專利名稱：使用合成的聚合物遞送對基因沉默有活性的核酸的工具的制作方法
使用合成的聚合物遞送對基因沉默有活性的核酸的工具本發(fā)明涉及在細(xì)胞中介導(dǎo)基因沉默的核酸、特別是提供RNA干擾(RNAi)的小干擾 RNA(在后面的說明書和權(quán)利要求書中被稱為siRNA)、以及任選質(zhì)粒DNA的有效的合成的聚 合物介導(dǎo)的體內(nèi)或離體遞送至培養(yǎng)中的真核細(xì)胞的工具、組合物和方法。RNA干擾(RNAi)是一種用于在早期基因功能水平基因沉默mRNA的技術(shù)(Fire et al，1998)。其原理是短RNA雙鏈體(siRNA ；小干擾RNA)極端選擇性干擾mRNA中的一個(gè)靶， 使提供序列特異性的mRNA降解從而抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)生。RNAi的高效緣于對siRNA有活性的序列的可預(yù)測設(shè)計(jì)以及對mRNA的靶向性。在 許多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，包括細(xì)胞系(Elbashir et al,2001)及原代細(xì)胞中，當(dāng)siRNA雙鏈 體通過載體、轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染被導(dǎo)入，且被遞送到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，RNAi就已經(jīng)顯示出有效的內(nèi)源性 及外源性基因沉默。RNAi對于人治療是很強(qiáng)大的工具，它將引人注目地帶來嚴(yán)重疾病(如癌癥或病毒 感染)的新治療方法上的進(jìn)展。對于開發(fā)RNAi的巨大潛能，需要RNAi轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建和 開發(fā)用于有效地將其遞送到患病有機(jī)體的細(xì)胞和組織中的策略。RNAi的成功取決于siRNA(設(shè)計(jì)和化學(xué)作用)和用于細(xì)胞遞送的載體/載質(zhì)。相 比反義或核酶技術(shù)，靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)(也許不是)對使用siRNA進(jìn)行沉默并不是強(qiáng)限制 因素。多個(gè)siRNA序列可能對一個(gè)靶向mRNA有效。siRNA雙鏈體的穩(wěn)定性和遞送到細(xì)胞 的siRNA的量是對沉默最大的限制因素，而非所選序列的靶向接近性。有兩個(gè)方法被提供 用來將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞用合成的siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中來遞送；以及由質(zhì) 粒(或DNA盒)原位表達(dá)通過基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核而初步導(dǎo)入的siRNA的遞送。RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中依賴于以下二者的有效的細(xì)胞內(nèi)遞送siRNA或者表達(dá) si/shRNA 或適合于微 RNA 的短發(fā)夾 RNA(shRNAmir)的 DNA 載體(Sui et al.，2002 ；Yu et al.,2002 ；Miyagishi&Taira,2002 ；Silva et al. ,2005 ；Brummelkamp et al. ,2002) ShRNA(短發(fā)夾RNA)或siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可經(jīng)由Pol II或Pol III⑴6或Hl) 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)。DNA載體基于表達(dá)雙鏈短發(fā)夾RNA(shRNA)的質(zhì)粒和病毒載體系統(tǒng)，所 述shRNA隨后被細(xì)胞器加工為siRNA。ShRNA系統(tǒng)的新進(jìn)展允許了組織特異性且可誘導(dǎo)的 基因敲除。這種表達(dá)對RNA干擾有活性的RNA的DNA載體的細(xì)胞內(nèi)遞送可使用重組病毒或 非病毒遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。說到基因?qū)爰夹g(shù)，有效的病毒或非病毒載體對細(xì)胞中SiRNA雙鏈體的導(dǎo)入是有 用的。對培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說，因?yàn)椴《据d體的轉(zhuǎn)染效率和易于將DNA遞送入細(xì)胞 核，其表現(xiàn)為對由遞送的質(zhì)粒DNA表達(dá)的siRNA的細(xì)胞內(nèi)庫的產(chǎn)生的有力手段。但是，重組 病毒遞送系統(tǒng)仍然遭受來自它們臨床表現(xiàn)中的免疫原性和潛在風(fēng)險(xiǎn)。相反，用合成系統(tǒng)的 核酸(質(zhì)?；蚝铣傻膕iRNA)轉(zhuǎn)染則是顯示了靈活性和不出現(xiàn)免疫原性的多用途方法。用非 病毒載體轉(zhuǎn)染合成的siRNA雙鏈體(化學(xué)法產(chǎn)生的或酶法產(chǎn)生的)是主要將短雙鏈RNA遞 送入細(xì)胞質(zhì)的最好技術(shù)。對siRNA遞送最有效的非病毒載體基于陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染， 它最初來自基因遞送領(lǐng)域或最近開發(fā)用于特異性RNAi應(yīng)用。陽離子脂質(zhì)制劑將核酸(質(zhì) 粒、寡核苷酸類、siRNA雙鏈體)包裝入帶正電的顆粒中，所述顆粒能在細(xì)胞表面與陰離子
