法(Higgins和Sharp (1989) CABI0S. 5 :151-153)，多重比對(duì)預(yù)設(shè)參數(shù)為空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10，成對(duì)比對(duì)預(yù) 設(shè)參數(shù)為KTUPLE = 1，空位罰分=3，窗口 = 5以及DIAGONALS SAVED = 5。圖15是圖14A和14B中顯示的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的 圖表。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如， 在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼LNT2或LNT2樣蛋白。在另一方面，本發(fā)明包括抑制DNA構(gòu)建體。抑制DNA構(gòu)建體能包含至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是在植物中有功 能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至(a)以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的 核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、 28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或 ( )核酸序列(a) (i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列?；蛘?b)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈 的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì) 方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并 且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣蛋白；或(c)以下序列的全部或部分(i) 核酸序列，所述核酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQ ID NO 17、19、23、25、27、29、或 31 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67% %,9,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或(ii) (c)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抑制DNA構(gòu)建體包含共抑制構(gòu)建 體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制性構(gòu)建體、莖環(huán)抑制性構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的 構(gòu)建體、RNAi構(gòu)建體或小RNA構(gòu)建體(如，siRNA構(gòu)建體或miRNA構(gòu)建體)。應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。導(dǎo)致給定位點(diǎn)處產(chǎn)生化學(xué)上等價(jià)的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核 酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的密碼 子可被編碼另一個(gè)疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基替換為另一個(gè)帶負(fù) 電荷的殘基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個(gè)帶正電荷的殘基替換為另一個(gè)帶正電 荷的殘基(例如，賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價(jià)的產(chǎn)物。導(dǎo)致多肽 分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計(jì)不會(huì)改變多肽的活性。所提出的 修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測(cè)定所編碼的產(chǎn)物的生物活性的保留。
“抑制DNA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時(shí)，導(dǎo)致該植物中的靶基因 “沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對(duì)該植物來(lái)說(shuō)，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本 文針對(duì)靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑 制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語(yǔ)“抑制”、“抑 制性”以及“沉默”包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不 確定機(jī)理并且包括(并且不限于)反義、共抑制、病毒抑制、發(fā)夾抑制、莖環(huán)抑制、基于RNAi 的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA構(gòu)建體可以包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可以包含所關(guān)注的靶 基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可 與所關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性 的同一性(如，具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%, 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并 且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒-抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制性構(gòu)建體、莖-環(huán) 抑制性構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾)構(gòu)建體和小RNA 構(gòu)建體，例如siRNA (短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA (微RNA)構(gòu)建體?！胺戳x抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA” 指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物 (美國(guó)專利號(hào)5，107，065)。反義RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序 列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)?！肮惨种啤敝府a(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物?！坝辛x”RNA 指包括mRNA和在細(xì)胞內(nèi)或體外能被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA在內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過(guò) 著眼于以有義方向過(guò)表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過(guò)表達(dá)的序列具 有同源性的所有RNA減少)設(shè)計(jì)出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見(jiàn)Vaucheret等人，Plant J.，16 651-659 (1998)；以及 Gura, Nature 404 :804_808 (2000))。另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對(duì)近端mRNA編碼序列的抑制(于 1998年8月20日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)WO 98/36083)。此前描述的是“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的利用，該結(jié)構(gòu)以互補(bǔ)方向整合mRNA編碼序列的全部 或部分，導(dǎo)致已表達(dá)的RNA形成潛在的“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)(于1999年10月21日公開(kāi)的PCT 專利公開(kāi)W099/53050)。在這種情況下，莖由對(duì)應(yīng)相對(duì)于啟動(dòng)子以有義或反義方向插入的 相關(guān)基因的多核苷酸形成，并且環(huán)由一些相關(guān)基因的多核苷酸形成，在構(gòu)建體中該多核苷 酸不具有互補(bǔ)序列。這增加了獲得的轉(zhuǎn)基因植物中的共抑制或沉默頻率。關(guān)于發(fā)夾抑制 的綜述,參見(jiàn) Wesley，S. V.等人，2003，Methods inMolecular Biology, Plant Functional Genomics :Methods and Protocols236 :273_286。其中莖由至少30個(gè)來(lái)自待抑制基因的核苷酸形成而環(huán)由任意的核苷酸序列形 成的構(gòu)建體也已經(jīng)有效地用于抑制(于1999年12月2日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)No. WO 99/61632)。
使用聚-T和聚-A序列產(chǎn)生莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖已經(jīng)有所描述(于2002年1月3 日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)No. WO 02/00894)。然而另一種變型涉及使用合成的重復(fù)序列來(lái)促進(jìn)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖的形成。用這 種重組DNA片段產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體已經(jīng)顯示由形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸片段編碼的蛋白 質(zhì)的水平降低，如于2002年1月3日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)WO 02/00904中所述。RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動(dòng)物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默 的過(guò)程(Fire等人，Nature 391:806 1998)。在植物中的對(duì)應(yīng)過(guò)程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉 默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò) 程是用于防止外來(lái)基因表達(dá)的進(jìn)化保守性細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所 共有(Fire等人，Trends Genet. 15 358(1999)).這種防止外來(lái)基因表達(dá)的保護(hù)作用可能 是通過(guò)特異性破壞病毒基因組RNA的同源單鏈RNA的細(xì)胞反應(yīng)，響應(yīng)源自病毒感染或源自 轉(zhuǎn)座因子隨機(jī)整合到宿主基因組內(nèi)的雙鏈RNA(dsRNA)的生成而進(jìn)化而來(lái)。dsRNA在細(xì)胞中 的存在通過(guò)還沒(méi)有完全表征的機(jī)制引發(fā)了 RNAi反應(yīng)。細(xì)胞中長(zhǎng)dsRNA的存在刺激了稱為dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及 使dsRNA加工成稱為短干擾RNA (siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409:363 2001)。源自dicer活性的短干擾性RNA的長(zhǎng)度通常是約21至約23個(gè)核苷酸，并且包含約 19個(gè)堿基對(duì)雙鏈體(Elbashir等人，Genes Dev. 15 188 (2001)).還有人提出Dicer參與從 保守結(jié)構(gòu)的前體RNA上切下21-和22-核苷酸小分子時(shí)序RNA (stRNA)，所述小分子時(shí)序RNA 參與翻譯控制(Hutvagner等人，2001，Science 293 :834)。RNAi響應(yīng)還涉及內(nèi)切核酸酶復(fù) 合物，通常稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序 列的單鏈RNA的裂解。靶RNA的裂解在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域中間發(fā)生。此 外，RNA干擾還涉及小RNA(如miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，可推定是通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并由 此防止靶基因序列轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制(參見(jiàn)例如Allshire，Science 297 1818-1819 (2002)； Volpe 等人，Science 297 1833-1837 (2002) Jenuwein, Science 297:2215-2218(2002)； 以及Hall等人，Science 297:2232-2237(2002))。這樣，本發(fā)明的miRNA分子可用于通過(guò) 與RNA轉(zhuǎn)錄物相互作用或者作為另一種選擇通過(guò)與特定基因序列相互作用來(lái)介導(dǎo)基因沉 默，其中這樣的相互作用導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默。已經(jīng)在多種系統(tǒng)中研究了 RNAi。Fire等人(Nature 391 :806 (1998))首次在秀 麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中觀察至Ij RNAi。 Wianny 禾口 Goetz (Nature Cell Biol. 2 70(1999))描述了在小鼠胚胎中由 dsRNA 介導(dǎo)的 RNAi。Hammond 等人(Nature 404 293(2000))描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅(Drosophila)細(xì)胞中的RNAi。Elbashir等人， (Nature411 494 2001)描述了通過(guò)在包括人胚胎腎和HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 導(dǎo)入合成21-核苷酸RNA的雙鏈體而誘導(dǎo)的RNAi。小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過(guò)程(包括開(kāi)花)的調(diào)節(jié)是由小 RNA控制的?，F(xiàn)在有可能通過(guò)使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來(lái)以工程手段改變 植物基因的基因表達(dá)。小RNA似乎是通過(guò)與互補(bǔ)RNA或DNA靶序列堿基配對(duì)來(lái)行使功能的。當(dāng)與RNA結(jié) 合時(shí)，小RNA或者引發(fā)靶序列的RNA裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時(shí)，據(jù)信 小RNA可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無(wú)論具體機(jī)制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。據(jù)認(rèn)為，小RNA和它們的RNA靶標(biāo)之間的序列互補(bǔ)性有助于確定采用了哪種機(jī)制 (RNA裂解或翻譯抑制)。據(jù)信，優(yōu)選與它們的靶標(biāo)互補(bǔ)的siRNA通過(guò)RNA裂解起作用。一 些miRNA與它們的靶基因具有完全或幾乎完全的互補(bǔ)性，并且對(duì)于至少一些這樣的miRNA， 已經(jīng)證實(shí)了 RNA裂解。其他miRNA與它們的靶標(biāo)具有若干錯(cuò)配，并且在翻譯水平上明顯 抑制了它們的靶標(biāo)。同樣，無(wú)需堅(jiān)持特定的作用機(jī)理，出現(xiàn)了這樣一種一般規(guī)律完全或 幾乎完全的互補(bǔ)性引起RNA裂解，而當(dāng)miRNA/靶標(biāo)雙鏈體含有許多錯(cuò)配時(shí)傾向于翻譯抑 制。對(duì)于此規(guī)律的一個(gè)明顯例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一個(gè)靶標(biāo)是 APETALA2 (AP2)，盡管miR172與AP2具有幾乎完全的互補(bǔ)性，但其表現(xiàn)出引起AP2的翻譯抑 制而不是引起RNA裂解。微RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為約19至約24個(gè)核苷酸(nt)的已經(jīng)在動(dòng)物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294 :853_858 2001，Lagos-Quintana 等人，Curr. Biol. 12 :735_739 (2002) ；Lau 等人，Science 294 :858_862 (2001) ；Lee 和 Ambros, Science294 :862_864(2001) ；Llave 等人，Plant Cell 14 1605-1619(2002)； Mourelatos 等人，Genes.偏差(Dev.) 16 :720_728 (2002) ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Reinhart 等人，Genes.偏差(Dev.) 16 1616-1626 (2002))。它們是由大 小為大約70至200nt的較長(zhǎng)的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在動(dòng)物中，涉及加工miRNA前體的酶稱為Dicer，這是一種核糖核酸酶III樣蛋 白(Grishok 等人，Cell 106:23-34(2001) ；Hutvagner 等人，Science293 :834_838 (2001)； Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15 :2654_2659 (2001))。植物也具有 Dicer-樣酶， DCLl (以前稱為 CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，并且最近的證據(jù)表 明，其象Dicer —樣也涉及發(fā)夾前體的加工以產(chǎn)生成熟miRNA (Park等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Reinhart 等人，Genes Dev. 16 1616-1626 (2002)) 此外，最近的研究已 經(jīng)清楚地表明，至少某些miRNA發(fā)夾前體最初是作為較長(zhǎng)的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物存在，并且 在單個(gè)轉(zhuǎn)錄物中可存在幾種不同的miRNA以及相關(guān)發(fā)夾(Lagos-Quintana等人，Science 294 =853-858(2001) ；Lee 等人，EMBO J. 21 =4663-4670 (2002)) 最近的研究還測(cè)定了從 dsRNA產(chǎn)物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產(chǎn)物是通過(guò)DICER加工發(fā)夾而產(chǎn)生的(Schwartz 等人，Cellll5 =199-208(2003)) ο看起來(lái)，經(jīng)加工的dsRNA的兩端的穩(wěn)定性(即G C對(duì) A U的含量比，和/或錯(cuò)配)影響鏈選擇，具有低穩(wěn)定性的末端更容易因解旋酶活性而解 旋。低穩(wěn)定性末端的5'末端鏈被整合至RISC復(fù)合物內(nèi)，而另一條鏈被降解。微RNA(miRNA)看起來(lái)通過(guò)與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補(bǔ)序列結(jié) 合來(lái)調(diào)節(jié)靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位點(diǎn)位于靶mRNA的3' UTR中(Lee等 人，Cell 75 843-854(1993) ；Wightman 等人，Cell 75 :855_862 (1993) ；Reinhart 等人， Nature 403 :901_906 (2000) ；Slack 等人，Mol. Cell 5 :659_669 (2000))，并且在 lin-4 和 let-7miRNA與其靶位點(diǎn)之間有幾個(gè)錯(cuò)配。結(jié)合lin_4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA 編碼的蛋白的穩(wěn)態(tài)水平的下調(diào)，而不影響自身的轉(zhuǎn)錄物(Olsen和Ambros，Dev. Biol. 216 671-680(1999))。另一方面，最近有證據(jù)表明，在某些情況下，miRNA可以引起靶轉(zhuǎn)錄物在 靶位點(diǎn)內(nèi)特異性RNA裂解，并且該裂解步驟看起來(lái)需要miRNA與靶轉(zhuǎn)錄物之間具有100% 的互補(bǔ)性(Hutvagner 和 Zamore,Science 297:2056-2060(2002) ；Llave 等人，Plant Cell
2114:1605-1619(2002))?？雌饋?lái)有可能miRNA可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑(1)當(dāng)靶互 補(bǔ)性< 100%時(shí)，蛋白下調(diào)；并且(2)當(dāng)靶互補(bǔ)性是100%時(shí)，RNA裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑 的微RNA與在動(dòng)物中RNA干擾(RNAi)期間以及在植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)期間產(chǎn)生 的21-25nt短干擾RNA(siRNA)類似，并且可能整合進(jìn)與在RNAi情況中觀察到的復(fù)合物類 似或相同的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)內(nèi)。用生物信息學(xué)鑒定miRNA的靶標(biāo)在動(dòng)物中沒(méi)有成功，這可能是因?yàn)閯?dòng)物miRNA與 它們的靶標(biāo)具有低水平的互補(bǔ)性。另一方面，生物信息學(xué)方法已經(jīng)成功地用于預(yù)測(cè)植物 miRNA 的靴標(biāo)(Llave 等人，Plant Celll4 1605-1619 (2002) ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Rhoades 等人，Cell 110 :513_520 (2002))，因此，看起來(lái)植物miRNA 與它 們的推定靶標(biāo)的整體互補(bǔ)性高于動(dòng)物miRNA。植物miRNA的這些預(yù)測(cè)靶標(biāo)中的大部分編碼 涉及植物發(fā)育模式或細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。調(diào)控序列本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)可能包含至少一個(gè)調(diào)控序列。調(diào)控序列是啟動(dòng)子。多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(及抑制DNA構(gòu)建體)中?？梢愿鶕?jù) 所需結(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子，并且可以包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子、組織特 異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子。雖然候選基因當(dāng)通過(guò)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)可預(yù)測(cè)其效應(yīng)，但候選基因在35S 或UBI啟動(dòng)子控制下的高水平、組成型表達(dá)可以(或可以不)具有多重效應(yīng)。使用組織特 異和/或脅迫特異啟動(dòng)子可消除不需要的效應(yīng)但保留氮耐受性的能力。在擬南芥中已經(jīng) 觀察到了對(duì)干旱和寒冷耐受性的這種類型的效應(yīng)(Kasuga等人，Nature Biotechnol. 17 287-91(1999))。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動(dòng)子包括(例如)Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和 在TO 99/43838和美國(guó)專利6，072，050中公開(kāi)的其他組成型啟動(dòng)子；CaMV 35S核心啟動(dòng)子 (Odell 等人，Nature 313:810-812(1985))；稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy 等人，Plant Cell 2 163-171(1990))；泛素啟動(dòng)子(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619_632，1989， 以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675_689 (1992)) ；pEMU (Last 等人，Theor. Appl. Genet. 81 :581_588 (1991)) ；MAS (Velten 等人，EMBO J. 3 2723-2730 (1984)) ；ALS 啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，659，026)等。其他組成型啟動(dòng)子包括例如在美國(guó)專利5，608，149、 5，608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463,5, 608，142 禾口 6，177,611中公開(kāi)的那些啟動(dòng)子。在選擇啟動(dòng)子用于本發(fā)明方法時(shí)，可能有利的是使用組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào) 節(jié)啟動(dòng)子。另一種組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子是這樣的DNA序列，該序列調(diào)節(jié)DNA 序列選擇性地在對(duì)雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種DNA序 列只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時(shí)空表達(dá)的可鑒定啟動(dòng)子均可 用于本發(fā)明的方法中。