專利名稱：：使基因表達(dá)靶向于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的核酸分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及使基因表達(dá)定向到神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的核酸分子、表達(dá)載體和方法。
背景技術(shù)：
：選擇的細(xì)胞或組織類型中的特異性基因表達(dá)可通過使用與配體結(jié)合的遞送載體的靶向基因遞送實(shí)現(xiàn)，所述遞送載體通過所述配體結(jié)合于靶細(xì)胞獨(dú)特的細(xì)胞表面受體。特異性基因表達(dá)還可通過使用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的靶向轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞特異性啟動(dòng)子是將特殊細(xì)胞功能限制于特定分化細(xì)胞類型的主要方式之一。這些啟動(dòng)子指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的能力通過特定類型細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)濃度和活性調(diào)節(jié)。使用細(xì)胞特異性細(xì)胞啟動(dòng)子以將轉(zhuǎn)基因表達(dá)限制在靶組織中的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)是一種可用于生物學(xué)研究以研究基因的細(xì)胞功能的技術(shù)，并且是一種可用于醫(yī)學(xué)用途以消除由治療基因的脫靶表達(dá)導(dǎo)致的副作用的技術(shù)。目前，采用組織或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子來控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特異性。此方法對(duì)于在癌癥治療中表達(dá)自殺基因尤其有吸引力，所述癌癥治療使用毒性基因或編碼使前藥轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔锏拿傅幕颉Ｇ叭嗽谧詺⒒虻谋磉_(dá)中使用組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或者腫瘤選擇性啟動(dòng)子的努力取得了利弊并存的成功，遭受到這些啟動(dòng)子將治療基因表達(dá)嚴(yán)密限制于腫瘤細(xì)胞的嚴(yán)密性的困擾(Harringtonetal,2000；Robson&Hirst,2003；SaukkonenandHemminki,2005)。這與以下觀念一致定義組織特異性并不簡(jiǎn)單，因?yàn)槿嘶蚪M的轉(zhuǎn)錄普遍存在(Yangetal.,2005；Birneyetal.，2007)。而且，組織特異性基因在不同的生理?xiàng)l件下可能不是真正特異性的，并且細(xì)胞啟動(dòng)子可因內(nèi)源性順式和反式調(diào)節(jié)元件在不同生理?xiàng)l件下的不同表達(dá)而呈現(xiàn)不同的誘導(dǎo)模式(Harringtonetal,2000；Robson&Hirst,2003；SaukkonenandHemminki，2005；Stoff-Khalilietal.，2008)。因此，可能需要其他控制方法獲得使用自殺基因表達(dá)治療癌癥所需的腫瘤選擇性。因此，此方法可能被在某些條件下的顯著脫靶表達(dá)所妨礙。例如，盡管細(xì)胞特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)的毒性基因表達(dá)可消除所述啟動(dòng)子在其中發(fā)揮功能的特定細(xì)胞類型衍生的腫瘤細(xì)胞，然而這一方法也會(huì)因所述細(xì)胞啟動(dòng)子在健康細(xì)胞中誘導(dǎo)的表達(dá)而殺死健康細(xì)胞。已對(duì)組織特異性啟動(dòng)子和腫瘤選擇性啟動(dòng)子就自殺基因表達(dá)進(jìn)行了試驗(yàn)，以使對(duì)非靶標(biāo)正常細(xì)胞的殺死效應(yīng)最小化。區(qū)分組織特異性啟動(dòng)子和腫瘤選擇性啟動(dòng)子倚賴啟動(dòng)子在正常和腫瘤組織中的相對(duì)活性，并且它們之間的分界線經(jīng)常是模糊的(Harringtonetal.，2000)。除上述缺點(diǎn)以外，體內(nèi)最精密的器官一中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的獨(dú)特特征使得成功的組織或細(xì)胞靶向的基因表達(dá)存在幾個(gè)障礙。在CNS中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型極為不同，其中許多對(duì)生理功能極為重要，并對(duì)基因表達(dá)的任何變化都高度敏感。使用選擇性靶向方法來控制治療基因的表達(dá)，例如使用自殺基因表達(dá)的試驗(yàn)，通常涉及表達(dá)毒性自殺基因的載體的直接腫瘤內(nèi)注射，藉此將治療基因表達(dá)局限于腫瘤組織。然而，由于大多數(shù)病毒載體的天然感染譜并不局限于腫瘤組織，因此腫瘤內(nèi)注射的載體可能泄露到正常組織中是一個(gè)問題，并且可能造成健康細(xì)胞的附帶破壞。盡管這種破壞在某些器官中是可忍受的，然而其在敏感器官例如腦中可能引起嚴(yán)重的后果。這些具體挑戰(zhàn)要求建立特異性方法以在CNS細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，包括局限于具體CNS細(xì)胞類型的基因表達(dá)，藉此確保在所需細(xì)胞中的治療效果，并且限制由在非靶CNS細(xì)胞中的基因表達(dá)造成的副作用。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤的最常見類型之一。神經(jīng)膠質(zhì)瘤可以是高度浸潤的，極有侵襲性，并可能是最難治的人癌癥形式之一(Ciafreetal.,2005；PulkkanenandYla-Herttuala,2005)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，主要是星形細(xì)胞，隨著惡性水平增加分級(jí)為I到IV。IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤，也稱為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)，包括近半的神經(jīng)膠質(zhì)瘤并且是成年人中最常見的原發(fā)性腦腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療例如手術(shù)、Y照射和化療對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤無效，證據(jù)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后很差，這些患者在診斷后的平均存活時(shí)間不到一年。正在研究的療法例如靶向基因表達(dá)仍然是最有希望的治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方法之一。這些方法需要建立一種可特異性殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)不影響CNS的非靶健康細(xì)胞的選擇性靶向方法。因此，使用治療性自殺基因的腫瘤特異性表達(dá)來治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的充分潛力將從建立可更精確地控制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自殺基因表達(dá)而不靶向CNS健康細(xì)胞的方法中獲益。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種核酸分子，包含一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子；一段轉(zhuǎn)基因編碼序列；和多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)；其中每個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均結(jié)合一個(gè)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)的miRNA，并且其中所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均可操作地連接于所述轉(zhuǎn)基因編碼序列。所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子可為星形細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，包括膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白啟動(dòng)子。所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)可以包含至少一個(gè)has-miR-31、has-miR-127或has-miR-143靶位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)包含至少一個(gè)has-miR-31靶位點(diǎn)、至少一個(gè)has-miR-127靶位點(diǎn)和至少一個(gè)has-miR-143位點(diǎn)；或者至少兩個(gè)has-miR-31靶位點(diǎn)、至少兩個(gè)has-miR-127靶位點(diǎn)和至少兩個(gè)has-miR-143位點(diǎn)。所述轉(zhuǎn)基因可編碼一種使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞被直接殺死的基因產(chǎn)物、一種免疫調(diào)節(jié)蛋白、一種細(xì)胞毒素、一種血管生成抑制蛋白、一種腫瘤抑制蛋白、一種自殺蛋白、一種凋亡蛋白、一種抗血管生成蛋白或一種抗體。例如，所述轉(zhuǎn)基因可編碼HSV-tk或DT-A。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含如本文所述的本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可為桿狀病毒載體。在又一方面，本發(fā)明提供了一種在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法，包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可為體外(invitro)細(xì)胞、從受試者體內(nèi)移出到體外的離體(exvivo)細(xì)胞或者受試者的體內(nèi)(invivo)細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含本發(fā)明表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種包含本發(fā)明表達(dá)載體的藥物組合物。在本發(fā)明的再一方面，提供了一種包含本發(fā)明表達(dá)載體和用于在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的說明書的試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀以下本發(fā)明具體實(shí)施方式和附表和附圖的描述后會(huì)明了本發(fā)明的其他方面和特征。在僅以舉例的方式說明本發(fā)明實(shí)施方案的表和圖中表1用于構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體的具體實(shí)施方案的引物的序列。圖1用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的miRNA的選擇。(a)在正常人星形細(xì)胞中具有高拷貝數(shù)并且在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)的miRNA的鑒定?；趤碜?0個(gè)微陣列測(cè)定的10個(gè)星形細(xì)胞樣品的平均信號(hào)強(qiáng)度和使用實(shí)時(shí)PCR定量的miR-31的絕對(duì)拷貝數(shù)估計(jì)了正常星形細(xì)胞中不同miRNA的拷貝數(shù)。圖中包括231個(gè)在正常星形細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中均表達(dá)的miRNA。將三個(gè)選擇的miRNA的點(diǎn)涂以藍(lán)色。