專利名稱：人非抗體肽或蛋白質(zhì)噬菌體文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用源自M13噬菌體的PlX的工程化雜交噬菌體載體來生成Pix噬菌 體展示文庫并使用該文庫來產(chǎn)生一種或多種非抗體肽或蛋白質(zhì)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
噬菌體展示是基于親和力的多肽選擇的一種成熟工具。在典型的噬菌體展示選擇 中，將多肽文庫經(jīng)基因工程融合至絲狀噬菌體M13外殼蛋白其中之一的末端。噬菌體顆粒 提供所述文庫的每個(gè)多肽成員與其編碼基因之間的物理關(guān)聯(lián)。接著可針對(duì)與所需靶分子結(jié) 合的文庫成員，對(duì)噬菌體文庫進(jìn)行親和選擇即淘選。將文庫與靶分子混合，洗掉未結(jié)合的噬 菌體顆粒，洗脫剩下的噬菌體并通過在大腸桿菌細(xì)胞中培養(yǎng)而擴(kuò)增。盡管已經(jīng)用M13的每種外殼蛋白實(shí)現(xiàn)了外源多肽的展示，然而pill和pVIII仍是 目前最常用的融合伙伴。pill是42kD的次要外殼蛋白，其負(fù)責(zé)噬菌體感染進(jìn)入大腸桿菌。 每個(gè)噬菌體顆粒在其表面含有最多五個(gè)拷貝的pill蛋白，聚集在噬菌體的一端。PVIII是 噬菌體的主要外殼蛋白；數(shù)千個(gè)拷貝的PVIII (分子量為5kD)在單鏈病毒基因組周圍以有 序的方式排列而構(gòu)成噬菌體衣殼。除了 ΡΙΠ，Μ13還有三種其他次要外殼蛋白PVI(12kD 的蛋白)以及PVII和pIX，其中pVII和pIX是涉及裝配起始和穩(wěn)定性維持的短蛋白質(zhì)(分 別具有33和32個(gè)氨基酸)。五個(gè)拷貝的pVI蛋白位于噬菌體的與pill相同的一端，而五 個(gè)拷貝的PVII和pIX的每一者均位于噬菌體的相對(duì)兩端。雖然已證實(shí)在許多情況下可產(chǎn)生與pill和pVIII融合的噬菌體文庫展示融合物， 但由噬菌體展示的多肽卻受到某些生物學(xué)約束。例如，大多數(shù)長度為八個(gè)或更多個(gè)氨基酸 的肽不能很好地展示為與pVIII的融合物。此外，與噬菌體蛋白自身相互作用或以其他方 式影響PlII或pVIII的表達(dá)、整合或活性的多肽將在文庫中遞呈效率低，因?yàn)檎故舅鼈兊?噬菌體生長不良。最后，因?yàn)镻lII是相當(dāng)大的蛋白，PlII展示的多肽通往某些靶位點(diǎn)的通 路(例如，蛋白表面的深而窄的縫隙)或以多聚體形式時(shí)發(fā)揮最佳功能的多肽的正確裝配 可能會(huì)將在空間上受到阻礙。因此，根據(jù)利用其他外殼蛋白(其具有不同結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功 能，因此可預(yù)計(jì)會(huì)對(duì)所展示的多肽施加不同的約束)的噬菌體文庫選擇將有助于確保搜尋 最大量的序列多樣性。在概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)PVII和PlX可用于展示抗體片段和肽。 這些結(jié)果是特別值得注意的，因?yàn)樵缙谘芯勘砻鲗⒍嚯娜诤现罰VII和pIX的N末端使得這 些外殼蛋白失去功能?？赏ㄟ^使用噬菌體、噬菌?；螂s交載體實(shí)現(xiàn)在噬菌體上展示外源多肽。通過使用 噬菌體載體，所關(guān)注的基因可被引入噬菌體基因組中作為與天然外殼蛋白基因的框內(nèi)融合 物。這些載體作為全功能噬菌體獨(dú)立地繁殖并展示多拷貝的外源多肽。相反，噬菌粒載體 是除細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)之外還含有噬菌體復(fù)制起點(diǎn)和包裝信號(hào)的質(zhì)粒。噬菌粒攜帶融合到外 殼蛋白基因的重組拷貝中的所關(guān)注的基因，并且一旦用輔助噬菌體救援，噬菌粒即被包裝 進(jìn)子代病毒中，其中展示的多肽整合在噬菌體外殼中。對(duì)輔助噬菌體的需要導(dǎo)致噬菌粒載 體比噬菌體載體勞動(dòng)強(qiáng)度更大，并且使定量任何指定樣品中所存在噬菌體數(shù)量的工作復(fù)雜
3化。此外，由于噬菌體顆?？赏瑫r(shí)利用野生型外殼蛋白和融合外殼蛋白進(jìn)行裝配，因此所得 噬菌體的某些部分將不展示所關(guān)注的多肽序列，從而導(dǎo)致較低的展示效率。雜交載體類似 于噬菌體載體，因?yàn)槭删w基因組中攜帶有融合蛋白并且不需要輔助噬菌體，雜交載體還 類似于噬菌粒系統(tǒng)，因?yàn)榛蚪M也攜帶有融合蛋白的野生型拷貝。關(guān)于PlX噬菌體展示的 先前報(bào)道描述了在噬菌粒載體環(huán)境中的融合；關(guān)于在來自雜交載體或噬菌體載體的PlX上 展示多肽尚未見報(bào)道。最近已報(bào)道了多肽在來自噬菌體載體的PVII上的展示。需要提供合成的非抗體肽或蛋白質(zhì)文庫，和同時(shí)提供人治療性肽和蛋白質(zhì)的高親 和力和活性、高產(chǎn)率、良好的溶解性質(zhì)以及在人中施用時(shí)低免疫反應(yīng)傾向這些關(guān)鍵要素的 方法。相對(duì)于現(xiàn)有的方法，還需要提高從合成文庫中分離非抗體肽或蛋白質(zhì)的效率，以減少 發(fā)現(xiàn)非抗體肽或蛋白質(zhì)的資源耗費(fèi)以及加速提供非抗體肽或蛋白質(zhì)用于生物學(xué)評(píng)價(jià)。通過 將綜合設(shè)計(jì)、裝配技術(shù)以及噬菌體Pix肽或蛋白質(zhì)展示加以結(jié)合，本發(fā)明的文庫和方法滿 足了這些需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供可與PVII和PlX噬菌體展示一起使用的工程化Pix噬菌體載體，用于 利用M13噬菌體的PlX生成肽或蛋白質(zhì)文庫，如使用誘變或其他多樣性產(chǎn)生技術(shù)，可選地使 用同步成熟(in line maturation)，從而為肽或蛋白質(zhì)及非抗體肽或蛋白質(zhì)片段的生成以 及治療性非抗體肽或蛋白質(zhì)的選擇提供有效快速的平臺(tái)。