專利名稱：抗hiv單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有中和人免疫缺陷病毒(HIV)的活性的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome ;AIDS)是由名 為人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus ；HIV)的慢病毒的慢性感染引起的病 態(tài)。近年來，人們開發(fā)了抑制HIV增殖的抗病毒藥，可以阻止AIDS發(fā)病。但是，即使使用強(qiáng) 效的抗病毒藥，也難以驅(qū)逐HIV，抗病毒治療必須持續(xù)一生。另一方面，因長(zhǎng)期使用抗病毒藥 而出現(xiàn)的耐藥性病毒或慢性毒性等問題也已明確，目前的抗病毒療法依然處于不充分的狀 態(tài)。另外，抗病毒藥昂貴，在發(fā)展中國(guó)家實(shí)質(zhì)上不可能長(zhǎng)期使用。鑒于上述情況，開發(fā)阻止 感染的疫苗是世界性課題，而且人們還要求開發(fā)無副作用的新的治療藥。關(guān)于中和HIV感染的單克隆抗體，有人報(bào)道了各種抗體(Burton，DR.等人， Nat. Immunol. 5，第 233-236 頁，2004 ；Zolla-Pazner, S.等人，Nat. Rev. Immunol. 4，第 199-210 頁，2004 ;Eda，Y.等人，J. Virol. 80 :5552-5562, 2006) 這些靶分子大致分為 抗外被膜蛋白gpl20的V1/V2、V3等可變區(qū)的抗體；抗⑶4結(jié)合位點(diǎn)(⑶4bs)的抗體；抗 ⑶4i (⑶4-gpl20結(jié)合后出現(xiàn)的表位)的抗體。另一方面，有人還發(fā)表了與跨膜蛋白、gp41 ^ MPR(membrane proximal region，近膜區(qū))反應(yīng)的抗體的中和活性。其中，顯示交叉反應(yīng) 的抗體有V3抗體中的447-52D和KD-247 ；CD4bs抗體中的bl2 ；gp41_MPR抗體中的2F5和 4E10 ；作為抗糖鏈抗體的2G12。在V3抗體中雖然確認(rèn)到交叉反應(yīng)性，但能夠反應(yīng)的病毒株 受限，這是問題之所在。另一方面，gp41-MI^R抗體在多個(gè)臨床分離株中確認(rèn)到交叉反應(yīng)，因 此近年來受到關(guān)注，但最近發(fā)現(xiàn)它們與宿主細(xì)胞的淋巴脂質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)，實(shí)際上是自身 抗體與HIV的gp41進(jìn)行交叉反應(yīng)。此外，bl2的⑶3也長(zhǎng)達(dá)18個(gè)氨基酸，暗示其與自身抗 原的交叉反應(yīng)性(Haynes，BF 等人，kience 308，第 1906-1908 頁，2005)。非專利文獻(xiàn)1 =Burton, DR.等人，Nat. Immunol. 5，第 233-236 頁，2004非專利文獻(xiàn)2 =Zolla-Pazner, S.等人，Nat. Rev. Immunol. 4，第 199-210 頁，2004非專利文獻(xiàn)3 :Eda, Y.等人，J. Virol. 80 :5552-5562, 2006非專利文獻(xiàn)4 =Haynes, BF 等人，Science 308，第 1906-1908 頁，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明應(yīng)解決的課題在于提供對(duì)廣范圍的HIV株具有中和活性的單克隆抗體。解決課題的方法尚未開發(fā)出阻止HIV感染的疫苗的原因之一在于尚未明確有效的中和抗體。另 一方面，在雖然感染HIV但長(zhǎng)期未見進(jìn)展的長(zhǎng)期非進(jìn)展病例中，存在對(duì)廣范圍的病毒株顯 示出中和活性、控制病毒增殖的病例。本發(fā)明人等為了研究在感染HIV但長(zhǎng)期未見進(jìn)展的 長(zhǎng)期非進(jìn)展病例中是哪一種中和抗體在起作用，將末消血的B細(xì)胞用EB病毒進(jìn)行無限增殖，通過克隆制成單克隆抗體產(chǎn)生株。根據(jù)對(duì)所得單克隆抗體的性質(zhì)進(jìn)行研究，不僅可以明 確該單克隆抗體在長(zhǎng)期非進(jìn)展病例中的有效的抗病毒反應(yīng)，還可以將其用于開發(fā)疫苗或新 的治療藥。即，根據(jù)本發(fā)明，提供以下發(fā)明。(1)單克隆抗體，其是選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20 的V3環(huán)的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :4記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。(2)單克隆抗體，其是選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20 的CD4結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :8記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO: 10記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。