專利名稱：使用表達(dá)鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶的重組生物進(jìn)行有機化合物的工業(yè)生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)表達(dá)鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶的基因修飾生物而進(jìn)行的生物燃料及 其它鹵代甲烷衍生物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
鹵代甲烷是反應(yīng)性的一碳化合物，從其可以生產(chǎn)出多種具有重要商業(yè)價值的有機 產(chǎn)物。已經(jīng)使用高能耗并且包含高溫和高壓條件的化學(xué)方法進(jìn)行鹵代甲烷的工業(yè)生產(chǎn)。 例如，鹵代甲烷工業(yè)生產(chǎn)的常見方法包括在高溫并且壓力至少為1巴的條件下，在存在氧 化鋁催化劑時將甲醇與氣態(tài)氯化氫反應(yīng)。參見，例如，McKetta, J.，CHEMICAL PROCESSING HANDBOOK,1993。多種植物和真菌產(chǎn)生鹵代甲烷并將它們釋放到環(huán)境中。這些生物含有將氯、溴或 碘離子與代謝產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸(“AdoMet”或“SAM”)的甲基結(jié)合以形成鹵代甲烷和 S-腺苷高半胱氨酸的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括一種方法，其包括將⑴包含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲 烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的生物、(ii)選自包含氯化物、溴化物和碘化物的組的鹵化物；和(iii)培 養(yǎng)基中的碳源，在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下混合?？蛇x地，可以收集該鹵代甲烷。該鹵代甲 烷可以轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵化有機分子的混合物，并且可以可選地對它們進(jìn)行收 集?？梢砸怨I(yè)規(guī)模實施該方法，例如，在反應(yīng)器中實施。本發(fā)明還提供了基因修飾的藻類、 真菌或細(xì)菌，其包含異源S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶基因，其經(jīng)過基因 修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途徑的通量；和/或其經(jīng)過基因修飾以提 高胞內(nèi)鹵化物濃度。有用的生物包括藻類、酵母和細(xì)菌。所述重組生物可以是革蘭氏陰性細(xì)菌， 例如，大腸桿菌(E. col i)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、集胞 藻(Synechtocystis)或歐文氏菌屬(Erwinia)。其它革蘭氏陰性細(xì)菌包括來自甲基 球菌科(Methylococcaceae)和甲基孢囊菌科(methylocystaceae)的成員；極端嗜熱 胃(Thermotoga hypogea)、BW ^ W Ifi lif (Thermotoganaphthophi la) > iiil T W Ifi lif (Thermotoga subterranean)、嗜鹽石油神袍菌(Petrotoga halophila)、墨西哥石油神袍菌(Petrotogamexicana)、溫禾口石油神袍菌(Petrotoga miotherma)禾口運云力石油神袍菌 (Petrotoga mobilis)。作為另外一種選擇，該重組生物可以是革蘭氏陽性細(xì)菌，例如，枯 草芽孢桿菌(B. subtilis)或梭狀芽孢桿菌(Clostridium)。如果需要，該重組生物可以 是真菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、 多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Scizosacchromyces pombe)或 里氏木霉(Trichodermareesei)，或酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢 遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、木霉屬 (Trichoderma)和裂殖酵母屬(Scizosacchromyces)的其它酵母種。該重組生物還可以是 真核生物，如藻類。藻類的實例包括衣藻型(Chlamydomonas)。該生物可選地包含編碼異源MHT的基因。該MHT可以是天然存在的MHT或是合 成的MHT。如果需要，該異源MHT的表達(dá)可以受誘導(dǎo)型啟動子的控制。有用的MHT包括， 例如但不限于，來自鹽草(Batis maritima)、腫塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、 iffl ix ^ (Synechococcus elongatus)、憲菁(Brassica rapa) > 1ξ[" M (Brassica oleracea)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、鉤端螺菌 屬(Leptospirillum)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、禾S (Oryza sativa)、 金牛販球菌(Ostreococcus tauri)、芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)、灰蓋 鬼傘(Coprinopsis cinerea)、Robiginitalea bofirmata、馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)、葡萄(Vitis vinifera)或嗜鹽嗜鹽紅螺菌 (halorhodospira halophila)的MHT。其它有用的MHT包括(但不限于)來自伯克氏菌 (B. xenovorans)、小白菜(B. rapa chinensis)、類鼻痕伯克氏菌(B. pseudomallei)、泰國伯 克氏菌(B. thailandensis)、海洋細(xì)菌HTCC2080和皮氏羅爾斯頓菌(R. pickett)的MHT。還 參見以下的討論和圖10A?？梢詫ι镞M(jìn)行基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途徑 的通量。例如，可以通過SAM合成酶的表達(dá)或過表達(dá)提高通過SAM生物合成途徑的通 量。SAM合成酶可以是大腸桿菌(E. coli)metK、立克次氏體(Rickettsia)metK、釀酒酵母 (S. cerevisae) samlp或釀酒酵母sam2p。SAM合成酶可選地具有與大腸桿菌(E. coli)metK 至少80%的氨基酸同一性。如果需要，可以通過使至少一種基因的表達(dá)和/或活性消除、失活或降低以提高 通過SAM生物合成途徑的通量。在適當(dāng)?shù)那闆r下，該基因可以參與SAM利用途徑，例如，糞 卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶、胱硫醚β-合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表異 構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3’，5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn) 移酶或甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。也可以通過提高通過甲硫氨酸生物合成途徑的通量來提高通過SAM生物合成途 徑的通量。例如，可以通過大腸桿菌(E. coli)metL、metA、metB、metC、metE和/或metH基 因的表達(dá)或過表達(dá)以提高通過甲硫氨酸生物合成途徑的通量。如果需要，可以使編碼甲硫 氨酸生物合成阻遏物的基因，例如，大腸桿菌(E. coli)metJ失活。如果需要，可以通過表達(dá)諸如Sam5p酵母線粒體基因的SAM轉(zhuǎn)運子蛋白以提高該 通量。另一方面，可以通過表達(dá)提高ATP胞內(nèi)濃度和/或可用性的基因和/或通過提高胞內(nèi)
8鹵化物濃度(例如，通過鹵化物轉(zhuǎn)運子蛋白基因的過表達(dá))來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。所述 鹵化物轉(zhuǎn)運子可以是大腸桿菌(E. colDclc轉(zhuǎn)運子或與大腸桿菌clc轉(zhuǎn)運子具有至少80% 氨基酸序列同一性的基因?？梢詫⒈景l(fā)明中使用的鹵化物以鹵鹽例如，氯化鈉、溴化鈉和碘化鈉來提供。該鹵 化物可以以0.05至0.3M的濃度存在于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基可選地包含甲硫氨酸。所產(chǎn)生的 鹵代甲烷可以是氯甲烷、溴甲烷和/或碘甲烷。鹵代甲烷向其它產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化可以是催化縮 合(catalytic condensation)的結(jié)果。有用的催化劑包括沸石催化劑，例如，ZSM-5或溴化 鋁(AlBr3)。催化縮合步驟導(dǎo)致鹵化物的產(chǎn)生，其可以再循環(huán)回到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的方法 可以用于生產(chǎn)包含烷烴(例如，乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷或它們的混合物) 的組合物?？梢援a(chǎn)生的其它有機分子包括但不限于烯烴、醇、醚和/或醛。可以在多個(例如，2、3、4、5或6個)位點對所述生物進(jìn)行基因修飾。每種修飾的 影響單獨可以提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。本發(fā)明一方面，提供了一種方法，其包括在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下將i)包含編碼 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的異源基因的重組酵母、ii)選自 包含氯化物、溴化物和碘化物的組的鹵化物；和iii)碳源在培養(yǎng)基中混合的步驟。該方法 還可以包括將所述鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵化有機分子混合物的步驟。在 一些實施方式中，所述酵母來自于選自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、 漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、木 霉屬(Trichoderma)和裂殖酵母屬(Scizosacchromyces)的屬。例如，所述酵母可以 是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形 漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂 耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或粟酒裂殖酵母 (Scizosacchromycespombe) 。 一，MHT * 自(Batis maritima)。 在一些實施方式中，所述碳源為通過纖維素代謝產(chǎn)生的乙酸鹽和/或乙醇，其中纖維素是 通過可分解纖維素的微生物代謝的。該分解纖維素的微生物可以是細(xì)菌，如發(fā)酵氨基酸球 菌(Actinotaleafermentans)。在一些實施方式中，纖維素為微晶纖維素。在一些實施方式 中，纖維素為切碎或粉碎的原料(例如，粉碎的柳枝稷、甘蔗渣、象草、玉米秸稈和白楊)。本發(fā)明一方面，提供了包含酵母和纖維素細(xì)菌的共培養(yǎng)物系統(tǒng)，其中所述酵母表 達(dá)至少一種異源蛋白。所述共培養(yǎng)物系統(tǒng)可以含有纖維素。在一些實施方式中，所述共培 養(yǎng)物系統(tǒng)含有一種酵母和一種細(xì)菌。在所述共培養(yǎng)物系統(tǒng)的一些實施方式中，所述酵母可以來自選自由酵母 屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母 屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、木霉屬(Trichoderma)和裂殖酵母屬 (Scizosacchromyces)構(gòu)成的組的屬,例如,釀酒酵母(S. cerevisiae)。在一些實施方式中，所述共培養(yǎng)物的酵母和細(xì)菌在培養(yǎng)中具有共生關(guān)系。在一些 實施方式中，所述細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。本發(fā)明一方面，提供了兩種微生物穩(wěn)定的體外共培養(yǎng)物(共培養(yǎng)，co-culture)， 所述兩種微生物適應(yīng)于需氧共同生長并且保持相對恒定的物種種群比，從而使任一種微生 物種群都不壓倒另一種。所述共培養(yǎng)物包括(i)代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種代謝產(chǎn)物的第一微生物組分；(ii)經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源蛋白并且不能夠經(jīng)過代謝降解纖維素 的第二微生物組分，其中第二微生物使用第一微生物的代謝產(chǎn)物作為碳源。在一種實施方 式中，第一微生物為纖維素細(xì)菌(cellulosic bacteria)而第二微生物為酵母。在一種實 施方式中，所述酵母表達(dá)異源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶。在一些實施方式中，所述酵母為釀酒酵母 (S. cerevisiae)而所述細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。在某些實施方式中，所述異源基因編碼包含MHT序列和將該MHT序列靶向酵母液 泡的靶肽序列的融合蛋白。該靶肽序列可以是羧肽酶Y的N末端肽結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明一方面，提供生產(chǎn)鹵代甲烷的方法，其包括在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下，在含 有纖維素和鹵化物的培養(yǎng)基中，將代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種代謝產(chǎn)物的第一微生物與 不代謝纖維素并經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶蛋白的第二微生物共同培養(yǎng)。在 一些實施方式中，該鹵化物為氯化物、溴化物和碘化物。本發(fā)明一方面，提供了重組酵母細(xì)胞，其包含編碼S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的異源基因。在某些實施方式中，該MHT來 自鹽草(Batis maritima)、月中塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、細(xì)長聚球藻 (Synechococcus elongatus)、憲菩(Brassica rapa) > 1ξ[" M (Brassica oleracea)、 擬南芥(Arabidopsisthaliana)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、鈞端螺菌屬 (Leptospirillum)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、禾S (Oryza sativa)、金 牛販球菌(Ostreococcus tauri)、芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)、灰蓋鬼 傘(Coprinopsis cinerea)、Robiginitalea bofirmata、馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)、葡萄(Vitis vinifera)或嗜鹽嗜鹽 紅螺菌(halorhodospira halophila)。在某些實施方式中，該MHT來自伯克氏菌 (B. xenovorans)、小白菜(B. rapa chinensis)、類鼻疽伯克氏菌(B. pseudomallei)、泰國 伯克氏菌(B. thailandensis)、海洋細(xì)菌HTCC2080或皮氏羅爾斯頓菌(R.pickett)。在 某些實施方式中，所述重組酵母細(xì)胞選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德 畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、角軍月旨耳口氏酵母(Yarrowia lipolytica)、里氏木霄(Trichoderma reesei)和粟酒裂殖酵母(Scizosacchromyces pombe)。例如，所述重組酵母細(xì)胞可以是表 達(dá)鹽草(Batis maritima)鹵代甲燒轉(zhuǎn)移酶蛋白的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 細(xì)胞。在一些實施方式中，該MHT作為融合蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)，所述融合蛋白包含 將蛋白質(zhì)靶向酵母液泡的靶肽序列(targetingp印tide sequence)。在一種實施方式中，該 靶肽序列是羧肽酶Y的N末端肽結(jié)構(gòu)域。另一方面，本文說明了共培養(yǎng)物系統(tǒng)，其包含培養(yǎng)基，其中含細(xì)菌代謝纖維素并產(chǎn) 生一種或多種代謝產(chǎn)物的纖維素細(xì)菌組分和使用所述細(xì)菌的至少一種代謝產(chǎn)物作為碳源 的酵母組分。在一種實施方式中，細(xì)菌-酵母共培養(yǎng)物包含代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種 代謝產(chǎn)物的發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)細(xì)菌和使用所述細(xì)菌產(chǎn)生的至少 一種代謝產(chǎn)物作為碳源的釀酒酵母(S. cerevisiae)。所述培養(yǎng)基可以含有纖維素。在一些 實施方式中，所述酵母不能通過代謝降解纖維素。在一些實施方式中，所述(一種或多種) 代謝產(chǎn)物是所述酵母唯一的或主要的碳源和能量來源。
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在一些實施方式中，所述酵母經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源蛋白或過表達(dá)內(nèi)源蛋白。 在一些實施方式中，所述酵母經(jīng)過重組修飾以敲除內(nèi)源蛋白的表達(dá)。在一些實施方式中， 所述細(xì)菌和酵母共同生長而保持相對恒定的物種種群比從而使得任一種微生物種群都不 壓倒另一種。所述共培養(yǎng)物系統(tǒng)可以保持在基本有氧的(aerobic)條件或基本無氧的 (anaerobic)條件下。在各種實施方式中，所述酵母來自于選自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵 母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母 (Yarrowia)(Trichoderma)禾口Hlt-M (Scizosacchromyces)白勺Μ。 禾中$ 施方式中，所述酵母為釀酒酵母(S.cerevisiae)。在多種實施方式中，所述細(xì)菌為氨基酸 球菌(Actinotalea)或纖維單胞菌(cellulomonas)種。在一種實施方式中，所述細(xì)菌為 發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。在一種實施方式中，所述酵母為釀酒酵母 (S. cerevisiae)而所述細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotaleafermentans)。在一些實施方 式中，所述共培養(yǎng)物(co-culture，共培養(yǎng))包含僅一種酵母和僅一種細(xì)菌。在一些實施方 式中，所述酵母和細(xì)菌在培養(yǎng)中具有共生關(guān)系。在一些實施方式中，由所述細(xì)菌產(chǎn)生的碳源為包含1-6個碳原子的分子，如，例 如，乙醇、乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽或蘋果酸鹽。在一些實施方式中，所述酵母表達(dá)異源蛋白。例如，所述異源蛋白可以是哺乳動物 蛋白，如，例如用于治療患者的人蛋白。在一些實施方式中，所述異源蛋白是酶，如在酵母中 催化合成途徑中步驟的酶。在一種實施方式中，所述異源蛋白是鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶。在一些 實施方式中，所述酵母經(jīng)過基因工程設(shè)計以產(chǎn)生具有商業(yè)價值的小分子化合物。在其它實 施方式中，所述酵母是未經(jīng)重組修飾的天然存在的或培養(yǎng)的菌株。另一方面，本文說明了 一種酵母培養(yǎng)方法，其包括在培養(yǎng)基中，在存在纖維素或纖 維素源的情況下，在以下條件下共同培養(yǎng)纖維素細(xì)菌和酵母，在所述條件下(i)所述細(xì)菌 代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種代謝產(chǎn)物，且(ii)所述酵母組分使用所述細(xì)菌的至少一種 代謝產(chǎn)物作為碳源。通常所述培養(yǎng)基是液體。在一種實施方式中，所述纖維素為微晶纖維
ο在一些實施方式中，所述纖維素源是生物質(zhì)(biomass)，例如但不限于，柳枝稷、甘 蔗渣、象草、玉米秸桿、白楊(每種均可以粉碎)以及這些和其它生物質(zhì)材料的混合物。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)維持在有氧條件下。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)維 持在無氧條件下。在一些實施方式中，所述酵母和細(xì)菌在培養(yǎng)中具有共生關(guān)系。在一些實 施方式中，所述酵母不能通過代謝降解纖維素。在一些實施方式中，所述細(xì)菌產(chǎn)生的碳源為 包含1-6個碳原子的分子，如，例如，乙醇、乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽或 蘋果酸鹽。在多種實施方式中，所述共培養(yǎng)物中的酵母來自于選自酵母屬(Saccharomyces)、 畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵 母(Yarrowia)(Trichoderma)禾口Hlt-M (Scizosacchromyces)白勺Μ。 禾中 實施方式中，所述酵母為釀酒酵母(S. cerevisiae)。在多種實施方式中，所述細(xì)菌為氨基 酸球菌(Actinotalea)或纖維單胞菌(Cellulomonas)種。在一種實施方式中，所述細(xì)菌 為發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。在一種實施方式中，所述酵母為釀酒酵母(S. cerevisiae)而所述細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌。在一些實施方式中，所述共培養(yǎng)物包含僅 一種酵母和僅一種細(xì)菌。在一些實施方式中，所述酵母和細(xì)菌在培養(yǎng)中具有共生關(guān)系。一些實施方式中，所述酵母經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源蛋白。例如，所述異源蛋白可 以是哺乳動物蛋白，如，例如用于治療患者的人蛋白。在一些實施方式中，所述異源蛋白是 酶。在一種實施方式中，所述異源蛋白是鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶。在一些實施方式中，所述酵母經(jīng) 過基因工程設(shè)計以產(chǎn)生具有商業(yè)價值的小分子化合物。在其它實施方式中，所述酵母是未 經(jīng)過重組修飾的天然存在的或培養(yǎng)的菌株。在一些實施方式中，所述酵母經(jīng)過重組修飾以敲除內(nèi)源蛋白的表達(dá)。在其它實施 方式中，所述酵母是未經(jīng)過重組修飾的天然存在的或培養(yǎng)的菌株。在一些實施方式中，所述方法包括從由酵母產(chǎn)生產(chǎn)物的培養(yǎng)基中回收產(chǎn)物的步 驟?？梢曰厥盏漠a(chǎn)物的實例包括，但不限于，由所述酵母表達(dá)的重組蛋白、由所述酵母細(xì)胞 合成的小分子、藥物、食品產(chǎn)品、氨基酸、輔因子、激素、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、烷烴、芳族化 合物、烯烴、醇或生物燃料中間體。在一種實施方式中，所述產(chǎn)物是鹵代甲烷。在一些實施 方式中，所述產(chǎn)物的合成需要在酵母中表達(dá)異源蛋白。在一些實施方式中，所述合成需要表 達(dá)在酵母中過表達(dá)的內(nèi)源蛋白或缺失酵母的一種或多種內(nèi)源基因。一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)鹵代甲烷的方法，其包括在包含纖維素源和鹵化物的 培養(yǎng)基中，在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下將代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種代謝產(chǎn)物的纖維素細(xì) 菌與不代謝纖維素并經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶蛋白的酵母共同培養(yǎng)。所述 鹵化物可以是氯化物(chlorine)、溴化物(bromine)和碘化物(iodine)?！矫?，本發(fā)明提供了一種方法，其包括在培養(yǎng)基中在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下混 合i)包含編碼S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的異源基因的重組 酵母，ii)選自氯化物、溴化物和碘化物構(gòu)成的組的鹵化物；和iii)通過纖維素代謝產(chǎn)生碳 源的纖維素分解細(xì)菌。在一些實施方式中，所述碳源是包含1-6個碳原子的分子，如乙醇、 乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、甲酸鹽、檸檬酸鹽或蘋果酸鹽。在一些實施方式中，所述方法包 括從培養(yǎng)基中回收鹵代甲烷并將該鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵化有機分子的 混合物。在一些實施方式中，所述酵母為釀酒酵母(S. cerevisiae)或下文所述的另一種酵 母。在一些實施方式中，所述細(xì)菌是發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotaleafermentans)或下 文所述的另一種纖維素細(xì)菌。在一些實施方式中，所述MHT來自鹽草(Batis maritima) 或為下文所述的另一種MHT。在一種實施方式中，所述酵母為釀酒酵母(S. cerevisiae)， 所述細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)而所述MHT來自鹽草(Batis maritima)。
圖1 通過含有從IPTG-誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)的重組鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)基因的 細(xì)菌進(jìn)行的鹵代甲烷生產(chǎn)。圖2 向培養(yǎng)基添加IPTG后，通過含有從IPTG-誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)的重組MHT基 因的細(xì)菌進(jìn)行的鹵代甲烷生產(chǎn)的時間過程。圖3 細(xì)菌生長期對鹵代甲烷生產(chǎn)的影響。
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圖4 培養(yǎng)基中鹵鹽濃度對鹵代甲烷生產(chǎn)的影響。圖5 不同鹵化物對鹵代甲烷生產(chǎn)的影響。圖6 通過過表達(dá)除MHT之外的基因(例如，metK)的細(xì)菌生產(chǎn)鹵代甲烷。圖7 通過表達(dá)來自多種生物的多種異源MHT的細(xì)菌實現(xiàn)鹵代甲烷的生產(chǎn)。圖8 生產(chǎn)有機化合物的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的示意圖。圖9A-C:使用微生物共培養(yǎng)從纖維素原料中生產(chǎn)CH3I。圖9A:共培養(yǎng)圖。發(fā)酵氨 基酸球菌(Actinotalea fermentans)將纖維素原料發(fā)酵為釀酒酵母(S. cerevisiae)可以 呼吸的作為碳源(和能量來源)的乙酸鹽和乙醇。圖9B，左側(cè)部分酵母在共培養(yǎng)中的生 長。將酵母接種到作為唯一碳源的羧甲基纖維素(CMC)上，其中含有和不含發(fā)酵氨基酸球 菌。以菌落形成單位測量生長。圖9B，右側(cè)部分細(xì)菌在共培養(yǎng)中的生長。圖9C:從纖維 素原料生產(chǎn)CH3I。以低密度接種共培養(yǎng)物并用指定的原料(20g/L)作為唯一碳源生長36 小時。加入碘化鈉并通過如前所述的GC-MS測量CH3I的產(chǎn)量。以克/升/天為單位報告 CH3I的產(chǎn)率，并用CFU/毫升培養(yǎng)物進(jìn)行歸一化。顯示了發(fā)酵氨基酸球菌_釀酒酵母共培 養(yǎng)在乙酸鹽、CMC、柳枝稷、玉米秸桿和白楊上的產(chǎn)率。不與發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)共同生長的培養(yǎng)物表現(xiàn)為無碘甲烷活性。圖10A-B 對MHT文庫篩選鹵代甲烷活性。圖IOA 大腸桿菌(E. coli)中MHT文庫 的鹵代甲烷活性。左側(cè)顯示了 MHT基因的來源生物。以紅色字體表示細(xì)菌，綠色表示植物， 藍(lán)色表示真菌，紫色表示古細(xì)菌。顯示了 CH3I、CH3Br和CH3Cl的生產(chǎn)。根據(jù)CH3I活性排列 基因。圖10B，對MHT文庫的子集測定鹵代甲烷活性。測量進(jìn)行三次并顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖IlA-D 在重組釀酒酵母(S. cerevisiae)中生產(chǎn)碘甲烷。圖11A，CH3I生產(chǎn)途徑。 表達(dá)具有N末端液泡靶向標(biāo)記的鹽草(B. maritima)MHT。使用SAM作為甲基供體，ATP-依 賴性MHT使碘離子甲基化。圖11B，隨時間測量的培養(yǎng)基頂部空間(頂空，headspace)中 的CH3I。示出了在葡萄糖上生長的細(xì)胞的活性。圖11C，CH3I的產(chǎn)率，單位為克/升培養(yǎng) 物/天?？膳囵B(yǎng)的紅藻格藥柃(E.muricata)的數(shù)值取自文獻(xiàn)。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計算 出表達(dá)鹽草(B.maritima)MHT的大腸桿菌(E. coli)和釀酒酵母(S. cerevisiae)的產(chǎn)率。 圖11D，酵母中CH3I的毒性。將指數(shù)生長期的培養(yǎng)物稀釋至0D_為0. 05并加入可商購的 CH3I。在生長24小時后測量OD6tltl。在填充框中示出了 W303a實驗室菌株，而在空白框中示 出了 DNA甲基化敏感性RAD50 Δ突變體。圖12 通過使用N-末端融合的CPY信號將鹽草(B. maritima)MHT靶向酵母液泡以 改善碘甲烷的生產(chǎn)。對每種培養(yǎng)，顯示了每小時的碘甲烷的量。在W303菌株和錨定VPS33 缺失的W303菌株(其消除了液泡形成)中表達(dá)了液泡靶向的(CPY-MHT)細(xì)胞質(zhì)MHT。