根據(jù)本發(fā)明，提供了雜交噬菌體 載體，其已經(jīng)工程改造而包含連接至上游信號(hào)肽和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的第二重組PlX編碼區(qū)。本發(fā)明提供將肽和蛋白質(zhì)展示為與pIX或pVII噬菌體蛋白的融合物的噬菌體載 體，以用于將此類肽或蛋白質(zhì)表達(dá)為肽或蛋白質(zhì)文庫，所述文庫用于例如(但不限于)篩 選、選擇、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潛在的治療性或診斷性肽或蛋白質(zhì)。因?yàn)樘?然基因IX的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)與PVII和pVIII的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)重疊，簡(jiǎn)單融合至該基因 的末端可能造成噬菌體失活(Hill和Petersen, J. of Virol. 44 =32-46,1982)。本發(fā)明的 載體包括該融合體而同時(shí)保留天然外殼蛋白的調(diào)控區(qū)。該載體(而不是噬菌粒)的使用不 需要輔助噬菌體并顯著減少在選擇和分析期間培養(yǎng)噬菌體所花費(fèi)的時(shí)間和工作量。此外， 這些展示系統(tǒng)的多價(jià)特性使得它更容易檢測(cè)低親和力結(jié)合物。因此本發(fā)明提供了新型載體構(gòu)建體，其用于以PlX噬菌體展示形式表達(dá)肽或蛋白 質(zhì)，以構(gòu)建多肽陣列。具體地講，本發(fā)明描述了包含編碼融合多肽的第二重組PlX編碼序列 的工程化PlX噬菌體載體，其中所述融合多肽包含融合至絲狀噬菌體PVII或PlX蛋白的氨 基末端的外源多肽。優(yōu)選地，所述噬菌體顆粒在其表面包含表達(dá)的融合蛋白。在一方面，本發(fā)明提供了工程化的重組核酸噬菌體載體，其用于表達(dá)結(jié)合至所選 生物活性配體上的噬菌體展示融合肽或蛋白質(zhì)，該載體包含(a)編碼重組噬菌體前導(dǎo)序列 的核酸序列；可操作地連接至(b)重組標(biāo)簽、啟動(dòng)子或選擇編碼核酸序列；可操作地連接 至(c)重組PlX或PVII編碼核酸序列；可操作地連接至(d)重組限制位點(diǎn)；可操作地連 接至(e)編碼肽接頭的核酸序列；可操作地連接至(f)選擇性地結(jié)合至生物活性配體上 的第一外源肽或蛋白質(zhì)編碼序列；(g)pVII編碼核酸序列；(h)編碼天然pIX的核酸序列； (i)pIII編碼核酸序列；以及(j)pVI編碼核酸序列。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中所述噬菌體前導(dǎo)編碼序列為pelB序列。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中重組標(biāo)簽或選擇序列為FLAG標(biāo)簽序列。這 種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中重組標(biāo)簽或選擇序列選自SEQ ID N0:3、4、5或6。 這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中所述FLAG標(biāo)簽序列包含SEQ ID NO :2。這種工 程化的核酸噬菌體載體可包括其中所述啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這種工程化的核酸噬菌體 載體可包括其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為Iac啟動(dòng)子。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其 中所述肽接頭選自SEQ ID N0:7和8。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中所述第一 外源肽或蛋白質(zhì)是推定的生物活性蛋白質(zhì)或肽。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中 所述生物活性配體介導(dǎo)至少一種生物體內(nèi)活性。這種工程化的核酸噬菌體載體可包括其中 所述載體編碼融合至至少一種噬菌體外殼蛋白上的第二外源肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括包含工程化的核酸噬菌體載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可表達(dá) 生物活性融合蛋白。本發(fā)明還涉及由根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌宿主細(xì)胞表達(dá)的生物活性融合蛋白。本發(fā)明還 涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含復(fù)數(shù)種根據(jù)本發(fā)明的工程化核酸噬菌體載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞 的噬菌體文庫。所述噬菌體文庫可包括其中所述第一外源肽或蛋白質(zhì)的變體被表達(dá)。