(b)用RT-qPCR進(jìn)行的miRNA表達(dá)分析。對(duì)三種選擇的miRNA:miRNA-31、miRNA-127和miRNA_143在U87細(xì)胞和NHA中的表達(dá)進(jìn)行了定量。基于用合成miR-31RNA寡核苷酸生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算了miRNA拷貝數(shù)。圖2=GFAP啟動(dòng)子和miRNA調(diào)節(jié)對(duì)螢光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組合效應(yīng)。(a)含有增強(qiáng)的星形細(xì)胞特異性GFAP啟動(dòng)子和miRNA靶序列的表達(dá)盒的示意圖。首先構(gòu)建并測(cè)試了具有GFAP啟動(dòng)子和不同miRNA靶序列的pFastBac質(zhì)粒(pFB)載體。CMVE/GFAP一種通過將人巨細(xì)胞病毒即刻早期基因5’端增強(qiáng)子的380bp片段添加至人GFAP啟動(dòng)子而構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子。Luc螢光素酶基因。將在表1中明示的miRNA靶序列插入Iuc基因的3’UTR區(qū)。PA聚腺苷酸信號(hào)。分別使用不含miRNA靶序列和含有mix9F序列的pFastBac質(zhì)粒作為穿梭載體，生成桿狀病毒載體BV-luc-ctrl和BV-luc-mix9F。(b)篩選在正常人星形細(xì)胞中、但不在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的miRNA靶序列。使用含有不同miRNA靶序列的PFB載體轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞和正常人星形細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染1天后分析螢光素酶基因表達(dá)。結(jié)果表示為無miRNA靶序列插入的對(duì)照pFB的百分?jǐn)?shù)。(c)由桿狀病毒載體介導(dǎo)的體外螢光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)。用從2到50增加的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)1天后分析螢光素酶基因表達(dá)。BV-luc-mix9F的結(jié)果表示為BV-luc-ctrl的百分?jǐn)?shù)。(d)由桿狀病毒載體介導(dǎo)的螢光素酶轉(zhuǎn)基因在腦中的表達(dá)。在將BV-luc-ctrl或BV-luc-mix9F注射到小鼠腦的紋狀體中兩天后，采集腦組織用于螢光素酶活性測(cè)定。結(jié)果表示為每個(gè)腦的相對(duì)光單位(RLU)。柱:平均值(n=4)；棒SD。*:p<0.05。圖3=BV-HSVtk的選擇性細(xì)胞效應(yīng)。(a)在BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F轉(zhuǎn)導(dǎo)的人神經(jīng)元、星形細(xì)胞和U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及小鼠腦中HSVtk表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。(b)BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F轉(zhuǎn)導(dǎo)的人神經(jīng)元、星形細(xì)胞和U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞在GCV處理2天后的細(xì)胞生活力。(c)BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F注射的小鼠的腦切片的GFAP免疫染色顯示了將miRNA靶序列整合至桿狀病毒表達(dá)盒中對(duì)GFAP陽性星形細(xì)胞的保護(hù)。STR:紋狀體。(d)在BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F注射的小鼠腦中GFAP表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡顯示了將miRNA靶序列整合至桿狀病毒表達(dá)盒中對(duì)GFAP陽性星形細(xì)胞的保護(hù)。圖4=BV-HSVtk-Ctrl和BV-HSVtk_mix9F顯示出對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤相同的治療效果。(a)以BV-HSVtk-ctrl(右腦)和BV-HSVtk-mix9F(左腦)注射的兩只具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的代表性小鼠。在腫瘤接種7天后對(duì)腦中人U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物的每一個(gè)進(jìn)行單次桿狀病毒注射，然后進(jìn)行5天的腹膜內(nèi)GCV注射。示出了桿狀病毒/GCV注射0、2和5天后的生物發(fā)光圖像。腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光信號(hào)在GCV注射5天后降低至背景水平，但在PPS注射5天后保持不變。(b)對(duì)4只動(dòng)物的生物發(fā)光信號(hào)的定量分析。注意，生物發(fā)光信號(hào)在BV-HSVtk-mix9F注射的腫瘤異種移植物中的變化與在BV-HSVtk-ctrl注射的腫瘤異種移植物中的變化具有相同的趨勢(shì)。(c)腦切片的代表性圖片示出了U251異種移植物。左GCV注射5天后，僅在遠(yuǎn)離病毒注射位置的腦切片中發(fā)現(xiàn)了小腫瘤(箭頭)。右在未進(jìn)行GCV注射的對(duì)照中，發(fā)現(xiàn)了大且明顯的腫瘤塊，腫瘤已擴(kuò)散至腦室。具體實(shí)施例方式本文所述的核酸分子、表達(dá)載體、方法和應(yīng)用結(jié)合使用了組織特異性啟動(dòng)子和microRNA(miRNA)差異表達(dá)以優(yōu)先指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)。為開發(fā)本發(fā)明的核酸分子、表達(dá)載體、方法和應(yīng)用，使用了微陣列來確定在健康星形細(xì)胞和在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中的差異miRNA表達(dá)。在健康星形細(xì)胞中豐富但在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)的miRNA的miRNA靶位點(diǎn)與神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子一起用于使基因例如治療性轉(zhuǎn)基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中優(yōu)先表達(dá)，同時(shí)降低在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形細(xì)胞中的表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，miRNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類基因調(diào)節(jié)子，其是在植物和動(dòng)物中均參與基因表達(dá)下調(diào)的約19-25個(gè)核苷酸的豐富的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA。miRNA首先由RNA聚合酶II從不同基因組位置轉(zhuǎn)錄為一級(jí)miRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA含有折回形成特殊莖-環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾_環(huán)結(jié)構(gòu)域。所述發(fā)夾_環(huán)結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞核中由與一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合體的核酸內(nèi)切酶切割，釋放出約60-70個(gè)核苷酸的前體(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA被主動(dòng)地從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們被核糖核酸酶切割。切割產(chǎn)生19-M個(gè)核苷酸雙鏈體的成熟產(chǎn)物，其隨后由解螺旋酶解鏈。所述成熟miRNA非對(duì)稱地整合至被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的效應(yīng)復(fù)合體中，所述復(fù)合體對(duì)含有miRNA所靶向序列的基因負(fù)調(diào)節(jié)。在與mRNA堿基配對(duì)后，miRNA通過以下機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因抑制誘導(dǎo)脫腺苷化、分解靶mRNA，并且/或者通過抑制翻譯起始、阻斷延伸和/或降解新生肽抑制蛋白產(chǎn)生(Filipowiczetal.，2008)。大多數(shù)動(dòng)物miRNA結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄物的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中多個(gè)部分互補(bǔ)的位點(diǎn)。這種互補(bǔ)性通常限于成熟miRNA序列5’端的前2-8堿基。靶mRNA的命運(yùn)由miRNA與其靶標(biāo)之間的堿基配對(duì)程度決定。miRNA與其靶標(biāo)的3’UTR之間完美或接近完美的互補(bǔ)會(huì)導(dǎo)致RISC誘導(dǎo)的mRNA切割，而不完美堿基匹配主要導(dǎo)致靶標(biāo)的翻譯沉默，對(duì)mRNA水平無大影響。到目前為止，已在人基因組中鑒定了約540個(gè)miRNA基因(http//microrna.sanger.ac.uk)。這些miRNA調(diào)節(jié)人基因組中全部蛋白編碼基因的10-30%(Johnetal.，2004；Lewisetal.，200。單種miRNA可能調(diào)節(jié)100-200種基因，每種基因可被多種miRNA所靶向，表明miRNA與其靶標(biāo)之間的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(Johnetal.,2004；Lewisetal.,2005)。鑒定miRNA的組織表達(dá)模式和這些小RNA在器官發(fā)育中的作用的研究已經(jīng)完成。已發(fā)現(xiàn)一些miRNA在人體中廣泛表達(dá)，而其他則以發(fā)育階段、組織或細(xì)胞類型特異的方式顯示出受限制的表達(dá)。miRNA幾乎控制到目前為止研究過的每個(gè)細(xì)胞過程，包括增殖、干細(xì)胞分裂、發(fā)育時(shí)控(developmentaltiming)、凋亡、分化和代謝(Bushati&Cohem，2007；Kloosterman&Plasterk,2007)。腦表達(dá)最大比例的組織特異性miRNA，逐漸增加的證據(jù)顯示了腦中的廣泛轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，并且已證明了腦特異性miRNA在控制神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性和可能的長時(shí)程記憶存儲(chǔ)中的調(diào)節(jié)作用(Krichevskyetal.,2003；Babaketal.,2004；Sempereetal.，2004)。因此，在腦中miRNA表達(dá)受損可導(dǎo)致分化的喪失(或去分化)，從而導(dǎo)致腦腫瘤的發(fā)生(Esquela-KerscherandSlack,2006；Rosenfeldetal.,2008)在腫瘤組織中，miRNA表達(dá)譜可提供人癌癥分類的信息，大多數(shù)miRNA在原發(fā)性腫瘤組織和癌細(xì)胞株中相比于在正常組織中是下調(diào)的(Luetal.，200。與miRNA表達(dá)與分化緊密聯(lián)系的觀念一致，分化程度低的腫瘤具有較低的miRNA表達(dá)的總水平，并且miRNA的總表達(dá)隨著腫瘤細(xì)胞的分化而增力口(Luetal.，2005)。數(shù)項(xiàng)研究已使用報(bào)告物系統(tǒng)來原位追蹤miRNA表達(dá)(Mansfieldetal.,2004；Zhaoetal.