專利名稱：具有預定支架的多肽文庫的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的基于共有支架的多肽變體群。這些多肽群可以用于提供新的結合 蛋白和多肽。背景本領域已經(jīng)描述了構建新的結合蛋白的不同方法(Nygren PA and Uhlen M(1997) Curr Opin Struct Biol 7 :463_469)。一種方法是產(chǎn)生組合文庫以及針對希望的性質進行 篩選或者選擇。原始Affibody 分子、這種分子的群體以及這種分子的支架已經(jīng)在WO 95/19374 中描述，該專利的教導在此援引加入本文作參考。對于一些應用，希望具有改良性質如堿穩(wěn)定性、低抗原性、結構穩(wěn)定性、化學合成 順應能力以及親水性的蛋白質、多肽或者Affibody 分子，這種分子的群體以及支架。堿穩(wěn)定性蛋白質藥物和生物工程試劑的生產(chǎn)需要一些純化步驟，以富集特定產(chǎn)物，同時除 去不希望的污染物。通過蛋白質樣親和性基質如單克隆抗體和金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA) 介導的親和性純化使得可以在一個步驟中有效純化。然而，為了成本效益，希望能適當?shù)卦?生所述親和性基質。這通常包括稱作就地清潔(cleaning-in-place，CIP)的方法，其中使 用試劑(通常是堿溶液)洗脫污染物。堿穩(wěn)定性也是用最常用的SPECT核素锝-99m標記分子成像追蹤劑所需的，以及使 得可以進行一些其它類型的化學修飾。低抗原性基于蛋白質的藥物，如治療性單克隆抗體和Affibody 分子，可能在人體內激發(fā) 不希望的免疫應答。導致免疫原性的主要因素是存在雜質、蛋白質聚集體、外源表位如新獨 特位、不同的Ig同種異型或者非自身序列。此外，交叉反應的免疫球蛋白(Ig)相互作用很 可能增加產(chǎn)生針對所述蛋白質藥物的特異性T細胞介導的記憶免疫應答的概率。為了使不 希望的與免疫系統(tǒng)的相互作用的危險最小化，需要通過藥物學蛋白質工程消除現(xiàn)有的免疫 表位。 Affibody· 分子衍生自金黃色葡萄球菌蛋白A (SpA)，其是革蘭氏陽性細菌金黃色 葡萄球菌(Staphylococcal aureus)表面上的細胞壁結合受體。更精確地，SpA由5個高 度同源結構域組成，其結合許多哺乳動物物種包括人的免疫球蛋白。每個SpA結構域以兩 種不同方式與人Ig相互作用直接結合？(^，包括化61、化62和化64(1^叫01^ JJ (1982) Adv Immunol 32 157-252)；或者結合 VH3 家族成員(Silverman GJ et al (1992) Int Rev Immunol 9:57-78)。原始Affibody 分子的共有支架與SpA的結構域B基本相同，不同 之處是G29A突變以及AlV突變，包含G29A突變是為了增加蛋白質穩(wěn)定性和消除羥胺裂 解位點，AlV突變導入在結構域之間的間隔區(qū)中(Nilsson B et al (1987)，Prot Eng 1 107-113)。SpA中參與與Fc γ和VH3相互作用的氨基酸殘基為本領域熟知，且已經(jīng)在文獻 中描述(Graille M et al (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97 :5399_5404)。通過在分子的一個表面上隨機化已知參與與Fc γ相互作用的表面殘基構建了不同Affibody 分子 的分子文庫，從而消除Fc γ親和性。結構穩(wěn)定性決定肽和蛋白質藥物成功的一個關鍵因素是蛋白質的穩(wěn)定性。顯示高結構穩(wěn)定性 的蛋白質很可能在生產(chǎn)期間以及在人體內在功能上可經(jīng)得住化學修飾和蛋白酶解。此外， 穩(wěn)定性將影響所述肽或者蛋白質藥物的活性保存期以及所述肽或者蛋白質藥物在人體內 的活性期?；瘜W合成順應能力研究人員通過傳統(tǒng)的生物方法獲得蛋白質，但是肽和小蛋白質的化學合成方法是 一種有效的互補方法，一般用于結構生物學、蛋白質工程和生物化學研究中。蛋白質的化學 合成提供了一種產(chǎn)生無生物污染物如DNA雜質和宿主細胞蛋白質的同源蛋白質的快速且 有效的方式。此外，由于化學合成可以摻入非天然氨基酸、化學修飾及導入生物化學和生物 物理探針，由此可以增加靈活性。肽和蛋白質的化學合成的成功依賴于所述分子的氨基酸 序列。某些氨基酸殘基示出低偶聯(lián)效力，意味著需要優(yōu)化合成期間的一些步驟，這是耗時方 法且無法保證成功。另外，在化學合成期間難以有效導入的氨基酸對于蛋白質產(chǎn)生更長的 蛋白質序列具有顯著的負面影響。增加的親水性對于大多數(shù)應用，希望肽和蛋白質是高度可溶的，并顯示低聚集傾向。這種蛋白質 特性在生產(chǎn)蛋白質藥物時尤為重要。蛋白質表面疏水性和低溶解性與增加的聚集傾向之間 存在明顯正相關。發(fā)明描述本發(fā)明的一個目的是提供基于新支架的多肽變體群。這些新的支架與已知的相似支架即所謂的原始支架相比具有一些優(yōu)勢。所述優(yōu)勢 也適用于使用這些新支架獲得的多肽。這些優(yōu)勢將在下文詳細論述，但是在此給出一些實 例。例如，已經(jīng)進行了廣泛研究以開發(fā)在堿性環(huán)境中示出高穩(wěn)定性的新多肽支架。堿穩(wěn)定 性的一方面是針對天冬酰胺脫酰胺的穩(wěn)定性。通過增加結構剛性或者通過置換這個殘基避 免該反應也提供了化學穩(wěn)定性，有助于例如在發(fā)酵過程或者貯存后獲得均質產(chǎn)物，在發(fā)酵 和貯存期間天冬酰胺的脫酰胺明顯導致難以分離的異質混合物。此外，通過在新支架序列中消除主要是VH3介導的剩余的免疫球蛋白親和性而獲 得改良的低抗原性(很少的IgG結合)。此外，新支架已經(jīng)以此方式被工程化，示出了高結構穩(wěn)定性，即簡單折疊的α螺 旋結構、高解鏈溫度以及消除已知靶向蛋白酶解的位點。原始Affibody 分子支架含有已經(jīng)示出降低化學合成速度和成效的一些氨基酸。 為了達到有效的、即高產(chǎn)量和高收益Affibody. 蛋白質生產(chǎn)，將一些氨基酸用具有更具有 化學合成相容性的殘基置換。為了改良親水性和溶解性，將Affibody .分子支架表面上疏水性殘基置換為更親 水的氨基酸。本發(fā)明的另一目的是提供多核苷酸群。本發(fā)明的再一目的是提供多肽群與多核苷酸群的組合。
本發(fā)明的另一目的是提供從多肽群中選擇對預定靶具有親和性的所需多肽的方 法。本發(fā)明再一目的是提供分離編碼對預定靶具有親和性的所需多肽的多核苷酸的 方法。本發(fā)明另一目的是提供鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法。本發(fā)明再一目的是提供選擇和鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法。本發(fā)明一相關目的是提供生產(chǎn)對預定靶具有親和性的所需多肽的方法。本發(fā)明的群和方法使得可以通過提供特征在于特異性結合所述預定靶的多肽而 提供(包括生產(chǎn)和評估)對預定靶具有親和性的制劑。本發(fā)明也可以提供呈現(xiàn)出很少或者無非特異性結合的結合預定靶的多肽。本發(fā)明也可以提供結合預定靶的多肽，其可用作融合多肽中組成部分。此外，本發(fā)明可提供結合預定靶的多肽，其解決了現(xiàn)有抗體試劑存在的一或多個 已知問題。此外，本發(fā)明可提供結合預定靶的多肽，其適用于治療和/或診斷性應用中。本發(fā)明也可提供結合預定靶的多肽，其可簡便地通過肽化學合成方法制成。