可用于本發(fā)明的種子或胚芽特異性啟動(dòng)子包括大豆Kimitz胰蛋白酶抑制劑啟動(dòng) 子(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、馬鈴薯塊蓮特異蛋白啟動(dòng)子(patatin 啟動(dòng)子)(馬鈴薯塊蓮)(Rocha-Sosa，Μ.等人，EMBO J. 8 :23_29 (1989))、 convicilin啟動(dòng)子、豌豆球蛋白啟動(dòng)子、豆球蛋白啟動(dòng)子(豌豆子葉)(Rerie，W. G.等人， Mol. Gen. Genet. 259 :149_157 (1991) ；Newbigin, E. J.等人，Planta 180 :461_470 (1990)； Higgins, T. J. V.等人，Plant. Mol. Biol. 11 :683_695 (1988))、玉米蛋白啟動(dòng)子(玉米胚 乳)(Schemthaner,J. P.等人，EMBO J. 7 :1249_1255 (1988))、菜豆蛋白啟動(dòng)子(菜豆子葉) (Segupta-Gopalan, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 :3320_3324 (1995))、植物血 球凝集素啟動(dòng)子(菜豆子葉)(Voelker，T.等人，EMBO J. 6 :3571_3577 (1987))、B-伴球蛋 白啟動(dòng)子和大豆球蛋白啟動(dòng)子(大豆子葉)(Chen，Z-L等人，EMBO J. 7 :297_302 (1988))、谷 蛋白啟動(dòng)子(大米胚乳)、大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子(大麥胚乳)(Marris，C.等人，Plant Mol. Biol. 10 :359-366(1988))、麥谷蛋白啟動(dòng)子和麥醇溶蛋白啟動(dòng)子(小麥胚乳)(Colot,V.等 人，EMBO J. 6 :3559-3564(1987))、和甘薯貯藏蛋白啟動(dòng)子(甘薯塊根)(Hattori，T.等人， Plant Mol. Biol. 14 :595_604 (1990))?？刹僮鞯剡B接至嵌合基因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子 特異性基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時(shí)空表達(dá)模式。這樣的實(shí)施例包括在擬南 芥屬和甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)種子中表達(dá)腦啡肽的擬南芥2S種子儲(chǔ)藏蛋白基因啟 動(dòng)子(Vanderkerckhove 等人，Bio/Technology 7 :L929_932 (1989))、表達(dá)熒光素酶的菜豆 凝集素和β-菜豆蛋白啟動(dòng)子(Riggs等人，Plant Sci. 63 :47_57 (1989))，以及表達(dá)氯霉素 乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動(dòng)子(Colot等人，EMBO J. 6 =3559-3564(1987))0可誘導(dǎo)啟動(dòng)子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如，通過(guò)化合物(化學(xué)誘導(dǎo) 劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操縱連接的DNA序列?？?誘導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動(dòng)子包括(例如)受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸如 乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動(dòng)子。其它啟動(dòng)子包括如下啟動(dòng)子1)脅迫誘導(dǎo)型RD29A啟動(dòng)子(Kasuga等人，Nature Biotechnol. 17 287-91 (1999)) ；2)大麥啟動(dòng)子B22E ;B22E的表達(dá)是發(fā)育中的玉米籽粒 巾白勺牛寺胃?jìng)€(gè)生白勺("Primary Structureof a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature AleuroneLayers (在未成熟糊粉層中差異表達(dá)的新大麥基因的 一級(jí)結(jié)構(gòu))，，，Klemsdal 等人，Mol. Gen. Genet. 228 (1/2) :9_16 (1991))；以及 3)玉米啟 動(dòng)子 Zag2 ( "Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homo log of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS (ZAG1-擬南芥屬花同 源異形基因AGAMOUS的玉米同系物的鑒定和分子表征)”，Schmidt等人，Plant Cell 5(7) :729_737 (1993) ；“Structuralcharacterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation oftwo pairs of AGAMOUS-Iike MADS-box genes from maize，，， Theissen 等人，Gene 156(2) 155-166 (1995) ；NCBI GenBank Accession X80206))。Zag2 轉(zhuǎn)錄物可在授粉前五天至授粉后(“DAP”)七至八天被檢測(cè)到，并且引導(dǎo)Ciml在發(fā)育中的 雌花序心皮中表達(dá)，Ciml對(duì)發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉 前四至五天至授粉后六至八DAP被檢測(cè)到。其他可用的啟動(dòng)子包括可源自其表達(dá)與發(fā)育中 的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動(dòng)子。用于調(diào)控本發(fā)明的核苷酸序列在植物中表達(dá)的其它啟動(dòng)子是莖特異性啟動(dòng)子。這 種莖特異性啟動(dòng)子包括苜蓿S2A啟動(dòng)子(GenBank登記號(hào)EF030816 ；Abrahams等人，Plant Mol. Biol. 27 :513_528 (1995))和 S2B 啟動(dòng)子(GenBank 登錄號(hào):EF030817)等等，將這些文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。啟動(dòng)子可以整個(gè)源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動(dòng)子的不同元件 組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可在不 同的組織或細(xì)胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境條件而引導(dǎo)基因的 表達(dá)。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下還不能完全確定調(diào)控序列的確切范圍，一些變型的 DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟 動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。目前不斷在發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞中的不同類型的新啟動(dòng) 子；在 Okamuro，J. K.和 Goldberg，R. B.，Biochem. Plants 15:1-82(1989)的匯編中可找到 許多實(shí)例。其它啟動(dòng)子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORURabl7、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、 SAM合成酶啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶啟動(dòng)子、R-等位基因啟動(dòng) 子、維管組織其它啟動(dòng)子S2A (Genbank登錄號(hào)EF030816)和S2B (Genbank登錄號(hào)EF030817) 及來(lái)自玉米的組成型啟動(dòng)子G0S2。其它啟動(dòng)子包括根啟動(dòng)子，例如玉米NAS2啟動(dòng)子、玉米 Cyclo啟動(dòng)子(US公布2006/0156439，公開(kāi)于2006年7月13日)、玉米R(shí)00TMET2啟動(dòng)子 (W0 2005/063998,公開(kāi)于 2005 年 7 月 14 日)、CRlBIO 啟動(dòng)子(W0 2006/055487,公開(kāi)于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W0 2005/035770,公開(kāi)于 2005 年 4 月 21 日)和玉米 ZRP2. 47 啟動(dòng)子(NCBI 登錄號(hào) U38790 ；NCBI GI No. 1063664)。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(及抑制DNA構(gòu)建體)也可包括其他調(diào)控序列，包括但 不限于翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。在本發(fā)明的另一個(gè)其它實(shí)施方案中， 本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。內(nèi)含子序列可以加至5’非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)或3’非翻譯區(qū)以增加積聚在胞漿 中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動(dòng)物兩者的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接 內(nèi)含子可使基因表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均增強(qiáng)高達(dá)1000倍(Buchman和Berg，Mol. Cell Biol. 8 4395-4405 (1988) ；Callis 等人，Genes Dev. 1 :1183_1200 (1987))。這種內(nèi)含 子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)通常在將其設(shè)置接近轉(zhuǎn)錄單位的5’端時(shí)為最大。玉米內(nèi)含子Adhl-S 內(nèi)含子1、2和6、Bronze-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域已知的。通常參見(jiàn)The Maize Handbook, 第 116 章，F(xiàn)reeling 和 Walbot (編輯)，Springer，紐約(1994)。如果期望進(jìn)行多肽表達(dá)，則通常希望在多核苷酸編碼區(qū)的3'-端處包含有多腺 苷酸化區(qū)。該多腺苷酸化區(qū)可源自天然基因，源自多種其他植物基因或源自T-DNA。要加入 的3'端序列可源自(例如)胭脂堿合成酶或章魚(yú)堿合成酶基因，或作為選擇源自另外的植 物基因，或在一個(gè)實(shí)施方案中是源自任何其他真核基因。“翻譯前導(dǎo)序列”指位于基因啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導(dǎo) 序列存在于翻譯起始序列的經(jīng)完全加工后的mRNA上游。翻譯前導(dǎo)序列可影響mRNA的初 級(jí)轉(zhuǎn)錄過(guò)程、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例已經(jīng)有所描述(Turner，R. and Foster, G. D.，Mol. Biotech. 3 225 (1995)).任何植物都可以選擇用來(lái)鑒定將用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和基因。 適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實(shí)例應(yīng)該包括但不限于苜蓿、蘋果、杏、擬南芥屬植 物、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、西蘭花、抱子甘藍(lán)、卷心 菜、卡諾拉、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔類、克萊門氏小柑橘類、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹(shù)、茴香、無(wú) 花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹(shù)、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻 子、玉米、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅(jiān)果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹(shù)、洋蔥、橙、觀賞植物、 棕櫚、木瓜樹(shù)、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹(shù)、花生、梨樹(shù)、胡椒、柿樹(shù)、松樹(shù)、菠蘿、大蕉、李 樹(shù)、石榴樹(shù)、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜、樹(shù)莓、稻、黑麥、高粱、南 方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹(shù)、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小 麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹(shù)、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。用于鑒定調(diào)控序列的特別其它植物是 擬南芥屬植物、玉米、小麥、大豆和棉。其它組合物本發(fā)明的其它組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括任何 抑制DNA構(gòu)建體)(例如上面所討論的任何一種其它構(gòu)建體)的植物。其它組合物也包括 任何植物的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組 中包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。子代包括通過(guò)植物的自花授粉或異型雜交 而獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交種和自交系。在一個(gè)實(shí)施方案中，在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可以自花授 粉而產(chǎn)生純合的自交系植物。該自交系植物產(chǎn)生含有新引入的重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA 構(gòu)建體)的種子。這些種子可以生長(zhǎng)而產(chǎn)生將會(huì)表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性(如，在氮限制條 件下農(nóng)學(xué)特性增加)的植物，或者可以用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可以 生長(zhǎng)而產(chǎn)生將會(huì)表現(xiàn)出如改變的農(nóng)學(xué)特性的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，種子是玉米種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是單子葉植物或雙子葉植物，是玉米或大豆植物，是玉米 植物，例如玉米雜種植物或玉米自交系植物。植物還可以是向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜 蓿、棉花、水稻、大麥或黍。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組中。其它實(shí)施方案尤其包括但不限于如下其它實(shí)施方案1-8 1.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆植 物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷 酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、 26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性，并 且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮 脅迫耐受性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在與該對(duì)照植物比較時(shí)，該植物還表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特 性的改變。2.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆植 物)，該重組DNA構(gòu)建體包含(a)可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn) 行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；或
(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地 連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)基于 Clustal V比對(duì)方法與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)，所述 區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或 LNT2樣多肽，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出至 少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。3.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大 豆植物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述 多核苷酸編碼LNT2或LNT2樣多肽，并且其中在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植 物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在與該對(duì)照植物比 較時(shí)，該植物還表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，該LNT2多肽來(lái)自 擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、煙豆(Glycine tabacina)、里予大豆(Glycine soja)或短絨里予大豆(Glycine tomentella)。4.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆 植物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核 苷酸編碼LNT2或LNT2樣多肽，并且其中在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行 比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出在氮限制條件下至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，該 LNT2 多肽來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、煙 豆(Glycine tabacina)、里予大豆(Glycine soja)或短絨里予大豆(Glycine tomentella)。5.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆植 物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷 酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、 26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性，并 且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出在氮限制 條件下至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。6.在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆 植物)，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或 反義鏈的全部或部分的區(qū)域的調(diào)控元件，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或 部分比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、 53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽， 并且其中在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出在氮限 制條件下至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。7.在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米或大豆植 物)，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接至以下序列的全部或部分的調(diào)控元件 (a)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%, 57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序 列同一性；或(b) (a)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，并且其中在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建 體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出在氮限制條件下至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。8.上述其它實(shí)施方案1-7中的植物的任何子代、上述其它實(shí)施方案1-7中的植物 的任何種子、上述其它實(shí)施方案1-7中的植物的子代的任何種子以及來(lái)自上述其它實(shí)施方 案1-7中的植物以及它們的子代的細(xì)胞。在上述其它實(shí)施方案1-8或本發(fā)明的任意其他實(shí)施方案中的任意一項(xiàng)中，重組 DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)在一個(gè)實(shí)施方案中包含至少一個(gè)在植物中有功能的啟動(dòng) 子作為其它調(diào)控序列。在上述其它實(shí)施方案1-8或本發(fā)明的任意其他實(shí)施方案中的任意一項(xiàng)中，至少一 種農(nóng)學(xué)特性的改變是增加或減少，在一個(gè)實(shí)施方案中是增加。在任一前述的其它實(shí)施方案1-8或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué) 特性選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn) 量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織中的含氮量、總植物氨基酸含量、營(yíng) 養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、 果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏抗性、收 獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、和穗長(zhǎng)。產(chǎn)量、綠度和生物量尤其是其它進(jìn)行改變的農(nóng)學(xué) 特性(在一個(gè)實(shí)施方案中是增加)。在任意上述其它實(shí)施方案1-8或本發(fā)明的任意其他實(shí)施方案中，在與不包含所述 重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的對(duì)照植物在氮脅迫條件下進(jìn)行比較時(shí)，在一個(gè)實(shí) 施方案中植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉模擬氮條件(限制性的或非限制性的)的規(guī)程，以及 用于評(píng)估已經(jīng)經(jīng)受過(guò)模擬的或天然存在的氮條件(限制性的或非限制性的)的植物的規(guī) 程。例如，技術(shù)人員能夠通過(guò)向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時(shí)期內(nèi)不提供氮來(lái) 模擬氮條件，并且技術(shù)人員能夠通過(guò)尋找農(nóng)學(xué)特性的差異來(lái)評(píng)估此類植物，例如在生理學(xué) 和/或物理?xiàng)l件上的變化，包括(但不限于)活力、生長(zhǎng)、大小、或根長(zhǎng)、或具體地講葉片顏 色或葉片面積大小。用于評(píng)估此類植物的其它技術(shù)包括測(cè)量葉綠素?zé)晒?、光合作用速率、?生長(zhǎng)或換氣速率。下面的實(shí)施例描述了一些用于模擬氮限制條件和/或在此類條件下評(píng)估植物的代表性規(guī)程和技術(shù)。技術(shù)人員也能夠通過(guò)植物在田間測(cè)試中，在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產(chǎn)量的能力(例如通過(guò)測(cè)量在低氮或高氮條件下，與標(biāo)準(zhǔn)氮條件下相比基本 上等同的產(chǎn)量，或通過(guò)測(cè)量在低氮或高氮條件下與對(duì)照或參照植物相比更少的產(chǎn)量損失) 來(lái)評(píng)估氮脅迫耐受性(在一個(gè)實(shí)施方案中至少75 %、76 %、77 %、78 %、79 %、80 %、81 %、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、或 100%的產(chǎn)量)。在評(píng)估或測(cè)量其中利用了對(duì)照或參照植物的本發(fā)明任何實(shí)施方案(如，如本文描 述的組合物或方法)中的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將很容 易認(rèn)識(shí)到要利用的合適對(duì)照或優(yōu)選植物。例如，通過(guò)如下非限制性示例來(lái)說(shuō)明1.轉(zhuǎn)化植物的子代，該植物對(duì)于重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)來(lái)說(shuō)是半 合子的，使得該子代分離成包含或不包含該DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株包 含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代將通常相對(duì)于未包含該重組DNA構(gòu)建體 (或抑制DNA構(gòu)建體)的子代來(lái)進(jìn)行測(cè)量(即，未包含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建 體)的子代是對(duì)照或參照植株)。2.重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)基因滲入至自交系中，例如在玉米中，或 基因滲入進(jìn)變體中，例如在大豆中基因滲入品系將通常相對(duì)于親本自交系或變種品系進(jìn) 行測(cè)量(即，親本自交系或變種品系是對(duì)照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個(gè)親本自交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的兩 個(gè)親本自交系產(chǎn)生，不同的是其中一個(gè)親本自交系含有重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建 體)第二雜交系通常將相對(duì)于第一雜交系進(jìn)行測(cè)量(即第一雜交系為對(duì)照植物或參照植 物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株該植株可以相對(duì)于這樣 的對(duì)照植株進(jìn)行評(píng)估或測(cè)量，該對(duì)照植株不包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)， 但具有與該植株相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的 植株相比較，核遺傳物質(zhì)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%的序列同一性)。存在許多可用于分析、比較和表征植物遺傳背景的基于實(shí) 驗(yàn)室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) 性DNA (RAPD)、任何引物聚合成酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋(DAF)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域 (SCAR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP )和也稱為微衛(wèi)星的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，評(píng)估或測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性 或表型時(shí)合適的對(duì)照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對(duì)所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過(guò)誘變 或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。其它方法其它方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、用于評(píng)估植物氮脅迫 耐受性的方法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法、和用于 制備種子的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是單子葉植物或雙子葉植物，是玉米或大豆植 物，甚至在一個(gè)實(shí)施方案中是玉米植物。植物還可以是向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉 花、水稻、大麥或黍。種子可以是玉米或大豆種子，可以是玉米種子，并且甚至在一個(gè)實(shí)施方