，200，然而，對(duì)miRNA介導(dǎo)的抑制的程度和魯棒性檢查得較少。Brown及其同事最近的研究證明，內(nèi)源性miRNA可廣泛地用于在不同細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Brownetal.，2006；2007)。然而，miRNA調(diào)節(jié)的多重性和協(xié)同性對(duì)選擇嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的內(nèi)源性miRNA提出了很大的挑戰(zhàn)。本發(fā)明的核酸分子、表達(dá)載體、方法和應(yīng)用基于如下觀念使用組織特異性啟動(dòng)子可增加優(yōu)先在特定類型的組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而另外使用miRNA調(diào)節(jié)將提供使轉(zhuǎn)基因在相同譜系的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞間差異表達(dá)的另一層控制。在miRNA有活性的細(xì)胞中，miRNA活性可導(dǎo)致基因表達(dá)的脫靶向，而非靶向。此機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平起作用并提供一種克服使用組織特異性啟動(dòng)子的現(xiàn)有基因遞送系統(tǒng)的局限性的方法，包括減少由于插入的位置效應(yīng)和/或組織特異性啟動(dòng)子的不完美重構(gòu)而導(dǎo)致的脫靶表達(dá)。通過阻止在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)同時(shí)允許在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的高水平表達(dá)，在本發(fā)明核酸分子、表達(dá)載體、方法和應(yīng)用中使用的miRNA調(diào)節(jié)和組織特異性啟動(dòng)子控制的結(jié)合可用于增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中基因表達(dá)的效力和特異性。因此，本發(fā)明所述的核酸分子(包括表達(dá)載體)可用于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中指導(dǎo)基因表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了一種核酸分子，其包含一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)特異性的啟動(dòng)子、一段轉(zhuǎn)基因編碼序列和多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)。所述miRNA靶位點(diǎn)的每一個(gè)均能夠結(jié)合一個(gè)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)的miRNA。所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性的啟動(dòng)子和所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均可操作地連接于所述轉(zhuǎn)基因編碼序列，從而調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。本文使用的“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞”或“神經(jīng)膠質(zhì)”是指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的一種或多種非神經(jīng)元細(xì)胞，它們用作神經(jīng)元細(xì)胞的支持物，不傳導(dǎo)電脈沖，并且在神經(jīng)組織的修復(fù)和再生中起作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞，其是星形的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并且可為纖維性星形細(xì)胞或原漿性星形細(xì)胞。原漿性星形細(xì)胞主要見于灰質(zhì)，而纖維性星形細(xì)胞主要存在于大腦和脊髓的白質(zhì)中。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞還包括小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞(在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中)或許旺細(xì)胞(khwarmcell)(在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中)?！霸从谏窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞”是指從包括星形細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生、發(fā)源或分化的細(xì)胞，包括贅生性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星形細(xì)胞瘤一包括低級(jí)別和高級(jí)別星形細(xì)胞瘤)，并且可為任何這類細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞、大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞?！罢！鄙窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一包括正常星形細(xì)胞，是指與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對(duì)的非癌性、非腫瘤性、未轉(zhuǎn)化的并且非贅生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。除非另有指明，否則在上下文允許的情況下，術(shù)語“一個(gè)細(xì)胞”或“多個(gè)細(xì)胞”是指單個(gè)細(xì)胞，以及多個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞生長物、細(xì)胞群或細(xì)胞系，并且可在體外或體內(nèi)。體外細(xì)胞包括從受試者體內(nèi)移出的離體細(xì)胞。類似地，除非另有指明，否則在上下文允許的情況下，提及“多個(gè)細(xì)胞”還包括提及單個(gè)細(xì)胞。應(yīng)理解，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)是位于基因編碼序列上游的核苷酸序列，該序列至少包含指導(dǎo)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄必需的最小必要DNA元件，并且通常包括一個(gè)指引RNA聚合酶至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)。啟動(dòng)子(包括天然啟動(dòng)子)可包括例如包含TATA盒和起始序列的核心啟動(dòng)子區(qū)，還可包括包含所述核心啟動(dòng)子之外的近側(cè)啟動(dòng)子元件的調(diào)節(jié)區(qū)，所述調(diào)節(jié)區(qū)的作用是增強(qiáng)或調(diào)節(jié)所述核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平，包括通常與給定啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)的增強(qiáng)子元件?！吧窠?jīng)膠質(zhì)”描述的物質(zhì)是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)或者包含神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。類似地，“星形膠質(zhì)”描述的物質(zhì)是星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞、與星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞相關(guān)或者包含星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞。術(shù)語“神經(jīng)膠質(zhì)特異性的”指的物質(zhì)或活性是存在于或出現(xiàn)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中，但不存在于或出現(xiàn)于或者基本不存在于或出現(xiàn)于非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或非源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞，例如神經(jīng)元細(xì)胞或不存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。。所述核酸分子包括神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子。神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子是控制這樣的基因表達(dá)的啟動(dòng)子，即所述基因僅在或主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞一包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形細(xì)胞一中表達(dá)。神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子指導(dǎo)基因在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中的表達(dá)，但基本不指導(dǎo)同一基因在其他細(xì)胞類型例如神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)，因此具有神經(jīng)膠質(zhì)特異性轉(zhuǎn)錄活性。在某些情況下，在其他細(xì)胞類型中可存在一些低水平表達(dá)，但這種表達(dá)基本比在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的低，例如為在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)的不足約1%，或者為約1%、2%、3%、5%、10%、15%或20%。這類啟動(dòng)子可為強(qiáng)啟動(dòng)子或可為弱啟動(dòng)子，其可指導(dǎo)基因在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中的組成型表達(dá)，或者其可指導(dǎo)響應(yīng)某些條件、信號(hào)或細(xì)胞事件的表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子可為需要特定配體、小分子、轉(zhuǎn)錄因子或激素蛋白以引起自所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可為雜合啟動(dòng)子，含有來自天然神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子的元件和來自另一啟動(dòng)子一例如病毒啟動(dòng)子一的元件例如人巨細(xì)胞病毒即刻早期基因的增強(qiáng)子元件。應(yīng)理解的是，使用的任何雜合啟動(dòng)子均應(yīng)保留神經(jīng)膠質(zhì)特異性。在某些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子包括JC病毒早期啟動(dòng)子(Kim，S.Y.，etal.，JVirol.(2003)77:3394-401)、髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子(Wei,Q.，etal.，Gene.(2003)313:161-7)或SlOOβ啟動(dòng)子(Namihira,M.，etal.，F(xiàn)EBSLett.(2004)572184-8)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子包括膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)基因的啟動(dòng)子區(qū)，其是星形細(xì)胞和源于星形細(xì)胞的細(xì)胞特異的。