專利名稱：生物工程化組織構(gòu)建物及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在組織工程領(lǐng)域中。本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生生物工程構(gòu)建物 (bioengineered construct)的方法。該生物工程構(gòu)建物是生物相容的和生物可重塑的并 可用于臨床目的。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及組織工程、組織再生和再生醫(yī)學(xué)的原理并結(jié)合生物工程方法以及生命 科學(xué)原理，以理解正常的和病理性哺乳動物組織中結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。這些原理的總體目標 在于用于修復(fù)、維護或促進組織功能的生物替代物的開發(fā)和最終應(yīng)用。因此，可以在實驗室 中設(shè)計并制備生物工程化組織(bioengineered tissue)。生物工程化組織可包括通常與天 然哺乳動物組織或人體組織締合的細胞以及合成或天然的基質(zhì)支架。當移植到宿主中時， 新的生物工程化組織必須具有功能，并能永久性結(jié)合到宿主體內(nèi)或被來自生物工程化組織 或受體宿主的細胞逐漸進行生物重塑。不結(jié)合或不依賴于外源支持元件或支架的生物工程 化組織構(gòu)建物(bioengineered tissue construct)的制備，在創(chuàng)建新的生物工程化組織構(gòu) 建物上是一個科學(xué)挑戰(zhàn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及由培養(yǎng)細胞和內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)組件而產(chǎn)生的生物工程化組織構(gòu) 建物，而無需外源基質(zhì)組件或網(wǎng)絡(luò)載體或支架元件。因此，有利的是，可以完全從人體細胞 和由這些細胞所產(chǎn)生的人體基質(zhì)組件來實施本發(fā)明，例如，當生物工程化組織構(gòu)建物經(jīng)設(shè) 計用于人用時。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生組織構(gòu)建物的方法，即通過刺激培養(yǎng)中的細胞，例如成纖 維細胞，來產(chǎn)生胞外基質(zhì)組件，而不添加外源基質(zhì)組件、網(wǎng)絡(luò)載體或支架元件。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生組織構(gòu)建物的方法，即通過在確定成分培養(yǎng)基系統(tǒng)中和/ 或不用未確定的或非人源性生物組件(例如牛血清或器官提取物)，刺激培養(yǎng)中的細胞，例 如成纖維細胞，來產(chǎn)生胞外基質(zhì)組件。此外，本發(fā)明涉及生物工程構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含由培養(yǎng)的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞 所產(chǎn)生并裝配的胞外基質(zhì)的失活和/或脫細胞層。還另外，本發(fā)明涉及用于制備生物工程構(gòu)建物的方法，所述方法包括產(chǎn)生兩層或 更多層內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)，隨后使胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞失活和或脫細胞，然后通過交聯(lián)和/ 或生物相容的和生物可重塑的粘合劑溶液，使兩層或更多層結(jié)合。組織構(gòu)建物是由培養(yǎng)細胞產(chǎn)生并自我裝配的，無需支架支持或加入外源胞外基質(zhì) 組件。
發(fā)明詳述迄今為止，現(xiàn)有的工程活組織構(gòu)建物并非完全是細胞裝配的，必須依賴于添加或 結(jié)合外源基質(zhì)組件或合成元件，用于結(jié)構(gòu)或支持，或這兩者。本文所述的生物工程化組織構(gòu)建物表現(xiàn)出其細胞來源組織的許多天然特征。由此 產(chǎn)生的組織構(gòu)建物可用于移植到受試者或用于體外試驗。一個優(yōu)選的實施方案是包含第一細胞類型和內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)的細胞基質(zhì)構(gòu) 建物，其中所述第一細胞類型能夠合成和分泌胞外基質(zhì)，從而產(chǎn)生細胞基質(zhì)構(gòu)建物。另一個優(yōu)選的實施方案是雙層構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含第一細胞類型和內(nèi)源產(chǎn)生 的胞外基質(zhì)以及分布在其中或在細胞基質(zhì)構(gòu)建物內(nèi)的由第一細胞類型構(gòu)成的第二類型細 胞層。一個更優(yōu)選的實施方案是細胞基質(zhì)構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含成纖維細胞，例如衍 生自真皮的那些，以構(gòu)成培養(yǎng)的真皮構(gòu)建物。另一個更優(yōu)選的實施方案是細胞基質(zhì)構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含成纖維細胞，例如 衍生自真皮的那些，以構(gòu)成具有培養(yǎng)在其上的角質(zhì)細胞層的培養(yǎng)的真皮構(gòu)建物，以構(gòu)成表 皮層，從而導(dǎo)致培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建物。本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建物表達天然皮膚的許多 物理、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述細胞基質(zhì)構(gòu)建物是類似于皮膚真皮層的組 織構(gòu)建物，所述構(gòu)建物是在包含人源性細胞的成分確定系統(tǒng)中形成的一種人真皮構(gòu)建物， 在其培養(yǎng)期間不用化學(xué)成分不確定組件。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組織構(gòu)建物是在包含人源性細胞的化學(xué)成分確 定系統(tǒng)中制備的，而不用化學(xué)成分不確定的或非人生物組件或細胞。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案包括至少一種類型的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞和內(nèi)源產(chǎn) 生的胞外基質(zhì)組件的結(jié)構(gòu)層，所述內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)組件簡稱為“基質(zhì)”，其中所述基質(zhì) 是通過培養(yǎng)細胞而完全由細胞合成并裝配的。該層在本文稱為“細胞基質(zhì)構(gòu)建物”或“細 胞-基質(zhì)層”，因為細胞在其基質(zhì)內(nèi)和通過其基質(zhì)分泌并含有它們自身。培養(yǎng)的組織構(gòu)建物 不需要、因此不包括外源基質(zhì)組件，也就是說，基質(zhì)組件并非由所述培養(yǎng)細胞產(chǎn)生，而是通 過其它方式引入的。在一個更優(yōu)選的實施方案中，由人真皮成纖維細胞產(chǎn)生的細胞基質(zhì)構(gòu) 建物表現(xiàn)出具有與天然皮膚類似的優(yōu)勢濃度的膠原蛋白。通過電鏡證明，所述基質(zhì)在性質(zhì) 上是纖維狀的，包含顯示出交錯排列的67nm帶狀圖案的膠原蛋白，以及類似于天然膠原蛋 白的原纖維和原纖維束的填充組織。延遲還原SDS-PAGE已經(jīng)檢出這些構(gòu)建物中存在I型和 III型膠原蛋白兩者，這是天然人皮膚中存在的優(yōu)勢膠原蛋白類型。采用標準免疫組織化學(xué) (IHC)技術(shù)，真皮細胞基質(zhì)構(gòu)建物對核心蛋白聚糖染色呈陽性，核心蛋白聚糖是一種硫酸皮 膚素蛋白聚糖，已知其與膠原蛋白原纖維締合并據(jù)信在體內(nèi)能調(diào)節(jié)原纖維直徑。經(jīng)TEM，在 構(gòu)建物中也可觀察到核心蛋白聚糖。所產(chǎn)生的組織也對生腱蛋白染色呈陽性，生腱蛋白是 一種胞外基質(zhì)糖蛋白，在修復(fù)下存在于例如間充質(zhì)或組織中。與在修復(fù)下的體內(nèi)組織非常 類似，培養(yǎng)產(chǎn)生的組織已經(jīng)顯示出能增加I型與III型膠原蛋白的比例，當基質(zhì)形成時。盡 管不希望受理論的束縛，但是據(jù)信，所述細胞快速地用類似于主要包含III型膠原蛋白和 纖連蛋白的肉牙形成組織的疏松基質(zhì)來填充其間的空隙，然后用主要包含I型膠原蛋白的 更致密的基質(zhì)來重塑該疏松基質(zhì)。所產(chǎn)生的細胞-基質(zhì)已經(jīng)表現(xiàn)出含有糖胺聚糖(GAG)，例如透明質(zhì)酸(HA)；纖連蛋白；除核心蛋白聚糖之外的蛋白聚糖，例如雙糖鏈蛋白聚糖和 多功能蛋白聚糖；以及一系列(profile)硫酸化糖胺聚糖，例如二-透明質(zhì)酸；二-軟骨 素-0-硫酸酯；二 -軟骨素-4-硫酸酯；二 -軟骨素-6-硫酸酯；二 -軟骨素-4，6-硫酸酯； 二 _軟骨素-4-硫酸酯-UA-2S ；和二 -軟骨素-6-硫酸酯-UA-2S。當構(gòu)建物在培養(yǎng)中發(fā)育 時，這些結(jié)構(gòu)特征和生化特征就自我表現(xiàn)出來，而當構(gòu)建物接近其最終形式時，它們變得尤 其明顯。在完全形成的培養(yǎng)真皮細胞基質(zhì)構(gòu)建物中這些組件的存在表明，所述構(gòu)建物具有 接近正常真皮的結(jié)構(gòu)特征和生化特征。盡管上述所列是由真皮成纖維細胞形成的培養(yǎng)的細胞基質(zhì)構(gòu)建物的生化特征和 結(jié)構(gòu)特征的列表，但是應(yīng)當認識到，由其它類型的成纖維細胞所形成的培養(yǎng)的細胞基質(zhì)構(gòu) 建物將會產(chǎn)生許多這些特征和其來源組織類型的其它表型。在某些情況下，可通過化學(xué)暴 露或接觸、物理應(yīng)激、或通過轉(zhuǎn)基因方式，誘導(dǎo)成纖維細胞表達非表型組件。本發(fā)明的另 一個優(yōu)選的實施方案是具有分散其上的第二層細胞的細胞_基質(zhì)層。第二層細胞是在細 胞-基質(zhì)層上培養(yǎng)，以形成生物工程化雙層組織構(gòu)建物。在一個更優(yōu)選的實施方案中，第 二層細胞是源自上皮。在最優(yōu)選的實施方案中，第二層包含與第一細胞_基質(zhì)層一起培養(yǎng) 的人角質(zhì)細胞，其為用于形成真皮層的由真皮成纖維細胞和內(nèi)源基質(zhì)形成的細胞基質(zhì)構(gòu)建 物，包括活皮膚構(gòu)建物。當完全形成時，表皮層是多層的、分層的和分化良好的角質(zhì)細胞層， 其顯示出基底層、基底上層(suprabasal layer)、顆粒層和角質(zhì)層。通過透射電鏡(TEM)觀 察，皮膚構(gòu)建物在真皮_表皮連接處具有發(fā)育良好的基底膜。通過TEM觀察，基底膜在半橋 粒周圍最厚，顯示由VII型膠原蛋白組成的錨定原纖維。可見錨定原纖維存在于基底膜中 并在真皮層中包含膠原蛋白原纖維。這些錨定原纖維以及其它基底膜組件是由角質(zhì)細胞分 泌的。也已經(jīng)知道，盡管角質(zhì)細胞自身能分泌基底膜組件，但是在成纖維細胞不存在時，可 辨認的基底膜將不會形成。對本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物進行免疫組織化學(xué)染色，也顯示出存在 層粘連蛋白(一種基底膜蛋白)。在用于形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物的本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，將第一細胞類型(胞外 基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型)接種到底物中，培養(yǎng)并誘導(dǎo)合成和在其周圍分泌有組織的胞外基質(zhì)， 形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方法中，將第二細胞類型的細胞接種在細 胞基質(zhì)構(gòu)建物的表面并培養(yǎng)形成雙層組織構(gòu)建物。在一個更優(yōu)選的方法中，形成具有類似 于天然人皮膚的特征的全厚度皮膚構(gòu)建物，即通過在足以誘導(dǎo)基質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)成纖 維細胞(例如人真皮成纖維細胞)，形成真皮細胞和基質(zhì)的細胞_基質(zhì)，即真皮層，在所述真 皮層上接種人上皮細胞(例如角質(zhì)細胞)并在足以形成完全分化的分層表皮層的條件下進 行培養(yǎng)。因此，獲取本發(fā)明生物工程化組織構(gòu)建物的一種方法包括(a)在外源胞外基質(zhì) 組件或結(jié)構(gòu)支持元件不存在時，培養(yǎng)至少一種胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型；(b)刺激步驟(a)的 細胞，以合成、分泌和組織胞外基質(zhì)組件，以形成包含細胞和由這些細胞所合成的基質(zhì)的組 織構(gòu)建物；其中步驟(a)和(b)可同時或連續(xù)進行；和(c)使包含胞外基質(zhì)組件的組織構(gòu)建 物失活或脫細胞，用于臨床用途。可通過交聯(lián)方式或使用生物相容的或生物可再吸收的粘 合劑，使兩種或更多種失活或脫細胞的組織構(gòu)建物接觸在一起和粘合在一起。I .培養(yǎng)基制劑可通過在促進細胞活力、增殖和促進細胞合成胞外基質(zhì)組件的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物。培養(yǎng)基是由營養(yǎng)基礎(chǔ)組成，通常還補充其它成分。在動物細胞 培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定合適的營養(yǎng)基礎(chǔ)，并合理地預(yù)期能成功產(chǎn)生本發(fā)明的組織構(gòu)建 物。許多市售營養(yǎng)來源可用于本發(fā)明的實踐。這些包括可提供無機鹽、能量來源、氨基酸 和B族維生素的市售營養(yǎng)來源，例如Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)；最低必需培 養(yǎng)基(MEM) ；M199 ；RPMI 1640 ；Iscove氏改良Dulbecco氏培養(yǎng)基(EDMEM)。最低必需培養(yǎng) 基(MEM)和M199需要額外補充磷脂前體和非必需氨基酸。提供額外氨基酸、核酸、酶的輔 因子、磷脂前體和無機鹽的市售富含維生素的混合物包括HamF-12、Ham F_10、NCTC 109和 NCTC 135。雖然濃度不同，但是所有基礎(chǔ)培養(yǎng)基都以葡萄糖、氨基酸、維生素和無機離子、以 及其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的形式提供用于細胞的基礎(chǔ)營養(yǎng)來源。本發(fā)明最優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 包括無鈣或低鈣Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)、或者分別介于3比1比率至1比 3比率之間的DMEM和Ham F-12的營養(yǎng)基礎(chǔ)?；A(chǔ)培養(yǎng)基中補充有例如氨基酸、生長因子和激素的成分。用于培養(yǎng)本發(fā)明細 胞的確定成分培養(yǎng)基描述于Parenteau的美國專利號5，712，163、國際PCT公布號WO 95/31473和PCT公布號WO 00/29553，其公開內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。其它培養(yǎng)基 是本領(lǐng)域已知的，例如公開于 Ham 和 McKeehan，Methods in Enzymology，58 :44_93 (1979) 的那些，或者對于其它合適的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基而言，公開于Bottenstein等，Methods in Enzymology, 58 :94_109 (1979)。在優(yōu)選的實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基在動物細胞培養(yǎng)中補 充有技術(shù)人員已知的下列成分胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺原氨酸(T3)以及乙醇胺和 ο-磷?；?乙醇胺中的任一種或兩種，其中技術(shù)人員可以確定補充的濃度和替代物。根據(jù)所培養(yǎng)的細胞類型和所產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)，來選擇適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基制 劑。所用的培養(yǎng)基和促進細胞生長、基質(zhì)合成和活力所需的具體培養(yǎng)條件將取決于所生長 的細胞類型或細胞類型的組合。在某些情況下，例如在制備本發(fā)明的生物工程雙層皮膚構(gòu)建物中，培養(yǎng)基組成在 每個制備時期是不同的，因為對于不同目的需要不同的補充。在一個優(yōu)選的方法中，在確定 條件下，也就是說，在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件下，形成細胞_基質(zhì)層。在另一個 優(yōu)選的方法中，組織構(gòu)建物包含細胞_基質(zhì)層，所述細胞_基質(zhì)層與分布和培養(yǎng)在其上的 第二層細胞一起提供，其中這兩種細胞類型都在確定成分培養(yǎng)基系統(tǒng)中培養(yǎng)。或者，組織 構(gòu)建物包含在確定成分培養(yǎng)基條件下制備的細胞_基質(zhì)層和在成分不確定的培養(yǎng)基條件 下在其上形成的第二層。相反，組織構(gòu)建物包含可在成分不確定的培養(yǎng)基條件下制備的細 胞-基質(zhì)層和在確定成分培養(yǎng)基條件下在其上形成的第二層。化學(xué)成分確定培養(yǎng)基的使用是優(yōu)選的，也就是說，不含例如下列成分不確定的動 物器官或組織提取物的培養(yǎng)基血清、垂體提取物、下丘腦提取物、胎盤提取物或胚胎提取 物或者由飼養(yǎng)細胞分泌的蛋白質(zhì)和因子。在最優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)基不含不確定的成 分和源自非人動物來源的生物成分。盡管加入不確定的成分并非是優(yōu)選的，但是它們可在 培養(yǎng)的任何時間點用于本文公開的方法，以便成功制備組織構(gòu)建物。當使用并非來自非人 動物來源的化學(xué)成分確定的成分培養(yǎng)的所選人體細胞來進行本發(fā)明時，所得的組織構(gòu)建物 就是確定的人體組織構(gòu)建物(defined human tissue construct)。在化學(xué)成分確定的定義 范圍之內(nèi)，也可添加合成的或重組的功能等同物，以補充化學(xué)成分確定培養(yǎng)基，用于最優(yōu)選 的制備方法。通常，細胞培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定公知動物成分的合適的天然人等同物、人重組等同物或合成等同物，以補充本發(fā)明的培養(yǎng)基，無需過多的研究或?qū)嶒?。