28案中可以是是玉米雜交種種子或玉米自交系種子。其它方法尤其包括但不限于如下方法增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較 時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；和(b)在步驟(a)后從該 可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu) 建體并且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受 性。所述方法可進(jìn)一步包括(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在 其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn) 出增加的氮脅迫耐受性。增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將包含至少一個(gè)調(diào)控序列(在 一個(gè)實(shí)施方案中是植物中有功能的啟動(dòng)子)的抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞， 該調(diào)控序列可操作地連接至以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽 的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行 比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100% 的序列同一性，或(ii) (a) (i)的核 酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；和(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體 的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。所述方法可進(jìn)一步包括(c)獲得源自 該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體并且在與 未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可 再生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是植物 中有功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈 的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于 Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽；和(b)在步驟(a) 之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑 制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。所述方法可進(jìn)一步包括(C)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代 植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較 時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較 時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)后從該可 再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建 體；以及(c)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮 脅迫耐受性。該方法還可包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在 其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)該子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建 體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性。評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；或(ii) (a) (i) 的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植 物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因植物在 與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性；該方法可另外包括 (d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu) 建體；以及(e)評(píng)價(jià)該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮 脅迫耐受性。評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是植物中有 功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至來(lái)源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區(qū)域，當(dāng)基于Clustal V比對(duì)方法與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全 部或部分進(jìn)行比較時(shí)，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制 DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比 較時(shí)的氮脅迫耐受性；該方法可另外包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該 子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)該子代植物在與不包含該抑 制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性。評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較 時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(13)在步驟(a)后從該可 再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建 體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組 DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比 較時(shí)的氮脅迫耐受性；評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；或(ii) (a) (i) 的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植 物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物 的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)子代 植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅迫耐受性；評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是植物中有 功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至來(lái)源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區(qū)域，當(dāng)基于Clustal V比對(duì)方法與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全 部或部分進(jìn)行比較時(shí)，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽；(b)在步驟(a)之 后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該 抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn) 行比較時(shí)的氮脅迫耐受性；確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較 時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)后從該可 再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu) 建體；以及(c)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法還可包括(d) 獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建 體；以及(e)確定所述子代植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述重組DNA 構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或(ii)⑴的 核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在 一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表 現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可另外包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植 物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)確定所述子代植物在一 個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn) 出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可 再生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是植物 中有功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈 的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于 Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,
3286%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽；(b)在步驟(a)之 后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制 DNA構(gòu)建體；以及(c)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所 述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可另外 包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制 DNA構(gòu)建體；以及(e)確定所述子代植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述 抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較 時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)后從該可再 生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建 體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組 DNA構(gòu)建體；以及(d)確定所述子代植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述 重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方 案中是在植物中有功能的啟動(dòng)子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 進(jìn)行比較時(shí)，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或(ii)⑴的 核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的 子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定所述子代植 物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是 否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可 再生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控序列(在一個(gè)實(shí)施方案中是植物 中有功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈 的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于 Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2或LNT2樣多肽；(b)在步驟(a)之 后從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制 DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含 該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定所述子代植物在一個(gè)實(shí)施方案中在氮限制條件下與不包 含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。產(chǎn)生種子(在一個(gè)實(shí)施方案中可以作為提供氮脅迫耐受性的產(chǎn)品銷售的種子)的 方法，該方法包括任意上述的其它方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種 子在它們的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。在任一前述的其它方法或本發(fā)明方法的任何其它實(shí)施方案中，測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中 農(nóng)學(xué)特性改變的步驟(如果適用的話)在一個(gè)實(shí)施方案中可包括測(cè)定在改變的環(huán)境條件下 與不包含重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)該轉(zhuǎn)基因植物是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué) 特性的改變。在任一前述的其它方法或本發(fā)明方法的任何其它實(shí)施方案中，測(cè)定子代植物中農(nóng) 學(xué)特性改變的步驟(如果適用的話)可包括測(cè)定在改變的環(huán)境條件下與不包含重組DNA構(gòu) 建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)該子代植物是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任何前述的其它方法或本發(fā)明方法的任何其它實(shí)施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中 所述可再生的植物細(xì)胞可包括愈傷組織細(xì)胞(在一個(gè)實(shí)施方案中是胚胎)、配子細(xì)胞、分生 細(xì)胞或未成熟胚芽細(xì)胞?？稍偕闹参锛?xì)胞在一個(gè)實(shí)施方案中來(lái)自自交玉米植物。在任意上述的其它方法或本發(fā)明方法的任意其他實(shí)施方案中，所述再生步驟在一 個(gè)實(shí)施方案中包括(i)在包含促進(jìn)胚發(fā)生的激素的培養(yǎng)基中培育所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞直 至觀察到愈傷組織；(ii)將所述步驟(i)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含促進(jìn)組織機(jī)體形成 的激素的第一培養(yǎng)基；以及(iii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟(ii)后的所述轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞，以允許嫩芽伸長(zhǎng)、根發(fā)育或這兩者同時(shí)發(fā)生。在任意上述的其它方法或本發(fā)明方法的任意其它實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué)特性 選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總 植物氮含量、果實(shí)氮含量、種子氮含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的氮含量、總植物氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織 中的游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果 實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏抗性、 收獲指數(shù)、莖桿倒伏、植物高度、穗高、以及穗長(zhǎng)。產(chǎn)量、綠度和生物量尤其是其它進(jìn)行改變 的農(nóng)學(xué)特性(在一個(gè)實(shí)施方案中是增加)。在任意上述其它方法或本發(fā)明的方法的任意其它實(shí)施方案中，在與不包含所述重 組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的對(duì)照植物在氮脅迫條件下進(jìn)行比較時(shí)，在一個(gè)實(shí)施 方案中植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任一前述的其它方法或本發(fā)明方法的任何其它實(shí)施方案中，存在供選擇的替代 方案用于將包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列上的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可 再生的植物細(xì)胞。例如，可將調(diào)控序列(例如一種或多種增強(qiáng)子、在一個(gè)實(shí)施方案中作為轉(zhuǎn) 位因子的部件)導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞，然后篩選其中將所述調(diào)控序列可操作地連接至編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源基因的事件。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體引入植物可通過(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)進(jìn)行，這些技術(shù)包 括但不限于DNA直接攝取、化學(xué)處理、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、感染、病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn) 移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。其它技術(shù)如下文實(shí)施例所示，用于轉(zhuǎn)化玉米植物細(xì)胞和大豆植物細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物(主要通過(guò)利用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)) 以及獲得轉(zhuǎn)基因植物的其它方法包括公開(kāi)的用于棉花的那些(美國(guó)專利5，004，863、美 國(guó)專禾Ij 5，159，135、美國(guó)專利5，518，908)；用于大豆的那些(美國(guó)專利5，569，834、美國(guó) 專利 5，416，011、McCabe 等人，Bio/Technology 6 923(1988), Christou 等人，Plant Physiol. 87 =671674 (1988))；用于蕓苔屬植物(Brassica)的那些(美國(guó)專利 5，463，174)； 用于花生的那些(Cheng 等人，Plant Cell Rep. 15 653 657 (1996)，McKently 等人，Plant Cell R印.14:699 703 (1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人， Plant Cell R印· 15 :254_258 (1995))。用電穿孔、粒子轟擊和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物也已有報(bào)道并且作為其它方法包 括(例如)如在天門冬屬(asparagus)中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Bytebier等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 84 :5354，(1987))；在大麥中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Wan和 Lemaux, Plant Physiol. 104 37(1994)) ；corn (Rhodes φ 人，Science 240:204(1988)， Gordon-Kamm 等人，Plant Cell 2 603 618(1990)， Fromm 等人，Bio/Technology 8 833(1990)，Koziel 等人，Bio/Technology 11 194 (1993)，Armstrong 等人，Crop Science 35:550-557(1995))；在燕麥中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology 10:1589(1992))；在野茅(orchardgrass)中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep. 7 =469(1988))；在稻中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Toriyama等人，Theor. Appl. Genet. 205 :34 (1986) ；Part 等人，Plant Mol. Biol. 32 1135 1148，(1996) ；Abedinia 等 人，Aust. J. Plant Physiol. 24 133 141 (1997) ；Zhang 禾口 Wu，Theor. Appl. Genet. 76 835(1988) ；Zhang 等人，Plant Cell Rep. 7 379, (1988) ；Battraw 和 Hall，Plant Sci. 86 191 202(1992) ；Christou 等人，Bio/Technology 9:957(1991))；裸麥(De la Pena 等人， Nature325 =274(1987))；在甘蔗中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Bower和Birch，Plant J. 2 409(1992))；高羊茅(Wang 等人，Bio/Technology 10:691(1992))；以及小麥(Vasil 等人， Bio/Technology 10:667(1992)；美國(guó)專利 5，631，152)。存在多種用于從植物組織再生植物的方法。再生的具體方法將取決于起始植物組 織以及待再生的具體植物物種。從單植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多種經(jīng)轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培育植物是本 領(lǐng)域所熟知的(Weissbach 禾口 Weissbach(編輯)，載于Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988))。該再生和生長(zhǎng)方法通常包括如下 步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、培養(yǎng)這些單獨(dú)化的細(xì)胞通過(guò)胚發(fā)育的通常階段以及通過(guò)生根小植 株階段。轉(zhuǎn)基因胚以及種子以類似的方式再生。隨后將所得的轉(zhuǎn)基因的生根小苗種植在諸 如土壤之類的合適植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。