本發(fā)明還提供針對(duì)具有所需生物活性的外源肽或蛋白質(zhì)對(duì)噬菌體肽或蛋白質(zhì)文 庫進(jìn)行篩選的方法，所述方法包括(a)由噬菌體文庫表達(dá)外源肽或蛋白質(zhì)，以及(b)選擇 表達(dá)具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明還提供根據(jù)此方法獲得 的外源肽或蛋白質(zhì)編碼核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，噬菌體載體還編碼第二融合多肽，其中所述第二融合多肽包含 融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端的第二外源多肽，并且第一融合多肽中的第一外源多肽 融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二融合多肽可聯(lián)合形成異 型二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如靶標(biāo)蛋白質(zhì)、受體、核酸結(jié)合蛋白或酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明描述了用于在絲狀噬菌體表面表達(dá)融合蛋白的載體， 所述載體具有用于表達(dá)所述融合蛋白的表達(dá)盒。該表達(dá)盒包含上游和下游可翻譯DNA序 列，該DNA序列通過適于插入DNA定向連接的核苷酸序列(即多位點(diǎn)接頭)可操作地連接， 其中上游序列編碼原核分泌信號(hào)，下游序列編碼PVII或pIX絲狀噬菌體蛋白。該可翻譯DNA 序列可操作地連接至一組DNA表達(dá)信號(hào)上，以將該可翻譯DNA序列表達(dá)為融合多肽的一些 部分。在一個(gè)優(yōu)選變型中，該載體任選還包含第二表達(dá)盒，用于在絲狀噬菌體表面上表達(dá)第 二融合蛋白，其中該第二表達(dá)盒具有第一表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)，前提條件是第一融合蛋白表達(dá)盒 編碼pIX或pVII蛋白和/或第二融合蛋白表達(dá)盒編碼pIX或pVII蛋白。該載體被用作噬 菌體基因組來在噬菌體顆粒表面上表達(dá)異型二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中該異型二聚體的兩 種外源多肽通過融合至第一和第二噬菌體蛋白(pVII和/或pIX)而錨定在噬菌體顆粒上。在另一個(gè)實(shí)施例中，基于所述工程化的pIX噬菌體載體，本發(fā)明設(shè)想了根據(jù)本發(fā) 明的噬菌體顆粒文庫(即組合文庫)，其中該文庫中的代表性顆粒各自展示不同的融合蛋 白。在顆粒展示異型二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物時(shí)，該文庫包含異型二聚體的組合文庫，例如Fv 分子文庫形式的非抗體肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選的文庫具有至少103、104、105、106、107、108、109、 101(1、1011、1012、IO13(或其中任何范圍或數(shù)值)種融合肽或蛋白的組合多樣性。一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例描述了包含由本發(fā)明的工程化PlX噬菌體載體表達(dá)的第一和第二多肽的融合蛋白，其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是絲狀噬菌體PVII或pIX蛋 白，其中外源蛋白融合至絲狀噬菌體蛋白的氨基末端上。另外，本發(fā)明還設(shè)想了多種從本發(fā)明的工程化pIX噬菌體載體表達(dá)蛋白質(zhì)或肽的 方法，用于產(chǎn)生噬菌體的組合文庫，包括將編碼外源多肽的全套基因克隆到本發(fā)明的載體 中、通過誘變來修飾文庫中外源多肽的結(jié)構(gòu)、隨機(jī)組合第一和第二融合蛋白文庫的群體、通 過靶向及親和篩選(“淘選”)來改變文庫的多樣性等等。設(shè)計(jì)具有改進(jìn)的或新穎的功能的蛋白質(zhì)是一個(gè)具有多種醫(yī)學(xué)、工業(yè)、環(huán)境以及基 礎(chǔ)研究應(yīng)用的重要目標(biāo)。在用工程化PlX噬菌體載體開發(fā)非抗體肽或蛋白質(zhì)組合文庫后， 強(qiáng)有力的下一步驟是朝著人造非抗體肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體以及其他蛋白質(zhì)基序推進(jìn)，所述人 造抗體構(gòu)建體以及其他蛋白質(zhì)基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。本發(fā)明通過將工程化的pIX噬菌體載體用于構(gòu)建多肽組合陣列而提供噬菌體展 示形式來應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，所述多肽組合陣列中pVII和/或pIX用來展示表達(dá)單體或二聚體 的肽或蛋白質(zhì)種類的融合蛋白。該技術(shù)的范圍和能力所固有的是能夠展示可參與單體或二聚相互作用的各種蛋 白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)不僅包括非抗體肽或蛋白質(zhì)，還包括某些酶、激素和激素受體以及DNA結(jié) 合蛋白。本文所述的展示技術(shù)可用于非抗體肽或蛋白質(zhì)框架區(qū)的組合改變，以及改組并微 型化非抗體肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，或?qū)NA結(jié)合蛋白(例如阻遏蛋白)展示為異型二聚體文庫， 供選擇具有臨床和治療價(jià)值的特定DNA序列。因此，本技術(shù)提供了肽或蛋白質(zhì)文庫以及其中成員由單體、同型二聚體或異型二 聚體陣列組成的組合文庫的展示和選擇。應(yīng)當(dāng)理解，以上一般性的描述和以下詳細(xì)的描述都僅出于示例性和說明性目的， 不應(yīng)限制受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明。