此外，本發(fā)明可以鑒別結合預定靶的多肽，其與結合相同靶的已知試劑相比呈現(xiàn) 出改良的穩(wěn)定性。本發(fā)明也可提供結合預定靶的多肽，當其在哺乳動物體內使用時呈現(xiàn)出低抗原 性，和/或在給予哺乳動物時呈現(xiàn)出改良的生物分布狀態(tài)。這些及其它目的符合所附權利要求書要求的本發(fā)明的不同方面。第一方面，本發(fā)明提供了基于共有支架的多肽變體群，該群中每個多肽均包含如 下支架氨基酸序列EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SFQ. ID. No. 1)或者在一些情況中，更優(yōu)選如下序列AKYAKEXXXAXX EIXXLPNLTX XQXXAFIXKL XDDPSQSSEL LSEAKKLNDS Q(SEQ. ID. No. 2)在上述序列中，每個X分別相應于在該群中變化的氨基酸殘基。該群由大量這種多肽分子的變體組成。在這種情況中，大量是指包含至少IXlO4 個獨特的多肽分子，或者至少1 X IO6個或者至少1 X IO8個或者至少1 X IO10個，或者至少 1 X IO12個或者至少1 X IO14個獨特的多肽分子的群。然而，需要使用足夠大的組(group)以 提供希望大小的群。本文所述“群”也可以表示“文庫”。上文規(guī)定每個X分別相應于變化的氨基酸殘基。這意味著每個X可以是獨立于所 述序列中X表示的任何其它殘基的任何氨基酸殘基。在支架氨基酸序列中，不同的變化的 氨基酸X可以選自所有20個天然發(fā)生的氨基酸殘基，由此任何這20個天然發(fā)生的氨基酸 殘基在任何指定變體中可以存在于相應X位置。每個位置氨基酸殘基的選擇是或多或少隨 機化的。也可以將從中選擇不同的變化的氨基酸殘基的集團限制為20個天然發(fā)生的氨基 酸殘基中的19、18、17、16個或者更少氨基酸殘基。不同位置的可變性可以在1個(意味著 無隨機化)至所有20個氨基酸之間個別調節(jié)。隨機導入較小的氨基酸子集可以通過仔細 選擇導入的脫氧核糖核苷酸而獲得，例如可以導入密碼子T(A/C)C以獲得在多肽鏈中指定位置隨機導入絲氨酸或者酪氨酸。同樣，可以導入密碼子(T/C/A/G)CC，以獲得在多肽鏈中 指定位置隨機導入苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸。技術人員意識到脫氧核糖核苷酸堿 基組合的許多選擇可用于在多肽鏈中指定位置獲得不同氨基酸組合。可以在多肽鏈中指定 位置出現(xiàn)的氨基酸集合(set)也可以通過在寡核苷酸合成期間導入三核苷酸而不是每次 導入一個脫氧核糖核苷酸而確定。包含上述支架氨基酸序列的多肽是新的Affibody 分子。由此，其衍生自金黃色 葡萄球菌蛋白A(SpA)。在這種情況中，“衍生”不是指所述多肽自身以任何方式必須直接源 自SpA。該術語是指所述支架具有結構類似于一個SpA結構域的序列，其中三螺旋束蛋白質 的疏水性核心中的氨基酸是保守的。在不偏離本發(fā)明的范圍內，可以對組成本發(fā)明多肽群的多肽進行不同的修飾和/ 或添加，以使得所述多肽適合特定應用。這種修飾和添加在下文詳細描述，可包括在同一多 肽鏈中添加氨基酸，或者使標記和/或治療劑與組成該群的多肽化學綴合或者以不同方式 結合。在一些實施方案中，可優(yōu)選在C末端添加氨基酸殘基。這些添加的氨基酸殘基在多 肽的結合中可發(fā)揮作用，但是也可以有其它目的，例如在多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定化、結合或 者檢測中。這種添加的氨基酸殘基可包含為了化學結合目的而加入的氨基酸殘基。例如在 多肽鏈的第一個或者最后一個位置即N或C末端加入半胱氨酸殘基。用于化學偶聯(lián)的半胱 氨酸殘基也可以通過置換蛋白質結構域表面上的、優(yōu)選在該表面不參與靶結合的那部分上 的另一氨基酸而導入。這種添加的氨基酸殘基也可以包含“標記”以進行多肽純化或者檢 測，如六組氨酸(His6)標記，或者“myc”標記或者“FLAG”標記以與特異于該標記的抗體相 互作用。技術人員知道其它選擇。上文論述的“添加的氨基酸殘基”也可以組成具有任何希望功能的一或多個多肽 結構域，所述功能如另一結合功能、或者酶功能、或者金屬離子螯合功能、或者熒光功能，或 者這些功能的混合。第二方面，本發(fā)明提供了多核苷酸群。這個群體中的每個多核苷酸均編碼上述多 肽群的成員。第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽群與本發(fā)明的多核苷酸群的組合，其中所 述多肽群的每個成員與編碼該成員的多核苷酸通過用于基因型-表型偶聯(lián)的手段以物理 方式結合或者在空間上結合。這種以物理方式的結合或者在空間上的結合根據(jù)所用系統(tǒng)是 或多或少嚴格的。用于基因型-表型偶聯(lián)的手段可包含噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示系統(tǒng)為本領域 技術人員熟知，例如在Smith GP(1985)Science 228 :1315_1317和Barbas CF et al(1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88 :7978_7982 中描述。此外，用于基因型-表型偶聯(lián)的手段可包括細胞表面展示系統(tǒng)。細胞表面展示系 統(tǒng)可包含原核細胞，如革蘭氏染色陽性(Gram+)細胞；或者真核細胞，如酵母細胞。細胞表 面展示系統(tǒng)為本領域技術人員熟知。原核細胞系統(tǒng)例如在Francisco JA et al (1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90 :10444-10448 和 Lee SY et al (2003) Trends Biotechnol 21: 45-52 中描述。真核細胞系統(tǒng)在例如 Boder ET et al (1997) Nat Biotechnol 15:553-557 和 Gai SA et al (2007) Curr Opin Struct Biol 17 :467_473 中描述。此外，用于基因型-表型偶聯(lián)的手段可包含無細胞展示系統(tǒng)。所述無細胞展示系統(tǒng)可包含核糖體展示系統(tǒng)，或者體外區(qū)室化展示系統(tǒng)，或者順式(cis)展示系統(tǒng)，或者微珠 展示系統(tǒng)。核糖體展示系統(tǒng)為本領域技術人員熟知，在例如Mattheakis LC et al (1994) Proc Natl Acad Sci U S A91 9022-9026 和 Zahnd C et al (2007) Nat Methods 4 269-279中描述。體外區(qū)室化系統(tǒng)為本領域技術人員熟知，在例如S印ρ A et al (2002) FEBS Lett532 :455-458中描述。Cis展示系統(tǒng)為本領域技術人員熟知，在例如Odegrip R et al (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 :2806_2810中描述。微珠展示系統(tǒng)為本領域技 術人員熟知，在例如 Nord 0 et al(2003)J Biotechnol 106 :1_13 中描述。此外，用于基因型_表型偶聯(lián)的手段可包含非展示系統(tǒng)，如蛋白質_片段互補測 定(PCA)。PCA系統(tǒng)為本領域技術人員熟知，在例如Koch H et al(2006)J Mol Biol 357 427-441中描述。