在臨床 上使用這類構(gòu)建物的優(yōu)勢就是對減少偶然的動物病毒或雜交品種的病毒污染和感染的考 慮。在試驗情況下，化學(xué)成分確定構(gòu)建物的優(yōu)勢是，當試驗時，不會因不確定成分的存在而 使結(jié)果令人困惑。胰島素是一種多肽激素，其可促進葡萄糖和氨基酸攝取，以通過多種途徑提供長 期益處。胰島素或胰島素樣生長因子(IGF)的補充對于長期培養(yǎng)而言是必要的，因為細胞 攝取葡萄糖和氨基酸的能力可能會耗盡，而且細胞表型可能退化。胰島素可來自動物來源 例如牛、人來源或通過重組方式作為人重組胰島素。因此，人胰島素將作為一種并非來自非 人生物來源的化學(xué)成分確定的成分定量。胰島素的補充對于連續(xù)培養(yǎng)而言是適當?shù)模⒖?按寬濃度范圍添加到培養(yǎng)基中。優(yōu)選的濃度范圍是介于約0. 1 μ g/ml至約500 μ g/ml之 間，更優(yōu)選在約5 μ g/ml至約400 μ g/ml之間，和最優(yōu)選在約375 μ g/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以容易地確定胰島素樣生長因子(例如IGF-1、IGF-2等)的合適補充濃度，用于所選細 胞類型的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)鐵蛋白在培養(yǎng)基中用于鐵的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)。鐵是血清中存在的必需痕量元素。因 為鐵在其游離形式下對細胞有毒，因此在血清中它是以與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的形式提供給細胞 的，其濃度范圍優(yōu)選介于約0. 05至約50μ g/ml之間，更優(yōu)選為約5 μ g/ml。三碘甲狀腺原氨酸(T3)是一種基礎(chǔ)成分，是甲狀腺激素的活性形式，在培養(yǎng)基中 含有它是為了維持細胞代謝速率。三碘甲狀腺原氨酸補充到培養(yǎng)基中的濃度范圍介于約0 至約400 P M之間，更優(yōu)選介于約2至約200 P M之間，最優(yōu)選為約20 P M。添加作為磷脂的乙醇胺和ο-磷酰基-乙醇胺中的一種或兩種，其功能是作為肌醇 途徑和脂肪酸代謝中的重要前體。在無血清培養(yǎng)基中補充在血清中正常存在的脂質(zhì)是必要 的。將乙醇胺和ο-磷?；鵢乙醇胺加入到培養(yǎng)基的濃度范圍介于約10_6至約10_2M之間， 更優(yōu)選為約1x10_4M。在整個培養(yǎng)期間，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中額外補充例如氫化可的松、硒和L-谷氨酰胺的 其它成分，以誘導(dǎo)合成或分化或改善細胞生長。已知氫化可的松在角質(zhì)細胞培養(yǎng)中能促進角質(zhì)細胞表型并因此增強分化特 征，例如傘形蛋白和角質(zhì)細胞谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶含量(Rubin等，J. Cell Physiol. , 138 208-214(1986))。因此，在這些特征有益的情況下，例如在形成角質(zhì)細胞片移植物或皮 膚構(gòu)建物的情況下，氫化可的松是期望的添加物?？商峁┑臍浠傻乃傻臐舛确秶鸀榧s 0.01 μ g/ml 至約 4. 0 μ g/ml，最優(yōu)選介于約 0. 4 μ g/ml 至 16 μ g/ml 之間。將亞硒酸添加到無血清培養(yǎng)基中，以再補充血清正常提供的痕量元素硒。提供亞 硒酸的濃度范圍為約ICT9M至約IO-7M ；最優(yōu)選為約5. 3x 10_8M。氨基酸L-谷氨酰胺在某些營養(yǎng)基礎(chǔ)中存在，在沒有或含量不足的情況下可以 添加。也可以穩(wěn)定形式提供L-谷氨酰胺，例如商標名為GlutaMAX-lTM(Gibc0 BRL, Grand Island, NY)的市售產(chǎn)品。GlutaMAX-l 是穩(wěn)定的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的二肽形式，可 與L-谷氨酰胺互換使用，可提供等摩爾濃度來替代L-谷氨酰胺。該二肽提供穩(wěn)定的L-谷 氨酰胺，以免L-谷氨酰胺在貯存和孵育期間隨時間降解而導(dǎo)致培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺有效 濃度的不確定性。通常，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充優(yōu)選介于約ImM至約6mM之間，更優(yōu)選介于約 2mM至約5mM之間，和最優(yōu)選4mM的L-谷氨酰胺或GlutaMAX-l 。
也可將生長因子例如表皮生長因子(EGF)添加到培養(yǎng)基中，有助于在細胞放大規(guī) 模和接種中建立培養(yǎng)。天然形式或重組形式的EGF都可使用。人形式、天然或重組的EGF 優(yōu)選用于培養(yǎng)基，當制備不含非人生物成分的皮膚等同物時。EGF是一種任選成分，可提供 的濃度介于約l-15ng/mL之間，更優(yōu)選介于約5-lOng/mL之間。其它補充物也可添加到培養(yǎng)基中，例如一種或多種前列腺素、轉(zhuǎn)化生長因子(包 括轉(zhuǎn)化生長因子α或β)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)或甘露 糖-6-磷酸(Μ6Ρ)或其組合。前列腺素E2 (PGE2)是由前列腺素E合酶作用于前列腺素H2 (PGH2)而產(chǎn)生的。已經(jīng) 鑒定了若干前列腺素E合酶。迄今為止，微粒體前列腺素E合酶-1作為PGE2形成的關(guān)鍵 酶出現(xiàn)。將PGE2補充到培養(yǎng)基中的優(yōu)選范圍為約0. 000038 μ g/mL至約0. 760 μ g/mL,更優(yōu) 選約 0. 00038 μ g/mL 至約 0. 076 μ g/mL,最優(yōu)選約 0. 0038 μ g/mL 至約 0. 038 μ g/mL。也可 按照這些范圍補充16，IBPGE2形式。轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)是在巨噬細胞、腦細胞和角質(zhì)細胞中產(chǎn)生的并誘導(dǎo)上 皮發(fā)育。它與EGF密切相關(guān)，也可以類似的效果與EGF受體結(jié)合。優(yōu)選TGF-α的長鏈形式 用于本發(fā)明。TGF-a是一種小( 50個殘基)蛋白質(zhì)，與EGF共享30%結(jié)構(gòu)同源性并競 爭相同的表面結(jié)合受體位點。它與傷口愈合相關(guān)并促進某些細胞的表型改變。將TGF a 或長鏈TGF α補充到培養(yǎng)基中的優(yōu)選范圍為約0.0005 μ g/mL至約0.30 μ g/mL，更優(yōu)選約 0. 0050 μ g/mL 至約 0. 03 μ g/ mL,最優(yōu)選約 0. 01 μ g/mL 至約 0. 02 μ g/mL。將角質(zhì)細胞生長因子5μ g/mL補充到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可用于支持表皮化 (epidermalization).將角質(zhì)細胞生長因子(KGF)補充到培養(yǎng)基中的優(yōu)選范圍為約 0. 001 μ g/mL 至約 0. 150 μ g/mL,更優(yōu)選約 0. 0025 μ g/mL 至約 0. 100 μ g/mL,最優(yōu)選約 0. 005 μ g/mL 至約 0. 015 μ g/mL。將甘露糖-6-磷酸(M6P)補充到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可用于支持表皮化。將甘露 糖-6-磷酸補充到培養(yǎng)基中的優(yōu)選范圍為約0. 0005mg/mL至約0. 0500mg/mL。CTGF(結(jié)締組織生長因子)是富含半胱氨酸的、與基質(zhì)結(jié)合的肝素結(jié)合蛋白。在體 外，CTGF表現(xiàn)出TGFii對皮膚成纖維細胞的某些作用，例如刺激胞外基質(zhì)產(chǎn)生、趨化性、增 殖和整聯(lián)蛋白表達。CTGF可促進內(nèi)皮細胞生長、遷移、粘附和存活并因此與內(nèi)皮細胞功能和 血管生成相關(guān)。CTGF與基底膜聚糖結(jié)合，該基底膜聚糖是局限在滑膜、軟骨和大量的其它組 織中的一種蛋白聚糖。已經(jīng)知道，CTGF與傷口愈合、硬皮病和其它纖維化過程中的胞外基 質(zhì)重塑有關(guān)，因為它能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(TIMP)兩者。因此，CTGF具 有激活胞外基質(zhì)合成和降解兩者的潛力。上述培養(yǎng)基通常制備如下。然而，應(yīng)當理解，可使用與其物理特性相容的常規(guī)方 法，制備和組合本發(fā)明的成分。本領(lǐng)域眾所周知的是，用合適的類似或功能等同的作用劑替 代某些成分，用于可用性或經(jīng)濟目的并達到類似結(jié)果。當用于實施本發(fā)明時，可以用具有類 似性質(zhì)和結(jié)果的重組或合成的生長因子來替代天然存在的生長因子。本發(fā)明的培養(yǎng)基是無菌的。無菌成分本來就是無菌的或者可通過制備后例如過濾 的常規(guī)方法使其無菌。在以下實施例中采用適當?shù)臏缇椒?。先將DMEM和F-12混合，再 添加單獨成分，使培養(yǎng)基完全。所有成分的貯液都可貯存于-20 °C，除了營養(yǎng)來源可貯存于 4°C之外。所有貯液都按照以上列出的終濃度的500X來制備。胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和三碘甲狀腺原氨酸(都來自Sigma)的貯液制備如下先將三碘甲狀腺原氨酸溶于2 1比例的無 水乙醇/IN鹽酸(HC1)。將胰島素溶于稀HCl (約0. 1N)，將轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于水。再將這3種混 合并用水稀釋至500X濃度。將乙醇胺和ο-磷?；?乙醇胺溶于水中至500X濃度，然后過 濾除菌。將黃體酮溶于無水乙醇中并用水稀釋。將氫化可的松溶于無水乙醇中并稀釋在磷 酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將硒溶于水至500X濃度并過濾除菌。EGF購回就是無菌的，將其 溶于PBS中。腺嘌呤很難溶解，但是可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法來溶解。可將 血清白蛋白添加到某些成分中，以便在溶液中穩(wěn)定它們，其目前源自人或動物來源。例如， 可添加人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)，為了延長貯存期，以維持黃體酮和EGF 貯液的活性。已經(jīng)開發(fā)出重組形式的白蛋白，例如人重組白蛋白，優(yōu)選用它們替代人和牛的 血清來源的形式。培養(yǎng)基在制備之后可立即使用，或可貯存于4°C。如果貯存的話，不應(yīng)添 加EGF，直到使用時才添加。為了通過培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生細胞而形成細胞-基質(zhì)層，在培養(yǎng)基中補充能促進細胞的 基質(zhì)合成和沉積的額外試劑。這些補充的試劑是細胞相容性的，限定至高純度的并且不含 污染物。用于產(chǎn)生細胞_基質(zhì)層的培養(yǎng)基稱為“基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基”。為了制備基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充抗壞血酸衍生物(例如抗壞血酸 鈉、抗壞血酸)或其在化學(xué)上更穩(wěn)定的衍生物(例如L-抗壞血酸磷酸鎂鹽η-水合物)。添 加抗壞血酸(鹽)以促進脯氨酸羥基化和前膠原的分泌，所述前膠原是沉積膠原蛋白分子 的一種可溶性前體。也已經(jīng)知道，抗壞血酸(鹽)是其它酶翻譯后加工的重要輔因子以及 I型和III型膠原蛋白合成的上調(diào)劑。盡管不希望受到理論的束縛，用參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸來補充培養(yǎng)基，即無需 通過細胞自身產(chǎn)生氨基酸，來保存細胞能量。優(yōu)選添加脯氨酸和甘氨酸，因為它們以及脯氨 酸、羥基脯氨酸的羥基化形式，都是構(gòu)成膠原蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)氨基酸。盡管不需要，但是基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基中可任選補充中性聚合物?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的細 胞基質(zhì)構(gòu)建物而無需中性聚合物，但是，盡管不希望受到理論的束縛，它在基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基 中的存在可使樣品之間膠原蛋白加工和沉積更具有一致性。一種優(yōu)選的中性聚合物是聚乙 二醇(PEG)，已經(jīng)知道聚乙二醇能促進培養(yǎng)細胞所產(chǎn)生的可溶性前體前膠原的體外加工，從 而加工為基質(zhì)沉積的膠原蛋白。范圍介于約1000至約4000MW(分子量)之間，更優(yōu)選介于 約3400至約3700MW之間的組織培養(yǎng)級PEG優(yōu)選用于本發(fā)明的培養(yǎng)基。優(yōu)選用于所述方法 的PEG濃度可以是濃度為約5 % w/v或更低，優(yōu)選約0.01% w/v至約0. 5%w/v,更優(yōu)選介于 約0. 025% w/v至約0. 2% w/v之間，最優(yōu)選約0. 05% w/v。其它的培養(yǎng)級中性聚合物(例 如葡聚糖優(yōu)選葡聚糖T-40，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，優(yōu)選范圍為30，000-40, 000MW)，也可 使用，其濃度為約5 % w/v或更低，優(yōu)選介于約0. 01 % w/v至約0. 5 % w/v之間，更優(yōu)選介于 約0. 025% w/v至約0. 2% w/v之間，最優(yōu)選約0. 05% w/v。哺乳動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員可以確定能增強膠原蛋白加工和沉積的其它細胞培養(yǎng)級和細胞相容性試劑。當細胞產(chǎn)生細胞匯合、并且培養(yǎng)基中補充了有助于基質(zhì)合成、分泌或組織的成分 時，據(jù)說細胞受到刺激，形成包含細胞和由所述細胞合成的基質(zhì)的組織_構(gòu)建物。因此，優(yōu)選的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基制劑包含包含Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基 (DMEM)(高葡萄糖制劑，無L-谷氨酰胺)的基礎(chǔ)，并補充有4mM L-谷氨酰胺或等同物、 5ng/ml表皮生長因子、Ojyg/ml氫化可的松、Ix ICT4M乙醇胺、Ix ICT4M ο-磷酰基-乙醇胺、5 μ g/ml胰島素、5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、20 P M三碘甲狀腺原氨酸、6. 78ng/ml硒、50ng/ ml L-抗壞血酸、0.2 μ g/ml L-脯氨酸和0. 1 μ g/ml甘氨酸。在產(chǎn)生培養(yǎng)基中，可將其它 藥理學(xué)試劑添加到培養(yǎng)基中，以改變所分泌胞外基質(zhì)的性質(zhì)、數(shù)量或類型。這些試劑可包 括上調(diào)膠原蛋白轉(zhuǎn)錄的多肽生長因子、轉(zhuǎn)錄因子或無機鹽。多肽生長因子的實例包括轉(zhuǎn)化 生長因子-0 1(TGF-i3 1)和組織-纖溶酶原激活物(TPA)，這兩者已知都能上調(diào)膠原蛋白 合成。Raghow^Journal of Clinical Investigation, 79 1285-1288 (1987) ；Pardes 等，Journal of Investigative Dermatology, 100 549 (1993) 刺激膠原蛋白產(chǎn)生的無 機鹽的實例是鈰。Shivakumar 等，Journal of Molecular 和 Cellular Cardiology 24: 775-780(1992)。II .細胞類型用于本發(fā)明的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型可以是能產(chǎn)生和分泌胞外基質(zhì)組件并組織 胞外基質(zhì)組件，以形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物的任何細胞類型。多于一種胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型 可經(jīng)培養(yǎng)形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物。不同細胞類型或組織來源的細胞可以作為混合物一起培 養(yǎng)，以產(chǎn)生類似于其天然組織中存在的那些的互補組件和結(jié)構(gòu)。例如，胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類 型可具有與其混合的其它細胞類型，以產(chǎn)生并非由第一細胞類型正常產(chǎn)生的一定量的胞外 基質(zhì)。或者，胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型也可與其它細胞類型混合，所述其它細胞類型在組織中 形成特化組織結(jié)構(gòu)，但基本上無助于細胞基質(zhì)構(gòu)建物(例如本發(fā)明的某些皮膚構(gòu)建物)的 基質(zhì)方面的總體形成。盡管任何胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞類型都可用于本發(fā)明，但是用于本發(fā)明的優(yōu)選細胞類 型是源自間充質(zhì)。更優(yōu)選的細胞類型是成纖維細胞、基質(zhì)細胞和其它支持性結(jié)締組織細胞， 最優(yōu)選人真皮中存在的人真皮成纖維細胞，用于產(chǎn)生人真皮構(gòu)建物。成纖維細胞通常產(chǎn)生 大量的胞外基質(zhì)蛋白，主要是膠原蛋白。有幾種類型的膠原蛋白是由成纖維細胞產(chǎn)生，然 而，I型膠原蛋白在體內(nèi)最普遍。人成纖維細胞株可源自多種來源，包括但不限于男性新生 兒包皮、真皮、腱、肺、臍帶、軟骨、尿道、角膜基質(zhì)、口腔粘膜和腸。人細胞可包括但不限于成 纖維細胞，但可包括平滑肌細胞、軟骨細胞和間葉細胞來源的其它結(jié)締組織細胞。優(yōu)選， 但并非需要的是，用于產(chǎn)生組織構(gòu)建物的基質(zhì)產(chǎn)生細胞的來源可源自類似或模擬的組織類 型，在使用本發(fā)明的培養(yǎng)方法之后。盡管不希望受到理論的束縛，真皮成纖維細胞(例如源 自新生兒成纖維細胞的那些)對于大多數(shù)機體組織而言具有廣泛應(yīng)用。新生兒真皮成纖維 細胞的益處在于，據(jù)信它們具有可塑性，意味著它們能轉(zhuǎn)分化；對低氧環(huán)境而言是理想的； 并且，據(jù)信是安全的、生物相容的和免疫豁免的，因為不會誘導(dǎo)受試者的排斥反應(yīng)。在另一 個優(yōu)選的實施方案中，通過顯微解剖術(shù)從毛囊的真皮乳突中分離出的成纖維細胞，可用于 單獨或與其它成纖維細胞聯(lián)合產(chǎn)生基質(zhì)。在產(chǎn)生角膜構(gòu)建物的實施方案中，基質(zhì)產(chǎn)生細胞 是源自角膜基質(zhì)。細胞供體的發(fā)育和年齡可以不同。細胞可源自胚胎、新生兒或年齡更大 個體(包括成體)的供體組織。胚胎祖細胞例如間葉干細胞可用于本發(fā)明并誘導(dǎo)分化和發(fā) 育成為所需組織。