具體實施例方式1、介紹使用石油化學(xué)工業(yè)中常用的沸石催化劑可以將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為商品化學(xué)品和包 括汽油在內(nèi)的液體燃料。鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)以ATP-依賴性方式將普遍存在的代謝產(chǎn)物 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基轉(zhuǎn)移到鹵離子上。使用生物信息學(xué)和郵購(mail-order) 的DNA合成，我們從植物、真菌、細(xì)菌和未鑒定生物中鑒別并克隆了 89種推定MHT基因的 文庫。在大腸桿菌(Escherichia coli)中篩選文庫以鑒別CH3C1、CH3Br和CH3I的產(chǎn)率，其中文庫中56%對氯化物(chloride)有活性、85%對溴化物(bromide)有活性而69%對 碘化物(iodide)有活性。最高活性的MHT的表達(dá)以及隨后在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的工程設(shè)計導(dǎo)致從葡萄糖和蔗糖的產(chǎn)率為4. 5克/升-天，是可培養(yǎng)的天 然存在來源的四個數(shù)量級(four orders of magnitude)。使用工程酵母和纖維素分解細(xì) 菌-發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)的共生共培養(yǎng)，我們能夠?qū)崿F(xiàn)從未處理的 柳枝稷(Panicum virgatum)、玉米秸桿和白楊中生產(chǎn)鹵代甲烷。從各種生物可再生資源生 產(chǎn)的鹵代甲烷可以用作化學(xué)工業(yè)中生產(chǎn)烷烴、芳烴、烯烴和醇類的ι-碳前體。一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)商品化學(xué)品和燃料的方法。本發(fā)明提供了生產(chǎn)生物燃 料以及其它有商業(yè)價值的有機產(chǎn)物的方法。一方面，在存在碳源的情況下(例如，農(nóng)業(yè)或廢 棄生物質(zhì)、培養(yǎng)基、石油、天然氣應(yīng)用甲烷)并且在產(chǎn)生鹵代甲烷氣體的條件下培養(yǎng)表達(dá)鹵 代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的重組細(xì)菌、真菌或植物細(xì)胞。在一種實施方式中，所述MHT是異源的。 將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機化合物，如長鏈烷烴、烯烴、醇、醚和醛。在一種實施方式中， 該有機化合物適于用作生物燃料?？梢酝ㄟ^任何方式將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為其它有機分子，這 并不局限于特定機制。在一種實施方式中，表達(dá)MHT的生物也表達(dá)將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為另一 種有機分子(如甲醇)的酶(內(nèi)源或異源的)。在一種實施方式中，表達(dá)MHT的生物釋放 鹵代甲烷，然后通過不同的生物(天然或重組的)將其轉(zhuǎn)化為另一種有機分子。在一種實 施方式中，收集鹵代甲烷并通過熟知的化學(xué)合成方法(例如，催化縮合)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將鹵代 甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵化有機分子的混合物后，可以收集該非鹵化有機分子和 /或進(jìn)行包裝以備隨后使用。本發(fā)明還包括表達(dá)異源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶并具有至少一個其它基因修飾的生物，所 述至少一個其它基因修飾導(dǎo)致該生物比缺少所述至少一個其它基因修飾的生物產(chǎn)生更多 的鹵代甲烷?？梢酝ㄟ^多種方式輔助MHT表達(dá)細(xì)胞中鹵代甲烷產(chǎn)率的提高，例如，通過工程 設(shè)計的SAM的過量生產(chǎn)、提高ATP的濃度和/或可用性、鹵離子輸入子(importer)的表達(dá)。 各種代謝途徑中的基因操控使得產(chǎn)生能夠有效地將來自纖維素、糖、廢料或CO2的碳轉(zhuǎn)化為 鹵代甲烷氣體的生物。本發(fā)明還提供了共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中將纖維素分解細(xì)菌和表達(dá)異源蛋白的酵母細(xì)胞 共同培養(yǎng)。在該系統(tǒng)中，細(xì)菌代謝纖維素以產(chǎn)生用作酵母碳源的產(chǎn)物。在一些實施例中，培 養(yǎng)基中產(chǎn)物的累積對該細(xì)菌是有毒的。酵母細(xì)胞對該產(chǎn)物的消耗起到除去該產(chǎn)物的作用， 從而使得所述細(xì)菌和酵母具有共生關(guān)系。2.表達(dá)鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞在本發(fā)明實踐中可以使用多種類型的細(xì)胞或生物，包括表達(dá)內(nèi)源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移 酶(MHT)的細(xì)胞和經(jīng)過修飾以表達(dá)異源的MHT的細(xì)胞。優(yōu)選地，該生物每天能夠產(chǎn)生約 l-1000mg/L的鹵代甲烷，通常為每天約10-100mg/L，如約20_60mg/L，例如，約30_50mg/L或 約40mg/L。如本文所使用的，術(shù)語“異源”指正常情況下不存在于該細(xì)胞基因組中的基因， 如來自不同物種的基因或天然未發(fā)現(xiàn)的基因，或由異源基因編碼的蛋白質(zhì)?？梢詫⒃谝吧?型細(xì)胞基因組中發(fā)現(xiàn)的基因或正常情況下在該細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)稱為“內(nèi)源的”?？梢詫?內(nèi)源基因的另外的拷貝(在組成型或誘導(dǎo)型啟動子的控制下)引入宿主生物以提高內(nèi)源酶 的水平。原則上，可以修飾幾乎任何細(xì)胞類型以用于本發(fā)明方法，然而在實踐中，這些細(xì)胞或生物應(yīng)適合于工業(yè)規(guī)模生物生產(chǎn)，例如，通常為單細(xì)胞的和/或快速生長的。為簡單起 見，在本文使用術(shù)語“細(xì)胞”以涵蓋表達(dá)MHT的單細(xì)胞生物和表達(dá)MHT的多細(xì)胞生物的細(xì)胞。 適合的細(xì)胞可以是真核的或原核的。實例包括細(xì)菌、真菌、藻類和高等植物細(xì)胞?？梢允褂帽磉_(dá)內(nèi)源MHT的細(xì)胞。在此情況下，通常選擇或修飾該細(xì)胞以表達(dá)高水 平的內(nèi)源MHT和/或在影響鹵代甲烷生產(chǎn)的其它位點選擇或修飾細(xì)胞，如下所討論的。盡 管在進(jìn)行或未進(jìn)行預(yù)先誘變的情況下可以使用選擇，但是由于重組技術(shù)對最終細(xì)胞表型的 控制更強，因此它們通常是優(yōu)選的。當(dāng)使用重組細(xì)胞時，它們可以表達(dá)異源MHT，表達(dá)修飾的內(nèi)源MHT，表達(dá)比野生型 細(xì)胞更高水平的內(nèi)源MHT，可以在除MHT基因(以下將進(jìn)行討論)之外的一個或多個位點進(jìn) 行修飾，或這些修飾的組合。最優(yōu)選地，細(xì)胞表達(dá)異源MHT并在影響鹵代甲烷生產(chǎn)的至少一 個其它位點進(jìn)行修飾。一方面，該重組生物不是大腸桿菌(E. Coli)。另一方面，該異源酶不是鹽草 (Batis)MHT。另一方面，該重組生物不是含有鹽草(Batis)MHT的大腸桿菌(E. coli)。2. 1表汰內(nèi)源MHT的細(xì)胞多種植物、真菌和細(xì)菌表達(dá)內(nèi)源MHT并可以根據(jù)本發(fā)明方法使用。另外，MHT表 達(dá)細(xì)胞是可以轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌(E.coli)的異源宿主的MHT基因源。表達(dá)MHT的生 物包括原核生物，例如細(xì)菌或古細(xì)菌(achaea)。根據(jù)本發(fā)明，可用于產(chǎn)生MHT的細(xì)菌的 實例包括土壤細(xì)菌和蛋白細(xì)菌(Proteobacteria)、氯甲烷甲基桿菌(Methylobacterium ch 1 oromethanicum)禾口氣甲;^生絲微菌(Hyphomicrobium chloromethanicum)。蛋白細(xì)菌 (Proteobacteria)門包括如假單胞菌屬(Pseudomonas)和伯克氏菌屬(Burkholderia)。 伯克氏菌屬(Burkholderia)的實例包括伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)(先前名 為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas c印acia)，然后改為洋蔥伯克氏菌(B. cepacia)和真菌 伯克氏菌(B.fimgorum))，它們已知能夠降解有機氯殺蟲劑和多氯聯(lián)苯(PCB)。其它的 伯克氏菌種包括鼻疽伯克氏菌(B. mallei)、類鼻疽伯克氏菌(B. pseudomallei)和洋蔥 伯克氏菌(B. cepacia)。除細(xì)菌之外，其它原核生物(如古細(xì)菌)可以在修飾或未修飾 的情況下用于產(chǎn)生MHT。古細(xì)菌的實例包括硫化葉菌屬(Sulfolobus)，如嗜酸熱硫化葉 菌(S. acidocaldarius)、冰島硫化葉菌(S. islandicus)、金屬硫化葉菌(S. metallicus)、 新西蘭硫化葉菌(S. neozealandicus)、希氏硫化葉菌(S. shibatae)、硫礦硫化葉菌 (S. solfataricus)或硫化葉菌屬 AMP12/99。其它特別有用的生物類型包括海洋藻類(例如，浮游植物、巨藻和海草)、高等 植物(例如，喜鹽植物、十字花科植物(Brassicaceae)，如甘藍(lán)(Brassica oleracea) (TMl 或 TM2)和擬南芥(Arabidopsis Thaliana) (TMl 或 TM2))和真菌(例如，酵母)。 特定的種包括鹽草(Batis maritima)、腫塊伯克氏菌(Burkholderiaphymatum) STM815、 細(xì)H^i求· (Synechococcus elongatus)PCC6301、/J、白胃亞禾中(Brassica rapa subsp. Chinensis)；鉤端螺菌屬(Leptospirillum sp.) II 組(Group)UBA ；新型隱球酵母 (Cryptococcus neoformans)變種新型 JEC21 ；稻(Oryza sativa)(日本產(chǎn)植物變種)；金 牛販球菌(Ostreococcus tauri)；芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)RCB ；灰 蓋鬼傘 R 山株(Coprinopsiscinerea okayama) ；Robiginitalea bofirmata HTCC2501 ； 馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)MCS10 ;黃桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 ；葡萄(Vitis vinifera)；嗜鹽紅螺菌(halorhodospira halophila) SLl ；蘋果木層孔菌 (Phellinus pomaceus,白腐真菌)、內(nèi)枝藻(Endocladia muricata，海洋紅藻)、冰葉日中花 (Mesembryanthemumcrystallium),如月旨肪巴夫藻(P. pinguis)禾口旋轉(zhuǎn)巴夫藻(P. gyrans) 的 EL 力■ (Pavlova)禾中、Papenfusiella kuromo> f同■ (Sargassumhorneri)禾口昆 $ (Laminaria digitata)。參見，例如，Wuosmaa 等，1990，Science 249 160-2 ；Nagatoshi 等， 2007，Plant Biotechnology 24，503_506。本文還公開了其它的種。2. 2表汰異源MHT的細(xì)胞在一些實施方式中，本發(fā)明中使用的細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源MHT，但經(jīng)過修飾可以表達(dá)異 源MHT。作為另外一種選擇，可以使用經(jīng)過修飾以表達(dá)異源MHT以及還表達(dá)內(nèi)源MHT的細(xì) 胞。使用表達(dá)異源MHT的細(xì)胞具有幾個優(yōu)勢。第一，使用本文所述方法，有可能將該生物的 所需特性(易于培養(yǎng)、代謝特定原料的能力、其它位點重組操控的適合性)與MHT基因的所 需特性(例如，高酶活性)相結(jié)合。可以經(jīng)過基因修飾以表達(dá)異源MHT的細(xì)胞包括原核生物和真核生物，如植物、真 菌等。示例性的原核生物包括革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌(E. Coli)(例如，MC1061、BL21 和DH10B)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如，SL1344)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、集胞藻 (Synechtocystis)、立克次氏體屬(Rickettsia)和歐文氏菌屬(Erwinia)，和革蘭氏陽性 細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium)。示例性的植物包括 藻類(例如,衣藻型(Chlamydomonas)、小球藻屬(Chlorella)和原壁菌屬(Prototheca))。 示例性的真菌包括里氏木霉(Trichoderma reesei)、曲霉屬(Aspergillus)和酵母(例 如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)和畢赤酵母屬(Pichia))。本文公開了其它細(xì) 胞類型并且它們在本領(lǐng)域中是已知的。其它示例性細(xì)菌包括芝田硫化葉菌(Sulfobolus sulfaticaricus)禾口蓮菌(Caulobacter),如馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)。可以選擇有效代謝特定碳源的生物以與可用原料相匹配。例如，當(dāng)使用纖維素 材料作為碳源時，可以使用如歐文氏菌屬(Erwinia)、大腸桿菌(E. coli)、畢赤酵母屬 (Pichia)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)和黑曲霉(Aspergillus Niger)的生物。大腸桿 菌(E. coli)和酵母(Saccharomyces)是可用于代謝淀粉和甘蔗的生物的實例。類似地，如 藻類(例如，小球藻屬(Chlorella)和原壁菌屬(Prototheca))的光合生物可以代謝如CO2 的碳源。2. 3鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明的上下文中，“鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT) ”是將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移 到鹵素上的蛋白。如上所述，鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶是自然界中普遍存在的。示例性的天然存在的 鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶包括，但不限于，本文中公開的那些?？梢詤⒖嫉鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫(例如，NCBI 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，http://www· ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ？ db = protein)禾口禾斗 學(xué)文獻(xiàn)識別其它天然存在的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶。下表1列出了已知具有MHT的一些生物。另外，請參見附圖、表4和6以及實施例 8 禾口 9。表1生物
鹽草(Batis maritima)
腫塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum) STM815
細(xì)長聚球藻(Synechococcus elongatus) PCC 6301
小白菜亞禾中(Brassica rapa subsp. Chinensis)
甘藍(lán)(Brassica oleracea) TMl
甘藍(lán)(Brassica oleracea) TM2
擬南芥(Arabidopsis Thaliana)TMl
擬南芥(Arabidopsis Thaliana)TM2
鉤端螺菌種(Leptospirillum sp. ) II 組 UBA
新型隱球酵母變種(Cryptococcus neoformans var.)新型 JEC21
稻(Oryza sativa)(日本產(chǎn)植物培養(yǎng)變種型)；
金牛蟲厲球菌(Ostreococcus tauri)
芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica) RCB
灰蓋鬼傘閃山株(Coprinopsis cinerea okayama)
Robiginitalea bofirmata HTCC2501
馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)MCSlO
黃桿菌(Flavobacteria bacterium) BBFL7
葡萄(Vitis vinifera)
嗜鹽嗜鹽紅螺菌(Halorhodospira halophila)SLl可以在適合于在宿主中使用的啟動子的控制下將MHT基因克隆并引入到宿主生 物。作為另外一種選擇，可以合成編碼所需MHT序列的基因，這使得在該基因中的密碼子使 用對該宿主優(yōu)化。所述啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的?？梢詫⑺霎愒碝HT基因整合到 該宿主染色體中(例如，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)或可以維持為游離基因。適合的MHT不限于由天然存在的基因所編碼的蛋白質(zhì)。例如，定向進(jìn)化技術(shù) 可以用于產(chǎn)生具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的新型或雜交基因產(chǎn)物。另外，可以使用天然存在
17的MHT的催化活性片段和變體。部分或全合成的MHT，如通過電腦模擬設(shè)計的酶或使用 本領(lǐng)域已知的定向進(jìn)化技術(shù)產(chǎn)生的酶，所述技術(shù)包括基因改組、家族改組、交錯延伸過程 (StEP)、過渡模板隨機嵌合生長(RACHITT)、用于產(chǎn)生雜交酶的重復(fù)截短(ITCHY)、截短模 板重組延伸(RETT)等(參見 Crameriet al, 1998, “ DNA shuffling of a family of genes fromdiverse species accelerates directed evolution" , Nature 391 288-91 ； Rubin-Pitel et al,2006, " Recent advances in biocatalysis by directedenzyme evolution " , Comb Chem High Throughput Screen 9 :247_57 ；Johannes 禾口 Zhao, 2006, " Directed evolution of enzymes andbiosynthetic pathways" , Curr Opin Microbiol. 9 :261_7 ;Bornscheuer 禾口 Pohl, 2001, " Improved biocatalysts by directed evolution and rationalprotein design" , Curr Opin Chem Biol. 5 :137—43)。顯然，在本發(fā)明方法中可以使用多種天然和非天然存在的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶，假設(shè) MHT可以影響宿主生物中S-腺苷甲硫氨酸的甲基向鹵化物(即氯化物、碘化物和/或溴化 物)的轉(zhuǎn)移?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種測定方法測量MHT酶的活性。這些測定方法 可以測量純化的或部分純化的蛋白質(zhì)的活性。參見，例如，Niand Hager, 1999，Proc. Natl. Acad. Sci USA,96 :3611_15 and Nagatoshi andNakamura,2007,Plant Biotechnology,24 503-506。作為另外一種選擇，可以在確實表達(dá)MHT的細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，并且在隨后的實 施例和其它本領(lǐng)域已知的測定中說明測量的鹵代甲烷產(chǎn)量。在一個測定中，將具有編碼MHT 蛋白的序列的表達(dá)載體引入細(xì)菌(例如，大腸桿菌(E. coli))宿主細(xì)胞和所選的轉(zhuǎn)化體中。 在試管或燒瓶中的生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)克隆(例如，在含有NaCl、NaI或NaBr的LB培養(yǎng)基上 并且在37°C振蕩培養(yǎng)4-22小時)。如果MHT編碼序列受誘導(dǎo)型啟動子的控制，則其中包含 誘導(dǎo)試劑。密封所述試管或燒瓶(例如，用橡皮筋捆緊的封口膜和鋁箔密封)。培養(yǎng)期結(jié)束 時，通過例如氣相色譜法確定頂部空間氣體中MeX的水平。如下文實施例8中所表明的，可以在本發(fā)明實踐中使用的MHT序列具有相當(dāng)?shù)淖?化性。當(dāng)在細(xì)菌或真菌細(xì)胞中異源表達(dá)時，已將彼此之間具有少至29%的序列同一性的序 列用于生產(chǎn)鹵代甲烷。此外，如實施例8所示，不同的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶均可以在大腸桿菌 (E. coli)中起作用。在某些實施方式中，本發(fā)明包括使用與本發(fā)明中已知的SAM-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn) 移酶(如本文所述的 MHT)具有至少約 25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或至少99%的同一性的酶活性多肽。如本文所使用的，“序列同一性百分比”表示通過對兩 種最優(yōu)比對序列的比較窗進(jìn)行比較所確定的值，其中與兩序列最優(yōu)比對的參考序列(不包 括添加或缺失)相比，比較窗中的多核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(即，缺口)。百 分比的計算如下，確定兩序列中氨基酸殘基相同的位置數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹 配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)并將該結(jié)果乘以100即得到了序列同一性百分比。3.影響鹵代甲烷生產(chǎn)的其它基因修飾除引入和操縱MHT基因外，可以進(jìn)行其它基因修飾以提高鹵代甲烷生產(chǎn)效率，或 提高鹵代甲烷產(chǎn)量。這些改變包括提高如鹵化物和S-腺苷甲硫氨酸(也稱為“SAM”或 "AdoMet")的反應(yīng)底物的胞內(nèi)濃度?？梢酝ㄟ^改變SAM生物合成速率(例如，通過提高SAM 前體物的水平)、降低SAM消耗等來提高SAM的胞內(nèi)水平?？梢酝ㄟ^刺激鹵化物向細(xì)胞的傳 輸、向胞外環(huán)境添加鹵化物等來提高胞內(nèi)鹵化物水平。一般說來，代謝工程技術(shù)可用于使鹵代甲烷的產(chǎn)量最大化。3. ISAM代謝涂徑可以通過操縱通過影響SAM水平的代謝途徑的通量來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量，所述 代謝途徑如SAM生物合成途徑、甲硫氨酸生物合成途徑、SAM利用或降解途徑和SAM循環(huán)途 徑。S-腺苷甲硫氨酸是普遍存在的代謝產(chǎn)物，其參與需要甲基轉(zhuǎn)移的多條代謝途徑。以下 說明了一條該類途徑
S-腺苷甲硫氨酸SAM-依賴性甲基酵ECZ1^ S- 高半胱氨酸
S-腺苷高半脫氨酸s_腺苷高半胱氣酸水解酶〉高半胱氨酸
EC3.3.1.1
高半胱氨酸+5-甲基四氫葉酸-甲德酸合成酶-^
EC2.1.1.13 或 EC2.1.1.14
曱疏氨酸
曱硫氨酸+ATP SAM合麟> S-腺苷曱硫氨酸3. 1. ISAM合成酶的過表汰從ATP和甲硫氨酸合成了 SAM，即由S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM合成酶，EC 2. 5. 1.6 ；Cantano, 1953, J Biol. Chem. 1953，204 403-16)催化的反應(yīng)。本發(fā)明一方面，對 MHT表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行修飾以通過內(nèi)源SAM合成酶的過表達(dá)或引入異源SAM合成酶來提高SAM 合成酶的活性。SAM合成酶(SAMS)基因包括如大腸桿菌(E. Coli)的原核生物中的metK(登 錄號:NP_289514. 1)，釀酒酵母(S. Cerevisiae)中的 samlp (登錄號:NP_010790. 1)或 sam2p或擬南芥(Arabidopsis)中的MT03(登錄號:NP_188365. 1)?？梢栽诮M成型或誘導(dǎo) 型啟動子的控制下，通過引入異源SAMS基因或引入宿主生物SAMS基因的另外的拷貝使 SAMS 在細(xì)胞中過表達(dá)。例如，Yu et al, 2003, Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 35 127-32中說明了通過釀酒酵母(S. cerevisiae) SAM合成酶2基因在巴 斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的過表達(dá)提高了 SAM的產(chǎn)量。如以下所討論的(3.8 節(jié))，對特定基因的參考是用于說明而不是限制。應(yīng)理解，生物與生物之間基因的名稱不同 并且以上對基因名稱的引用不旨在限制，而旨在涵蓋具有相同酶活性的同源基因、直系同 源基因(orthologs)和變體。3. 1. 2提高SAM的循環(huán)如上所示，鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶催化SAM向S-腺苷高半胱氨酸的轉(zhuǎn)化。S-腺苷高半胱 氨酸通過SAM生物合成途徑“循環(huán)”回到SAM。因此，可以通過提高該途徑中酶的水平和/ 或活性來提高SAM的產(chǎn)量或水平。該類酶的實例包括SAM-依賴性甲基酶(EC 2. 1. 1)、甲硫 氨酸合成酶(EC 2. 1. 1. 13或EC 2. 1. 1. 14)和N5-甲基-四氫蝶酰三谷氨酸鹽-高半胱氨 酸甲基轉(zhuǎn)移酶(例如，酵母MET6)。作為甲基化代謝的關(guān)鍵酶，S-腺苷-L-高半胱氨酸水解 酶(SAHl)使起到所有AdoMet依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的強競爭性抑制劑作用的S-腺苷-L-高 半胱氨酸分解代謝。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。
3. 1. 3SAM利用涂徑的削弱鹵代甲烷產(chǎn)生生物中的各種代謝途徑導(dǎo)致游離SAM的胞內(nèi)水平下降(SAM利用途 徑)。為了有利于或提高鹵代甲烷的生產(chǎn)，可以降低參與SAM利用途徑的一種或多種酶的含 量和/或生物活性?？梢酝ㄟ^抑制以降低SAM利用的基因的實例包括S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(對 應(yīng)于大腸桿菌(E.coli)基因speD)。其它實例包括胱硫醚β _合成酶、核酮糖5-磷酸 酯3-表異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3’，5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨 酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(可逆的，線粒體酶)、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(可逆的)，對應(yīng)于釀酒酵母 (S. cerevisae)基因 CYS4、Rpel、Zwfl、Alt、Met22、Shml-m 和 Shm2。應(yīng)理解，生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制 而旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 1. 4SAM轉(zhuǎn)運基因的過表汰在一種方法中，在細(xì)胞中表達(dá)或過表達(dá)了參與SAM從胞外環(huán)境向細(xì)胞轉(zhuǎn)運的SAM 轉(zhuǎn)運蛋白。實例包括酵母Sam5p蛋白和同源物，如GenBank ID No. BC037142 (小家鼠(Mus musculus))、AL355930 (粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa))、AE003753 (果蠅(Drosophila melanogaster))、Z68160(秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans))和 SLC25A26(人)。參 BMarrobio et al,2003, EMBO J. 22 5975-82 ；and Agrimi et al,2004, Biochem. J. 379 183-90。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 2.甲硫氨酸生物合成途徑可以通過使用具有高甲硫氨酸合成效率的微生物來提高SAM的生物合成以及相 應(yīng)的鹵代甲烷的生產(chǎn)。一般說來，導(dǎo)致甲硫氨酸合成的基本代謝途徑是熟知的(參見，例 如，Voet and Voet, 1995, "Biotechnology", 2nd edition, Jon Wiley&Sons, Inc. ；Riickert etal,2003, J. of Biotechnology 104,213-228 ；and Lee et al,2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. ,62 =459-67) 0這些途徑通常受到各種機制(如反饋控制)的嚴(yán)格調(diào)控。(參 見，例如，Neidhardt，1996， E.coli and S. lyphimurium, ASM Press Washington)。因此， 相關(guān)基因的表達(dá)或抑制，或相應(yīng)基因產(chǎn)物水平和/或活性的提高可以導(dǎo)致甲硫氨酸產(chǎn)量的 提尚。3. 2. 1甲硫氨酸生物合成酶可以表達(dá)或上調(diào)的基因包括參與甲硫氨酸生物合成的那些基因。PCT公開WO 02/10209說明了為提高甲硫氨酸產(chǎn)量而對某些基因過表達(dá)或抑制，該專利以其整體作為參 考并入。甲硫氨酸生物合成酶的實例包括0-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶(metY)和0- 丁 二酰-高絲氨酸硫化氫解酶(metZ)。其它基因包括亞甲基四氫葉酸還原酶(MetF)；天冬氨 酸激酶(IysC)；高絲氨酸脫氫酶(horn)；高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(metX)；高絲氨酸琥珀酰 轉(zhuǎn)移酶(metA)；胱硫醚Y-合成酶(metB)；胱硫醚β -裂解酶(metC)；維生素B12-依賴性 甲硫氨酸合成酶(metH)；非維生素B12-依賴性甲硫氨酸合成酶(metE) ；N5atl-亞甲基-四氫 葉酸還原酶(metF)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)。對甲硫氨酸反饋抑制有耐受性的這些酶的變體可以進(jìn)一步提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。在 WO 07/011939and Park et al，2007，MetabEng. 9 :327_36 中說明了一些該類變體，以上 參考文獻(xiàn)以其全部作為參考并入。舉例來說，可以在諸如大腸桿菌(E.Coli)和棒狀桿菌 (Corynebacterium)的原核生物中通過使如 metY、metA、metB、metC、metE 禾口 / 或 metH 的基 因過表達(dá)或另外地提高它們的基因產(chǎn)物的水平或活性來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。類似地，降 低阻遏蛋白基因的水平或削弱其活性可以提高鹵代甲烷的產(chǎn)量(例如，metJ或metD(McbR) 基因編碼的阻遏物，其阻遏了甲硫氨酸合成的相關(guān)基因，如metB、metL和metF)。參見，Rey et al,2003, J. Biotechnol. ,103 1~65 ；Nakamori et al,1999, Applied Microbiology andBiotechnology 52 179-85 ；WO 02/097096 ；每篇文獻(xiàn)以其整體作為參考并入)。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 2. 2甲硫氨酸牛物合成前體也可以通過改變提供其它前體的那些途徑的通量來提高甲硫氨酸合成，所述其它 前體的實例包括不同氧化態(tài)的硫原子、諸如氨的還原態(tài)氮、包括Cl-碳源(如絲氨酸、甘氨 酸和甲酸鹽)的碳前體、甲硫氨酸的前體和在N5和/或NlO用碳取代的四氫葉酸的代謝 物。另外，例如，還原等價形式的能量(如NADH、NADPH或FADH2)可以參與產(chǎn)生甲硫氨酸的 途徑。例如，可以通過提高參與硫酸鹽同化、半胱氨酸生物合成和丁酮二酸鹽向天冬氨 酸半醛轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物的水平和/或活性來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量?；虻膶嵗↙-半 胱氨酸合成酶(cysK)、NADPH依賴性亞硫酸還原酶(cysl)和烷基磺酸鹽單加氧酶(ssuD)。提高絲氨酸的水平也可以導(dǎo)致甲硫氨酸產(chǎn)量的提高。因此，可以針對參與絲氨酸 代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白對生物進(jìn)行修飾。參與絲氨酸合成的酶包括D-3-磷酸甘油酸脫氫酶 (SerA)、磷酸絲氨酸磷酸化酶(SerB)和磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)。參見WO 07/135188，該 專利以其整體作為參考并入?？梢孕揎梾⑴c絲氨酸合成的酶以降低或防止絲氨酸反饋抑 制。類似地，可以提高參與絲氨酸向甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化的一種或多種酶的水平和/或 生物活性。這些基因包括絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)和亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)。類似地，可以降低參與絲氨酸降解為丙酮酸鹽(例如，絲氨酸脫水酶，sdaA)或參 與絲氨酸從細(xì)胞輸出(例如，ThrE)的一種或多種酶的含量和/或生物活性。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 2. 3甲硫氨酸吸收可以修飾細(xì)胞中控制甲硫氨酸吸收的基因以提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。例如，大腸桿 菌(E. coli)中的MetD位點編碼了腺苷三磷酸酶(metN)、甲硫氨酸透性酶(metl)和底物結(jié) 合蛋白(metQ)。這些基因的表達(dá)受L-甲硫氨酸和MetJ(甲硫氨酸調(diào)節(jié)子的常見阻遏物) 的調(diào)控。已知多種其它物種中的直系同源物(orthologs)，如沙門氏菌屬(Salmonella), 耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弧菌屬(Vibrio)、嗜血菌屬(Haemophilus)、土壤桿菌屬 (Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)禾口布氏菌屬(Brucella)。參見，例如，Merlin et al，2002，J.Bacteriology 184 :5513_17· et al，2003，EMB0 J. 22 5975-82 ；andAgrimi et al，2004，Biochem. J. 379 :183_90。