含有編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的外來(lái)的外源性分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是本 領(lǐng)域所熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，將再生的植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘撸瑢⒌米栽偕参锏幕ǚ叟c農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植株進(jìn)行雜交。相反，將來(lái) 自這些重要品系的植物用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有 所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù) 是攝氏度，除非另外說(shuō)明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的其它實(shí)施方案，但僅 是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā) 明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明做出多種改變和修 飾，以使其適用于多種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文 所述，本發(fā)明的各種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也 旨在屬于附加的權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。實(shí)施例1制備具有激活標(biāo)記基因的擬南芥種群構(gòu)建18. 49kb 的 T-DNA 基二元構(gòu)建體，pHSbarENDs2 (SEQ ID NO :1 ；圖 1)包含四 個(gè)來(lái)源于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的四個(gè)多聚增強(qiáng)子元件(對(duì)應(yīng)于序列-341至-64，如 Odell等人Nature 313 :810_812所述(1985))。該構(gòu)建體也包含允許質(zhì)粒救援的載體序列 (PUC9)和多接頭(SEQ ID NO :11)、再動(dòng)員T-DNA的轉(zhuǎn)座子序列(Ds)、以及允許草胺磷選擇 轉(zhuǎn)基因植物的bar基因。原則上，僅將從右邊界(RB)至左邊界(LB)包含的10. 8kb片段轉(zhuǎn) 移到寄主植物基因組中。因?yàn)樵鰪?qiáng)子元件位于靠近RB處，它們可誘導(dǎo)T-DNA整合后的基因 組位點(diǎn)順式激活。通過(guò)整個(gè)植株的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化制備擬南芥激活標(biāo)記種群。將pHSbarENDd構(gòu)建體轉(zhuǎn) 化到根癌農(nóng)桿菌菌株C58中，在25°C下在溶菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600 1.0。然后離 心沉淀細(xì)胞，并重懸在相等體積的5%蔗糖/0. 05% Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時(shí)，培育擬南芥屬生態(tài)型Col-O的土壤使用農(nóng)桿菌懸浮液進(jìn)行頂部灌溉。一 周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行頂部灌溉。然后將該植物 的種子設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)。所得Tl種子在土壤中播種，通過(guò)噴灑草胺磷(FINALE ；AgrEvo ；Bayer Environmental Science)選擇轉(zhuǎn)基因幼苗。選擇了總計(jì)100，000個(gè)草胺磷抗性Tl幼苗。 分開(kāi)保存來(lái)自每個(gè)品系的T2種子。實(shí)施例2篩詵以鑒定具有低氮耐警件的品系來(lái)自每個(gè)100，000個(gè)分離Tl激活標(biāo)記品系的i^一個(gè)T2植物可種植在方板 (15mmX15mm)上，方板包含 0. 5xN_Free Hoagland，s，0. 4mM硝酸鉀，0. 蔗糖，ImM MES 和 0. 25% Phytagel (低氮培養(yǎng)基)。每個(gè)板種植五個(gè)品系，并且每個(gè)板包括9個(gè)野生型個(gè)體 以使總計(jì)64個(gè)個(gè)體排列成8X8的網(wǎng)格圖案(參見(jiàn)圖11)。在暗處、4°C條件下保持平板三 天以使種子分層，然后在22°C光照和20°C黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六小 時(shí)光照和八小時(shí)黑暗，平均光照強(qiáng)度為 200mmol/m2/S。每天旋轉(zhuǎn)并振動(dòng)每個(gè)架子中的平 板。在第十二天(生長(zhǎng)九天)，對(duì)整個(gè)板拍照以評(píng)估幼苗狀態(tài)。在掩蔽該平板圖像以移除背景顏色后，每個(gè)個(gè)體收集兩個(gè)不同的測(cè)量數(shù)據(jù)總羅賽塔面積和進(jìn)入綠色區(qū)的顏色百分比。使用色調(diào)、飽和度和強(qiáng)度數(shù)據(jù)(HSI)，綠色區(qū)由色調(diào) 50至66組成?？偭_賽塔面積用作植物生物量的量度，而綠色區(qū)通過(guò)劑量-響應(yīng)研究已經(jīng)顯 示指示氮同化作用(參見(jiàn)圖12)。將在與野生型對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)具有顯著的總羅賽塔面積和/或綠色區(qū)增加 的品系命名為Phase 1 hits。在相同分析條件下進(jìn)行Phase Ihits的重復(fù)試樣再篩選 (Phase 2篩選)。還通過(guò)Phase 3篩選以進(jìn)一步驗(yàn)證通過(guò)Phases 1和2的突變體。在 Phase 3中，將每個(gè)品系分開(kāi)種植在低氮培養(yǎng)基中，使得32個(gè)T2個(gè)體緊鄰著32個(gè)野生型個(gè) 體生長(zhǎng)，為分析提供更高的統(tǒng)計(jì)學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性。如果一個(gè)品系顯示與Phase 3中對(duì)照的顯著差 異，然后可認(rèn)為該品系是經(jīng)驗(yàn)證的氮缺乏抗性品系。實(shí)施例3鑒定激活標(biāo)記基因使用下述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)程序中的一個(gè)或兩個(gè)鑒定側(cè)接導(dǎo)致氮耐受性的T-DNA插入序 列的基因(1)熱不對(duì)稱交錯(cuò)(TAIL) PCR(Liu 等人，Plant J. 8 :457_63 (1995))；以及(2) SAIFF PCR(Siebert 等人，NucleicAcids Res. 23 1087-1088 (1995))。至于復(fù)雜的多聚 T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下，可使 用包括反式PCR、質(zhì)粒拯救和/或基因組文庫(kù)構(gòu)建在內(nèi)的其他程序。成功的結(jié)果是其中單個(gè)TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記，通過(guò)與公開(kāi)可用的擬南芥 屬基因組的序列比對(duì)來(lái)鑒定候選基因。具體地講，最靠近35S增強(qiáng)子元件/T-DNA RB的注 釋基因是激活的基因的候選基因。為了驗(yàn)證鑒定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合偽克隆的可 能性，用一個(gè)T-DNA中的寡核苷酸和一個(gè)候選基因特異性的寡核苷酸進(jìn)行對(duì)基因組DNA的 診斷PCR。將提供PCR產(chǎn)品的基因組DNA樣本理解為表示T-DNA插入序列。該分析也驗(yàn)證 了其中一種以上的插入事件發(fā)生在相同品系中的情況，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分 析中鑒定是否有多個(gè)不同基因組片段。實(shí)施例4鑒定激活標(biāo)記LNT2基因進(jìn)一步分析顯示氮缺乏耐受性的激活標(biāo)記品系(品系111786)。提取來(lái)自該品系 的DNA，并且在突變品系中側(cè)接T-DNA插入序列的基因通過(guò)連接介導(dǎo)PCR(Siebert等人， Nucleic Acids Res. 23 1087-1088 (1995))進(jìn)行鑒定。鑒定一個(gè)單獨(dú)擴(kuò)增的片段，它包含 T-DNA邊界序列和擬南芥基因組序列。一旦獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記， 通過(guò)與完全擬南芥屬基因組的序列比對(duì)鑒定候選基因。具體地講，最靠近35S增強(qiáng)子元 件/T-DNA RB的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系111786而言，最靠近 35S增強(qiáng)子的基因是At5g50930 (SEQ ID NO 27)，它編碼擬南芥“unknown蛋白”，本文稱為 LNT2(SEQ ID NO 28 ；NCBI GI 15241317)。實(shí)施例5通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證候選擬南芥基因(At5g50930)可將候選基因轉(zhuǎn)化到擬南芥屬中并在35S啟動(dòng)子作用下過(guò)表達(dá)。如果在轉(zhuǎn)基因品 系中觀察到與親本激活標(biāo)記品系相同或相似的表型，則將該候選基因認(rèn)為是擬南芥屬中驗(yàn)證過(guò)的“前導(dǎo)基因”。通過(guò)以下方法測(cè)試擬南芥At5g50930基因(SEQ ID NO ,21)的賦予氮缺乏耐受性 的能力。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增At5g50930cDNA，使用以下引物L(fēng)At5g5O93O-5' attB 正向引物(SEQ ID NO 35)正向引物包含attBl 序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ；SEQ ID NO 12)和共有 的Kozak序列(CAACA)的所述cDNA蛋白編碼區(qū)上游的前21個(gè)核苷酸(以ATG起始密碼子 開(kāi)頭)。2. At5g50930_3，attB 反向引物(SEQ ID NO 36)反向引物包含attB2 序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ； SEQ ID NO 13)，該序列 鄰近所述cDNA蛋白編碼區(qū)的反向互補(bǔ)序列的后21個(gè)核苷酸(以終止密碼子的反向互補(bǔ)序 列開(kāi)頭)。RT-PCR反應(yīng)生成兩個(gè)產(chǎn)物，本文稱為lnt2-2和lnt2_3 (分別是SEQID NO 29和 31)。將這些產(chǎn)物鑒定為At5g50930基因的剪接變體。使用INVITROGEN GATEWAY. CL0NASE 技術(shù)，用 pD0NR Zeo (SEQ ID NO :2 ；圖 2) 進(jìn)行每個(gè)RT-PCR產(chǎn)物的BP重組反應(yīng)。這種方法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基 因(CAM)從pD0NRTMZeo移除并定向地克隆了該在旁側(cè)具有attBl和attB2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物 而得到入門克隆(entry clone)。如下所述，將每個(gè)剪接變體序列的一個(gè)鑒定為陽(yáng)性的入門 克隆與一個(gè)目的載體一起用于隨后的LR重組反應(yīng)。用緊接INVITROGEN GATEWAY Cl轉(zhuǎn)化插入序列上游的1. 3_kb35S啟動(dòng)子構(gòu)建稱 為pBC-yellow(SEQ ID NO :4 ；圖4)的16. 8_kb T-DNA基的二元載體(目的載體)，所述插 入序列包含ccdB細(xì)菌致死基因以及側(cè)接attRl和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。該 載體也包含RD29a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)ZS-YellowdNVITROGEN )，它賦予轉(zhuǎn)化 過(guò)的種子黃色熒光。使用INVITROGEN GATEWAY 技術(shù)，使用包含lnt2_2和pBC-yellow載 體的入門克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)。該擴(kuò)增允許快速定向克隆Int2-2(SEQ ID NO :29)，克隆 發(fā)生在pBC-yellow中的35S啟動(dòng)子之后。還使用包含lnt2_3和pBC-yellow載體的入門 克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)。申請(qǐng)人:然后使用如實(shí)施例1所述的相同農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化程序，將35S啟動(dòng)子 At5g50930表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入野生型擬南芥生態(tài)型Col-Ο。轉(zhuǎn)基因Tl種子通過(guò)黃色熒光進(jìn)行 選擇，并且將32個(gè)這些Tl種子緊鄰著32個(gè)野生型擬南芥生態(tài)型Col-O種子種植在低氮培 養(yǎng)基上。所有隨后的生長(zhǎng)和拍照條件均如實(shí)施例1所述。發(fā)現(xiàn)來(lái)自激活標(biāo)記的、對(duì)氮限制 條件具有耐受性的初始表型能在用其中At5g50930基因通過(guò)35S啟動(dòng)子直接表達(dá)的構(gòu)建體 轉(zhuǎn)化過(guò)的野生型擬南芥植物中重現(xiàn)。實(shí)施例6cDNA f庫(kù) 他目成、cDNA克降的分離和測(cè)丨序cDNA文庫(kù)可通過(guò)許多可用的方法中的任一種制備。例如，通過(guò)首先根據(jù)生產(chǎn)商的 說(shuō)明書(shū)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)制備Uni-ZAPTMXR載體中的 cDNA 文庫(kù)，可將cDNA引入質(zhì)粒載體中。根據(jù)Stratagene提供的說(shuō)明書(shū)，將Uni-ZAPTMXR文庫(kù)轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒文庫(kù)。當(dāng)轉(zhuǎn)換的時(shí)候，將把cDNA插入序列包含于質(zhì)粒載體rBLUESCRIPT 中。 此外，可使用T4連接酶(New England Biolabs)將cDNA直接導(dǎo)入預(yù)切過(guò)的Bluescript II SK(+)載體(Stratagene)中，隨后按照制造商規(guī)程(GIBCO BRL Products)轉(zhuǎn)染 DHlOB 細(xì)胞。一旦cDNA插入序列處于質(zhì)粒載體中，從隨機(jī)選取的含重組pBLUESCRIPT 質(zhì)粒的細(xì) 菌菌落制備質(zhì)粒DNA，或者用對(duì)插入的cDNA序列旁側(cè)的載體序列特異性的引物，通過(guò)聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增插入的cDNA序列。將擴(kuò)增的DNA插入序列或質(zhì)粒DNA在引物標(biāo)記法測(cè)序 反應(yīng)(dye-primer sequencingreaction)中進(jìn)行測(cè)序，以產(chǎn)生部分cDNA序列(表達(dá)序列標(biāo) 記或“EST，，;參見(jiàn) Adams 等人，1991，Science 252:1651-1656)。用 Perkin Elmer Model377 熒光測(cè)序儀分析所得的EST。用改進(jìn)的轉(zhuǎn)座規(guī)程產(chǎn)生全長(zhǎng)插入序列(FIS)數(shù)據(jù)。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS的克隆，并通過(guò)堿性裂解分離質(zhì)粒DNA。將分離的DNA模板在基于PCR的 測(cè)序反應(yīng)中與載體引物M13正向和反向寡核苷酸反應(yīng)并上樣至自動(dòng)化的測(cè)序儀上。通過(guò)與 對(duì)其進(jìn)行FIS查詢的初始EST序列進(jìn)行序列比對(duì)來(lái)確認(rèn)克隆鑒定。將確認(rèn)的模板通過(guò)基于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tyl轉(zhuǎn)座因子 (Devine和Boeke，1994，Nucleic Acids Res. 22 :3765_3772)的Primer Island轉(zhuǎn)座試劑盒 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)座。該體外轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在整個(gè)一組大DNA 分子中隨機(jī)地放入獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)。隨后將轉(zhuǎn)座的DNA用于通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化DHlOB電-感 受態(tài)細(xì)胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉(zhuǎn)座因子含有另外的可選標(biāo) 記(稱為 DHFR ；Fling 禾口 Richards, 1983, Nucleic AcidsRes. 11 :5147_5158)，使得能在瓊 脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉(zhuǎn)座子的那些亞克隆。從每次轉(zhuǎn)座反應(yīng)隨機(jī)地選擇多個(gè)亞 克隆，通過(guò)堿性裂解制備質(zhì)粒DNA，并用對(duì)轉(zhuǎn)座子內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)特異性的獨(dú)特引物從轉(zhuǎn)座事 件位點(diǎn)向夕卜進(jìn)行測(cè)序(ABI Prism dye-terminator ReadyReaction mix)。收集序列數(shù)據(jù)(ABIPRISM Collections)并用 Phred 和 Phrap (Ewing 等人， Genome Res. 8 175-185 (1998) ；Ewing 等人，Genome Res. 8 186-194 (1998))進(jìn)行裝配。 Phred是一種公用軟件程序，該程序再次讀取ABI序列數(shù)據(jù)，再次調(diào)出(recall)堿基，賦質(zhì) 量值，并將堿基序列(base call)和質(zhì)量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap序列組裝程序 使用這些質(zhì)量值來(lái)增加組裝的序列重疊群的準(zhǔn)確度。通過(guò)Consed序列編輯器(Gordon等 人，1998，Genome Res. 8 195-202)檢查裝配序列。在一些克隆中，cDNA片段對(duì)應(yīng)基因的3’ -端的一部分并且不會(huì)涵蓋整個(gè)開(kāi)放閱 讀框。為了獲得上游信息，使用兩種不同規(guī)程中的一者。這兩種方法中的第一種方法導(dǎo)致 產(chǎn)生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有整個(gè)開(kāi)放閱讀框的 片段。這兩種方法均使用兩輪PCR擴(kuò)增以從一個(gè)或多個(gè)文庫(kù)獲得片段。有時(shí)基于以前的知 識(shí)(特定的基因應(yīng)該存在于某些組織中)選擇文庫(kù)，有時(shí)則進(jìn)行隨機(jī)地選擇。獲得相同基 因的反應(yīng)可平行地在若干文庫(kù)中進(jìn)行，或者在文庫(kù)池中進(jìn)行。文庫(kù)池通常用3至5個(gè)不同 的文庫(kù)制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用載體 特異性的(正向)引物，同時(shí)還使用基因特異性的(反向)引物，該正向引物對(duì)應(yīng)位于克 隆5’ -端處的載體的一部分。-第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補(bǔ)的序列，而 第二種方法使用與3’ -非翻譯區(qū)(也稱為UTR)的一部分互補(bǔ)的基因特異性引物。在第二 輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用套式引物組。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，用市售試劑盒將所得DNA片段連接進(jìn)pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括Invitrogen (Carlsbad，CA)、 Promega Biotech (Madison, WI)和 Gibco-BRL (Gaithersburg，MD)在內(nèi)的一些供應(yīng)商的許 多試劑盒。如上所述，將質(zhì)粒DNA通過(guò)堿性裂解方法分離并進(jìn)行測(cè)序和用Phred/Phrap進(jìn) 行裝配。實(shí)施例7cDNA克降的鑒定編碼LNT2樣多肽的cDNA克隆通過(guò)這樣鑒定進(jìn)行BLAST(基本的局部比對(duì)搜索 工具)；Altschul等人，J.Biol. 215 =403-410,1993 ；還可參見(jiàn)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)家醫(yī)學(xué) 圖書(shū)館的國(guó)家生物技術(shù)信息中心的萬(wàn)維網(wǎng)址上對(duì)BLAST算法的解釋)進(jìn)行鑒定，尋找與 BLAST “nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank⑶S翻譯序列、源自 3_維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)、SWISS_PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) 的最新的主要版本、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)的序列)的相似性。在所有的閱讀框中翻譯來(lái)自克 隆的 DNA 并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法(Gish 和 States，Nat. Genet. 3 :266_272 (1993))。 采用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列編碼的多肽與包含 在“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有可公開(kāi)獲得的氨基酸序列的相似性。為方便起見(jiàn)，通過(guò)BLAST計(jì)算 僅僅偶然觀察到cDNA序列與所搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值 (期望值)，在本文報(bào)導(dǎo)為“pLog”值，它代表所報(bào)導(dǎo)的P值或E值的負(fù)對(duì)數(shù)。-因此，pLog 值越大，cDNA編碼的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。EST序列能與如上所述的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。通過(guò)使用BLASTn算法 (Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 (1997))對(duì)杜邦專利數(shù)據(jù)庫(kù)比較具有序 列同源共有區(qū)域或重疊區(qū)域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在兩個(gè) 或更多個(gè)核酸片段之間存在共有或重疊序列時(shí)，該序列可裝配成單一的連續(xù)核苷酸序列， 從而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦確定了最5'的EST后，可以通過(guò)全 長(zhǎng)插入序列來(lái)確定其完整的序列?？捎胻BLASTn算法，通過(guò)將已知基因(來(lái)自專有來(lái)源或公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)的已知基因) 的氨基酸序列對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，可找到屬于不同物種的同源基因。tBLASTn算法對(duì)所 有6個(gè)閱讀框都翻譯了的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異，并且允許密碼子簡(jiǎn)并。實(shí)施例8表征編碼LNT2樣多肽的cDNA克降制備提供來(lái)自玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、和大豆(Glycinemax)不同 組織的mRNA的cDNA文庫(kù)。下面描述了該文庫(kù)的特征。表2來(lái)自玉米、大米、和大百的cDNAt庫(kù)________________________________________文庫(kù)________________________________________玉米(Zea mays L.)，用與RNA、DNA合成相關(guān)cpglc
rcaln pkOOl. f6 :fis
的化學(xué)制品處理過(guò)的收集的BMS
歸一化的水稻(Oryza sativa L.，Nipponbare)愈傷
組織
rcaln.
Jl pkOOl. k5
sfllnl 歸一化的大豆(Glycine max L.，Wye)未成熟的花。 sfllnl. pk002.
大豆(Glycine max，Wye) 11天齡幼苗的全長(zhǎng)文
sdslf
sdslf.
庫(kù)，使用海藻糖如表3、圖14A-14B、和圖15所示，表2中鑒定的cDNA編碼的多肽類似于來(lái)自擬南 芥的LNT2多肽(At5g50930 ；NCBI通用標(biāo)識(shí)號(hào)15241317 ；SEQ ID NO 28)和來(lái)自水稻(GI No. 38347162，對(duì)應(yīng)于 SEQID NO 33)以及葡萄(GI No. 147791927，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO 34) 的LNT2樣多肽。表3(非專利文獻(xiàn))和表4 (專利文獻(xiàn))中所示的分別是單獨(dú)的EST (“EST”) BLASTP 結(jié)果、包含標(biāo)明的cDNA克隆的整個(gè)cDNA插入物的序列(“FIS”)、由兩個(gè)或更多個(gè)EST、FIS 或PCR序列裝配而成的重疊群序列(“Contig”)、或編碼源自FIS或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列(“CGS”)。表3和表4也顯示了使用Clustal V比對(duì)方法、使用默認(rèn)參 數(shù)計(jì)算的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比值(如下所述)。
表3
多肽的BLASTP結(jié)果 與LNT2多肽的同源性
序列
(SEQ ID NO #)
狀況 NCBI GI
% 同一性 BLAST
PLOG打分
cpglc. pk013. 06 :fis
(SEQ ID NO 18) rcaln. pkOOl. f6:fis
(SEQ ID NO 20) PS0415619
(SEQ ID NO 24) PS0415620
CGS
CGS
重疊群
38347162
(SEQ ID :33. 38347162
(SEQ ID :33. 147791927
(SEQ ID :34. 147791927
77. 4
100. 0
58. 7
17. 8
15. 8
13. 0(SEQ ID NO 26)
重疊群57. 1
(SEQ ID 34.