(3)單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體是具有保藏號(hào)FERMBP-11021或保藏號(hào) FERM BP-11060的細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環(huán)的單克隆抗體。(4)單克隆抗體，該單克隆抗體是具有保藏號(hào)FERM BP-11020、保藏號(hào)FERM BP-11022或保藏號(hào)FERM BP-11023的細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的CD4 結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體。(5) (1) 中任一項(xiàng)所述的抗體，該抗體是由下述細(xì)胞產(chǎn)生的所述細(xì)胞由根 據(jù)與gpl20的結(jié)合性篩選長(zhǎng)期非進(jìn)展病例的HIV感染患者的B細(xì)胞，并選擇產(chǎn)生gpl20結(jié) 合抗體的B細(xì)胞而來。(6) (1) (5)中任一項(xiàng)所述的抗體的制造方法，該方法包括以下步驟根據(jù)與 gpl20的結(jié)合性篩選長(zhǎng)期非進(jìn)展病例的HIV感染患者的B細(xì)胞，并選擇產(chǎn)生gpl20結(jié)合抗體 的B細(xì)胞，之后采集所選擇的B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。(7)細(xì)胞，其是具有保藏號(hào)FERM BP-11021或保藏號(hào)FERMBP-11060的產(chǎn)生(1)所 述的抗體的細(xì)胞。(8)細(xì)胞，其是具有保藏號(hào)FERM BP-11020、保藏號(hào)FERMBP-11022或保藏號(hào)FERM BP-11023的產(chǎn)生⑵所述的抗體的細(xì)胞。(9) HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥，其中含有(1) (5)所述的至少一種以上的 單克隆抗體。(IO)HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥，其中含有⑴或(3)所述的單克隆抗體與 (2)或(4)所述的單克隆抗體的組合。發(fā)明效果本發(fā)明的單克隆抗體可用作AIDS/HIV-1感染癥的預(yù)防、治療藥。此外，本發(fā)明的單克隆抗體還可用作開發(fā)中和抗體誘導(dǎo)型HIV疫苗的研究試劑。


圖1顯示通過gpl20_捕捉ELISA進(jìn)行的單克隆抗體的反應(yīng)性的分析。圖2顯示與HIV-IJR-FL慢性感染細(xì)胞(PM1/JR-FL)表面的結(jié)合活性的FACS分析。圖3顯示中和單克隆抗體對(duì)4種包膜假病毒的交叉中和活性。圖4顯示0. 5d(3D6)顯著增強(qiáng)V3抗體與gpl20的反應(yīng)性。圖5顯示0. 5g (1C10)與0. 5d(3D6)的組合對(duì)抑制HIV-1JR-FL的協(xié)同效果。圖6顯示本發(fā)明的單克隆抗體0.5Y (1C10)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列和預(yù)測(cè) 的氨基酸序列。圖7顯示本發(fā)明的單克隆抗體5G2的抗原結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸 序列。圖8顯示本發(fā)明的單克隆抗體0. 5 δ (3D6)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列和預(yù)測(cè) 的氨基酸序列。圖9顯示本發(fā)明的單克隆抗體42F9的抗原結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基 酸序列。圖10顯示本發(fā)明的單克隆抗體49G2的抗原結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基 酸序列。圖11顯示本發(fā)明的抗體對(duì)各種病毒株的中和活性。圖12顯示CCR5抑制劑與本發(fā)明的抗體結(jié)合使用時(shí)的協(xié)同抑制效果。
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式和實(shí)施方法進(jìn)行說明。1.本發(fā)明的單克隆抗體本發(fā)明的單克隆抗體的第一例為選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜 糖蛋白gpl20的V3環(huán)的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO=I記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :4記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。上述抗體的具體例子有具有保藏號(hào)FERM BP-11021或保藏號(hào)FERM BP-11060的 細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環(huán)的單克隆抗體或其片段。