應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 3提高胞內(nèi)鹵化物濃度還可以通過提高M(jìn)HT表達(dá)細(xì)胞中胞內(nèi)鹵化物濃度來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。這可以 通過多種方式實現(xiàn)，例如，通過引入或提高一種或多種鹵化物轉(zhuǎn)運子的水平和/或活性，和 /或提高培養(yǎng)基中鹵化物濃度。實例包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gefl、 大腸桿菌(E. coli) (P37019)和集胞藻(Synechtocystis) (P74477)的 EriC0應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 4提高ATP水平還可以通過提高鹵代甲烷合成活性來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量，而鹵代甲烷合成活性 可以通過提高ATP的胞內(nèi)濃度和/或可用性得以提高。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。3. 5削弱鹵代甲烷利用可以降低鹵代甲烷利用酶的活性和/或水平。這些酶包括emu基因簇中的酶，如 cmuC、cmuA、orfl46、paaE和hutl。其它的酶包括細(xì)菌的10-甲酰-H4葉酸水解酶、5，10-亞 甲基-H4葉酸還原酶和purU和類咕啉酶，如鹵代甲烷二硫化物/鹵離子甲基轉(zhuǎn)移酶。應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對基因名稱的引用不旨在限制而 旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。 3. 6表汰MHT的重組酵母我們已觀察到使用酵母作為MHT表達(dá)細(xì)胞會導(dǎo)致特別高的鹵代甲烷產(chǎn)率。參見實 施例10。一方面，本發(fā)明提供了重組酵母細(xì)胞，其包含編碼S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性 鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的異源基因。如在本文其它處所討論的，可以在酵母中表達(dá)的MHT 蛋白的實例包括來自鹽草(Batis maritima)、腫塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、 iffl ix ^ (Synechococcus elongatus)、憲菁(Brassica rapa) > 1ξ[" M (Brassica oleracea)(Arabidopsisthaliana)(Arabidopsis thaiiana) ^ ^^m^MM 屬(Leptospirillum)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、禾S (Oryza sativa)、金 牛販球菌(Ostreococcus tauri)、芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)、灰蓋鬼 傘(Coprinopsis cinerea)、(Robiginitalea bofirmata)、馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)、葡萄(Vitis vinifera)或嗜鹽嗜鹽紅螺菌 (halorhodospira halophila)的那些。如在本文其它處所討論的，適合的重組酵母細(xì)胞 的實例包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、 多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解 脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和粟酒裂殖酵母 (Scizosacchromyces pombe)等。在本領(lǐng)域中，酵母的培養(yǎng)和基因操縱方法是熟知的。3. 7使用靶結(jié)構(gòu)域提高酵母中的產(chǎn)量異源鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(例如，鹽草(Batis maritima)MCT)在釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中的表達(dá)會導(dǎo)致鹵代甲烷的生產(chǎn)(例如，碘甲烷)。通過使用肽信號將酶靶向液泡顯著地提高了產(chǎn)率。參見以下的討論。不旨在限制于特定的機 制，據(jù)信產(chǎn)量的提高是由于(i)大多數(shù)細(xì)胞SAM在液泡中聚集(隔離，sequestration) (Farooqui et al,1983, Studies on compartmentation ofS-adenosyl-L-methionine in Saccharomyces cerevisiae and isolated rathepatocytes. Biochim Biophys Acta 757 342-51)，和(ii)鹵離子在液泡中聚集(Wada et al，1994，Chemiosmotic coupling of ion transport inthe yeast vacuole :its role in acidification inside organelles. J BioenergBiomembr 26 631-7) M弓Ife白勺。一個肽信號是已知將懸掛蛋白(pendant protein)靶向酵母液泡的羧肽酶Y 的N末端肽結(jié)構(gòu)域，但是也可以使用其它靶肽。參見，例如，Valls et al，1990，Yeast carboxypeptidase Y vacuolar targetingsignal is defined by four propeptide amino acids. J Cell Biol 111 361-8 ；and Tague et al,1987," The Plant Vacuolar Protein, Phytohemagglutinin, Is Transported to the Vacuole of Transgenic Yeast" , J. Cell Biology, 105 1971-1979 ；Tague et al,1990, “ A Short Domain of the PlantVacuolar Protein Phytohemagglutinin Targets Invertase to the YeastVacuole〃 , The Plant Cell, 2 533-546和美國專利No. 6054637，以上所有文獻(xiàn)作為參考并入本文。在一種方法中，為了說明而非限制，合成了鹽草(B.maritima)氯甲烷轉(zhuǎn)移酶 (MCT)的編碼序列并在 tet-阻遏性 CYC 啟動子(plasmid pCM190，Gari et al，1997，yeast 13:837-48)的控制下克隆到高拷貝載體中。將MCT編碼序列融合到來自已知將懸掛蛋白 靶向酵母液泡的羧肽酶Y的N末端肽結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列KAISLQRPLGLDKDVL，Valls et al，1990，J Cell Biol. Ill :361_8)。將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株 W303a中。將攜帶MCT表達(dá)載體的酵母在冷凍保存(15%的甘油)的尿嘧啶缺陷型板上劃 線并生長48小時。將各個菌落接種到2mL合成的完全尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基上并在30°C生 長過夜。接著，將培養(yǎng)物接種到IOOmL新鮮合成的完全尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基上并生長24小 時。將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)離心并在加入2%葡萄糖和IOOmM碘化鈉鹽的新鮮YP培養(yǎng)基中濃縮至高細(xì) 胞密度(OD 50)。將IOmL該濃縮的培養(yǎng)物等分到14mL培養(yǎng)管中并用橡皮塞密封。在30°C， 以250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩使培養(yǎng)物生長，并在指定的間隔通過氣相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS) 測定碘甲烷的產(chǎn)量。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由6850系列II型網(wǎng)絡(luò)化氣相色譜系統(tǒng) (Agilent)和5973型網(wǎng)絡(luò)化質(zhì)量選擇系統(tǒng)(Agilent)組成。溫箱溫度程序化地從50°C (1 分鐘)升高到60°C (10°C /分鐘)。用注射器穿過橡皮塞吸取100微升培養(yǎng)物頂部空間并 手動進(jìn)樣到氣相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，從而測量了碘甲烷的產(chǎn)量。如以下所討論的(實施例10)，使用如上所述的方法，我們使用羧肽酶Y肽將鹽草 (B. maritima)MHT靶向釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株W303a的液泡，并測定了從葡萄糖生 產(chǎn)的碘甲烷(圖9A)。酵母對葡萄糖表現(xiàn)出高活性(圖9B)并且與天然來源幾天的倍增時 間相比，表現(xiàn)出正常的生長速率(約90min的倍增時間)。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較，將來自葡萄 糖的碘甲烷的產(chǎn)率測量為4. 5g/升-天，這是最好的天然來源的約10000倍(圖9C)。更一般地，應(yīng)理解可以使用將參與代謝過程的其它酶靶向液泡以提高產(chǎn)量。具 體地，可以通過這種靶向作用提高底物為SAM和/或鹵化物的反應(yīng)的產(chǎn)率。例如，可以通 過使用SAM的代謝途徑生產(chǎn)乙烯(參見，例如，美國專利No. 5416250，其以參考形式并入 本文)。在表達(dá)1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)合成酶(參見，Wilsonet al，1993，Appleripening-related cDNA clone pAP4 confersethylene-forming ability in transformed Saccharomyces cerevisiae. Plant physiol. 103 :783_8，以參考形式并入本文)和乙烯 形成酶(EFE,參見 McGarvey et al, 1992, Characterization and kinetic parameters ofethylene-forming enzyme from avocado fruit. J Biol Chem. 267 (9) 5964-7)白勺酵母 (例如，釀酒酵母(S. cerevisiae))中，可以通過將這些酶靶向液泡來提高乙烯的產(chǎn)量。3. 7 組合通常，本發(fā)明的方法利用了在多個不同位點(例如，至少2個，有時至少3個，有時 至少4個和有時為5個或5個以上)選擇或修飾的細(xì)胞以提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。細(xì)胞可以 具有另外的基因修飾以有利于它們在特定原料上生長和提供抗生素抗性等。在一些實施方 式中，可以進(jìn)一步對以不同目的開發(fā)的菌株進(jìn)行修飾以滿足本發(fā)明的需要。參見，例如，He et al,2006,"A synergistic effect on theproduction of S-adenosyl-L-methionine in Pichia pastoris by knockingin of S-adenosyl-L-methionine synthase and knocking out ofcystathionine-beta synthase，，，J Biotechnol. 126 :519_27。Park et al, 2007, “Characteristics of methionine production by an engineeredCorynebacterium glutamicum strain"Metab Eng. 9 :327_36 中說明了對谷氨酸棒桿菌(C. glutamicum)進(jìn) 行基因操縱以提高甲硫氨酸的產(chǎn)量。該菌株攜帶了下調(diào)的(deregulatecOhom基因以消除 蘇氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制而thrB基因的缺失消除了蘇氨酸的合成。又如所討 論的，可以通過用選擇方法代替重組技術(shù)獲得修飾的菌株，其中可以針對甲硫氨酸的過量 生產(chǎn)對生物進(jìn)行誘變和篩選。已經(jīng)從包括大腸桿菌(E.coli)和酵母在內(nèi)的多種生物中分 離出 了高產(chǎn)菌株。參見，例如，Alvarez-Jacobs et al, 2005, BiotechnologyLetters, 12 425-30 ；Dunyak et al,1985,21 182-85 ；Nakamori et al,1999, Applied Microbiology and Biotechnology 52 179-85。出于說明而非限制的目的，可以使用下列示例性組合。指定特定的修飾并不排除 其他修飾的存在a)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途徑 的通量。在一種實施方式中，通過提高SAM合成酶(它可以是異源的或內(nèi)源的)的表達(dá)來 提高通過SAM生物合成途徑的通量。在一種實施方式中，使metK基因或同源基因過表達(dá)。 在一種實施方式中，使samlp和/或sam2p基因或同源基因過表達(dá)。參見上述3. 1. 1節(jié)。b)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高通過SAM “循環(huán)”途徑的通量。在一個實施 方式中，提高了 SAM-依賴性甲基酶、甲硫氨酸合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(例 如，SAH1)和N5-甲基四氫蝶酰-三谷氨酸-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(例如，MET6)的活性。 參見上述3. 1.2節(jié)。c)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以抑制通過SAM利用途徑的通量。在一個實施方 式中，抑制了糞卟啉原III氧化酶、糞卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶、胱硫醚 β -合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3’， 5’-二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶或甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，抑 制了 CYS4、RpeU ZwfU Alt、Met22、Shml-m、Shm2、HEM 13 或 hemF 基因。參見上述 3. 1. 3 節(jié)。d)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高甲硫氨酸生物合成。參見上述3. 2. 1節(jié)。
e)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高參與硫酸鹽同化、半胱氨酸生物合成和/或 丁酮二酸鹽向天冬氨酸半醛轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物的活性。在一些實施方式中，L-半胱氨酸合成 酶(例如，cysK)、NADPH-依賴性亞硫酸還原酶(例如，cysl)或烷基磺酸鹽單加氧酶(例 如，ssuD)過表達(dá)。參見上述3. 2. 2節(jié)。f)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高胞內(nèi)ATP水平。參見上述3. 4節(jié)。g)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高胞內(nèi)絲氨酸水平。參見上述3. 2. 2節(jié)。h)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高甲硫氨酸的吸收。參見上述3. 2. 3節(jié)。i)異源MHT的表達(dá)和基因修飾以提高胞內(nèi)鹵化物濃度。參見上述3. 3節(jié)。j)異源MHT的表達(dá)和基因修飾，其降低了除用于鹵代甲烷合成外的鹵化物的利 用。參見上述3. 5節(jié)。k) (a)-(j)的組合，如 a+b、a+c、a+d、a+e、a+f、a+g、a+h、a+i、a+j、b+c、b+d、b+e、 b+f > b+g、b+h、b+i、b+j、c+d、c+e、c+f > c+g、c+h、c+i、c+j、d+e、d+f > d+g、d+h、d+i、d+j、 e+f、e+g、e+h、e+i、e+j、f+g、f+h、f+i、f+j、g+h、g+i、g+j、h+i 或 h+jD1)除細(xì)胞表達(dá)或過表達(dá)內(nèi)源MHT而非異源MHT外，以上(a)-(k)中存在的修飾。3. 8同源物、盲系同源物和變體應(yīng)理解生物與生物之間基因名稱不同，并且以上對上述基因名稱的引用不旨在限 制而旨在涵蓋具有等價活性的同源基因。此外，在所述方法需要活性過表達(dá)的情況下，只要 過表達(dá)的蛋白具有適當(dāng)?shù)幕钚圆⒖梢栽谒拗髦斜磉_(dá)，則編碼的蛋白不需要與天然存在的形 式一致。在某些實施方式中，本發(fā)明包括酶活性多肽的使用，其具有與以上所述的已知蛋白 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。4.重組技術(shù)可以通過基因工程技術(shù)或使用經(jīng)典微生物學(xué)技術(shù)(如化學(xué)或紫外線誘變以 及隨后篩選)來實現(xiàn)基因修飾。重組修飾和經(jīng)典篩選技術(shù)的組合可以用于產(chǎn)生所關(guān) 心的生物。使用重組技術(shù)，可以以導(dǎo)致在該生物或在培養(yǎng)物中鹵代甲烷產(chǎn)率提高的方 式使核酸分子引入、缺失、抑制或修飾。在本領(lǐng)域中，原核生物和真核生物的基因操縱 方法是熟知的。因此，僅簡要地說明了這些方法。一般地，公開了一些培養(yǎng)和基因工 程技術(shù)，例如，在 Sambrook et al，1989，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, ColdSpring Harbor Laboratory Press ；Sambrook 禾口Russell，2001，M0LECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, ColdSpring Harbor Laboratory Press ；Ausubel et al, 2002，SH0RTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons Juan, R. S.，1997， RECOMBINANT GENE EXPRESSI0NPR0T0C0LS, Humana Press ；Ball, A. S.，1997，BACTERIAL CELLCULTURE :ESSENTIAL DATA, John Wiley&Sons ；Richmond, A. ，2003， HANDBOOK OF MICR0ALGAL CULTURE, Wiley-Blackwell ；Becker, E. W.，1994，“MICR0ALGAEBI0TECHN0L0GY AND MICROBIOLOGY, Cambridge UniversityPress ；Guthrie and Fink,2004，GUIDE TO YEAST GENETICS ANDM0LECULAR BIOLOGY,Academic Press ；and Walker,G. M.，1998，YEAST PHYSIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, John Wiley&Sons中，以上每篇文獻(xiàn)出于各種目的作為參 考并入本文。在實驗室和工業(yè)規(guī)模，由重組細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白或產(chǎn)物的表達(dá)和富集是熟知的 并在文獻(xiàn)中廣泛討論。對于工業(yè)級的生產(chǎn)，可以使用大型生物反應(yīng)器(參見，例如，McKetta，J. CHEMICALPROCESSING HANDBOOK,1993, Marcel Dekker ；Lee, S.，ENCYCLOPEDIA OF CHEMICAL PROCES SING,2006,Taylor andFrancis Group ；Asenjo,J. ,BI0REACT0R SYSTEM DESIGN,1995,Marcel Dekker ；Nielsen, J. ,BIOREACTION ENGINEERINGPRINCIPLES，2003， Kluwer Academics ；Crow et al, Process formanufacturing methyl chloride,美國專 利 No. 6111153 ；Van' t Riet andTramper, 1991, BASIC BI0REACT0R DESIGN, CRC Press ； Asenjoand Merchuk, 1995, BIOREACTOR SYSTEM DESIGN, CRC Press)。4. 1重組基因的表汰可以實現(xiàn)或提高有助于鹵代甲烷生產(chǎn)的基因表達(dá)，和/或相應(yīng)基因產(chǎn)物(mRNA和/ 或蛋白質(zhì))的存在、水平和/或活性。可以通過引入指導(dǎo)基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組 構(gòu)建體，或通過改變內(nèi)源基因產(chǎn)物表達(dá)的基礎(chǔ)水平(例如，通過誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄或使其去阻遏， 或提高諸如mRNA和/或蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定性和/或活性)來實現(xiàn)過表達(dá)。非 內(nèi)源核酸序列的密碼子優(yōu)化也可以提高翻譯效率?？梢酝ㄟ^，例如，將克隆基因保持在復(fù)制型載體中或通過將克隆基因整合到生產(chǎn) 生物的基因組中實現(xiàn)克隆基因的穩(wěn)定引入。實例包括多拷貝質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、病毒載體或YAC。 所述載體可以包含復(fù)制原點，如PSC101、BAC、pl5a或ColEl (原核生物)或ARS (酵母)或 SV40原點(真核生物)?？梢杂糜诋a(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的表達(dá)載體可以包括以下的可操作連接(1)編碼用于 將表達(dá)載體保持在宿主細(xì)胞中的原點的DNA元件；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件，如啟動 子；(3)控制轉(zhuǎn)錄本加工的DNA元件，如轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選地，編碼可選擇標(biāo)志物(如 抗生素抗性)的基因。在所需的原核或真核生物中起作用的啟動子的控制下，放置待表達(dá)的序列。根據(jù) 具體應(yīng)用，多種啟動子是熟知的并且可以使用。本發(fā)明涵蓋了誘導(dǎo)型和組成型啟動子。誘 導(dǎo)型啟動子包括受阿拉伯糖(PBAD) ；IPTG (PTRC)、鹵鹽(例如，氯化鈉)、滲透壓、糖、淀粉、 纖維素或光誘導(dǎo)的那些啟動子。如實施例4所示，細(xì)菌中使用IPTG誘導(dǎo)型啟動子的鹵代甲烷的產(chǎn)量在表達(dá)誘導(dǎo)后 1-2. 5個小時內(nèi)提高到峰值水平。通過將基因可操作地連接至天然或異源轉(zhuǎn)錄控制元件上可以提高基因的表達(dá)?？?以通過使用合成操縱子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止位點等進(jìn)行該操作。在本領(lǐng)域中，多種 原核和真核表達(dá)控制序列是已知的。參見，例如，WO 06/069220，以其整體作為參考并入。 編碼重組核糖體結(jié)合位點的序列的實例為ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC?？梢酝ㄟ^在不改變合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列的情況下將該生物翻譯系統(tǒng)非優(yōu)選 的克隆基因內(nèi)的任何密碼子改變?yōu)閮?yōu)選密碼子從而對特定宿主物種中的蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化 重組序列。密碼子優(yōu)化可以提高重組基因的翻譯?？蛇x地，可以改變基因的DNA序列從而 使得與野生型DNA序列之間的差異最大化，例如，以避免宿主細(xì)胞調(diào)控蛋白調(diào)控該基因的 可能性。4. 2基因的阻遏、抑制或缺失可以消除或減少傾向于限制、調(diào)節(jié)或降低鹵代甲烷產(chǎn)量或相應(yīng)基因產(chǎn)物(mRNA和 /或蛋白質(zhì))的存在、水平和/或活性的基因表達(dá)?？梢酝ㄟ^使基因完全或部分失活、抑制、 缺失、中斷、封閉或下調(diào)導(dǎo)致基因和/或基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能降低的基因修飾。例如，
26可以通過基因“敲除”、失活、突變、缺失或反義技術(shù)實現(xiàn)這一過程?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的 方法實現(xiàn)基因敲除，包括可商購的試劑盒，如“TargeTron基因敲除系統(tǒng)”(Sigma-Aldrich)。 可以從大腸桿菌(E. coli)基因組計劃(www, genome, wise, edu)中獲得具有各個基因敲除 的大腸桿菌(E.coli)菌株。本發(fā)明包括多個敲除，例如，在相同生物中的2-6個基因。本 發(fā)明還包括基因引入、缺失或修飾的任意組合。5.培養(yǎng)/發(fā)酵培養(yǎng)基和條件在本文中術(shù)語“培養(yǎng)”和“發(fā)酵”可替換使用以表示MHT表達(dá)細(xì)胞在液體培養(yǎng) 基中，在生產(chǎn)鹵代甲烷的條件下(有氧或無氧)的培養(yǎng)。用于生產(chǎn)鹵代甲烷的生長培 養(yǎng)基很大程度上取決于宿主生物。多種原核生物和真核生物通常在實驗室或工業(yè)環(huán)境 中使用的適合的生長條件是已知的并在科學(xué)文獻(xiàn)中有所說明。參見，例如，Ball, Α. S.， 1997，BACTERIAL CELL CULTURE ESSENTIAL DATA, Johnffiley&Sons ；Richmond, A.，2003， HANDBOOK OF MICROALGALCULTURE, Wiley-Blackwell ；Becker, E. W.，1994，MICROALGAE BIOTECHNOLOGY AND MICROBIOLOGY,Cambridge UniversityPress ；and Walker,G. M.，1998， YEAST PHYSIOLOGY ANDBI0TECHN0L0GY, John Wiley&Sons，以上每篇文獻(xiàn)出于所有目的作為 參考并入本文?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)確定優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法。營養(yǎng)或培養(yǎng)基將包含碳源、鹵化物源和營養(yǎng)物。培養(yǎng)基還應(yīng)含有適量的氮和硫 源，例如，以一種或多種硫酸鹽(如硫酸銨)和/或硫代硫酸鹽的形式。培養(yǎng)基還可以 含有維生素，如維生素B12。用于細(xì)菌(如大腸桿菌(E.coli))的一種適合的培養(yǎng)基為 Luria-Bertani (LB)肉湯培養(yǎng)基。代謝含碳底物以提供鹵代甲烷的甲基部分。還可以代謝碳化合物以提供驅(qū)動鹵代 甲烷生產(chǎn)的能量。底物包括諸如石油和/或天然氣的含碳化合物、碳水化合物，其中的碳以 可以被所選生物代謝的形成存在。碳水化合物的實例包括單糖、諸如葡萄糖、果糖或蔗糖的 糖類、寡糖、諸如淀粉或纖維素的多糖和一碳底物或它們的混合物，例如，以原料形式存在。 二氧化碳也可以用作碳源，特別是使用諸如藻類的光合生物時?？梢允褂玫某Ｒ姾荚?料包括，但不限于，木屑、蔬菜、生物質(zhì)、排泄物、動物糞便、燕麥、小麥、玉米(例如，玉米秸 稈)、大麥、蜀黍、小米、大米、黑麥、高粱、馬鈴薯、甜菜、芋頭、木薯、水果、果汁和甘蔗。柳枝 稷(Panicum virgatum)、象草(Miscanthus giganteus)、甘蔗渣、白楊、玉米秸稈和其它專 用能量來源作物。根據(jù)所選生物的不同，最適底物的選擇將有所不同。如上所述，當(dāng)使用纖 維素材料作為碳源時，可以使用諸如歐文氏菌屬(Erwinia)、大腸桿菌(E. coli)、畢赤酵母 屬(Pichia)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)和黑曲霉(Aspergillus Niger)的生物。大腸 桿菌(E.coli)和酵母(Saccharomyces)是可以用于代謝淀粉和甘蔗的生物的實例。類似 地，諸如藻類(例如，小球藻屬(Chlorella)和原壁菌屬(Prototheca))的光合生物可以代 謝如 C02 的碳源。參見，Schmid，R. D.，2003，POCKET GUIDE TO BI0TECHN0L0GYAND GENETIC ENGINEERING, John Wiley&Sons0可選地，可以在加入到培養(yǎng)基之前混合或粉碎纖維素原 料。除了各種基因修飾之外，可以通過優(yōu)化生長培養(yǎng)基的組成來提供鹵代甲烷的產(chǎn) 量。如所提到的，還可以通過提高SAM生物合成中的一種或多種反應(yīng)物或前體(如鹵化物、 甲硫氨酸、SAM)和中間體的胞內(nèi)濃度來提高鹵代甲烷的產(chǎn)率。使用富含甲硫氨酸、絲氨酸 和/或鹵化物的培養(yǎng)基可以提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。在某些實施方式中，培養(yǎng)基中甲硫氨酸的濃度為約0. 5gm/L至約10gm/L。在其它實施方式中，培養(yǎng)基中絲氨酸的濃度為約0. 5gm/ L 至約 10gm/L。向培養(yǎng)基中添加鹵鹽可以提高胞內(nèi)鹵化物濃度。鹵鹽包括鈉、鉀、鎂等的氯化物、 碘化物或溴化物。如以下在實施例5中所示，鹵代甲烷的產(chǎn)量隨鹵化物的原子量而升高。 因此，在某些情況下，碘化物的產(chǎn)率可以比溴化物的好，而相應(yīng)地，溴化物的產(chǎn)率趨于比氯 化物的好。如實施例5所示，可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中鹵化物的濃度來提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。 培養(yǎng)基的最佳摩爾滲透壓濃度通常為約0. 01至1M，通常為約0. 05至0. 3，如約0. IM0根據(jù) 本發(fā)明的指導(dǎo)，技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗確定所選鹵鹽的最佳濃度。以NaCl的使用為例，本發(fā) 明計劃使用約0. 01至0. IM的NaCl，通常使用約0. 05至0. 5M，例如約0. 1M，如0. 085M的 NaCl0諸如Luria-Bertani (LB)肉湯培養(yǎng)基(0. 171M的NaCl)的培養(yǎng)基是適合的。也可以 使用各種反離子(接近約0. 16M)制備LB肉湯培養(yǎng)基。例如，在由5g/L酵母提取物、10g/L 胰蛋白胨和0. 5g/L的NaCl制備的LB肉湯培養(yǎng)基中可以補充16. 7g/L的NaBr或24. 4g/L 的 NaI。也可以通過，例如，提供富含絲氨酸的營養(yǎng)源以提高絲氨酸的水平從而導(dǎo)致甲硫 氨酸產(chǎn)量的提高。參見，例如，WO 07/135188，以其整體作為參考并入?？梢栽谟兄邴u代甲烷生產(chǎn)的條件下維持或培養(yǎng)所述生物。多個參數(shù)可以影響鹵 代甲烷的生產(chǎn)，如頂部空間比、生長期和氧含量。本發(fā)明設(shè)計了所述生物處于靜止期或指數(shù)(log)期的培養(yǎng)條件。靜止期通常適合 于鹵代甲烷的生產(chǎn)。類似地，本發(fā)明還涵蓋了培養(yǎng)物的有氧和無氧生長。有時，有氧生長是 適合的。有時，可以提高細(xì)胞密度(并且相應(yīng)也提高了營養(yǎng)物濃度)而不損害鹵代甲烷的生 產(chǎn)。一些宿主細(xì)胞維持在高溫(例如，37°C)并具有攪拌的條件下。在一種方法中，使用了固 態(tài)發(fā)酵(參見，Mitchell 等，SOLID-STATEFERMENTATION BI0REACT0RS) ",2006, Springer。 部分根據(jù)生物和菌株，可以選擇有氧或無氧條件。根據(jù)本發(fā)明，使用亨利定律(Henry’ s law)可以優(yōu)化單位液體培養(yǎng)基體積的頂部 空間氣體(空氣)比。已確定最佳比一般為約0.5 1至4 1，例如約2 1。通常以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的鹵代甲烷和非鹵化有機分子，例如， 生產(chǎn)適合作為石油代用品的生物燃料。因此，在一些實施方式中，可以在具有至少10升、 至少50升、至少100升或至少500升液體容積的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)包含S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的生物。例如，生物反應(yīng)器的液體容積通常為至少 1000升、至少5000升或至少10000升。在本發(fā)明的培養(yǎng)物中，培養(yǎng)基的體積通常為至少10 升、至少25升、至少50升、至少100升、至少500升、至少1000升或至少5000升。