表4
多肽的BLASTP結(jié)果 與LNT2多肽的同源件重疊群57.111.8_序列BLAST狀況 參照序列％同一性(SEQ ID NO #)pLOG 打分_CGSCGS重疊群重疊群圖14A和14B提供如SEQ ID NO :18、20、24、26所示的氨基酸序列和來(lái)自擬南 芥(分別是 SEQ ID NO :28、30、和 32)的 LNT2 (At5g50930 ；NCBI 通用標(biāo)識(shí)號(hào) 15241317)、 LNT2-2、以及LNT2-3多肽的氨基酸序列的比對(duì)。也包括來(lái)自水稻(GI No. 38347162，對(duì)應(yīng) 于 SEQ ID NO 33)以及葡萄(GI No. 147791927，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO 34)的 LNT2 樣多肽的 比對(duì)。圖15是圖14A和14B中顯示的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖 表。用LASERGENE 生物信息計(jì)算包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)的 MEGALIGN 程序 進(jìn)行序列比對(duì)和同一性百分比計(jì)算。用帶默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10) 的Clustal比對(duì)方法(Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 :151_153)進(jìn)行序列的多重比對(duì)。 使用Clustal方法的成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE 1，空位罰分=3，窗口 = 5,DIAGONALS SAVED = 5。實(shí)施例9制備含有擬南芥屬前導(dǎo)基因的同源物的棺物表汰載體可使用諸如BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool ；Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1993 ；也參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院 (National Institutes of Health)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(National Library of Medicine)的 國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)
cpglc. pk013. 06 :fis
(SEQ ID NO 18) rcaln. pkOOl. f6:fis
(SEQ ID NO 20) PS0415619
(SEQ ID NO 24) PS0415620
(SEQ ID NO 26)
SEQ ID NO=224380
在 US2004214272-A1 中 SEQ ID NO 188525
在 US2004123343-A1 中 SEQ ID NO : 183694
在 US2004031072-A1 中 SEQ ID NO : 183694
在 US2004031072-A1 中
92. 3
100. 0
92. 1
84. 9
21. 0
15. 7
21. 4
19. 8址上對(duì)BLAST算法的解釋)之類的序列比較算法，鑒定與前導(dǎo)LNT2基因同源的序列。同源 LNT2樣序列，如實(shí)施例8所述的序列，可通過(guò)任何一種以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。方法1 (基于RNA的方法)如果LNT2同源物的蛋白編碼區(qū)域的5’和3’序列信息 是可用的，可如實(shí)施例5A所述設(shè)計(jì)基因特異性引物?？蓪T-PCR用于植物RNA來(lái)獲得含 有蛋白編碼區(qū)的核酸片段，該EXST蛋白編碼區(qū)旁側(cè)為attBl (SEQ ID NO 12)和attB2 (SEQ ID NO 13)序列。引物可含有起始密碼子上游的共有Kozak序列(CAACA)。方法2 (基于DNA的方法)作為另外一種選擇，如果LNT2同源物的cDNA克隆是可 用的，可以PCR擴(kuò)增完整cDNA插入序列(含有5'和3'非編碼區(qū))。可設(shè)計(jì)正向引物和反向 引物，使它們分別或者含有attBl序列和在該cDNA插入序列前面的載體特異性序列或者含 有attB2序列和在該cDNA插入序列后面的載體特異性序列。對(duì)于克隆進(jìn)載體pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ IDNO 15)和反向引物VC063 (SEQ ID NO 16)。方法1和方法2可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的步驟進(jìn)行修改。例如，方法1的引物 可含有限制性酶切位點(diǎn)而不是attBl和attB2位點(diǎn)，用于后來(lái)將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)含有attBl 和attB2位點(diǎn)的載體內(nèi)。另外，方法2可涉及從cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因組DNA 擴(kuò)增。可利用BP重組反應(yīng)將通過(guò)任一種上述方法獲得的PCR產(chǎn)物與GATEWAY 供體載體 (例如 pDONR Zeo (SEQ ID NO :2 ；圖 2)或 pD0NR 221 (SEQ ID NO :3 ；圖 3)組合。這種方 法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)從pDONR Zeo或pD0NR 221移除并定 向地克隆了該在旁側(cè)具有attBl和attB2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物而得到入門克隆(entry clone)。 使用INVITR0GEN GATEWAY CL0NASE 技術(shù)，然后可將來(lái)自入門克隆的編碼同源LNT2多 肽的序列轉(zhuǎn)移到合適的目的載體中(如pBC-Yellow(SEQ ID NO :4 ；圖4)、PHP27840 (SEQID NO 5 ；圖5)、或PHP23236(SEQ ID NO 6 ；圖6))以獲得植物表達(dá)載體，所述載體分別用于擬 南芥、大豆、和玉米。圖2和3中分別示出了供體載體pD0NRTM/Zeo或pDONR 221的attPl和attP2位 點(diǎn)。圖 4、5 和 6 分別示出 了 目的載體 pBC-Yellow、PHP27840、和 PHP23236 的 attRl 和 attR2 位點(diǎn)。作為另外一種選擇，可進(jìn)行多個(gè)入門克隆和合適的目的載體之間的MultiSite Gateway LR重組反應(yīng)以產(chǎn)生表達(dá)載體。實(shí)施例10吿組百.表汰裁■臓H寸_赫能細(xì)·擁為了檢查所得表型，可將大豆植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)每個(gè)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥屬 (Arabidopsis)基因或來(lái)自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物?？蓪?shí)施例5中所述的相同GATEWAY · Λ門克隆用于將每個(gè)基因定向克隆進(jìn) ΡΗΡ27840載體(SEQ ID NO 5 ；圖5)中，使得該基因的表達(dá)處于SCPl啟動(dòng)子的控制下。然后可用包含編碼本多肽的序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆胚。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，可將子葉(長(zhǎng)度為3_5mm，從大豆品種A2872的表面滅菌的未 成熟種子解剖出來(lái))于26°C在光下或黑暗下培養(yǎng)六至十周。然后切取體細(xì)胞胚(其產(chǎn)生次 生胚)并將其置于合適的液體培養(yǎng)基內(nèi)。在重復(fù)選擇增殖為早期球形階段胚的體細(xì)胞胚的簇后，按下面的描述保持該懸浮液?？蓪⒋蠖古甙l(fā)生懸浮培養(yǎng)物在26°C下在搖床(150rpm)上的35mL液體培養(yǎng)基中 保持，熒光光照采用16 8小時(shí)(白天/黑夜)的時(shí)間表。通過(guò)將大約35mg組織移植進(jìn) 35ml液體培養(yǎng)基中，每?jī)芍軐⑴囵B(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后可通過(guò)基因槍轟擊方法(Klein等人，Nature (London) 327 :70_73 (1987)，美 國(guó)專利4，945，050)轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。杜邦公司的BIOLISTIC PDS1000/HE儀 器(氦氣改進(jìn)型)可用于這些轉(zhuǎn)化。可用于幫助大豆轉(zhuǎn)化的可選標(biāo)記基因是由來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子 (Odell 等人，Nature 313 :810_812 (1985))、來(lái)自質(zhì)粒 pJR225 (來(lái)自大腸桿菌；Gritz 等人， Gene 25 :179_188，1983)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因以及胭脂堿合成酶基因的3'區(qū)構(gòu)成的 嵌合基因，該胭脂堿合成酶基因來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti質(zhì)粒的 T-DNA?？捎糜趲椭蠖罐D(zhuǎn)化的另一種可選標(biāo)記基因是來(lái)自大豆或擬南芥屬的除草劑抗性 乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成中 的第一共用酶。已經(jīng)鑒定出ALS中的突變導(dǎo)致對(duì)三類ALS抑制劑中的某些或全部具有抗性 (美國(guó)專利5，013，659 ；其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文)。除草劑抗性ALS基因的表達(dá) 可處于SAM合成酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利申請(qǐng)US-2003-0226166-A1 ；藉此將其全部?jī)?nèi)容以引用 的方式并入本文)的控制下。將如下物質(zhì)(依次)加入50 μ L 60mg/mL的1 μ m金顆粒懸浮液5 μ L DNA (1 μ g/ μ L),20 μ L亞精胺(0. 1Μ)和50 μ L CaCl2 (2. 5Μ)。然后攪拌該顆粒制備物三分鐘，在微量 離心機(jī)(microfuge)中離心10秒并移除上清液。然后將DNA包覆的顆粒在400 μ L 70%乙 醇中洗滌一次并再懸浮于40 μ L無(wú)水乙醇中?？蓪NA/顆粒懸浮液用超聲波處理三次，每 次一秒鐘。然后將五μ L該DNA-包覆的金顆粒裝載至每個(gè)宏載體盤上。將大約300_400mg兩周大的懸浮培養(yǎng)物置于60X 15mm的空培養(yǎng)皿中并用吸管將 殘留的液體從組織移除。對(duì)于每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，大約5-10板的組織受到正常轟擊。膜破裂壓 力設(shè)定為IlOOpsi并將腔室抽成28英寸汞柱的真空。將組織置于離阻擋網(wǎng)大約3. 5英寸 的地方并轟擊三次。轟擊后，可將組織分成兩份并放回液體培養(yǎng)基中，如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后五至七天，用新鮮培養(yǎng)基更換該液體培養(yǎng)基，并在轟擊后七至十二天，用含 有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基更換?？擅恐芨鼡Q這種選擇培養(yǎng)基。轟擊后七至八周，可 觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的壞死的胚芽發(fā)生簇長(zhǎng)出來(lái)。移出分離的綠色組織并將其 移植進(jìn)單獨(dú)的燒瓶中以產(chǎn)生新的、無(wú)性繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物?？蓪⒚恳恍缕废?當(dāng)成是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。然后可將這些懸浮培養(yǎng)物作為未成熟胚進(jìn)行傳代培養(yǎng)和維持，或 者通過(guò)使單獨(dú)體細(xì)胞胚成熟并萌發(fā)而再生成整株植株?？煞治鲇抿?yàn)證過(guò)的基因轉(zhuǎn)化大豆植株以研究相對(duì)于對(duì)照或參照植株的農(nóng)學(xué)特性。 例如，能夠分析在低氮和高氮條件(如氮限制條件和氮充分條件)下的產(chǎn)量增加和/或穩(wěn) 定性。實(shí)施例11使用粒子轟擊用驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化玉米為了檢查所得表型，可將大豆植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥屬前導(dǎo)基因或來(lái) 自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物。
可以將實(shí)施例5中所述的相同GATEWAY 入門克隆用于將每種相應(yīng)的基因定向 克隆進(jìn)玉米轉(zhuǎn)化載體中。在玉米轉(zhuǎn)化載體中的基因的表達(dá)可以處于組成型啟動(dòng)子的控制 下，例如玉米泛素啟動(dòng)子(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 =619-632,1989,以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675_689，1992)。然后可通過(guò)下面的方法將上述重組DNA構(gòu)建體引入玉米細(xì)胞中?？蓮脑从谧越挥?米系H99和LH132雜交的發(fā)育中的穎果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分離 胚，這時(shí)它們長(zhǎng)為1. O至1. 5mm。然后將胚以軸線側(cè)朝下放置并與瓊脂糖硬化的N6培養(yǎng)基 (Chu等人，Sci. Sin. Peking 18 =659-668,1975)接觸。將胚在27°C下保持在黑暗中。從這 些未成熟胚的胚鱗增生出易脆的胚發(fā)生愈傷組織，該愈傷組織由未分化的細(xì)胞塊構(gòu)成，在 胚柄結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)有體細(xì)胞原胚狀體和胚狀體?？蓪脑撛庵搀w分離的胚發(fā)生愈傷組織在N6 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并每?jī)芍寥茉谶@種培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。可將質(zhì)粒 p35S/Ac (得自 Peter Eckes 博士，Hoechst Ag, Frankfurt, Germany)用 于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以便提供可選標(biāo)記。該質(zhì)粒含有pat基因(見(jiàn)歐洲專利公布O 242 236)，該基因 編碼草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。酶PAT賦予對(duì)除草性谷氨酰胺合成酶抑制劑例如草胺膦的 抗性。p35S/Ac的pat基因處于來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等人，Nature313 810-812(1985))和胭脂堿合成酶基因的3'區(qū)的控制下，該胭脂堿合成酶基因來(lái)自根癌農(nóng) 桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA?？蓪⒘Ｗ愚Z擊法(Klein等人，Nature 327 :70_73 (1987))用于將基因轉(zhuǎn)移至愈傷 組織培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)該方法，利用下面的技術(shù)用DNA包覆金顆粒(直徑1 μ m)。將十yg 質(zhì)粒DNA加到50 μ L金顆粒的懸浮液(60mg每mL)中。將氯化鈣(50 μ L的2. 5Μ溶液)和 亞精胺游離堿(20 μ L的1. OM溶液)加入到該顆粒中。再加入這些溶液過(guò)程中渦旋該懸浮 液。10分鐘后，將試管粗略地離心(以15，OOOrpm進(jìn)行5秒鐘)并移除上清液。將該顆粒 再懸浮于200mL的無(wú)水乙醇中，再次離心并移除上清液。再次進(jìn)行乙醇沖洗并將顆粒再懸 浮于終體積為30 μ L的乙醇中。可將DNA包覆的金顆粒等分試樣(5 μ L)置于KAPTON飛行 圓盤(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用 BI0LISTIC PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA)，采用IOOOpsi的氦氣壓、0. 5cm的間隙距離以及1. Ocm的飛行距離，將顆粒加 速射入玉米組織中。對(duì)于轟擊，將胚發(fā)生組織置于瓊脂糖硬化的N6培養(yǎng)基上的濾紙上。組織布置成薄 薄一層，并覆蓋直徑為約5cm的圓形區(qū)域。然后可將包含組織的培養(yǎng)皿置于離阻擋網(wǎng)大約 8cm的PDS-1000/He的腔室內(nèi)。然后將該腔室中的空氣抽出至28英寸汞柱的真空。利用在 擊波管中氦氣壓力達(dá)到IOOOpsi時(shí)破裂的可破裂膜，宏載體被氦氣沖擊波加速。轟擊后七天，可將組織轉(zhuǎn)移至N6培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有雙丙氨磷(每升5mg)并 缺少酪蛋白或脯氨酸。組織繼續(xù)在這種培養(yǎng)基上緩慢生長(zhǎng)。另外兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至含 有bialaphos的新鮮N6培養(yǎng)基上。六周后，在某些裝有補(bǔ)充了雙丙氨磷的培養(yǎng)基的盤上， 可辨別直徑約Icm的區(qū)域上有活性生長(zhǎng)的愈傷組織。當(dāng)在選擇培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)時(shí)，這些 愈傷組織可繼續(xù)生長(zhǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法由愈傷組織再生出植物首先將組織簇轉(zhuǎn)移到N6培養(yǎng)基中，所 述培養(yǎng)基補(bǔ)充了 0.2mg 2，4-D/升。-兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中(Fromm等人， Bio/Technology 8:833-839(1990))。