4蛋白聚糖類相互作用，并由胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在運(yùn)送到胞吞胞內(nèi)囊泡(主要是胞內(nèi)體) 后，陽離子脂質(zhì)具有通過脂質(zhì)交換/擴(kuò)散使這些胞內(nèi)小室的膜去穩(wěn)定的特性，從而導(dǎo)致核 酸“去復(fù)合”并釋放到細(xì)胞質(zhì)(Xu and Szoka, 1996) 0另外，被稱為質(zhì)子海綿活性的第二機(jī) 制可與一些脂質(zhì)誘導(dǎo)胞內(nèi)體膨脹和破裂(其將核酸釋放到細(xì)胞質(zhì)中)相關(guān)。由于RNAi機(jī) 制出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，基于陽離子脂質(zhì)制劑的載體是將合成的SiRNA雙鏈體遞送到細(xì)胞中的 有效媒質(zhì)。由質(zhì)粒、非病毒載體原位表達(dá)的siRNA，基于陽離子脂質(zhì)制劑或陽離子聚合物，使 胞內(nèi)體小室去穩(wěn)定是適宜的。與它們能夠有效地將基因(長的雙鏈DNA)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)相反，陽離子聚合物對遞 送短的核酸缺乏效率。陽離子聚合物顯示出比基于陽離子脂質(zhì)的系統(tǒng)缺少遞送siRNA的效 率。陽離子聚合物能夠體外介導(dǎo)siRNA濃度約100 200nM的RNA干擾。這種濃度下RNA 干擾的選擇性是它們使用上的限制。此外，所用siRNA的高量與誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)的聚合 物高量相關(guān)聯(lián)。迄今為止，體外使用了陽離子聚合物(如分枝的或線性的聚乙烯亞胺、聚組 氨酰聚合物、殼聚糖、聚(氨基酯乙二醇氨基甲酸乙酯)、氨基環(huán)糊精衍生物)，但未與陽離 子脂質(zhì)比較相關(guān)效率。本發(fā)明的目的是提高陽離子聚合物、此非病毒性遞送載體的主要種類對體外 siRNA轉(zhuǎn)染的能力。陽離子聚合物能夠經(jīng)siRNA的磷酸與聚合物的氨基間的靜電相互作用 而相互作用。但依照siRNA的結(jié)構(gòu)，聚合物不能縮合包含僅兩個(gè)圈(每鏈約20個(gè)核苷酸) 的如此小的雙螺旋。甚至復(fù)合物出現(xiàn)在siRNA和陽離子聚合物之間，導(dǎo)致siRNA附著在聚 胺主干上，陽離子聚合物缺乏協(xié)同相互作用來引發(fā)縮合入復(fù)合分子的顆?；蛭?聚集物。除聚胺和小雙鏈寡核苷酸攜帶的正負(fù)電荷間的靜電相互作用之外，與核酸堿基的 疏水堆積和氫鍵形成相互作用是我們旨在增大聚胺和SiRNA之間相互作用的方法?？傊?靜電和疏水相互作用以及氫鍵提供足夠能量導(dǎo)致siRNA的穩(wěn)定復(fù)合和縮合作用。芳香族氨基酸(AAA)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的疏水特性并且還與蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)-配 體間經(jīng)由疏水相互作用的相互作用有關(guān)。AAA還能夠與核酸通過與核酸堿基(鳥嘌呤，腺嘌 呤，胸腺嘧啶或胞嘧啶)堆積來相互作用。本發(fā)明涉及疏水性聚胺的新概念，所述疏水性聚胺包含被芳香族氨基酸高度修飾 的聚胺主干。此類聚合物提供了與小核酸(如siRNA)經(jīng)由靜電作用、疏水性堆積以及氫鍵 而相互作用的可能性。作為待克服能量壁壘，通過將AAA化學(xué)連接到聚胺的增加將能夠提 供足夠的能量去誘導(dǎo)以縮合結(jié)束的協(xié)同相互作用。結(jié)果是由疏水相互作用產(chǎn)生的復(fù)合物的 穩(wěn)定化(以穩(wěn)定顆?；蚓奂镄问?。本發(fā)明描述了新類的非病毒轉(zhuǎn)染劑，其屬于陽離子聚合物類，尤其適合應(yīng)用于小 尺寸寡核苷酸的轉(zhuǎn)染。特別是小核苷酸的物理性質(zhì)提示了本發(fā)明人去設(shè)計(jì)基于疏水性和陽 離子聚合物的新類轉(zhuǎn)染劑。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，高效的轉(zhuǎn)染劑可通過組合目的寡核苷酸與疏水性及陽離子聚合 物形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物來獲得。有益的是、所述制劑也可用于siRNA與質(zhì)粒DNA的共轉(zhuǎn)染，其可促進(jìn)介導(dǎo)RNA干擾 的小RNA的原位表達(dá)。本發(fā)明還旨在提供用作用于siRNA和表達(dá)對RNAi有活性的RNA的任選DNA載體 的轉(zhuǎn)染劑的新組合物。