本發(fā)明的單克隆抗體的第二例為選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜 糖蛋白gpl20的CD4結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :8記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 10記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。上述抗體的具體例子有具有保藏號(hào)FERM BP-11020、保藏號(hào)FERM BP-11022或保 藏號(hào)FERM BP-11023的細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的⑶4結(jié)合位點(diǎn)的 單克隆抗體。本說明書的實(shí)施例中記載的產(chǎn)生單克隆抗體3D6(0. 5 δ )、5G2、42F9和49G2的細(xì) 胞分別以保藏號(hào)FERM BP-11020、保藏號(hào)FERMBP-11021、保藏號(hào)FERM BP-11022和保藏號(hào) FERM BP-11023于2008年(平成20年)9月17日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究 所專利生物寄托中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)，本說明書的實(shí) 施例中記載的產(chǎn)生單克隆抗體IClO (0. 5 γ)的細(xì)胞以保藏號(hào)FERM BP-11060 (認(rèn)收號(hào)FERM ABP-11060)于2008年(平成20年)11月7日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專 利生物寄托中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)。在本說明書中，當(dāng)談及抗體時(shí)，以不僅包含全長(zhǎng)抗體還包含抗體片段的含義使用。 抗體片段優(yōu)選為功能性的片段，例如F(ab，)2、Fab，等。F(ab' )2、Fab，是指用蛋白分解酶 (例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)處理免疫球蛋白而制得的、在存在于鉸鏈區(qū)中的2條H鏈 間的二硫鍵的前后消化而生成的抗體片段。并且，當(dāng)談及抗體片段時(shí)，還包含含有來自編碼 該抗體的基因的抗原結(jié)合位點(diǎn)的蛋白。例如，用木瓜蛋白酶處理IgGl時(shí)，在存在于鉸鏈區(qū)中的2條H鏈間的二硫鍵的上 游將其切斷，可以制造由VL(L鏈可變區(qū))和CL(L鏈恒定區(qū))形成的L鏈、以及由VH(H鏈 可變區(qū))和CHY1(H鏈恒定區(qū)中的Yl區(qū))形成的H鏈片段在C末端區(qū)通過二硫鍵結(jié)合的 相同的兩個(gè)抗體片段。這兩個(gè)相同的抗體片段分別稱作Fab’。另外，用胃蛋白酶處理IgG 時(shí)，在存在于鉸鏈區(qū)中的2條H鏈間的二硫鍵的下游將其切斷，可以制造比上述兩個(gè)Fab’ 通過鉸鏈區(qū)連接而成的片段稍大的抗體片段。該抗體片段稱作F(ab’)2。本發(fā)明的單克隆抗體，可以以固定在固相載體等不溶性載體上的固定化抗體的形 式使用、或者以用標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記抗體的形式使用。這樣的固定化抗體或標(biāo)記抗體均包 括在本發(fā)明范圍內(nèi)。固定化抗體是指處于通過物理吸附或化學(xué)結(jié)合等擔(dān)載在不溶性載體上的狀態(tài)的 抗體。這些固定化抗體可用于檢測(cè)、定量、分離或純化試樣(例如血漿等體液試樣、培養(yǎng)上 清或離心上清等)中所含的抗原。作為可用于固定抗體的不溶性載體，例如有(1)由包 含聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、硅酮樹脂或尼龍樹脂等的塑料或玻璃等所代表的不溶于 水的物質(zhì)形成的板、試管或管等具有內(nèi)容積的載體、珠粒、球、濾紙或膜等；以及( 纖維素 系載體、瓊脂糖系載體、聚丙烯酰胺系載體、葡聚糖系載體、聚苯乙烯系載體、聚乙烯醇系載 體、聚氨基酸系載體或多孔性二氧化硅系載體等用于親和層析的不溶性載體。標(biāo)記抗體是指用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體，這些標(biāo)記抗體可用于檢測(cè)或定量試樣(例如 血漿等體液試樣、培養(yǎng)上清或離心上清等)中所含的抗原。對(duì)本發(fā)明中可以使用的標(biāo)記物 沒有特別限定，只要是通過物理結(jié)合或化學(xué)結(jié)合等與抗體結(jié)合，從而可以檢測(cè)它們的存在 的標(biāo)記物即可。