可以作 為分批發(fā)酵、在連續(xù)培養(yǎng)生物反應(yīng)器中或使用本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行培養(yǎng)。5. 1酵母和纖維素分解細(xì)菌的共培養(yǎng)另一方面，本發(fā)明提供了使用纖維素原料作為唯一或主要碳源生產(chǎn)任意多種生物 或有機產(chǎn)物的方法。根據(jù)該方法，制備了包含葉肉纖維素分解細(xì)菌(例如，發(fā)酵氨基酸球菌 (Actinotalea fermentans))和重組酵母(例如，釀酒酵母(S. cerevisiae))的共培養(yǎng)。將 纖維素(例如，纖維素、微晶纖維素、Avicel、纖維素原料)作為能量來源提供給該共培養(yǎng) 物。在本文涉及纖維素的地方，據(jù)考慮在某些實施方式中半纖維素和/或木質(zhì)素(其它生 物質(zhì)組分)可以與纖維素一同使用或代替纖維素使用。通常，如本文所述，使用粗纖維素原料或部分處理的纖維素原料。然后，纖維素被細(xì)菌代謝以產(chǎn)生作為酵母碳源的產(chǎn)物。因此， 重組酵母能夠在提供纖維素的共培養(yǎng)中進(jìn)行代謝過程。在一些實施方式中，細(xì)菌-酵母共 培養(yǎng)維持在有氧條件下。在一些實施方式中，細(xì)菌-酵母共培養(yǎng)維持在無氧條件下。在一些實施方式中，該共培養(yǎng)為共生共培養(yǎng)。共生共培養(yǎng)是其中酵母的碳源依賴 于細(xì)菌(即，以作為細(xì)菌代謝廢物的化合物形式)，而細(xì)菌依賴于酵母對有毒廢物的代謝的 培養(yǎng)。即，在不存在酵母共生體的情況下細(xì)菌廢物的累積會抑制該細(xì)菌的生長或生存力。 因此，例如，(a)代謝纖維素以產(chǎn)生乙醇并且(b)生長受乙醇抑制的纖維素分解細(xì)菌與代謝 乙醇的酵母可以用于共生共培養(yǎng)。如另一實施例，(a)代謝纖維素以產(chǎn)生乙酸鹽并且(b) 生長受乙酸鹽抑制的纖維素分解細(xì)菌與代謝乙酸鹽的酵母可以用于共生共培養(yǎng)。如另一實 施例，(a)代謝纖維素以產(chǎn)生乳酸鹽并且(b)生長受乳酸鹽抑制的纖維素分解細(xì)菌與代謝 乳酸鹽的酵母可以用于共生共培養(yǎng)。這些實施例用于對本發(fā)明進(jìn)行說明而非用于限制本發(fā) 明。此外，就這一點來說，“依賴”不必須表示絕對的依賴性，而可以表示生物的生長或生存 力在共培養(yǎng)中更高或更穩(wěn)定?？梢詫⒐采?xì)菌_酵母共培養(yǎng)描述為彼此制約的協(xié)作系統(tǒng)， 其中每種生物的生存力均依賴于另一種生物。多種纖維素分解細(xì)菌適合在共培養(yǎng)中使用。有關(guān)對纖維素分解細(xì)菌的討論， 參見，例如，Lynd et al, 2002, "Microbial eel luloseuti Iization fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev. 66 :506_77。在一些實施方式中，所述纖維 素分解細(xì)菌為纖維單胞菌屬(Cellulomonas)或氨基酸球菌(actinotalea)種。作為 說明而非限制，示例性纖維素分解細(xì)菌包括哈茨木霉(Trichodermaharz ianum)、里氏 木霉(Trichoderma reesei)、潮濕纖維單胞菌(Cellulomonas uda)、產(chǎn)黃纖維單胞菌 (Cellulomonas flavigena)、解纖維纖維單胞菌(Cellulomonas cellulolyticum)、假單胞 菌(Pseudomonas)和嗜熱單孢菌(Thermomonospora)。能夠?qū)⒗w維素有氧發(fā)酵為乙醇、乙酸 鹽或乳酸鹽的細(xì)菌很適合于共培養(yǎng)。能夠?qū)⒗w維素有氧發(fā)酵為琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽 或蘋果酸鹽的細(xì)菌也很適合于共培養(yǎng)。在一些實施方式中，使用了能夠?qū)⒗w維素?zé)o氧發(fā)酵 為乙醇、乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽或蘋果酸鹽的細(xì)菌。可以重組修飾纖 維素細(xì)菌(例如，摻入藥物抗性標(biāo)志物、修飾細(xì)胞中的合成途徑等)。在一些實施方式中， 根據(jù)纖維素的細(xì)菌代謝產(chǎn)物對生長的抑制(例如，乙醇、乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸 鹽、甲酸鹽或蘋果酸鹽對生長的抑制)選擇纖維素分解細(xì)菌。應(yīng)理解表現(xiàn)出這種生長抑制 的細(xì)菌對共生共培養(yǎng)特別有用。可以通過參考科學(xué)文獻(xiàn)鑒別表現(xiàn)出這種生長抑制的纖維素 分解細(xì)菌，或者可以在實驗室中進(jìn)行鑒別或篩選。在一些實施方式中，使用重組技術(shù)使特定 的細(xì)菌類型或菌株對該抑制敏感。其它所需的特性包括快速生長、在有氧或無氧條件下生 長的能力和分泌來源于纖維素的大量的碳的能力(例如，在有氧和無氧條件其中之一或兩 種狀態(tài)下，至少約20%、優(yōu)選地至少約40%、最優(yōu)選至少約50% )。在一些實施方式中，該 細(xì)菌不是乳酸桿菌種(Lactobacillus)。在一些實施方式中，該細(xì)菌不是馬乳酒樣乳桿菌 (Lactobaci1luskef iranofaciens) 0在一種實施方式中，該細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌。發(fā)酵氨基酸球菌 (A. fermentans)可得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC 43279)并且之前稱為發(fā)酵纖維 單胞菌(Cellulomonas fermentans)(參見，Yi et al,2007, "Demequina aestuarii gen.nov. ， sp.nov. ， a novelactinomycete of the suborder Micrococcineae， andreclassification ofCellulomonas fermentans Bagnara et al. 1985 as Actinotalea fermentansgen. nov.，comb，nov.，，Int J Syst Evol Microbiol 57 (Pt 1) 151-6 ；另夕卜 參見 Bagnara et al, 1987，“Physiological properties of Ce 1 lulomonasfermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium. ”App1.Microbiol. Biotechnol. 26 :170_176， 1987)。發(fā)酵氨基酸球菌代謝纖維素以產(chǎn)生乙酸鹽和乙醇。類似地，可以使用多種酵母菌株和菌種。在一個實施方式中，該酵母為釀酒酵母 (S. cerevisiae)(例如，釀酒酵母W303a)。在其它實施方式中，使用了另一酵母種(例如，巴 斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵 母(Kluyveromyces lactis)、角軍月旨耳口氏酵母(Yarrowia lipolytica)、酵母(Sacharomyces) 禾口粟酒裂殖酵母(Scizosacchromyces pombe))。只要纖維素的細(xì)菌代謝產(chǎn)物可以用作酵母的能量來源和碳源，那么該共培養(yǎng)可以 包含纖維素分解細(xì)菌和酵母的任意組合。在一種實施方式中，細(xì)菌對纖維素的代謝產(chǎn)生了 分泌的乙酸鹽和/或乙醇。纖維素細(xì)菌的其它終產(chǎn)物包括分泌的乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸 鹽、蘋果酸鹽、甲酸酯和其它有機分子(通常具有1-6個碳原子)。在一種實施方式中，所述纖維素細(xì)菌為發(fā)酵氨基酸球菌(A. fermnentans)而所述 酵母為釀酒酵母(S. cerevisiae)。通常對所述酵母進(jìn)行重組設(shè)計以產(chǎn)生所關(guān)心的產(chǎn)物。例如，可以修飾釀酒酵母 (S. cerevisiae)以表達(dá)鹽草(Batis Maritima)MHT。如實施例中所述，與通過工程設(shè)計以 表達(dá)MHT的酵母共培養(yǎng)可以用于生產(chǎn)鹵代甲烷。然而，可以在多種其它應(yīng)用中應(yīng)用共培 養(yǎng)。即，給定經(jīng)過重組修飾以產(chǎn)生所關(guān)心產(chǎn)物的任意酵母，則可以在存在纖維素源和該酵 母產(chǎn)生該產(chǎn)物所需的任何底物的情況下使用該酵母和纖維素細(xì)菌的共培養(yǎng)生產(chǎn)產(chǎn)物。酵 母產(chǎn)物可以是藥物、食品、氨基酸、輔因子、激素、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、工業(yè)酶等。通過重 組酵母生產(chǎn)的產(chǎn)物實例包括小分子藥物(參見，例如，Ro et al，2006 “Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid inengineered yeast"Nature 440(7086) 940-3)；石化預(yù)制品(參見，例如，Pirkov et al, 2008,"Ethylene production by metabolic engineeringof the yeast Saccharomyces cerevisiae"Metab Eng. 10(5) 276-80)；商用或醫(yī)用蛋白質(zhì)(參見，例如，Gerngross et al, 2004, "Advances inthe production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentousfungi" Nat Biotechnol ；22 (11) =1409-14) 0示例性醫(yī)用蛋白質(zhì)包括胰島素、乙型肝炎抗原、地西 盧定、來匹盧定(1印idurin)和高血糖素。有關(guān)其它實例，請參見，Porro et al,2005, "Recombinant proteinproduction in yeasts"Mol Biotechnol. 31 (3) :245_59?？梢?通過本發(fā)明共培養(yǎng)中酵母產(chǎn)生的有商業(yè)價值的化合物的其它實例包括，但不限于，1，4 二 酸(琥珀酸、富馬酸和蘋果酸)；2，5呋喃二羧酸；3羥基丙酸；門冬氨酸；葡萄糖二酸；谷 氨酸；衣康酸；乙酰丙酸；3-羥基丁內(nèi)酯；甘油；山梨糖醇；木糖醇/阿拉伯糖醇；葡糖酸； 乳酸；丙二酸；丙酸；三元酸(檸檬酸和烏頭酸)；木糖酸；醋偶姻；糠醛；左旋葡聚糖；賴 氨酸；絲氨酸；蘇氨酸、纈氨酸和S-腺苷甲硫氨酸。其它實例包括3甘油、3羥基丙酸、 乳酸、丙二酸、丙酸、絲氨酸；4醋偶姻、門冬氨酸、富馬酸、3-羥基丁內(nèi)酯、蘋果酸、琥珀 酸、蘇氨酸；5阿拉伯糖醇、糠醛、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、脯氨酸、木糖醇、木糖酸；烏頭 酸、檸檬酸和 2，5 呋喃二羧酸。參見，Werpy et al，2004" TOP VALUE ADDED CHEMICALSFROMBIOMASS VOLUME I-RESULTS OF SCREENING FORPOTENTIAL CANDIDATES FROM SUGARS AND SYNTHESISGAS" published by Department of Energy Washington D. C.。另外，參見 Biomass Document Databaseathttp://wwwl. eere. enerRY. Rov/biomass/publications. _，它們以其整體作為參考并入。對酵母進(jìn)行基因修飾從而使其產(chǎn)生所需產(chǎn)品的方法在 本領(lǐng)域中是已知的或者可以開發(fā)。一方面，本發(fā)明包括收集或富集由酵母細(xì)胞產(chǎn)生的所關(guān)心產(chǎn)物的其它步驟。在一 個實施方式中，所關(guān)心的產(chǎn)物是分子量小于1000的小分子化合物。通常并且最方便地，使共培養(yǎng)的細(xì)菌和酵母組分在液體培養(yǎng)基中共同(混合)生 長。然而，在一些實施方式中，可以(例如)將共培養(yǎng)的生物維持在通過滲透膜隔開的生物 反應(yīng)器的單獨隔室中，所述滲透膜允許代謝產(chǎn)物和其它分子在隔室之間擴(kuò)散。多種適合的 生物反應(yīng)器在本領(lǐng)域中是已知的。除可以添加的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、生物質(zhì)、原料等之外，共培養(yǎng)中使用的培 養(yǎng)物或生長培養(yǎng)基將包含適量的氮和硫源，例如，以一種或多種硫酸鹽(如硫酸銨)和/ 或硫代硫酸鹽的形式。該培養(yǎng)基還可以含有維生素，如維生素B12?？梢允褂肶P培養(yǎng)基 (10克Bacto-酵母提取物(Difco)、20克Bacto-蛋白胨(Difco)，加入雙蒸水(ddH20)至 900mL)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)確定優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法。參見，例如，Ball，A. S.， 1997，BACTERIALCELL CULTURE ESSENTIAL DATA, John ffiley&Sons ；Richmond, Α.，2003， (HANDBOOK OF MICR0ALGAL CULTURE, Wiley-Blackwell ；Becker, E. W.，1994，MICROALGAE BIOTECHNOLOGY AND MICROBIOLOGY”，Cambridge UniversityPress ；and Walker, G. M.， 1998，YEAST PHYSIOLOGY ANDBI0TECHN0L0GY, John Wiley&Sohs。本發(fā)明提供了細(xì)菌-酵母共培養(yǎng)，其中所述細(xì)菌代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多種代 謝產(chǎn)物，而所述酵母使用所述細(xì)菌的代謝產(chǎn)物作為碳源。在一些實施方式中，所述微生物適 應(yīng)共同生長并且維持相對恒定的物種種群比，從而使任一種微生物種群均不壓倒另一種。 在以下5. 1節(jié)中所述的細(xì)菌-酵母共培養(yǎng)類型中，我們通常觀察到細(xì)菌比酵母過量100倍 (每毫升中有約100萬個活酵母細(xì)胞和1億個活細(xì)菌細(xì)胞)。5. 1. 1表達(dá)MHT的釀酒酵母(S. cerevisiae)和發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)的其培養(yǎng)與現(xiàn)有預(yù)制品(building block)分子相比，在酵母中生產(chǎn)碘甲烷具有幾個優(yōu)勢， 包括與工業(yè)過程的兼容性。然而，從來源于糧食作物的糖(如玉米和甘蔗)生產(chǎn)生物燃料 和生物基預(yù)制品可以直接造成全球食品短缺。為了緩和這些問題，碘甲烷(及其它生物基 分子)必須來源于纖維素原料，其包括“能量來源作物”，如柳枝稷(Panicum virgatum)和 象草(Miscanthus giganteus)以及諸如玉米秸稈的農(nóng)業(yè)廢物。由于木質(zhì)纖維材料能夠耐 受微生物的消化，因此這些真實世界的生物質(zhì)來源向可發(fā)酵的糖和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化存在問題。我們構(gòu)建了 MHT-表達(dá)酵母(如上所述)與葉肉纖維素分解細(xì)菌，發(fā)酵氨基酸球 菌(Actinotalea fermentans)的共培養(yǎng)。發(fā)酵氨基酸球菌有氧地將纖維素發(fā)酵為乙酸 鹽和乙醇，而釀酒酵母(S. cerevisiae)能夠?qū)⑵渥鳛樘荚催M(jìn)行利用。重要的是，發(fā)酵氨 基酸球菌的生長受乙酸鹽和乙醇累積的抑制，從而在群落內(nèi)產(chǎn)生代謝相互依賴性，即釀酒 酵母(S. cerevisiae)的碳源依賴于發(fā)酵氨基酸球菌，而發(fā)酵氨基酸球菌依賴釀酒酵母 (S. cerevisiae)對有毒廢物進(jìn)行代謝(圖9A)。我們將釀酒酵母(S. cerevisiae)與發(fā)酵
31氨基酸球菌接種到含有羧甲基纖維素作為唯一碳源的培養(yǎng)基上并測量酵母和細(xì)菌的菌落 形成單位(CFU)隨時間的變化。酵母在共培養(yǎng)中生長36小時后增加到106cfu/ml，而無纖 維素分解同伴的酵母表現(xiàn)出較少的生長(圖9B，左側(cè)部分)。通過消耗有毒成分，酵母的存 在也提高了細(xì)菌的生長率(圖9B，右側(cè)部分)。這種相互作用表明了共生的關(guān)系。我們接著測試了纖維素原料向碘甲烷的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。我們在含有粉碎的干燥柳枝 稷作為唯一碳源的培養(yǎng)基上以低密度接種共培養(yǎng)物。在接種后的36小時，向培養(yǎng)基中添加 碘化鈉以誘導(dǎo)碘甲烷的生產(chǎn)。圖9C顯示了各種纖維素源上碘甲烷的產(chǎn)率，包括柳枝稷、玉 米秸稈和白楊。添加乙酸鹽作為非可發(fā)酵碳源的參照，而添加羧甲基纖維素(CMC)作為纖 維素標(biāo)準(zhǔn)品。與傳統(tǒng)作物相比，諸如柳枝稷的能量來源作物提供了幾種優(yōu)勢，如需要較少的 農(nóng)業(yè)輸入和在邊際耕地上生長，或表現(xiàn)出優(yōu)良的生長或遺傳易處理性(例如，白楊)。諸如 玉米(Zea mays)秸桿的農(nóng)業(yè)殘余物是纖維素碳的另一來源，其中美國每年產(chǎn)生約200mg的 秸桿。該結(jié)果表明可以從多種纖維素碳源生產(chǎn)碘甲烷。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)鹵代甲烷的方法，其包括將代謝纖維素并產(chǎn)生一種或多 種代謝產(chǎn)物的第一微生物與不代謝纖維素并經(jīng)過重組修飾以表達(dá)異源商代甲烷轉(zhuǎn)移酶蛋 白的第二微生物在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下在含有纖維素和鹵化物(例如，氯化物、溴化物 和碘化物)的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。6.鹵代甲烷的收集和純化鹵代甲烷是揮發(fā)性的并逸入液體培養(yǎng)基上方的蒸汽中。在生產(chǎn)規(guī)模中，由于純化 鹵代甲烷(如果需要)需要相對很少的額外能量，因此與(例如)其它生物燃料中間體相 比，這是有利的。在一個實施方式中，可以在轉(zhuǎn)化為一種或多種非鹵化有機分子前收集鹵代 甲烷。在另一個實施方式中，省略了收集步驟，例如，當(dāng)產(chǎn)生鹵代甲烷的同一生物還將該鹵 代甲烷轉(zhuǎn)化為有機分子時?？梢栽诜磻?yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)、鹵代甲烷的收集和/或鹵代甲烷向諸如高分子 量化合物(以下)的有機化合物的轉(zhuǎn)化。化學(xué)加工方法和生物反應(yīng)器系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是 已知的并且可以容易地適應(yīng)于本發(fā)明。出于說明而非限制，在科學(xué)和工程文獻(xiàn)中提供了指 導(dǎo)，例如，McKetta, J.，CHEMICAL PROCESSING HANDBOOK, 1993, Marcel Dekker ；Lee, S.， ENCYCLOPEDIA OF CHEMICALPROCESSING,2006, Taylor and Francis Group ；Asenjo, J.， BI0REACT0R SYSTEM DESIGN,1995,Marcel Dekker ；Nielsen,J. ,BI0REACTI0N ENGINEERING PRINCIPLES,2003, KluwerAcademics ；Crow et al, Process for manufacturing methyl chloride,美國專利 No. 6111153 ；Van ' t Riet and Tramper, 1991，BASICBI0REACT0R DESIGN, CRC Press ；Asenjo and Merchuk, 1995, BI0REACT0R SYSTEM DESIGN, CRC Press ； and Narita et al,Preparation of methyl chloride，美國專利 No. 5917099，以上每篇文 獻(xiàn)作為參考并入本文。出于說明而非限制，圖9中示出了一種反應(yīng)器系統(tǒng)?？梢允褂萌魏我?知方法通過將以氣態(tài)形式產(chǎn)生的鹵代甲烷從發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移到冷凝器以收集揮發(fā)性鹵代甲烷。 在該冷凝器中，可以降低包含鹵代甲烷的氣體的溫度，例如，使鹵代甲烷液化而不使其它氣 態(tài)組分液化，這使其易于純化。在反應(yīng)器中可以發(fā)生催化縮合或其它反應(yīng)。作為縮合反應(yīng) 副產(chǎn)物產(chǎn)生的鹵鹽可以通過例如引回發(fā)酵罐而進(jìn)行循環(huán)。可以容易地通過例如氣相色譜-質(zhì)譜法測量氣相的產(chǎn)量，其確定了所產(chǎn)生的鹵代 甲烷的分子數(shù)?？梢允褂煤嗬?Henry' s Law)計算所產(chǎn)生的鹵代甲烷的總量。子可以將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為有機產(chǎn)物，如醇、烷烴(乙烷-辛烷或更長鏈的烷烴)、醚、 醛、鏈烯、烯烴和硅氧烷聚合物。相應(yīng)地，這些產(chǎn)物可以用于制備非常廣泛的石油化學(xué)品，有 時稱為“生物燃料”。在傳統(tǒng)石化工業(yè)中，在生產(chǎn)更復(fù)雜的有機化合物中使用包括鹵代甲烷 在內(nèi)的鹵代烴類是已知的。參見，例如，Osterwalder andStark，2007，“Direct coupling of bromine-mediated methane activationand carbon-deposit gasification，，， Chemphyschem 8 :297_303 ;0sterwalder 禾口 Stark, 2007, Production of saturated C2to C5hydrocarbons”，歐洲專利申請 EP 1837320?？梢酝ㄟ^多種已知方法實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，包括生物轉(zhuǎn)化(例如，通過使用可以將鹵代甲 烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子的生物，例如，該通過一種或多種酶的作用)。如果需要，可以在維 持產(chǎn)生鹵代甲烷的生物的相同反應(yīng)器或容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化?？梢杂卯a(chǎn)生鹵代甲烷的相同生物 或不同的生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述相同生物或不同的生物存在于相同反應(yīng)器中或隔離在不同隔 室或反應(yīng)器中。可以修飾生物從而與未修飾生物相比以更高的速率或更大的程度產(chǎn)生或轉(zhuǎn) 化(或既產(chǎn)生又轉(zhuǎn)化)鹵代甲烷。當(dāng)通過產(chǎn)生鹵代甲烷的相同生物實現(xiàn)轉(zhuǎn)化時，可以可選 地省略鹵代甲烷的收集?？梢钥蛇x地在相同容器或反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化。通過使用化學(xué)催化劑，可以將鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為多種有機分子。根據(jù)底物的選擇 (所用的化學(xué)催化劑和/或鹵代甲烷)和不同變量的調(diào)整(如溫度、(分)壓力和催化劑預(yù) 處理)，可以獲得多種有機產(chǎn)物。例如，使用金屬氧化物催化劑可以導(dǎo)致較長鏈烷烴的生產(chǎn)。 使用AlBrJI化劑可以導(dǎo)致丙烷的生產(chǎn)。如果所需產(chǎn)品為醇、醚或醛，則可以將鹵代甲烷通 過根據(jù)其選擇性而選擇的特定金屬氧化物以產(chǎn)生所需的功能性(例如，醇、醚或醛)。如果 所需產(chǎn)物的選擇性受一鹵代烷基與金屬氧化物之間反應(yīng)中所存在的水含量的影響，則可以 向一溴代烷基原料中加水至適當(dāng)水平。使用沸石催化劑可以導(dǎo)致烯烴的生產(chǎn)。沸石的實例包括天然存在的沸石，如斜堿 沸石、方沸石、鈉紅沸石、貝爾伯格石、比基塔石、伯格斯石、鍶沸石、菱沸石、斜發(fā)沸石、刃沸 石、環(huán)晶石、鋇沸石、柱沸石、毛沸石、八面沸石、鎂堿沸石、十字沸石、水鈣沸石、鈉菱沸石、 戈硅鈉鋁石、纖沸石、古柱沸石、交沸石、堿菱沸石、片沸石、濁沸石、插晶菱沸石、馬里鉛沸 石、針沸石、麥鉀沸石、中沸石、蒙特索馬石、絲光沸石、鈉沸石、鉀沸石、副鈉沸石、方堿沸 石、五元環(huán)沸石、培水硅鋁鉀石、鈣十字沸石、銫榴石、鈣沸石、鈉環(huán)晶沸石、淡紅沸石、輝沸 石、四鈉沸石、桿沸石、缺泥沸石(Tschernichite)、斜鈣沸石、鋇鈣十字石、鉀菱沸石和湯河 原沸石。也可以使用合成沸石。在本領(lǐng)域中，使用沸石從鹵代甲烷進(jìn)行生產(chǎn)是熟知的。參見， 例如，Svelle et al，2006，Journal of Catalysis, 241 :243_54and Millar et al, 1995, 美國專利No. 5，397，560，以上兩篇文獻(xiàn)以其整體作為參考并入，其討論了使用沸石產(chǎn)生烴 類產(chǎn)物，包括鏈烯，如乙烯、丙烯和丁烯以及乙苯和高級芳烴。除作為有機分子工業(yè)生產(chǎn)中有用的中間體外，鹵代甲烷具有各種其它用途，例如 在丁基橡膠生產(chǎn)和石油煉制中用作溶劑，在有機化學(xué)中用作甲基化和/或鹵化試劑，用作 油脂、油劑和樹脂的提取劑，用作聚苯乙烯泡沫塑料生產(chǎn)的拋射劑和起泡劑，用作局部麻醉 劑，用作藥物生產(chǎn)的中間體，用作低溫聚合反應(yīng)中的催化劑載體，用作測溫和恒溫設(shè)備的液 體以及用作除草劑。8.實施例
下列實施例僅出于說明的目的而并不是要進(jìn)行限制。實施例1.在大腸桿菌(E. coli)中表汰鹽草(Batis Maritima)MHTcDNA鹽草(BatisMaritima)MHT cDNA (Genbank 登錄號AF109128 或 AF084829)是人 工合成的并克隆到表達(dá)載體pTRC99a中。所得的大腸桿菌(E.coli) (DH10B菌株)包含受IPTG誘導(dǎo)型啟動子控制的編碼鹽 草(Batis maritima)MHT的表達(dá)構(gòu)建體，并將其稱作“E. coli_MHTBatis”菌株。實施例2 測量鹵代甲烷的產(chǎn)量可以通過氣相色譜法測量鹵代甲烷的產(chǎn)量。在如下所述的實驗中，使用了 Agilent 氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)系統(tǒng)。通?！癆IR. U”調(diào)諧文件使用1341的電離電壓。在一些實 驗中，使用了約1250的電離電壓。將溶劑延遲設(shè)置為0并將掃描參數(shù)集設(shè)置為15-100MW。 將進(jìn)樣口(注射口，injection port)和柱預(yù)置為50°C。振蕩數(shù)秒以混合待測試樣品。用 氣密注射器提取100 μ L頂部空間氣體。手動將樣品氣體進(jìn)樣(injected)到GCMS進(jìn)樣口。 以下列設(shè)置啟動GCMS程序50°C，1:00 ；每分鐘升高10°C至70°C (樣品通常以約52°C離 開)；70°C，1:00。然后清洗色譜柱(2分鐘升高到240°C )。通過提取對應(yīng)于50麗的GC峰 鑒別出樣品峰(-0.3，+0.7)。對該峰進(jìn)行積分以產(chǎn)生“GC 50麗”數(shù)據(jù)。實施例3 通過表汰鹽草(Batis Maritima)鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌 (E. coli)牛產(chǎn)鹵代甲烷用編碼來自如實施例1所述的鹽草(Batis Maritima)的密碼子優(yōu)化的氯甲烷轉(zhuǎn) 移酶基因MCT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) (DH10B、BL21或MC1061菌株)和沙門氏菌屬 (Salmonella) (SL1344)。在16mL培養(yǎng)管中，對加入ImM IPTG的IOmL LB培養(yǎng)基接種鋪板 細(xì)胞的單一菌落。然后，覆蓋封口膜和鋁箔并用橡皮筋扎緊以密封該管。在37°C振蕩培養(yǎng) 該培養(yǎng)物4-22小時，并測量鹵代甲烷的產(chǎn)量。每株菌株均產(chǎn)生氯甲烷。另外，發(fā)現(xiàn)該結(jié)果高度可重復(fù)。使用大腸桿菌(E. coli) (DH10B菌株)中一種鹽草 (Batis maritima)MHT酶的5個不同克隆重復(fù)試驗得到了每個克隆中氯甲烷的產(chǎn)量，其標(biāo) 準(zhǔn)偏差為平均鹵代甲烷產(chǎn)量的約12%。實施例4 =鹵代甲烷的生產(chǎn)遵循用其它IPTG誘導(dǎo)型構(gòu)建體觀察到的誘導(dǎo)曲線將用編碼密碼子優(yōu)化的氯甲烷轉(zhuǎn)移酶基因MCT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(DH10B菌 株)在存在誘導(dǎo)劑(IPTG)的情況下培養(yǎng)，其中所述密碼子優(yōu)化的氯甲烷轉(zhuǎn)移酶基因MCT來 自如實施例1所述的鹽草(Batis maritima)。如圖1所示，提高IPTG的水平造成氯甲烷的
產(chǎn)量提高。如圖2所示，誘導(dǎo)后，鹵代甲烷的產(chǎn)量在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上隨時間線性增加直至約1至 2. 5小時。如圖3所示，靜止期的細(xì)胞比生長期的細(xì)胞產(chǎn)生更多鹵代甲烷。如果營養(yǎng)物濃度 不提高，則人工加倍培養(yǎng)物的密度不能提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。比較了有氧和無氧培養(yǎng)條件之間的鹵代甲烷產(chǎn)量。有氧條件產(chǎn)生了更高水平的鹵 代甲烷培養(yǎng)物。實施例5 培養(yǎng)基中鹽濃度的影響使E. coli-MHTBatis細(xì)胞在改變了 NaCl濃度的改進(jìn)Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基上 生長。正常LB培養(yǎng)基含有5g/L的酵母提取物、10g/L的胰蛋白胨、10g/L的NaCl (0. 171MNaCl)，pH為7。測試了在LB培養(yǎng)基和含有0. 85或0. 017M NaCl的改進(jìn)LB培養(yǎng)基上的氯 甲烷的產(chǎn)量。圖4中總結(jié)了結(jié)果。0.085M NaCl的結(jié)果最好。然而，正常LB培養(yǎng)基的結(jié)果 接近最佳值。如表3所示，配制了具有0. 16M的溴或碘的反離子(count ion)的改進(jìn) Luria-Bertani ilff^S；。表3 實施例6 不同鹵化物的影響為了比較使用不同鹵鹽的鹵代甲烷的產(chǎn)量，設(shè)計了標(biāo)準(zhǔn)化測定。在20mL LB培養(yǎng) 基上接種了鋪板細(xì)胞的單一菌落并在37°C振蕩培養(yǎng)約10-14小時。使細(xì)胞成粒并用LB培 養(yǎng)基再懸浮。將相等等份加入至具有IPTG的IOml LB,LB-Br或LB-I培養(yǎng)基并培養(yǎng)1. 5小 時。采集100 μ L的頂部空間氣體并按照實施例2測量存在的鹵代甲烷的量。如圖5所示，更高分子量的鹵化物具有更高的鹵代甲烷產(chǎn)率，其中碘離子的產(chǎn)率 最大，然后是溴離子和氯離子。使用亨利定律(Henry’ s law)計算產(chǎn)生的氣體總量(溶于 培養(yǎng)基和存在于頂部空間中的量)，計算得到碘甲烷的產(chǎn)率為約每天40(具體地為43)mg/ L0 實施例7 表汰異源MHT和過表汰大腸桿菌(E. coli)metK的大腸桿菌(E. coli)細(xì) 胞中鹵代甲烷的產(chǎn)量測試了某些輔助蛋白的過表達(dá)對鹵代甲烷生產(chǎn)的影響。用編碼大腸桿菌(E. coli) metK、大腸桿菌(E. coli)clcA或大腸桿菌(E. coli) vgb基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli_MHTBatis菌 株。培養(yǎng)細(xì)胞并測量氯甲烷的產(chǎn)量。如Ml所示，metK的過表達(dá)改善了氯甲烷的產(chǎn)率。在 所使用的條件下，vgb和clcA的表達(dá)造成了一般的毒性。實施例8 大腸桿菌(E. coli)中異源MHT表汰的影響對來自各種生物的十九種鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并引入大腸 桿菌(E.coli)。對每種基因確定了溴甲烷和碘甲烷的產(chǎn)量。如表5所示，這些基因 來自鹽草(Batis maritima)、月中塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum) STM815、細(xì)長 聚 求· (Synechococcus elongatus)PCC 6301、力、白胃亞禾中(Brassica rapasubsp. Chinensis) ； 1ξ[" M (Brassica oleracea) TM2 ； ^f (Arabidopsisthaliana)TMl ； 芥(Arabidopsis thaliana)TM2 ；鉤端螺菌屬(I^ptospirillum sp) II 組 UBA ；新型隱球 酵母(Cryptococcusneoformans)新型變體 JEC21 ；水稻(Oryza sativa)(日本產(chǎn)植物培 #組(iaponica cultivar-group))；金牛蟲 求菌(Ostreococcus tauri)；芳方矣月兌單Ifi 菌(Dechloromonas aromatica)RCB ；灰蓋鬼傘網(wǎng)山株(Coprinopsis cinerea okayama)； Robiginitalea bofirmataHTCC2501 ；馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)MCSlO ；黃 桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 ；葡萄(Vitis vinifera)；嗜鹽嗜鹽紅螺菌 (halorhodospira halophila) SLl。表 4 中示出了 MHT序列。表 5 顯示了與鹽草(Batis maritima)蛋白相比的氨基酸同一性水平。鹽草(BATISMARITIMA)MSTVANIAPVFTGDCKTIPTPEECATFLYKVVNSGGWEKCWVEEVIPWDLGVPTPLVLHLVKNNALPNGKGLVPGCGGGYDVVAMANPERFMVGLDISENALKKARETFSTMPNSSCFSFVKEDVFTWRPEQPFDFIFDYVFF CAlDPKMRPAffGKAMYELLKPDGELITLMYPI