第四方面，本發(fā)明提供了從多肽群中選擇對預定靶具有親和性的所需多肽的方 法，包括如下步驟(a)提供如上述多肽群；(b)使所述多肽群與預定靶在一定條件下接觸，所述條件是使得靶與具有靶親和 性的至少一種所需多肽之間發(fā)生特異性相互作用的條件；以及(c)基于所述特異性相互作用，從剩余的多肽群中選擇至少一種所需多肽。根據(jù)本發(fā)明，這種方法在下文被稱作選擇方法。步驟(a)可包括提供多核苷酸群和表達所述多核苷酸群以產(chǎn)生所述多肽群的預 備步驟。產(chǎn)生多肽群的方式根據(jù)使用的展示系統(tǒng)而有所不同，這種方式的例子可見于上述 基因型-表型參考文獻中。用于本發(fā)明的選擇方法中的所述多肽群的每個成員可以通過用 于基因型-表型偶聯(lián)的手段與編碼該成員的多核苷酸以物理方式結合。用于基因型-表型 偶聯(lián)的手段可以是上文論述的方式之一。步驟(b)包括使所述多肽群與預定靶在一定條件下接觸的步驟，所述條件是使得 靶與具有所述靶親和性的至少一種所需多肽之間發(fā)生特異性相互作用?？蓱玫臈l件范圍 通過所述靶的魯棒性(robustness)、展示系統(tǒng)的魯棒性以及通過與靶相互作用的希望的性 質確定。例如分離如酸化為預定PH值的相互作用的特定方法可能是希望的。本領域技術 人員已知需要什么樣的實驗以確定合適的條件。步驟(c)包括至少一種多肽的選擇?；陬A定靶與至少一種具有靶親和性所需多 肽之間的特異性相互作用，從剩余的多肽群中選擇所需多肽的方式根據(jù)使用的展示系統(tǒng)而 有所不同，可見于上述基因型-表型參考文獻中。例如，體外展示選擇系統(tǒng)是與如噬菌體展 示系統(tǒng)和蛋白質片段區(qū)室化測定等系統(tǒng)相反的無細胞系統(tǒng)。第五方面，本發(fā)明提供了分離編碼對預定靶具有親和性的所需多肽的多核苷酸的 方法，包括如下步驟-使用本發(fā)明的選擇方法從多肽群中選擇所述所需多肽和編碼其的多核苷酸；及-分離由此分離的編碼所需多肽的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，這種方法在下文被稱作分離方法。從多肽中分離多核苷酸可以根據(jù)用于選擇的展示系統(tǒng)而不同地分離。例如，在無 細胞展示系統(tǒng)如順式展示系統(tǒng)和核糖體展示系統(tǒng)中，所述多核苷酸或者相應的mRNA通過 使用在上述基因型_表型參考文獻中所述方式從多肽中有效洗脫而回收。
多核苷酸的分離根據(jù)用于選擇的展示系統(tǒng)而可以通過不同方法進行。在大多數(shù)上 述選擇系統(tǒng)中，例如在蛋白質片段互補測定中，多核苷酸可以通過使用合適的寡核苷酸進 行特異性PCR擴增而直接分離。例外的是，如在核糖體展示系統(tǒng)中，多核苷酸可以通過使用 逆轉錄從相應的mRNA中分離。分離多核苷酸的各種方式可見于上述基因型-表型參考文 獻中。第六方面，本發(fā)明提供了鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下 步驟-使用本發(fā)明的分離方法分離編碼所述所需多肽的多核苷酸；及-對所述多核苷酸進行測序，以通過推導確定所述所需多肽的氨基酸序列。多核苷酸測序可以根據(jù)本領域技術人員熟知的標準方法進行。第七方面，本發(fā)明提供了從多肽群中選擇和鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽 的方法，包括如下步驟(a)在單獨的載體或者珠上合成所述多肽群的每個成員；(b)基于所述多肽與預定靶的相互作用選擇或者富集所述載體或者珠；以及(c)通過蛋白質保證方法鑒別所述多肽。在步驟(c)中，例如可以使用質譜分析法。根據(jù)本發(fā)明，這種方法在下文被稱作選擇和鑒別方法。第八方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下 步驟-使用本發(fā)明的選擇方法或者本發(fā)明的選擇和鑒別方法選擇和鑒別所需多肽；以 及_產(chǎn)生所述所需多肽。根據(jù)本發(fā)明，這種方法在下文被稱作本發(fā)明的產(chǎn)生方法。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，可以通過使用編碼所需多肽的多核苷酸的重組表達進行 生產(chǎn)。也可以通過使用所需多肽從頭化學合成方法進行生產(chǎn)。第九方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下 步驟(al)使用本發(fā)明的分離方法分離編碼所述所需多肽的多核苷酸；或者(a2)回譯(backtranslating)用本發(fā)明的選擇和鑒別方法鑒別的多肽；以及(b)表達由此分離的多核苷酸以產(chǎn)生所述所需多肽，其中步驟(b)在步驟(al)或者步驟(a2)之后進行。多核苷酸的表達可以在本領域技術人員已知的任何合適的表達宿主中進行，所述 表達宿主例如但不限于細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞。短語“對預定靶的結合親和性”、“與預定靶結合”等是指多肽的性質，其可以通過 確定親和性常數(shù)-即在指定抗原濃度下結合和解離的多肽量-而直接測量?？梢允褂貌?同方法鑒定分子相互作用，例如但不限于競爭分析、平衡分析和微量熱分析，以及基于表面 等離子共振相互作用的實時相互作用作用分析(例如使用Biacore，儀器)。這些方法為
本領域技術人員熟知，在例如 Neri D et al (1996) Tibtech 14 :465_470 和 Jansson M et al(1997)J BiolChem 272 :8189_8197 中描述。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過任何上述方法獲得的結合預定靶的多肽與結合相同靶的已知 多肽相比可以呈現(xiàn)出一或多種令人驚奇的優(yōu)勢，同時保留那些先前已知的多肽結合所述靶 的能力。這種優(yōu)勢非限制性地例如下文所述·結合預定靶并通過任何上述方法獲得的多肽包含更少的在多肽序列的化學合成 中可以導致如低產(chǎn)量和成功率問題的氨基酸殘基，如天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸和甲硫氨 酸?！そY合預定靶并通過任何上述方法獲得的多肽包含更少的賦予表面疏水性的氨基 酸殘基。這意味著具有低溶解性和聚集問題更少。不希望受理論的束縛，目前也認為在將 多肽給予宿主時，更高的親水性特性改變所述多肽的生物分布，從肝膽途徑(通過肝排泄) 至更希望的腎途徑(通過腎排泄)?！そY合預定靶并通過任何上述方法獲得的多肽包含更少的與多肽穩(wěn)定性問題相關 的氨基酸殘基，如甲硫氨酸、天冬酰胺以及二肽天冬酰胺-脯氨酸。甲硫氨酸易氧化，天冬 酰胺易脫酰胺，天冬酰胺_脯氨酸鍵易被酸裂解，由此導致終產(chǎn)物的非均質性。·結合預定靶并通過任何上述方法獲得的多肽缺少這樣的氨基酸殘基，即發(fā)現(xiàn) 在相似的序列中增強與含有VH3的重鏈可變結構域的免疫球蛋白相互作用的氨基酸殘基 (Silverman GJ(1992) supra)。不希望受理論的束縛，目前認為置換結合預定靶并通過任何 上述方法獲得的多肽中這種氨基酸殘基可以在將所述多肽的給予宿主時降低其抗原性。在本發(fā)明支架的優(yōu)勢中，堿穩(wěn)定性、低抗原性、結構穩(wěn)定性、改良的化學合成性質 和/或增加的親水性是最重要的。結合預定靶并通過任何上述方法獲得的多肽可用作檢測試劑、捕獲試劑、分離試 劑、體內或者體外診斷劑，獨自用作治療劑或者用作使其它治療劑和/或診斷劑靶向預定 靶的工具。體外應用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進行，如在微滴定平板中、在蛋白質 陣列中、在生物傳感器表面上、在組織切片上等。上述對組成本發(fā)明多肽群的多肽進行的修飾也可適用于通過任何上述方法獲得 的多肽。本發(fā)明的多肽可以通過任何已知方法產(chǎn)生，包括化學合成方法或者在不同的原核 或者真核宿主中表達，所述宿主包括植物和轉基因動物?，F(xiàn)在通過描述根據(jù)本發(fā)明進行的實驗詳細地舉例說明本發(fā)明。如下實施例不限制 本發(fā)明范圍。在實施例中，參考附圖所述內容。附圖簡述