標(biāo)記物的具體例子有酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素、抗生物素蛋白 或放射性同位素等，更具體有過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、 葡糖-6-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、青霉素酶、過氧化氫酶、脫輔基葡糖氧化 酶、脲酶、螢光素酶或乙酰膽堿酯酶等酶；異硫氰酸熒光素、藻膽蛋白、稀土金屬螯合物、丹磺酰氯或四甲基異硫氰酸羅達(dá)明等熒光物質(zhì)；3H、14C、125I或131I等放射性同位素；生物素、 抗生物素蛋白或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。標(biāo)記物與抗體的結(jié)合方法可以采用戊二醛法、馬來酰亞胺 法、吡啶二硫化物法或過碘酸法等公知的方法。其中，放射性同位素和熒光物質(zhì)可以單獨(dú)產(chǎn)生能夠檢測(cè)的信號(hào)，而酶、化學(xué)發(fā)光物 質(zhì)、生物素和抗生物素蛋白則無法單獨(dú)產(chǎn)生能夠檢測(cè)的信號(hào)，所以通過進(jìn)一步與1種以上 的其他物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生能夠檢測(cè)的信號(hào)。例如，當(dāng)為酶時(shí)，至少需要底物，根據(jù)測(cè)定酶活性 的方法(比色法、熒光法、生物發(fā)光法或化學(xué)發(fā)光法等)而使用各種底物。當(dāng)為生物素時(shí)， 通常至少與抗生物素蛋白或酶修飾抗生物素蛋白反應(yīng)。根據(jù)需要，進(jìn)一步使用依賴于該底 物的各種顯色物質(zhì)。2.產(chǎn)牛本發(fā)明的單克降抗體的細(xì)胞本發(fā)明還涉及產(chǎn)生上述本發(fā)明的單克隆抗體的細(xì)胞。本發(fā)明的單克隆抗體可以使 用該細(xì)胞來制造。以下，說明產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的細(xì)胞的取得方法。利用通常的比重離心法等，從HIV患者的末梢血液中回收含有B淋巴細(xì)胞的淋巴 細(xì)胞，之后利用EBV進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以從該淋巴細(xì)胞中得到安定地產(chǎn)生抗體、且持續(xù)進(jìn)行無限增 殖的細(xì)胞株。EBV是使人正常B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成增殖型細(xì)胞株的病毒(Nature，第269卷，第 410頁(1973))。作為含有EBV的材料，可以使用狨細(xì)胞B95-8株(Proc. Natl. Acad. Sci., USA，第87卷，第3333 3337頁(1990))。首先，從對(duì)廣泛的HIV株具有中和活性的長(zhǎng)期 非進(jìn)展病例患者中采集末梢血到含有肝素的采血管內(nèi)，利用比重離心法等采集末梢血單核 細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)部分。利用 Dynabeads、免疫磁體(4 Λ 7 y才、y卜)從所得的PBMC中除去⑶8陽性細(xì)胞。將⑶8-缺失的PBMC懸浮于含有 50% EB病毒產(chǎn)生株B95-8 (ATCC)的培養(yǎng)上清的培養(yǎng)基(15%胎牛血清；含F(xiàn)CS的RPMI1640) 中，移至24孔培養(yǎng)皿(Linbro, ICN)中，在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 18小時(shí) 左右。在此期間，用EB病毒感染末梢血中的B細(xì)胞，可以以該IO4個(gè)細(xì)胞中得到1株的比 例得到無限增殖細(xì)胞?；厥赵鲋车募?xì)胞的培養(yǎng)上清，通過gpl20-捕捉試驗(yàn)進(jìn)行篩選，對(duì)于 通過反復(fù)篩選判斷為陽性的克隆，以對(duì)正常人的PBMC照射X射線而得到的細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì) 胞，利用極限稀釋法進(jìn)行克隆，可以分離具有抗gpl20活性的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。根據(jù)需要，重 復(fù)進(jìn)行篩選的程序。通過培養(yǎng)上述得到的EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，可以產(chǎn)生本發(fā)明的目標(biāo)單克隆抗體。培養(yǎng) 液中的抗體的純化，例如根據(jù)需要，可以通過適當(dāng)組合DEAE陰離子交換層析、親和層析、硫 酸銨分餾法、PEG分餾法、乙醇分餾法等公知的方法來進(jìn)行。3.本發(fā)明抗體的基因編碼本發(fā)明抗體的基因可如下獲得使用來源于產(chǎn)生上述本發(fā)明的單克隆抗體的 EBV轉(zhuǎn)化人細(xì)胞的mRNA制作cDNA文庫，從中分離含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的cDNA的質(zhì) 粒，即可獲得基因。mRNA可以通過培養(yǎng)EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞，之后用異硫氰酸胍溶液溶解細(xì)胞后進(jìn) 行提取來制備。以所得的mRNA為模板制作cDNA，將其整合到載體中，由此制作cDNA文庫。 