所述GFAP啟動(dòng)子可為指導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白表達(dá)的任何啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，所述GFAP啟動(dòng)子包含位于人GFAP基因側(cè)翼的2.21Λ5’端區(qū)。GFAP是一種中間絲蛋白，僅在神經(jīng)膠質(zhì)源的細(xì)胞中表達(dá)(Eng，1985)。此蛋白已被用作星形細(xì)胞惡性腫瘤的病理標(biāo)記物(Rutkaetal.，1997)。盡管因GFAP啟動(dòng)子的超甲基化而使GFAP蛋白在許多多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤中檢測(cè)不到，然而在基因轉(zhuǎn)移載體中的啟動(dòng)子在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是有活性的(Condorellietal.,1994；Fukuyamaetal.，1996)。因此，已對(duì)GFAP啟動(dòng)子在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的選擇性轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行了廣泛的測(cè)試(Chenetal.，1998；McKieetal.，1998；Wangetal.，2006；Horstetal.,2007)在具體實(shí)施方案中，所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子區(qū)包含人GFAP啟動(dòng)子或大鼠GFAP啟動(dòng)子的序列，或者基本由所述序列構(gòu)成，或者由所述序列構(gòu)成，所述序列如下所示人GFAP啟動(dòng)子[SEQIDNO1]GTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGTAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCAGAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACAGGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACGGAGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGCCAGCACAGCCAGCTCATGCGTAACGGCTTTGTGGAGCTGTCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAGGAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGATAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACCTCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGCTGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAATGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGACTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGGTGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAATTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCCTGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATCTGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCACTCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTATTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAGAGAGGGTCCTCTTGATTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTCTGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAGGAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGCTATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTCTAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGCAGAGCCAGAGCAT大鼠GFAP啟動(dòng)子[SEQIDNO2]CCTGCAGGGCCCACTAGTCTGTAAGCTGGAAGTCTGGCAGTGCTGAGCTGGCCAACCCCCTCAGGACCTCCTCCTTGTGCCCACTGAATGACTCACCTTGGCATAGACATAATGGTCAGGGGCGGGCACACAGCCTGATTCCCGCTGCACTCCAGGCCCCCTTCAATGCTTTCCGAGAAGTCCATTGAGCTGGGAGCTTGTACTGCACCAAGGGCTGACATCCTGGCAGCCAGGGATGAAAGCAGCCCATGGGGCTACCCTTGCCGTATGCCTCACTGGCGGCAGAGAACAAGGCTCTATTCAGCAAATGCCCTGGAGTAGACACCAGAAGTCCAAGCATGGGCAGAGGAAGGCAGGCGTTGGGGGCTGGAGGGGAGCAGAGCTGTCTGTTTTCCAGAAGCCCAAGGGTACAGATGGCGCCTGGGGGGGAACTGAGTGGAGGGGATAGATGGGCCTGAGATCTCAAACATCAACAGCCTCCTCCCCACCAACGATGAAGGTGGAGGTTGGTTTCCCAGACCTACATATCCCCCAGAGACCTGGTGTATGAAAATTCAAAGGAGGTAAGTCTCCTGAGAGAACGGGGGGCTCACAAATGAAGCCAGCTGTCTTACCCTATCAGGACCTACGTGCATTCCTTCTGTCCTGCCCCCTAAACACACAGCCAGAGGCTCAAATTGATTCTGGAGTCACAAAGGGGGCTTGAAACCCCAGCCCCCCACTCCTGAACTCCAGGAATGAGAAGATAGTATTGGAGGGGTTCAGAGGAGAGGGCTCTGCACATCTGTTGAGAATGGGGGTCCCAGGAGAGTGTAATTTAGGCTGATCCCGGAGGAAGGGAATAGGCTCTTCAAGATCCTAGCATCTCACAGGCCCACAGAGAAGTTCAGAGTTGGGGCAGCCCTGGCTTACAGGCTCTAAGAACTGGAGGCAGTTTACCCAACCCAGCTGTGTGCATGCTGTCCCTCTCTCTGTCTCTGTCTGTCTCTCTCTGTCTCTGTCTCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGCTCACACACGTGTGTGTTTATCACACAAATGTTCATGTGTGTGTACATACATGTGTTGAGGCCAGAGGTCAACCTCAGACACTGTTGACTTGGTTGTATGAGATAACATTTCCCCCTGGGACCTGGGATTTGCCAATTAGTGTGACCCAGGAAGCCTACTTATTTTCATTCCTCAGCACTGCAGTTACAAGTATGCACTGTCAAACCAGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAACCAGGCCTTTTGTATTCGCTCTGTGGCTAGAACTTGGGTCTCCATGCTTGACAGGCAAGCGATTTATGGACTAAGCTGTTTCCTCGGCCCTCTCTTGACCCATTTACCAGAAATGGGGTTTCCTTGATCAATGGTTAAGCCAGGCTGGTGTTCCCAGGAAACCCTTGACTCTGGGTACAGTGACCTTGGTGGGGTGAGAAGAGTTCTCTCCATAGCTGGGCTGGGGCCCAGCTCCACCCCCTCAGGCTATTCAATGGGGTGCTGCCAGGAAGTCAGGGGCAGATCCAGTCCAGCCCGTCCCTCAATAAAGGCCCTGACATCCCAGGAGCCAGCAGAAGCAGGGCAT本文使用的“基本由......構(gòu)成”是指核酸序列在所述序列內(nèi)或在所述序列的一端或兩端包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基，但是這些額外的核苷酸堿基在實(shí)質(zhì)上不影響所述核酸序列的功能。除細(xì)胞類型特異性以外，治療基因的高水平表達(dá)對(duì)于癌癥治療通常是需要的。與其他細(xì)胞啟動(dòng)子相比，GFAP啟動(dòng)子具有相當(dāng)強(qiáng)的活性，能夠驅(qū)動(dòng)構(gòu)成總腦蛋白最多至約0.2%的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Smithetal.,NeurobiolAging.(1998)Sep-Oct；19(5):407-13)。所述核酸分子還含有多個(gè)miRNA靶序列?！癿iRNA靶序列”是為miRNA分子(包括整合至RISC中的miRNA分子)所識(shí)別并能夠結(jié)合所述miRNA分子的核酸序列。在基因的3’UTR中插入miRNA靶序列可導(dǎo)致為包含結(jié)合所述靶序列的miRNA的RISC所識(shí)別和結(jié)合；并可最終導(dǎo)致該基因的表達(dá)下降，包括該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯下降。miRNA靶序列能夠結(jié)合miRNA，意味著所述靶序列與所述miRNA序列至少部分互補(bǔ)，并且能夠據(jù)濃度、細(xì)胞環(huán)境、環(huán)境條件和其他結(jié)合分子的存在為所述miRNA所識(shí)別并可結(jié)合于所述miRNA。類似的，提及“用于結(jié)合”miRNA或“結(jié)合”miRNA的miRNA靶序列是指所述靶序列能夠結(jié)合所述miRNA，但并非意味著所述靶序列必須在任何給定時(shí)間均為結(jié)合的miRNA或RISC所占據(jù)。所述多個(gè)miRNA靶序列中包含的每個(gè)miRNA靶序列均基于miRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的相對(duì)水平進(jìn)行選擇。靶序列的選擇針對(duì)的是在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中相比于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中豐富、從而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中相對(duì)下調(diào)的miRNA。例如，所述miRNA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的水平可為在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多或約10倍或更^^οmiRNA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的水平可使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法(包括RNA定量技術(shù)例如RNA微陣列方法)來評(píng)估。也可使用評(píng)估m(xù)iRNA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的活性的方法，例如測(cè)定給定miRNA沉默包含合適的miRNA靶序列的報(bào)告基因的能力的方法。這些用于評(píng)估m(xù)iRNA水平的技術(shù)的實(shí)例包括在下面實(shí)施例中描述的那些。適合在核酸分子中使用的miRNA的靶序列包括has_miR-31、has-miR-127或has-miR-143的靶序列。在具體實(shí)施方案中，每個(gè)miRNA靶序列包含has_miR-31、has-miR-127或has-miR-143，或者基本由這些序列構(gòu)成，或者由這些序列構(gòu)成，這些序列如下所示Has-miR-31[SEQIDNO3]CAGCTATGCCAGCATCTTGCCHas-miR-127[SEQIDNO4]:AGCCAAGCTCAGACGGATCCGAHas-miR-143[SEQIDNO:5]TGAGCTACAGTGCTTCATCTCA所述多個(gè)miRNA靶序列內(nèi)的每個(gè)miRNA靶序列與另一個(gè)miRNA靶序列均可相同或不同。在某一實(shí)施方案中，每個(gè)miRNA靶序列均為相同的靶序列。