圖1示出得自使用Jasco J-810分光偏振計的⑶測量的結果。對在PBS緩沖液 中0. 5mg/ml的His6_ZTNF_a :3230進行可變溫度測量。從20至80°C在221nm測量吸光度，溫度 梯度為5°C /分鐘。使用光程長度為Imm的小池。His6_ZTNF_a :323(1的解鏈溫度(Tm)從可變 溫度測量中確定。圖2示出在實施例4中描述的選擇方法的總結。在兩個不同路徑中進行選擇，一 個是高濃度靶(路徑1)，一個是低濃度靶(路徑2)。根據(jù)每個路徑和循環(huán)以及洗滌次數(shù)給 出靶濃度(在括號內)。圖3是在將His6_Z04674加熱至96°C之前(實線)和之后(虛線)的兩個⑶光 譜覆蓋圖(overlay plot)。
圖4示出多肽變體的Biacore分析結果；在固定的Dynazyme上相繼注 射 His6-Z04777 (實心方塊)、His6-Z04687 (實心三角)、His6-Z04665 (空心三角)、 His6-Z04674(黑色線)、His6-Z04781 (灰色線)和運行緩沖液(空心方塊)之后獲得的傳 感圖(sensorgram)。應答(RU表示)針對時間(s)作圖。圖 5 示出具有序列 maESEKYAKEMR NAYffEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK的多肽在氨基酸殘基18-58的合成階段的分析性HPLC洗脫圖。A) 在位置22-23、41-42、45-46和53-54使用假脯氨酸在聚苯乙烯樹脂上進行合成。B)在聚苯 乙烯樹脂上無假脯氨酸的標準肽合成。圖 6 示出具有序列 maESEKYAKEMR NAYffEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK的多肽在氨基酸殘基1_58 (A)和10-58 (B)的合成階段的分析性HPLC 洗脫圖。A)在位置22-23、41-42、45-46和53-54使用假脯氨酸在聚苯乙烯樹脂上進行合 成。B)在聚苯乙烯樹脂上無假脯氨酸的標準肽合成。圖7示出具有序列A)和B)的多肽的分析性HPLC洗脫圖，序列A) AEAKYAKEMW IAffEEIRNLP NLNGffQMTAF IAKLLDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKC (本發(fā)明的序列)，序列 B) AENKFNKEMW IAffEEIRNLP NLTGffQMTAF IASLLDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK (用以對比)。
實施例實施例1 組合的多肽文庫的構建基本如GriinwallCet al(2007)J Biotechnol 128 162-183 所述構建多肽的組 合文庫，通過PCR擴增編碼金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A-衍生的蛋 白質Z (Nilsson et al (1987), supra)的螺旋1和2的具有一些簡并密碼子的123個核苷酸 的模板寡核苷酸(5，-GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CM NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC-3，)，所述螺旋 1 和 2 具有點突變 N3A、F5Y、N6A、N23T 和 S33K。 使用分別具有如表1下劃線所示的Xho I位點和Sac I位點的引物AFFI-1364和AFFI-1365 進行PCR擴增。用Xho I和Sac I限制消化編碼所述文庫的所得基因片段。隨后，將編碼文庫的 基因片段連接在Xho I-和Sac I-限制的為噬菌體展示采用的噬菌粒載體pAY2016中，其 基本基于噬菌粒載體pAffil(Gr5nwallC et al (2007)，supra)，與蛋白質Z的41-58位 氨基酸殘基符合讀框，編碼具有點突變A42S、N43E、A46S和A54S的螺旋3。螺旋3通過退 火兩個互補寡核苷酸AFFI-1333和AFFI-1334而構建(表1)。將所得文庫載體電穿孔進大腸桿菌菌株RRlA M15 (Ruther U (1982) Nucl Acids Res 10:5765-5772)中，產(chǎn)生2. 4X IOici個成員的文庫。使用包括M13K07輔助噬菌體的標準方法從所述文庫中制備噬菌體原種(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)，通常產(chǎn)生大約IollCfuAil培養(yǎng)物的噬菌體效價。表1:寡核苷酸列表名稱序列5’-3，AFFI-1333AGCTCTGAATTACTGAGCGAAGCTAAAAAGCTAAATGATAGCC AGGCGCCGAAAGTAGACTACAFFI-1334GTAGTCTACTTTCGGCGCCTGGCTATCATTTAGCTTTTTAGCTT CGCTCAGTAATTCAGAGCTAFFI-13 64AAATAAATCTCGAGGTAGATGCCAAATACGCCAAAGAFFI-13 65TAAATAATGAGCTCTGGCTTGGGTCATC2 λ HER2結合多flt奪體的卩策菌體展示詵擇和鑒定概述生物素酰化的HER2在噬菌體展示選擇中用作靶，使用在實施例1中構建的文庫。 使用各種條件進行選擇，以使得獲得HER2高親和性分子的可能性最大化。在洗脫選擇的噬 菌體之后，在ELISA裝置中檢測相應表達的蛋白質的HER2親和性。鑒別陽性克隆并測序， 推導相應多肽及其HER2結合基序的預測氨基酸序列，獲得大量HER2結合分子序列。HER2的生物素酰化將凍干的人HER2 蛋白(R&D Systems, #1129_ER)溶解于 PBS (2. 68mMKCl, 1. 47mM KH2PO4,137mM NaCl，8. ImM Na2HPO4, pH 7.4)中，至終濃度為 10mg/ml。將 EZ-link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce，#21335)溶解于水中，至終濃度為lmg/ml，并且將5和30 倍摩爾過量加入500 μ g HER2中，總體積為0. 5ml。將該混合物在室溫(RT)保溫30分鐘。 未結合的生物素通過使用透析盒(Slide-A-Lyser，IOkDa5Pierce)用PBS透析而除去。噬菌體展示選擇共進行5次選擇循環(huán)，使用逐漸增加的嚴格條件，如降低HER2濃度以及增加洗滌 次數(shù)。進行三次最初的選擇循環(huán)，主要是確定合適的選擇方案，然后使用表2列出的選擇緩 沖液、靶濃度和固體支持物組合再進行兩次選擇循環(huán)。表2 :HER2選擇的選擇條件