TNHEGGPPFSVSESEYEKVLVPLGFKQLSLEDYSDLAVEPRKGKEKLARffKKMNN腫塊伯克氏菌(BURKHQLDERIAPHYMATUM) STM815 (與鹽草(BATIS MARITIMA) 29% 的同一性)MSDKRPSVPPSAPDFENRDPNAPGFWDERFGRGFTPWDQAGVPPAFKAFVERHSPVPVLIPGCGSAYEARWLAEKGWTVRAIDFAPNAVEAARAQLGSHASLVHEADFFTYRPPFDPGWIYERAFLCALPPARRSDWVARMAQLLSPGGLLAGFFFIGATEKGPPFGIERAELDALMSPDFTLVEDEPVDDSIAVFAGRERWLTWRRRGAARG細(xì)長聚球藻(SYNECHOCOCCUSELONGATUS) PCC 6301MTNAVNQAQFffEQRYQEGSDRffDLGQAAPVffRSLLAGTNAP
APGRIAVLGCGRGHDARLFAEQGFEVVGFDFAPSAIAAAQALAQGTTAQFLQRDIFALPQEFAGQFDTVLEHTCFCAIDPDRRAEYVEVVRQILKPKGCLLGLFWCHDRPSGPPYGCSLTELRDRFAQGWQEEQLESVTESVEGRRGEEYLGRffRRLD小白菜亞種(BRASSICARAPA SUBSP. CHINENSIS)MAEVQQNSAHINGENIIPPEDVAKFLPKTVEEGGffEKCffEDGVTPWDQGRATPLVVHLVESSSLPLGRALVPGCGGGHDVVAMASPERYVVGLDISESALEKAAETYGSSPKAKYFTFVKEDFFTffRPNELFDLIFDYVVFCAIEPETRPAWAKAMYELLKPDGELITLMYPITDHDGGPPYKVAFSTYEDVLVPVGFKAVSIEENPYSIATRKGKEKLARffKKIN甘藍(lán)(BRASSICA0LERACEA) (TMl)MAEEQQKAGHSNGENIIPPEEVAKFLPETVEEGGffEKCffEDGITPWDQGRATPLVVHLVDSSSLPLGRALVPGCGGGHDVVAMASPE
RFVVGLDISESALEKAAETYGS SPKAKYFTFVKEDFFTffRPNELFDLIFDYVVFCAIEPEMRPAWAKSMYELLKPDGELITLMYPITDHDGGPPYKVAVSTYEDVLVPVGFKAVSIEENPYSIATRKGKEKLGRWKKIN甘藍(lán)(BRASSICAOLERACEA) (TM2)MAEVQQNS GNSNGENIIPPEDVAKFLPKTVDEGGffEKCffEDGV
TPWDQGRATPLVVHLVESSSLPLGRGLVPGCGGGHDVVAMASPERYVVGLDISESALEKAAETYGSSPKAKYFTFVKEDFFTffRPNELFDLIFDYVVFCAIEPETRPAWAKAMYELLKPDGELITLMYPITDHDGGPPYKVAVSTYEDVLVPVGFKAVSIEENPYSIATRKGKEKLARffKKIN擬南芥(ARABIDOPSISTHALIANA) TMlMAEEQQNS SYSIGGNILPTPEEAATFQPQVVAEGGffDKCffEDGVTPWDQGRATPLILHLLDSSALPLGRTLVPGCGGGHDVVAMASPERFVVGLDISDKALNKANETYGSSPKAEYFSFVKEDVFTWRPNELFDLIFDYVFFCAIEPEMRPAWGKSMHELLKPDGELITLMYPMTDHEGGAPYKVALS SYEDVLVPVGFKAVSVEENPDSIPTRKGKEKLARffKKIN擬南芥(ARABIDOPSISTHALIANA) TM2MAEEQQNSDQSNGGNVIPTPEEVATFLHKTVEEGGWEKCWEEEITPffDQGRATPLIVHLVDTS SLPLGRALVPGCGGGHDVVAMASPERFVVGLDISESALAKANETYGSSPKAEYFSFVKEDVFTWRPTELFDLIFDYVFFCAIEPEMRPAWAKSMYELLKPDGELITLMYPITDHVGGPPYKVDVSTFEEVLVPIGFKAVSVEENPHAIPTRQREAGKVEEDQLIPKKEILLFGKSVICVIYKE鉤端螺菌屬(LEPTOSPIRILLUMSP. ) II 組 UBA
MPDKIFWNQRYLDKNTGWDLGQPAPPFVRLVEKGEFGPPGRVLIPGAGRSYEGIFLASRGYDVTCVDFAPQAVREAREAARQAGVKLTVVEEDFFRLDPRTIGVFDYLVEHTCFCAIDPPMRQAYVDQSHALLAPGGLLIGLFYAHGREGGPPffTTTEEEVRGLFGKKFDLLSLGLTDffSVDSRKGEELLGRLRRKNDRIE新型隱球酵母(CRYPTQCOCCUSNEOFORMANS)新型變體(VAR. NEOFORMANS JEC21) (假定蛋白質(zhì))MAQASGDDNAWEERWAQGRTAFDQSAAHPVFVKFLKSDIARELGVPKSGKALVPGCGRGYDVHLLASTGLDAIGLDLAPTGVEAARRWIGSQPSTSGKADILVQDFFTYDPLEKFDLIYDYTFLCALPPSLRQEffARQTTHLANIAADTNPILITLMYPLPPSAKSGGPPFALSEEIY
QELLKEQGWKMVWSEDIEEPTRMVGAPGGEKLAVWKRI稻(ORYZA SATIVA)日本產(chǎn)植物培育組(JAPONICACULTIVAR-GROUP)
MASAIVDVAGGGRQQALDGSNPAVARLRQLIGGGQES SDGffSRCWEEGVTPWDLGQRTPAVVELVHSGTLPAGDATTVLVPGCGAGYDVVALSGPGRFVVGLDICDTAIQKAKQLSAAAAAAADGGDGSSSFFAFVADDFFTWEPPEPFHLIFDYTFFCALHPSMRPAWAKRMADLLRPDGELITLMYLAEGQEAGPPFNTTVLDYKEVLNPLGLVITSIEDNEVAVEPRKGMEKIARffKRMTKSD金牛蠣球菌(0STRE0C0CCUS TAURI)(未命名蛋白產(chǎn)物)MTTS SAPTRHTSMRVALAAPATVTRRLGTYKRVFDRRAMSTRAI
DGAVTSNA⑶FARQDGSTDWEGMWSRGITKGAAFDCSRTEPAFQNALDAKEIAIGSGRALVPGCGRGYALASLARAGF ⑶ WGLEISETAKEACEEQLKAESIPETARVEVVVADFFAYDPKEAFDAAYDCTFLCAIDPRRREEWARKHASLIKPGGTLVCLVFPV⑶FEGGPPYALTPEIVRELLAPAGFEEIELRETPAEMYARGRLEYLFTWRRRS芳族脫氯單胞菌(DECHL0R0M0NASAROMATICA) RCBMSETIKPPEQRPEHPDFWCKRFGEGVTPWDAGKVPMAFVDFVGAQTTPLNSLIPGCGSAWEAAHLAELGWPVTALDFSPLAIEKAREVL⑶SPVKLVCADFFTFAPRQPLDLIYERAFLCALPRKLWADWGKQVAELLPSGARLAGFFFLCDQPKGPPFGILPAQLDELLRPNFELI
EDQPV⑶SVPVFAGRERWQVWRRR灰蓋鬼傘岡山株(C0PRIN0PSIS CINEREA 0ΚΑΥΑΜΑ)(假定蛋白質(zhì))MADPNLAPEIRAKMQEIFKPDDRHSWDLLWKENITPWDA⑶AQPSLIELIEESGLDFARKGRALVPGCGTGYDAVYLASALGLQTIGMDISESAVEAANRYRDSSGVQGADRAIFQKADFFTYKVPDEERFDLIMDHTFFCAIHPSLRPEWGQRMSELIKPGGYLITICFPMIPKVETGPPYYLRPEHYDEVLKETFEKVYDKVPTKS SENHKDKERMLVWKKKROBIGINITALEA BIFORMATA HTCC2501MTDLDRDFffEDRYRAGTDRffDLGGPSPPLTAYIDGLTDQELRIL
VPGAGRGYEAEYLYRAGFENLTIVDLARRPLDDLRRRLPELPAAALQQTDFFSFRGGPFDLILEHTFFCALPPARRPDYVQAMHRLLVPGGRLAGLFFDFPLTEDGPPFGGSETEYRNRFSSLFHIRKLERARNSIPPRAGTELFFIFEKK馬氏海洋桿狀菌(MARICAULISMARIS)MCSIOMTHDENRSAFDffEARFIDGNTPffERGALHPAFEAffQHQ SAFAA⑶RALIPGCGRSPELLALAQAGLAVTGADLSGTAMAWQRKLFADAGQQVELITCDVFDWQPQQALDLVYEQTFLCAIHPRLRTRYEEALARffLKPGGRLYALFMQKPERGGPPFDCALDAMRALFPAERWTffPAEADIQPffPHPQLNGKAELGAVLIRR黃桿菌(FLAVOBACTERIABACTERIUM) BBFL7
MPLNKQYWEDRYKNNSTGWDLGIISTPIKEYVNQLENKNSKILIPGAGNAHEATYLVKNGFKNIFILDIALSPLKFAKQRSKLPEEHLIQQDFFDHKGSYDLIIEQTFFCALEPRFRESYVKKIHMLLRDQGCLIGVLFNFENNLSSPPFGGSINEYLNLFEPYFEIVTMEPCNNSVIERQGKEIFIKLKKKK葡萄(VITISVINIFERA)MASPDNTKPKARSSESVTGQRRGRRPSDRHWPCVGEESGSFYNTIADGERQYQHRIELRASKNKPSSWEEKWQQGITPWDLGKATPIIEHLHQAGALPNGRTLIPGCGRGYDVVAIACPERFVVGLDISDSA
IKKAKESSSSSWNASHFIFLKADFFTWNPTELFDLIIDYTFFCAIEPDMRPAffASRMQQLLKPDGELLTLMFPISDHTGGPPYKVSIADYEKVLHPMRFKAVSIVDNEMAIGSRKKKYPLKPDLSLFGFVDRPKRAYEARSEEFRISDffVCGWMGLCVPSGRISGGVCGLLSGRSLTffAKNLGVSTTQLRMSNNGS SIESNPKVQKLNQIIGSDSAGGffEKSWQQGHTPffDLGKPTPIIQHLHQTGTLPSGKTLVPGCGCGYDVVTIACPERFVVGLDISDSAIKKAKEISDHAGGPPYKVSVADYEEVLHPMGFKAVSIVDNKMAIGPRKGREKLGRWKRTPSKSLL嗜鹽嗜鹽紅螺菌(HAL0RH0D0SPIRAHALOPHILA) SLlMSGDPDPRRAPWEARWREGRTGWDRGGVSPTLEAffLSAGVIP
GRRVLVPGAGRGYEVEALARRGYKVTAVDIAAEACQQLRDGLDAAGVEARVVQADLLAWQPDTPFDAVYEQTCLCALDPADWPAYEQRLYGWLRPGGVLLALFMQTGASGGPPFHCALPEMATLFDSERffQWPAEPPRQWPHPSGRWEEAVRLLRR表 5 按照以下方法培養(yǎng)細(xì)胞對于每個菌株，挑取單一菌落并在置于30mL玻璃試管中的20mL的LB miller培養(yǎng) 基上，在37°C以250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩通氣(松開蓋)生長過夜(10-14小時)。在搖擺斗離 心機中以3000 Xg的離心力對培養(yǎng)物離心沉降5分鐘。將細(xì)胞重新懸浮于含有IOOuM IPTG 誘導(dǎo)劑的20mL的適當(dāng)培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、165mM NaX[其中X = Cl、Br、I])。用橡皮塞和封口膜密封細(xì)胞并在37°C以250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)1.5小時。對培 養(yǎng)物進(jìn)行GC/MS，采集100 μ L的頂部空間氣體樣品并加載到色譜柱上。方法運行為V0IGT. m。報告了適當(dāng)物質(zhì)(MeCl、MeBr、MeI)的計數(shù)值。細(xì)胞始終在存在30 μ g/mL氯霉素的情況 下生長。 如上述實施例所述，測量了鹵代甲烷的產(chǎn)量。在圖7中總結(jié)了結(jié)果。發(fā)現(xiàn)鹽草 (B. maritima)轉(zhuǎn)移酶的溴甲烷產(chǎn)量最好，而腫塊伯克氏菌(B. phymatum)轉(zhuǎn)移酶溴甲烷產(chǎn) 量在細(xì)菌中最好。新型隱球酵母(C.ne0f0rmans)JEC21得到了最好的溴甲烷和碘甲烷產(chǎn) 量。鉤端螺菌屬(L印tospirillum)得到了最好的碘甲烷產(chǎn)量。來自稻(0. sativa)、金牛 蠣球菌(0. tauri)；芳族脫氯單胞菌(D. aromatica)和灰蓋鬼傘(C. cinerea)的酶對碘甲 烷的生產(chǎn)表現(xiàn)出顯著的特異性。鹽草(B. maritima)、小白菜亞種(Brassica rapa subsp. chinensis)和甘藍(lán)(B. oleracea)對溴甲烷的生產(chǎn)表現(xiàn)出顯著的特異性。表5中的酶RB、 MM、AT-2、FB、VV和HH表現(xiàn)出不顯著的活性。
實施例9A 鑒別新的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶通過BLAST蛋白-蛋白搜索，對與已知MHT (如來自鹽草(Batismaritima)的MHT) 具有序列同一性的蛋白質(zhì)進(jìn)行搜索以鑒別具有MHT活性的蛋白質(zhì)(包括先前不知道具有該 活性的蛋白質(zhì))?；邴}草(Batis maritima)和腫塊伯克氏菌(Burkholderia phymatum) MHT序列之間29%的同一性，將同一性的截止點指定為28%。將每種鑒別出的序列通過 BLAST返回數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索并產(chǎn)生了新列表。重復(fù)該操作直至不再發(fā)現(xiàn)其它序列為止。表 6示出了已經(jīng)鑒別為具有MHT活性的序列(和相應(yīng)的GenBank登錄號)，包括至今未識別具 有MHT活性的蛋白。多種新近鑒別的蛋白質(zhì)為巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶。表 6>鹽草序列(BATIS SEQ)MSTVANIAPVFTGDCKTIPTPEECATFLYKVVNSGGWEKCWVEEVIPWDLGVPTPLVLHLVKNNALPNGKGLVPGCGGGYDVVAMANPERFMVGLDISENALKKARETFSTMPNSSCFSFVKEDVFTWRPEQPFDFIFDYVFFCAIDPKMRPAWGKAMYELLKPDGELITLMYPITNHEGGPPFSVSESEYEKVLVPLGFKQLSLEDYSDLAVEPRKGKEKLARffKKMNN> GII 30689545 I REF| NP_850403. 11硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶，推定的，[擬南芥 (ARABIDOPSIS THALIANA)]MENAGKATSLQSSRDLFHRLMSENSSGGWEKSWEAGATPWDLGKPTPVIAHLVETGSLPNGRALVPGCGTGYDVVAMASPDRHVVGLDISKTAVERSTKKFSTLPNAKYFSFLSEDFFTWEPAEKFDLIFDYTFFCAFEPGVRPLWAQRMEKLLKPGGELITLMFPIDERSGGPPYEVSVSEYEKVLIPLGFEAISIVDNELAVGPRKGMEKLGRWKKS STFHSTL> GI1157353829 | EMB | CA046361. 11 未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物，[葡萄(VITIS VINIFERA)]MANDSTSIESNSELQKISQVIGSGFNGSWEEKWQQGLTPWDLGK
ATPIIEHLHQAGALPNGRTLIPGCGRGYDVVAIACPERFVVGLDISDSAIKKAKESSSSSWNASHFIFLKADFFTWNPTELFDLIIDYTFFCAIEPDMRPAWASRMQQLLKPDGELLTLMFPISDHTGGPPYKVSIADYEKVLHPMRFKAVSIVDNEMAIGSRKGREKLGRWKRTDEPLL> GI1157353828 | EMB | CA046360. 11 未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物，[葡萄(VITIS VINIFERA)]MGLCVPSGRISGGVCGLLSGRSLTWAKNLGVSTTQLRMSNNGSSIESNPKVQKLNQIIGSDSAGGWEKSWQQGHTPWDLGKPTPIIQHLHQTGTLPSGKTLVPGCGCGYDVVTIACPERFVVGLDISDSAIKKAKELSSSLWNANHFTFLKEDFFTWNPTELFDLIFDYTFFCAIEPDMRSVffAKRMRHLLKPDGELLTLMFPISDHAGGPPYKVSVADYEEVLHPMGFKAVSIVDNKMAIGPRKGREKLGRWKRTPSKSLL> GI11255541311GB | EAY99736. 1 假定蛋白質(zhì)，0SI_020969，[稻(ORYZA SATIVA) (印度產(chǎn)植物培養(yǎng)組)]MDRALPLALSVSLWWLLVGDLGGRWTLEDDGGGGGVSRFGSffYRMCGffffffVffADffIIELGASSffGNLFGLVLKRRKNEAVERDSSDGWEKSWEAAVTPWDLGKPTPIIEHLVKSGTLPKGRALGYDVVALASPERFVVGLGISSTAVEKAKQWSSSLPNADCFTFLADDFFKWKPSEQFDLIFDYTFFCALDPSLRLAWAETVSGLLKPHGELITLIYLVTEESIYSFVYFSIEDVMVLIISYCAERISYYRSVTKKEDHHSIIQSPILLRCPFRNHSYQKVLEPLGFKAILMEDNELAIKPRKAISAFRTSEQPSLAAQDVTE> GI1125546406 | GB | EAY92545. 1 假定蛋白質(zhì)，OSIjn3778,[稻(ORYZA SATIVA) (印度產(chǎn)植物培養(yǎng)組)]MASAIVDVAGGGRQQALDGSNPAVARLRQLIGGGQES SDGffSRCWEEGVTPWDLGQPTPAVVELVHSGTLPAGDATTVLVPGCGAGYDVVALSGPGRFVVGLDICDTAIQKAKQLSAAAAAAADGGDGSSSFFAFVADDFFTWEPPEPFHLIFDYTFFCALHPSMRPAWAKRMADLLRPDGELITLMYLAEGQEAGPPFNTTVLDYKEVLNPLGLVITSIEDNEVAVEPRKGMEKIARffKRMTKSD>GI|108712049|GB|ABF99844. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，表達(dá)的，[稻 (ORYZASATIVA)(日本產(chǎn)植物培養(yǎng)組)]MASAIVDVAGGGRQQALDGSNPAVARLRQLIGGGQESSDGWSRCWEEGVTPWDLGQRTPAVVELVHSGTLPAGDATTVLVPGCGAGYDVVALSGPGRFVVGLDICDTAIQKAKQLSAAAAAAADGGDGS
SSFFAFVADDFFTWEPPEPFHLIFDYTFFCALHPSMRPAWAKRMADLLRPDGELITLMYLVINRRYQHV> GI1115466488 I REFINP_001056843. 110S06G0153900,[稻(ORYZA SATIVA)(日 本產(chǎn)植物培養(yǎng)組)]
MSSSAARVGGGGGRDPSNNPAVGRLRELVQRGDAADGWEKSWEAAVTPWDLGKPTPIIEHLVKSGTLPKGRALVPGCGTGYDVVALASPERFVVGLDISSTAVEKAKQffSSSLPNADCFTFLADDFFKffKPSEQFDLIFDYTFFCALDPSLRLAWAETVSGLLKPHGELITLIYLISDQEGGPPFNNTVTDYQKVLEPLGFKAILMEDNELAIKPRKGQEKLGRffKRFVPGSSL>灰蓋鬼傘岡山株(C0PRIN0PSIS CINEREA 0ΚΑΥΑΜΑ)(假定蛋白質(zhì))
MADPNLAPEIRAKMQEIFKPDDRHSWDLLWKENITPWDA⑶AQPSLIELIEESGLDFARKGRALVPGCGTGYDAVYLASALGLQTIGMDISESAVEAANRYRDSSGVQGADRAIFQKADFFTYKVPDEERFDLIMDHTFFCAIHPSLRPEWGQRMSELIKPGGYLITICFPMIPKVETGPPYYLRPEHYDEVLKETFEKVYDKVPTKSSENHKDKERMLVWKKK> GII 71024813 | REF | XP_762636. 1 假定蛋白質(zhì)，UM06489. 1，[玉米黑粉菌 (USTILAGO MAYDIS)521]MTSSLSKDDQIQNLRRLFADSGVPNDPKAWDQAWIDSTTPWDANRPQPALVELLEGAHDADAKVPDVDGNLIPVSQAIPK ⑶ GTAWPGCGRGYDARVFAERGLTSYGVDI SSNAVAAANKWLiiDQDLPT
ELDDKVNFAEADFFTLGTSKSLVLELSKPGQATLAYDYTFLCAIPPSLRTTWAETYTRLLAKHGVLIALVFPIHGDRPGGPPFSISPQLVRELLGSQKNADGSAAWTELVELKPKGPETRPDVERMMVWRRS> GI1145230089 | REF | XP_001389353. 11 假定蛋白質(zhì)，AN01G09330，[黑曲霉 (ASPERGILLUS NIGER)]MTDQSTLTAAQQSVHNTLAKYPGEKYVDGWAEIWNANPSPPWDKGAPNPALEDTLMQRRGTIGNALATDAEGNRYRKKALVPGCGRGVDVLLLASFGYDAYGLEYSGAAVQACRQEEKESTTSAKYPVRDEE⑶FFKDDWLEELGLGLNCFDLIYDYTFFCALSPSMRPDWALRHTQLLAPSPHGNLICLEYPRHKDPSLPGPPFGLSSEAYMEHLSHPGEQVSYDAQGRCRGDPLREPSDRGLERVAYWQPARTHEVGKDANGEVQDRVSIffRRR> GI1111069917 IGB IEAT91037. 1 假定蛋白質(zhì)，SN0G_01388,[小麥葉枯病菌 (PHAEOSPHAERIA NQDORUM)SNl5]MANPNQDRLRSHFAALDPSTHASGWDSLWAEGTFIPWDRGYANPALIDLLANPSSPPTSSDANPTPGAPKPNTIDGQGVQLPAPLEGGVRRKALVPGCGKGYDVALLASWGYDTWGLEVSRHAADAAKEYLKDAGEGALEGEYKIKDAKIGKGREECVVADFFDDAffLKDVGAGEFDVIYDNTFLCALPPLLRPKffAARMAQLLARDGVLICLEFPTHKPASSGGPPWSLPPTVHQELLKRPGEDISYDEGGVVVATDRAESENALVRVAHWTPKRTHNIAVINGVVRDCVSVWRHKKQS
> GI11191953011 REF| XP_001248254. 11 假定蛋白質(zhì)，CIMG_02025,[粗球孢子菌 (COCCIDIOIDES IMMITIS)RS]MANElLRSAPNLSDRFKNLDGRNQGEVffDDLffKESRTPffDRGSHNPALEDALVEKRGFFGAPVFEDEPLRRKKALVPGCGRGVDVFLLASFGYDAYGLEYSKTAVDVCLKEMEKYGEGGKVPPRDEKVGSGKVMFLEGDFFKDDffVKEAGVEDGAFDLIYDYTFFCALNPALRPQWALRHRQLLAPSPRGNLICLEFPTTKDPAALGPPFASTPAMYMEHLSHPGEDIPYDDKGHVKSNPLQQPSDKGLERVAHWQPKRTHTVGMDDKGNVLDffVSIffRRRD> GI1145234849 | REF | XP_001390073. 1 假定蛋白質(zhì)，AN03G01710,[黑曲霉 (ASPERGILLUS NIGER)]MSEAPNPPVQGRLISHFADRRAEDQGSGWSALWDSNESVLWDR
GSPSIALVDVVEQQQDVFFPYTRDGRRKKALVPGCGRGYDPVMLALHGFDVYGLDISATGVSEATKYATSEMQSPQDVKFIAGDFFSSEffESQALQDGDKFDLIYDYTFLCALHPDLRRKffAERMSQLLHPGGLLVCLEFPMYKDTSLPGPPWGLNGVHWDLLARGGDGITNITKEEEDEDSGIQLSGQFRRAQYFRPIRSYPSGKGTDMLSIYVRR> GI|119499868|REF|XP_001266691. 1|硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶，推定的，[費希新薩托 菌(NEOSARTORYA FISCHERI)NRRL181]MSNDPRLLSSIPEFIARYKENYVEGWAELWNKSEGKPLPFDRGFPNPALEDTLIEKRDIIGGPIGRDAQGNTYRKKALVPGCGRGVDVLLLASFGYDAYGLEYSDTAVQVCKEEQAKNGDKYPVRDAEIGQGKITFVQ⑶FFKDTWLEKLQLPRNSFDLIYDYTFFCALDPSMRP
QWALRHTQLLADSPRGHLICLEFPRHKDTSLQGPPWASTSEAYMAHLNHPGEEIPYDANRQCSIDPSKAPSPQGLERVAYWQPARTHEVGlVEGEVQDRVSIffRRPN> GII 70993254 I REF| XP_751474. 11硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶，推定的，[煙曲霉 (ASPERGILLUS FUMIGATUS)AF293]MSNDPRLVSSIPEFIARYKENYVEGWAELWDKSEGKPLPFDRGFPNPALEDTLIEKRDIIGDPIGRDAQGNTYRKKALVPGCGRGVDVLLLASFGYDAYGLEYSATAVKVCKEEQAKNGDKYPVRDAEIGQGKITYVQGDFFKDTWWEKLQLPRNSFDLIYDYTFFCALDPSMRPQWALRHTQLLADSPRGHLICLEFPRHKDTSLQGPPWASTSEAYMAHLNHPGEEIPYDANRQCSIDPSKAPSPQGLERVAYWQPARTHEVGlVEGEVQDRVSIffRRPN> GI |46137187|REF|XP_390285. 11 假定蛋白質(zhì)，F(xiàn)G10109. 1，[玉蜀黍赤霉 (GIBBERELLA ZEAE)PH-1]MATENPLEDRISSVPFAEQGPKWDSCWKDALTPWDRGTASIALH
DLLAQRPDLVPPSQHQDHRGHPLRDATGAIQKKTALVPGCGRGHDVLLLSSWGYDVWGLDYSAAAKEEAIKNQKQAESEGLYMPVDGLDKGKlHWITGNFFAQDffSKGAGDDGKFDLIYDYTFLCALPPDARPKffAKRMTELLSHDGRLICLEFPSTKPMSANGPPWGVSPELYEALLAAPGEEIAYNDDGTVHEDPCSKPWADALHRLSLLKPTRTHKAGMSPEGAVMDFLSVffSR> GI1145228457 I REFI XP_001388537. 11 假定蛋白質(zhì)，AN01G00930，[黑曲霉 (ASPERGILLUS NIGER)]MTTPTDNKFKDAQAYLAKHQGD SYLKGffDLLffDKGDYLPffDRGFPNPALEDTLVERAGTIGGPIGPDGKRRKVLVPGCGRGVDVLLFASFGYDAYGLECSAAAVEACKKEEEKVNNIQYRVRDEKVGKGKITFVQ⑶FFDDAWLKEIGVPRNGFDVIYDYTFFCALNPELRPKWALRHTELLAPFPAGNLICLESPRHRDPLAPGPPFASPSEAYMEHLSHPGEEISYNDKGLVDADPLREPSKAGLERVAYWQPERTHTVGKDKNGVIQDRVSIffRRRD> GI|121708664|REF|XP_001272206. 1| 硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶，推定的，[棒曲霉 (ASPERGILLUS CLAVATUS)NRRL1]MSTPSLIPSGVHEVLAKYKDGNYVDGWAELWDKSKGDRLPWDRGFPNPALEDTLIQKRAIIGGPLGQDAQGKTYRKKALVPGCGRG
VDVLLLASFGYDAYGLEYSATAVDVCQEEQAKNGDQYPVRDAEIGQGKITFVQGDFFEDTWLEKLNLTRNCFDVIYDYTFFCALNPSMRPQWALRHTQLLADSPRGHLICLEFPRHKDPSVQGPPWGSASEAYRAHLSHPGEEIPYDASRQCQFDSSKAPSAQGLERVAYWQPERTHEVGKNEKGEVQDRVSIffQRPPQSSL> GII 67539848 | REF | XP_663698. 1 假定蛋白質(zhì)，AN6094. 2，[構(gòu)巢曲霉 (ASPERGILLUS NIDULANS)FGSC A4]MSSPSQQPIKGRLISHFENRPTPSHPKAWSDLWDSGKSSLWDRGMPSPALIDLLESYQDTLLHPFEIDIEDEEDS SDAGKTRKRKRALVPGCGRGYDVITFALHGFDACGLEVSTTAVSEARAFAKKELCSPQSGNFGRRFDRERARHIGVGKAQFLQ⑶FFTDTWIENESTGLDQG
RTENGKFDLVYDYTFLCALHPAQRTRffAERMADLLRPGGLLVCLEFPMYKDPALPGPPWGVNGIHWELLAGGDTGQGKFTRKAYVQPERTFEVGRGTDMISVYERK> GI|121529427|REF|ZP_01662039. 1|保守的假定蛋白質(zhì)，[皮氏羅爾斯頓菌 (RALSTONIA PICKETTII)12J]MAQPPVFQSRDAADPAFWDERFTREHTPWDAAGVPAAFRQFCEAQPAPLSTLIPGCGNAYEAGWLAERGWPVTAIDFAPSAVASARAVLGPHADVVQLADFFRFSPPRPVHWIYERAFLCAMPRRLWPDYAAQVAKLLPPRGLLAGFFAVVEGREAMPKGPPFETTQPELDALL
SPAFERISDMPIAETDSIPVFAGRERWQVWRRRAD> GI1175451811 REF | NP_518583. 1 假定蛋白質(zhì)，RSC0462,[茄科雷爾氏菌 (RALSTONIA SOLANACEARUM)GMI1000] MAQPPVFTTRDAAAPAFWDERFSRDHMPWDAHGVPPAFRQFCEAQPAPLSTLIPGCGSAYEAGWLAERGWPVAAIDFAPSAVASAQAVLGPHAGVVELADFFRFTPRQPVQWIYERAFLCAMPRRLWADYATQVARLLPPGGLLAGFFVVVDGRAAAPSGPPFEITAQEQEALLSPAFERIADALVPENESIPVFAGRERWQVWRRRAD> GII 83644186 I REF| YP_432621. 1 |SAM-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，[HAHELLA CHEJUENSIS KCTC 2396]MDANFWHERWAENSIAFHQCEANPLLVAHFNRLDLAKGSRVFVPLCGKTLDISWLLSQGHRVVGCELSEMAIEQFFKELGVTPAISEIVAGKRYSAENLDIIVGDFFDLTVETLGHVDATYDRAALVALPKPMRDSYAKHLMALTNNAPQLMLCYQYDQTQMEGPPFSISAEEVQH
HYADSYALTALATVGVEGGLRELNEVSETVWLLESR>鉤端螺菌屬(LEPTOSPIRILLUM SP.) II 組 UBAMPDKIFWNQRYLDKNTGWDLGQPAPPFVR LVEKGEFGPPGRVLIPGAGRSYEGIFLASRGYDVTCVDFAPQAVREAREAARQAGVKLTVVEEDFFRLDPRTIGVFD YLVEHTCFCAIDPPMRQAYVDQSHALLAPGGLLIGLFYAHGREGGPPWTTTEEEVRGLFGKKFDLLSLGLTDWSVDS RKGEELLGRLRRKNDRIE> GII 37520387 | REF | ΝΡ_923764. 1 類似于硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶，[GL0E0BACTER VIOLACEUS PCC 7421]MPSEESSGVDQPAFWEYRYRGGQDRWDLGQPAPTFVHLLSGSEAPPLGTVAVPGCGRGHDALLFAARGYKVCGFDFAADAIADATRLALRAGAAATFLQQDLFNLPRPFAGLFDLVVEHTCFCAIDPVRREEYVEIVHWLLKPGGELVAIFFAHPRPGGPPYRTDAGEIERLFSPRFKITALLPAPMSVPSRRGEELFGRFVRA> GII 861308411 REF | ZP_01049440. 11 假定蛋白質(zhì)，MED134_07976,[噬纖維菌屬 (CELLULOPHAGA SP.)MED134]MELTSTYWNNRYAEGSTGWDLKEVSPPIKAYLDQLENKELKILI
PGGGYSYEAQYCWEQGFKNVYVVDFSQLALENLKQRVPDFPSLQLIQEDFFTYDGQFDVIIEQTFFCALQPDLRPAYVAHMHTLLKAKGKLVGLLFNFPLTEKGPPYGGSTTEYESLFSEHFDIQKMETAYNSVAARAGKELFIKMVKK> GI1159875886 | GB | EDP69945. 1 假定蛋白質(zhì)，F(xiàn)BALC1_10447,[黃桿菌 (FLAVOBACTERIALES BACTERIUM)ALC-1]MISMKKNKLDSDYWEDRYTKNSTSWDIGYPSTPIRTYIDQLKDKSLKlLlPGAGNSFEAEYLffNLGFKNIYILDFAKQPLENFKKRLPDFPENQLLHIDFFKLDIHFDLILEQTFFCALNPSLREKYVEQMHQLLKPKGKLVGLFFNFPLTKSGPPFGGSLTEYQFLFDKKFKIKILETSI