本發(fā)明還涉及體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。用作轉(zhuǎn)染劑的本發(fā)明的組合物含經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺和小的雙鏈或單鏈 RNA。有益的是、聚胺包括分枝或線性的聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、樹狀聚體、聚氨酯、聚賴 氨酸、聚組氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸或殼聚糖。所述聚胺更尤其選自線性的聚乙烯亞胺(LPEI)、聚烯丙胺(PAA)和聚賴氨酸 (PLL)。所述聚胺的分子量優(yōu)選400Da以上。有用的聚胺選自線性的2KD 220KD的聚乙烯亞胺、IOKD 70KD的聚烯丙胺和 IKD 300KD的聚賴氨酸。所述用于修飾聚胺的芳香族氨基酸選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸或它們的衍 生物。所述芳香族氨基酸優(yōu)選色氨酸和/或酪氨酸。在以上定義的組合物中，所述RNA是普通或經(jīng)修飾的RNA，修飾基團(tuán)為例如2’_氟 基、2’ -甲氧基、硫代磷酸基、LNA或嗎啉基。上述定義的RNA是雙鏈或單鏈反義siRNA，或者單鏈正義/反義siRNA的混合物。有益的是、所述siRNA是15 30聚體。優(yōu)選的組合物含有如上定義的經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺和等滲介質(zhì)(如NaCl、 葡萄糖、緩沖液)中的雙鏈或單鏈siRNA。所述siRNA的濃度可為pmol量級到μ mol量級。有益的是、上述定義的組合物含一種或數(shù)種添加劑，所述添加劑為例如PEG、PVA、
糖、聚糖、肽、蛋白質(zhì)、維生素。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，上述定義的組合物還含質(zhì)粒DNA、其表達(dá)對RNAi有活性 的RNA或編碼轉(zhuǎn)基因。所述質(zhì)粒尤其表達(dá)siRNA、shRNA或適于微RNA的短發(fā)卡RNA。所述siRNA可分別含經(jīng)合適的基團(tuán)穩(wěn)定化而抵抗降解的基團(tuán)，其選自被經(jīng)修飾的 類似物(例如脫氧核苷酸)和/或經(jīng)修飾的核苷酸類似物(如糖基或主干經(jīng)修飾的核糖 核苷酸或脫氧核糖核苷酸)取代的嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸。所述寡核苷酸序列可包含脫 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物(Verma and Eckstein，1998)，核苷酸類似物有 例如甲基磷酸基、嗎啉基磷二酰胺(phosphorodiamidate)、硫代磷酸基、PNA、LNA,2'烷 基-核苷酸類似物。本發(fā)明還旨在提供合成所述組合物的方法。所述合成上述定義的組合物的經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺的方法包括在聚胺存 在的情況下使用經(jīng)二甲氧基三嗪-N-甲基嗎啉(DMTMM)活化的芳香族氨基酸超酯。聚胺合成在堿性緩沖液中進(jìn)行，如200mM、pH = 7. 5 9的硼酸鹽緩沖液或者在堿 或水/乙醇混合物的存在下在水介質(zhì)中進(jìn)行，是有利的。所述組合物中聚胺被芳香族氨基酸修飾的百分比更尤其為0. 01% 100%，尤其 是 15% 50%。本發(fā)明還涉及體外、離體和體內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA或siRNA和質(zhì)粒DNA的方法，包括使用例如上述定義的組合物。SiRNA的體外轉(zhuǎn)染在含粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行是有利的。所述培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基或合成的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供用作藥物組合物的組合物，所述組合物用于誘發(fā)對一種或多種靶蛋 白的表達(dá)的調(diào)控影響，所述蛋白負(fù)責(zé)或參與基因遺傳性疾病或復(fù)雜的基因疾病。本發(fā)明旨在提供用作DNA載體轉(zhuǎn)染劑的新組合物，其可促進(jìn)介導(dǎo)RNA干擾的小RNA 的原位表達(dá)。本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)在以下實(shí)施例提及的