樣品名稱選擇緩沖液補充物靶濃度(nM)鏈霉抗生物素蛋白珠(yg)循環(huán)4A凝膠20100B凝膠10100CBSA5100DBSA2. 5100循環(huán)5A凝膠1050B凝膠550
12CBSA150DBSA0. 550 所述選擇方法中使用的所有試管和珠(Dynabeads M_280 Streptavidin, #112. 06 ；Dynal)均在 TPBSB (5% ) (0. 05% Tween20，5%牛血清白蛋白(BSA)，0. 02%疊氮 化鈉于PBS中)或者凝膠(0. 5% )中在室溫預封閉至少30分鐘。根據(jù)表2，選擇溶液(Iml)含有生物素酰化的人HER2、噬菌體、疊氮化鈉 (0. 02% Tween 20(0. 05% )以及 BSA (3% )或者凝膠(0. )，并且在 PBS 中制備。在 循環(huán)4的3天期間以及在循環(huán)5的1天期間將噬菌體與生物素?；娜薍ER2靶在4°C保 溫，隨后在室溫攪拌保溫1小時。將選擇樣品移至封閉的鏈霉抗生物素蛋白珠，在室溫攪拌 保溫15分鐘。將該珠用Iml選擇緩沖液(即TPBSB (3% ) (0. 05% Tween20，3%牛血清白 蛋白(BSA)，0.02% 疊氮化鈉于 PBS 中)或者 GT 0. 1 (0. 1 % 凝膠，0. 1 % Tween 20 和 0.02% 疊氮化鈉于PBS中))洗滌10次，隨后用PBS洗滌10次，其中倒數(shù)第二次洗滌進行5分鐘。 將噬菌體用IOOOyl 50mM甘氨酸-HCl、ρΗ 2. 2在室溫洗脫10分鐘，隨后用補加100 μ 1 IM Tris-HCl, ρΗ 8. 0的900 μ 1 PBS立即中和；或者用1000 μ 1胰蛋白酶(2mg/ml)在室溫洗 脫30分鐘，隨后加入1000 μ 1抑肽酶(0. 4mg/ml)。在每次選擇循環(huán)后，洗脫的噬菌體(3/4 體積)用于感染50ml對數(shù)生長期大腸桿菌RRl ΔΜ15細胞(Rilther，1982，supra)。在37°C 輕輕攪拌保溫30分鐘以及劇烈攪拌保溫30分鐘，離心細胞，將沉淀以較小體積溶解并涂布 于TYE平板(15g/l瓊脂，10g/l胰化蛋白胨水(Merck), 5g/l酵母提取物，3g/l NaCl，補加 2%葡萄糖和lOOyg/ml氨芐青霉素)上，最后在37°C保溫過夜。噬菌體原種制備將來自平板的細胞重懸于TSB培養(yǎng)基(30g/l胰酶大豆肉湯)中，通過測量在 600nm的光密度確定細胞濃度，假定OD6tltl = 1相應于5X IO8個細胞/ml。將細胞接種于(與 洗脫的噬菌體相比細胞超出大約100倍)補加2%葡萄糖和100μ g/ml氨芐青霉素的100ml TSB+YE培養(yǎng)基中，在37°C生長至大約OD6tltl = 0. 5-0. 7。之后，將IOml移至新的培養(yǎng)瓶中， 用10倍過量摩爾體積的M13K07輔助噬菌體(New England Biolabs,#N0315S)感染，低速攪 拌保溫30分鐘。在2000g離心細胞10分鐘，將沉淀重懸于補加100 μ M異丙基β -D-I-硫 代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml氨芐青霉素的100ml TSB+YE 培養(yǎng)基中，在25°C以IOOrpm生長過夜。將一部分重懸的細胞在_80°C貯存作為甘油原種。將過夜培養(yǎng)物在2500g離心10分鐘，上清中的噬菌體通過加入1/4體積的沉淀 緩沖液(20% PEG/2. 5 M NaCl)沉淀，并在冰上保溫1小時。沉淀的噬菌體通過在4°C以 IOOOOg離心30分鐘沉淀，重懸于20ml PBS中，之后重復沉淀步驟。噬菌體最后重懸于Iml PBS中，通過0. 45 μ m濾膜過濾。在每輪選擇之后滴定選擇、洗滌和洗脫溶液。將噬菌體溶液在微滴定平板中在無 菌水中稀釋，在每個噬菌體稀釋液中加入100 μ 1對數(shù)生長期大腸桿菌RRl Δ Μ15細胞。在 室溫保溫20分鐘之后，將5 μ 1每個滴定液移至TYE平板，在37°C保溫過夜。計數(shù)所得菌落 并計算效價(cfu/ml)。HER2結合的ELISA分析
表達來自最后的選擇循環(huán)的克隆，并針對HER2結合活性進行篩選，使用下文實施 例4所述ELISA裝置進行(但是使用HER2作為靶蛋白質)或者如下文所述進行。通過將每 個菌落接種于補加100 μ g/ml氨芐青霉素和ImM IPTG的Iml TSB+YE培養(yǎng)基中以及在37°C 生長18-24小時，在96孔深孔平板中表達隨機挑取的菌落。在保溫后，通過將一小部分每 種培養(yǎng)物移至具有15%甘油的96孔平板中制作復制平板，在_20°C貯存。剩余的細胞通過在3000g離心10分鐘沉淀，重懸于400 μ 1 PBS-T 0. 05(補加 0. 05% Tween 20的PBS)中，在_80°C冷凍。將冷凍的樣品在水浴中解凍，將細胞在3700g 離心至少20分鐘沉淀。收集含有表達的分子的上清，用于ELISA中。將一半面積的微滴定平板孔(Costar，#3690)用在ELISA包被緩沖液(Sigma， #3041)中濃度為6 μ g/ml的50 μ 1的HSA包被過夜。將該孔用100 μ 1封閉緩沖液(2% 脫脂乳于PBS中)在室溫封閉2小時。在除去封閉緩沖液之后，在孔中加入50 μ 1制備的 蛋白質，將該平板在室溫保溫1.5小時。棄去上清，在孔中加入于PBS-T 0.05中濃度為 0. 5-10 μ g/ml的生物素?；腍ER2，保溫1. 5小時。使用在PBS-T 0. 05中1 5000稀釋 的辣根過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(HRP，Dako，#P0397)檢測結合的復合物，在室 溫保溫1小時。在孔中加入50 μ 1 ImmunoPure TMB底物(Pierce，#34021)，根據(jù)廠商指導 處理平板。在Tecan Ultra 384 ELISA讀數(shù)器(Tecan)中讀取所述孔的450nm吸光度，并 使用Magellan v. 5. 0軟件(Tecan)評估。在加入每種新試劑之前，使用PBS-T 0. 05進行 四次洗滌?；谶@個實驗的結果，如下文所述挑取克隆進行測序。ELISA陽性克隆的測序使用合適的寡核苷酸從選擇的菌落中擴增PCR片段。根據(jù)廠商指導及使用合 適的生物素酰化的寡核苷酸，使用BigDye Terminator v3. 1循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems)對擴增的片段測序。使用 Magnatrix 8000 儀器(Magnetic Biosolutions)通 過結合Dynabeads REGEN 鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁性珠純化測序反應，最后在ABI PRISM 3100 基因分析儀(Applied Biosystems)上分析。亞克隆進質粒pAY1448中將編碼選擇的HER2特異性分子的DNA亞克隆進表達載體pAY1448中，產(chǎn)生 His6-標記的單體分子，稱作 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD(His6-Z#####)，其中 Z##### 表示 起始變體分子群的經(jīng)鑒別的成員。使用Qiagen Mini試劑盒(Qiagen)，根據(jù)廠商指導從大 腸桿菌RRl ΔΜ15細胞在補加100 μ g/ml氨芐青霉素的TSB中的2ml過夜培養(yǎng)物中純化含 有插入體的質粒。使用合適的PCR引物對通過AccI-NotI PCR粘端克隆將選擇的分子的DNA亞克隆 進表達載體PAY 1448中。