使用該cDNA文庫，可以獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體的基因。此外，關(guān)于本發(fā)明抗體的基因，它們的核苷酸序列和氨基酸序列均通過以下實(shí)施 例而明確，所以還可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基因化學(xué)合成法來制造。例如，對(duì)于分 別含有編碼SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄幸约芭c其互補(bǔ)的核苷酸序列的基因，將它們的基因分成若干個(gè)寡核苷酸后進(jìn)行化學(xué)合成，再將每個(gè) 嵌段依次適當(dāng)連接，即可制作。將編碼本發(fā)明的單克隆抗體的基因插入表達(dá)載體中，可以構(gòu)建重組表達(dá)載體。表 達(dá)載體通常在翻譯起始密碼子(ATG)的上游具有啟動(dòng)子區(qū)，在翻譯終止密碼子(TAA、TGA或 TAG)的下游具有polyA信號(hào)區(qū)?？梢酝ㄟ^公知方法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)該 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從而可以使本發(fā)明的單克隆抗體表達(dá)。作為宿主細(xì)胞，可以使用大腸桿菌、 酵母或動(dòng)物細(xì)胞等。通過培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。4.使用本發(fā)明的單克降抗體的藥物本發(fā)明的單克隆抗體以及根據(jù)需要使用藥學(xué)上可接受的適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑、稀 釋劑等，可以用作HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥。作為HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥， 例如可以制成注射劑。HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥的給藥量取決于患者的癥狀程度、年 齡和體重、給藥方法等，以作為有效成分的抗體的重量計(jì)算，通常為約IOng 約100mg/kg 體重的范圍。5. #用本發(fā)明的單克降杭體的HIV病毒的表擬的檢測(cè)丨 本發(fā)明中，通過使用本發(fā)明的單克隆抗體或其片段進(jìn)行免疫測(cè)定，還可以檢測(cè)HIV 病毒。該方法優(yōu)選至少包括下述步驟(a)和(b)。(a)使本發(fā)明的單克隆抗體或其片段與試樣反應(yīng)的步驟；以及(b)使步驟(a)中形成的抗原抗體復(fù)合物與用于檢測(cè)的標(biāo)記抗體反應(yīng)的步驟；本發(fā)明的檢測(cè)和/或定量方法只要是使用抗體進(jìn)行的測(cè)定、即免疫測(cè)定即可，可 以是任一種方法，例如酶免疫測(cè)定法(ELISA)、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法(RIA)、發(fā) 光免疫測(cè)定法、酶抗體法、熒光抗體法、免疫比濁法、膠乳凝集反應(yīng)、膠乳比濁法、紅細(xì)胞凝 集反應(yīng)、顆粒凝集反應(yīng)或蛋白質(zhì)印跡法等。當(dāng)利用酶免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法或發(fā)光免疫測(cè)定法等使 用標(biāo)記抗體的免疫測(cè)定法來實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)，還可以通過夾層法或競(jìng)爭(zhēng)法來進(jìn) 行，采用夾層法時(shí)，只要固化抗體和標(biāo)記抗體中的至少一種是本發(fā)明的單克隆抗體即可。使抗體致敏固相載體后再使用時(shí)，作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、苯乙 烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯類聚合物、膠乳、明膠、脂質(zhì)體、微囊、紅細(xì)胞、二氧化 硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷或磁性體等材質(zhì)制成的顆粒。作為該致敏方法，可以采用物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或?qū)⑦@些方法結(jié)合使用等公 知的方法。測(cè)定的操作方法可以利用公知的方法來進(jìn)行，例如，利用光學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)， 使試樣與抗體、或者使試樣與致敏固相載體的抗體反應(yīng)，利用終點(diǎn)法或速率法測(cè)定透過光 或散射光。目視測(cè)定時(shí)，使試樣與致敏固相載體的抗體在板或微量滴定板等容器中反應(yīng)，目 視判定凝集狀態(tài)。需要說明的是，也可以使用酶標(biāo)儀(microplate reader)等儀器進(jìn)行測(cè) 定，以代替目視測(cè)定。利用以下實(shí)施例來進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受實(shí)施例的限定。 實(shí)施例實(shí)施例1 中和單克隆抗體的制作