盡管人細胞優(yōu)選用于本發(fā)明，但是用于本發(fā)明方法的細胞不限于人來源的細胞。 可使用來自其它哺乳動物物種的細胞，所述動物物種包括但不限于馬、犬、豬、牛和綿羊來 源；或嚙齒類物種例如小鼠或大鼠。另外，為自發(fā)的、化學(xué)或病毒轉(zhuǎn)染的或重組的細胞或基 因工程細胞的細胞也可用于本發(fā)明。對于結(jié)合多于一種細胞類型的那些實施方案而言，可使用來自兩種或更多種來源的正常細胞的嵌合混合物，例如自體細胞和同種異體細胞的嵌 合混合物；正常細胞和基因修飾細胞或轉(zhuǎn)染細胞的混合物；源自不同組織或器官類型的細 胞混合物；或者，兩種或更多種物種或組織來源的細胞混合物。重組細胞或基因工程細胞可用于產(chǎn)生細胞基質(zhì)構(gòu)建物，以創(chuàng)建作為藥物遞送移植 物的組織構(gòu)建物，用于需要增加天然細胞產(chǎn)物水平或用治療藥進行處理的受試者。在一段 連續(xù)時間內(nèi)或當因受試者中存在的條件而轉(zhuǎn)導(dǎo)生物信號、化學(xué)信號或熱信號需要時，通過 移植重組細胞產(chǎn)物、生長因子、激素、肽或蛋白質(zhì)，細胞可產(chǎn)生并遞送給受試者。長期或短期 基因產(chǎn)物表達都是需要的，取決于培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的使用指征。當植入培養(yǎng)的組織構(gòu)建 物以便在延長的時間內(nèi)將治療性產(chǎn)物遞送給受試者時，需要長期表達。相反，當將培養(yǎng)的組 織構(gòu)建物植入具有創(chuàng)傷的受試者時，則需要短期表達，其中培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的細胞促進 正常的或接近正常的愈合或減少創(chuàng)傷部位的疤痕。一旦創(chuàng)傷愈合，在其部位就不再需要或 者可能不再需要來自培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的基因產(chǎn)物。細胞也可經(jīng)基因工程化以表達蛋白質(zhì) 或不同類型的胞外基質(zhì)組件，所述組件或者是“正常的”但是高水平表達或者是經(jīng)某種方式 修飾，以制成包含胞外基質(zhì)和活細胞的移植物裝置，所述裝置對于改善傷口愈合、促進或指 導(dǎo)新血管形成或者縮小瘢痕或瘢痕疙瘩形成具有治療優(yōu)勢。這些方法通常是本領(lǐng)域已知 的，描述于以下文獻Sambrook^Molecular CloninR,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY(1989)，其通過引用結(jié)合到本文中。所有上述細胞 類型都包括在本發(fā)明所用的“基質(zhì)產(chǎn)生細胞”的定義之內(nèi)。由成纖維細胞產(chǎn)生的占優(yōu)勢的主要胞外基質(zhì)組件是原纖維狀膠原蛋白，尤其是膠 原蛋白I型。原纖維狀膠原蛋白是細胞-基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組件；然而，本發(fā)明并不限于僅 包含該蛋白或蛋白類型的基質(zhì)。例如，可通過使用合適細胞類型來產(chǎn)生其它膠原蛋白，即來 自膠原蛋白家族的原纖維狀膠原蛋白和非原纖維狀膠原蛋白，例如膠原蛋白II型、III型、 IV 型、V 型、VI 型、VII 型、VIII 型、IX 型、X 型、XI 型、XII 型、XIII 型、XIV 型、XV 型、XVI 型、XVII型、XVIII型、XIX型和可鑒定的其它膠原蛋白。類似的，可用現(xiàn)有方法產(chǎn)生和沉積 的其它基質(zhì)蛋白包括但不限于彈性蛋白；蛋白聚糖，例如核心蛋白聚糖或雙糖鏈蛋白聚糖； 或糖蛋白，例如生腱蛋白；玻連蛋白；纖連蛋白；層粘連蛋白、凝血酶敏感蛋白I和糖胺聚糖 (GAG)例如透明質(zhì)酸(HA)。因為上述細胞類型可用于產(chǎn)生本發(fā)明的細胞-基質(zhì)，它們也可通過本發(fā)明的細 胞-基質(zhì)組合物來遞送，其中將活的、失活的或脫細胞的形式的一種或多種細胞-基質(zhì)片制 備成為細胞遞送裝置?？蛇f送這些細胞類型，使本發(fā)明的細胞-基質(zhì)接觸到需要功能性細 胞或細胞產(chǎn)物的受試者的部位。因為本發(fā)明的細胞-基質(zhì)組合物包括膠原蛋白，而膠原蛋 白是細胞粘附的天然底物，所以這些細胞將會天然地粘附到細胞-基質(zhì)組合物上。因為細 胞-基質(zhì)組合物也是可以操縱的，所以它允許遞送細胞并起到將細胞保持在遞送部位局部 的手段。III.培養(yǎng)條件和方法用于產(chǎn)生細胞-基質(zhì)層的系統(tǒng)可以是靜態(tài)的，或者可使用向培養(yǎng)基灌注的方式， 以便向形成中的細胞-基質(zhì)層施加機械力，以模擬體內(nèi)的力。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，施用合適的 刺激可產(chǎn)生期望的特性，例如增加強度。在靜態(tài)系統(tǒng)中，培養(yǎng)基是靜止和相對不動的，與培 養(yǎng)基處于運動中的灌注系統(tǒng)正好相反。培養(yǎng)基灌注會影響細胞活力并增強基質(zhì)層的發(fā)育。灌注方式包括但不限于在培養(yǎng)皿底部(下)或含有培養(yǎng)膜的底物載體附近使用磁力攪拌 棒或機械攪拌漿，以攪拌培養(yǎng)基；在培養(yǎng)皿或室內(nèi)或通過培養(yǎng)皿或室來泵送培養(yǎng)基；在振 搖或旋轉(zhuǎn)平臺上溫和攪拌培養(yǎng)皿；或旋轉(zhuǎn)，如果在旋轉(zhuǎn)瓶中制備時。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確 定其它灌注方式，用于本發(fā)明的方法?？赏ㄟ^在培養(yǎng)期間對多孔膜進行脈沖、扭曲、波曲或 拉伸而施加其它機械力。將培養(yǎng)物維持在培養(yǎng)箱中，確?？刂茰囟?、濕度和氣體混合物的足夠的環(huán)境條 件，用于培養(yǎng)細胞。優(yōu)選的條件介于約34°C至約38°C之間，更優(yōu)選37士 1°C，氣氛介于約 5-10士 CO2之間，相對濕度(Rh)介于約80-90%之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定 環(huán)境條件，所述條件可以是在上述環(huán)境條件之內(nèi)或之外，這取決于所培養(yǎng)的細胞或所進行 的培養(yǎng)步驟?？蓪⑴囵B(yǎng)物從這些條件下移至周圍室溫、空氣和濕度下，例如在飼養(yǎng)、接種額 外細胞或在進行不會損害培養(yǎng)物或其形成細胞-基質(zhì)片的能力的其它處理期間。在優(yōu)選的實施方案中，細胞基質(zhì)構(gòu)建物是由真皮成纖維細胞及其所分泌的基質(zhì)形 成的真皮構(gòu)建物。優(yōu)選，所使用的人真皮成纖維細胞是源自真皮的原代細胞或者更優(yōu)選來 自已建立的細胞貯液或庫的連續(xù)傳代或繼代培養(yǎng)，所述細胞貯液或庫已經(jīng)經(jīng)過病毒和細菌 污染篩選并測定純度。細胞在生長培養(yǎng)基中在充分條件下培養(yǎng)，使其增殖到合適數(shù)量，用于 將細胞接種到培養(yǎng)底物，在培養(yǎng)底物上形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物?；蛘?，可將來自冷凍細胞貯液 的細胞直接接種到培養(yǎng)底物上。一旦達到充足的細胞數(shù)量，就收獲細胞并接種到合適的培養(yǎng)表面并在合適的生長 條件下培養(yǎng)，形成細胞匯合片。在優(yōu)選的實施方案中，將細胞接種在多孔膜上，讓其浸沒， 讓培養(yǎng)基通過孔接觸到細胞培養(yǎng)物下面和上面兩者，并且在細胞培養(yǎng)物的頂部表面以上接 觸。優(yōu)選，將細胞懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基中并接種在細胞培養(yǎng)物表面，其密度介于 約Ix IO5細胞/cm2至約6. 6x IO5細胞/cm2之間，更優(yōu)選介于約3x IO5細胞/cm2至約6. 6x IO5細胞/cm2之間，和最優(yōu)選為約6. 6xl05細胞/cm2 (細胞/平方厘米表面積)。將培養(yǎng)物在 生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以建立培養(yǎng)物并培養(yǎng)至介于約80%至100%之間匯合，此時，通過將培 養(yǎng)基改換為基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基而對其進行化學(xué)誘導(dǎo)，以便上調(diào)胞外基質(zhì)的合成和分泌。在一 個替代方法中，以至少80%匯合，將細胞直接接種在基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基中，從而無需將基礎(chǔ)培 養(yǎng)基改換為產(chǎn)生培養(yǎng)基，但是該方法需要更高接種密度。更高接種密度達到超匯合水平，意 味著細胞以超過100 %匯合，最高至約900 %匯合的水平接種，包括范圍約300 %至約600 % 匯合。當以超匯合接種時，在膜上培養(yǎng)細胞的生長期被繞過并將細胞接種在基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng) 基中，以便在接種之時就開始產(chǎn)生基質(zhì)。在培養(yǎng)期間，成纖維細胞分泌內(nèi)源基質(zhì)分子并組織所分泌的基質(zhì)分子，形成三維 組織樣結(jié)構(gòu)，但不表現(xiàn)出顯著收縮力，所述收縮力能使形成中的細胞基質(zhì)構(gòu)建物收縮并從 培養(yǎng)底物上剝落下來。每隔2-3天用新鮮的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基來更換培養(yǎng)基，隨時間推移， 所分泌的基質(zhì)厚度增加并形成組織。創(chuàng)建細胞基質(zhì)構(gòu)建物所需的時間依賴于開始接種的密 度、細胞類型、細胞系的年齡以及細胞系合成和分泌基質(zhì)組件的能力。當完全形成時，本發(fā) 明的細胞基質(zhì)構(gòu)建物具有松散的厚度，因為由細胞產(chǎn)生并組織成纖維狀基質(zhì)；它們并非是 普通的匯合或過度匯合的細胞培養(yǎng)物，其中細胞可以是彼此松散粘合。纖維狀特性使得構(gòu) 建物粘合組織樣特性不象通常的培養(yǎng)物那樣，因為它們在臨床設(shè)置的常規(guī)處置中能抵抗物 理損傷，例如撕扯或開裂。在制備來自真皮成纖維細胞的培養(yǎng)的細胞_基質(zhì)片、以形成真皮構(gòu)建物的過程中，細胞將會在細胞培養(yǎng)物表面、在其周圍形成有組織的基質(zhì)，優(yōu)選其厚度至 少約30微米或更厚，更優(yōu)選介于約60至約120微米之間厚，跨越膜表面；然而，已經(jīng)得到超 過120微米的厚度并適合用于試驗或臨床應(yīng)用，其中需要這類更大的厚度。VI.培養(yǎng)底物在適合動物細胞或組織培養(yǎng)的容器例如培養(yǎng)皿、瓶或轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生細胞， 所述容器允許形成三維組織樣結(jié)構(gòu)。細胞可以在其上生長的合適的細胞生長表面可以是任 何生物相容性材料，細胞可粘附在所述材料上并提供錨定方式，用于細胞基質(zhì)構(gòu)建物的形 成。例如玻璃；不銹鋼；聚合物，包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏二乙烯、聚二甲基 硅氧烷、含氟聚合物和氟化乙烯丙烯；和硅基體，包括熔融石英、多晶硅或硅晶體的材料，都 可用作細胞生長表面。細胞生長表面材料可以經(jīng)過化學(xué)處理或改性、帶有靜電荷或用生物 物質(zhì)例如聚-1-賴氨酸或肽涂覆。肽涂料的實例是RGD肽。盡管本發(fā)明的組織構(gòu)建物可生長在固體細胞生長表面，但是優(yōu)選具有孔的細胞生 長表面，所述孔與膜的頂表面和底表面溝通，允許培養(yǎng)基接觸發(fā)育中的組織構(gòu)建物的兩側(cè) 或用于僅在培養(yǎng)物下面接觸。兩側(cè)接觸允許培養(yǎng)基接觸發(fā)育中的基于細胞-基質(zhì)的構(gòu)建物 的上下表面兩者，從而使最大表面積暴露給培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)。在培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建物的發(fā) 育期間，培養(yǎng)基也可僅接觸形成中的培養(yǎng)組織構(gòu)建物的底部，以便頂表面可暴露在空氣中。 優(yōu)選的培養(yǎng)容器是利用載體或培養(yǎng)插入物的一種容器，所述培養(yǎng)插入物是一種經(jīng)培養(yǎng)基處 理的可滲透元件，例如懸浮在含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中的多孔膜。通常，該膜可固定在管狀 元件的一端或框架上，插入其內(nèi)并與基礎(chǔ)例如Petri皿或培養(yǎng)皿界面連接，并可蓋上蓋子。 培養(yǎng)容器加入具有多孔膜的載體插入物是本領(lǐng)域已知的，并優(yōu)選用于實施本發(fā)明，描述于 本領(lǐng)域的大量美國專利，其中有些是市售的，包括例如5, 766，937,5, 466，602,5, 366，893、 5，358，871,5, 215，920,5, 026，649,4, 871，674,4, 608，342，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本 文中。當使用這些類型的培養(yǎng)容器時，組織-構(gòu)建物在膜的一個表面(優(yōu)選在頂部、向上的 表面)上產(chǎn)生，并且細胞培養(yǎng)基在頂表面、底表面兩者接觸培養(yǎng)物。生長表面的孔允許培養(yǎng) 基通過，從而通過膜而向培養(yǎng)物的下側(cè)提供營養(yǎng)，因此允許細胞從兩側(cè)或僅從底側(cè)得以飼 養(yǎng)。優(yōu)選的孔徑足夠小而不允許細胞生長通過膜，但又足夠大而允許培養(yǎng)基所含營養(yǎng)自由 通過，到達細胞基質(zhì)構(gòu)建物的底表面，例如通過毛細管作用。優(yōu)選的孔徑大小為約小于3微 米，但可使用孔徑的范圍介于約0. 1微米至約3微米之間，更優(yōu)選介于約0. 2微米至約1微 米之間和最優(yōu)選約0. 4微米至約0. 6微米之間。在人真皮成纖維細胞的情況下，最優(yōu)選的 材料是孔徑介于約0. 4至約0. 6微米之間的聚碳酸酯。最大孔徑不僅取決于細胞大小，而 且取決于細胞改變其形狀并穿過膜的能力。重要的是，組織樣構(gòu)建物粘附在表面上，但不結(jié) 合或包裹底物，所以可以從上面取下來，例如通過用最小力剝離下來。所形成的組織構(gòu)建物 的大小和形狀是由它所生長的容器表面或膜的大小而定。底物可以是圓形、方形、矩形或角 形或者具有圓形頂角的形狀或不規(guī)則形狀。底物也可以是扁平的或波形的，作為模子，產(chǎn)生 成形的構(gòu)建物，以便與創(chuàng)傷界面連接或模擬天然組織的物理結(jié)構(gòu)。為了得到更大表面積的 生長底物，按照比例，將更多細胞接種到表面并需要更大體積的培養(yǎng)基，以充分浸泡和滋養(yǎng) 細胞。當基于細胞-基質(zhì)的組織構(gòu)建物最終形成時，可通過從膜底物上剝離而取下來，然后 移植給受試者。本發(fā)明的培養(yǎng)的細胞基質(zhì)構(gòu)建物并不依賴于合成的或生物可再吸收的元件(例如網(wǎng)狀元件(mesh member))的形成。網(wǎng)狀元件被組織成織造、編織或粘結(jié)的材料。在使用 網(wǎng)狀元件的系統(tǒng)中，將細胞培養(yǎng)在網(wǎng)狀元件上并生長在網(wǎng)的每一側(cè)和空隙中，將網(wǎng)包裹和 結(jié)合到培養(yǎng)的組織構(gòu)建物中。通過結(jié)合所述網(wǎng)的方法而形成的最終構(gòu)建物依靠它作為物理 支持并用于使其松散。依靠合成的網(wǎng)狀元件的培養(yǎng)組織構(gòu)建物的實例可參見Naughton等 的美國專利號 5，580，781,5, 443，950,5, 266，480,5, 032，508,4, 963，489。IV .化學(xué)改性本發(fā)明的細胞基質(zhì)構(gòu)建物或者是失活的(以終止細胞)或者是脫細胞的(以除去 細胞)，取決于它們在所處理受試者中的最終用途。或者可以在培養(yǎng)插入物的膜上使本發(fā)明的細胞-基質(zhì)失活或脫細胞，或者可先使 其從培養(yǎng)插入物的膜上脫去。因為培養(yǎng)插入物使細胞-基質(zhì)懸浮在培養(yǎng)皿上而允許兩側(cè)接 觸培養(yǎng)基，所以當使用化學(xué)失活劑或脫細胞劑來處理細胞-基質(zhì)時或者當細胞基質(zhì)構(gòu)建物 是用空氣、光或輻射干燥時，兩側(cè)接觸可被加強(leveraged)。將培養(yǎng)插入物從培養(yǎng)儀器中 方便地取出，可將其移入不同容器中，其中可讓其經(jīng)歷或接觸失活劑或脫細胞劑。使細胞-基質(zhì)中的細胞失活，是指終止、但不除去細胞，形成非活細胞-基質(zhì)?？墒?本發(fā)明的構(gòu)建物失活，換句話說，讓能產(chǎn)生內(nèi)源胞外基質(zhì)組件、以形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物的基 質(zhì)產(chǎn)生細胞終止。當細胞被終止時，它們?nèi)员Ａ粼谒鼈兯纬傻幕|(zhì)中。優(yōu)選保留細胞-基 質(zhì)完整性和結(jié)構(gòu)的失活劑和方法。在細胞基質(zhì)構(gòu)建物中使細胞失活的一個方法利用了使構(gòu)建物脫水或干燥，以除去 構(gòu)建物中所有或基本上所有的水分。除去水分的方式包括在空氣中脫水、冷凍或冷凍干燥。 為了通過風(fēng)干使構(gòu)建物脫水，將培養(yǎng)基從制備細胞基質(zhì)構(gòu)建物的容器中移出，簡單地讓細 胞基質(zhì)構(gòu)建物脫水，其脫水時間足以讓細胞死亡。脫水條件因溫度和相對濕度不同而異。 在細胞基質(zhì)構(gòu)建物中，優(yōu)選的脫水溫度范圍從冷凍溫度以上到膠原蛋白的變性溫度(經(jīng)差 示掃描量熱法或”DSC”測量)，例如，介于約0°C至約60°C之間。更優(yōu)選的脫水溫度是周圍 室溫，約18°C至約22°C。優(yōu)選較低的相對濕度值，范圍為約0%至約60% ；然而，也優(yōu)選介 于約10% Rh至約40% Rh之間的相當于室內(nèi)濕度的相對濕度。當在周圍室溫和濕度下通 過風(fēng)干進行脫水時，細胞基質(zhì)構(gòu)建物將會具有約10%至約40% w/w水分或更低。因此，當 風(fēng)干本發(fā)明的細胞基質(zhì)構(gòu)建物時，在某種水平上仍保留了水分。為了冷凍干燥構(gòu)建物，也稱 為“凍干”，將細胞-基質(zhì)冷凍，然后放在真空環(huán)境下，去除水分。凍干技術(shù)可用于本發(fā)明所 公開的構(gòu)建物，使得構(gòu)建物內(nèi)多種生長因子的生物活性不間斷地得以保留。一方面，可直接 將一層細胞基質(zhì)構(gòu)建物從培養(yǎng)物中取下并于-80°C冷凍，然后凍干過夜，例如在約6至約15 小時或更長時間內(nèi)。另一方面，可先將一層細胞基質(zhì)構(gòu)建物風(fēng)干約8小時，然后在-80°C冷 凍，再凍干過夜，例如在約6至約15小時或更長時間內(nèi)。在周圍環(huán)境條件下干燥或凍干之后，細胞-基質(zhì)失活但仍保留失活細胞和細胞殘 余物。凍干也可賦予不同于在周圍環(huán)境條件下脫水所致的特性。這類特性，在一個實施方 案中，表現(xiàn)為更多孔和開放的纖維狀基質(zhì)結(jié)構(gòu)。也可采用化學(xué)方法使細胞基質(zhì)構(gòu)建物中的細胞失活。可利用水，用滲透壓來終止 細胞。將細胞基質(zhì)構(gòu)建物浸泡在無菌的純水中，其浸泡時間足以允許低滲膨脹而導(dǎo)致細胞 裂解。