將表達載體pAY1448在兩個步驟中使用分別于NEB4和NEB3緩沖液(New England Biolabs)中的AccI和NotI在37 V消化4小時，并且使用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP ； Fermentas)在37°C去磷酸化1小時。裂解的質粒和片段通過使用QIAquick PCR純化試劑 盒(Qiagen)根據(jù)廠商指導進行純化。雜交PCR產(chǎn)物，并且使用T4DNA連接酶(5單位/ μ 1 ；Fermentas)在室溫將其連接 進AccI-NotI消化的去磷酸化的pAY1448中1小時。將等份的連接混合物電穿孔進大腸桿菌BL21(DE3)細胞中。將該細胞鋪板于補加50 μ g/ml卡那霉素的胰蛋白血瓊脂基礎(TBAB) 平板上，在37°C保溫過夜。如上述首先通過PCR篩選檢驗陽性克隆的插入體，然后分析正確 的序列。His6-標記的多肽的表達和純化如上述全部亞克隆進pAY1448中的選擇的分子在大腸桿菌BL21(DE3)中表達為 N-末端His6-標記融合體，并通過IMAC純化。每個分子的菌落用于接種補加50 μ g/ml卡 那霉素的5ml TSB培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37°C生長過夜。第二天，將50 μ 1每種培養(yǎng)物單獨接 種于在1升培養(yǎng)瓶中補加50 μ g/ml卡那霉素的100ml TSB+YE培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物在37°C在 IOOrpm生長至OD6tltl為0. 7-1，之后加入IPTG至終濃度為0. 5mM,將細胞在室溫在IOOrpm保 溫過夜。通過在SOOOg離心5分鐘收獲培養(yǎng)物，將沉淀貯存在冷凍器中直至進行蛋白質制 備。His6-標記的蛋白質是在變性條件下使用1. 5ml Ni-NTA Superflow柱(Qiagen) 純化的IMAC。使用PD-10柱(GE Healthcare)時緩沖液更換為PBS。使用A28tl和BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)，根據(jù)廠商指導確定蛋白質濃度。蛋 白質的純度通過考馬斯藍R染色SDS-PAGE分析。選擇的分子的人HER2親和性的生物傳感器分析根據(jù)廠商指導，使用人HER2在BiaCOre2000儀器(GE Healthcare)上進行生物傳 感器分析，所述人HER2通過胺偶聯(lián)固定在CM-5芯片(研究級別，GE Healthcare)表面上 羧化的葡聚糖層上。芯片上的表面1被激活及滅活，并且在注射期間用作參考池(cell)，將 如上述表達和純化的選擇的分子在HBS-EP (GE Healthcare)中稀釋為25nM，以25 μ 1/分鐘 的恒定流速注射10分鐘，隨后在HBS-EP中解離30分鐘。所述表面通過注射兩次25mM HCl 而再生。實施例3 原始的及本發(fā)明的支架變體的克隆、生產(chǎn)以及解鏈溫度和體外抗原性 的評估概述這個實施例描述了原始的和本發(fā)明的支架變體的克隆、產(chǎn)生和評估。據(jù)認為導入 的支架突變改良多肽分子的一些性質，如抗原性、親水性和堿穩(wěn)定性以及結構穩(wěn)定性。因 此，評估不同分子的解鏈溫度和體外抗原性，結果示出本發(fā)明的分子與原始分子相比具有 增高的解鏈溫度及展示較低的體外抗原性(較低的IgG結合力)。多肽的克隆對于原始構建體，在兩個單獨的反應(PCR1和PCR2)中通過PCR擴增DNA序列， 所述DNA序列編碼特異于腫瘤壞死因子_ α (TNF- α )、HER2、胰島素、Taq聚合酶和血小板 衍生的生長因子_受體β (PDGF-Rii)(表3)的分子。在PCRl和PCR2中分別使用引物對 AFFI-267/AFFI-1014 和 AFFI-1015/AFFI-270(表 4)，其編碼 5，末端中部分 AccI 限制位點。 為了制備質粒模板，將攜帶該質粒DNA的細菌在補加50 μ g/ml卡那霉素的TSB培養(yǎng)基中生 長過夜。通過離心沉淀細胞，使用QIApr印Spin Minipr印試劑盒(Qiagen)制備質粒。對于本發(fā)明的構建體，對編碼修飾的本發(fā)明分子的核苷酸序列進行PCR擴增 (PCR1和PCR2)，使用部分重疊的寡核苷酸作為模板(AFFI-1320-AFFI-1323，AFFI-1326和 AFFI-1327)或者使用具有原始構建體和含有相關突變(AFFI-69，AFFI-70, AFFI-1151和AFFI-1152)的寡核苷酸的載體(表4)。所述PCR反應中包含編碼5’末端部分AccI限制 位點引物對 AFFI-1328/AFFI-1331 和 AFFI-1329/AFFI-1330。根據(jù)標準PCR 方案使用 Pfu Turbo DNA 聚合酶(Stratagene，#600854-52)擴增 PCR反應，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。使用具有改變的密碼子和基于PCR的誘變技術，產(chǎn)生PDGF-R β結合Z變體。使用 In-Fusion技術(Clontech，#639607)，將獲得的PCR片段連接進裂解的表達載體中。為了產(chǎn)生所有構建體的含有上游和下游AccI粘端的DNA片段，使用磁性鏈霉抗生 物素蛋白珠分離PCRl和PCR2產(chǎn)物的正向和反向核苷酸鏈。在室溫在持續(xù)旋轉條件下保溫 30分鐘之后，將該珠用洗滌緩沖液(50mMTris-HCl pH 7. 5, IOmM MgCl2, IOmM DTT)洗滌，加 熱至95°C進行5分鐘。收集含有非生物素?；钠蔚纳锨澹訜嶂?5°C，隨后在30分鐘 期間逐步冷卻至25°C以雜交DNA鏈。隨后將編碼結合分子的DNA片段在CIP-處理的(小牛腸堿性磷酸酶)及純化 的表達載體中在室溫連接2小時或者過夜，所述表達載體預先用AccI限制酶消化。獲得 的構建體為 MGSSHHHHHHLQ- [Z#####] -VD、MGSSLQ- [Z#####] -VDC (對于 ZPDeF_Ke :2465)或者 M- [Z#####] -C (對于 ZPD(;F_M :3358)。如實施例2所述，將連接體轉化進電轉感受態(tài)大腸桿菌T0P10細胞中，以及在平板 上培養(yǎng)。如實施例2所述，對攜帶新構建的質粒的細菌菌落進行PCR篩選，檢驗插入的DNA 序列。如先前所述制備檢驗質粒。多肽的表達將用相關質粒轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)物接種于補加50 μ g/ml卡那霉素 和0. 3ml/l防沫劑(Breox FMT 30)的800ml TSB-YE培養(yǎng)基中，在37 °C生長至0D600大 約為2。然后通過加入IM IPTG至終濃度為0.5mM誘導蛋白質表達。使用多發(fā)酵罐系統(tǒng) (multifermenter system) Greta (Belach)進行培養(yǎng)。誘導后 5 小時通過在 15900 X g 離心 20分鐘收獲培養(yǎng)物。棄去上清，收集細胞沉淀并在_20°C貯存。通過使用SDS-PAGE及目測 染色的凝膠確定蛋白質表達水平。表達的多肽的純化如下所述純化具有His6標記的蛋白質將攜帶可溶的His6標記的多肽的沉淀的 細菌細胞懸浮于His GraviTrap結合緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5MNaCl,20mM咪唑和40U/ml Benzonase )中，通過超聲破壞。