在另一實(shí)施方案中，每個(gè)miRNA靶序列均為不同的靶序列。在另一實(shí)施方案中，所述多個(gè)靶序列包含多于一種不同的靶序列，但各個(gè)(individual)miRNA靶序列中的至少兩個(gè)是相同的。所述核酸分子包含多個(gè)miRNA靶序列。所述多個(gè)miRNA靶序列中的各個(gè)miRNA靶序列的數(shù)目為足以使轉(zhuǎn)基因在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)但同時(shí)可使所述轉(zhuǎn)基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)目。例如，所述多個(gè)miRNA靶序列可為2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)或者10個(gè)或更多個(gè)各個(gè)miRNA靶序列。在某些實(shí)施方案中，所述多個(gè)miRNA靶序列包含3個(gè)靶序列、6個(gè)靶序列或9個(gè)靶序列。在具體實(shí)施方案中，所述多個(gè)miRNA靶序列包含has_miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各一個(gè)；或者包含3個(gè)靶序列，其中全部3個(gè)均為has-miR-31、has-miR-127或has-miR-143的靶序列。在其他實(shí)施方案中，所述多個(gè)miRNA靶序列包含has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各1個(gè)，重復(fù)2次總計(jì)6個(gè)靶序列；或者包含has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各1個(gè)，重復(fù)3次總計(jì)9個(gè)靶序列。不囿于任何具體理論的，觀察到的miRNA的抑制水平可隨著靶序列數(shù)目的增加而增加，暗示mRNA中miRNA靶位點(diǎn)的數(shù)目可影響轉(zhuǎn)基因抑制的水平，這可能是由于單個(gè)必需結(jié)合事件發(fā)生的可能性提高的結(jié)果。同樣，已證明靶mRNA的抑制通過不同miRNA種類的組合作用實(shí)現(xiàn)(BartelandChen，2004)，并且在下面實(shí)施例部分中陳述的本發(fā)明結(jié)果表明，不同miRNA可共同作用以降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)。盡管在動(dòng)物中只知曉少數(shù)幾個(gè)miRNA:mRNA相互作用對(duì)，然而已有實(shí)例發(fā)現(xiàn)不同miRNA種類調(diào)節(jié)可相同靶標(biāo)(BartelandChen，2004)，例如miRNAlin-4和let-7及其靶mRNAlin-14、lin-28、lin-41和hbl-1(Reinhartetal.，2000；Abrahanteetal.，2003；Linetal.，2003；Sempereetal.，2004)。沉默復(fù)合體可相互穩(wěn)定，或者共同相互作用以更有效地抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，或者這兩種機(jī)制可同時(shí)起作用(Doenchetal.，200。這些實(shí)例，與其他生物調(diào)節(jié)系統(tǒng)一樣，最顯著的是，基因調(diào)節(jié)的共同相互作用可通過調(diào)節(jié)不同miRNA與mRNA的3’UTR結(jié)合的程度使得細(xì)胞微調(diào)mRNA的表達(dá)(BartelandChen，2004)。miRNA調(diào)節(jié)的這種性質(zhì)可有利地用于本發(fā)明所述的核酸分子以增強(qiáng)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抑制。在所述核酸分子內(nèi)的所述miRNA靶序列可由接頭序列相互隔開。例如，可在所述多個(gè)miRNA靶序列內(nèi)的每個(gè)miRNA靶序列之間插入2、4、6、8、10或更多個(gè)核苷酸堿基。如上所述，所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和多個(gè)miRNA靶序列可操作地連接于轉(zhuǎn)基因編碼序列。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)核酸序列和第二個(gè)核酸序列處于功能關(guān)系中時(shí)，第一個(gè)核酸序列就與第二個(gè)核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動(dòng)子激活編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么所述編碼序列就與所述啟動(dòng)子可操作地連接。在另一實(shí)例中，如果調(diào)節(jié)序列例如miRNA靶序列一包括在與其他順式或反式作用因子例如RISC合作的情況下一能夠調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)，那么所述調(diào)節(jié)序列就與所述編碼序列可操作地連接。因此，所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄至少部分地受到神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)基因的翻譯至少部分地受到結(jié)合于miRNA靶序列的miRNA的調(diào)節(jié)。這種安排降低了所述轉(zhuǎn)基因在非神經(jīng)膠質(zhì)源的細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)所述miRNA控制降低了所述轉(zhuǎn)基因在相關(guān)miRNA相對(duì)豐富的正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。所述轉(zhuǎn)基因可為任何需要在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，例如為了診斷、檢測(cè)或治療。所述轉(zhuǎn)基因可編碼任何在臨床上有用的表達(dá)產(chǎn)物，例如參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)防或治療的基因產(chǎn)物或蛋白，或者具有涉及神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)防或治療的調(diào)節(jié)作用的基因產(chǎn)物或蛋白。所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可為蛋白或肽。在某些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物直接靶向腫瘤細(xì)胞生長或存活所需的特定基因的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括治療蛋白或肽。所述治療蛋白或肽可以替代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有缺陷或缺失的基因產(chǎn)物、蛋白或細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，從而能夠殺死神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或者預(yù)防或治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌。治療蛋白或肽包括導(dǎo)致被轉(zhuǎn)染或感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞被直接殺死的基因產(chǎn)物(包括HSV-tk，細(xì)胞毒素，腫瘤抑制蛋白例如p53、p51或p71，凋亡誘導(dǎo)物)、免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如IL-2、IL-4、IL-12、IFN和TNF-α)、血管生成抑制蛋白、腫瘤抑制蛋白、自殺蛋白、凋亡蛋白、抗血管生成蛋白和抗體(包括抗體的功能片段)。所述治療蛋白還可為細(xì)菌DT-A蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述治療蛋白包括ρ53蛋白或ρ53蛋白凋亡通路中的蛋白(“Ρ53通路蛋白”)，所述蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停止或凋亡。Ρ53通路蛋白是處于ρ53凋亡通路中的參與在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)或誘導(dǎo)凋亡的蛋白，并可在Ρ53凋亡通路中處于ρ53的上游或下游。例如，所述ρ53通路蛋白可為激活Ρ53的蛋白、調(diào)節(jié)ρ53活性或表達(dá)的蛋白、為ρ53所激活的蛋白或因ρ53激活而表達(dá)的蛋白以及參與與Ρ53激活有關(guān)的凋亡反應(yīng)的蛋白。野生型ρ53基因的過表達(dá)是一種通過凋亡抑制腫瘤細(xì)胞生長或促進(jìn)所述細(xì)胞死亡的方法，該方法基于如下結(jié)果許多腫瘤的不受控制生長至少部分是由于Ρ53基因的丟失或突變導(dǎo)致的。當(dāng)與放療和化療結(jié)合使用時(shí)，恢復(fù)正常野生型Ρ53功能還可增強(qiáng)這些療法的凋亡作用。已對(duì)數(shù)個(gè)病毒載體測(cè)試了Ρ53基因遞送。一項(xiàng)研究報(bào)告了攜帶在CMV啟動(dòng)子控制之下的Ρ53基因的桿狀病毒載體殺死&10S-2腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用(Songetal.,ExpMolMed.(2001)Mar31；33(1):46-53)。在另一具體實(shí)施方案中，所述治療蛋白為DT-A蛋白。在細(xì)胞類型或腫瘤特異性啟動(dòng)子的控制之下，已在癌癥療法中對(duì)DT-A基因進(jìn)行了測(cè)試(Massuda，Ε.S.，etal.ProcNatlAcadSciUSA(1997)9414701-6)。這種細(xì)菌蛋白在引入到真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中時(shí)具有很高的毒性，并且通過催化細(xì)胞延伸因子2的白喉酰胺部分的ADP核糖基化抑制蛋白合成，并且通過凋亡通路殺死細(xì)胞(Michl，P.andGress，Τ.Μ.CurrCancerDrugTargets(2004)4:689-702)。在另一具體實(shí)施方案中，所述治療蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)。所述胸苷激酶將無毒前藥更昔洛韋(ganciclovir)轉(zhuǎn)化為一種對(duì)細(xì)胞有毒的化合物。因此，先表達(dá)胸苷激酶，再進(jìn)行更昔洛韋治療，是一種現(xiàn)行的用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的方法。包含均可操作地連接于轉(zhuǎn)基因編碼序列的神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子序列和多個(gè)miRNA靴序列的上述核酸分子可使用例如在Sambrooketal.(2001)MolecularCloningaLaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarbourLaboratoryPress中^的*令^已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和分子克隆技術(shù)合成。為了用于可支持從神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的合適表達(dá)系統(tǒng)中，可將所述核酸分子插入用于遞送至表達(dá)系統(tǒng)并在其中穩(wěn)定的表達(dá)載體。例如，所述核酸分子可包括在質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA、病毒或核酸片段中。因此，提供了包含本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體。如上所述，所述表達(dá)載體可為質(zhì)粒、包括人工染色體的染色體、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA、病毒或核酸片段。在某些實(shí)施方案中，所提供的表達(dá)載體是一種病毒載體。桿狀病毒載體特別適合在神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特別是星形細(xì)胞和源于星形細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。