當細胞裂解后，細胞-基質(zhì)失活，但仍保留失活細胞和細胞殘余物。當使用水時，也 可混合其它物質(zhì)，例如過乙酸或過氧化氫、或鹽或其組合。例如，可使用介于約0. 05%至約3% ν/ν之間的過乙酸/水的失活溶液。也可使該失活劑緩沖或使其含有高鹽濃度，以防止 在終止細胞時，細胞基質(zhì)過度膨脹。有機溶劑和有機溶劑溶液可用作本發(fā)明的失活劑。有機溶劑能夠置換待終止的細 胞基質(zhì)構(gòu)建物中的水，因此使細胞_基質(zhì)中的細胞失活。優(yōu)選，用于除去水的有機溶劑是當 從構(gòu)建物中除去時不留殘留物的有機溶劑。優(yōu)選的有機溶劑包括醇類，例如乙醇、甲醇和異 丙醇；或丙酮。為了說明的目的，將細胞基質(zhì)構(gòu)建物浸泡在無菌乙醇中，其浸泡時間足以置 換細胞基質(zhì)構(gòu)建物中的水并使細胞失活。然后從乙醇中取出細胞基質(zhì)構(gòu)建物，再暴露在空 氣中，其暴露時間足以讓細胞基質(zhì)構(gòu)建物中所吸收的乙醇蒸發(fā)掉。溶劑蒸發(fā)之后，細胞-基 質(zhì)失活，但仍保留失活細胞和細胞殘余物，并且細胞_基質(zhì)已脫水。使細胞失活的其它方式包括讓細胞基質(zhì)構(gòu)建物經(jīng)歷紫外光或Y輻射。這些方式 可與用水使細胞基質(zhì)構(gòu)建物低滲膨脹的方式、或其它化學(xué)失活方式或用空氣和冷凍失活方 式聯(lián)用。使本發(fā)明的細胞-基質(zhì)脫細胞，是指從細胞-基質(zhì)中除去細胞，使細胞、細胞殘余 物從細胞-基質(zhì)中除去，得到胞外基質(zhì)，所述胞外基質(zhì)不含產(chǎn)生胞外基質(zhì)的細胞?？墒贡?發(fā)明的細胞基質(zhì)構(gòu)建物脫細胞，換句話說，讓能產(chǎn)生內(nèi)源胞外基質(zhì)組件、以形成細胞基質(zhì)構(gòu) 建物的基質(zhì)產(chǎn)生細胞從細胞_基質(zhì)中除去。當細胞被除去時，由培養(yǎng)細胞內(nèi)源產(chǎn)生的細 胞_基質(zhì)現(xiàn)在仍然存在，但形成它們的那些細胞則不存在。使本發(fā)明的細胞基質(zhì)構(gòu)建物脫 細胞的一個優(yōu)選的方法采用了一系列化學(xué)處理，以除去細胞、細胞殘余物和殘留的細胞DNA 和RNA。使用使細胞基質(zhì)構(gòu)建物脫細胞的試劑和方法，其它非膠原蛋白性和非彈性蛋白性胞 外基質(zhì)組件也可被除去或減少，例如糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、脂質(zhì)和其它非膠原蛋白 性蛋白質(zhì)。將細胞和非膠原蛋白性和非彈性蛋白性組件從細胞-基質(zhì)中除去，得到無細胞 的并包含所有或基本上所有膠原蛋白和少量彈性蛋白的細胞-基質(zhì)。細胞基質(zhì)構(gòu)建物先經(jīng)過處理，即通過使其與有效量的螯合劑(優(yōu)選生理堿)接觸， 以便可控地限制細胞_基質(zhì)的膨脹。螯合劑通過降低二價陽離子濃度，而有助于將細胞、細 胞碎片和基底膜結(jié)構(gòu)從基質(zhì)中除去。堿處理使糖蛋白和糖胺聚糖從膠原蛋白性組織中離解 并使脂質(zhì)皂化。本領(lǐng)域已知可使用的螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇 雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylenebis (oxyethylenitrilo) tetraacetic acid，EGTA)。 EDTA是優(yōu)選的螯合劑，并且可通過添加氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鈣(Ca(OH) 2)、碳酸鈉或過 氧化鈉，而使其堿性更強。EDTA或EGTA濃度優(yōu)選介于約1至約200mM之間；更優(yōu)選介于約 50至約150mM之間；最優(yōu)選約100mM。NaOH濃度優(yōu)選介于約0. 001至約IM之間；更優(yōu)選介 于約0. 001至約0. IOM之間；最優(yōu)選約0. OlM0其它堿或堿性試劑可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確 定，以使螯合溶液的PH在有效堿性pH范圍之內(nèi)。堿性螯合溶液的最終pH應(yīng)當優(yōu)選介于約 8和約12之間，但更優(yōu)選介于約11. 1至約11. 8之間。在最優(yōu)選的實施方案中，將細胞-基 質(zhì)與IOOmM EDTA/lOmM NaOH水溶液接觸。細胞-基質(zhì)優(yōu)選通過浸泡在堿性螯合劑中進行 接觸，而更有效的處理優(yōu)選通過將構(gòu)建物和溶液一起溫和攪拌一段時間，用于使處理步驟 更有效。然后將細胞-基質(zhì)與有效量的酸性溶液(優(yōu)選含有鹽)接觸。酸處理在糖蛋白 和糖胺聚糖的去除以及非膠原蛋白性蛋白質(zhì)和核酸(例如DNA和RNA)的去除中也有作 用。鹽處理控制酸處理期間的膠原蛋白性基質(zhì)膨脹并涉及將某些糖蛋白和蛋白聚糖從膠原蛋白性基質(zhì)中去除。本領(lǐng)域已知的酸溶液都可使用并且包括但不限于鹽酸(HCl)、乙酸 (CH3COOH)和硫酸(H2SO4)。優(yōu)選的酸是鹽酸(HCl)，其濃度優(yōu)選介于約0. 5至約2M之間，更 優(yōu)選介于約0. 75至約1. 25M之間；最優(yōu)選約1M。酸/鹽溶液的最終pH優(yōu)選介于約0至約 1，更優(yōu)選介于約0和0. 75之間，和最優(yōu)選介于約0. 1至約0. 5之間。鹽酸和其它強酸對破 壞核酸分子而言最有效，而弱酸效果較差?？墒褂玫柠}優(yōu)選是無機鹽，包括但不限于氯化物 鹽例如氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)和氯化鉀(KCl)，而其它有效的鹽可由本領(lǐng)域技術(shù)人 員來確定。優(yōu)選，氯化物鹽的使用濃度優(yōu)選介于約0. 1至約2M之間；更優(yōu)選介于約0. 75至 約1. 25M之間；最優(yōu)選約1M。用于所述方法的優(yōu)選的氯化物鹽是氯化鈉(NaCl)。在最優(yōu)選 的實施方案中，將細胞-基質(zhì)與IM HC1/1M NaCl水溶液接觸。細胞-基質(zhì)的接觸優(yōu)選通過 浸泡在酸/鹽溶液中，優(yōu)選通過將構(gòu)建物和溶液一起溫和攪拌一段時間，用于使處理步驟 更有效，從而達到有效的處理。然后將細胞_基質(zhì)與有效量的鹽溶液接觸，所述鹽溶液優(yōu)選緩沖至約生理pH。緩 沖鹽溶液中和材料同時減少膨脹?？梢允褂玫柠}優(yōu)選是無機鹽和包括但不限于氯化物鹽例 如氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)和氯化鉀(KCl)；和含氮鹽例如硫酸銨(NH3SO4)，而其它 有效鹽可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。優(yōu)選氯化物鹽的使用濃度優(yōu)選介于約0. 1至約2M之 間；更優(yōu)選介于約0. 75至約1. 25M之間；最優(yōu)選約IM0用于所述方法的優(yōu)選的氯化物鹽是 氯化鈉(NaCl)。緩沖劑是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于磷酸鹽溶液和硼酸鹽溶液，而其它則 可由技術(shù)人員確定用于所述方法。使鹽溶液緩沖的一個優(yōu)選的方法是向所述鹽溶液中添加 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，優(yōu)選其中磷酸鹽濃度為約0. 001至約0. 02M,鹽濃度為約0. 07至約 0. 3M。用于所述溶液的優(yōu)選的pH介于約5至約9之間，更優(yōu)選介于約7至約8之間，最優(yōu) 選介于約7. 4至約7. 6之間。在最優(yōu)選的實施方案中，使組織接觸IM氯化鈉(NaCl)/IOmM 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，其pH介于約7.0至約7. 6之間。細胞-基質(zhì)的接觸優(yōu)選通過浸泡 在緩沖鹽溶液中，通過將組織和溶液一起溫和攪拌一段時間，用于使處理步驟更有效，從而 達到有效的處理?；瘜W(xué)凈化處理之后，然后優(yōu)選清洗細胞_基質(zhì)，即通過將其與有效量的清洗劑接 觸，使其不含化學(xué)凈化劑。例如水、等滲鹽溶液和生理PH的緩沖液的試劑都可使用，使其與 細胞-基質(zhì)接觸一段時間，接觸時間足以去除凈化劑。優(yōu)選的清洗溶液是生理PH緩沖鹽水， 例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。用于清洗含有化學(xué)凈化劑的細胞-基質(zhì)的其它方式可由本領(lǐng) 域技術(shù)人員來確定?？梢园凑杖魏雾樞?，進行用堿性螯合劑接觸細胞_基質(zhì)和用含鹽的酸 溶液接觸細胞-基質(zhì)的凈化步驟，以達到基本相同的凈化效果。然而，各溶液可以不混合并 作為單一步驟來進行。使細胞基質(zhì)構(gòu)建物脫細胞的結(jié)果是，使由培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的內(nèi)源產(chǎn)生的膠原蛋白性 基質(zhì)脫去其產(chǎn)生的細胞。使細胞基質(zhì)構(gòu)建物脫細胞的進一步結(jié)果是，使由培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的 內(nèi)源產(chǎn)生的膠原蛋白性基質(zhì)脫去其產(chǎn)生的細胞，并且除去或減少非膠原蛋白性和非彈性蛋 白性胞外基質(zhì)組件。在某些實施方案中，可先使細胞基質(zhì)構(gòu)建物失活，以終止細胞，然后脫細胞，以除 去失活細胞。失活或脫細胞的細胞基質(zhì)構(gòu)建物可以按其現(xiàn)有狀態(tài)來使用，但也可進一步對它們 進行如下修飾即經(jīng)過化學(xué)處理、物理處理、添加其它物質(zhì)，例如藥物、生長因子、培養(yǎng)細胞、其它天然的、生物合成的、聚合物來源的基質(zhì)組件，并且它們可以與醫(yī)療器械(例如支架和 封合器(closure devices))聯(lián)合用于治療心臟的卵圓孔未閉合缺陷。交聯(lián)。使用交聯(lián)劑可使脫細胞的或失活的細胞-基質(zhì)交聯(lián)，以控制其生物重塑率 并增加其持久性，當植入或移入活體內(nèi)時。它可經(jīng)交聯(lián)并用作單層構(gòu)建物或者它可經(jīng)結(jié)合 或操縱，以創(chuàng)建不同類型的構(gòu)建物。本發(fā)明的交聯(lián)方法也提供用于將細胞-基質(zhì)片或其部 分結(jié)合在一起的方法。細胞-基質(zhì)優(yōu)選呈平片結(jié)構(gòu)(planar sheet structure)，其可用于制備各種類型 的細胞基質(zhì)構(gòu)建物，用作假體，假體的形狀最終取決于其預(yù)定用途。為了形成本發(fā)明的假 體，應(yīng)當制備失活或脫細胞的細胞-基質(zhì)片，采用既能保留基質(zhì)片的生物重塑性、又能增強 其強度和結(jié)構(gòu)性能的方法，以達到作為置換組織的性能。本發(fā)明的平片(flat sheet)構(gòu)建 物包含或者失活的或脫細胞的細胞_基質(zhì)片，或者失活的和脫細胞的基質(zhì)片(例如一種失 活細胞_基質(zhì)片和一種脫細胞的細胞_基質(zhì)片)，它們彼此層層接觸，并結(jié)合在一起。本發(fā) 明的管狀構(gòu)建物包含或者失活的或者脫細胞的基質(zhì)片，其將自身卷至讓其接觸自身的至少 最小程度。基質(zhì)片之間或基質(zhì)片與自身的接觸區(qū)是結(jié)合區(qū)。多層交聯(lián)的構(gòu)建物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的假體裝置具有兩個或更 多個疊合基質(zhì)片，其結(jié)合在一起形成平片構(gòu)建物。本文所用的“結(jié)合的膠原蛋白層”是指由 相同或不同來源的兩種或更多種細胞_基質(zhì)片組成或經(jīng)以下方式處理的剖面(profile)， 所述方式使各層彼此疊合并足以通過自身的層壓和化學(xué)鍵合而結(jié)合在一起。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及平片假體、以及制備和使用平片假體的方法，所 述平片假體包括結(jié)合和交聯(lián)的兩種或更多種基質(zhì)片。因為基質(zhì)片具有平片結(jié)構(gòu)，所以容易 制備包含任何層數(shù)的假體，優(yōu)選介于2-20層之間，更優(yōu)選介于2-10層之間，層數(shù)取決于構(gòu) 建物最終的預(yù)期用途所需的強度和體積?；蛘?，因為疊合排列的最終大小受基質(zhì)片大小的 限制，所以可以按照拼合排列方式交錯層疊，形成片狀構(gòu)建物，其表面積大于任何單一基質(zhì) 片的尺寸，但沒有跨越排列區(qū)的連續(xù)層。在包含基質(zhì)片的多層構(gòu)建物的制備過程中，優(yōu)選使用無菌環(huán)境和無菌工具，以維 持無菌性。為了形成基質(zhì)片的多層構(gòu)建物，鋪設(shè)第一無菌剛性支持元件，例如剛性聚碳酸酯 片。如果基質(zhì)片在失活或脫細胞過程后仍不呈水合狀態(tài)，讓它們在水溶液(例如水或磷酸 鹽緩沖鹽水)中水合。用無菌吸水布吸干基質(zhì)片，從材料上吸去過量水分。將第一基質(zhì)片 鋪在聚碳酸酯片上并用手將其抹平在聚碳酸酯片上，以除去任何氣泡、皺褶和折痕。將第二 基質(zhì)片鋪在第一片頂部，再次用手除去任何氣泡、皺褶和折痕。重復(fù)該鋪層過程，直到達到 具體應(yīng)用所需的層數(shù)。當所需層數(shù)的基質(zhì)片鋪層之后，再將它們一起脫水。盡管不希望受到理論的束縛， 脫水使胞外基質(zhì)組件例如膠原蛋白纖維的各層貼合在一起，當相鄰基質(zhì)片纖維之間的水分 被除去時?？墒垢鲗用撍蛘咴诘谝恢С衷穆睹婊蛘咴诘谝恢С衷c第二支持元 件(例如第二片聚碳酸酯)之間，后者在干燥之前放在頂層并固定在第一支持元件上，以保 持所有層都是平面排列在一起，采用或不采用壓縮。為了便于脫水，支持元件可以是多孔 的，允許空氣和水分通過，而使各層脫水。各層可以風(fēng)干、真空干燥或通過化學(xué)方式干燥，例 如通過丙酮或醇例如乙醇或異丙醇。風(fēng)干脫水可以在室內(nèi)濕度下進行，所述濕度介于約0% Rh至約60% Rh之間或更低；或約10%至約40% w/w水分或更低。脫水可以容易地進行，即通過在周圍室溫(約20°C )和室內(nèi)濕度下，將疊合基質(zhì)層懸掛在朝向?qū)恿髡值臒o菌氣流 達至少約1小時至24小時。通過真空或化學(xué)方式進行的脫水，將會使各層水分水平低于通 過風(fēng)干所達到的那些水平。在任選的步驟中，脫水層再水合，或者，再水合和再次脫水。如上所述，脫水使相鄰 基質(zhì)層的胞外基質(zhì)組件貼在一起并將這些層交聯(lián)在一起，在組件之間形成化學(xué)鍵，以使各 層結(jié)合。為了使各層再水合，將它們一起從多孔支持元件上剝離下來，在含水的再水合劑 (優(yōu)選水)中再水合，即通過在介于約4°C至約20°C的溫度之間，將它們轉(zhuǎn)移到裝有含水的 再水合劑的容器中，持續(xù)至少約10至約15分鐘，使各層再水合，而不將它們分離或分層。然 后將基質(zhì)層交聯(lián)在一起，即通過使層狀的基質(zhì)片與能維持基質(zhì)層生物重塑性的交聯(lián)劑優(yōu)選 化學(xué)交聯(lián)劑接觸。使結(jié)合的假體裝置交聯(lián)，也給裝置提供了強度和持久性，以改善操作性能。各種類 型的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域已知的，可使用例如碳二亞胺、京尼平、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、核糖和其它 糖類、去甲二氫化愈創(chuàng)木酸(NDGA)、氧化劑、紫外(UV)光和熱交聯(lián)(dehydrothermal，DHT) 方法。除了化學(xué)交聯(lián)劑之外，也可用生物相容的基于纖維蛋白的膠水或醫(yī)用級粘合劑(例 如聚氨酯、乙酸乙烯酯或聚環(huán)氧樹脂)將各層結(jié)合在一起。一種優(yōu)選的生物相容的粘合劑 是絲纖蛋白，也就是說將4-8%絲纖蛋白溶液分散在用甲醇活化的組織基質(zhì)的相鄰層之間 的結(jié)合區(qū)。生物相容的膠水或粘合劑可用于將交聯(lián)的各層或非交聯(lián)的各層或這兩者結(jié)合在 一起，形成本發(fā)明的生物工程構(gòu)建物。優(yōu)選的生物相容性粘合劑是絲纖蛋白，也就是說將約2-8%絲纖蛋白溶液分散在 組織基質(zhì)的相鄰層之間的結(jié)合區(qū)。一方面，使用生物相容性粘合生物材料，可將兩種或更多 種上述細胞基質(zhì)構(gòu)建物結(jié)合在一起。作為實例，絲纖蛋白溶液可得自家蠶(Bombyx mori), 其可經(jīng)加工而獲得無絲膠蛋白的化合物，其一方面可用作生物相容的絲粘合劑。家蠶主要 是由甘氨酸和丙氨酸重復(fù)序列組成，其在結(jié)構(gòu)中占優(yōu)勢。絲心蛋白鏈由兩種基本多肽序列 (結(jié)晶狀多肽和有序性較差的多肽)有規(guī)律地交替組成?！敖Y(jié)晶狀”多肽的基本序列是采用 β _片結(jié)構(gòu)的-(Ala-Gly)n-,而“有序性較差的”多肽含有額外氨基酸，具體地講，是酪氨酸、 纈氨酸和酸性及堿性氨基酸。可以理解，源自重組來源的絲纖蛋白可用于得到類似的生物 相容性粘合劑特性，用于實施本發(fā)明。簡而言之，一方面，將家蠶繭在含有0. 02Μ Na2CO3的水溶液中煮沸20_30分鐘。為 了提取膠水樣絲膠蛋白，再將蠶繭進行清洗。在一個實施方案中，在約60°C將提取的絲纖蛋 白溶于9. 3M溴化鋰(LiBr)溶液中，保持約4小時，得到20% (w/v)溶液。所得溶液再針對 蒸餾水透析，使用Slide-a-Lyzer透析盒(MWC0 3，500，Pierce)在室溫下透析48小時，以 除去鹽，然而，任何透析方法都包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。所得透析液一式兩份進行離心，各自 在-20°C離心20分鐘，以除去雜質(zhì)和透析步驟期間形成的聚集物。優(yōu)選的交聯(lián)劑是1-乙基-3-(3_ 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在另 一個優(yōu)選的方法中，按照以下文獻所述，將磺基-N-羥基琥珀酰亞胺加入到EDC交聯(lián)劑中 Staros, J. V.，Biochem. 21,3950-3955，1982。在最優(yōu)選的方法中，將EDC溶于水中，濃度優(yōu) 選介于約0. ImM至約IOOmM之間，更優(yōu)選介于約1. OmM至約IOmM之間，最優(yōu)選約1. OmM。除 了水之外，磷酸鹽緩沖鹽水或(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)(MES)緩沖液可用于溶解EDC。其它 試劑可加入到該溶液中，例如丙酮或醇，最多達99% ν/ν/水，通常50%，以使交聯(lián)更均勻和有效。這些試劑從各層中除去水，使基質(zhì)纖維貼在一起，促進這些纖維之間的交聯(lián)。交聯(lián)劑 中這些試劑與水的比例可用于調(diào)節(jié)交聯(lián)。在臨用前制備EDC交聯(lián)溶液，因為EDC將隨時間 而失去其活性。為了使交聯(lián)劑與基質(zhì)層接觸，將水合的結(jié)合基質(zhì)層移至容器例如淺盤中，將 交聯(lián)劑輕輕倒入該盤，確?；|(zhì)層被覆蓋和自由漂浮，在基質(zhì)層下或之間沒有氣泡存在。蓋 上容器，讓基質(zhì)層交聯(lián)約4至約24小時，更優(yōu)選8至約16小時，溫度介于約4°C至約20°C 之間?？捎脺囟葋碚{(diào)節(jié)交聯(lián)在較低溫度時，交聯(lián)更有效，因為反應(yīng)緩慢；在較高溫度時，交 聯(lián)效果較差，因為EDC穩(wěn)定性較差。