圖1A-D. Ml3-9載體中的用于表達(dá)重組ΗΑ-ρΙΧ融合蛋白的合成DNA插入序列。圖2.pM0M 60的圖譜，示出了天然噬菌體外殼蛋白基因以及插入的重組pIX基因 的位置。圖3. M13-9的圖譜，示出了天然噬菌體外殼蛋白基因以及插入的pelB信號(hào)序列和 HA表位的位置。圖 4A-E. ELISA 示出各抗體與 ΗΑ-ρΙΧ 融合物(a)、FLAG_pIX 融合物(b)、His_6-pIX 融合物(c)的特異性結(jié)合，以及sEGFR-模擬體與M13-9噬菌體上的PHPEP 190-pIX融合物 (d)和EGF-pIX融合物(e)的特異性結(jié)合。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供可與pVII和pIX噬菌體展示一起使用的工程化pIX噬菌體載體，用于 利用M13噬菌體的pIX生成肽或蛋白質(zhì)文庫，如使用誘變或其他多樣性產(chǎn)生技術(shù)，可選地使 用同步成熟，從而為肽或蛋白質(zhì)及非抗體肽或蛋白質(zhì)片段的生成以及治療性非抗體肽或蛋 白質(zhì)的篩選提供有效快速的平臺(tái)。根據(jù)本發(fā)明，提供了雜交噬菌體載體，其已經(jīng)工程改造而 包含連接至上游信號(hào)肽和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的第二重組PlX編碼區(qū)。
本發(fā)明提供將肽和蛋白質(zhì)展示為與pIX或pVII噬菌體蛋白的融合物的雜交載體， 以用于將此類肽或蛋白質(zhì)表達(dá)為肽或蛋白質(zhì)文庫，所述文庫用于例如(但不限于)篩選、選 擇、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潛在的治療性或診斷性肽或蛋白質(zhì)。因?yàn)樘烊换?因IX的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)與PVII和pVIII的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)重疊，簡(jiǎn)單融合至該基因的末 端可能造成噬菌體失活(Hill和Petersen, J. of Virol. 44 =32-46,1982) (8)。作為替代， 已將M13mpl9的衍生物進(jìn)行工程改造而包含連接至上游信號(hào)肽和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的第二重 組PlX編碼區(qū)。該載體(而不是噬菌粒)的使用不需要輔助噬菌體并顯著減少在選擇和分 析期間培養(yǎng)噬菌體所花費(fèi)的時(shí)間和工作量。此外，攜帶該載體的生長噬菌體的數(shù)量比攜帶 噬菌粒的生長噬菌體的數(shù)量更容易確定。因此本發(fā)明提供了新型載體構(gòu)建體，其用于以PlX噬菌體展示形式表達(dá)肽或蛋白 質(zhì)，以構(gòu)建多肽陣列。具體地講，本發(fā)明描述了包含編碼融合多肽的第二重組PlX編碼序列 的工程化PlX噬菌體載體，其中所述融合多肽包含融合至絲狀噬菌體PVII或PlX蛋白的氨 基末端的外源多肽。優(yōu)選地，噬菌體顆粒包含在噬菌體顆粒表面上表達(dá)的融合蛋白質(zhì)。利用本文所述的這種工程化pIX噬菌體載體生成的人肽或蛋白質(zhì)從頭文庫與現(xiàn) 有的非抗體肽或蛋白質(zhì)文庫技術(shù)現(xiàn)狀不同之處在于它是通過M13噬菌體的pIX基因來展
7J\ ο絲狀噬菌體本發(fā)明設(shè)想將本文所述的工程化PlX噬菌體載體與編碼至少一個(gè)重組融合肽或 蛋白質(zhì)的Pix或PVII噬菌體一起使用。該融合蛋白包括融合至絲狀噬菌體PVII或PlX蛋 白的氨基末端的外源多肽部分。所謂“外源的”意指融合至噬菌體蛋白的多肽通常不與絲狀噬菌體的野生型種類 中的噬菌體PVII或pIX蛋白相締合，而是對(duì)于正常噬菌體蛋白而言是外來的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，絲狀噬菌體封裝有編碼第一和/或第二融合蛋白的基因 組，其中第一融合蛋白包含融合至PVII或pIX上的第一外源多肽，第二融合蛋白包含融合 至pIX或pIX上的第二外源多肽。如本文所述，絲狀噬菌體還包含展示于噬菌體顆粒表面上的一種或多種融合蛋 白。因此，如果存在至少第一和第二融合蛋白，則噬菌體可以功能性方式展示這些蛋白，使 得第一和第二外源多肽可相互作用成為異型二聚體，從而在噬菌體表面上形成功能性雙鏈 蛋白質(zhì)復(fù)合物。在存在于本發(fā)明噬菌體上的融合蛋白中，外源多肽和絲狀噬菌體pVII或pIX蛋白 之間的“融合”可包含典型的酰胺鍵，或可如實(shí)例中所述包含連接多肽(即“接頭”)。可使 用多種接頭中的任何一種，所述接頭通常為一段長度為約5至50個(gè)氨基酸的序列。尤其優(yōu) 選的接頭可在靠近接頭處給融合蛋白提供高度的活動(dòng)性。文庫設(shè)計(jì)以前的合成文庫并入了以下內(nèi)容的一部分，但沒有一個(gè)全面地包括以 下全部?jī)?nèi)容。序列多樣性的位置和性質(zhì)。序列多樣性是如何內(nèi)源提供具有高親和力、選擇性結(jié) 合實(shí)體的人體蛋白質(zhì)的標(biāo)志。這種序列多樣性的產(chǎn)生和積累不是隨機(jī)的。基因組序列的核 苷酸突變的位點(diǎn)和類型因DNA序列和機(jī)理而具有偏向性，但是只有提供結(jié)合和功能優(yōu)勢(shì)的 突變才被選擇和儲(chǔ)存，并且通常伴隨中性置換。雖然不易從機(jī)理預(yù)測(cè)，但已知的人肽或蛋白