使EB病毒感染末梢血B細(xì)胞，并反復(fù)進(jìn)行克隆，分離具抗gpl20活性的抗體產(chǎn)生 細(xì)胞。制作方法基本上采用我們以前對(duì)人T細(xì)胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1 ；HTLV-1)感染病例進(jìn)行的方法(Matsushita S.等人，Proc. Natl. Acad, ki. (USA)83 :3672-3676,1986)。從對(duì)廣泛的病毒株具有中和活性的一例長(zhǎng)期非進(jìn)展病例采集 末梢血到含有肝素的采血管內(nèi)(20 30ml)，利用FicolI-Hypaque的比重離心法采集末梢 血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)部分。利用 Dynabeads、免疫磁 體從所得的PBMC中除去CD8陽性細(xì)胞。具體如下將PBMC和DynabeadsCD8在4°C下培養(yǎng) 1小時(shí)，利用磁性器具除去磁性珠粒，得到除去了⑶8的PBMC(⑶8-缺失的PBMC)。將1 IOXlO6個(gè)⑶8-缺失的PBMC，懸浮于2 5ml含有50% EB病毒產(chǎn)生株B95-8 (ATCC)的培 養(yǎng)上清的培養(yǎng)基(15%胎牛血清；含F(xiàn)CS的RPMI1640)中，之后移入M孔培養(yǎng)皿(Linbro， ICN)中，在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 18小時(shí)。在此期間，使EB病毒感染末梢 血中的B細(xì)胞，考慮可以以該IO4個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生1株的比例得到無限增殖細(xì)胞。收集培養(yǎng)的 細(xì)胞，離心，舍棄舊培養(yǎng)基，分注到96孔平底培養(yǎng)板(Falcon)中，使新培養(yǎng)基中CD8-缺失 的PBMC的密度達(dá)到IX IO4個(gè)/孔以下，進(jìn)一步在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 10天， 其間每天將一半培養(yǎng)基換成新的培養(yǎng)基，同時(shí)等待B細(xì)胞株的增殖。將已增殖的細(xì)胞在48 孔或M孔培養(yǎng)皿(Linbro，ICN)中擴(kuò)增(Expand)，回收進(jìn)行增殖的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，通過 后述的“gpl20-捕捉試驗(yàn)”進(jìn)行篩選。對(duì)于通過反復(fù)篩選判斷為陽性的克隆，以對(duì)正常人的 PBMC照射了 X射線而得到的細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，利用極限稀釋法進(jìn)行克隆，分離具抗gpl20 活性的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。根據(jù)需要，重復(fù)克隆的程序。實(shí)施例2 :gpl20-捕捉 ELISA在具抗gp 120活性的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的篩選中，使用“ gp 120-捕捉ELISA ”(J. P. Moore等人，J. Virol. 67，第6136-6151頁，1993)。即，在實(shí)驗(yàn)前1天向96孔聚丙烯板 (Falcon)中加入50 μ 1用CC緩沖液(碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，ρΗ9. 6)調(diào)整至13. 3 μ g/ ml 的抗 gpl20-C5 綿羊抗體(D73M，Aalto Bioreagents, Dublin, Ireland)，在 4°C下靜置 一夜。除去上清后，加入175 μ 1封閉緩沖液牛血清白蛋白；BSA、0. 疊氮化物、PBS、 ρΗ7· 2)，在室溫下靜置30分鐘。用ELISA清洗緩沖液(0. 15% Tween20, PBS ρΗ7· 2)清洗 孑L 3 次，之后每孑L中力口人 50 μ 1 單體 gpl20(gpl20_SF2 ；Austral Biologicals^San Ramon, California)。在室溫下靜置2小時(shí)，之后用ELISA清洗緩沖液清洗3次，制成“gpl20_捕 捉板”。向該板中加入B細(xì)胞培養(yǎng)上清，使之在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用ELISA清洗緩沖液清 洗3次，加入100 μ 1用ELISA緩沖液稀釋了 1000倍的抗人IgG-ALP，在室溫下靜置1小時(shí)。 用ELISA清洗緩沖液清洗3次，之后將磷酸酶底物(SIGMA)溶于底物緩沖液(二乙醇胺緩 沖液pH9. 85)中，向每孔中分別加入100 μ 1，在室溫下靜置10 30分鐘，之后用酶標(biāo)儀測(cè) 定吸光度G05nm)。如此操作，得到20種產(chǎn)生gpl20結(jié)合抗體的B細(xì)胞克隆(表1)。[表 1]由長(zhǎng)期“非進(jìn)展HIV-I感染病例”得到的中和單克隆抗體的列表