交聯(lián)之后，輕輕倒出交聯(lián)劑并處理，然后通過用清洗劑接觸交聯(lián)的多層基質(zhì)構(gòu)建 物而清洗它們，以除去殘留交聯(lián)劑。優(yōu)選的清洗劑是水或其它含水溶液。優(yōu)選，通過用等體 積的無菌水接觸交聯(lián)的多層基質(zhì)構(gòu)建物達3次，每次清洗約5分鐘，從而達到充分清洗。管狀構(gòu)建物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的基質(zhì)構(gòu)建物是由單一、通常是 矩形的基質(zhì)片形成的管狀構(gòu)建物。將基質(zhì)片卷起來，使一邊接觸并重疊相反的一邊。重疊 起到結(jié)合區(qū)的作用。根據(jù)其指定用途，由基質(zhì)片形成的管狀構(gòu)建物可以制備成各種直徑、長 度和層數(shù)，并且可以結(jié)合其它組件。為了形成管狀構(gòu)建物，選擇心軸，其直徑測量將決定所形成的構(gòu)建物的直徑。心軸 優(yōu)選是圓筒狀或卵形截面，并由玻璃、不銹鋼或無反應(yīng)性醫(yī)用級組合物制成。心軸可以是直 的、彎曲的、有角度的，它可以具有分枝或分叉或具有多種這些特性。待形成的管狀構(gòu)建物 的層數(shù)與基質(zhì)片卷繞心軸和其自身的次數(shù)是一致的。基質(zhì)片可卷繞的次數(shù)取決于所加工基 質(zhì)片的尺寸。對于兩層管狀構(gòu)建物，基質(zhì)片的寬度必須足以讓該片在心軸上卷繞至少2次。 可優(yōu)選，寬度足以讓該片在心軸上卷繞所需次數(shù)并有額外更多的重疊百分率，其介于心軸 圓周長的約5%至約20%之間，以固定結(jié)合區(qū)并確保接縫緊密。類似的，心軸長度將決定其 上能形成的管長度。為了便于在心軸上操作構(gòu)建物，心軸應(yīng)當比構(gòu)建物的長度更長，使得心 軸、而非所形成的構(gòu)建物，在操作時被接觸。優(yōu)選，心軸提供有套筒形式的無反應(yīng)、醫(yī)用級品質(zhì)的、彈性橡膠或乳膠材料的覆蓋 物。盡管可在心軸表面上直接形成管狀基質(zhì)片構(gòu)建物，但套筒便于將所形成的管從心軸上 取下而不會與其粘連、反應(yīng)或在基質(zhì)片上留下殘余物。為了取下所形成的構(gòu)建物，可將套筒 從心軸的一端拉下來，以攜帶構(gòu)建物與其一起從心軸上拉下來。因為基質(zhì)片僅稍微粘連在 套筒上并與其它基質(zhì)片粘連得更緊密，由基質(zhì)片制備管是便利的，因為管狀構(gòu)建物可從心 軸取下，而不會拉伸或?qū)?gòu)建物產(chǎn)生其它應(yīng)力和有風(fēng)險的損壞。在最優(yōu)選的實施方案中，套 筒包含KRATON (Shell Chemical Company)，即一種由苯乙烯-乙烯/ 丁烯-苯乙烯 共聚物組成的熱塑性橡膠，其具有非常穩(wěn)定的飽和中嵌段。為了簡單說明，在直徑約4mm的心軸上形成直徑4mm并有10%重疊的2層管狀構(gòu) 建物。心軸提供有KRATON 套筒，其長度約與心軸等長，但比在其上形成的構(gòu)建物長。 修剪基質(zhì)片，使寬度尺寸為約28mm，長度尺寸因構(gòu)建物所需長度而異。在層流罩的無菌環(huán)境 中，通過以下方法，使基質(zhì)片形成管。基質(zhì)片沿著一邊潤濕，并與套筒覆蓋的心軸對齊，增強 基質(zhì)片的粘合性質(zhì)，其沿著套筒覆蓋的心軸長度標記(flagged)，并在適當?shù)奈恢酶稍镏辽?10分鐘或更多時間。然后使標記的基質(zhì)片水合并卷繞在心軸上，然后卷繞自身一整圈再加 10%的圓周長，共110%重疊，以起到結(jié)合區(qū)的作用并提供緊密接縫。為了形成單層管狀構(gòu)建物，基質(zhì)片必須能夠在心軸上卷繞一整圈并且有至少約5%額外卷繞作為重疊以提供結(jié)合區(qū)，也就是說等于構(gòu)建物圓周長的約5%。對于2層構(gòu)建 物，基質(zhì)片必須能夠在心軸上卷繞至少2圈并且優(yōu)選有額外的5%至20%卷繞作為重疊。 盡管2層卷繞在基質(zhì)片表面之間提供了 100%的結(jié)合區(qū)，但是額外的重疊率確保緊密而不 滲透的接縫。對于3層構(gòu)建物，基質(zhì)片必須能夠在心軸上卷繞至少3次。可制備任何層數(shù) (由基質(zhì)片的尺寸來限定)和所需規(guī)格的構(gòu)建物。通常，管狀構(gòu)建物將具有10層或以下，例 如2-6層或者2層和3層之間，其具有不同的重疊程度。卷繞之后，將材料下和各層間的任 何氣泡、皺褶和折痕都除去并抹平?？山?jīng)手工或借助設(shè)備將基質(zhì)片卷在心軸上，所述設(shè)備有助于張力均勻并去除心軸 下或所卷繞的基質(zhì)片各層之間的氣泡或水泡或折痕。設(shè)備有一個表面，心軸可沿其長度接 觸該表面，當其轉(zhuǎn)動并卷繞基質(zhì)片時。然后，采用用于使由基質(zhì)片制備的平片構(gòu)建物結(jié)合和交聯(lián)的方法和試劑，將所卷 繞的基質(zhì)片的各層結(jié)合在一起。交聯(lián)并清洗之后，可通過套筒，將所卷繞的脫水ICL構(gòu)建物 從心軸上拉下來，或者就留在上面用于進一步加工?？勺寴?gòu)建物在含水溶液優(yōu)選水中再水 合，即通過將它們轉(zhuǎn)移到裝有再水合劑的室溫容器中過至少約10至約15分鐘，使各層再水 合，而不使它們分離或分層。物質(zhì)的添加。本發(fā)明的失活或脫細胞的單細胞-基質(zhì)片或多層細胞基質(zhì)構(gòu)建物還 可包含一種或多種額外物質(zhì)，從而給材料(matrial)賦予不同操作或功能特性或賦予不同 特征，使活體內(nèi)的細胞和組織將會以所需方式與其反應(yīng)，當植入或移入至機體或其內(nèi)時。肝素。在構(gòu)建物將會用于接觸血液例如在循環(huán)系統(tǒng)中的實施方案中，通過將肝素 施用于構(gòu)建物，施用于構(gòu)建物所有表面或平片構(gòu)建物的僅一側(cè)或者管狀構(gòu)建物的內(nèi)腔或外 腔(luminally or abluminally)，使構(gòu)建物具有不形成血栓的性質(zhì)。可通過各種眾所周知 的技術(shù)，將肝素施用于構(gòu)建物。為了說明，可以按照以下3種方式將肝素施用于構(gòu)建物。第 一，可將苯甲烴銨肝素(BA-Ifep)異丙醇溶液施用于假體，即通過垂直填充其內(nèi)腔，或?qū)⒓?體浸泡在溶液中，然后再風(fēng)干。該方法用離子結(jié)合的BA-Hep復(fù)合物處理膠原蛋白。第二， EDC可用于活化肝素并將肝素與膠原蛋白纖維共價結(jié)合。第三，EDC可用于活化膠原蛋白， 然后將魚精蛋白與膠原蛋白共價結(jié)合，再使肝素與魚精蛋白發(fā)生離子結(jié)合?？刮⑸锾幚??？蓪⑺幬?、生長因子、細胞因子、遺傳物質(zhì)和培養(yǎng)細胞結(jié)合到基質(zhì) 層內(nèi)部或其上。額外的材料層可置于構(gòu)建物的至少一個表面上，這樣的額外材料層包括呈 純化或粗制形式的蛋白質(zhì)和其它胞外基質(zhì)組件。蛋白質(zhì)。胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)是用于本發(fā)明的優(yōu)選的一類蛋白質(zhì)。實例包括但不限于 膠原蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白、蛋白聚糖。例如，血纖蛋白原，當與 凝血酶結(jié)合時，形成纖維蛋白。類透明質(zhì)酸(Hyaluronan)(也稱為透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)或透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate))是非硫酸化的糖胺聚糖，廣泛分布在結(jié)締組織、上皮 組織和神經(jīng)組織中。它是胞外基質(zhì)的主要組件之一，明顯有助于細胞增殖和遷移并用于減 少操作后粘附。這些蛋白質(zhì)各自有多種天然存在的類型以及可通過合成制備或基因工程產(chǎn) 生的類型。例如，膠原蛋白存在多種形式和類型。所有這些類型和亞類都包括在本文所述 的蛋白質(zhì)的用途中。蛋白質(zhì)這一術(shù)語還包括但不限于每種所述蛋白質(zhì)的片段、類似物、保守 氨基酸取代和非天然存在的氨基酸的取代。本文所用的術(shù)語“殘基”是指通過酰胺鍵結(jié)合 到蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基酸(D或L)或氨基酸模擬物。如此，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限定，可包括其作用方式類似于天然存在氨基酸的已知的天然氨基酸的類似 物(即氨基酸模擬物)。此外，酰胺鍵模擬物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的肽主鏈修飾。合成材料可置于細胞基質(zhì)構(gòu)建物的至少一個表面。合成材料可呈片狀、疊合形 式或交錯排列在細胞基質(zhì)構(gòu)建物上，在細胞-基質(zhì)層上形成合成的層。一類合成材料，優(yōu) 選生物相容性合成材料，包括聚合物。這類聚合物包括但不限于下列聚合物聚(氨酯)、 聚(硅氧烷)或硅酮、聚(乙烯)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、 聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚丙烯酰胺、 乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯 (PGA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚酐和聚原酸酯或可開發(fā)的生物相容性的任何其 它類似的合成聚合物。一般術(shù)語“生物相容的合成聚合物”應(yīng)該還包括共聚物和摻混物， 和上述聚合物的任何其它組合或與其它聚合物的任何其它組合。這些聚合物的使用將會 取決于給定用途和所需規(guī)格。例如，生物相容性合成材料也可以是生物可降解的，使其在 植入受試者體內(nèi)時，可隨時間發(fā)生生物降解。當置于細胞基質(zhì)構(gòu)建物上時，組合構(gòu)建物包 含生物可降解層和生物可重塑層。有關(guān)這些聚合物和聚合物類型的更詳細討論，可參見 Brannon-Peppas,Lisa, “ Polymers in Controlled Drug Delivery," Medical Plastics and BiomaterialS，1997年11月，其通過引用結(jié)合到本文中，如同全文引用一樣?？捎米饕r里層(backing layer)的其它合成材料的實例是硅酮。使用呈多孔或微 孔膜形式或無孔膜形式的硅酮層并與基質(zhì)構(gòu)建物粘附。當用于傷口愈合時，硅酮層可用于 對皮膚創(chuàng)傷來處理和操作基質(zhì)構(gòu)建物并將創(chuàng)傷周圍密封，以將基質(zhì)構(gòu)建物包起來，治療創(chuàng) 傷。硅酮也形成水分屏障，以保持創(chuàng)傷干燥。在成功形成愈合創(chuàng)傷組織之后，通常在約21 天，用鑷子將硅酮小心地從已愈合或正在愈合的創(chuàng)傷邊緣揭下來。滅菌。用醫(yī)療器械滅菌領(lǐng)域已知的方法，最終對構(gòu)建物進行滅菌。優(yōu)選的滅菌方法 是，按照美國專利號5，460，962(其通過引用結(jié)合到本文中)，通過用無菌0. 過乙酸(PA) 處理來接觸構(gòu)建物，用足夠量的ION氫氧化鈉(NaOH)中和。凈化過程在振動臺上的容器例 如ILNalge容器中進行約18士2小時。然后通過用3倍體積的無菌水接觸構(gòu)建物來清洗它 們，每次清洗10分鐘。本發(fā)明的構(gòu)建物可通過Y輻射來滅菌。將構(gòu)建物包裝在適合Y輻射的材料所制 成的容器中，并用真空密封機密封，再將其放入密封袋中，在25. 0-35. OkGy之間進行、輻 射。Y輻射能顯著而無害地降低楊氏模量和收縮溫度。Y輻射之后的機械性能仍足以用 于應(yīng)用范圍，Y是優(yōu)選的滅菌方式，因為它廣泛用于可植入醫(yī)療器械領(lǐng)域。V .物理改性在移植給需要創(chuàng)傷護理的受試者之前，可將本發(fā)明的構(gòu)建物制成網(wǎng)狀。當用于傷 口愈合時，制成網(wǎng)狀能改善構(gòu)建物對創(chuàng)面(wound bed)的結(jié)構(gòu)并提供將創(chuàng)傷滲出物從移植 物下引流的方法。術(shù)語“制網(wǎng)(meshing)”定義為給組織穿孔、從而制成網(wǎng)樣排列的機械方 法。優(yōu)選通過使用常規(guī)的皮膚制網(wǎng)器(skin mesher) (ZIMMER ;BIOPLASTY )來制 網(wǎng)。可通過拉伸皮膚而使孔隙打開，從而擴大網(wǎng)狀構(gòu)建物(Meshed construct)，然后再用于 創(chuàng)面。擴大的網(wǎng)狀構(gòu)建物為創(chuàng)傷區(qū)提供最大覆蓋。或者，可使用網(wǎng)狀構(gòu)建物而不擴大，只作 為具有未擴大網(wǎng)孔的片來使用。網(wǎng)狀構(gòu)建物可單獨使用或與來自機體其它區(qū)域的受試者自 身皮膚一起使用。也可通過其它方式對本發(fā)明構(gòu)建物進行穿孔或開窗和使其具有孔隙。可手工采用激光、穿孔器、解剖刀、針或針頭來開窗。也可提供具有孔的本發(fā)明構(gòu)建物，這樣的孔可連通構(gòu)建物兩面?？梢园凑找?guī)則或 不規(guī)則模式來穿孔。也可用解剖刀或針頭對組織進行手工刻劃或穿孔。νπ.治療方法本發(fā)明的生物工程構(gòu)建物可用于傷口愈合，例如用于包括手術(shù)創(chuàng)傷或燒傷區(qū)在內(nèi) 的急性創(chuàng)傷，或者例如靜脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡的慢性創(chuàng)傷可得益于使用本文所公開 的皮膚構(gòu)建物而治愈。其它先天性皮膚病例如大皰性表皮松解也可得益。本發(fā)明的生物工 程構(gòu)建物可用于心臟用途、牙周用途、手術(shù)用途和化妝品用途以及神經(jīng)學(xué)上的用途，例如硬 膜修復(fù)貼劑或用于末梢神經(jīng)修復(fù)的移植物、用于神經(jīng)束或管的包裹劑(wrap)，用于指導(dǎo)神 經(jīng)再生。細胞遞送?？裳b配本發(fā)明的生物工程構(gòu)建物并用于細胞遞送用途。本發(fā)明的失活 或脫細胞構(gòu)建物可用作細胞的培養(yǎng)底物。因為本發(fā)明的構(gòu)建物主要包含膠原蛋白，所以它 們是細胞培養(yǎng)的天然底物?？蓪⒈景l(fā)明的基質(zhì)構(gòu)建物放置并固定在培養(yǎng)器中，并將懸浮于 培養(yǎng)基中的細胞懸液置于基質(zhì)構(gòu)建物上，讓其附著在基質(zhì)構(gòu)建物表面上，或在基質(zhì)構(gòu)建物 內(nèi)部和下面或這兩者上，并增殖。用于與基質(zhì)構(gòu)建物一起培養(yǎng)的所選細胞是這樣的細胞它 們具有治療受損或患病器官或組織所需要的性質(zhì)，從而修復(fù)器官或組織，恢復(fù)其預(yù)定功能 性。對于用于細胞遞送的本發(fā)明構(gòu)建物的另一構(gòu)型實例而言，可將基質(zhì)層裝配成口袋狀或 信封狀，用于遞送干細胞或祖細胞、前體細胞或功能性細胞。提供下列實施例，以便更好地解釋本發(fā)明的實踐，但不應(yīng)視為以任何方式限制本 發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道，對本文所述的方法可以進行各種修改，而不背離本 發(fā)明的精神和范圍。
實施例實施例1 :由人新生兒包皮成纖維細胞形成膠原蛋白性基質(zhì)按照5 X IO5 細胞 /162cm2 組織培養(yǎng)處理瓶(Costar Corp. , Cambridge,ΜΑ,目錄號 3150)，接種人新生兒包皮成纖維細胞(來自O(shè)rganogenesis，Inc. Canton, ΜΑ)并在生長培 養(yǎng)基中生長。生長培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成DulbeCC0氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(高葡 萄糖制劑，不含L-谷氨酰胺，8丨011^ 31 ^，1311 ^8^^116，1 )，補充有10%新生小牛血清 (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc.，Logan, Utah)和 4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker， ffalkersville, MD) 0在10士 1 % CO2的氣氛中，將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中。每隔2-3 天一次，用新鮮制備的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)8天后，細胞生長至匯合，也就是說，細胞在 組織培養(yǎng)瓶底部已經(jīng)形成匯合的單層，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中吸出。為了清洗單層，將除菌 過濾的磷酸鹽緩沖鹽水加入到各培養(yǎng)瓶底部，再從瓶中吸出。通過向各瓶加入5mL胰蛋白 酶-EDTA谷氨酰胺(BioWhittaker，WalkerSVille，MD)并溫和旋轉(zhuǎn)以確保完全覆蓋單層，使 細胞從瓶上釋放下來。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。當細胞釋放后，就立即將5ml SBTI (大豆胰 蛋白酶抑制劑)加入到各瓶中并與懸液混合，以終止胰蛋白酶-EDTA的作用。將細胞懸液 從瓶中移出并平分到無菌的錐底離心管中。通過在約SOO-IOOOXg離心5分鐘收集細胞。用新鮮培養(yǎng)基使細胞重新懸浮，濃度為3. OX IO6細胞/ml，然后接種到6孔板中 的0.4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理插入物(TRANSWELL , Corning Costar)中，接種密度為3. OX IO6細胞/插入物(6. 6 X IO5細胞/cm2)。在10士 CO2的氣氛中， 將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中，每隔2-3天添加新鮮的制備培養(yǎng)基，共21天。制備培養(yǎng) 基包含DMEM 和 Hams F-12 培養(yǎng)基(Quality Biologies Gaithersburg, MD)的 3 1 基 礎(chǔ)混合物、4mM GlutaMAX-l (Gibco BRL, Grand Island, NY)并添加所得濃度的下列成分 5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology Lake Placid, NY)、2%新生小牛血 清(Hyclone，Logan, Utah)、0· 4 μ g/ml 氫化可的松(Sigma St. Louis, MO)、1 X ICT4M 乙醇胺 (Fluka，Ronkonkoma，NY ACS 級)、1 X ICT4M ο-磷?；?乙醇胺(Sigma，St. Louis)、5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis, M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis, M0)、20pM 三碘甲狀 腺原氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.， Milwaukee, WI) ,50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 Chemicals USA，Inc. #013-12061)、0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma，St. Louis，M0)、0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 0. 05%聚乙 二醇(PEG) 3400-3700MW(細胞培養(yǎng)級)(Sigma，St. Louis, M0)。在第7、14和21天采集組織學(xué)分析樣品并固定在福爾馬林中，再包埋在石蠟中。 按照本領(lǐng)域已知的方法，將經(jīng)福爾馬林固定的樣品包埋在石蠟中，5微米切片用蘇木精-伊 紅(H&E)染色。使用H&E染色片，對10個隨機挑選的顯微鏡視野進行厚度測量，使用裝有 IOmm/100微米標線的10X目鏡。兩種不同的人真皮成纖維細胞株的結(jié)果總結(jié)于表1，顯示出細胞基質(zhì)構(gòu)建物的厚 度，當它在發(fā)育時。 對第7、14和21天的樣品也進行膠原蛋白濃度分析。通過使用本領(lǐng)域已知的用于 羥基脯氨酸含量的比色測定(W0essner，1961)來評價膠原蛋白含量。在這些同樣的時間 點，也測定細胞數(shù)。表2是膠原蛋白濃度的總結(jié)，表3是使用上述方法，由兩種不同的細胞 株(B156和B119)產(chǎn)生的細胞基質(zhì)構(gòu)建物而來的細胞數(shù)據(jù)的總結(jié)。