可再生出轉(zhuǎn)基因的TO植株并按照下面的HTP步驟確定它們的表型?？墒占疶l種子?？稍诘拗茥l件下(例如ImM硝酸鹽)栽培Tl植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數(shù)可收集并定量植株面積、體積、生長(zhǎng)速率以及顏色分析。超表達(dá)構(gòu) 建體與合適的對(duì)照植物比較導(dǎo)致綠度(綠色區(qū))、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重或 干重、果實(shí)或種子產(chǎn)量、總植物氮含量、果實(shí)或種子氮含量、營(yíng)養(yǎng)組織的氮含量、總植物游離 氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的游離氨基酸含量、果實(shí)或種子中的游離氨基酸含量、果實(shí)或種子 中的蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，可認(rèn)為它是擬南芥前導(dǎo)基因在玉米 中發(fā)揮功能提高對(duì)氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的證據(jù)。此外，可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化或者 從單獨(dú)轉(zhuǎn)化的品系基因滲入而將含有證實(shí)的擬南芥基因的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入玉米自交 系內(nèi)。實(shí)施例12電穿孔根癌農(nóng)桿菌LBA4404(概沭)將電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(40 μ L)，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404 (含有ΡΗΡ10523)在冰上解凍(20-30分鐘)。ΡΗΡ10523含有用于T-DNA轉(zhuǎn)移的VIR 基因、農(nóng)桿菌屬的低拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)、四環(huán)素抗性基因以及用于體內(nèi)DNA生物分子 重組的cos位點(diǎn)。同時(shí)，將電穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設(shè)置調(diào)節(jié)至2. lkV。將DNA等分試樣(0. 5 μ L親代DNA，在低鹽緩沖液或雙蒸H2O中 的濃度為0. 2 μ g-1. 0 μ g)與解凍的根癌農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞混合，同時(shí)仍然保持在冰上。 將該混合物轉(zhuǎn)移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上1-2分鐘。通過(guò)按下“pulse (脈沖)，， 鍵兩次(理想的是獲得4. 0毫秒的脈沖)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔(Eppendorf電穿孔儀2510)。 隨后，將0. 5ml室溫下的2xYT培養(yǎng)基(或SOC培養(yǎng)基)加入到電穿孔管并轉(zhuǎn)移至15mL按 壓蓋管(例如FALCON 管)中。將細(xì)胞在28-300C >200-250rpm下培養(yǎng)3小時(shí)。將250 μ L的等分試樣散布在包含YM培養(yǎng)基和50 μ g/mL奇放線菌素的板上并在 28-30°C下培養(yǎng)三天。為了增加轉(zhuǎn)化體的數(shù)目，可進(jìn)行如下兩個(gè)可選步驟中的其中一個(gè)選擇1 用30 μ L 15mg/ml的利福平覆蓋平板。LBA4404具有針對(duì)利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的LBA4404感受態(tài)細(xì)胞制備物時(shí)觀察到的一 些污染克隆。選擇2 進(jìn)行兩次重復(fù)的電穿孔以補(bǔ)償較差的電感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體的鑒定選取四個(gè)獨(dú)立的克隆并劃痕接種在包含AB基本培養(yǎng)基和50 μ g/mL奇放線菌素的 平板上用于分離單個(gè)克隆。將平板在28°C下孵育二至三天。對(duì)于每個(gè)推定的共整合體選取 單個(gè)克隆并將其接種在4ml的10g/L細(xì)菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉，和50mg/ L奇放線菌素中。將該混合物在28°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。采用QIAGEN Minipr印和可選 的PB緩沖液洗滌，從4ml培養(yǎng)物分離出質(zhì)粒DNA。DNA在30 μ L中洗提。如上所述，將2 μ L 的等分試樣用于電穿孔20 μ L DHlOb+ZOyL雙蒸Η20?？扇芜x地，可將15 μ L等分試樣用于 轉(zhuǎn)化 75-100 μ L 的 INVITR0GEN Library Efficiency DH5 α。將細(xì)胞散布在包含 LB 培養(yǎng) 基和50 μ g/mL奇放線菌素的平板上并將其在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。
對(duì)于每個(gè)推定的共整合體選取三至四個(gè)獨(dú)立克隆并將其接種在4ml的2xYT培養(yǎng) 基(10g/L細(xì)菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉)和50yg/mL奇放線菌素中。將 細(xì)胞在37°C下?lián)u晃培養(yǎng)過(guò)夜。接下來(lái)，使用QIApi^p Minipr印，用任選PB緩沖液洗滌液 (稀釋成50 μ L)從4mL培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。8 μ L質(zhì)粒DNA用SalI (使用親本DNA和 ΡΗΡ10523作對(duì)照物)進(jìn)行消化。對(duì)于4個(gè)質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI和HindIII 再進(jìn)行三次消化(使用親代DNA和PHP10523作為對(duì)照)，這4個(gè)質(zhì)粒代表2種具有正確 SalI消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠(Electronic gel)用于比較。作為另一種選擇，對(duì)于高通量應(yīng)用，例如針對(duì)Gaspe Flint衍生的玉米品系(實(shí)施 例16)所描述的，代替通過(guò)限制性酶切分析來(lái)評(píng)價(jià)所得的共整合載體，可將三個(gè)克隆同時(shí) 用于如實(shí)施例13 (經(jīng)由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化)所述的感染步驟。實(shí)施例13使用農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)菌轉(zhuǎn)化玉米為了檢查所得表型，可將大豆植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥屬前導(dǎo)基因或來(lái) 自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物。農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化基本上按照以下文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行Zhao等 人，in Meth. Mol. Biol. 318 315-323 (2006)中描述的方法進(jìn)行(還可參見(jiàn)Zhao等人，Mol. Breed. 8 =323-333(2001)和1999年11月9日公布的美國(guó)專利5，981，840，以引用的方式將 該文獻(xiàn)并入本文)。該轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及細(xì)菌接種、共培養(yǎng)、靜息、選擇和植物再生。1.未成熟胚芽制備將未成熟胚芽從穎果上切下來(lái)，并且放置在含有2mL PHI-A培養(yǎng)基的2mL胃管中。2.細(xì)謹(jǐn)荊_干麵_趣■士咨養(yǎng)2. 1感染步驟用ImL微吸移管將(1)的PHI-A培養(yǎng)基取出，并且加入ImL農(nóng)桿菌屬細(xì)菌懸浮液。 將該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養(yǎng)5分鐘。2. 2共培養(yǎng)步驟用ImL微吸移管將農(nóng)桿菌屬細(xì)菌懸浮液從感染步驟中取出。使用無(wú)菌刮刀將胚從 管中刮出并轉(zhuǎn)移到100X15mm培養(yǎng)皿中的PHI-B培養(yǎng)基的平板中。確定胚的朝向，使得胚 軸在培養(yǎng)基表面上朝下。將具有胚芽的平板在20°C于黑暗中培養(yǎng)3天。L-半胱氨酸可用 于共培養(yǎng)階段。采用標(biāo)準(zhǔn)二元載體，補(bǔ)充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)于 回收穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因事件是至關(guān)重要的。3.詵擇推定的轉(zhuǎn)基因事件向在IOOX 15mm培養(yǎng)皿中的PHI-D培養(yǎng)基的平板中轉(zhuǎn)移10個(gè)胚芽，保持朝向，并 且用parafilm將培養(yǎng)皿密封。將平板在黑暗中于28°C培養(yǎng)。預(yù)計(jì)在6_8周將看見(jiàn)作為黃 色胚芽組織的主動(dòng)生長(zhǎng)推定事件。不產(chǎn)生事件的胚可能是棕色和壞死的，并且?guī)缀蹩床灰?jiàn) 脆性組織生長(zhǎng)。以2-3周的間隔將推定的轉(zhuǎn)基因胚芽組織轉(zhuǎn)移到新鮮的PHI-D平板上進(jìn)行 傳代培養(yǎng)，時(shí)間間隔取決于生長(zhǎng)速度。記錄事件。4. TO棺株的再牛將在PHI-D培養(yǎng)基上繁殖的胚芽組織轉(zhuǎn)移到在100 X 25mm培養(yǎng)皿中的PHI-E培養(yǎng) 基(體細(xì)胞胚芽成熟培養(yǎng)基)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在28°C于黑暗中培養(yǎng)直至體細(xì)胞胚芽成熟，培養(yǎng)大約10-18天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個(gè)體成熟體細(xì)胞胚芽轉(zhuǎn)移到PHI-F 胚芽發(fā)芽培養(yǎng)基中，并且在28°C于光中(約80 μ E，來(lái)自冷光燈或同等熒光燈)培養(yǎng)。在 7-10天，將約IOcm高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中，并且使用標(biāo)準(zhǔn)園藝方法進(jìn)行 耐寒鍛煉(hardened-off)。用干棺物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)某1. PHI-A :4g/L CHU基礎(chǔ)鹽，1. OmL/L 1000XEriksson' s 維生素混合物，0. 5mg/L 鹽酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68. 5g/L 蔗糖，36g/L 葡萄糖，pH5. 2。加入 100 μ M乙酰丁香酮(過(guò)濾滅菌的)。2. PHI-B :ΡΗΙ_Α，不含有葡萄糖，將2，4_D增加至2mg/L，將蔗糖降低至30g/L，并 且補(bǔ)充0. 85mg/L硝酸銀(過(guò)濾滅菌的)，3. Og/LGELRITE , 100 μ M乙酰丁香酮(過(guò)濾滅菌 的)，ρΗ5. 8。3. PHI-C :ΡΗΙ-Β，不含 GELRITE 和乙酰丁香酮，將 2，4_D 降低至 1. 5mg/L，并且補(bǔ) 充8. Og/L瓊脂，0. 5g/L 2-[N-嗎啉代]乙烷-磺酸(MES)緩沖液，100mg/L羧芐西林(過(guò) 濾滅菌的)。4. PHI-D =PHI-C 補(bǔ)充 3mg/L bialaphos (過(guò)濾滅菌的)。5. PHI-E 4. 3g/L 的 Murashige and Skoog(MS)鹽(Gibco，BRLl 1117-074)、0· 5mg/ L的煙酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、0. 5mg/L的鹽酸吡哆醇、2. 0mg/L的甘氨酸、0. lg/L的肌 醇、0. 5mg/L 的玉米素(Sigma，商品目錄號(hào):No. Z-0164)，lmg/L 吲哚乙酸(IAA)，26. 4 μ g/L 脫落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/L bialaphos (過(guò)濾滅菌的)，100mg/L羧芐西林(過(guò)濾滅菌 的)，8g/L 瓊脂，pH5.6。6. PHI-F 不含玉米素、IAA、ABA 的 PHI-E ；將蔗糖降低至 40g/L ；用 1. 5g/L
(K)
GELRITE替代瓊脂；pH為5. 6?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法由愈傷組織再生出植物首先將組織簇轉(zhuǎn)移到N6培養(yǎng)基中，所 述培養(yǎng)基補(bǔ)充了 0.2mg 2，4-D/升。-兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中(Fromm等人， Bio/Technology 8:833-839(1990))。轉(zhuǎn)基因TO植株可以再生，并且可以確定其表型?？墒占疶l種子?？稍诘拗茥l件下(例如ImM硝酸鹽)栽培Tl植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數(shù)可收集并定量植株面積、體積、生長(zhǎng)速率以及顏色分析。超表達(dá)構(gòu) 建體與合適的對(duì)照植物比較導(dǎo)致綠度(綠色區(qū))、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重或 干重、果實(shí)或種子產(chǎn)量、總植物氮含量、果實(shí)或種子氮含量、營(yíng)養(yǎng)組織的氮含量、總植物游離 氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的游離氨基酸含量、果實(shí)或種子中的游離氨基酸含量、果實(shí)或種子 中的蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，可認(rèn)為它是擬南芥前導(dǎo)基因在玉米 中發(fā)揮功能提高對(duì)氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的證據(jù)。此外，可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化或者從單獨(dú)轉(zhuǎn)化的品系基因滲入而將含有證實(shí)的擬南芥基 因的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入玉米自交系內(nèi)。實(shí)施例14A制各表汰裁體用干用駘iifi寸的候詵擬南芥某因(At5g50930)、使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米品系通過(guò)INVITR0GEN GATEWAY· 技術(shù)，使用GATEWAY· 入門克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)以生成前體質(zhì)粒PHP28699，GATEWAY 入門克隆包含擬南芥lnt2_2(如實(shí)施例5所述)、 入門克隆 PHP23112(SEQ IDNO :14)、入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO :9 ；圖 9)和目的載 體PHP22655 (SEQ ID NO: 10)。同樣地，使用GATEWAY 入門克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)以生 成前體質(zhì)粒PHP28700，GATEWAY 入門克隆包含擬南芥lnt2_2 (如實(shí)施例5所述)、入 門克隆 PHP23112(SEQ ID NO 14)、入門克隆 PHP20234 (SEQ ID NO :9 ；圖 9)和目的載體 PHP22655 (SEQID NO 10)。PHP28699 和 PHP28700 各包含以下表達(dá)盒1.表達(dá)PAT抗除草劑性基因的泛素啟動(dòng)子moPAT: :PinII終止子盒，該基因用于 轉(zhuǎn)化過(guò)程期間的選擇。2.表達(dá)DS-RED顏色標(biāo)記的LTP2啟動(dòng)子DS_RED2: :PinII終止子盒，該標(biāo)記用于 分選種子。此外，PHP28699包含泛素啟動(dòng)子lnt2_2: PinII終止子盒，該表達(dá)盒過(guò)表達(dá)擬 南芥LNT2-2，而PHP28700包含泛素啟動(dòng)子lnt2_3: :PinII終止子盒，該表達(dá)盒過(guò)表達(dá)擬 南芥 LNT2-3。實(shí)施例14B練胃難iH糊謝以赫細(xì)(At5g50930)規(guī) 口口口胃使用如實(shí)施例12和13所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，可將載體ΡΗΡ28699 (如實(shí)施例14Α 所述)中存在的LNT2-2表達(dá)盒導(dǎo)入玉米自交系或來(lái)源于優(yōu)良玉米自交系的可轉(zhuǎn)化玉米品 系。也能使用相同程序?qū)ⅵ宝Е?8700中存在的LNT2-3表達(dá)盒導(dǎo)入玉米自交系或來(lái)源于優(yōu)良 玉米自交系的可轉(zhuǎn)化玉米品系。能把表達(dá)載體ΡΗΡ28699通過(guò)電穿孔導(dǎo)入包含載體ΡΗΡ10523 (SEQID NO :7，圖7) 的LBA4404農(nóng)桿菌菌株以制備共整合載體ΡΗΡ28841，該載體包含lnt2-2表達(dá)盒。共整合載 體通過(guò)每個(gè)載體上包含的COS重組位點(diǎn)重組兩個(gè)質(zhì)粒PHP28699和PHP10523形成，并且除 了農(nóng)桿菌菌株以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化需要的其它基因(ΤΕΤ、ΤΕΤ、TRFA、ORI終止子、CTL、ORI V、VIR Cl、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，還包含上述相同的三個(gè)表達(dá)盒(實(shí)施例14A)。同 樣地，能把表達(dá)載體PHP28700通過(guò)電穿孔導(dǎo)入包含載體PHP10523 (SEQ ID NO -J,圖7)的 LBA4404農(nóng)桿菌菌株以制備共整合載體PHP28840，該載體包含lnt2-3表達(dá)盒?？墒褂?但 不限于)實(shí)施例12中的電穿孔規(guī)程。實(shí)施例15制備目的載體PHP23236用于轉(zhuǎn)化到Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系中目的載體 PHP23236 (圖 6，SEQ ID NO 6)是通過(guò)用載體 PHP23235 (圖 8 ;SEQ ID NO 8)轉(zhuǎn)化包含PHP10523(圖7 ；SEQ ID NO 7)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404并分離所得的共整 合產(chǎn)物而獲得。目的載體PHP23236可被用于如實(shí)施例16所述的與入門克隆的重組反應(yīng)，以產(chǎn)生 用于轉(zhuǎn)化Gaspe Flint衍生的玉米品系的玉米表達(dá)載體。實(shí)施例16制各表汰構(gòu)律體用干轉(zhuǎn)仆Jl丨Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系中使用INVITROGEN GATEWAY LR重組技術(shù)，可使用如實(shí)施例5所述的相同入門 克隆將表達(dá)盒定向克隆到GATEWAY 目的載體PHP23236 (SEQ ID NO :6;圖6)中以制備 相應(yīng)的表達(dá)載體。表達(dá)載體PHP29694和PHP29689分別包含lnt2_2 (SEQ ID NO 29)和Int2-3(SEQID NO :31)。每個(gè)表達(dá)載體包含在UBI啟動(dòng)子控制下的受關(guān)注cDNA，并且是 T-DNA 二元載體，用于通過(guò)如本文所述實(shí)施例所述(但不限于)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到玉米中。實(shí)施例17A用駘iifi寸的候詵擬南芥某因(At5g50930)轉(zhuǎn)化Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系為了檢查所得表型，可將玉米植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)擬南芥屬(Arabidopsis) At5g50930基因(和來(lái)自其它物種的對(duì)應(yīng)同源物)。可使用如實(shí)施例16所述的表達(dá)構(gòu)建體。受體棺株受體植株細(xì)胞可來(lái)自具有短的生活周期(“快速循環(huán)”)、大小減少以及轉(zhuǎn)化潛能 高的單一玉米品系。對(duì)玉米典型的這些植株細(xì)胞是來(lái)自可公開(kāi)獲得的Gaspe Flint(GF)品 系變種的植株細(xì)胞。一種可能的候選植株品系變種是GFXQ (Quick Turnaround Maize (快 速周轉(zhuǎn)玉米)，選擇用于在溫室條件下生長(zhǎng)的Gaspe Flint的可公開(kāi)獲得形式)的Fl雜交 種，其在Tomes等人(美國(guó)專利申請(qǐng)10/367,416，提交于2003年2月13日；美國(guó)專利公開(kāi) 公布2003/0221212 Al，公布于2003年11月27日)中有所公開(kāi)。從該品系獲得的轉(zhuǎn)基因 植株具有如此小的大小使得它們可在4英寸的盆中生長(zhǎng)(是正常大小的玉米植株所需空間 的1/4)并且它們?cè)谏儆?. 5個(gè)月時(shí)間內(nèi)成熟。(傳統(tǒng)上，一旦轉(zhuǎn)基因植株適應(yīng)溫室后需要 3. 5個(gè)月來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因TO種子。)另一合適的品系包括但不限于GS3(高度可轉(zhuǎn)化的品系) X Gaspe Flint的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開(kāi)花、高度減小或 這兩者的轉(zhuǎn)基因的可轉(zhuǎn)化的優(yōu)良玉米自交系。轉(zhuǎn)化規(guī)程任何合適的方法可用于將轉(zhuǎn)基因引入玉米細(xì)胞中，包括但不限于利用基于農(nóng)桿菌 載體的接種類型的步驟(參見(jiàn)例如實(shí)施例12和13)。轉(zhuǎn)化可在受體(靶標(biāo))植株的未成熟 胚上進(jìn)行。精確的生長(zhǎng)和植株跟蹤將由轉(zhuǎn)化的玉米胚產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因(TO)植株的事件群體在受控的溫室環(huán)境中栽 培，該溫室使用改良的隨機(jī)分塊(block)設(shè)計(jì)以降低或消除環(huán)境誤差。隨機(jī)分塊設(shè)計(jì)是這 樣一種植株布局，在該布局中，實(shí)驗(yàn)植株被分成組(如，每組30株植株)，稱為塊，而每株植 株隨塊被隨機(jī)分配一個(gè)位置。