NSIKEREGKELFFIFESP> GI11491998211 REF | ZP_01876851. 1 硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶 樣蛋白， [LENTISPHAERA ARANEOSA HTCC2155]MRTKGNEKAESWDKIYREGNPGWDIKKPAPPFEDLFKQNPSWLKAGSLISFGCGGGHDANFFAQNDFNVTAVDFASEAVKLARSNYPQLNVIQKNILELSPEYDEQFDYVLEHTCFCAVPLDHRRAYMESAHAILKAGAYLFGLFYRFDPPDQDGPPYSLSLEDLEDAYSGLFTLEENAIPKRSHGRRTQRERFIVLKKI> GII 71066354 | REF| YP_265081. 1 假定蛋白質(zhì)，PSYC_1799，[北極嗜冷桿菌 (PSYCHROBACTER ARCTICUS)273-4]MGNVNQAEFWQQRYEQDSIGWDMGQVSPPLKVYIDQLPEAAKEQAVLVPGAGNAYEVGYLYEQGFTNITLVDFAPAPIKDEAERYPDFPADKLICADFFDLLPKQHQFDWVLEQTFFCAINPARRDEYVQQMARLLKPKGQLVGLLFDKDFGRNEPPFGGTKEEYQQRFSTHFDTEIMEQSYNSHPARQGSELFIKMRVKD> GII 86135149 | REF | ZP_01053731. 1 假定蛋白質(zhì)，MED152_10555，[黏著桿菌屬 (TENACIBACULUM SP.)MED152]MlFDEQFffDNKYlTNKTGffDLGQVSPPLKAYFDQLTNKDLKILIPGGGNSHEAEYLLENGFTNVYVIDISKLALTNLKNRVPGFPS SNLIHQNFFELNQTFDLVIEQTFFCALNPNLREEYVSKMHSVLNDNGKLVGLLFDAKLNEDHPPFGGSKKEYTSLFRNLFTIEVLEECYNSIENRKGMELFCKFVK> GII 93006905 I REF| YP_581342. 1 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[PSYCHROBACTER CRYOHALOLENTIS K5]MENVNQAQFffQQRYEQD SlGffDMGQVSPPLKAYIDQLPEAAKNQAVLVPGAGNAYEVGYLHEQGFTNVTLVDFAPAPIAAFAERYPNFPAKHLICADFFELSPEQYQFDWVLEQTFFCAINPSRRDEYVQQMASLVKPNGKLIGLLFDKDFGRDEPPFGGTKDEYQQRFATHFDIDIMEPSYNSHPARQGSELFIEMHVKD> GI1114778202 | REF | ZP_01453074. 11硫代甲基轉(zhuǎn)移酶1_樣蛋白，[鐵氧化深海 菌(MARIPROFUNDUS FERR00XYDANS)PV-I]MTVWEERYQRGETGWDRGGVSPALTQLVDHLHLEARVLIPGCGRGHEVIELARLGFRVTAIDIAPSAIAHLSQQLEQEDLDAELVNGDLFAYAPDHCFDAVYEQTCLCAIEPEQRADYEQRLHGWLKPEGVLYALFMQTGIRGGPPFHCDLLMMRELFDASRWQWPEETGAVLVPHKNGRFELGHMLRRTGR> GII 83855599 | REF | ZP_00949128. 1 假定蛋白質(zhì)，CA2559_00890，[CR0CEIBACTER ATLANTICUS HTCC2559]MTSNFffEQRYANNNTGffDLNTVSPPLKHYI DTLSNKTLFILI
PGCGNAYEAEYLHNQGFENVFIVDLAEHPLLEFSKRVPDFPKSHILHLDFFNLTQKFDLILEQTFFCALHPEQRLHYAHHTSKLLNSNGCLVGLFFNKEFDKTGPPFGGNKKEYKNLFKNLFKIKKLENCYNSIKPRQGSELFFIFEKK> GII 83858455 | REF | ZP_00951977. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶，
MTQAS SDTPRSEDRSGFDWESRFQSDDAPWERQGVHPAAQDWVRNGEIKPGQAILTPGCGRSQEPAFLASRGFDVTATDIAPTAIAWQKTRFQTLGVMAEAIETDALAffRPETGFDALYEQTFLCAIHPKRRQDYEAMAHASLKSGGKLLALFMQKAEMGGPPYGCGLDAMRELFADTRWVWPDGEARPYPHPGLNAKAELAMVLIRR> GI1113866478 | REF | YP_724967. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)，[真氧產(chǎn)堿 桿菌(RALSTONIA EUTROPHA) Η16]MSDPAKPVPTFATRNAADPAFWDERFEQGFTPWDQGGVPEEFRQFIEGRAPCPTLVPGCGNGWEAAWLFERGWPVTAIDFSPQAVASARQTLGPAGVVVQQGDFFAFTPQPPCELIYERAFLCALPPAMRADYAARVAQLLPPGGLLAGYFYLGENRGGPPFAMPAEALDALLAPAFERLEDRPTAAPLPVFQGQERffQVffRRRSG> GI1150025500 | REF | ΥΡ_001296326. 1 假定蛋白質(zhì)，F(xiàn)P1441，[嗜冷黃桿菌 (FLAVOBACTERIUM PSYCHROPHILUM)JIP02/86]MKKIDQKYWQNRYQTNDIAWDTGKITTPIKAYIDQIEDQSIKILI
PGCGNGYEYEYLIKKGFYNSFVADYAQTPIDNLKKRIPNCNANQLLISDFFELEGSYDLIIEQTFFCALNPELRVKYAQKMLSLLSPKGKIIGLLFQFPLTEAGPPFGGSKEEYLKLFSTNFNIKTIETAYNSIKPREGNELFFIFTKK> GI1124268594 | REF | ΥΡ_001022598. 1 假定蛋白質(zhì)，MPE_A3410 [METHYLIBIUM PETROLEIPHILUM PMl]MSGPDLNFWQQRFDTGQLPWDRGAPSPQLAAWL⑶GSLAPGRIAVPGCGSGHEVVALARGGFSVTAIDYAPGAVRLTQGRLAAAGLAAEVVQADVLTWQPTAPLDAVYEQTCLCALHPDHWVAYAARLHAffLRPGGTLALLAMQALREGAGQGLIEGPPYHVDVNALRALLP⑶RWDWPRPPYARVPHPSSTWAELAIVLTRR> GII 86141349 | REF | ΖΡ_01059895. 1 假定蛋白質(zhì)，MED217_05007，[黃桿菌 (FLAVOBACTERIUM SP. )MED217]MKTDLNKLYWEDRYQNQQTGWDIGSVSTPLKEYIDQIDDKNIQILVPGAGYGHEVRYLAQQGFKNVDVIDLSVSALTQLKKALPDTTAYQLIEGDFFEHHTSYDLILEQTFFCALEPDKRPDYAAHAASLLKDSGKISGVLFNFPLTEKGPPFGGSSEEYKKLFSEYFNIKTLEACYNSIKPRLGNELFFIFEKSNQES
> GI1124003356 | REF | ZP_01688206. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)超家族， [海洋微顫菌(MICROSCILLA MARINA) ATCC23134]MHTTLDKDFffSNRYQAQDTGffDAGSITTPIKAYVDQLEDKHLKILVPGAGNSHEAEYLHQQGFTNVTVIDIVQAPLDNLKSRSPDFPEAHLLQGDFFELVGQYDLIIEQTFFCALNPSLRESYVQKVKSLLK
PEGKLVGVLFCNVFLDRTEPPFGATEQQHQEYFLPHFIAKHFASCYNSIAPRQGAEffFICLIND>GI|151577463|GB|EDN41864. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[皮氏羅爾斯頓菌 (RALSTONIA PICKETTII)12D]MAEPPVFQSRDAADPAFWDERFSREHTPWDAAGVPAAFQQFCESQPVPLSTLIPGCGSAYEAGWLAERGWPVTAIDFAPSAVASARAVLGPHADVVEMADFFGFSPARSVQWIYERAFLCAMPRRLWPDYAAQVAKLLPPGGLLAGFFAVVEGREAVPKGPPFETTQPELDALLSPAFERISDIPIAEADSIPVFAGRERffQVffRRRAD> GI1121303859 | GB | EAX44825. 1保守的假定蛋白質(zhì)，[皮氏羅爾斯頓菌 (RALSTONIA PICKETTII)12J]MAQPPVFQSRDAADPAFWDERFTREHTPWDAAGVPAAFRQFCE
AQPAPLSTLIPGCGNAYEAGWLAERGWPVTAIDFAPSAVASARAVLGPHADVVQLADFFRF SPPRPVHWIYERAFLCAMPRRLWPDYAAQVAKLLPPRGLLAGFFAVVEGREAMPKGPPFETTQPELDALLSPAFERISDMPIAETDSIPVFAGRERWQVWRRRAD> GI1121583316 | REF | YP_973752. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[噬萘極地單胞菌 (P0LAR0M0NAS NAPHTHALENIVORANS)CJ2]MAGPTTDFffQARFDNKETGffDRGAPGPQLLAffLESGALQPCRIAVPGCGSGWEVAELARRGFEVVGIDYTPAAVERTRALLAAQGLAAEVVQADVLAYQPHKPFEAIYEQTCLCALHPDHWVAYARQLQQffLKPQGSIffALFMQMVRPEATDEGLIQGPPYHCDINAMRALFPAQHWAWPRPPYAKVPHPNVGHELGLRLMLRQGR> GII 88802008 I REF| ZP_01117536. 1 假定蛋白質(zhì)，PI23P_05077，[伊氏極地桿菌 (POLARIBACTER IRGENSII)23-P]MNLSADAWDERYTNNDIAWDLGEVSSPLKAYFDQLENKEIKILIPGGGNSHEAAYLFENGFKNIWVVDLSETAIGNIQKRIPEFPPSQLIQ⑶FFNMDDVFDLIIEQTFFCAINPNLRADYTTKMHHLLKSKGKLVGVLFNVPLNTNKPPFGGDKSEYLEYFKPFFIIKKMEACYNSFGNRKGRELFVILRSK> GI1126661882 | REF | ZP_01732881. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[黃桿菌 (FLAVOBACTERIABACTERIUM)BAL38]MNYffEERYKKGETGffDAGTITTPLKEYIDQLTDKNLTILIPGAGNGHEFDYLIDNGFKNVFVVDIAITPLENIKKRKPKYSSHLINADF
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FSLTTTFDLILEQTFFCALPPEMRQRYVEKMTSLLNPNGKLAGLLFDFPLTSEGPPFGGSKSEYITLFSNTFSIKTLERAYNSIKPRENKELFFIFETK> GI1149924142 | REF | ZP_01912520. 1 假定蛋白質(zhì)，PPSIR1_29093，[太平洋近囊 菌(PLESIOCYSTIS PACIFICA)SIR-I]MRVIVPGAGVGHDALAWAQAGHEVVALDFAPAAVARLRERAAEAGLTIEAHVADVTNPGPALNDGLGGRFDLVWEQTCLCAITPELRGAYLAQARSWLTPDGSMLALLWNTGNEGGPPYDMPPELVERLMTGLFVIDKFAPVTGSNPNRREHLYWLRPEPT> GI1126647682 I REFI ZP_01720187. 11 假定蛋白質(zhì)，ALPR1_06920，[噬冷菌 (ALGORIPHAGUS SP)PRl]MAELDEKYWSERYKSGLTGWDIGFPSTPIVQYLDQIVNKDVEILIPGAGNAYEAYYAFQSGFSNVHVLDISQEPLRNFKDKFPNFPSSNL
HHGDFFEHHGSYNLILEQTFFCALNPSLRPKYVKKMSELLLKGGKLVGLLFNKEFNSPGPPFGGGIKEYQKLFHNSFEIDVMEECYNSIPARAGSEAFIRLINSKG> GII 89900214 | REF | YP_522685. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[鐵還原紅育菌 (RH0D0FERAX FERRIREDUCENS)Tl18]MAGPTTEFWQERFEKKETGWDRGSPSPQLLAWLASGALRPCRIAVPGCGSGWEVAELAQRGFDVVGLDYTAAATTRTRALCDARGLKAEVLQADVLSYQPEKKFAAIYEQTCLCAIHPDHWIDYARQLHQffLEPQGSLffVLFMQMIRPAATEEGLIQGPPYHCDINAMRALFPQKDWVWPKPPYARVSHPNL SHELALQLVRR> GI1175451811 REF | ΝΡ_518583. 1 假定蛋白質(zhì)，RSC0462,[茄科雷爾氏菌 (RALSTONIA SOLANACEARUM)GMI 1000]MAQPPVFTTRDAAAPAFWDERFSRDHMPWDAHGVPPAFRQFCEAQPAPLSTLIPGCGSAYEAGWLAERGWPVAAIDFAPSAVASAQAVLGPHAGVVELADFFRFTPRQPVQWIYERAFLCAMPRRLWADYATQVARLLPPGGLLAGFFVVVDGRAAAPSGPPFEITAQEQEALLSPAFERIADALVPENESIPVFAGRERWQVWRRRAD>GI|120436745|REF|YP_862431. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[弗塞特革蘭菌 (GRAMELLA FORSETII)KT0803]MNKDFWSLRYQKGNTGWDIGNISTPLKEYIDHLHKKELKILIPGAGNSYEAEYLFEKGFKNIffICDIAKEPIENFKKRLPEFPESQILNRDFFELKDQFDLILEQTFFCALPVNFRENYAKKVFELLKVNGKISGVLFDFPLTPDGPPFGGSKEEYLAYFSPYFKINTFERCYNSINPRQGKELFFNFSKK> GII 86159623 | REF | YP_466408. 1112型甲基轉(zhuǎn)移酶，[脫鹵厭氧粘球菌 (ANAEROMYXOBACTER DEHALOGENANS)2CP-C]
MGTSYRLAYLIGFTPWEDQPLPPELSALVEGLRARPPGRALDLGCGRGAHAVYLASHGWKVTGVDLVPAALAKARQRATDAGVDVQFLD⑶VTRLDTLGLSPGYDLLLDAGCFHGLSDPERAAYARGVTALRAPRAAMLLFAFKPGWRGPAPRGASAEDLTSAFGPSWRLVRSERARESRLPLPLRNADPRffHLLEAA> GI|118468119|REF|YP_886428. 1|12型甲基轉(zhuǎn)移酶，[恥垢分枝桿菌菌系 (MYCOBACTERIUM SMEGMATIS STR. )MC2155]MDTTPTRELFDEAYESRTAPWVIGEPQPAVVELERAGLIRSRVLDVGCGAGEHTILLTRLGYDVLGIDFSPQAIEMARENARGRGVDAR
FAV ⑶ AMALGDLiiDGAYDTILDSALFHIFDDADRQTYVASLHAGCRPGGTVHILALSDAGRGFGPEVSEEQIRKAF⑶GWDLEALETTTYRGVVGPVHAEAIGLPVGTQVDEPAWLARARRL> GI1119504877 | REF | ZP_01626954. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[海洋 Y 蛋白菌 (MARINEGAMMA PROTEOBACTERIUM)HTCC2080]MEKFGASAMEPVLDWEARYQESSVPWERTGLNPAFVAWQSffLRDHQGGTVVVPGCGRSPELQAFADMGFNVIGVDLSPSAAQFQETVLAAKGLDGKLVVSNLFDWSPDTPVDFVYEQTCLCALKPDHWRAYENLLTRffLRPGGTLLALFMQTGESGGPPFHCGKAAMEQLFSEQRWIWDETSVRSEHPLGVHELGFRLTLR> GI1161325846 | GB | EDP97172. 1 假定蛋白質(zhì)，KA0T1_18457，[KQRDIA ALGICIDA OT-1]MNSDATKEYWSQRYKDNSTGWDIGSPSTPLKTYIDQLKDRNLKILIPGAGNAYEAEYLLQQGFTNIYILDISEIPLQEFKQRNPEFPSDRLLCDDFFTHKNTYDLIIEQTFFCSFPPLPETRAQYAKHMADLLNPNGKLVGLffFDFPLTDDLEKRPFGGSKEEYLEYFKPYFDVKTFEKAYNSIAPRAGNELFGIFIKS> GI1150389542|REF|YP_001319591. 1111 型甲基轉(zhuǎn)移酶，[嗜堿菌 (ALKALIPHILUS METALLIREDIGENS)QYMF]MNDKLDQEVILNQEDLL匪LDSLLEKWDEEffffNEFYSDKGKPIPFFVNAPDENLVTYFDKYFDDIGRALDVGCGNGRNSRFIASRGYDVEGLDFSKKSIEWAKEESKKTGDIALYVNDSFFNINRELSSYDLIYDSGCLHHIKPHRRSQYLEKVHRLLKPGGYFGLVCFNLKGGANLSDHDVYKKS SMAGGLGYSDIKLKKILGTYFEIVEFREMRECADNALYGKDI CffS ILMRRLAK> GI |71024813|REF|XP_762636. 11 假定蛋白質(zhì)，UM06489. 1，[玉米黑粉菌 (USTILAGO MAYDIS)521]MTSSLSKDDQIQNLRRLFADSGVPNDPKAWDQAWIDSTTPWDANRPQPALVELLEGAHDADAKVPDVDGNLIPVSQAIPK ⑶ GTAWPGCGRGYDARVFAERGLTSYGVDI SSNAVAAANKWLiiDQDLPT
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ELDDKVNFAEADFFTLGTSKSLVLELSKPGQATLAYDYTFLCAIPPSLRTTWAETYTRLLAKHGVLIALVFPIHGDRPGGPPFSISPQLVRELLGSQKNADGSAAWTELVELKPKGPETRPDVERMMVWRRS> GII 20090980 | REF | NP_617055. 1 假定蛋白質(zhì)，MA2137，[噬乙酸甲燒八疊球菌 (METHANOSARCINA ACETIVORANS)C2A]MFWDEVYKGTPPWDIDHPQPAFQALIESGEIRPGRALDIGCGRGENAIMLAKNGCDVTGIDLAKDAI SDAKAKAIERHVKVNFIVGNVLEMDQLFTEDEFDIVIDSGLFHVITDEERLLFTRHVHKVLKEGGKYFMLCFSDKEPGEYELPRRASKAEIESTFSPLFNIIYIKDVIFDSLLNPGRRQAYLLSATKS>嗜鹽嗜鹽紅螺菌(HAL0RH0D0SPIRA HAL0PHILA)SLIMSOTPDPRRAPWEARWREGRTGWDRGGVSPTLEAWLSAGVIPGRRVLVPGAGRGYEVEALARRGYKVTAVDIAAEACQQLRDGLDAAGVEARVVQADLLAWQPDTPFDAVYEQTCLCALDPADWPAYEQRLYGWLRPGGVLLALFMQTGASGGPPFHCALPEMATLF
DSERWQWPAEPPRQWPHPSGRffEEAVRLLRR> GII 54295659 I REF| YP_128074. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[嗜肺性軍團(tuán)菌菌 系(LEGIONELLAPNEUMOPHILA STR.)LENS]MNKGQYFWNELWCEGRISFHKKEVNPDLIAYVS SLNIPAKGRVLVPLCGKSVDMLWLVRQGYHVVGIELVEKAILQFVQEHQITVRENTIGQAKQYFTDNLNLWVTDIFALNSALIEPVDAIYDRAALVALPKKLRPAYVDICLKffLKPGGSILLKTLQYNQEKVQGPPYSVSPEEIALSYQQCAKIKLLKSQKRIQEPNDHLFNFGISEVNDSVWCIRKG> GI1116187307 I REFI ZP_01477195. 1 假定蛋白質(zhì)，VEX2W_02000031，[弧菌屬 (VIBRIOSP. )EX25]MKQAPTINQQFffDNLFTQGTMPffDAKTTPQELKAYLENALHSGQSVFIPGCGAAYELSSFIQYGHDVIAMDYSEQAVKMAQSTLGK
HKDKWL ⑶ VFNADSTHSFDVIYERAFLAALPRDQWPEYFAMVDKLLPRGGLLIGYFVIDDDYHSRFPPFCLRSGELEGYLEPVFKLVESSVVANSVEVFKGRERWMVWQKSCRI> GI1120402886 I REFI YP_952715. 1111 型甲基轉(zhuǎn)移酶，[范氏分枝桿菌 (MYCOBACTERIUM VANBAALENII)PYR-I]MDLTPRLSRFDEFYKNQTPPWVIGEPQQAIVELEQAGLIGGRVLDVGCGTGEHTILLARAGYDVLGIDGAPTAVEQARRNAEAQGVDARFELADALHLGPDPTYDTIVDSALFHIFDDADRATYVRSLHAATRPGSVVHLLALSDSGRGFGPEVSEHTIRAAFGAGffEVEALTETTYRGVVIDAHTEALNLPAGTVVDEPAWSARIRRL> GI1134101246 I REFI YP_001106907. 11 6-0-甲基鳥嘌呤 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶[糖多 孢紅霉菌(SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA) NRRL 2338]
MDDELAESQRAHWQDTYSAHPGMYGEEPSAPAVHAAGVFRAAGARDVLELGAGHGRDALHFAREGFTVQALDFSSSGLQQLRDAARAQQVEQRVTTAVHDVRHPLPSADASVDAVFAHMLLCMALSTEEIHALVGEIHRVLRPGGVLVYTVRHTGDAHHGTGVAHGDDIFEHDGFAVHFFPRGLVDSLADGWTLDEVHAFEE⑶LPRRLWRVTQTLPR>腫塊伯克氏菌(BURKHOLDERIA PHYMATUM) STM815 (與鹽草(BATIS)具有 29% 的 同一性)MSDKRPSVPPSAPDFENRDPNAPGFWDERFGRGFTPWDQAGVPPAFKAFVERHSPVPVLIPGCGSAYEARWLAEKGWTVRAIDFAPNAVEAARAQLGSHASLVHEADFFTYRPPFDPGWIYERAFLCALPP
ARRSDWVARMAQLLSPGGLLAGFFFIGATEKGPPFGIERAELDALMSPDFTLVEDEPVDDSIAVFAGRERWLTWRRRGAARG> GII 91781799 | REF | YP_557005. 1 假定蛋白質(zhì)，ΒΧΕ_Α4046，[伯克氏菌 (BURKHOLDERIA XEN0V0RANS)LB400]MSDPTQPAVPDFETRDPNSPAFWDERFERRFTPWDQAGVPAAFQSFAARHSGAAVLIPGCGSAYEAVWLAGQGNPVRAIDFSPAAVAAAHEQLGAQHAQLVEQADFF TYEPPFTPAffIYERAFLCALPLARRADYAHRMADLLPGGALLAGFFFLGATPKGPPFGIERAELDALLTPYFDLIEDEAVHDSIAVFAGRERffLTffRRRA> GI1118038664 I REFI ZP_01510068. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[吩嗪伯克氏菌 (BURKHOLDERIA PHYTOFIRMANS)PSJN]MSDPTQPSAPEFESRDPNSPEFWDERFERGFMPWDQAGVPSAFE
SFAARHAGAAVLIPGCGSAYEAVWLAGHGYPVRAIDFSPAAVAAAHEQLGAQHADLVEQADFFTYELPFTPAffIYERAFLCALPLARRADYARRMADLLPGGALLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDGLLKPYFELlEDEPVHDSIAVFAGRERffLTffRRRV> GII 83719252 I REF| YP_441114. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[泰國伯 克氏菌(BURKHOLDERIA THAILANDENSIS) E264]MTSEANK⑶AAVQAA⑶AQPASPASPPSADVQPARAALAPSSVPPAPSAANFASRDP⑶ASFWDERFERGVTPWDSARVPDAFAAFAARHPRCPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRESGADAALVEQADFFAYVPPFVPQWIYERAFLCAIPTSRRADYARRVAELLPAGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLSPNFELVEDEPVADSLPVFAGRERffLAffRRS> GI1134296925 I REFI YP_001120660. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[越南伯克氏 菌(BURKHOLDERIA VIETNAMIENSIS)G4]MSNPTQPPPPSAADFATRDPANASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRRAPCTVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAEQ
AVVAAKATLGAHADVVEQADFFAYQPPFVVQWVYERAFLCALPPSLRAGYAARMAELLPAGGLLAGYFFVMKKPKGPPFGIERAELDALLAP SFELIEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GI1118707586 I REFI ZP_01560172. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[新洋蔥伯克氏 菌(BURKHOLDERIA CEN0CEPACIA)MC0_3]MSDPKQPAAPSAAEFATRDPGSASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRHEPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKVQLGAHADVVEQADFFQYRPPFDVQWVYERAFLCALPPSLRADYAARMAELLPTGGLLAGYFFVVAKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELLEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GI|53724994|REF|YP_102027. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[鼻疽伯 克氏菌(BURKHOLDERIA MALLEI) ATCC 23344]MKDRLMSQGDGVTNEANQPEAAGQAA⑶AQPASPAGPAHIANPANPANPPALPSFSPPAAASSSASSAAPFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRELGEDAGLVEQADFFTYAPPFVPQWIYERAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPHFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS> GII 76808612 | REF | YP_332262. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[類鼻疽 伯克氏菌(BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI) 1710B]MKDRLMSQGDGVTNEANQPEAAGQATGDAQPASPAGPAHIANPANPANPANPPALPSLSPPAAAPSSASSAAHFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRELGEDAGLVEQADFFTYAPPFVPQWIYERAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPHFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS> GI1107023663 I REFI YP_621990. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[新洋蔥伯克氏菌 (BURKHOLDERIA CENOCEPACIA)AU 1054]MSDPKQPAAPSAADFATRDPGSASFWDERFARGVTPWEFGGVP
DGFRVFAQRREPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFQYRPPFDVQWVYERAFLCALPPGLRAGYAARMAELLPTGGLLAGYFFVVAKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELLEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GII 84362923 | REF | ZP_00987534. 11 C0G0500 :SAM 依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，[勉強伯 克氏菌(BURKHOLDERIA D0L0SA) AU0158]MTGRSFAMSDPKQPGTPTAADFATRDP⑶ASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRLERCAVLIPGCGSAQEAGWLADAGWPVRAIDFAAQAVATAKAQLGAHADVVELADFFTYRPPFDVRWIYE
RAFLCALPPARRADYAAQMAALLPAGGLLAGYFFVTAKPKGPPFGIERAELDALLAPQFDLIDDWPVTDSLPVFEGHERWLTWRRR> GI1115352830 I REFI YP_774669. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[不明確伯克氏菌 (BURKHOLDERIA AMBIFARIA)AMMD]MSEPKQPSTPGAADFATRDP⑶ASFWDERFARGVTPWEFGGVPEGFRAFAQRLGPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFMYRPPFDVQWVYERAFLCALPPSLRAGYAARMAELLPAGALLAGYFFVTKKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELIDDLPVTDSLAVFEGHERffLTffRRR> GII 78067524 | REF | YP_370293. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[伯克氏菌 (BURKHOLDERIA SP.)383]MSDPKQPKPNAPAAADFTTRDPGNASFWNERFERGVTPWEFGGVPEGFSVFAHRLELCAVLIPGCGSAQEAGWLAEAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHAGVVEQADFFAYRPPFDVQWVYERAFLC
ALPPAMRADYAARMAELLPADGLLAGYFFLMAKPKGPPFGIERAELDALLTPHFELIEDLPVTDSLAVFEGHERffLTffRRR> GI11615237511 REF | YP_001578763. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶[多噬伯克氏菌 (BURKHOLDERIA MULTIVORANS)ATCC 17616]MSDPKHAAAPAAASFETRDP⑶ASFWDERFARGMTPWEFGGVPAGFRAFASARPPCAVLIPGCGSAREAGWLAQAGWPVRAIDFSAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFAYRPPFDVQWIYERAFLCALPPARRADYAATMAALLPAQGLLAGYFFVADKQKGPPFGITRGELDALLGAHFELlDDAPVSDSLPVFEGHERffLAffRRR> GII 84355663 | REF | ZP_00980538. 11 C0G0500 SAM-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，[新洋蔥 伯克氏菌(BURKHOLDERIA CENOCEPACIA) PC184]MLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAH
ADVVEQADFFAYRPPFDVQWVYERAFLCALPPSLRAGYAARMAELLPTGGLLAGYFFVVAKPKGPPFGIEPAELDALLAPHFALLEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GI1116187307 I REFI ZP_01477195. 1 假定蛋白質(zhì)，VEX2W_02000031，[弧菌屬 (VIBRIOSP. )EX25]MKQAPTINQQFffDNLFTQGTMPffDAKTTPQELKAYLENALHSGQSVFIPGCGAAYELSSFIQYGHDVIAMDYSEQAVKMAQSTLGKHKDKWL ⑶ VFNADSTHSFDVIYERAFLAALPRDQWPEYFAMVDKLLPRGGLLIGYFVIDDDYHSRFPPFCLRSGELEGYLEPVFKLVESSVVANSVEVFKGRERWMVWQKSCRI> GII 289010011 REF | NP_800656. 11 假定蛋白質(zhì)，VPAl 146，[副溶血弧菌(VIBRIO PARAHAEM0LYTICUS)RIMD 2210633]MKSKDSPIINEQFWDALFFNGTMPWDRSQTPNELKHYLKRIAD
KTHSVFIPGCGAAYEVSHFVDCGHDVIAMDYSAEAVNLAKSQLGQHQDKVML⑶VFNADFSREFDVIYERAFLAALPREIWGDYFAMIERLLPSNGLLVGYFVISDDYRSRFPPFCLRSGEIEQKLEANFHLIESTPVTDSVDVFKGKEQWMVWQKK> GII 91224783 | REF | ZP_01260043. 1 假定蛋白質(zhì)，V12G01_01280，[溶藻弧菌 (VIBRIOALGINOLYTICUS)12G01]MKQAPMINTQFWDDLFIRGTMPWDAQSTPQELKDYLDNSLHVGQSVFIPGCGAAYELSTFIQYGHDVIAMDYSQEAVKMAQSALGNYKDKVVL⑶VFNADFSHSFDVIYERAFLAALPRDMWSEYFSTVDKLLPSGGFLIGFFVIDDDYCSRFPPFCLRSGELASFLEPTFELVKSSVVANSVEVFKGREQWMVWQKR>細(xì)長聚球藻(SYNECHOCOCCUS ELONGATUS) PCC630IMTNAVNQAQFffEQRYQEGSDRffDLGQAAPVffRSLLAGTNAPAPGRIAVLGCGRGHDARLFAEQGFEVVGFDFAPSAIAAAQALAQGTTAQFLQRDIFALPQEFAGQFDTVLEHTCFCAIDPDRRAEYVEVVRQILKPKGCLLGLFWCHDRPSGPPYGCSLTELRDRFAQGWQEEQLESVTESVEGRRGEEYLGRffRRLD> GI11482392211 REF | YP_001224608. 11 可能的巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[聚球 藻(SYNECHOCOCCUS SP.)WH 7803]MTNVHLPQAffDARYQHGTDGffELGKAAPPLQAFLEHHPRAPQPEGTVLVPGCGRGHEAALLARLGFEVIGLDFSSEAIREARRLHGE