7質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)功能分析的數(shù)據(jù)庫能鑒定在很多情況下與所需靶標(biāo)或抗原的識(shí)別(包括蛋 白質(zhì)、肽和小分子抗原之間的區(qū)分)相關(guān)的位置和氨基置換。本發(fā)明的文庫通過利用設(shè)計(jì) 的簡(jiǎn)并寡核苷酸來在推定的結(jié)合區(qū)及功能區(qū)整合進(jìn)置換，從而提供這種天然的人多樣性。表達(dá)、生物化學(xué)和生物物理特性。優(yōu)選的人非抗體肽或蛋白質(zhì)不僅具有所需生物 活性和結(jié)合活性，而且可由多種宿主高效生產(chǎn)，并且具有穩(wěn)定性和良好的溶解特性。高頻率 種系基因用法(Id)也表明在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的良好表達(dá)。此外，通過選擇或篩選的細(xì)菌噬 菌體展示方法來從文庫回收的非抗體肽或蛋白質(zhì)應(yīng)在細(xì)菌宿主中表達(dá)良好。本發(fā)明的文庫 是基于人種系衍生的模板，所述模板是從標(biāo)準(zhǔn)的重組哺乳動(dòng)物宿主(例如HEK 293和CHO 細(xì)胞)以及細(xì)菌宿主良好表達(dá)和純化的，并具有高穩(wěn)定性和良好的溶解特性。文庫組裝技術(shù)。優(yōu)選的從頭非抗體肽或蛋白質(zhì)文庫具有高的多樣性(> IOlt1)，易 于改變，容易組裝，并且不需要的序列的背景低。這些背景序列包括親代模板和低定向多樣 性。結(jié)合以下方法可加速文庫組裝并產(chǎn)生低的背景(a)基于Kimkle的單鏈誘變；(b)具有 限制性位點(diǎn)的回文環(huán)；(C)大引物pIX肽或蛋白質(zhì)噬菌體展示。所有以前的絲狀噬菌體從頭人非抗體肽或蛋白質(zhì)文 庫均利用PlII或PVIII噬菌體外殼蛋白來進(jìn)行展示。pIX與選定的肽或蛋白質(zhì)模板的組合 是用于回收非抗體肽或蛋白質(zhì)的更有效的選擇系統(tǒng)，所回收的非抗體肽或蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化為 單克隆抗體及其他相關(guān)分子時(shí)保留它們的選定特性。肽或蛋白質(zhì)展示。肽或蛋白質(zhì)是人非抗體肽或蛋白質(zhì)的天然片段，當(dāng)它們通過基 因工程引入至完全非抗體肽或蛋白質(zhì)中時(shí)可更好地重演它們的活性。肽或蛋白質(zhì)的有效絲 狀展示除要求在細(xì)菌宿主良好表達(dá)這個(gè)特性之外還要求其他特性。本發(fā)明的文庫中所用的 肽序列被選擇用于通過Pix在絲狀噬菌體上有效展示。噬菌粒展示。肽或蛋白質(zhì)相對(duì)于噬菌體PlX外殼蛋白而言可能較大，因此如果連 接至在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的所有PlX蛋白的話，則可能干擾重組噬菌體顆粒的裝配。規(guī)避該 干擾的一種方法為使用PlX噬菌粒系統(tǒng)，憑此野生型PlX蛋白和肽或蛋白質(zhì)連接的PlX蛋 白都可整合進(jìn)重組噬菌體顆粒中。在一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用中，本發(fā)明的文庫是通過PlX在噬菌 粒系統(tǒng)中展示。用于展示的噬菌體外殼蛋白pIX。類似于pIII，pIX以較低的拷貝數(shù)存在于噬菌 體上，并適于對(duì)展示的肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行親和選擇。但是，PlII蛋白質(zhì)參與侵染過程并起著 關(guān)鍵作用，展示在該P(yáng)lII蛋白質(zhì)上的蛋白質(zhì)可能干擾侵染效率。此外，重鏈Fd或輕鏈片段 都可與PlX融合以進(jìn)行展示。預(yù)計(jì)展示在PlX蛋白上的本發(fā)明文庫可被有效復(fù)制和遞呈， 以進(jìn)行選擇和/或篩選。肽或蛋白質(zhì)-pIX表達(dá)。篩查從噬菌體文庫中回收的肽或蛋白質(zhì)的一種方法是去 除連接至用來展示的肽或蛋白質(zhì)分子的噬菌體外殼蛋白。PlX蛋白的小尺寸提供了無需這 個(gè)步驟而直接篩選肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)選擇。噬菌體構(gòu)造。合適的M13或類似類型的噬菌體載體可用作根據(jù)本發(fā)明的工程化載 體?？筛鶕?jù)已知技術(shù)對(duì)具有合適的調(diào)節(jié)、選擇、限制性酶切以及其他所需位點(diǎn)和序列(如啟 動(dòng)子、信號(hào)序列、前導(dǎo)序列(如PelB)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(如Shine-Delgano)、標(biāo)簽(如FLAG 標(biāo)簽)、轉(zhuǎn)錄終止子(如trpA)、選擇序列(如LACZ)、限制性位點(diǎn)(如HindIII, EcoRI)、肽 接頭等等)的編碼PlX或PVII融合蛋白的這種載體進(jìn)行修飾，使其還包含連接至上游信號(hào)