分析了第7、14和21天的人細胞衍生的真皮基質(zhì)的樣品，即通過延遲還原 SDS-PAGE測定膠原蛋白組成，顯示出樣品中的I型和III型膠原蛋白α條帶。用免疫組織化學(xué)方法測定了真皮基質(zhì)的生化特性。在石蠟固定切片上進行了纖 連蛋白鑒定，使用Zymed Histostain鏈霉抗生物素-生物素系統(tǒng)(Zymed Laboratories Inc. , South San Francisco, CA)。通過第一抗生腱蛋白抗體染色(Dako, Carpintheria, CA)，再用抗小鼠辣根過氧化物酶標記的抗體(Calbiochem)作為第二抗體，測定生腱蛋白 的存在。用二氨基苯炔(Sigma St. Louis, MO)并用核固紅復(fù)染，觀察樣品。使用前述方法(Famdale，1986)，對第21天的樣品進行糖胺聚糖(GAG)定量測定。 測定表明，在接種后21天采集的人細胞衍生的真皮基質(zhì)樣品中，存在0. 44克GAG/cm2。實施例2 在體外，由人新生兒包皮成纖維細胞在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中形成膠 原蛋白性基質(zhì)采用實施例1所述方法，擴增人新生兒包皮成纖維細胞。然后使細胞重新懸浮， 濃度為3X IO6細胞/ml，然后接種到6孔板中的0. 4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理 膜插入物上，接種密度為3. OX IO6細胞/TW(6. 6X IO5細胞/cm2)。然后按照實施例1所 述，始終用不含新生小牛血清的培養(yǎng)基來維持這些細胞。更具體地講，培養(yǎng)基含有=DMEM 和 Hams F-12 培養(yǎng)基(Quality Biologies，Gaithersburg，MD)的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL, Grand Island, NY)并添加5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、0. 4 μ g/ml 氫化可的松(Sigma, St. Louis, M0) U X 1(T4 M 乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma, NY cat. #02400 ACS 級)、1 X ICT4M o_ 磷?；?乙醇胺 (Sigma, St. Louis, MO) ,5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis, M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis, M0)、20 P M 三碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company,Milwaukee, WI) >50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 Chemicals USA, Inc.)、0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma, St. Louis, M0)、0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma, St. Louis,M0)和 0.05%聚乙二醇(PEG) (Sigma，St. Louis，MO)。用所述方法，在第 7、14 和 21天檢查樣品的膠原蛋白濃度和細胞數(shù)。結(jié)果總結(jié)于表4(細胞數(shù))和表5(膠原蛋白)。 按照實施例1所述，樣品也經(jīng)福爾馬林固定并用蘇木精和伊紅染色處理，用于光學(xué)顯微鏡 分析。組織學(xué)評價證明，生長在確定成分培養(yǎng)基中的構(gòu)建物類似于生長在含有2%新生小牛 血清的培養(yǎng)基中的那些。用實施例1所述方法，樣品也對纖連蛋白染色呈陽性。
除了內(nèi)源產(chǎn)生的原纖維狀膠原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于細胞 基質(zhì)構(gòu)建物中。實施例3 在體外，由人跟腱成纖維細胞形成膠原蛋白性基質(zhì)用實施例1所述的同樣方法，用人跟腱成纖維細胞(HATF)替代人新生兒包皮成 纖維細胞，形成細胞基質(zhì)構(gòu)建物。在制備培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后，使用實施例1所述的方 法，樣品也進行H&E染色和厚度測量。目測所得構(gòu)建物，細胞基質(zhì)組織樣構(gòu)建物的厚度為 75. 00士27. 58微米(η = 2)。內(nèi)源產(chǎn)生的原纖維狀膠原蛋白、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也 存在于構(gòu)建物中。實施例4 在體外，由轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細胞形成膠原蛋白性基質(zhì)使用以下方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的人真皮成纖維細胞。將一管jCRIP-43血小板衍生的生 長因子(PDGF)病毒產(chǎn)生者(viral producer) (Morgan, .J等)融化，然后按照2X IO6細 胞/162cm2瓶(Coming Costar, Cambridge, ΜΑ)接種細胞。給這些培養(yǎng)瓶添加生長培養(yǎng) 基，并在10士 1% CO2的氣氛下維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中。生長培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成 Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker， Walkersville，MD)，補充有 10%新生小牛血清(HyClone Laboratories, Inc. ,Logan,Utah) 和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。在同一天，也將1管人新生兒包皮 成纖維細胞(HDFB156)融化并按照 1. 5 X IO6 細胞/162cm2 瓶(Coming Costar, Cambridge, ΜΑ)接種。3天后，給jCRIP PDGF-43病毒產(chǎn)生者添加新鮮生長培養(yǎng)基。給HDFB156添加 上述生長培養(yǎng)基并加上8 μ g/ml聚凝膠(Sigma，St. Louis, MO)。第2天，按照以下方法感 染HDFB156的細胞。收集來自jCRIP PDGF-43病毒產(chǎn)生者的用過的培養(yǎng)基，通過0. 45微米 濾器過濾。將8μ g/ml聚凝膠加入到該過濾的、用過的培養(yǎng)基中。再將該用過的培養(yǎng)基放 置在HDF上。在隨后的兩天，給HDF添加新鮮生長培養(yǎng)基。HDF從p5傳代至p6之日后，以 2. 5X IO6細胞/162cm2瓶(Coming Costar,Cambridge,ΜΑ)的密度接種。細胞傳代如下將 用過的培養(yǎng)基吸出。然后用磷酸鹽緩沖鹽水清洗瓶子，以去除任何殘留的新生小牛血清。通 過向各瓶加入5mL胰蛋白酶-EDTA并溫和旋轉(zhuǎn)以確保完全覆蓋單層，使細胞從瓶上釋放下
25來。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。當細胞釋放后，就立即將5ml SBTI (大豆胰蛋白酶抑制劑)加入 到各瓶中并與懸液混合，以終止胰蛋白酶-EDTA的作用。將細胞/胰蛋白酶/SBTI懸液從 瓶中移出并平分到無菌的錐底離心管中。通過在約800-1000Xg離心5分鐘收集細胞。將 細胞重懸于生長培養(yǎng)基中，按照上述密度接種。2天后，給細胞添加新鮮生長培養(yǎng)基。次日 如上所述地收獲細胞，在含有10%新生小牛血清(NBCS)和10%二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, St. Louis, MO)的生長培養(yǎng)基中稀釋至密度為1.5X IO6細胞/ml。然后以Iml/冷凍管，在 約-80°C冷凍細胞。對于該實施例，膠原蛋白性基質(zhì)的產(chǎn)生利用了與實施例1和實施例3的同樣方法， 用人新生兒包皮成纖維細胞代替人新生兒包皮成纖維細胞，如上所述，所述人新生兒包皮 成纖維細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生高水平的血小板衍生的生長因子(PDGF)。如上所述，在接種后18 天采集樣品，用于H&E染色。用抗生物素蛋白-生物素方法，也對樣品進行染色，用于檢測 實施例10所列舉的纖連蛋白的存在。按照實施例1所述，在接種后18天采集樣品，用于 H&E染色，顯示出與實施例1所述的類似的細胞-基質(zhì)總體表現(xiàn)，其所測厚度為123.6微米 (N = 1)。通過ELISA，在培養(yǎng)期間(18天)，在細胞基質(zhì)構(gòu)建物中轉(zhuǎn)染細胞的PDGF輸出經(jīng) 測定為lOOng/mL，而對照的PDGF輸出不可檢出。實施例5 在體外，由人角膜的角膜細胞形成基質(zhì)人角膜的角膜細胞(來自O(shè)rganogenesis，Inc. Canton, ΜΑ)用于產(chǎn)生角膜的基質(zhì) 構(gòu)建物。使用胰蛋白酶-EDTA，使人角膜細胞的匯合培養(yǎng)物從其培養(yǎng)底物上釋放下來。當 釋放后，大豆胰蛋白酶抑制劑用于中和胰蛋白酶-EDTA，細胞懸液離心，棄去上清液，將細 胞重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，濃度為3Χ IO6細胞/ml。將細胞接種到6孔板中的0. 4微米孔 徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理transwells中，密度為3. OX IO6細胞/TW(6. 6 X IO5細胞/ cm2)。將這些培養(yǎng)物在種子培養(yǎng)基中維持過夜。種子培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成=Dulbecco氏 改良 Eagle 氏培養(yǎng)基(DMEM)禾Π Hams F-12 培養(yǎng)基(Quality Biologies Gaithersburg,MD cat.)的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4 mM GlutaMAX(Gibco BRL, Grand Island, NY)，添加5ng/ml 人重組表皮生長因子(EGF) (Upstate Biotechnology Lake Placid，NY)、0. 4 μ g/ml 氫化 可的松(Sigma St. Louis，M0)、lXl(T4M 乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，NY)、1 X 10_4M o_ 磷酰 基-乙醇胺(Sigma，St. Louis, M0) ,5 μ g/ml 胰島素(Sigma，St. Louis, M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵 蛋白(Sigma，St. Louis，M0)、20pM 三碘甲狀腺原氨酸(Sigma, St. Louis,M0)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI)。隨后，給該培養(yǎng)物添加新 鮮制備培養(yǎng)基。制備培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成DMEM，HamS F_12培養(yǎng)基(Quality Biologies Gaithersburg, MD)的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL.，Grand Island, NY)， 添加5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，NY)、2%新生小 牛血清(Hyclone，Logan, Utah)、0· 4 μ g/ml 氫化可的松(Sigma, St. Louis, MO)、1 X ICT4M 乙 醇胺(Fluka，Ronkonkoma, NY ACS 級)、1 X ICT4M ο-磷酰基-乙醇胺(Sigma，St. Louis,)、 5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis,M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis,M0)、20pM 三 碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis，MO)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co. , Milwaukee, WI)>50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 pure chemical company)、0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma，St. Louis，M0)、0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 0. 05%聚乙 二醇(PEG) (Sigma, St. Louis, M0,細胞培養(yǎng)級)。
在10% 士 CO2的氣氛下將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中，并每隔2_3天添加新 鮮制備培養(yǎng)基，共20天(一共培養(yǎng)21天)。培養(yǎng)21天后，按照實施例1所述的方法來測 定，角膜細胞沉積了約40微米厚度的基質(zhì)層。內(nèi)源產(chǎn)生的原纖維狀膠原蛋白、核心蛋白聚 糖和糖胺聚糖也存在于細胞基質(zhì)構(gòu)建物中。實施例6 在體外，由接種在制備培養(yǎng)基中的人新生兒包皮成纖維細胞形成膠原 蛋白性基質(zhì)以1 X IO5細胞/6孔板中的0. 4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理載體 (TRANSWELL , Costar Corp. Cambridge，MA)，接種人新生兒包皮成纖維細胞(來自 Organogenesis, Inc. Canton, ΜΑ)，并在生長培養(yǎng)基中生長。生長培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成 Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker， Walkersville，MD)，補充有 10%新生小牛血清(HyClone Laboratories, Inc. ,Logan,Utah) 和 4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，ffalkersville, MD)。在 10士 CO2 的氣氛下將細胞 維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)9天后，從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng) 基，并更換為制備培養(yǎng)基。在10士 CO2的氣氛下將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中，并每 隔2-3天添加新鮮制備培養(yǎng)基，共21天。制備培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成DMEM，HamS F-12培 養(yǎng)基(Quality Biologies，Gaithersburg，MD)的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL, Grand Island, NY)，添力口 5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、2% 新生小牛血清(Hyclone, Logan, Utah)、0. 4 μ g/ml 氫化可的松 (Sigma St. Louis, M0)、1 X ICT4M 乙醇胺(Fluka, Ronkonkoma, NY ACS 級)、1 X ICT4M ο-磷 ?；?乙醇胺(Sigma，St. Louis) ,5 μ g/ml 胰島素(Sigma，St. Louis, M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵 蛋白(Sigma，St. Louis, M0)、20 P M 三碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 6. 78ng/ ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)、50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 Pure Chemical Company) >0. 2 μ g/ml L- IfMSI (Sigma, St. Louis,M0)、0. 1 μ g/ml V^UW. (Sigma, St. Louis, M0)和 0. 05%聚乙二醇(PEG) (Sigma, St. Louis, M0，細胞培養(yǎng)級)。在第21天采集樣品并固定在福爾馬林中，再包埋在石蠟中。按照本領(lǐng)域常規(guī)使用 的技術(shù)，將經(jīng)福爾馬林固定的樣品包埋在石蠟中，5微米切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色。 使用H&E染色片，對10個隨機挑選的顯微鏡視野進行測量，使用裝有10mm/100微米標線 (Olympus America Inc.，Melville, NY)的 IOX 目鏡(Olympus America Inc.，Melville, NY)。用此方法創(chuàng)建的構(gòu)建物在結(jié)構(gòu)和生化組成上類似于實施例1創(chuàng)建的那些構(gòu)建物，其所 測厚度為82. 00 士 7. 64微米。實施例7 在體外，由豬真皮成纖維細胞形成膠原蛋白性基質(zhì)如下所述，以5X IO5細胞/162em2組織培養(yǎng)處理瓶(Costar Corp.，Cambridge, ΜΑ.目錄號3150)，接種豬真皮成纖維細胞(來自O(shè)rganogenesis，Inc. Canton，MA)，并在生 長培養(yǎng)基中生長。