權(quán)利要求
1.單克隆抗體，其為選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3 環(huán)的單克隆抗體，(a)抗體，該抗體具有SEQID NO :1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 4記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列。
2.單克隆抗體，其為選自以下任一種抗體的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的CD4 結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體，(a)抗體，該抗體具有SEQID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 6記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 8記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQID NO :9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 10記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列。
3.單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體是具有保藏號(hào)FERMBP-11021或保藏號(hào)FERM BP-11060的細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環(huán)的單克隆抗體。
4.單克隆抗體，該單克隆抗體是具有保藏號(hào)FERMBP-11020、保藏號(hào)FERM BP-11022或 保藏號(hào)FERM BP-11023的細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的⑶4結(jié)合位點(diǎn) 的單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的抗體，該抗體是由下述細(xì)胞產(chǎn)生的所述細(xì)胞由根 據(jù)與gpl20的結(jié)合性篩選長(zhǎng)期非進(jìn)展病例的HIV感染患者的B細(xì)胞，并選擇產(chǎn)生gpl20結(jié) 合抗體的B細(xì)胞而來。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抗體的制造方法，該方法包括以下步驟根據(jù)與 gpl20的結(jié)合性篩選長(zhǎng)期非進(jìn)展病例的HIV感染患者的B細(xì)胞，并選擇產(chǎn)生gpl20結(jié)合抗體 的B細(xì)胞，之后采集所選擇的B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
7.細(xì)胞，其是具有保藏號(hào)FERMBP-11021或保藏號(hào)FERMBP-11060的產(chǎn)生權(quán)利要求1所 述的抗體的細(xì)胞。
8.細(xì)胞，其是具有保藏號(hào)FERMBP-11020、保藏號(hào)FERMBP-11022或保藏號(hào)FERM BP-11023的產(chǎn)生權(quán)利要求2所述的抗體的細(xì)胞。
9.HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥，其中含有權(quán)利要求1 5所述的至少一種以上的單 克隆抗體。
10.HIV感染癥的預(yù)防和/或治療藥，其中含有權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體與權(quán) 利要求2或4所述的單克隆抗體的組合。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，提供選自以下任一種抗體的、識(shí)別AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3環(huán)的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ IDNO1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO2記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO4記載的氨基酸序列作為L(zhǎng)鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。
文檔編號(hào)C12P21/08GK102066418SQ200880125590
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者吉村和久, 松下修三 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人熊本大學(xué)