桿狀病毒感染不會(huì)導(dǎo)致其自身基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或在其中進(jìn)行病毒復(fù)制(Carbonelletal.,JVirol.(1985)Oct；56(1):153-60；Hofmannetal.,ProcNatlAcadSciUSA(1995)92:10099-10103；Stanbridgeetal.，JBiomedBiotechnol.(2003)2003(2):79-91)。因此，即使病毒的某些序列可作為轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子起作用，它們也會(huì)因缺少支持因子而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沉默，并且不太可能影響插入到桿狀病毒載體中的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的細(xì)胞類型特異性。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述病毒載體是桿狀病毒苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)0基于AcMNPV的載體作為新一代的基因遞送載體出現(xiàn)(Hofmarmetal.，(1995)，見上文；Boyceetal.，ProcNatlAcadSciUSA(1996)93:2348-2352；Sarkisetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.(2000)97:14638-43；Ghoshetal.，MolTher(2002)6:5-11；KostandCondreay,TrendsBiotechnol(2002)20:173-180；KostΤΑ,etal.,NatBiotechnol.(2005)23567-75)。桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能有效地復(fù)制和表達(dá)病毒蛋白，這意味著這些病毒可進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞但不在其中復(fù)制，因此顯著降低了哺乳動(dòng)物中業(yè)已存在的抗病毒體液和細(xì)胞免疫的可能性。使AcMNPV作為基因遞送載體的選擇具有吸引力的其他固有優(yōu)點(diǎn)包括對(duì)增殖和非增殖細(xì)胞的廣泛向性、無明顯細(xì)胞病變效應(yīng)、高克隆能力以及容易制備高效價(jià)病毒。當(dāng)作為系統(tǒng)遞送的基因載體使用時(shí)，桿狀病毒在暴露于血清補(bǔ)體后容易失活(Hofmannetal.，GeneTher(1998)5:531-536)。受血腦屏障(BBB)保護(hù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)實(shí)際上是與包括補(bǔ)體組分在內(nèi)的循環(huán)免疫因子隔離的(CarsonandSutcliffe,JNeurosciRes(1999)55:1_8)，用作桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)的合適器官。向腦中直接注射桿狀病毒載體一使用細(xì)針和慢注射速度以避免出血一通常可獲得器官中滿意水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Sarkisetal.，(2000)，見上文；Lietal.，MolTher.(2004)10:1121-9；Lietal.ExpPhysiol.O005)90:39-44)。具有吸引力的是，桿狀病毒表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的高向性(Sarkisetal.,(2000)，見上文)。以前使用Cy3標(biāo)記的桿狀病毒的研究證明了紋狀體中約70%的病毒感染細(xì)胞為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Lietal.,(2004)，見上文)。由于該因子與本發(fā)明核酸分子一其整合一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相對(duì)在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)的相關(guān)miRNA的靶序列一的結(jié)合，所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)會(huì)主要被限制于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，藉此使對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有重要功能的健康細(xì)胞的可能副作用最小化，否則所述副作用可能被外源基因的表達(dá)誘發(fā)。主要被限制于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是指在如上所述的非神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)基本更低。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用已知的分子生物學(xué)和克隆技術(shù)構(gòu)建合適的表達(dá)載體，包括病毒載體特別是桿狀病毒載體，并且能夠測(cè)試所構(gòu)建的載體將所述核酸分子遞送至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。類似地，技術(shù)人員能夠使用常規(guī)測(cè)試一例如通過在不同細(xì)胞類型中使用不同載體構(gòu)建體來監(jiān)測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)一確定具體病毒載體是否影響從本發(fā)明雜合啟動(dòng)子表達(dá)的細(xì)胞特異性。特別地，桿狀病毒是眾所周知并良好表征的，并且桿狀病毒載體用于哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)染包括應(yīng)用苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)也是已知的(參見例如Sarkis，C.etal.(2000)ProcNatlAcadSci97(26)14638-43)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地構(gòu)建任何合適的桿狀病毒載體用于本發(fā)明?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如PCR和分子克隆技術(shù)改造所述桿狀病毒。例如，可使用市售的克隆和表達(dá)系統(tǒng)例如Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(GibcoBRL,LifeTechnologies,USA)容易地改造桿狀病毒。所述核酸分子一包括在整合至合適表達(dá)載體時(shí)一可用于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞例如星形細(xì)胞瘤細(xì)胞或者源于神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的組織培養(yǎng)系中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。因此，本發(fā)明提供了一種在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法。用所述核酸分子例如包含上述核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法取決于要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的性質(zhì)、培養(yǎng)或培育要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的方法以及要使用的具體表達(dá)載體。所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可為任何神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，包括星形細(xì)胞瘤細(xì)胞、贅生性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腫瘤性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可為體外細(xì)胞包括從受試者體內(nèi)移出的離體細(xì)胞，或者可為受試者體內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。用核酸分子轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法是已知的，包括使用載體分子例如脂質(zhì)體、陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)和磷酸鈣的轉(zhuǎn)染，通過顯微注射、無針注射、電穿孔和使用裸DNA的轉(zhuǎn)染。當(dāng)所述表達(dá)載體為病毒載體時(shí)，所述轉(zhuǎn)染可通過在可使細(xì)胞被病毒轉(zhuǎn)染的條件下，使所述細(xì)胞暴露于含有具體病毒表達(dá)載體DNA的病毒顆粒而實(shí)現(xiàn)，所述暴露例如向培養(yǎng)基中加入活病毒或使所述活病毒接觸細(xì)胞外部。在用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，在允許從所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子表達(dá)的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述條件包括任何從所用具體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞信號(hào)的存在。例如，如果所述啟動(dòng)子是一種需要通常不在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白或特定細(xì)胞蛋白的雜合啟動(dòng)子，那么就應(yīng)在生長培養(yǎng)基中提供或在所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)這一生長因子或蛋白，例如通過使編碼這一因子的基因包括在表達(dá)載體中但處在不需這一因子的啟動(dòng)子的控制下。在另一實(shí)施方案中，提供了一種治療受試者體內(nèi)可能為星形細(xì)胞瘤的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方法?！爸委煛笔侵斧@得益處或所需結(jié)果包括臨床結(jié)果的方法。益處或所需臨床結(jié)果可包括但不限于一個(gè)或多個(gè)癥狀或病況的減輕或改善、疾病程度的減輕、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定、疾病發(fā)生的預(yù)防、疾病擴(kuò)散的預(yù)防、疾病進(jìn)展的延緩或減慢、疾病發(fā)作的延緩或減慢、疾病狀態(tài)的改善或減輕，以及緩解(部分或全部)?！爸委煛边€可指相對(duì)不進(jìn)行治療的預(yù)期存活時(shí)間延長患者的存活時(shí)間?！爸委煛边€可指抑制疾病的進(jìn)展、暫時(shí)減慢疾病的進(jìn)展，但更優(yōu)選參與永久性停止疾病的進(jìn)展。所述方法包括對(duì)受試者給予上述核酸分子，例如插入表達(dá)載體中的核酸分子。所述受試者是需要這種治療的任何受試者，包括哺乳動(dòng)物特別是人受試者。將所述核酸分子引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的方法是已知的，并可用于對(duì)受試者給予本發(fā)明的核酸分子例如表達(dá)載體以治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤?？墒褂美缫韵路椒▽⒈景l(fā)明的核酸遞送至受試者體內(nèi)的細(xì)胞DNA直接注射、受體介導(dǎo)的DNA攝取、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或非病毒轉(zhuǎn)染以及基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染，其中所有這些方法均可包括使用本文所述的表達(dá)載體?？墒褂脤NA注射到體內(nèi)細(xì)胞中的遞送裝置(例如“基因槍”)。這種裝置可市售獲得(例如自BioRad)。