對(duì)于一組30株植株，24株轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)植株和6株對(duì)照植株(具有設(shè)定好的表型 的植株)(總起來(lái)說(shuō)稱為“重復(fù)組”)被置于盆中，這些盆在位于溫室內(nèi)的桌子上布置成陣列 (也叫做重復(fù)組或塊)。每株植株(對(duì)照植株或?qū)嶒?yàn)植株)隨塊被隨機(jī)分配一個(gè)位置，所述 的塊映射一個(gè)唯一的、溫室物理位置以及映射該重復(fù)組。在單次實(shí)驗(yàn)中多個(gè)30株植株的重 復(fù)組中的每一個(gè)可栽培在相同的溫室中。應(yīng)該確定重復(fù)組的布局(布置方式)以使對(duì)空間 的要求最小以及溫室內(nèi)的環(huán)境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。對(duì)于加入特定的對(duì)照組的一種替代方法是鑒定不表達(dá)所關(guān)注基因的那些轉(zhuǎn)基因 植株?？蓪⒅T如RT-PCR之類的多種技術(shù)應(yīng)用于定量評(píng)估引入基因的表達(dá)水平?？蓪⒉槐?達(dá)轉(zhuǎn)基因的TO植株與表達(dá)轉(zhuǎn)基因的那些植株進(jìn)行比較。在整個(gè)評(píng)價(jià)過(guò)程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株，并且從那些植株收集的數(shù)據(jù)自動(dòng)與那些植株相關(guān)聯(lián)，使得所搜集的數(shù)據(jù)可與由該植株攜帶的轉(zhuǎn)基因關(guān)聯(lián)。例如，每個(gè) 植株容器具有機(jī)器可讀的標(biāo)簽(例如通用貨單代碼(UPC)條形碼)，該標(biāo)簽包含了關(guān)于植物 身份的信息，身份信息繼而又與溫室位置相關(guān)，使得從植物獲得的數(shù)據(jù)可自動(dòng)與該植物相 關(guān)聯(lián)。作為另外一種選擇，可使用任何有效的、機(jī)器可讀的植物識(shí)別系統(tǒng)，例如二維矩 陣代碼或甚至是射頻識(shí)別標(biāo)簽(RFID)，其中數(shù)據(jù)被接收并由射頻接收器/處理器進(jìn)行 翻譯。參見(jiàn)提交于2002年12月19日的美國(guó)專利申請(qǐng)10/324，288(美國(guó)專利公開(kāi)公布 2004/0122592 Al，公布于2004年6月24日)，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。利用三維成像講行表型分析對(duì)TO事件群體中的每株溫室植株(包括任何對(duì)照植株)分析所關(guān)注的農(nóng)學(xué)特性， 并且以這樣一種方式記錄或存儲(chǔ)每株植株的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)，該方式使得數(shù)據(jù)與該植株的辨識(shí)數(shù) 據(jù)(見(jiàn)上面)相關(guān)聯(lián)?？衫门c上述類似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可在Tl代中完成對(duì)表型(基因效 應(yīng))的確認(rèn)。在植物的整個(gè)溫室生活周期中，利用定量的非破壞性成像技術(shù)在表型水平上來(lái)分 析TO植株以評(píng)估所關(guān)注的性狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，將數(shù)字成像分析儀用于整株植物的自 動(dòng)多維分析。成像可在溫室內(nèi)進(jìn)行。將兩個(gè)攝像系統(tǒng)(位于頂部和側(cè)面)和用于旋轉(zhuǎn)植物 的裝置用于從所有側(cè)面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、前面和側(cè)面采集圖像。所有 的三個(gè)圖像一起提供了足夠的信息用于評(píng)價(jià)例如每株植物的生物量、大小和形態(tài)。由于植物在第一片葉片從土壤顯現(xiàn)出來(lái)時(shí)到植物處于它們發(fā)育的末期時(shí)大小的 改變，在一個(gè)實(shí)施方案中是從頂部以較高的放大倍率記錄植物發(fā)育的早期。這攝像可通過(guò) 利用完全由成像軟件控制的自動(dòng)變焦鏡頭系統(tǒng)來(lái)完成。在單次成像分析操縱中，進(jìn)行如下事件(1)將植株傳送至分析儀區(qū)域內(nèi)，旋轉(zhuǎn) 360度以便其機(jī)器可讀標(biāo)簽可被讀取，并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動(dòng)；(2)獲取側(cè) 面圖像并將其輸入數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)將植株旋轉(zhuǎn)90度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動(dòng)，以及(4)將該植株傳送出分析儀。每24小時(shí)的周期讓植物至少6個(gè)小時(shí)處于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。成像儀器可使用任何合適的成像儀器，包括但不限于可從LemnaTec GmbH (ffurselen， Germany)商購(gòu)獲得的光譜數(shù)字成像儀。獲取圖像并用具有1/2" IT Progressive Scan IEE CCD成像設(shè)備的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2進(jìn)行分析。該成像照相機(jī)可配備有自 動(dòng)變焦、自動(dòng)調(diào)節(jié)光圈和自動(dòng)聚焦?？衫肔emnaTec軟件設(shè)定所有的照相機(jī)設(shè)置。在一個(gè) 實(shí)施方案中，對(duì)于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約5%，對(duì)于次要組成成像分析儀的 儀器差異小于約10%。^^成像分析系統(tǒng)包括用于顏色和構(gòu)造分析的LemnaTec HTS Bonit軟件程序和用于 存儲(chǔ)約500，000次分析的數(shù)據(jù)(包括分析數(shù)據(jù))的服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(kù)。原始圖像和分析過(guò)的圖 像儲(chǔ)存在一起以允許用戶根據(jù)需要進(jìn)行再次分析?？蓪?shù)據(jù)庫(kù)連接至成像硬件用于自動(dòng)的 數(shù)據(jù)收集和存儲(chǔ)。多種可商購(gòu)獲得的軟件系統(tǒng)(例如Matlab，其它軟件)可用于定量解釋 圖像數(shù)據(jù)，并且可將這些軟件體系中的任何一種應(yīng)用于所述圖像數(shù)據(jù)集。
傳送系統(tǒng)具有植物旋轉(zhuǎn)裝置的傳送系統(tǒng)可用于將植物傳送至成像區(qū)域并在成像過(guò)程中選 擇植物。例如，將最多4株植物(每株最高高度為1.5m)裝上小車，該小車在循環(huán)的傳送系 統(tǒng)上行進(jìn)并通過(guò)成像測(cè)量區(qū)域。在這種情況下，該單位(成像分析儀和傳送環(huán)線)的總占 有面積為約5mX5m?？蓴U(kuò)大傳送系統(tǒng)以同時(shí)容納更多植物。將植物沿傳送環(huán)線傳送至成像區(qū)域并對(duì)每 株植物分析最多50秒。獲取植物的三個(gè)視圖。傳送系統(tǒng)以及成像設(shè)備應(yīng)該能夠用于溫室 環(huán)境條件。MM任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如，可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇，可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應(yīng)該將被照亮的區(qū)域 圍起來(lái)以確保恒定的照明條件。遮蔽物應(yīng)該長(zhǎng)于測(cè)量區(qū)域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開(kāi)和關(guān)閉門。作為另一種選擇，可以變化照明以引起轉(zhuǎn)基因(如，綠色熒光蛋白(GFP)、 紅色熒光蛋白(RFP))的激發(fā)或者引起內(nèi)源性(如葉綠素)熒光基團(tuán)的激發(fā)?；谌S成像的牛物量估計(jì)為了更好地估計(jì)生物量，應(yīng)該從至少三個(gè)軸(在一個(gè)實(shí)施方案中是頂部視圖和兩 個(gè)側(cè)面(側(cè)面1和側(cè)面2)視圖)獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景(盆 和花粉控制袋(如果適用的話))分離?？赏ㄟ^(guò)如下計(jì)算評(píng)價(jià)植物的體積
體積(體素)/頂部面積(像素)x^/側(cè)面1面積(像素)χλ/側(cè)面2面積(像素)在上面的等式中，體積和面積的單位是“任意單位”。在該體系中，任意單位完全足 以檢測(cè)基因?qū)χ参锎笮『蜕L(zhǎng)影響，因?yàn)樗璧氖菣z測(cè)與實(shí)驗(yàn)平均值或?qū)φ掌骄档牟钪?(正_較大和負(fù)_較小兩者)。大小(如面積)的任意單位可通過(guò)將物理參照加入到成像 過(guò)程而輕易地轉(zhuǎn)化成物理量度。例如，可在頂部成像過(guò)程和側(cè)面成像過(guò)程兩者中均包括已 知面積的物理參照?；谶@些物理參照的面積，可測(cè)定轉(zhuǎn)換因子以允許從像素轉(zhuǎn)換為面積 單位，例如平方厘米(cm2)。物理參照可以是或可以不是獨(dú)立的樣本。例如，具有已知直徑 和高度的盆足可用作物理參照。顏餼分類成像技術(shù)還可以用于確定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。將圖 像顏色歸屬于顏色類型是LemnaTec軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統(tǒng)，可通過(guò) 多種計(jì)算方法確定顏色分類。對(duì)于植物大小和生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定，一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案，包括綠色的兩種或三種色調(diào)(在一個(gè)實(shí)施方案中色調(diào)是50-66，參見(jiàn)圖12)，此外，還有 關(guān)于缺綠病、壞死和漂白(在這些條件出現(xiàn)時(shí))的顏色類型。還使用了背景顏色類型，其包 括圖像中的非植物顏色(例如盆和土壤顏色)，并將這些像素特別地從測(cè)定大小中排除。在 受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物內(nèi)隨時(shí)間推移的任何改變，或者植物 之間或植物不同分枝之間的任何改變(如季節(jié)差異)。除了其在測(cè)定植物的大小、生長(zhǎng)中的有效性外，顏色分類還可用于評(píng)估其他產(chǎn)量 構(gòu)成性狀。對(duì)于這些其他產(chǎn)量構(gòu)成性狀，可使用另外的顏色分離方案。例如，稱為“保綠度(staygreen) ”的性狀(已經(jīng)將其與產(chǎn)量的提高相關(guān)聯(lián))可通過(guò)顏色分類來(lái)評(píng)估，該顏色分 類將綠色色調(diào)與黃色和棕色色調(diào)(其指示老化的組織)相分離。通過(guò)將這種顏色分類應(yīng)用 于在TO或Tl植物生活周期末獲取的圖像，可鑒定綠色的量相對(duì)于黃色和棕色(例如，可表 示為綠色/黃色比率)增加的植物。這種綠色/黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定為 攜帶影響這種重要農(nóng)學(xué)性狀的轉(zhuǎn)基因。熟練的植物學(xué)家將認(rèn)識(shí)到可以指示植物健康或應(yīng)激反應(yīng)的其他植物顏色(花青 素)的出現(xiàn)，以及認(rèn)識(shí)到其他顏色分類方案可以提供對(duì)基因在與這些響應(yīng)相關(guān)的性狀方面 的作用的進(jìn)一步度量。棺物結(jié)構(gòu)分析改變植物結(jié)構(gòu)參數(shù)的轉(zhuǎn)基因也可以用本發(fā)明鑒定，包括諸如最大高度和寬度、節(jié) 間距離、葉與莖之間的角度、在節(jié)處開(kāi)始的葉片數(shù)以及葉片長(zhǎng)度。LemnaTec系統(tǒng)軟件可如下 用于確定植物構(gòu)造。在第一成像步驟中將植物簡(jiǎn)化至其主要的幾何構(gòu)造，并且隨后基于該 圖像可進(jìn)行不同構(gòu)造參數(shù)的參數(shù)化鑒定。或者是單獨(dú)地或者是組合地修改任何這些構(gòu)造參 數(shù)的轉(zhuǎn)基因可通過(guò)應(yīng)用此前所述的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)鑒定?；ǚ勖撀淙掌诨ǚ勖撀淙掌谑寝D(zhuǎn)基因植物中要分析的一個(gè)重要參數(shù)，并且可以通過(guò)活性雄花第 一次出現(xiàn)在植物上來(lái)確定。為了找到雄花目標(biāo)，通過(guò)顏色對(duì)莖的上端進(jìn)行分類以檢測(cè)黃色 或紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花，活性花繼而可用于計(jì)算花粉脫落日期。作為另外一種選擇，花粉脫落日期和其他易于在視覺(jué)上檢測(cè)到的植物屬性(如授 粉日期、第一穗絲日期)可以由負(fù)責(zé)進(jìn)行植物看護(hù)的工作任人員來(lái)記錄。為了使數(shù)據(jù)完整 性和過(guò)程效率最大化，通過(guò)利用相同的由LemnaTec光譜數(shù)字分析設(shè)備利用的條形碼來(lái)跟 蹤該數(shù)據(jù)?？蓪⒕哂袟l形碼閱讀器的電腦、掌上設(shè)備或筆記本電腦用于使記錄觀察時(shí)間、植 物標(biāo)識(shí)符的數(shù)據(jù)捕捉變得容易，以及使捕捉數(shù)據(jù)的操縱者變得舒適。植物的取向以接近商業(yè)栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的結(jié)構(gòu)。也就是說(shuō)，植 物具有一可清晰分辨的寬的側(cè)面和窄的側(cè)面。對(duì)來(lái)自植物寬側(cè)的圖像進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于每株 植物，給其賦予一個(gè)明確界定的基本取向以獲得寬側(cè)圖像與窄側(cè)(edgewise)圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于確定植物的主軸，而將額外的旋轉(zhuǎn)裝置用于在開(kāi)始主圖像采集 前將植物轉(zhuǎn)至合適的取向。實(shí)施例17B用玉米同源物轉(zhuǎn)化Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系使用INVITROGEN GATEWAY LR重組技術(shù)，可制備入門克隆用于玉米同源物 (SEQ ID NO :17)(參見(jiàn)關(guān)于入門克隆制備的實(shí)施例5)，并且能夠?qū)⑷腴T克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體PHP23236(SEQID N0:6;圖6)中以制備表達(dá)載體PHP30115。該表達(dá)載 體目前包含在UBI啟動(dòng)子控制下的受關(guān)注cDNA，并且是T-DNA 二元載體，用于通過(guò)如本文所 述實(shí)施例所述(但不限于)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到玉米中。實(shí)施例18在最佳和減少氮條件下篩選Gaste Flint衍生的玉米品系
轉(zhuǎn)基因植物將含有兩個(gè)或三個(gè)劑量的Gaspe Flint-3與一個(gè)劑量的GS3 (GS3/ (Gaspe-3) 2X或GS3/ (Gaspe-3) 3X)，并且對(duì)于顯性轉(zhuǎn)基因會(huì)以1 1分離。將包含 PHP29689(表達(dá)盒=lnt2_3)的轉(zhuǎn)基因植物種植在包含100 % Turface的200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)盆 中。用l.OmM KNO3生長(zhǎng)培養(yǎng)基(參見(jiàn)圖13)澆灑植物直到分離確定。在8DAP(種植后天 數(shù))，將幼苗隨機(jī)均勻置于相應(yīng)的處理組中。進(jìn)行兩種處理最佳氮(6. 5mMolKN03)和減少 氮(1. OmMol KNO3)處理，每日兩次直至13DAP。在13和24DAP之間的每天灌溉時(shí)間是在 9:00AM、12:00PM、和3 OOPM用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)澆灌3分鐘(156mL)。在25DAP，在5 OOAM增加第 四次澆灌，在31DAP，在5:00PM增加第五次澆灌。每個(gè)表每周監(jiān)控pH至少三次，并且記錄 哪天出苗以及哪天脫落。每周對(duì)每個(gè)植株拍照三次(周一、周三、和周五)以評(píng)估表面積積 聚、比生長(zhǎng)速率(sgr)、和顏色變化。在8DAP對(duì)植物取樣進(jìn)行ELISA Μ0ΡΑΤ，并且在35DAP 進(jìn)行表達(dá)和代謝表達(dá)譜分析。從在37DAP收獲的組織中獲取鮮重?cái)?shù)據(jù)，并且然后將收獲的 組織烘干(70°C，120小時(shí))以獲取干重?cái)?shù)據(jù)。評(píng)估PHP29689的四個(gè)事件(圖16)。計(jì)算更大的Student t檢驗(yàn)的概率用于比較 每個(gè)轉(zhuǎn)基因平均值與合適的無(wú)效轉(zhuǎn)基因平均值(分離無(wú)效轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體無(wú)效轉(zhuǎn)基因)。 使用最小值(P <t)0. 1作為臨界值。表5示出每個(gè)事件與分離無(wú)效轉(zhuǎn)基因相比顯著增加 的變量。^ 5PHP29689 事件綜沭 當(dāng)認(rèn)為所有事件是相對(duì)于無(wú)效構(gòu)建體(圖17)時(shí)，該構(gòu)建體與無(wú)效構(gòu)建體相比多 個(gè)變量平均顯示出顯著的增加(數(shù)據(jù)概述于表6中)。PHP29689構(gòu)建體概述 實(shí)施例19H有ffl南芥玉米品系的產(chǎn)量分豐斤自交或頂交雜交體的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇筇镌囼?yàn)來(lái)研究在氮限制條件下和無(wú)氮限制條件下的產(chǎn)量增加和/或穩(wěn)定性。例如，可進(jìn)行產(chǎn)量分析以測(cè)定包含驗(yàn)證過(guò) 的擬南芥lnt2-2或lnt2-3基因的植物在與對(duì)照植物(或參比植物)進(jìn)行比較時(shí)是否具 有產(chǎn)量改善(在氮限制條件下和無(wú)氮限制條件下)，所述對(duì)照植物是構(gòu)建體轉(zhuǎn)化無(wú)效植物 或野生型植物。氮限制條件通過(guò)以前的能育性實(shí)踐組合提供，其中施加含量減少的氮一年 或多年，玉米或替代作物在該條件下生長(zhǎng)并且每季移除種子作物。在此類條件下，基于由 Federal and State Extension服務(wù)對(duì)特定生長(zhǎng)區(qū)域確定的土壤測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)，低氮(LN)環(huán)境 指氮量少于在早春或夏季施加的標(biāo)準(zhǔn)氮肥的量，而標(biāo)準(zhǔn)氮(NN)環(huán)境指加入正常產(chǎn)量所需 的充足的氮。包含驗(yàn)證過(guò)的擬南芥lnt2_2或lnt2_3基因的玉米雜交體測(cè)交以及它們的對(duì)照植 物在Woodland，CA和Johnston，IA的LN和NN環(huán)境下生長(zhǎng)，并且評(píng)估產(chǎn)量。在LN環(huán)境下觀 察到的產(chǎn)量減少與在NN環(huán)境下獲得的產(chǎn)量比較。包含驗(yàn)證過(guò)的擬南芥lnt2-2或lnt2_3 基因的玉米雜交體測(cè)交的產(chǎn)量與構(gòu)建體無(wú)效轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)量比較。這些產(chǎn)量試驗(yàn)的結(jié)果在 圖18-21中顯示。包含PHP28840 (表達(dá)盒=lnt2_3)的植物的個(gè)體事件顯示在LN條件下顯著增加 的產(chǎn)量(2007 年在 Woodland 的事件 E6919. 105. 1. 11 和 E6919. 105. 1. 21)，而 2007 年在 Johnston測(cè)試的E6919. 105. 1. 21事件具有數(shù)字上更高的產(chǎn)量。2008年相似的測(cè)試揭示事 件 E6919. 105. 1. 21 在 Woodland 和 Johnston 以及事件 E6919. 105. 1. 2 和 E6919. 105. 1. 24 在Woodland和Johnston分別具有顯著改善的產(chǎn)量。包含PHP28840的植物在低氮條件下 的結(jié)果在圖18中顯示。在標(biāo)準(zhǔn)氮(NN)處理?xiàng)l件下，2007年在Woodland和Johnston的事件 E6919. 105. 1. 11與無(wú)構(gòu)建體植物的產(chǎn)量相似(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異)，說(shuō)明在更高的氮 含量條件下，該事件保留了高產(chǎn)量的潛力。