在澄清后，將上清加樣于預先用His GraviTrap結合緩 沖液平衡的His GraviTrap柱(GE Healthcare)中。在將該柱用10個柱體積(CV)的His GraviTrap洗滌緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl, 60mM咪唑)洗滌之后，使用3個柱體積 (CV)的His GraviTrap洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，500mM咪唑)洗脫所述多肽。如下所述純化無His6標記的蛋白質將攜帶可溶的ZPDGF_Rli :2465-Cys或者 ZPD(;F-M:3358-Cys的沉淀的細菌細胞懸浮于20mM Tris-HCl，pH 7. 1中。為了破壞細胞及釋放 胞內內容物，將該細胞懸浮液加熱至85°C進行3分鐘。通過離心及隨后過濾澄清裂解物，加 樣于充填在XK26柱(GE Healthcare)中 25ml Q Sepharose FF(GE Healthcare)中，所述柱 預先用20mM Tris-HCl，pH 7. 1平衡。在將該柱用5個CV的20mM Tris-HCl，pH 7. 1洗滌之 后，在10個CV期間用線性梯度的在20mM Tris-HCl,pH 7. 1中的0_0. 5M NaCl洗脫結合的蛋白質。流速為5ml/分鐘，檢測在280nm的信號。含有ZPDeF_Ke :2465_Cys或者ZPDeF_Ke :3358_Cys 的級分通過SDS-PAGE分析鑒別。集合相關級分，通過加入IM Tris-HCl, pH 8. 0至終濃度 為50mM將pH調節(jié)為8. 0。所述構建體C末端半胱氨酸通過加入DTT至20mM還原，隨后在 40°C保溫3分鐘。在還原后，加入乙腈(ACN)至終濃度為5%，將還原的ZPDeF_Ke:2465-CyS或 者 ZPDeF-Ke:3358-CyS 加樣于預先用 RPC A 緩沖液(0. TFA，5% CAN，95%水)平衡的 Iml Resource 15RPC柱(GE Healthcare)中。在將該柱用10個CV的RPC A緩沖液洗滌之后， 用線性梯度的0-40% RPCB緩沖液(0. 1% TFA,80% CAN，20%水)洗脫結合的蛋白質。流 速為Iml/分鐘，監(jiān)測在280nm的信號。通過SDS-PAGE分析鑒別含有純ZPDGF_Rfi :2465_Cys或 者ZPDeF_Ke:3358-CyS的級分并集合。為了凍干所述蛋白質，將所述緩沖液更換為IOmM碳酸氫銨緩沖液pH8.0或者 IOmM乙酸銨緩沖液pH 6.0，使用一次性PD-10脫鹽柱(GE Healthcare)進行。根據(jù)相關 蛋白質的等電點選擇凍干緩沖液。最后，使用Christ Alpha 2-4 LSC儀器凍干結合多肽
His6_ZTNF_a :185、His6_ZHEE2.342> His6_Z 胰島素810、His6_ZTaq:1154> ZPDGF_R0:2465_Cys、His6_ZHER2:2628、 Hi S6-Zt叫:3229、Hi s6-ZTNF_ α :3230、His6-Z胰島素:3232 和 ZPDGF_K0:3358_Cys，在 4°C 貯存直至使用(表 5)。 根據(jù)廠商(Pierce)指導，使用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)封閉游離的C-末端半胱氨酸。純化的多肽的分析通過使用NanoDrop ND-1000分光光度計測量在280nm的吸光度確定多肽溶液的 濃度。使用SDS-PAGE和LC-MS進一步分析所述蛋白質。對于SDS-PAGE分析，將大約10 μ g多肽與LDS樣品緩沖液和DTT (終濃度45mM) 混合，在70°C保溫15分鐘，加樣于NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠上。將該凝膠在Novex Mini-Cell中與MES SDS運行緩沖液一起運行，使用SeeBlue Plus2預染標準作為分子量 標記以及PageBlue 蛋白質染色溶液進行染色。為了檢驗多肽的相同性，使用裝備API-ESI和單四極質譜分析儀(single quadruple mass analyzer)的 Agilent 1100LC/MSD 系統(tǒng)進行 LC/MS 分析。在更換緩沖 液之后，將蛋白質樣品在凍干緩沖液中稀釋至終濃度為0. 5mg/ml，將10 μ 1加樣于Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore 柱(2. 1 X 150mm, 3. 5 μ m)上，流速為 0. 5ml/ 分鐘。使用線性梯度 10-70%溶液B以0. 5ml/分鐘流速洗脫蛋白質30分鐘。在30°C進行分離。監(jiān)測在280和 220nm的離子信號及吸光度。純化的蛋白質的分子量通過分析離子信號確定。解鏈溫度(Tm)的確定將凍干的多肽溶解于PBS中至終濃度為大約0. 5mg/ml，在冰上貯存。在光程長度 為Imm的小池中使用Jasco J-810分光偏振計進行⑶分析。在可變溫度測量中，測量從20 至80°C的在221nm的吸光度，溫度坡度為5°C分鐘。通過確定⑶vs溫度圖示的轉折中點 計算檢測多肽的解鏈溫度(Tm)。根據(jù)本發(fā)明修飾的多肽分子與原始分子相比具有增高的解鏈溫度(表6)。圖1示 出His6-ZTNF_a:323(1(本發(fā)明的TNF-α特異性多肽)獲得的解鏈曲線。體外抗原性ELISA (血清中IgG結合分析)進行ELISA的一般條件如下所述在96孔平板的一半?yún)^(qū)域中進行ELISA測定。除 了在使用100 μ 1進行封閉的情況中，所有保溫使用體積是50 μ 1。在4°C在(15mM Na2CO3 和35mM NaHCO3)包被緩沖液中包被過夜，所有其它保溫均在室溫進行。靈長類血清和檢測抗體的稀釋在PBS+0. 5%酪蛋白中進行。所有洗滌均使用自動ELISA Scan Washer 300進 行，其中每個孔每次用175 μ 1洗滌緩沖液(PBS-T ；在IXPBS中0. 05% Tween 20)洗滌緩 沖液洗滌4次。將ELISA 平板的孔用 2 μ g/ml 的結合蛋白 His6_ZTNF_a :185、HiS6-Zhee2:342> His6-Z胰島 素8io、Hi s6_ZTaq. 1154、ZPDGF_Eβ :2465_Cys_NEM、His6_ZHER2:2628、His6_ZTaq:3229、His6_ZTNF—α :3230、His6_Z 胰 m 3232和ZPDeF-M :3358-CyS-NEM包被。Z臓:342用作標準。在包被后，將孔用自來水洗滌兩次， 并且用PBS+0. 5%酪蛋白封閉。倒空平板，將2倍稀釋的得自獼猴(MAccaca fascicularis ； 得自 Swedish Institute for Infectious Disease Control)的靈長類動物血清集合加入 孔中。滴定系列在1/100稀釋度開始，在1/102400稀釋度結束。直接在96孔平板中進行稀 釋。在與靈長類動物血清集合保溫1小時后，洗滌平板，加入1/5000稀釋的山羊抗人Ig-HRP 抗體進行檢測。在與檢測抗體保溫50分鐘之后，洗滌平板并加入底物。將Immun0Pure TMB 試劑盒中兩種成分等體積混合，每孔加入50μ 1。隨后，將平板在黑暗中保溫12分鐘，通過 加入50 μ 1終止溶液(2Μ H2SO4)終止反應。使用ELISA讀數(shù)器記錄在450nm的吸光度。作 為陰性對照，使用PBS+0. 5%酪蛋白代替靈長類動物血清集合。為了評估結果以及獲得代表靈長類動物結合所述多肽的Ig分子水平的IVA值，使 用GraphPad Prism 5程序。減去背景OD值的樣品值被加到基于XY-非線性回歸(S型劑量 效應)公式的模板。OD 0.3的稀釋值得自該公式，IVA值通過設定標準稀釋值為100以及 通過關聯(lián)所有樣品為100而計算。低于100的值表示檢測的多肽與用作陽性對照的Zims2l342 分子相比結合結合免疫球蛋白的能力降低。本發(fā)明的分子與原始分子相比示出與免疫球蛋白結合力更低(表7)。結果以體外 抗原性(IVA)值示出，IVA值降低則認為體外抗原性(IgG結合力)降低。表3 結合多肽序列列表