8肽編碼序列和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如LacZa)的第二 pIX和/或pVII編碼序列。這會(huì)消除了對(duì) 輔助噬菌體的需要，并且還顯著減少了在選擇和/或分析步驟期間培養(yǎng)噬菌體所需的時(shí)間 和精力。另外，與使用其他載體相比，可更容易地確定需要培養(yǎng)的噬菌體數(shù)量。舉以非限制性的例子，源自M13mpl9的M13KE是已知的可通過插入重組pIX基因 來提供本發(fā)明的工程化Pix噬菌體載體的噬菌體載體?？蓪⒅亟M區(qū)插入(例如)M13mpl9 的IacZ α區(qū)，位于噬菌體基因組基因間區(qū)域中，因此Iac啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)重組基因IX融合物 的轉(zhuǎn)錄。插入序列(圖1)可包含Shine-Delgarno序列(核糖體結(jié)合位點(diǎn))、來自果膠裂 解酶B的信號(hào)序列(pelB)、用于后續(xù)克隆的雙BbsI限制酶識(shí)別位點(diǎn)、pIX編碼區(qū)以及trpA 轉(zhuǎn)錄終止子。FLAG標(biāo)簽肽DYKDDDDK以及五氨基酸接頭(M13-99 =GGTKT)或九氨基酸接頭 (M13-99L :SGGSGGTKT)包含在 pelB 與 IX 基因之間。可用九氨基酸接頭將具有各種長度和電荷的另外的肽(例如，但不限于表1中的 那些)展示于PlX的氨基末端，以確定最適合表達(dá)特定多肽的接頭。此外，將一種或多種外 源融合肽展示于PlX或pVII上?？舍槍?duì)肽標(biāo)簽的展示分析最終噬菌體載體是否含有重組pIX基因，例如在ELISA 實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行分析?？捎每筂13/靶標(biāo)綴合物或任何其他表達(dá)外源肽的檢測(cè)方法來檢測(cè)結(jié)合 至固定化的靶標(biāo)肽或蛋白質(zhì)上的噬菌體。皿。用于在pIX上展示肽和蛋白質(zhì)的噬菌體系統(tǒng)與以前開發(fā)的噬菌粒系統(tǒng)相 比，在親合力、速度和方便性方面更有優(yōu)勢(shì)。由于親合力的影響，與噬菌?；螂s交系統(tǒng)相比， 其結(jié)合信號(hào)顯著增加。因此，該系統(tǒng)可作為從大的集合中鑒別出弱的結(jié)合物的理想系統(tǒng)。結(jié) 合信號(hào)的這種放大對(duì)往往內(nèi)在親和力弱而不具備親和力成熟的肽來說至關(guān)重要。具有不同 長度、電荷、線性和環(huán)狀的肽和小的球形蛋白質(zhì)已成功展示于Pix上，并在本文公開。該噬 菌體載體所節(jié)省的時(shí)間也是明顯的。噬菌體可感染進(jìn)入宿主細(xì)胞并且擴(kuò)增一個(gè)下午，基本 上在一個(gè)步驟中進(jìn)行。相反，噬菌粒的擴(kuò)增需要進(jìn)行噬菌粒感染和長出、用輔助噬菌體以確 定的培養(yǎng)物濃度進(jìn)行超感染以及對(duì)所救援的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。因此該過程必需要額外的步 驟和操作者輸入，并且(至少)要過夜培養(yǎng)。相對(duì)于典型選擇實(shí)驗(yàn)中涉及的重復(fù)選擇循環(huán) 和多輪篩選過程，噬菌體系統(tǒng)的時(shí)間節(jié)省可十分明顯。此外，噬菌體系統(tǒng)不需輔助噬菌體感 染，僅存在一種類型的噬菌體基因組可包裝進(jìn)噬菌體顆粒中。這生成了均一的噬菌體群體， 使得能精確測(cè)量含有融合基因組的病毒顆粒。雖然已概括地描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明的實(shí)施例還將在以下的實(shí)例中進(jìn)一步公 開，所述實(shí)例不應(yīng)理解為限制權(quán)利要求的范圍。實(shí)例1 示例性的工程化噬菌體載體的構(gòu)建9型噬菌體載體的構(gòu)建原型M13-9載體(PHPEP208)被構(gòu)建成含有來自果膠 裂解酶B的信號(hào)序列(pelB)和雙BbsI限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)用于在噬菌體基因組 M13KE (M13mpl9的衍生物)中的pVII和pIX基因之間插入后續(xù)克隆。在未經(jīng)修飾的M13KE 噬菌體基因組中，PVII基因的最后一個(gè)氨基酸密碼子的末端核苷酸堿基為pIX基因的ATG 起始密碼子的第一個(gè)核苷酸堿基。在PHPEP 208中在pVII基因和pelB信號(hào)序列的ATG起 始密碼子之間保留PVII和pIX基因之間共用的該最后一個(gè)和第一個(gè)核苷酸。在elB信號(hào) 序列和基因PlX之間包含流感血凝素(HA)肽YPYDVPDYA和九-氨基酸接頭SGGSGGTKT。將 具有各種長度、電荷的三種其他肽(表1)和小的球形蛋白質(zhì)表皮生長因子(EGF) (SEQ ID
9NO 6)亞克隆至PHPEP208中，并用所述九氨基酸接頭使它們展示于pIX的氨基端。方法。通過對(duì)含有HA盒(MOM 60)的M13-99噬菌體基因組進(jìn)行兩個(gè)系列的PCR 而產(chǎn)生編碼pVII-PelB-HA-pIX盒的DNA (圖ld，該DNA的兩側(cè)為BsrGI和BspHI酶識(shí)別位 點(diǎn))，以獲得N端和C端片段。然后，通過重疊PCR重組反應(yīng)將這兩個(gè)片段連接在一起。MOM 60含有插入噬菌體基因組M13KE(M13mpl9的衍生物)中的重組pIX基因(圖2)。重組區(qū) 已插入M13mpl9的IacZa區(qū)，位于噬菌體基因組基因間區(qū)中，因此Iac啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)該重 組基因IX融合物的轉(zhuǎn)錄。插入序列包含Shine-Delgarno序列(核糖體結(jié)合位點(diǎn))、來自果膠裂解酶B的 信號(hào)序列(pelB)、用于后續(xù)克隆的雙BbsI限制性酶識(shí)別位點(diǎn)、pIX編碼區(qū)以及trpA轉(zhuǎn)錄 終止子。在pelB和基因IX之間包含HA肽YPYDVPDYA(SEQ ID NO :2)和九-氨基酸接頭 SGGSGGTKT (SEQ ID NO :7)。為了產(chǎn)生N端片段，從M0M60基因組PCR擴(kuò)增出一段包含BsrGI 位點(diǎn)和PVII基因的DNA (圖la)。然后，通過PCR擴(kuò)增將pelB信號(hào)序列的一部分添加至其C 端末端，以提供18bp的互補(bǔ)堿基配對(duì)位點(diǎn)，用于與C端片段進(jìn)行后續(xù)的重組反應(yīng)(圖lb)。 