HPRLRWLQADLFDADALSGAGLASGSLSGVLEHTCFCAIDPSQRAHYRSTVDRLLRAEGWLLGLFFCHPRPGGPPFGSDPEQLAASWAQIGFYPLIWEPARGSVAGRSEEWLGFWRKPEQRSA> GII 87124194 | REF | ΖΡ_01080043. 1 巰基甲基轉(zhuǎn)移酶 1_ 樣蛋白，[聚球藻 (SYNECHOCOCCUS SP. )RS9917]MQLDGASSAPTLTARDffDARYRQGTDRffELGMAAPPLQAFLEQHPLAPKPTGTVLVPGCGRGHEAALLARLGFDVVGLDFSVEAIREARRLQGEHENLRffLQADLFNGAALDRAGLGAHSLSGVVEHTCFCAIDPSQRDHYRSTVDRLLEPGGWLLGVFFCHDRPGGPPYGSDAEQLAASWSQIGFTGVIffEPAQGSVAQRSDEWLGLWRKPSQADNEAIPAGSR> GI|87124194|REF|ZP_01080043. 1| 巰基甲基轉(zhuǎn)移酶 1-樣蛋白，[聚球藻 (SYNECHOCOCCUS SP. )RS9917]MQLDGASSAPTLTARDffDARYRQGTDRffELGMAAPPLQAFLEQHPLAPKPTGTVLVPGCGRGHEAALLARLGFDVVGLDFSVEAIREARRLQGEHENLRffLQADLFNGAALDRAGLGAHSLSGVVEHTCFCAIDPSQRDHYRSTVDRLLEPGGWLLGVFFCHDRPGGPPYGSDAEQLAASffSQIGF
TGVIWEPAQGSVAQRSDEWLGLWRKPSQADNEAIPAGSR>GI|111027025|REF|YP_709003. 1| 可能的 3-去甲輔酶 Q-9 3-甲基轉(zhuǎn)移酶，[紅 球菌(RH0D0C0CCUS SP.) RHAL]MVDAPRFPYPGSPPVHGPDDLYVTPPPWDIGRAQPVFVALAEGGAIRGRVLDCGCGTGEHVLLAAGLGLDATGVDLAATALRIAEQK
ARDRGLTARFLHHDARRLAELGERFDTVLDCGLFHIFDPDDRAAYVDSLRDVLVPGGRYLMLGFSDQQP⑶WGPHRLTRDEITTAFDDGWTIDSLESATLEVTLDPAGMRAWQLAATRTWPHPIERECSAPC> GI1118038664 I REFI ZP_01510068. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶[吩嗪伯克氏菌 (BURKHOLDERIA PHYTOFIRMANS)PSJN]MSDPTQPSAPEFESRDPNSPEFWDERFERGFMPWDQAGVPSAFESFAARHAGAAVLIPGCGSAYEAVWLAGHGYPVRAIDFSPAAVAAAHEQLGAQHADLVEQADFFTYELPFTPAffIYERAFLCALPLARRADYARRMADLLPGGALLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDGLLKPYFELlEDEPVHDSIAVFAGRERffLTffRRRV> GII 91685753 | GB | ABE28953. 1 保守的假定蛋白質(zhì)，[伯克氏菌(BURKHOLDERIA XEN0V0RANS)LB400]MSDPTQPAVPDFETRDPNSPAFWDERFERRFTPWDQAGVPAAFQSFAARHSGAAVLIPGCGSAYEAVWLAGQGNPVRAIDFSPAAVAAAHEQLGAQHAQLVEQADFFTYEPPFTPAWIYERAFLCALPLARRADYAHRMADLLPGGALLAGFFFLGATPKGPPFGIERAELDALLTPYFDLIEDEAVHDSIAVFAGRERffLTffRRRA>GI|118655249|GB|EAV62028. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[新洋蔥伯克氏菌 (BURKHOLDERIA CEN0CEPACIA)MC0_3]MSDPKQPAAPSAAEFATRDPGSASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRHEPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKVQLGAHADVVEQADFFQYRPPFDVQWVYERAFLCA
LPPSLRADYAARMAELLPTGGLLAGYFFVVAKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELLEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GI|134140082|GB|AB055825. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[越南伯克氏菌 (BURKHOLDERIA VIETNAMIENSIS)G4]MSNPTQPPPPSAADFATRDPANASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRRAPCTVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAEQAVVAAKATLGAHADVVEQADFFAYQPPFVVQWVYERAFLCALPPSLRAGYAARMAELLPAGGLLAGYFFVMKKPKGPPFGIERAELDALLAPSFELIEDLPVTDSLAVFDGHERWLTWRRR> GII 83653077 IGB IABC37140. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[泰國伯克 氏菌(BURKHOLDERIA THAILANDENSIS) E264]
57
MTSEANK⑶AAVQAA⑶AQPASPASPPSADVQPARAALAPSSVPPAPSAANFASRDP⑶ASFWDERFERGVTPWDSARVPDAFAAFAARHPRCPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRESGADAALVEQADFFAYVPPFVPQWIYERAFLCAIPTSRRADYARRVAELLPAGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLSPNFELVEDEPVADSLPVFAGRERffLAffRRS> GI1148029498 IGB IEDK87403. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[鼻疽伯克 氏菌(BURKHOLDERIA MALLEI) 2002721280]MKDRLMSQGDGVTNEANQPEAAGQAA⑶AQPASPAGPAHIANPANPANPPALPSFSPPAAASSSASSAAPFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRELGEDAGIVEQADFFTYAPPFVPQWIYE
RAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPHFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS>GI|116648837|GB|ABK09478. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[新洋蔥伯克氏菌 (BURKHOLDERIA CENOCEPACIA)HI2424]MSDPKQPAAPSAADFATRDPGSASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRVFAQRREPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFQYRPPFDVQWVYERAFLCALPPGLRAGYAARMAELLPTGGLLAGYFFVVAKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELLEDLPVTDSLAVFDGHERffLTffRRR> GI1124292927 IGB IABN02196. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[鼻疽伯克 氏菌(BURKHOLDERIA MALLEI) NCTC 10229]MSQGDGVTNEANQPEAAGQAA⑶AQPASPAGPAHIANPANPAN
PPALPSFSPPAAASSSASSAAPFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRELGEDAGLVEQADFFTYAPPFVPQWIYERAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPHFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS> GII 84362923 | REF | ZP_00987534. 11 C0G0500 : SAM-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，[勉強伯 克氏菌(BURKHOLDERIA D0L0SA) AU0158]MTGRSFAMSDPKQPGTPTAADFATRDP⑶ASFWDERFARGVTPWEFGGVPDGFRAFAQRLERCAVLIPGCGSAQEAGWLADAGWPVRAIDFAAQAVATAKAQLGAHADVVELADFFTYRPPFDVRWIYERAFLCALPPARRADYAAQMAALLPAGGLLAGYFFVTAKPKGPP
FGIERAELDALLAPQFDLIDDWPVTDSLPVFEGHERWLTWRRR> GI1147750562 IGB IEDK57631. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，[鼻疽伯克 氏菌(BURKHOLDERIA MALLEI) JHU]MTNEANQPEAAGQAA⑶AQPASPAGPAHIANPANPANPPALPSF
SPPAAASSSASSAAPFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWPVRAIDFSAQAVAAARRELGEDAGLVEQADFFTYAPPFVPQWIYERAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPHFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS> GI1126220666 IGB IABN84172. 11推定巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[類鼻疽伯克氏 菌(BURKHOLDERIA PSEUD0MALLEI)668]MKDRLMSQGDGVTNEANQPEAAGQAA⑶AQPASPAGPAHIAN
PANPANPANPPALPSLSPPAAAPSSASSAAHFSSRDP⑶ASFWDERFEQGVTPWDSARVPDAFAAFAARHARVPVLIPGCGSAYEARWLARAGWLVRAIDFSAQAVAAARRELGEDARLVEQADFFTYAPPFVPQWIYERAFLCAIPRSRRADYARRMAELLPPGGFLAGFFFIGATPKGPPFGIERAELDALLCPRFALVEDEPVADSLPVFAGRERWLAWRRS> GI|77968269|GB|ABB09649. 11巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[伯克氏菌 (BURKHOLDERIA SP.)383]MSDPKQPKPNAPAAADFTTRDPGNASFWNERFERGVTPWEFGGVPEGFSVFAHRLELCAVLIPGCGSAQEAGWLAEAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHAGVVEQADFFAYRPPFDVQWVYERAFLC
ALPPAMRADYAARMAELLPADGLLAGYFFLMAKPKGPPFGIERAELDALLTPHFELIEDLPVTDSLAVFEGHERffLTffRRR>GI|115282818|GB|ABI88335. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[不明確伯克氏菌 (BURKHOLDERIAAMBIFARIA)AMMD]MSEPKQPSTPGAADFATRDP⑶ASFWDERFARGVTPWEFGGVPEGFRAFAQRLGPCAVLIPGCGSAQEAGWLAQAGWPVRAIDFAAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFMYRPPFDVQWVYERAFLCALPPSLRAGYAARMAELLPAGALLAGYFFVTKKPKGPPFGIERAELDALLAPHFELIDDLPVTDSLAVFEGHERffLTffRRR> GI|118659542|GB|EAV66286. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[多噬伯克氏菌 (BURKHOLDERIA MULTIVORANS)ATCC 17616]MSDPKHAAAPAAASFETRDP⑶ASFWDERFARGMTPWEFGGVP
AGFRAFASARPPCAVLIPGCGSAREAGWLAQAGWPVRAIDFSAQAVAAAKAQLGAHADVVEQADFFAYRPPFDVQWIYERAFLCALPPARRADYAATMAALLPAQGLLAGYFFVADKQKGPPFGITRGELDALLGAHFELlDDAPVSDSLPVFEGHERffLAffRRR> GI1113866478 | REF | YP_724967. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)，[真氧產(chǎn)堿 桿菌(RALSTONIA EUTROPHA) Η16]MSDPAKPVPTFATRNAADPAFWDERFEQGFTPWDQGGVPEEFRQFIEGRAPCPTLVPGCGNGWEAAWLFERGWPVTAIDFSPQAVAS
ARQTLGPAGVWQQ ⑶ FEAFTPQPPCELIYERAFLCALPPAMRADYAARVAQLLPPGGLLAGYFYLGENRGGPPFAMPAEALDALLAPAFERLEDRPTAAPLPVFQGQERffQVffRRRSG> GI|151577463|GB_|EDN41864. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[皮氏羅爾斯頓菌 (RALSTONIA PICKETTII)12D]MAEPPVFQSRDAADPAFWDERFSREHTPWDAAGVPAAFQQFCESQPVPLSTLIPGCGSAYEAGWLAERGWPVTAIDFAPSAVASARAVLGPHADVVEMADFFGFSPARSVQWIYERAFLCAMPRRLWPDYAAQVAKLLPPGGLLAGFFAVVEGREAVPKGPPFETTQPELDALLSPAFERISDIPIAEADSIPVFAGRERffQVffRRRAD> GI|34102667|GB|AAQ59032. 1保守的假定蛋白質(zhì)，[紫色色桿菌 (CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM)ATCC 12472]MADSSRADFWEQRYREGVTPWEGGQLPPRARAFFAAQRPLRVLMPGCGSAADLPPLLAMGHDVLAVDFSEAAIELAARQWPEAAGRLLLADFFQLQMPAFDCLFERAFLCALPVGMRSQYAERVAALIAPGGALAGVFFVADTERGPPFGMQAEALRELLSPffFELEEDLALDESVAVFRNRERWMVWRRRGFDLGQVSEHESTGNCGAHRKE> GI1157353828 | EMB | CA046360. 1 未命名蛋白產(chǎn)物，[葡萄(VITIS VINIFERA)]MGLCVPSGRISGGVCGLLSGRSLTWAKNLGVSTTQLRMSNNGSSIESNPKVQKLNQIIGSDSAGGWEKSWQQGHTPWDLGKPTPIIQHLHQTGTLPSGKTLVPGCGCGYDVVTIACPERFVVGLDISDSAIKKAKELSSSLWNANHFTFLKEDFFTWNPTELFDLIFDYTFFCAIEPDMRSVffAKRMRHLLKPDGELLTLMFPISDHAGGPPYKVSVADYEEVLHPMGFKAVSIVDNKMAIGPRKGREKLGRWKRTPSKSLL> GI |46102042|GB|EAK87275. 11 假定蛋白質(zhì)，UM06489. 1，[玉米黑粉菌 (USTILAGO MAYDIS)521]MTSSLSKDDQIQNLRRLFADSGVPNDPKAWDQAWIDSTTPWDANRPQPALVELLEGAHDADAKVPDVDGNLIPVSQAIPK ⑶ GTAWPGCGRGYDARVFAERGLTSYGVDI SSNAVAAANKWLiiDQDLPTELDDKVNFAEADFFTLGTSKSLVLELSKPGQATLAYDYTFLCAIPPSLRTTWAETYTRLLAKHGVLIALVFPIHGDRPGGPPFSISPQLVRELLGSQKNADGSAAWTELVELKPKGPETRPDVERMMVWRRS> GI1134057747|EMB|CAK38144. 11 未命名蛋白產(chǎn)物，[黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)]MSEAPNPPVQGRLISHFADRRAEDQGSGWSALWDSNESVLWDRGSPSIALVDVVEQQQDVFFPYTRDGRRKKALVPGCGRGYDPVMLALHGFDVYGLDISATGVSEATKYATSEMQSPQDVKFIAGDFFSSEffESQALQDGDKFDLIYDYTFLCALHPDLRRKffAERMSQLLHPGGLLVCLEFPMYKDTSLPGPPWGLNGVHWDLLARGGDGITNIT[1023]KEEEDEDSGIQLSGQFRRAQYFRPIRSYPSGKGTDMLSIYVRR> GI |46137187|REF|XP_390285. 11 假定蛋白質(zhì)，F(xiàn)G10109. 1，[玉蜀黍赤霉 (GIBBERELLA ZEAE)PH-I]MATENPLEDRISSVPFAEQGPKWDSCWKDALTPWDRGTASIALHDLLAQRPDLVPPSQHQDHRGHPLRDATGAIQKKTALVPGCGRGHDVLLLSSWGYDVWGLDYSAAAKEEAIKNQKQAESEGLYMPVDGLDKGKlHWITGNFFAQDffSKGAGDDGKFDLIYDYTFLCALPPDARPKffAKRMTELLSHDGRLICLEFPSTKPMSANGPPWGVSPELYEALLAAPGEEIAYNDDGTVHEDPCSKPWADALHRLSLLKPTRTHKAGMSPEGAVMDFLSVffSR> GI |88184126|GB|EAQ91594. 1 假定蛋白質(zhì)，CHGG_03529，[球毛殼菌 (CHAETOMIUM GL0B0SUM)CBS 148.51]MAHPKSDPPGRLITHFANRDRQSQKAGWSELWDSDQTDLWDRGMPSPALIDFITTRRDIIGRLGGGRRRPRALVPGCGRGYDVVMLAFHGFDAIGLEVSQTAVNSARAYAEVELSDPSAYNFATEDDEKRRATCQPGTVSFVCGDFFQREWETSCFAPGDDGGFDLIYDYTFLCALLPEMRKDWAQQMRELIRPTGVLVCLEFPLYKDVTADGPPWGLQGIYWNLLAEGGNGRMDGPAATDGGRGPFSRVAYIKPSRSYEMGRGTDMLSVWAPQEPS⑶RKRPATAATPIPWCAHYLLNDTPAPFPLAYTTSIVVNRVCVRPS SQKQLAEARVAVPVAGARSYMKGR [1041 ]LARVVRLPARRSHFQKGLGGffVKLELYCALEIRPGCVAGLHLSYRAPLDMRCARNLEPAASPSELD> GI|119414856|GB|EAW24794. 1|巰基甲基轉(zhuǎn)移酶，推定的，[費希新薩托菌 (NEOSARTORYA FISCHERI)NRRL 181]MSNDPRLLSSIPEFIARYKENYVEGWAELWNKSEGKPLPFDRGFPNPALEDTLIEKRDIIGGPIGRDAQGNTYRKKALVPGCGRGVDVLLLASFGYDAYGLEYSDTAVQVCKEEQAKNGDKYPVRDAEIGQGKITFVQ⑶FFKDTWLEKLQLPRNSFDLIYDYTFFCALDPSMRPQWALRHTQLLADSPRGHLICLEFPRHKDTSLQGPPWASTSEAYMAHLNHPGEEIPYDANRQCSIDPSKAPSPQGLERVAYWQPARTHEVGlVEGEVQDRVSIffRRPN> GI |90307040|GB|EAS36671. 11 假定蛋白質(zhì)，CIMG_02025,[粗球孢子菌 (COCCIDIOIDES IMMITIS)RS]MANElLRSAPNLSDRFKNLDGRNQGEVffDDLffKESRTPffDRGSHNPALEDALVEKRGFFGAPVFEDEPLRRKKALVPGCGRGVDVFLLASFGYDAYGLEYSKTAVDVCLKEMEKYGEGGKVPPRDEKVGSGKVMFLEGDFFKDDffVKEAGVEDGAFDLIYDYTFFCALNPALRPQWALRHRQLLAPSPRGNLICLEFPTTKDPAALGPPFASTPAMYMEHLSHPGEDIPYDDKGHVKSNPLQQPSDKGLERVAHWQPKRT
61[1058]HTVGMDDKGNVLDffVSIffRRRD> GI|145018369|GB|EDK02648. 11巰基甲基轉(zhuǎn)移酶1，推定的，[稻瘟菌 (MAGNAPORTHE GRISEA)70-15]MGTPEQTNKLSNLFLDQPLSEHGKRffDGLffKEDYTPffDRAGPSMALYDVLTGRPDLVPPPTGGQKKRALVPGCGRGYDVLLLSRLGYDVWGLDYSEEATKQSIIYEKKVEQGDDGTYAELEREGVKKGKVTffLTGDFFSDEffVNKAGVQQFDLTYDYTFLCALPISARPAffARRMADLLAHEGRLVCLQWPTAKPWSGGGPPWGVLPEHYIAQLARPGEKVEYESDGKIPAQAMPKVVEQGGLRRLELVVPSRTHNSGIADGVLHDRIAVFAH> GI1111069917 IGB IEAT91037. 1 假定蛋白質(zhì)，SN0G_01388,[小麥葉枯病菌 (PHAEOSPHAERIA N0D0RUM)SNl5]MANPNQDRLRSHFAALDPSTHASGWDSLWAEGTFIPWDRGYANPALIDLLANPSSPPTSSDANPTPGAPKPNTIDGQGVQLPAPLEGGVRRKALVPGCGKGYDVALLASWGYDTWGLEVSRHAADAAKEYLKDAGEGALEGEYKIKDAKIGKGREECVVADFFDDAffLKDVGAGEFDVIYDNTFLCALPPLLRPKffAARMAQLLARDGVLICLEFPTHKPASSGGPPffSLPPTVHQELLKRPGEDISYDEGGVVVATDRAESENALVRVAHWTPKRTHNIAVINGVVRDCVSVWRHKKQS> GI|39577142|EMB|CAE80965. 1保守的假定蛋白質(zhì)，[噬菌蛭弧菌 (BDELL0VIBRI0 BACTERI0V0RUS)HD100]MAIPTNFIQIDEEGFALSREVRIQDPIVGQEILQNLKIHEGGTLLSTF⑶VPVIVEAFDEPYVAAQVNLKEDKTWEILLPYGVHYAFELESLSLDEffDRFHGYAANKIPFVMSRKAQATFFNLLEEFGDDFIEFDGKTYDIPAYWPPHKDVEKETYWSQIYQQEENPGWNLGEPAEALKDMIPRLKISRSRVLVLGCGEGHDAALFAAAGHFVTAVDISPLALERAKKLYGHLPTLTFVEADLFKLPQDFDQSFDVVFEHTCYCAINPERRQELVKVWNRVLVQGGHLMGVFFTFEKRQGPPYGGTEWELRQRLKNHYHPIFffGRffQKSIPRRQGKELFIYTKKK> GII 35211380 I DBJl BAC88759. 1 |GLL0818,[無類囊體藍(lán)藻(GL0E0BACTER VIOLACEUS)PCC7421]MPSEESSGVDQPAFWEYRYRGGQDRWDLGQPAPTFVHLLSGSEAPPLGTVAVPGCGRGHDALLFAARGYKVCGFDFAADAIADATRLALRAGAAATFLQQDLFNLPRPFAGLFDLVVEHTCFCAIDPVRREEYVEIVHWLLKPGGELVAIFFAHPRPGGPPYRTDAGEIERLF SPRFKITALLPAPMSVPSRRGEELFGRFVRA> GII 85818252 | GB | EAQ39412. 1 假定蛋白質(zhì)，MED134_07976,[東海獨島菌 (D0KD0NIA D0NGHAENSIS)MED134]MELTSTYWNNRYAEGSTGWDLKEVSPPIKAYLDQLENKELKILI[1092]PGGGYSYEAQYCWEQGFKNVYVVDFSQLALENLKQRVPDFPSLQLIQEDFFTYDGQFDVIIEQTFFCALQPDLRPAYVAHMHTLLKAKGKLVGLLFNFPLTEKGPPYGGSTTEYESLFSEHFDIQKMETAYNSVAARAGKELFIKMVKK> GI11519396911GB | EDN58518. 11 巰基嘌呤 S-甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)超家族，[弧 菌屬(VIBRIO SP. )EX25]MKQAPTINQQFffDNLFTQGTMPffDAKTTPQELKAYLENALHSGQSVFIPGCGAAYELSSFIQYGHDVIAMDYSEQAVKMAQSTLGKHKDKWL ⑶ VFNADSTHSFDVIYERAFLAALPRDQWPEYFAMVDKLLPRGGLLIGYFVIDDDYHSRFPPFCLRSGELEGYLEPVFKLVESSVVANSVEVFKGRERWMVWQKSCRI> GI1124261369|GB|ABM96363. 11 假定蛋白質(zhì)，MPE_A3410，[METHYLIBIUM PETROLEIPHILUM PMl]MSGPDLNFWQQRFDTGQLPWDRGAPSPQLAAWL⑶GSLAPGRIAVPGCGSGHEVVALARGGFSVTAIDYAPGAVRLTQGRLAAAGLAAEVVQADVLTWQPTAPLDAVYEQTCLCALHPDHWVAYAARLHAffLRPGGTLALLAMQALREGAGQGLIEGPPYHVDVNALRALLP⑶RWDWPRPPYARVPHPS STffAELAIVLTRR> GI|114551449|GB|EAU54004. 1巰基甲基轉(zhuǎn)移酶1_樣蛋白質(zhì)[鐵氧化深海菌 (MARIPROFUNDUS FERROOXYDANS)PV-I]MTVWEERYQRGETGWDRGGVSPALTQLVDHLHLEARVLIPGCGRGHEVIELARLGFRVTAIDIAPSAIAHLSQQLEQEDLDAELVNGDLFAYAPDHCFDAVYEQTCLCAIEPEQRADYEQRLHGWLKPEGVLYALFMQTGIRGGPPFHCDLLMMRELFDASRWQWPEETGAVLVPHKNGRFELGHMLRRTGR> GI|92394583|GB|ABE75858. 1巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[嗜冷桿菌 (PSYCHROBACTER CRYOHALOLENTIS)K5]MENVNQAQFWQQRYEQDSIGWDMGQVSPPLKAYIDQLPEAAKNQAVLVPGAGNAYEVGYLHEQGFTNVTLVDFAPAPIAAFAERYPNFPAKHLICADFFELSPEQYQFDWVLEQTFFCAINPSRRDEYVQQMASLVKPNGKLIGLLFDKDFGRDEPPFGGTKDEYQQRFATHFDIDIMEPSYNSHPARQGSELFIEMHVKD> GI |83849399|GB|EAP87267. 1 假定蛋白質(zhì)，CA2559_00890, [CR0CEIBACTER ATLANTICUS HTCC2559]MTSNFWEQRYANNNTGWDLNTVSPPLKHYIDTLSNKTLFILIPGCGNAYEAEYLHNQGFENVFIVDLAEHPLLEFSKRVPDFPKSHILHLDFFNLTQKFDLILEQTFFCALHPEQRLHYAHHTSKLLNSNGCLVGLFFNKEFDKTGPPFGGNKKEYKNLFKNLFKIKKLENCYNSIKPRQGSELFF IFEKK[1126]>GI|120596574|GB|ABM40010. 1|巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶，[噬萘極地單胞菌 (P0LAR0M0NAS NAPHTHALENIVORANS)CJ2]MAGPTTDFffQARFDNKETGffDRGAPGPQLLAffLESGALQPCRIAVPGCGSGWEVAELARRGFEVVGIDYTPAAVERTRALLAAQGLAAEVVQADVLAYQPHKPFEAIYEQTCLCALHPDHWVAYARQLQQffLKPQGSIffALFMQMVRPEATDEGLIQGPPYHCDINAMRALFPAQHWAWPRPPYAKVPHPNVGHELGLRLMLRQGR合成了編碼上述序列的密碼子優(yōu)化的核酸并插入至在大腸桿菌(E. coli)、釀酒酵 母(S. cerevisiae)和其它宿主細(xì)胞中有活性的表達(dá)載體。在碳源和鹵化物源存在下，在鹵 代甲烷轉(zhuǎn)移酶表達(dá)以及在產(chǎn)生鹵代甲烷的情況下培養(yǎng)細(xì)胞?？蛇x地收集鹵代甲烷并將其轉(zhuǎn) 化為非鹵化有機分子。實施例9B 鑒別新的鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶如實施例9A中所述，為了篩選在重組宿主中具有高活性的MHT，我們根據(jù)NCBI序 列數(shù)據(jù)庫合成了所有推定的MHT并在大腸桿菌(E. coli)中測定了鹵代甲烷的生產(chǎn)。我們首 先鑒別出與已知MHT具有類似性的89個基因的自相一致集(self-consistent set) (Rhew et al, 2003, "Genetic control of methyl halide production inArabidopsis，，，Curr Biol 13 1809-13 ；Attieh et al,1995,"Purificationand characterization of a novel metnyltrahsferase responsible forbiosynthesis of halomethanes and methanethiol in Brassica oleracea，，，JBiol Chem 270 :9250_7 ；Ni and Hager, 1999, "Expression of Batismaritima methyl chloride transferase in Escherichia coli，，， Proc NatlAcad Sci USA 96:3611-5)。該文庫包含高度的序列多樣性，其序列間氨基酸平均同一性為26%。 該文庫包括推定、假定和錯誤注釋的基因，以及來自未鑒定生物和環(huán)境樣本的基因。這些基 因通過計算對大腸桿菌(E. coli)和酵母表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并使用自動全基因DNA合成 進(jìn)行構(gòu)建。這是基于信息的克隆的實例，其中從數(shù)據(jù)庫檢索基因數(shù)據(jù)，化學(xué)合成這些基因并 測定功能，整個過程不接觸來源生物。通過向生長培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)柠u鹽，對三種離子(氯、溴和碘)測定了鹵代甲烷 活性。通過使用GC-MS分析頂部空間氣體，對鹵代甲烷的生產(chǎn)進(jìn)行取樣(補充信息)。我們 發(fā)現(xiàn)對每種離子的活性分布廣泛，其中51%的基因?qū)β然锉憩F(xiàn)出活性，85%的基因?qū)︿?化物表現(xiàn)出活性，而69%的基因?qū)Φ饣锉憩F(xiàn)出活性(圖10A)。具體地，在所有基因中來 自鹽草(Batis maritima)(—種喜鹽植物)的MHT對所有離子表現(xiàn)出最高的活性。幾種基 因?qū)o定離子表現(xiàn)出獨特的特異性(圖10B)，并且在生物水平上也觀察到了該現(xiàn)象(Rhew 等，2003，supra)。碘甲烷的最高產(chǎn)率比溴甲烷高約10倍，而溴甲烷的產(chǎn)率比氯甲烷高10 倍。這與這些酶所測量的 Km—致Γ(8· 5mM)、Br_(18. 5mM)和 Cl_(155mM) (Attieh et al, 1995, supra ；Ni and Hager, 1999,見前)。實施例10 鹽草(B. maritima)MHT 在釀酒酵母(Saccharomycescerevisia)中的 表汰我們將鹽草(B.mar it ima) MHT 基因轉(zhuǎn)移到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia) 中(圖11A)。代謝工程中真核宿主的一個優(yōu)勢是能夠?qū)⒒虍a(chǎn)物靶向可以提供更有利 于酶功能的環(huán)境的特定細(xì)胞區(qū)室。我們假設(shè)將鹽草(B.maritima)MHT靶向酵母液泡可
64以提高碘甲烷的產(chǎn)率大多數(shù)SAM在液泡中聚集(Farooqui etal，1983，“Studies on compartmentation of S-adenosyl-L-methionine inSaccharomyces cerevisiae and isolated rat hepatocytes, "BiochimBiophys Acta 757 342-51)