權利要求
基于共有支架的多肽變體群，該群中每個多肽均包含如下支架氨基酸序列EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.1)其中每個X分別相應于在該群中變化的氨基酸殘基。
2.基于共有支架的多肽變體群，該群中每個多肽均包含如下支架氨基酸序列 AKYAKEXXXAXX EIXXLPNLTX XQXXAFIXKL XDDPSQSSELLSEAKKLNDS Q(SEQ. ID. No. 2) 其中每個X分別相應于在該群中變化的氨基酸殘基。
3.權利要求1或2的群，其包含至少IXIO4個獨特的多肽分子。
4.權利要求3的群，其包含至少IXIO6個獨特的多肽分子。
5.權利要求4的群，其包含至少IXIO8個獨特的多肽分子。
6 權利要求5的群，其包含至少IXIOki個獨特的多肽分子。
7 權利要求6的群，其包含至少IXlO12個獨特的多肽分子。
8.權利要求7的群，其包含至少IXIO14個獨特的多肽分子。
9.多核苷酸群，特征在于其每個成員均編碼權利要求1-8任一項的多肽群的成員。
10.權利要求1-8任一項的多肽群與權利要求9的多核苷酸群的組合，其中所述多肽群 的每個成員與編碼該成員的多核苷酸通過用于基因型-表型偶聯(lián)的手段以物理方式結合 或者在空間上結合。
11.權利要求10的組合，其中所述用于基因型-表型偶聯(lián)的手段包含噬菌體展示系統(tǒng)。
12.權利要求10的組合，其中所述用于基因型-表型偶聯(lián)的手段包含細胞表面選擇展 示系統(tǒng)。
13.權利要求12的組合，其中所述細胞表面展示系統(tǒng)包含原核細胞。
14.權利要求13的組合，其中所述原核細胞是革蘭氏陽性細胞。
15.權利要求12的組合，其中所述細胞表面展示系統(tǒng)包含真核細胞。
16.權利要求15的組合，其中所述真核細胞是酵母細胞。
17.權利要求10的組合，其中所述用于基因型-表型偶聯(lián)的手段包含無細胞展示系統(tǒng)。
18.權利要求17的組合，其中所述無細胞展示系統(tǒng)包含核糖體展示系統(tǒng)。
19.權利要求17的組合，其中所述無細胞展示系統(tǒng)包含體外區(qū)室化展示系統(tǒng)(in vitro compartmentalization display system)。
20.權利要求17的組合，其中所述無細胞展示系統(tǒng)包含順式展示系統(tǒng)。
21.權利要求17的組合，其中所述無細胞展示系統(tǒng)包含微珠展示系統(tǒng)。
22.權利要求10的組合，其中所述用于基因型-表型偶聯(lián)的手段包含非展示系統(tǒng)。
23.權利要求22的組合，其中所述非展示系統(tǒng)是蛋白質片段互補測定法。
24.從多肽群中選擇對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下步驟(a)提供權利要求1-8任一項的多肽群；(b)使所述多肽群與預定靶在一定條件下接觸，所述條件是使得所述靶與至少一種對 所述靶具有親和性的所需多肽之間發(fā)生特異性相互作用的條件；(c)基于所述特異性相互作用從剩余的多肽群中選擇至少一種所需多肽。
25.權利要求24的方法，其中步驟(a)包括提供權利要求9的多核苷酸群以及表達所 述多核苷酸群以產(chǎn)生所述多肽群的預備步驟。
26.權利要求25的方法，其中所述多肽群的每個成員與編碼該成員的多核苷酸通過用于基因型_表型偶聯(lián)的手段以物理方式結合或者在空間上結合。
27.權利要求26的方法，其中所述用于基因型-表型偶聯(lián)的手段如權利要求11-23任一項限定。
28.分離編碼對預定靶具有親和性的所需多肽的多核苷酸的方法，包括如下步驟 -使用權利要求26的方法從多肽群中選擇所述所需多肽和編碼其的多核苷酸； -分離由此分離的編碼所需多肽的多核苷酸。
29.鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下步驟 -使用權利要求28的方法分離編碼所述所需多肽的多核苷酸；-對所述多核苷酸進行測序以通過推導確定所述所需多肽的氨基酸序列。
30.從多肽群中選擇和鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下步驟(a)在單獨的載體或者珠上合成多肽群的每個成員；(b)基于所述多肽與預定靶的相互作用選擇或者富集所述載體或者珠；(c)通過蛋白質表征方法鑒別所述多肽。
31.權利要求30的方法，其中步驟(c)中使用的蛋白質表征方法是質譜分析法。
32.產(chǎn)生對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下步驟-使用權利要求29的方法分離及鑒別所需多肽，或者使用權利要求30或者31的方法 選擇和鑒別所需多肽； -產(chǎn)生所述所需多肽。
33.權利要求32的方法，其中所述產(chǎn)生是使用化學合成方法從頭產(chǎn)生所需多肽進行的。
34.權利要求32的方法，其中所述產(chǎn)生是利用編碼所需多肽的多核苷酸的重組表達進 行的。
35.產(chǎn)生對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，包括如下步驟(al)使用權利要求28的方法分離編碼所述所需多肽的多核苷酸；或者 (a2)回譯(backtranslating)使用權利要求30或者31的選擇和鑒別方法鑒別的多 肽；以及(b)在(al)或者(a2)之后，表達由此分離的多核苷酸以產(chǎn)生所述所需多肽。
全文摘要
本發(fā)明揭示了基于共有支架的多肽變體群，該群中每個多肽均包含支架氨基酸序列EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ或者AKYAKEXXXAXX EIXXLPNLTX XQXXAFIXKL XDDPSQSSEL LSEAKKLNDS Q，其中每個X分別相應于在該群中變化的氨基酸殘基。本發(fā)明還揭示了多核苷酸群，其中每個成員編碼多肽群的成員。此外，本發(fā)明揭示了這種多肽群及這種多核苷酸群的組合，其中多肽群的每個成員與編碼該成員的多核苷酸通過用于基因型-表型偶聯(lián)的手段以物理方式結合或者在空間上結合。此外，本發(fā)明揭示了從多肽群中選擇對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，分離編碼對預定靶具有親和性的所需多肽的多核苷酸的方法，鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，選擇和鑒別對預定靶具有親和性的所需多肽的方法，以及產(chǎn)生對預定靶具有親和性的所需多肽的方法。
文檔編號C12N15/10GK101983204SQ200880126773
公開日2011年3月2日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權日2007年12月21日
發(fā)明者C·倫德爾, J·菲爾德維什, L·阿布拉姆森, N·赫內 申請人:阿菲博迪公司