生長培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成DulbeCC0氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM) (高葡萄糖制劑，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker, ffalkersville, MD)，補充有10%胎牛 血 青(HyClone Laboratories, Inc. , Logan, Utah)禾口 4mM L-谷氛酷胺(BioWhittaker, ffalkersville, MD) 0在10 % 士 1 % CO2的氣氛中，將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中。每隔 2-3天一次更換培養(yǎng)基。匯合后，也就是說細胞在組織培養(yǎng)瓶底部已經(jīng)形成了長滿的一層， 將培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿中吸出。為了清洗單層，將除菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水加入到單層上，再從皿中吸出。通過向各瓶加入5mL胰蛋白酶-EDTA谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersvi 1 Ie， MD)并溫和旋轉(zhuǎn)以確保完全覆蓋單層，使細胞從瓶上釋放下來。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。當 細胞釋放后，就立即將5ml SBTI (大豆胰蛋白酶抑制劑)加入到各瓶中并與細胞懸液混 合，以終止胰蛋白酶-EDTA的作用。將懸液從瓶中移出并平分到無菌的錐底離心管中。通 過在約800-1000Xg離心5分鐘收集細胞。將細胞重懸并稀釋至濃度為3X IO6細胞/ml， 然后接種到6孔板中的0. 4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理transwells中，密度為 3. OX IO6細胞/TW (6. 6 X IO5細胞/cm2)。細胞在種子培養(yǎng)基中維持過夜。種子培養(yǎng)基由以 下物質(zhì)組成DMEM，Hams F-12 培養(yǎng)基(Quality Biologies，Gaithersburg，MD)的 3 1 基 礎(chǔ)混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL, Grand Island, NY)，添加5ng/ml 人重組表皮生長因 子(Upstate Biotechnology Lake Placid，NY)、0· 4 μ g/ml 氧化可的豐公(Sigma St. Louis, M0)、1 X ICT4M 乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，NY ACS 級)、1 X ICT4M o_磷酰基-乙醇胺(Sigma, St. Louis)、5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis, M0)、5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis, M0)、20 P M三碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis,M0)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co. ， Milwaukee, WI) >50ng/ml L-(WAK0 Pure Chemical Company) >
0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis, M0)。 在10士 CO2的氣氛中，將細胞維持在37士 1°C培養(yǎng)箱中并每隔2-3天添加新鮮制備培養(yǎng) 基，共7天。制備培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成DMEM，Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologies, Gaithersburg,MD)的 3 1 基石出混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL,Grand Island,NY), 添加5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid，NY)、2%新生小 牛血清(Hyclone，Logan, Utah)、0· 4 μ g/ml 氫化可的松(Sigma St. Louis, MO) U X ICT4M 乙 醇胺(Fluka，Ronkonkoma, NY ACS 級)、1 X ICT4M ο-磷?；?乙醇胺(Sigma，St. Louis,)、 5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis,M0) ,5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis,M0)、20pM 三 碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis，MO)和 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co. , Milwaukee, WI)>50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 Pure Chemical Company)、0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma，St. Louis，M0)、0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis, M0)和 0. 05%聚乙 二醇(PEG) (Sigma，St. LouiS，M0)細胞培養(yǎng)級。7天后，培養(yǎng)基更換為不含新生小牛血清的 制備培養(yǎng)基。每隔2-3天將新鮮的該培養(yǎng)基添加到細胞中達20多天，共培養(yǎng)28天。在第21天采集樣品并固定在福爾馬林中，再包埋在石蠟中。按照本領(lǐng)域常用技 術(shù)，將經(jīng)福爾馬林固定的樣品包埋在石蠟中，5微米切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色。使 用H&E染色片，對10個隨機挑選的顯微鏡視野進行測量，使用裝有10mm/100微米標線 (Olympus America Inc.，Melville, NY)的 10X 目鏡(Olympus America Inc.，Melville, NY)。樣品顯示出由細胞和基質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)，所測厚度為71. 20 士 9. 57微米。除了內(nèi)源產(chǎn)生 的原纖維狀膠原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于細胞基質(zhì)構(gòu)建物中。實施例8 在體外，由人新生兒包皮成纖維細胞在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中形成膠 原蛋白性基質(zhì)采用實施例1所述的方法，擴增人新生兒包皮成纖維細胞。使細胞重新懸浮，濃度 為3X IO6細胞/ml，然后接種到6孔板中的0. 4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理膜插 入物上，密度為3. OX IO6細胞/TW (6. 6 X IO5細胞/cm2)。該實施例的細胞始終培養(yǎng)在化學(xué) 成分確定培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基含有:DMEM,Hams F-12 培養(yǎng)基(Quality Biologies, Gaithersburg, MD) 的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，NY)，并添加5ng/ml 人 重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、1 X ICT4M 乙醇胺(Fluka, Ronkonkoma，NY 目錄號 02400ACS 級)、1 X ICT4M ο-磷?；?乙醇胺(Sigma，St. Louis，MO)、 5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma，St. Louis, MO) ,20 P M 三碘甲狀腺原氨酸(Sigma，St. Louis, MO) 禾口6. 78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company,Milwaukee,WI)>50ng/ml L-抗 壞血酸(WAKO Chemicals USA, Inc.) ,0. 2 μ g/ml L-脯氨酸(Sigma, St. Louis,MO)、0. 1 μ g/ ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis, MO)。向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按照以下這些單獨條件來添加其它成分1. 5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis, MO)、0· 4μ g/ml 氫化可的松(Sigma, St. Louis, MO)、0. 05%聚乙二醇(PEG) (Sigma, St. Louis, M0)。2. 5 μ g/ml 胰島素(Sigma, St. Louis, M0)、0. 4 μ g/ml 氫化可的松(Sigma, St. Louis, M0)。3. 375 μ g/ml 胰島素(Sigma，St. Louis, M0)、6 μ g/ml 氫化可的松(Sigma， St. Louis, M0)。樣品經(jīng)福爾馬林固定并用蘇木精和伊紅染色處理，用于光學(xué)顯微鏡分析。目測組 織學(xué)評價證明，缺乏PEG的條件2表現(xiàn)出與含有PEG的條件1相當類似的基質(zhì)。測定構(gòu) 建物的膠原蛋白含量的生化分析顯示出兩者近似等量的膠原蛋白含有PEG的條件1為 168. 7 士 7. 98 μ g/cm2，而不含PEG的條件2為170. 88 士9. 07 μ g/cm2。含有高水平胰島素和 氫化可的松的條件3在比其它兩種條件更早的時間點就顯示出更高的基質(zhì)(包括膠原蛋 白)表達。在所有條件下，除了內(nèi)源產(chǎn)生的原纖維狀膠原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚 糖也存在于細胞基質(zhì)構(gòu)建物中。由該實施例的條件2的方法形成的培養(yǎng)的真皮構(gòu)建物見圖 2所示。圖2顯示的是經(jīng)固定、石蠟包埋、蘇木精和伊紅染色的細胞基質(zhì)構(gòu)建物切片的顯微 照片，所述細胞基質(zhì)構(gòu)建物是由培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 天而形成的。多孔膜看來是構(gòu)建物之下的薄的半透明帶，可以看到細胞生長在膜表面，而不 是與基質(zhì)一起包裹在膜內(nèi)。圖3顯示2個放大倍數(shù)的培養(yǎng)真皮構(gòu)建物的透射電鏡(TEM)圖像，所述構(gòu)建物是 由該實施例的條件2的方法培養(yǎng)21天形成的。圖3A是7600X放大倍數(shù)，顯示成纖維細胞間 的內(nèi)源膠原蛋白纖維的排列。圖3B是19000X放大倍數(shù)的完全形成的內(nèi)源膠原蛋白纖維， 顯示出原纖維排列和緊密度。在該實施例的所有條件下，所形成的培養(yǎng)真皮構(gòu)建物包含真皮成纖維細胞和內(nèi)源 產(chǎn)生的基質(zhì)。所有都具有完全形成的膠原蛋白原纖維，以緊密組織排列在細胞之間。它們 的纖維特性、厚度和粘附完整性賦予構(gòu)建物相當大的強度，允許將它從培養(yǎng)膜上剝離下來 并進行處理，當把它作為移植物或植入物而轉(zhuǎn)移到用構(gòu)建物治療的受試者中時。實施例9 由人口腔粘膜成纖維細胞(Buccal Fibroblast)形成膠原蛋白性基質(zhì)本實驗的目的就是從分離自人面頰組織(cheek tissue)的口腔粘膜成纖維細胞 產(chǎn)生細胞基質(zhì)構(gòu)建物。將口腔粘膜(Buccal)培養(yǎng)在裝有含10% NBCS培養(yǎng)基的DMEM的 T-150瓶中。7天后，為了進一步擴增細胞數(shù)，收獲口腔粘膜細胞并以4. 0 X IO6細胞/含有 10% NBCS培養(yǎng)基的DMEM，傳代到9個T-150瓶中，并培養(yǎng)至匯合，此時收獲細胞。
為了收獲細胞，從培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基。為了清洗單層，將除菌過濾的磷酸鹽緩沖 鹽水加入到各培養(yǎng)瓶底部，再從瓶中吸出。通過向各瓶加入5mL胰蛋白酶-EDTA谷氨酰胺 (Bioffhittaker,ffalkersville,MD)并溫和旋轉(zhuǎn)以確保完全覆蓋單層，使細胞從瓶上釋放下 來。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。當細胞釋放后，就立即將5ml SBTI (大豆胰蛋白酶抑制劑)加 入到各瓶中并與懸液混合，以終止胰蛋白酶-EDTA的作用。將細胞懸液從瓶中移出并平分 到無菌的錐底離心管中。通過在約SOO-IOOOXg離心5分鐘收集細胞。用新鮮培養(yǎng)基使細胞重新懸浮，濃度為3. OX IO6細胞/ml，然后接種到6孔板中 的0.4微米孔徑、24mm直徑的組織培養(yǎng)處理插入物(TRANSWELL ,Coming Costar)中， 密度為3. OX IO6細胞/插入物(6. 6 X IO5細胞/cm2)。在10士 CO2的氣氛中，將細胞維 持在37士 1°C培養(yǎng)箱中并添加含有以下成分的培養(yǎng)基DMEM，Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologies, Gaithersburg, MD)的 3 1 基礎(chǔ)混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL, Grand Island,NY)并添加5ng/ml 人重組表皮生長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、0· 4μ g/ml 氫化可的松(Sigma, St. Louis, M0)、1 X ICT4M 乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma, NY 目錄號 02400ACS 級)、1Χ1(Γ4Μ ο-磷?；?乙醇胺(Sigma, St. Louis，MO)、5 μ g/ml 胰 島素(Sigma, St. Louis，M0)、5y g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, St. Louis，M0)、20 P M三碘甲狀腺原 氨酸(Sigma, St. Louis, M0)禾口 6. 78ng/ml 硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI) ,50ng/ml L-抗壞血酸(WAK0 Chemicals USA, Inc.) ,0. 2 μ g/ml L-脯氨酸 (Sigma, St. Louis，M0)、0. 1 μ g/ml 甘氨酸(Sigma，St. Louis,M0)和 0. 05%聚乙二醇(PEG) (Sigma, St. Louis, M0)。接種后1天，培養(yǎng)基更換為無血清制備培養(yǎng)基，每隔2-3天更換一次，共21天。在 第21天，將樣品固定在福爾馬林中，用于組織學(xué)。3份樣品用于蛋白質(zhì)和膠原蛋白產(chǎn)生分 析。對于24mm直徑構(gòu)建物，在培養(yǎng)21天后，膠原蛋白產(chǎn)量平均為每個構(gòu)建物519 μ g。 對于24mm直徑的構(gòu)建物，在培養(yǎng)21天后，總蛋白產(chǎn)量平均為每個構(gòu)建物210 μ g。從形態(tài)學(xué) 上看，口腔粘膜成纖維細胞的細胞基質(zhì)構(gòu)建物(一種口腔結(jié)締組織的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物) 顯示出周圍圍繞著基質(zhì)的口腔粘膜成纖維細胞，而從物理學(xué)上看，構(gòu)建物具有物理松散性 和完整性。實施例10 在內(nèi)源產(chǎn)生的基質(zhì)構(gòu)建物中終止成纖維細胞、以形成失活的細胞基質(zhì) 構(gòu)建物的方法使用alamarBlue 測定，來檢測內(nèi)源產(chǎn)生的細胞基質(zhì)構(gòu)建物中成纖維細胞的終 止。alamarBlue 測定結(jié)合了氧化_還原指示劑，該指示劑在響應(yīng)生長培養(yǎng)基化學(xué)還原時 變色，作為細胞代謝的直接結(jié)果。隨暴露時間的延長，細胞代謝活性將會使alamarBlue 還 原成微紅色或粉紅色。缺乏活細胞則應(yīng)該沒有或很少有顏色變化。將按照實施例1的方法制備的12個24mm直徑的基質(zhì)構(gòu)建物(細胞基質(zhì)構(gòu)建物) 在具有0. 4微米孔徑的24mm培養(yǎng)插入物上生長25天，并且各培養(yǎng)插入物位于深孔板中。4 種成纖維細胞終止方法(每種條件各η = 3)過夜進行如下(1)在周圍室溫和濕度下風(fēng)干； (2)在100%乙醇中清洗；(3)風(fēng)干后快速冷凍；和⑷凍干。將24mm膜培養(yǎng)插入物移回到 原先的6孔板。各孔含有11. OmL Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑， 不含 L-谷氨酰胺，Bioffhittaker, ffalkersville, Md.)和 10% AlamarBlue 。在 8 小時和24小時從各孔采集培養(yǎng)基樣品200 μ L，采集樣品并等分到96孔板中，貯存于2_8°C。在采 樣的第二個時間點之后，在讀板器上以兩個波長對96孔板中的樣品讀數(shù)。根據(jù)讀板器給出 的吸光度值，計算AlamarBlue 還原的百分比。孵育24小時之后，所有所測條件都沒有顯示出明顯的代謝活性，這表明，使用這 些終止方法，成功地終止了各細胞基質(zhì)構(gòu)建物中的細胞。該實施例的結(jié)果是使單層基質(zhì)構(gòu) 建物失活，其可用于本發(fā)明的多層、或管狀、或復(fù)合生物工程構(gòu)建物的制備。該實施例的失 活方法可用于前述實施例的任何活的基質(zhì)構(gòu)建物，以得到失活的基質(zhì)構(gòu)建物。實施例11 人細胞衍生的真皮基質(zhì)的交聯(lián)按照實施例1的方法制備2個75mm直徑的細胞基質(zhì)構(gòu)建物，即通過在75mm直徑、 0. 4微米的多孔聚碳酸酯膜上培養(yǎng)它們。一種細胞基質(zhì)構(gòu)建物通過在室溫和室內(nèi)濕度下風(fēng) 干而失活，而另一種則通過在100%乙醇中浸泡過夜，然后風(fēng)干，讓乙醇從細胞基質(zhì)構(gòu)建物 中蒸發(fā)，而失活。使用一體積的無菌注射用水，使這兩種細胞基質(zhì)構(gòu)建物再水合。為了形成 兩層構(gòu)建物，用彎頭鑷子將細胞基質(zhì)構(gòu)建物從其各自的膜上剝離下來，并通過在IOOmm培 養(yǎng)皿蓋上將各層彼此疊合。將約15mL l.OmM EDC溶液加入到層狀的細胞基質(zhì)構(gòu)建物中，讓 其交聯(lián)過夜，或過約15-18小時。將2層構(gòu)建物從EDC溶液中取出，在無菌水中清洗并風(fēng)干， 得到2層交聯(lián)的失活細胞基質(zhì)構(gòu)建物，其是由人成纖維細胞內(nèi)源產(chǎn)生的。然后讓構(gòu)建物再水合。