圖1 8中給出，這些圖各自涉及 到·圖1 :L-PEI_Tyr結(jié)合在D2O上的1H-匪R分析。 圖2A和圖2B :siRNA遞送到A549細(xì)胞。 圖3 由用經(jīng)不同程度的酪氨酸殘基修飾的L-PEI皿經(jīng)GL3Luc siRNA轉(zhuǎn)染的 A549-GL3Luc細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶基因(pGL3)的RNA干擾效率。 圖 4 由用 L-PEIiqk 或 L_PEI1(1KTyr33 % 綴合物經(jīng) GL3Luc siRNA 轉(zhuǎn)染的 A549-GL3LUC細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶基因(pGL3)的比較沉默效率。 圖 5 由用 L-PEIm-Tyr33%經(jīng) GL3Luc siRNA 轉(zhuǎn)染的 A549_GL3Luc 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) 的熒光素酶基因(PGL3)的選擇性RNA干擾。 圖6 用I-PEI1QK-Tyr33%復(fù)合的siRNA轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞系中的有效的和選擇 性的GAPDH基因沉默。 圖 7 由用 PAA17K-Tyr4(1#5 GL3Luc siRNA 轉(zhuǎn)染的 A549_GL3Luc 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的 熒光素酶基因(PGL3)的選擇性RNA干擾。 圖 8A 和圖 8B 用 PEI1(IK-Tyr 19%經(jīng) GL2Luc siRNA 和 pCMVLuc 質(zhì)粒(pGL2Luc)共 轉(zhuǎn)染后由HeLa細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶基因(GL2Luc)的選擇性RNA干擾。材料與方法化學(xué)品和寡核苷酸寡核苷酸是由Eurogentec (比利時(shí))化學(xué)合成且經(jīng)PAGE純化的。寡核苷酸在1 X 退火緩沖液(50mM醋酸鉀、50mM醋酸鎂)(Eurogentec)中于95°C退火2分鐘，接著于室溫 溫育2 4小時(shí)。GAPDH SMART pool 試劑來自 DharmBcori 0所用siRNA 雙鏈體對應(yīng)于序列 SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :8。
GL3Luc siRNA 雙鏈體SEQ ID NO SEQ ID NO15'-CUUACGCUGAGUACUUCGA(dT)2-3' 23'-(dT)2GAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'GL2Luc siRNA 雙鏈體SEQ ID NO SEQ ID NO35'-CGUACGCGGAAUACUUCGA(dT)2-3' 43'-(dT)2GCAUGCGCCUUAUGAAGCU-5'siRNA TNF-α若丹明雙鏈 體SEQ ID NO SEQ ID NO55'-GCACCACUAGUUGGUUGUC(dT)2-3' 63'-(dT)2CGUGGUGAUCAACCAACAG-5'核纖層蛋白A/C SiRNA雙 鏈體SEQ ID NO SEQ ID NO75'-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3' 83'-dTdTGACCUGAAGGUCUUCUUGU-5'
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所有化學(xué)試劑和原材料均購自Sigma-Aldrich (法國)并不經(jīng)純化而使用。溶液 訂購自SDS-Carlo Erba(法國)。二乙醚經(jīng)二苯甲酮鈉干燥和蒸餾。1H NMR 光譜于 25°C在 CDC13、D20 或 CD3OD 中，用 Bruker AF-400 光譜儀記錄，且質(zhì) 子化學(xué)位移的低磁場報(bào)告來自TMS。NMR多重態(tài)簡寫為s =單線態(tài)，d =雙線態(tài)，br =寬， m=多線態(tài)，t =三線態(tài)。線件聚乙烯亞胺(L-PEI)的合成LPEI由2-乙基-2-噁唑啉單體的活性陽離子開環(huán)聚合后產(chǎn)生的中間體聚2_乙 基-2-噁唑啉得到。 聚2-乙基-2-噁唑啉的合成將0. 4mol的2_乙基_2_噁唑啉單體溶于40ml乙腈 后在氬氣氛下加入0. 4/Xmol的甲基對甲苯磺酸。所述反應(yīng)于80°C加熱24 48小時(shí)。該 反應(yīng)用Na2CO3飽和溶液淬火，及加熱24小時(shí)。在室溫緩慢冷卻后，加入IOml甲醇和乙醚直 到沉淀。該沉淀物經(jīng)過濾并用乙醚洗滌。以80 90%的產(chǎn)率得到聚2-乙基-2-噁唑啉。 1H-NMR 分析，400MHz，在 CDCl3 中1 1. 06ppm(s，3H，CHgCH2CONCH2CH2) ；2. 2 2. 3ppm(m, 2H, Ch3CH2CONCH2CH2) ；3 3. 4ppm(s，4H，Ch3Ch2CONCE^Ch2)。L-PEI的合成將0. 35mol的聚2_乙基_2_噁唑啉溶于IOOml水中，其后加入 200ml、37%的鹽酸，并將該混合液于120°C加熱。24小時(shí)后蒸發(fā)該反應(yīng)混合液，然后在凍干 前加入水。該產(chǎn)率為90%。用1H-NMR分析，400MHz，在D2O中單個(gè)峰值位于3. 4ppm
權(quán)利要求