為將所述核酸分子特異性地遞送至腦部具體區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星狀細(xì)胞瘤細(xì)胞，可通過注射(包括本領(lǐng)域已知的立體定位顯微注射)給予所述核酸分子，特別是病毒表達(dá)載體。對(duì)于人患者，可將立體定位基架固定在顱骨內(nèi)，然后使用高分辨率MRI對(duì)帶有所述立體定位基架的腦部成像。使用合適的立體定位軟件，將所述圖像翻譯為適合用于載體DNA靶向注射的所述立體定位框架的三維坐標(biāo)。可以以足以獲得所需結(jié)果例如轉(zhuǎn)基因在靶細(xì)胞中表達(dá)的量給予所述核酸分子。例如，可以以對(duì)表達(dá)足夠量的治療產(chǎn)物必需的量和劑量給予所述核酸分子，所述治療產(chǎn)物的功能是用于緩解神經(jīng)膠質(zhì)瘤、改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤、減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘤、改良神經(jīng)膠質(zhì)瘤、穩(wěn)定神經(jīng)膠質(zhì)瘤、抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤、預(yù)防神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括預(yù)防神經(jīng)膠質(zhì)瘤的擴(kuò)散、減慢或延緩神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，或者治愈神經(jīng)膠質(zhì)瘤。要給予患者的有效量可根據(jù)許多因素而變化，所述因素例如核酸分子的藥效學(xué)性質(zhì)，給藥模式，受試者的年齡、健康和體重，病況或疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度，治療頻率以及，如果有的話，并存治療的類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于上述因素確定合適的量?？墒紫纫院线m的量給予所述核酸分子，所述合適的量可以根據(jù)患者的臨床反應(yīng)按照需要進(jìn)行調(diào)整。核酸分子的有效量可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)并根據(jù)所述核酸分子可安全給藥的最大量來確定。當(dāng)所述核酸分子構(gòu)成病毒表達(dá)載體時(shí)，所述病毒的毒力和效價(jià)將是確定所述有效量的一個(gè)因素。具體地，當(dāng)所述核酸分子以桿狀病毒的形式存在時(shí)，由于桿狀病毒在脊椎動(dòng)物中只有很小或沒有細(xì)胞毒性，因此可耐受較大劑量。然而，所給予的桿狀病毒的量應(yīng)為獲得所需結(jié)果的最小量。在多個(gè)實(shí)施方案中，將對(duì)人患者給予劑量為約IO9空斑形成單位(“pfu”)的本文所述的桿狀病毒。在其他實(shí)施方案中，可在單劑中給予約IO2到約IO9Pfiu約IO6到約Kfpfu、約IO5到約107pfu或約IO5到約IO6Pfu0可根據(jù)初始治療方案的效果多次給予有效量的桿狀病毒。給藥通常周期地進(jìn)行，同時(shí)監(jiān)測(cè)任何反應(yīng)。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可根據(jù)選擇的給藥計(jì)劃和途徑，給予較上述劑量更低或更高的劑量。所述核酸分子可作為唯一療法給藥，或者可結(jié)合其他療法(包括化療、放療或其他基因治療)給藥。例如，所述核酸分子可在手術(shù)去除原發(fā)腫瘤之前或之后，或者在治療例如給予放療或常規(guī)化療藥物之前、同時(shí)或之后給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可共同地或以序貫的方式給予所述核酸分子和一種溶瘤病毒，該溶瘤病毒誘導(dǎo)被該病毒感染的細(xì)胞的溶解。本發(fā)明還考慮本文所述的多種核酸分子構(gòu)建體用于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，以及用于治療受試者的神經(jīng)細(xì)胞瘤的應(yīng)用。還考慮本文所述的多種核酸分子構(gòu)建體用于制備治療受試者的神經(jīng)細(xì)胞瘤的藥物的應(yīng)用。還考慮包含本發(fā)明核酸分子或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。為利于給藥，可將所述核酸分子或表達(dá)載體制劑成藥物組合物的成分。所述組合物可常規(guī)地含有可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和多種相容的載體或稀釋劑。對(duì)于所有形式的遞送，均可將所述核酸分子或表達(dá)載體配制在生理鹽水中。所述可藥用稀釋劑的比例和對(duì)其的認(rèn)同(identity)通過以下因素確定所選擇的給藥途徑、與核酸分子的相容性、在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候與活病毒的相容性以及標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐。通常用不會(huì)明顯損害所述核酸一特別是當(dāng)其是桿狀病毒表達(dá)載體時(shí)一的生物學(xué)性質(zhì)的組分配制所述藥物組合物。在例如Remington’sPharmaceuticalSciences(Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,USA1985)中描述了合適的溶劑和稀釋劑。可在生理學(xué)合適的緩沖劑中配制所述核酸分子的溶液。在正常的保存和使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長，但不會(huì)使所述核酸分子失活或降解的防腐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知曉如何制備合適的制劑。在例如Remington，sPharmaceuticalkiences和1999^djlKWTheUnitedStatesPharmacopeia:TheNationalFormulary(USP24NF19)中描述了用于選擇和制備合適制劑的常規(guī)方法和成分。適合注射用的藥物組合物形式包括無菌水溶液或分散液以及用于臨用前配制無菌注射溶液或分散液的無菌粉末，其中術(shù)語無菌的范圍不涉及可包含要給予的核酸分子的活病毒。在所有情況下，所述形式都必須無菌并且必須為存在易可注射性的流體。還考慮包含本文所述核酸分子構(gòu)建體(包括表達(dá)載體)的試劑盒和商業(yè)包裝體，或者包含本文所述藥物組合物的試劑盒和商業(yè)包裝體。這一試劑盒或商業(yè)包裝體還會(huì)包含有關(guān)所包含核酸分子或藥物組合物的應(yīng)用一例如用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤或用于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因一的說明書。本發(fā)明的核酸分子、表達(dá)載體、方法和應(yīng)用通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步示例性說明。實(shí)施例1為驗(yàn)證如下假設(shè)構(gòu)建了一種桿狀病毒載體以在腦中表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)瘤自殺基因使用組織特異性啟動(dòng)子可增加優(yōu)先在特定類型的組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而另外使用miRNA調(diào)節(jié)將提供使轉(zhuǎn)基因在相同譜系的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞間差異表達(dá)的另一層控制。所述桿狀病毒載體包含一個(gè)基因工程膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)基因啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)自殺基因在神經(jīng)膠質(zhì)源的細(xì)胞中的表達(dá)，而在腫瘤內(nèi)注射載體發(fā)生局部或系統(tǒng)泄漏的情況下使腦中和其他器官中具有重要功能的神經(jīng)元和其他類型細(xì)胞免遭破壞。在本研究中，使用了GFAP啟動(dòng)子以使HSVtk基因的表達(dá)靶向至神經(jīng)膠質(zhì)源的細(xì)胞，從而避免對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ內(nèi)部或外部的非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的任何非希望的有害作用。然而，如同許多其他組織特異性啟動(dòng)子一樣，GFAP啟動(dòng)子的表達(dá)譜在相同譜系的正常和腫瘤細(xì)胞之間沒有明顯差異，并且先表達(dá)HSVtk自殺基因、隨后用GCV處理對(duì)正常星形細(xì)胞有毒性(Maronetal.,1997；Cowsilletal.，2000)，使得必須使用其他控制機(jī)制來保護(hù)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，所述正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在CNS中豐富并在維持神經(jīng)元的存活和生理功能中起關(guān)鍵作用。因此，所述載體的表達(dá)盒還包含在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中豐富但在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)的三種miRNA的靶序列，以大大避免從腫瘤泄漏出的載體對(duì)附近正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的副作用，而不干擾自殺基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。一個(gè)基因工程膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)基因啟動(dòng)子和在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中豐富但在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中下調(diào)的三種microRNA的重復(fù)靶序列在單一表達(dá)載體中的結(jié)合使用導(dǎo)致自殺基因表達(dá)的體內(nèi)選擇性顯著提高。將miRNA調(diào)節(jié)整合至轉(zhuǎn)錄靶向載體中對(duì)防止脫靶轉(zhuǎn)基因表達(dá)增加了另外一層面的安全性。下面描述的此實(shí)施例部分證明這種使用轉(zhuǎn)錄靶向和miRNA調(diào)節(jié)的雙重控制導(dǎo)致了腦中脫靶轉(zhuǎn)基因表達(dá)的顯著減少。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)在此研究中使用的人細(xì)胞為U87、H4、T98G、U118、U138、U251、A172、CCF、SW1783和SW1088成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，正常人星形細(xì)胞(NHA)以及人胚胎干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。所有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系均從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。U87、H4、T98G、U118、U138、U251、A172和CCF細(xì)胞在37°C下和5%CO2中培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清(FBQ、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.lmg/ml鏈霉素的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中；SW1783和SW1088在含有100%空氣的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)在添加有胎牛血清(10%),2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.lmg/ml鏈霉素的Leibovitz，sL-15培養(yǎng)基中。按照前人所述建立穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的U87-1UC細(xì)胞(Wangetal.2006)。