當再水合時，2層構(gòu)建物快速得到水分并且質(zhì)地變得平滑。 再水合過程幾乎是瞬間、在1分鐘之內(nèi)發(fā)生。2層構(gòu)建物看起來是一片組織并以一片組織來 操作。將構(gòu)建物切成約1. 25 X 5cm的4條，然后在Instron機械試驗機上測試強度。Instron 機記錄的各條的平均強度為4. 9N。實施例12 將失活組織構(gòu)建物分層并交聯(lián)，形成多層構(gòu)建物采用基本上類似于實施例1的方法和材料，將16個基質(zhì)構(gòu)建物在具有約0.4μπι 孔徑的75mm直徑的培養(yǎng)插入物膜上生長。為了使其失活，將組織構(gòu)建物在周圍室溫和濕度 下風(fēng)干過夜，確保成纖維細胞終止。然后用注射用水(WFI)，使失活的組織構(gòu)建物水合，用彎 頭鑷子或鈍頭鑷子將組織構(gòu)建物從各膜上剝離下來。將失活的組織構(gòu)建物在IOOmm培養(yǎng)皿 蓋(作為便利的工作表面)上完全鋪開，再通過將失活的組織構(gòu)建物一層疊合在另一層的 頂部而添加隨后的層，得到2或3層。讓各層在周圍室溫和濕度下風(fēng)干過夜，或過約15-18 小時。干燥之后，疊合層彼此粘附。所粘附的層水合，然后疊合在其它粘附層上，再讓其干 燥過夜，或過約15-18小時。從16個單層失活的組織構(gòu)建物，形成10層、5層和單層的構(gòu)建 物，其中10層構(gòu)建物和5層構(gòu)建物的各層經(jīng)干燥和再水合過程而彼此粘附。然后，構(gòu)建物 再與交聯(lián)劑交聯(lián)。將構(gòu)建物放入容器中，向各容器中加入約IOmL 1. OmMEDC/WFI溶液。讓 分層的失活ECM組織構(gòu)建物交聯(lián)過夜(大約15-18小時)。將組織構(gòu)建物從EDC溶液中取 出，用WFI清洗并在周圍室溫和濕度下風(fēng)干最后一次，得到交聯(lián)的多層失活的人細胞衍生 的組織構(gòu)建物。將2個多層構(gòu)建物切成約1. 25 X 5cm的3條，然后在Instron機械試驗機上測試 強度。5層組織構(gòu)建物的每一層的標準化拉伸強度經(jīng)測定為1. 425N/層；對于10層組織構(gòu) 建物，拉伸強度為1.706N/層。對無細胞的ECM組織構(gòu)建物進行風(fēng)干、分層和EDC交聯(lián)的組合，成功賦予無細胞 ECM強度和均勻性?？沙晒Φ貙o細胞的ECM組織構(gòu)建物進行分層、干燥并讓其再水合。對無細胞的ECM組織構(gòu)建物的操作和成形并不能減少多次干燥和再水合的步驟。將無細胞的 ECM組織構(gòu)建物層數(shù)增加至5層和多達10層，可增加構(gòu)建物的總體強度并在切割成一定大 小之后能保持組織形狀。實施例13 使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶/EDC進行交聯(lián)，制備多層細胞 基質(zhì)構(gòu)建物將失活的細胞基質(zhì)構(gòu)建物分層，并用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、接著用 EDC/MES緩沖液來交聯(lián)，將各層結(jié)合在一起。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(“TGM”)是作用是連接蛋白 質(zhì)的天然存在的酶家族的統(tǒng)稱。TGM催化游離氨基與Y-羧酰胺基之間形成共價鍵，尤其作 用于賴氨酸和谷氨酰胺。有若干種形式的TGM，但集中在本實驗的類型是Activa 食品級 TGM，它是通過發(fā)酵方法而制備的，可用作粘合劑。它是到貨即用的干粉劑，但也可混合為漿 液或溶液。按照實施例1的方法并采用基本上類似于實施例1中所提出那些的材料，將12個 細胞基質(zhì)構(gòu)建物在具有0. 4 μ m多孔膜的75mm直徑的培養(yǎng)插入物中生長并培養(yǎng)25天。將 細胞基質(zhì)構(gòu)建物在周圍室溫和濕度下風(fēng)干過夜，約15-18小時，使其失活。用無菌注射用 水(WFI)，使干燥失活的細胞基質(zhì)構(gòu)建物水合，用鈍頭鑷子將構(gòu)建物從其各自的膜上剝離下 來。將細胞基質(zhì)構(gòu)建物在IOOmm培養(yǎng)皿上完全鋪開，讓疊合的細胞基質(zhì)構(gòu)建物層疊地放在 其上，形成3個4層構(gòu)建物。在分層時，各細胞-基質(zhì)層接觸不同濃度(對于每個4層構(gòu)建 物的濃度為28U、280U和700U)的5. OmL TGM溶液，所述溶液添加到各層之間，以確保全部 細胞_基質(zhì)層都受到交聯(lián)劑的處理。讓細胞基質(zhì)構(gòu)建物在交聯(lián)溶液中松散地分層，以評價 在不施加壓力或使用干燥步驟的情況下各層的融合情況。將3個4層細胞基質(zhì)構(gòu)建物放入 40°C培養(yǎng)箱中過夜，或過約15-18小時。將這3個4層細胞基質(zhì)構(gòu)建物從40°C培養(yǎng)箱中移 出并讓其在周圍室溫和濕度下風(fēng)干。完全風(fēng)干之后，用無菌WFI，讓這些細胞基質(zhì)構(gòu)建物水 合。將這些細胞基質(zhì)構(gòu)建物對半切開，各構(gòu)建物的一半用l.OmM EDC/MES緩沖液處理并讓 其在4°C交聯(lián)過夜。各構(gòu)建物的另一半用TGA單獨來交聯(lián)，也在WFI中于4°C貯存過夜。次 日，所有6片都在Instron機上測試拉伸強度和縫線置留(suture retention)。盡管樣品與樣品之間結(jié)果不同，通常，所有條件都得到失活的內(nèi)源產(chǎn)生的細 胞_基質(zhì)層的4層結(jié)合的構(gòu)建物，當將TGA單獨處理與TGA/EDC交聯(lián)和結(jié)合的構(gòu)建物比較 時，其每層經(jīng)測定都具有相當?shù)膹姸?。實施?4 使用食品級谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進行交聯(lián)，制備多 層細胞基質(zhì)構(gòu)建物在多層失活細胞基質(zhì)構(gòu)建物上，比較了兩類谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGM)。所比較的酶的 種類是Activa 食品級和重組人谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。按照實施例1的方法并采用基本上類似于實施例1中所提出那些的材料，將32個 細胞基質(zhì)構(gòu)建物在具有0. 4 μ m多孔膜的75mm直徑的培養(yǎng)插入物中生長并培養(yǎng)25天。將 所有組織基質(zhì)構(gòu)建物在周圍室溫和濕度下風(fēng)干，使其失活。然后用無菌注射用水(WFI)，H 干燥失活的單層細胞基質(zhì)構(gòu)建物水合24小時，再用鈍頭鑷子將構(gòu)建物從其各自的膜上剝 離下來。然后制備具有8層的細胞基質(zhì)構(gòu)建物。通過將細胞-基質(zhì)片疊合，使其成對分層，得到16個2層細胞基質(zhì)構(gòu)建物。再讓 它們在周圍室溫和濕度下、在無菌條件下風(fēng)干。將4組2-層構(gòu)建物在IOOmm板上鋪開，向
32各組中加入20mL指定類型和活性的TGM或rhTGM溶液⑴8層食品級TGM 5U ；⑵8層食 品級TGM IOU ； (3)8層rhTGM 15U ；和，(4)8層rhTGM 30U。將構(gòu)建物放入40°C培養(yǎng)箱中并 讓其交聯(lián)過夜。次日，每種條件的2層構(gòu)建物層疊形成4層構(gòu)建物。再次重復(fù)該過程，但不 加TGM，對于每種交聯(lián)條件都得到1個8層構(gòu)建物。將其在周圍室溫和濕度下風(fēng)干并用相同 的TGM交聯(lián)劑處理第2次和最后一次。將構(gòu)建物放入40°C培養(yǎng)箱中并讓其交聯(lián)過夜，約過 18-24小時。最后風(fēng)干之后，用無菌WFI使構(gòu)建物水合。用激光測量各構(gòu)建物的厚度。每個 8層單元(unit)都取3片，在Instron機上測試拉伸強度和縫線置留。在本實驗中，對于8層構(gòu)建物，用rhTGM進行交聯(lián)，比用食品級TGM更成功。與其 它條件相比，較低濃度的rhTGM得到更好的拉伸強度和縫線置留。實施例15 結(jié)締組織構(gòu)建物接種從擴大培養(yǎng)中回收的成纖維細胞，在所述擴大培養(yǎng)中將成纖維細胞培養(yǎng)在生 物反應(yīng)器內(nèi)的微載體上。用不銹鋼篩網(wǎng)裝置過濾成纖維細胞，將成纖維細胞與微載體分離。 該步驟從細胞懸液中移出所有微載體和細胞塊。將約3. OX IO7細胞接種到浸泡在約140mL 化學(xué)成分確定的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基中的約44cm2表面積的0. 4微米多孔膜上。該接種密度為 超匯合。化學(xué)成分確定的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基含有DMEM(高葡萄糖，不含L-谷氨酰胺)的基 礎(chǔ)，添加大約以下量的成分4mM L-谷氨酰胺；lOng/ml人重組表皮生長因子；1 X10_4M乙醇 胺；1 X ICT4M ο-磷酰基-乙醇胺；5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，20 P M三碘甲狀腺原氨酸，5 μ g/ml胰 島素；6. 78ng/ml亞硒酸；50ng/ml抗壞血酸鎂；0. 2 μ g/ml L-脯氨酸；0. 1 μ g/ml甘氨酸； 0. 02 μ g/ml 人重組長鏈 TGF- α ；0. 0038 μ g/ml 前列腺素 E2 (PGE2) ；0.4 μ g/ml 氫化可的松。 每隔3-4天將基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基更換為新鮮基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基，共18天。在此時間內(nèi)，細胞形 成內(nèi)源性細胞基質(zhì)構(gòu)建物。實施例16 雙層皮膚構(gòu)建物在化學(xué)成分完全確定的培養(yǎng)基系統(tǒng)中形成具有成纖維細胞層和角質(zhì)細胞層的皮 膚構(gòu)建物。接種從擴大培養(yǎng)中回收的成纖維細胞，在所述擴大培養(yǎng)中將成纖維細胞培養(yǎng)在 生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體上。用不銹鋼篩網(wǎng)裝置過濾成纖維細胞，將成纖維細胞與微載體分 離。該步驟從細胞懸液中移出所有微載體和細胞塊。約1. OX IO7細胞接種到浸泡在約130mL 化學(xué)成分確定的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基中的約44cm2表面積的0. 4微米多孔膜上。該接種密度為 超匯合。化學(xué)成分確定的基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基含有 將成纖維細胞在基質(zhì)產(chǎn)生培養(yǎng)基中培養(yǎng)11天，每隔3-4天定期更換培養(yǎng)基。在第11天，在培養(yǎng)基中，將角質(zhì)細胞懸液接種到細胞基質(zhì)構(gòu)建物表面，其密度約 3. 3 X IO6細胞，所述培養(yǎng)基含有大約以下量的成分 在第13天，通過添加含有以下成分的分化培養(yǎng)基來誘導(dǎo)分化 在第15天，更換培養(yǎng)基制劑，以在含有大約以下量的成分的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)正在發(fā) 育的角質(zhì)細胞層的角質(zhì)化 角質(zhì)化培養(yǎng)基每隔2-3天更換一次。皮膚構(gòu)建物成熟并維持在第22-35天期間，并添加維持培養(yǎng)基，每隔2-3天用含有以下成分的新鮮維持培養(yǎng)基來更換培養(yǎng)基 當完全形成時，培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建物顯示出內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)及其成纖維細胞的 細胞_基質(zhì)層，其中分化的角質(zhì)細胞層置于細胞_基質(zhì)層的頂部。實施例17 使用絲纖蛋白粘合液，制備膠原蛋白性材料-合成的聚合物構(gòu)建物測試了純化的異種膠原蛋白層(例如“ICL”)與各種物體的粘合特性。更具體地 講，并不視為限于以下實施方案，分析了介于以下兩者之間的粘合性能(a)兩層ICL層； (b)至少一層ICL層與至少一種基于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的聚合物框架；和(c)至少一 層ICL層與至少一種基于PHA的聚合物桿。樣品制備如下列實例所述(a)將干燥的單層ICL切割成1X2. 5cm大小的片。將2片ICL重疊0. 5cm尺寸而 粘附，將一滴絲液滴加在各層之間。可以理解，所切ICL片的尺寸和重疊尺寸并不限于以上 實例。(b)將基于PHA的聚合物框架在絲纖蛋白溶液中浸泡至少一分鐘，用絲纖蛋白溶 液薄層覆蓋框架表面支柱。再將一片ICL(約1.5X1. 5cm)粘附在框架前端。(c)將基于PHA的聚合物桿在絲纖蛋白溶液中浸泡至少一分鐘，其用量足以用絲 纖蛋白溶液薄層覆蓋桿表面。再將一片ICL(約1X1. 5cm)粘附在桿上。隨后，所有樣品都在室溫下干燥約1. 5小時。再將樣品浸泡在基于甲醇的溶劑中 過5-10分鐘，然后干燥10分鐘。將上述樣品浸泡在去離子水中過至少24小時。然后，使 用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，通過對樣品施加機械應(yīng)力來評價絲纖蛋白溶液所達到 的粘合特性。并不視為是限制性的，可以理解，用絲纖蛋白水溶液作為粘合劑，可以實施例如在 ICL與以下材料之間的粘合電紡膠原蛋白、電紡纖維蛋白、基于金屬的材料、基于陶瓷的 材料、組織工程構(gòu)建物、合成的聚合物材料、天然材料。實施例18 使用絲纖蛋白粘合液，制備多層細胞基質(zhì)構(gòu)建物為了制備多層細胞-組織構(gòu)建物，先將單元(unit)從培養(yǎng)中移出，吸去生長和/ 或基質(zhì)制備培養(yǎng)基，讓單元風(fēng)干至少到細胞失活。然后在IOml WFI中讓單元再水合約10 分鐘。另外和/或或者，將單元在5mL中再水合或暴露至約0. 5mL的約8%絲液中，然后將 單元層疊在一起。再讓單元干燥過夜，隨后浸泡在3mL甲醇中過至少10分鐘。重復(fù)上述步驟，直到形成5層或更多層細胞_組織構(gòu)建物。作為替代方法，可以理解，可將谷氨酰胺轉(zhuǎn) 移酶施用于多層細胞組織-構(gòu)建物的各層之間。另外，在用8%絲液處理各層的步驟之后， 可用滾筒將所述單元碾平。隨后通過將構(gòu)建物放入凍干機中過至少約17小時，將所得5層或更多層細胞_組 織構(gòu)建物凍干?？梢岳斫猓z液起到粘合劑的作用，以防止層狀的構(gòu)建物分層。盡管為了清楚和便于理解的目的，以說明和實例的方式詳細描述了本發(fā)明，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以進行某些變化和修改。
權(quán)利要求
一種生物工程構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含由培養(yǎng)的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞所產(chǎn)生并裝配的胞外基質(zhì)的失活層。
2.權(quán)利要求1的生物工程構(gòu)建物，所述構(gòu)建物還包含由培養(yǎng)的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞所產(chǎn) 生并裝配的胞外基質(zhì)的一層或多層額外失活層。
3.權(quán)利要求2的生物工程構(gòu)建物，其中所述胞外基質(zhì)層已經(jīng)脫去所述培養(yǎng)的胞外基質(zhì) 產(chǎn)生細胞。
4.權(quán)利要求3的生物工程構(gòu)建物，其中所述胞外基質(zhì)層在結(jié)合區(qū)彼此相鄰接觸。
5.權(quán)利要求4的生物工程構(gòu)建物，其中在結(jié)合區(qū)相鄰接觸的所述胞外基質(zhì)層是通過交 聯(lián)而結(jié)合在一起的。
6.權(quán)利要求4的生物工程構(gòu)建物，其中在結(jié)合區(qū)相鄰接觸的所述胞外基質(zhì)層是通過置 于所述層之間的生物可重塑的或生物可再吸收的粘合劑而結(jié)合在一起的。
7.權(quán)利要求6的生物工程構(gòu)建物，其中所述生物可重塑的或生物可再吸收的粘合劑是 源自家蠶(Bombyx mori)的溶液。
8.權(quán)利要求7的生物工程構(gòu)建物，其中所述溶液包含絲纖蛋白，其濃度介于約2%至約 8% w/v之間。
9.權(quán)利要求2的生物工程構(gòu)建物，其中至少一層胞外基質(zhì)是交聯(lián)的。
10.權(quán)利要求2的生物工程構(gòu)建物，其中至少一層胞外基質(zhì)交聯(lián)程度較低，且至少一層 胞外基質(zhì)交聯(lián)程度較高。
11.權(quán)利要求1的生物工程構(gòu)建物，其中所述層是在包括不含動物來源成分的化學(xué)成 分確定培養(yǎng)基在內(nèi)的條件下產(chǎn)生的。
12.權(quán)利要求1的生物工程構(gòu)建物，其中所述胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞源自選自以下的組織 男性新生兒包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帶、角膜基質(zhì)、口腔粘膜和腸。
13.權(quán)利要求1的生物工程構(gòu)建物，其中所述胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞源自干細胞。
14.權(quán)利要求1的生物工程化組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞是真皮 成纖維細胞。
15.一種用于制備生物工程構(gòu)建物的方法，所述方法包括在誘導(dǎo)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞形成第一層胞外基質(zhì)的條件下，在第一培養(yǎng)物中培養(yǎng)所述細胞；在誘導(dǎo)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞形成第二層胞外基質(zhì)的條件下，在第二培養(yǎng)物中培養(yǎng)所述細胞；在第一層胞外基質(zhì)和第二層胞外基質(zhì)中終止所述胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞，形成胞外基質(zhì)的第一和第二失活層；通過讓胞外基質(zhì)的第一失活層與胞外基質(zhì)的第二失活層疊合，將所述第一層與第二層 接觸，形成結(jié)合區(qū)；將所述第一層與第二層結(jié)合，其中所述結(jié)合是通過交聯(lián)或粘合劑而實現(xiàn)的。
全文摘要
生物工程構(gòu)建物是由培養(yǎng)細胞經(jīng)誘導(dǎo)合成并分泌內(nèi)源產(chǎn)生的胞外基質(zhì)組件而形成的，無需外源基質(zhì)組件或網(wǎng)絡(luò)載體或支架元件。本發(fā)明的生物工程構(gòu)建物可以用各種方式來處理，使所述生物工程構(gòu)建物的細胞失活和/或除去，而不破壞所述構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)完整性。此外，本發(fā)明的生物工程構(gòu)建物可以與生物相容的/生物可重塑的溶液聯(lián)合使用，其允許所述構(gòu)建物具有各種幾何構(gòu)型。
文檔編號C12N5/071GK101925675SQ200880125904
公開日2010年12月22日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者K·C·法里亞, 王冼燕 申請人:器官發(fā)生有限公司