C端片段通過PCR擴(kuò)增一段DNA來產(chǎn)生，該段DNA含有pelB信號(hào)序列、HA表位和來自M0M60 噬菌體基因組的HA盒的pIX基因的重組拷貝(圖lc)。反向寡核苷酸引物含有BspHI限制 性位點(diǎn)。讓所述N端和C端PCR片段在互補(bǔ)區(qū)退火在一起，并通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增(圖Id)。 將該表達(dá)盒用BsrGI和BspHI酶進(jìn)行限制性酶切消化，并連接至已用BsrGI和BspHI消化的 M13KE RF DNA中。最終的噬菌體載體M13-9 (SEQ ID NO 1)的圖解見圖3。對(duì)于其他的肽， 其互的補(bǔ)寡核苷酸退火到一起而生成適當(dāng)?shù)腄NA序列。退火的寡核苷酸含有與BbsI消化 的M13-9載體對(duì)應(yīng)的相容懸突，使得肽標(biāo)簽DNA和載體能連接。PHPEP 190為對(duì)可溶性EGFR 受體具有親和力的肽。其氨基酸殘基中的八個(gè)位于由二硫鍵限定的環(huán)中。對(duì)EGF進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用BbsI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，然后連接至BbsI消化的M13-9中。接種重組噬菌體 以在XL-I藍(lán)宿主大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene)的菌苔上分離出單個(gè)菌斑。將噬菌斑重新懸 浮于介質(zhì)中，并讓其在瓊脂上擴(kuò)散。將噬菌體感染進(jìn)XL-I藍(lán)大腸桿菌細(xì)胞中并在37°C下 培養(yǎng)4. 5小時(shí)。在噬菌體生長和誘導(dǎo)之后，通過離心移除細(xì)菌，用4% PEG-8000、0. 5M NaCl 將噬菌體從培養(yǎng)上清液中沉淀出來，并在4°C下孵育過夜。通過離心回收噬菌體顆粒，并將 噬菌體粒料重新懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。展示的肽的分析。在ELISA實(shí)驗(yàn)中針對(duì)展示對(duì)含有肽或蛋白質(zhì)的噬菌體進(jìn)行檢 測(cè)。用抗M13/HRP綴合物檢測(cè)結(jié)合至固定化的單克隆抗體或可溶性EGFR-模擬體的噬菌體。 發(fā)現(xiàn)具有HA插入序列的M13-9特異性地結(jié)合至抗HA抗體而非抗flag抗體上，表示HA標(biāo) 簽在重組PlX上得到了成功展示(圖4a)。其他肽和EGF的ELISA數(shù)據(jù)在圖4b、4c、4d和 4e中示出。抗his和抗flag抗體用作適當(dāng)?shù)氖删w的靶標(biāo)。將可溶性EGFR-模擬體用于 檢測(cè)PHPEP 190肽和EGF蛋白的展示。將人IgGl Fc支架用作PHPEP 190和EGF噬菌體 ELISA的陰性對(duì)照。這些結(jié)果表明，這些肽和EGF蛋白也成功地展示在重組pIX上。方法。將Maxisorp ELISA板(NUNC)的各孔用500ng單克隆抗體或可溶性EGFR-模 擬體(PBS中5 μ g/mL)包被，4°C下過夜。用含有0. 1 % Tween-20的Tris緩沖鹽水(TBS-T) 沖洗各孔兩次，然后用Starting Block(Pierce)在室溫下封閉1小時(shí)。再次沖洗小孔。將 稀釋于Starting Block中的PEG沉淀的噬菌體(IO8 I(Tpfu)加入小孔中并在室溫下振蕩孵育1小時(shí)。用TBS-T沖洗小孔三次，將抗M13/辣根過氧化物酶綴合物(GE Healthcare)(在Starting Block中以1 5000稀釋)加入小孔中，并在室溫下振蕩孵育1小時(shí)。用 PBS-T沖洗小孔三次，然后加入POD化學(xué)發(fā)光底物(Roche)，并在Tecan讀板器上檢測(cè)。表1.克降講DIX雜奪表汰裁體中的flt序歹U。
—肽標(biāo)簽 象基酸序列 — FLAG — DYKDDDDK (SEQ ID NO: 3) “ HA — YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 2) “ HIS HHHHHH (SEQ ID NO: 4) PHPEP 190— GGDPCTWEVWGRECLQGG (SEQ ID NO: 5) “ EGF MAVFNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR~ __(SEQ ID NO: 6)_參考文獻(xiàn)1. Kehoe, J. W.禾口 B. K. Kay. 2005. Filamentous phage display in the new millennium. Chem Rev 105 :4056o2. Iannolo, G. , 0. Minenkova, R. Petruzzelli 禾口 G. Cesareni. 1995. Modifying filamentous phage capsid :limits in the size of the major capsid protein,J Mol Biol 248 :835o3. Gao，C. ，S. Mao，C. H. Lo, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 1999. Making artificial antibodies -.a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. Proc Natl Acad Sci USA 96 :6025o4. Gao, C. ， S. Mao, G. Kaufmann, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 2002. A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display. Proc Natl Acad Sci USA 99:12612。