2008年在Woodland獲得了相似的結(jié)果。與之 相反，2008 年在 Johnston 的事件 E3919. 105. 1. 11 和 2007 年與 2008 年在 Johnston 的事 件E6919. 105. 1. 21以及E6919. 105. 1. 24具有顯著較低的產(chǎn)量。包含PHP28840的植物在 標(biāo)準(zhǔn)氮條件下的結(jié)果在圖20中顯示。包含PHP28841 (表達(dá)盒=lnt2_2)的植物的個(gè)體事件(2007年，Woodland,在LN 條件下的事件E6919. 106. 1. 17和E6919. 106. 1. 3)顯示具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性的產(chǎn)量增 加。然而，2007年，Johnston，在LN條件下的事件E6919. 106. 1. 3顯示顯著較低的產(chǎn)量，并 且未收集事件E6919. 106. 1. 17的產(chǎn)量。圖19示出包含PHP28841的植物在低氮(LN)條件 下的結(jié)果。在標(biāo)準(zhǔn)氮(NN)處理?xiàng)l件下，與構(gòu)建體無(wú)效轉(zhuǎn)化植物相比，2007年在Woodland和 Johnston的E6919. 106. 1. 17都具有數(shù)字上更高的產(chǎn)量，然而事件E6919. 106. 1. 3在2007 年、在Woodland顯示顯著增加的產(chǎn)量，而在2007年、在Johnston顯示數(shù)字上增加的產(chǎn)量。 事件E6919. 106. 1. 22和E619. 106. 1. 8在Woodland顯示顯著減少的產(chǎn)量。包含PHP28841 的植物在標(biāo)準(zhǔn)氮(NN)條件下的結(jié)果在圖21中顯示。實(shí)施例20NUE玉米幼苗分析使用種子顏色標(biāo)記將轉(zhuǎn)基因事件的種子(具有構(gòu)建體PHP28841或PHP28840)分 成轉(zhuǎn)基因(雜合的)種子和無(wú)效轉(zhuǎn)基因種子。進(jìn)行兩組不同的隨機(jī)分配處理，使用所有處理的9個(gè)平行測(cè)定，使每個(gè)隨機(jī)分塊(block)有排列成6排9列的54個(gè)盆。在一個(gè)實(shí)例 中，混合相同構(gòu)建體的5個(gè)事件的4個(gè)無(wú)效轉(zhuǎn)基因種子，將其用作批對(duì)照用于比較該分塊的 5個(gè)陽(yáng)性事件，在每個(gè)分塊中制備6個(gè)處理的組合。在第二個(gè)實(shí)例中，將3個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性處 理以及它們對(duì)應(yīng)的無(wú)效轉(zhuǎn)基因隨機(jī)分配到該分塊的54個(gè)盆中，制備每個(gè)分塊的6個(gè)處理組 合(3個(gè)陽(yáng)性處理以及對(duì)應(yīng)的無(wú)效轉(zhuǎn)基因)，包含所有處理組合的9個(gè)平行測(cè)定。在第一個(gè) 實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因參數(shù)與批量無(wú)效構(gòu)建體比較；在第二個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因參數(shù)與對(duì)應(yīng)的無(wú)效轉(zhuǎn) 基因事件比較。在其中每個(gè)構(gòu)建體有10、15、或20個(gè)事件的實(shí)例中，將事件分成5個(gè)事件一 組，并且計(jì)算54個(gè)盆的每個(gè)分塊的變量。然而，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因方法比較前收集分塊的分塊 無(wú)效轉(zhuǎn)基因方法。就每個(gè)處理而言，將兩個(gè)種子種植在4英寸的方盆中，盆中包含在8英寸交錯(cuò) 中心上的Turface。盆每天用包含以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶液澆灌四次lmM CaCl2, 2mM MgSO4, 0. 5mM KH2PO4,83ppm Sprint330, 3mMKCl, ImM KNO3,1 μ M ZnSO4,1 μ M MnCl2,3yM H3BO4, 0. 1 μ MCuSO4,禾口 0· 1 μ M NaMoO4。植物出苗后，將其減少到每盆一個(gè)種子。通常在周一種植處理種子，并且植物在周 五后出苗。然后在種植后18天收獲植物。在收獲時(shí)從盆中移除植物，并且將Turface從根 部洗脫。使根與苗分開(kāi)，把根置于紙袋中并且在70°C干燥70小時(shí)。將干燥后的植物部分 (根和苗)稱重并置于50mL的圓錐管中，管中有大約20 5/32英寸的鋼球，在涂料振蕩器中 進(jìn)行振蕩研磨。將大約30mg研磨組織(記錄重量用于后續(xù)的調(diào)節(jié))在2mL 20% H2O2和6M H2SO4中水解30分鐘，水解溫度為170°C。在冷卻后，加水至20ml，充分混合該溶液。移除 50 μ 1的等分試樣并加到950 μ 1 IM Na2CO3中。通過(guò)將100 μ L該溶液置于96孔板的每個(gè) 孔中，然后加入50yL OPA溶液，使用該溶液中的氨評(píng)估減少的總植物氮。測(cè)定熒光強(qiáng)度， 激發(fā)(excitation) = 360nM/發(fā)射(emission) = 530nM，并且與溶解在相似溶液并用OPA 溶液處理過(guò)的NH4Cl標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。以下溶液用于前述實(shí)驗(yàn) OPA溶液-5 μ 1巰基乙醇+Iml OPA儲(chǔ)備液(每天新鮮制備)OPA 儲(chǔ)備液-50mg 鄰苯二醛(0PA_Sigma#P0657)溶解于 1. 5mL 甲醇 +4. 4mL IMBorate 緩沖液 pH9. 5 (3. 09g H3BO4+Ig NaOH,溶于 50mL 水中)+0. 55mL 20% SDS (每周新 鮮制備)測(cè)量以下參數(shù)，并且使用Student t檢驗(yàn)比較參數(shù)平均值與無(wú)效參數(shù)平均值 SPAD (綠度)、莖直徑、根干重、苗干重、總干重、和植物氮濃度。在每個(gè)隨機(jī)分塊中使用最近 鄰計(jì)算以及使用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(CRD)模型的方差分析(Analysis of Variance, AN0VA)計(jì) 算差異。使用F統(tǒng)計(jì)，通過(guò)將總隨機(jī)分塊處理平均面積除以總隨機(jī)分塊誤差平均面積計(jì)算 每個(gè)隨機(jī)分塊的總處理效應(yīng)。計(jì)算更大的Student t檢驗(yàn)的概率用于比較每個(gè)轉(zhuǎn)基因平均 值與合適的無(wú)效轉(zhuǎn)基因(或者批構(gòu)建體或單個(gè)事件的無(wú)效轉(zhuǎn)基因平均值)平均值。使用最 小值(P <t)0.1作為臨界值。圖 22 示出 PHP28840(表達(dá)盒=lnt2_3)和 PHP28841 (表達(dá)盒=lnt2_2)構(gòu)建體 的NUE幼苗測(cè)定結(jié)果。包含UBI:lnt2-3表達(dá)盒的事件E6919. 105. 1. 21顯示以下變量具有 統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性的增加苗干重、氮濃度、和總氮。具有UBI:lnt2-3表達(dá)盒的另一個(gè)事 件和具有UBI:lnt2-2表達(dá)盒的六個(gè)事件中的四個(gè)表現(xiàn)出植物氮濃度具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性的增加。此外，包含UBI lnt2-2表達(dá)盒的六個(gè)事件中的兩個(gè)顯示具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯 著性的總氮增加。實(shí)施例21規(guī)禾口 i平·械iH寸白■賊_±百.__±百.基于同源性搜索，能鑒定驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的一個(gè)或若干個(gè)候選大豆同源 物，并且還能評(píng)估它們?cè)黾哟蠖沟拗茥l件耐受性的能力。載體構(gòu)建、植物轉(zhuǎn)化和表型分析 將類似于上文實(shí)施例所述的規(guī)程。實(shí)施例22規(guī)禾口 i平·械iH寸白■賊_玉.綱原_絲基于同源性搜索，能鑒定驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的一個(gè)或若干個(gè)候選玉米同源 物(例如SEQ ID NO: 18和20)，并且還能評(píng)估它們?cè)黾佑衩椎拗茥l件耐受性的能力。載 體構(gòu)建、植物轉(zhuǎn)化和表型分析可類似于上文實(shí)施例所述的規(guī)程。實(shí)施例23臓H寸白■賊禾找百._浦體赫可將驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的大豆和玉米同源物在35S啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)化 到擬南芥中，并且當(dāng)在低氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)分析其葉片面積和綠色區(qū)積聚?？扇绫疚膶?shí)施 例所述進(jìn)行載體構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化。檢測(cè)分析的條件、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析可類似于上文實(shí) 施例所述的規(guī)程。
權(quán)利要求
在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ IDNO18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含(a)可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多 肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO 18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行 比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；或(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的完全互補(bǔ)序列；或( )源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)基于Clustal V 比對(duì)方法與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)，所述區(qū)域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2多肽，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出至少一 種農(nóng)學(xué)特性的改變。
4.權(quán)利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
5.權(quán)利要求3的植物，其中當(dāng)在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對(duì) 照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的所述改變。
6.權(quán)利要求5的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
7.權(quán)利要求3的植物，其中所述至少一種農(nóng)學(xué)特性選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物 量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含 氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含 量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織 蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏抗性、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高度和穗長(zhǎng)度。
8.權(quán)利要求7的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.權(quán)利要求3的植物，其中在與所述對(duì)照植物相比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出所述至少一 種農(nóng)學(xué)特性的增加。
10.權(quán)利要求9的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性；和(b)在步驟(a)之后從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物 進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
12.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增加的 氮脅迫耐受性。
13.評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮 脅迫耐受性。
14.權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮脅 迫耐受性。
15.評(píng)估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)的氮 脅迫耐受性。
16.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
17.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(e)測(cè)定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)是否表 現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述測(cè)定步驟(c)包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制 條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的 改變。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述測(cè)定步驟(e)包括測(cè)定所述子代植物在氮限制條 件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
20.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體弓I入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(d)測(cè)定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出 至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述測(cè)定步驟(d)包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制 條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的 改變。
22.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述調(diào) 控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或( )源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，在與所述區(qū)域所來(lái) 源的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在 其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn) 出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述測(cè)定步驟(c)包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制 條件下與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
24.權(quán)利要求22的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)測(cè)定所述子代植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)是否表 現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述測(cè)定步驟(e)包括測(cè)定所述子代植物在氮限制條 件下與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改 變。
26.測(cè)定植物中的農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該調(diào)控 元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的完全互補(bǔ)序列；或( )源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，在與所述區(qū)域所來(lái) 源的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)，基于Clustal V比對(duì)方法，所述區(qū)域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼LNT2多肽；(b)在步驟(a)之后從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn) 行比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)性狀的改變；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在基因組中包含該抑制DNA 構(gòu)建體；以及(d)測(cè)定該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少 一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述測(cè)定步驟(d)包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制 條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
28.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO :18、24、或26進(jìn)行比較時(shí)具有至少85%的序列同一性；或 ( )所述(i)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。
29.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì) 方法在與SEQ ID NO :18、24、或26進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%的序列同一性。
30.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì) 方法在與SEQ ID NO :18、24、或26進(jìn)行比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。
31.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其中所述多肽的序列包括SEQIDNO :18、24、或26。5
32.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其中所述核酸序列包括SEQ IDN0:17、23、或25。
全文摘要
尤其可用于在氮限制條件下改變植物農(nóng)學(xué)特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構(gòu)建體，包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接在植物中有功能的啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼LNT2多肽。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101918560SQ200880124194
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日
發(fā)明者D·盧塞爾特, H·薩凱, M·奧克曼, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·盧克 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司;先鋒國(guó)際良種公司