用作轉(zhuǎn)染劑的組合物，其含經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺和對RNA干擾有活性的雙鏈或單鏈RNA。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述聚胺包括分支或線性的聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、樹狀 聚體、聚氨酯、聚賴氨酸、聚組氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸或殼多糖。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述聚胺選自線性的聚乙烯亞胺(LPEI)、聚烯丙胺 (PAA)和聚賴氨酸(PLL)。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚胺的分子量為400Da以上。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚胺選自線性的2KD 220KD的聚乙烯亞胺、 IOKD 70KD的聚烯丙胺和IKD 300KD的聚賴氨酸。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述用于修飾所述聚胺的芳香族氨基酸選 自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，或它們的衍生物。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述芳香族氨基酸是色氨酸和/或酪氨酸。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述RNA是普通或經(jīng)修飾的RNA，修飾基團(tuán) 為例如2’ -氟基、2’ -甲氧基、硫代磷酸基、LNA或嗎啉基。
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)的組合物，其中所述RNA是雙鏈或單鏈反義siRNA，或者單 鏈正義/反義siRNA的混合物。
10.權(quán)利要求8或9的組合物，其中所述siRNA是15 30聚體。
11.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的組合物，其含 例如上述定義的經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺、和眷等滲介質(zhì)中的雙鏈或單鏈siRNA，所述等滲介質(zhì)為例如NaCl、葡萄糖、緩沖液。
12.權(quán)利要求8 11中任一項(xiàng)的組合物，其中所述siRNA的濃度為pmol量級 μmol量級。
13.權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)的組合物，其還含一種或數(shù)種添加劑，所述添加劑為例 如PEG、PVA、糖、聚糖、肽、蛋白質(zhì)、維生素。
14.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)的組合物，其還含質(zhì)粒DNA，所述質(zhì)粒DNA表達(dá)對RNAi 有活性的RNA或編碼轉(zhuǎn)基因。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述轉(zhuǎn)基因被所述小RNA靶向。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中，所述質(zhì)粒表達(dá)siRNA、shRNA或適于微RNA的短發(fā)卡RNA ；所述組合物含經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺，所述芳香族氨基酸尤其是酪氨酸及其衍生 物，所述聚胺尤其是帶有酪氨酸及其衍生物的聚乙烯亞胺；且所述組合物用作DNA載體轉(zhuǎn)染劑，其中所述質(zhì)粒表達(dá)siRNA、shRNA或適于微RNA的短 發(fā)卡RNA。
17.合成權(quán)利要求1 16中任一項(xiàng)的組合物的經(jīng)芳香族氨基酸修飾的聚胺的合成方 法，包括在聚胺存在的情況下使用經(jīng)二甲氧基三嗪-N-甲基嗎啉(DMTMM)活化的芳香族氨 基酸超酯。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述聚胺合成在堿性緩沖液中進(jìn)行，所述堿性緩沖液如 200mM、pH = 7. 5 9的硼酸鹽緩沖液；或者在堿或水/乙醇混合物的存在下在水介質(zhì)中進(jìn) 行。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述組合物中聚胺被芳香族氨基酸修飾的百分比為 0. 01% 100%，尤其為 15% 50%。
20.體外、離體轉(zhuǎn)染siRNA或siRNA和質(zhì)粒DNA的方法，包括使用權(quán)利要求1 16中任 一項(xiàng)的組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述siRNA體外轉(zhuǎn)染在含粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基 中進(jìn)行。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基或合成的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用作轉(zhuǎn)染劑的組合物，所述組合物含被芳香族氨基酸修飾的聚胺和用于RNA干擾的小雙鏈或單鏈RNA。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101952434SQ200880125788
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者A·阿迪布, F·斯多克, N·哈夫迪, P·埃爾巴徹 申請人:聚加轉(zhuǎn)染公司