集(Wada 禾口 Anraku, 1994 "Chemiosmotic coupling of ion transport in the yeast vacuole :itsrole in acidification inside organelles", J Bioenerg Biomembr 26 631-7)。使用來自如上所討論的羧肽酶Y的十六個氨基酸N端標(biāo)記將鹽草(B.maritima) MHT靶向酵母液泡。酵母在葡萄糖或蔗糖上表現(xiàn)出高產(chǎn)率(圖IlB和11C)和正常生長速率。降葡萄 糖上碘甲烷的產(chǎn)率測量為4. 5g/L-天，比從大腸桿菌(E. coli)中獲得的高10倍，并且是最 好天然來源的約12000倍(圖11C)。除速率外，葡萄糖向碘甲烷轉(zhuǎn)化的碳轉(zhuǎn)化效率是確定 過程活力的重要參數(shù)。對于酵母，我們根據(jù)以下平衡方程確定了碘甲烷的最大理論產(chǎn)率為 0. 66 (摩爾分?jǐn)?shù))CsHi2O6 + 4r + 4H+ + 8ATP -^-MCH3I + 2C02 + 2HZ0葡萄糖中碳釋放的最大效率與葡萄糖中乙醇的最大效率相同。測量的葡萄糖向碘 甲烷轉(zhuǎn)化的碳轉(zhuǎn)化效率為2. 5%，表明通過將碳通量重新定向到SAM還有提高產(chǎn)率的空間。宿主生物對過度產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的有毒影響的響應(yīng)對集成工業(yè)過程的開發(fā)至關(guān)重 要。鹵代甲烷是已知會在ssDNA和RNA中造成細(xì)胞毒素?fù)p害甲基化劑。我們發(fā)現(xiàn) 酵母耐受高水平的碘甲烷的有害甲基化作用(>58/1，圖110)。由于該發(fā)酵是有氧的 并且碘甲烷的亨利常數(shù)較大(參見，Moore et al，1995，Chemosphere30 1183-91)，因此 可以從發(fā)酵罐的釋放氣體(off-gas，廢氣)中回收碘甲烷。缺乏DNA修復(fù)基因的突變株 (RAD50 Δ Symington et al，2002，Microbiol Mol Biol Rev 66:630-70)對碘甲燒表現(xiàn)出 提高的敏感性，從而確認(rèn)了甲基化壓力在細(xì)胞毒性中的作用。實施例11 通過靶向液泡的MHT牛產(chǎn)碘甲燒我們將來自酵母羧肽酶Y的16個氨基酸的液泡靶向標(biāo)記(KAISLQRPLGLDKDVL)融 合到鹽草(B.maritima)MCT的N-末端并在載體pCM190中表達(dá)該酶。碘甲烷產(chǎn)量的測定表 明將MCT靶向液泡造成產(chǎn)率提高50% (圖12)。我們接著在VPS33A背景中表達(dá)細(xì)胞溶質(zhì) 和液泡靶向酶，該背景不能形成功能性液泡。在VPS33D菌株中消除了產(chǎn)率的差異，表明將 MCT靶向完全形成的液泡是提高碘甲烷形成率所必須的。實施例12 材料和方法本實施例說明了在以上討論的實施例中使用的材料和方法。菌株和質(zhì)粒使用標(biāo)準(zhǔn)程序在大腸桿菌(E. coli)TOPlO細(xì)胞(Invitrogen)中進(jìn)行克隆。以下 列出了引物。通過DNA 2. O (Menlo Park, CA)在攜帶氯霉素抗性基因的pTRC99a誘導(dǎo)型表 達(dá)載體中合成了 MHT編碼區(qū)。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到DHlOB菌株中用于鹵代甲烷生產(chǎn)測定。對于 酵母表達(dá)，將鹽草佤111￡11^^111￡1)1^11編碼區(qū)克隆到載體？011190中。使用標(biāo)準(zhǔn)程序在大腸桿菌(E. coli)TOPlO細(xì)胞(Invitrogen)中進(jìn)行克隆。通過 DNA 2. O (Menlo Park, CA)合成了鹽草(B. maritima)MCT編碼區(qū)，并根據(jù)制造商的說明使用 指定的引物通過PfuUltra II(Stratagene)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)制造商的說明，使用Zymo凝膠 提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物。用限制酶Notl和Pstl在37°C對純化的表達(dá)載體(pCM190)和編碼區(qū)插入(插入序列，insert)消化過夜，并在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠純化，根據(jù)制造 商的說明使用Promega Wizard SV凝膠試劑盒進(jìn)行提取。在室溫下對載體和插入進(jìn)行定量 并用T4連接酶(Invitrogen)連接(IOfmol載體相對于30fmol插入)15分鐘，并轉(zhuǎn)化至化 學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)TOP10細(xì)胞(Invitrogen)。對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選并使用指定的引 物對質(zhì)粒測序以確認(rèn)克隆。使用標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰技術(shù)將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(S. cerevisiae)W303a背景中并 在選擇性培養(yǎng)基上鋪板(涂板，plate)。簡要地，通過用水和IOOmM醋酸鋰的Tris-EDTA緩 沖液連續(xù)清洗制備了感受態(tài)W303a細(xì)胞。將1 μ g質(zhì)粒在30°C與50 μ L感受態(tài)細(xì)胞以及作 為載體的300 μ L的PEG 4000和5 μ g煮沸的鮭魚精液一同培養(yǎng)30分鐘。然后在42°C對細(xì) 胞進(jìn)行熱休克20分鐘。細(xì)胞離心沉降并在100 μ L的水中重新懸浮，在合成完全尿嘧啶缺 陷板上鋪板。將板在30°C培養(yǎng)48小時并通過在尿嘧啶缺陷板上劃線確認(rèn)陽性轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)基和生長條件從新近劃線平板中接種攜帶MHT表達(dá)載體的細(xì)菌并生長過夜。將細(xì)胞在含有ImM IPTG和IOOmM適當(dāng)鹵化鈉鹽的培養(yǎng)基中稀釋100倍。用橡皮塞密封培養(yǎng)管并在37°C生長 3小時。將攜帶MHT表達(dá)載體的酵母在冷凍保存(15%的甘油)的尿嘧啶缺陷板上劃線并 生長48小時。將單個菌落接種到2mL合成完全尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上并在30°C生長過夜。 接著，將培養(yǎng)物接種到IOOmL新鮮的合成完全尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上并生長24小時。使細(xì) 胞離心沉降并在加入2%葡萄糖和IOOmM碘化鈉鹽的新鮮YP培養(yǎng)基中濃縮至高細(xì)胞密度 (0D50)。將IOmL該濃縮的培養(yǎng)物等分到14mL培養(yǎng)管中并用橡皮塞密封。使培養(yǎng)物在30°C 以250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩生長。氣相色譜-質(zhì)譜法氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)系統(tǒng)由6850系列II型網(wǎng)絡(luò)氣相色譜系統(tǒng)(Agilent) 和5973網(wǎng)絡(luò)質(zhì)量選擇系統(tǒng)(Agilent)組成。溫箱溫度程序化地從50°C (1分鐘)升高到 700C (10°C/分鐘)。用注射器穿過橡皮塞吸取100 μ L培養(yǎng)物頂部空間并手動進(jìn)樣到氣相 色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)。通過與可商購的碘甲烷(Sigma)比較，確認(rèn)樣品為碘甲烷，其保留時間為 1. 50分鐘而分子量為142。將碘甲烷的產(chǎn)量與YPD中可商購碘甲烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。 將標(biāo)準(zhǔn)品在加入2%葡萄糖的IOmL YP培養(yǎng)基中配制成0. Ig/L、0. 5g/L、l. Og/L和10g/L, 等分到14mL培養(yǎng)管中并用橡皮塞密封。將標(biāo)準(zhǔn)品在30°C培養(yǎng)1小時，并如上所述測量頂部 空間中的碘甲烷。用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)以將頂部空間計數(shù)與碘甲烷相關(guān)聯(lián)。碘甲烷毒性測定將單個菌落接種到加入2%葡萄糖的YP培養(yǎng)基中并生長過夜。將培養(yǎng)物稀釋至 OD600為0. 05并加入碘甲烷至指定的量。使培養(yǎng)物在30°C以250rpm的轉(zhuǎn)速下振蕩生長24小 時。以YP培養(yǎng)基作為空白，用分光光度法測量0D_值。每個數(shù)據(jù)點重復(fù)三次。RAD50A突
自—十戈Ij (Saccharomyces Genome DeletionProject, Invitrogen) 葡萄糖向碘甲烷轉(zhuǎn)化的效率將效率測量為每消耗單位克數(shù)的葡萄糖所產(chǎn)生的高能碳的克數(shù)。用氣相色譜-質(zhì) 譜法測量培養(yǎng)基頂部空間中碘甲烷的產(chǎn)量，而使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算液相中的碘甲烷部分。通 過減去鹵離子的分子量計算出高能碳(-CH3)的克數(shù)從而與其它烴類生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行比較。按 照制造商的說明通過使用己糖激酶試劑盒(Sigma)測量了在限定時間量(90分鐘)前后生長培養(yǎng)基中的葡萄糖從而計算了消耗的葡萄糖的量并使用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線進(jìn)行定量。累積碘甲烷產(chǎn)量測定通過誘導(dǎo)如上所述的培養(yǎng)，測定1小時的碘甲烷以及排出培養(yǎng)物以模擬產(chǎn)物提 取，測量了長期(>2小時)碘甲烷的產(chǎn)量。然后重新密封培養(yǎng)物并再次測量碘甲烷以確 定排放的碘甲烷的量。使培養(yǎng)物再生長1小時，然后測量并排出。在正文中，通過加和每小 時的產(chǎn)量顯示了數(shù)據(jù)。纖維素原料上的生長和碘甲烷產(chǎn)量發(fā)酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)得自ATCC(43279)。將發(fā)酵氨基 酸球菌和釀酒酵母(S. cerevisiae)細(xì)胞接種到Y(jié)P培養(yǎng)基+2 %葡萄糖(用于釀酒酵母 (S. cerevisiae))或BH培養(yǎng)基+2%葡萄糖(用于發(fā)酵氨基酸球菌)并生長過夜。將培 養(yǎng)物在含有20g/L纖維素原料作為唯一碳源的50mL YP培養(yǎng)基中稀釋到0D600 = 0. 05。 使用配備了 1HPU000W電機的可商購攪拌器粉碎玉米秸稈和白楊。將甘蔗渣分成適當(dāng)干 重，然后用熱水清洗3次以除去土壤和殘余的糖。將培養(yǎng)物在30°C以250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩 培養(yǎng)36小時。將9ml的培養(yǎng)物等份置于加入Iml IM氯化鈉的14ml管中并用橡皮塞密 封。如上所述，測定了頂部空間樣品的氣相色譜-質(zhì)譜產(chǎn)量。如下所述，對發(fā)酵氨基酸球菌 (A. fermentans)和釀酒酵母(S. cerevisiae)進(jìn)行定量。酵母和細(xì)菌定量通過在選擇性培養(yǎng)基上鋪板，定量了生長在纖維素原料上的培養(yǎng)物中的釀酒酵母 (S. cerevisiae)和發(fā)酵氨基酸球菌(A. fermentans)。用無菌水稀釋培養(yǎng)物，并將100 μ L培 養(yǎng)物鋪板到Y(jié)PD瓊脂+氨芐西林(以定量釀酒酵母(S. cerevisiae))或腦-心臟瓊脂(以 定量發(fā)酵氨基酸球菌(A. fermentans))上。將板在30°C培養(yǎng)48小時(對于YPD)或16小 時(對于BH)。對菌落手動計數(shù)，并且將來自至少4塊板的計數(shù)進(jìn)行平均。在生長于柳枝稷 和玉米秸稈上的培養(yǎng)物中，出現(xiàn)了一些未識別的背景培養(yǎng)物，但是它們表現(xiàn)出與發(fā)酵氨基 酸球菌可區(qū)分的形態(tài)。菌株大腸桿菌(E. coli) (Invitrogen TOP 10)[FmcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)801acZM151acX74recAlaral39(ara-leu)7697galU galK rpsL (StrE) endAl nupG]釀酒酵母(S.cerevisiae)W303a(MATa leu2_3，112trpl-lcanl-100ura3-lade2_l his3_ll，15)發(fā)酵氨基酸球菌(A.fermentans) (ATCC 43279)***以上給出的實施例僅是說明性的而不旨在表示本發(fā)明所有可能的實施方式、應(yīng)用 或改變的詳細(xì)列表。因此，在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的 各種改變和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管已結(jié)合具體實施方式
對本發(fā) 明進(jìn)行了說明，但是應(yīng)理解如所要求的，本發(fā)明不應(yīng)過度地限制于這些具體實施方式
。以上引用的所有參考文獻(xiàn)和出版物的公開明確地以其整體作為參考并入，并且達(dá) 到正如它們分別作為參考并入的程度一樣。
權(quán)利要求
一種方法，包括在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下，在培養(yǎng)基中混合以下物質(zhì)i)重組酵母，包含編碼S 腺苷甲硫氨酸(SAM) 依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的異源基因，ii)鹵化物，選自氯化物、溴化物和碘化物構(gòu)成的組；和iii)碳源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括將所述鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵 化有機分子混合物的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酵母來自選自由酵母屬(Saccharomyces)、畢 赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母 (Yarrowia)、木霉屬(Trichoderma)和裂殖酵母屬(Scizosacchromyces)構(gòu)成的組中的屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述酵母選自由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴其Jf德畢赤酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha) > 乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)禾口粟酒裂殖酵母(Scizosacchromyces pombe)構(gòu)成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述酵母是釀酒酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中MHT來自鹽草(Batismaritima)。
7.一種方法，包括a)在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下，在培養(yǎng)基中混合以下物質(zhì)i)包含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶(MHT)的生物， )鹵化物，選自氯化物、溴化物和碘化物構(gòu)成的組；和iii)碳源；b)將所述鹵代甲烷轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子或非鹵化有機分子混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括在步驟(a)之后并且在步驟(b)之前收集所述 鹵代甲烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物是高等植物、藻類、酵母、細(xì)菌或古細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述生物是包含編碼異源MHT的基因的重組生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述MHT是天然存在的MHT。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述MHT來自鹽草、腫塊伯克氏菌 (Burkholderia phymaturm)、細(xì)長聚球藻(Synechococcus elongatus)、憲菁(Brassica rapa)、甘藍(lán)(Brassica oleracea)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、擬南芥、鉤端螺菌 屬(Leptospirillum)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、禾§ (Oryza sativa)、 金牛販球菌(Ostreococcustauri)、芳方矣脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)、灰蓋 鬼傘(Coprinopsis cinerea)、Robiginitalea bof irmata、馬氏海洋桿狀菌(Maricaulis maris)、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)、葡萄(Vitis vinifera)或嗜鹽嗜鹽紅螺菌 (halorhodospirahalophila) 0
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述異源MHT的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動子的控制。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組生物是革蘭氏陰性細(xì)菌或古細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌(E.Coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、集胞藻(Synechtocystis)、 歐文氏菌屬(Erwinia)、來自甲基球菌科(Methylococcaceae)和甲基孢囊菌科 (methylocystaceae)的一個或多個成員；或極端嗜熱菌(Thermotoga hypogea)、嗜萘棲熱 袍菌(Thermotoganaphthophila)、地下棲熱袍菌(Thermotoga subterranean)、嗜鹽石油神 袍菌(Petrotoga halophila)、墨西哥石油神袍菌(Petrotoga mexicana)、溫禾口石油神袍菌 (Petrotoga miotherma)或運動石油神袍菌(Petrotoga mobilis)。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組生物是革蘭氏陽性細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)或梭狀芽孢桿菌(Clostridium)。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組生物是真菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述真菌是釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、或里氏木霉。
20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述生物是藻類。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述藻類是衣藻型。
22.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中對所述生物進(jìn)行基因修飾以提高通過S-腺苷 甲硫氨酸(SAM)生物合成途徑的通量。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中通過表達(dá)或過表達(dá)SAM合成酶以提高通過所述 SAM生物合成途徑的所述通量。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述SAM合成酶是大腸桿菌metK、立克次氏體 metK、釀酒酵母samlp或釀酒酵母sam2p或與大腸桿菌metK具有至少80%氨基酸同一性的 蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中通過消除或降低至少一種基因的表達(dá)和/或活 性以提高通過所述SAM生物合成途徑的所述通量。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中通過消除至少一種基因的表達(dá)以提高通過所述 SAM生物合成途徑的所述通量。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述基因參與SAM利用途徑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述基因編碼糞卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲 硫氨酸脫羧酶、胱硫醚β “合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、 L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3’，5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、或甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中通過提高通過甲硫氨酸生物合成途徑的通量以 提高通過所述SAM生物合成途徑的所述通量。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中通過表達(dá)或過表達(dá)大腸桿菌metL、metA、metB、 metC.metE和/或metH基因以提高通過所述甲硫氨酸生物合成途徑的通量。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中編碼甲硫氨酸生物合成阻遏物的基因失活。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因是大腸桿菌metJ基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中通過表達(dá)SAM轉(zhuǎn)運子蛋白以提高通量。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述SAM轉(zhuǎn)運子是Sam5p酵母線粒體基因。
35.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中通過表達(dá)提高ATP的胞內(nèi)濃度和/或可用性 的基因提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。
36.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中通過提高胞內(nèi)鹵化物的濃度提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中通過過表達(dá)鹵化物轉(zhuǎn)運子蛋白基因提高胞內(nèi)鹵 化物的濃度。
38.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中所述鹵化物以鹵鹽提供，所述鹵鹽選自氯化 鈉、溴化鈉和碘化鈉構(gòu)成的組。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述鹵化物以0.05至0. 3M的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
40.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含甲硫氨酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述鹵代甲烷是氯甲烷。
42.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述鹵代甲烷是溴甲烷。
43.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述鹵代甲烷是碘甲烷。
44.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中(c)中所述轉(zhuǎn)化是催化縮合的結(jié)果。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述催化劑是沸石催化劑。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述催化劑是溴化鋁。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述催化縮合步驟導(dǎo)致鹵化物的產(chǎn)生，所述鹵 化物再循環(huán)回到所述培養(yǎng)基中。
48.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的方法，其中產(chǎn)生包含烷烴、烯烴、醚、醛或其混合物的組 合物。
49.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在2、3、4、5或6個位點對所述生物進(jìn)行基因修 飾，其中每種所述修飾的影響分別為相對于未經(jīng)修飾的生物提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。
50.一種基因修飾的生物，包含異源S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶基 因，其中所述生物是藻類、真菌或細(xì)菌，并且其中所述生物i)經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途徑的通量；和/或 )經(jīng)過基因修飾以提高胞內(nèi)鹵化物的濃度。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，其中所述MHT是天然存在的MHT。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生物，其中所述MHT來自鹽草、腫塊伯克氏菌、細(xì)長聚球藻、 蕪菁、甘藍(lán)、擬南芥、擬南芥、鉤端螺菌屬、新型隱球酵母、稻、金牛蠣球菌、芳族脫氯單胞菌、 灰蓋鬼傘、Robiginitalea bofirmata、馬氏海洋桿狀菌、黃桿菌、葡萄或嗜鹽嗜鹽紅螺菌。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物是革蘭氏陰性細(xì)菌。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的生物，所述生物是大腸桿菌(E.Coli)。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的生物，所述生物是沙門氏菌屬、紅桿菌屬、集胞藻、歐文氏 菌屬。
56.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物是革蘭氏陽性細(xì)菌。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的生物，所述生物是枯草芽孢桿菌或梭狀芽孢桿菌。
58.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物是真菌。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的生物，所述生物是酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、克魯 維酵母屬、耶氏酵母屬、木霉屬和裂殖酵母屬。
60.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物是藻類。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的生物，其中所述藻類是衣藻型(Chlamydomonas)。
62.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途徑的通量，其中所述基因修飾是SAM合成酶的過表達(dá)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的生物，其中所述SAM合成酶是大腸桿菌metK、立克次氏體 metK、釀酒酵母samlp、或釀酒酵母sam2p。
64.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨 酸(SAM)生物合成途徑的通量，其中所述基因修飾是編碼SAM利用途徑中的蛋白質(zhì)的基因 的缺失或失活。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的生物，其中所述基因編碼糞卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲 硫氨酸脫羧酶、胱硫醚β _合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、 L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3’，5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、或甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。
66.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途徑的通量，其中所述基因修飾提高通過甲硫氨酸生物合成途徑的通量。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的生物，其中通過表達(dá)或過表達(dá)大腸桿菌metL、metA、metB、 metC, metE和/或metH基因以提高通過所述甲硫氨酸生物合成途徑的通量。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的生物，其中編碼甲硫氨酸生物合成阻遏物的基因被失活。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的生物，其中所述基因是大腸桿菌metJ基因。
70.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途徑的通量，其中通過表達(dá)SAM轉(zhuǎn)運子蛋白提高通量。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的生物，其中所述SAM轉(zhuǎn)運子是Sam5p酵母線粒體基因。
72.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高通過S-腺苷甲硫氨 酸(SAM)生物合成途徑的通量，其中通過表達(dá)提高ATP胞內(nèi)濃度和/或可用性的基因提高 通量。
73.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物經(jīng)過基因修飾以提高所述胞內(nèi)鹵化物的濃度。
74.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，其中通過過表達(dá)鹵化物轉(zhuǎn)運子蛋白基因提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。
75.根據(jù)權(quán)利要求50所述的生物，所述生物在2、3、4、5或6個位點進(jìn)行基因修飾，其中 每種所述修飾的影響分別為相對于未經(jīng)修飾的生物提高鹵代甲烷的產(chǎn)量。
76.一種重組酵母細(xì)胞，包含編碼S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶 (MHT)的異源基因。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的重組酵母細(xì)胞，其中所述MHT來自鹽草、腫塊伯克氏菌、細(xì) 長聚球藻、蕪菁、甘藍(lán)、擬南芥、擬南芥、鉤端螺菌屬、新型隱球酵母、稻、金牛蠣球菌、芳族脫 氯單胞菌、灰蓋鬼傘、Robiginitalea bofirmata、馬氏海洋桿狀菌、黃桿菌、葡萄或嗜鹽嗜 鹽紅螺菌。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的重組酵母細(xì)胞，所述重組酵母細(xì)胞選自釀酒酵母、巴斯德 畢赤酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、解脂耶氏酵母、里氏木霉和粟酒裂殖酵母構(gòu)成 的組。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的重組酵母細(xì)胞，所述重組酵母細(xì)胞是表達(dá)鹽草鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶蛋白的釀酒酵母細(xì)胞。
80.根據(jù)權(quán)利要求76-79中任一項所述的重組酵母細(xì)胞，其中所述MHT表達(dá)為融合蛋 白，所述融合蛋白包含將蛋白質(zhì)靶向所述酵母的液泡的靶肽序列。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的重組酵母細(xì)胞，其中所述靶肽序列是來自羧肽酶Y的N末 端肽結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性鹵代甲烷轉(zhuǎn)移酶的基因工程生物用于生產(chǎn)有機化合物的方法，并且所述基因工程生物可選地在影響通過SAM代謝途徑的通量或影響胞內(nèi)鹵化物水平的位點進(jìn)行修飾。在一種方法中，將所述生物、鹵化物(氯化物、溴化物和/或碘化物)和碳源在產(chǎn)生鹵代甲烷的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可以收集所述鹵代甲烷并將其轉(zhuǎn)化為非鹵化有機分子。
文檔編號C12N1/00GK101932694SQ200880125972
公開日2010年12月29日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者丹尼爾·V·桑蒂, 克里斯托弗·A·沃伊特, 特拉維斯·S·拜爾 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會;丹尼爾·V·桑蒂