5. Gao, C. , S. Mao, H. J. Ditzel, L. Farnaes, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 2002. A cell-penetrating peptide from a novel pVII-pIX phage-displayed random peptide library. Bioorg Med Chem 10:4057。6. Endemann, H.禾口 P. Model. 1995. Location of filamentous phage minor coat proteins in phage and in infected cells. J Mol Biol 250 :496。7. Hill, D. F.禾口 G. B. Petersen. 1982. Nucleotide Sequence of Bacteriophage fl DNA. Journal of Virology 44:32。序列表SEQ ID NO : 1Ml3-9 (HA)的序列aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgccccaaatgaaaat 60atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaactaaatctact 120cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca
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權(quán)利要求
一種工程化重組核酸噬菌體載體，其用于表達(dá)結(jié)合至選定的生物活性配體的噬菌體展示融合肽或蛋白質(zhì)，所述載體包含a.編碼重組pVII噬菌體的核酸序列；其可操作地連接至b.編碼重組噬菌體前導(dǎo)序列的核酸序列；其可操作地連接至c.重組限制性位點(diǎn)；其可操作地連接至d.編碼肽接頭的核酸序列；其可操作地連接至ae.編碼選擇性結(jié)合至生物活性配體的第一外源肽或蛋白質(zhì)的序列；f.編碼天然pIX的核酸序列；g.編碼成熟pVIII的核酸序列；以及h.編碼成熟pIII的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中所述編碼噬菌體前導(dǎo)序列的序 列為peIB序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中重組標(biāo)簽或選擇序列為HA標(biāo)簽 序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中重組標(biāo)簽或選擇序列選自SEQ ID NO :3、4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中所述肽接頭選自SEQID NO :6、 7 禾口 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中所述第一外源肽或蛋白質(zhì)是推 定的生物活性蛋白質(zhì)或肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的工程化核酸噬菌體載體，其中所述生物活性配體介導(dǎo)至少一 種體內(nèi)生物活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌體載體，其中所述載體編碼融合至至少一種 噬菌體外殼蛋白的第二外源肽或蛋白質(zhì)。
9.一種細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化核酸噬菌 體載體。
10.一種生物活性融合蛋白，所述生物活性融合蛋白由根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)菌宿 主細(xì)胞表達(dá)。
11.一種生物活性外源肽或蛋白質(zhì)，所述外源肽或蛋白質(zhì)源自根據(jù)權(quán)利要求10所述的融合蛋白。
12.—種細(xì)菌宿主細(xì)胞的噬菌體文庫，所述噬菌體文庫包含復(fù)數(shù)種根據(jù)權(quán)利要求1所 述的工程化核酸噬菌體載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的噬菌體文庫，其中所述第一外源肽或蛋白質(zhì)的變體被表達(dá)。
14.一種針對(duì)具有所需生物活性的外源肽或蛋白質(zhì)對(duì)噬菌體肽或蛋白質(zhì)文庫進(jìn)行篩選 的方法，所述方法包括(a)由根據(jù)權(quán)利要求13所述的噬菌體文庫表達(dá)外源肽或蛋白質(zhì)，以 及(b)選擇表達(dá)具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞。
15.一種編碼外源肽或蛋白質(zhì)的核酸，所述核酸從根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用源自M13噬菌體的pIX的工程化雜交噬菌體載體來生成pIX噬菌體展示文庫并使用該文庫來產(chǎn)生一種或多種非抗體肽或蛋白質(zhì)的組合物和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101970691SQ200880127065
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者C·黃, K·奧奈爾, L·尹 申請(qǐng)人:森托科爾奧索生物科技公司