將來自CloneticsPrimaryCellSystems(Lonza,Basel,Switzerland)的正常人星形細(xì)胞(NHA)培養(yǎng)在添加有AGMSingleQuots(Lonza)并添加有10μg/ml人表皮生長因子、10mg/ml胰島素、25μg/ml孕酮、50mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、50mg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素和10%FBS的特殊星形細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ABM)中。這些原代星形細(xì)胞培養(yǎng)物是從正常人腦組織建立的，并在第二代或第三代后冷藏保存。人胚胎干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元基于Reubinoff等人(Reubinoffetal.2001)所述的方案生成。miRNA表達(dá)分析對(duì)于miRNA分析，使用PureLinkmiRNAIsolationKit(Invitrogen)依照廠商說明書從成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系和正常人星形細(xì)胞中分離小RNA。通過分光光度法對(duì)小RNA樣品進(jìn)行定量并在Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,Inc.CA,USA)上使用RNA6000NanoChip測(cè)定其純度。使用NCodeMulti-SpeciesmiRNAMicroarrayVersion2(Invitrogen)進(jìn)行高通量分析。所述陣列由印刷在環(huán)氧化物包被的玻片上的針對(duì)miRBaseSequenceDatabase,Release9.O(Griffiths-Jonesetal.2006)中記錄的所有成熟miRNA優(yōu)化的探針序列構(gòu)成。在所述陣列上有553個(gè)對(duì)應(yīng)人miRNA的一式三份的探針。采用雙色標(biāo)記系統(tǒng)來比較成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中miRNA的表達(dá)水平與NHA水平。根據(jù)NCodemiRNALabelingSystem(Invitrogen)在聚腺苷酸加尾后用AlexaFluorf連接混合物對(duì)來自NHA的小RNA(500ng)進(jìn)行序列標(biāo)記。類似地，但獨(dú)立地，用AleXaFluor5連接混合物對(duì)來自神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的等量小RNA進(jìn)行標(biāo)記。所述連接混合物將一個(gè)捕獲序列標(biāo)記至所述小RNA，為AlexaFluorf捕獲劑或AlexaFluor5捕獲劑與所述雜交的miRNA的序列的在后結(jié)合提供特異性。將標(biāo)記的NHA和神經(jīng)細(xì)胞瘤樣品在每種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的一式三份陣列上共雜交過夜。在此初始雜交后，將AlexaFluor3和AlexaFluor5標(biāo)記的3DNA樹枝狀大分子(Genisphere)的混合物施加于每個(gè)用于檢測(cè)的微陣列，進(jìn)行4小時(shí)的第二次雜交。除了與連接在雜交的miRNA上的標(biāo)簽互補(bǔ)的特異性序列以外，所述樹枝狀大分子還攜帶約900個(gè)AlexaFluor熒光團(tuán)，并可檢測(cè)短的雜交靶。所有中間和最終洗滌步驟都按推薦進(jìn)行，然后在GenePix4000B掃描儀(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA,USA)上在532和635nm下分別掃描玻片的AlexaFluor3(綠色)和AlexaFluor5(紅色)信號(hào)。所有雜交均在BiopolisSharedFacilities(A*Star,Singapore)的MicroarrayCentre使用帶有MAUIMixer雜交箱的MAUIHybridisation系統(tǒng)(BiomicroSystems,SaltLakeCity,Utah)進(jìn)行。強(qiáng)度數(shù)據(jù)在可視地標(biāo)記無探針點(diǎn)或人工產(chǎn)物(artefactual)雜交并手動(dòng)調(diào)整網(wǎng)格以對(duì)齊所掃描玻片圖像上的點(diǎn)之后使用GenePixPrO6.0軟件(MolecularDevices)獲得。將所產(chǎn)生的*.GPR(GenePixResults)文件導(dǎo)入GeneSpringGX7.3(SiliconGenetics,RedwoodCity,CA)進(jìn)行進(jìn)一步分析。每個(gè)探針點(diǎn)均含有NHA(綠色/對(duì)照)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(紅色/原始)的強(qiáng)度值。中位數(shù)像素強(qiáng)度值已減去背景值，并且每片玻片上的一式三份斑點(diǎn)均通過GeneSpring對(duì)于兩個(gè)通道自動(dòng)處理為其平均值。對(duì)于每個(gè)玻片，每個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化均使用GeneSpring上的標(biāo)準(zhǔn)化選項(xiàng)，通過用每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度除以其對(duì)照通道值來進(jìn)行；如果對(duì)照通道小于10，那么使用10代替。每個(gè)玻片標(biāo)準(zhǔn)化被處理成對(duì)具體玻片的測(cè)量值的第50個(gè)百分位數(shù)。對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系與NHA的每個(gè)組合的一式三份生物學(xué)玻片進(jìn)行分組并取平均值來代表一種情況，生成具有以神經(jīng)膠質(zhì)瘤(紅色)信號(hào)比NHA(綠色)信號(hào)計(jì)算的強(qiáng)度比值的10種情況。為獲得僅針對(duì)認(rèn)為存在的miRNA探針的可靠數(shù)據(jù)，將考慮的每個(gè)數(shù)據(jù)文件在“標(biāo)示篩過濾器(Flagfilter)”上過濾以排除無探針點(diǎn)。為鑒定在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中差異表達(dá)的miRNA，使用了2X的倍數(shù)變化截值(強(qiáng)度比<0.5或>2)并進(jìn)一步應(yīng)用了嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)顯著性過濾(t檢驗(yàn)的ρ值<0.05)。microRNA的實(shí)時(shí)PCR是基于報(bào)道的方案(ShiandChiang，2005)稍加修改進(jìn)行的。使用TRIzol試劑(Invitrogen,Singapore)從三種成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U87、H4和T98G)和NHA中分離總RNA，并用TURBODNA-freeDNase(Ambion)處理。將經(jīng)DNAse處理的總RNA(Iyg)分別使用Poly(A)TailingKit(Ambion)根據(jù)廠商說明書通過聚腺苷酸聚合酶用ATP聚腺苷酸化。聚腺苷酸化的總RNA通過RNeasyMiniKit(Qiagen)使用適合的方案進(jìn)行純化。簡(jiǎn)而言之，將100%乙醇加入聚腺苷酸化的RNA與裂解緩沖液的混合物中至70%ν/ν的乙醇終濃度，這使得所述小RNA級(jí)分可與所述柱結(jié)合。將純化的聚腺苷酸化的RNA用200USuperscriptIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)禾口0.5μg聚胸苷酸接頭[FirstChoiceRLM-RACE試劑盒中的互補(bǔ)DNA末端3，’快速擴(kuò)增(RACE)接頭；Ambion]根據(jù)廠商說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)PCR分析的正向引物基于整個(gè)已知成熟miRNA序列設(shè)計(jì)，在3’’端添加3個(gè)“A”提高擴(kuò)增特異性。hsa-miR-143引物是一個(gè)例外其在5’’端被截去2個(gè)堿基，因?yàn)樵摮墒靘iRNA序列的前后4個(gè)堿基之間的互補(bǔ)性。選擇了5SrRNA作為PCR定量的內(nèi)參基因。所用引物的序列如下hsa-miR-31(5‘-GGCAAGAUGCUGGCAUAGCUGAAA)[SEQIDNO.:6]、hsa-miR-127(5‘-UCGGAUCC⑶CUGAGCUUGGCUAAA)[SEQIDNO.:7]、hsa-miR-143(5‘-AGAUGAAGCACUGUAGCUCAAA)[SEQIDNO.:8]禾口5S(5'CCGCCTGGGAATACCGGGTGCTGTAGGCTTT)[SEQIDNO.:9]。所用反向引物為3，接頭引物(FirstChoiceRLM-RACE試劑盒中的3’RACE外引物)。為確定絕對(duì)拷貝數(shù)，使用合成的miR16aRNA寡核苷酸(lstBase，Singapore)形成了標(biāo)準(zhǔn)曲線。假設(shè)每個(gè)細(xì)胞含有30pg總RNA，那么每個(gè)樣品反應(yīng)的CT值就可基于此曲線轉(zhuǎn)化為絕對(duì)拷貝數(shù)。所用的全部引物均由Sigma-ProligoSingaporePteLtd(BiopolisWay,Singapore)合成。弓I物優(yōu)化根據(jù)Two-StepRT-PCRMasterMixforPrimerOptimization(AppliedBiosystems)的方案進(jìn)行。實(shí)時(shí)PCR在Rotor-Gene6000(CorbettLifeScience)上以如下條件進(jìn)行95°C10分鐘，然后擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)(95°C15秒，60°C1分鐘)。全部反應(yīng)均一式三份進(jìn)行。通過熔解曲線檢查PCR特異性?；蜣D(zhuǎn)移載體的構(gòu)建為構(gòu)建質(zhì)粒載體，使用了之前生成并含有基因工程細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子的重組PFastBacl載體pFB-CMVE/GFAP-luc(Wangetal.，2006)作為起始骨架。此構(gòu)建體含有在膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)編碼基因的啟動(dòng)子控制之下的螢火蟲螢光素酶(Iuc)基因，該基因的活性通過將人巨細(xì)胞病毒即刻早期基因的增強(qiáng)子置于所述GFAP啟動(dòng)子的上游而提高(CMVE,WangandWang，2006)。pFB_CMVE/GFAP-luc載體中緊接在Iuc基因之后的HindIII位點(diǎn)用于插入miRNA靶序列。所選miRNA的成熟miRNA序列從miRNARegistry(Griffiths-Jonesetal.,2006)中獲得。設(shè)計(jì)了稱為X-mir-31、3X-miR-127、3X-miR-143和Mix_mir的四種寡核苷酸。前三種包含被設(shè)計(jì)為與相應(yīng)miRNA完美互補(bǔ)的序列(以小寫字母表示)的三個(gè)串聯(lián)拷貝，而Mix-mir構(gòu)建體以所給出的順序包含三種不同miRNA互補(bǔ)序列的各一個(gè)拷貝(表1和圖2a)。每個(gè)miRNA靶序列都由一個(gè)4核苷酸接頭隔開。首先使用T4PolynucleotideKinase(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)使所述寡核苷酸在5’端處磷酸化。將分別磷酸化的所述寡核苷酸的正義和反義鏈退火并亞克隆到HindIII位點(diǎn)上。測(cè)序后選擇以正向和反向包含不同拷貝的插入物(miRNA互補(bǔ)序列)的構(gòu)建體。為構(gòu)建桿狀病毒載體，使用了Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)。選擇兩種含有螢光素酶的PFB構(gòu)建體(pFB-CMVE/GFAP-luc和pFBmix-9F)用于桿粒生產(chǎn)。為生成包含單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的桿狀病毒載體，將pFB-CMVE/GFAP-luc和pFBmix-9F載體中的螢光素酶基因替換為pORF-HSVtk(InvivoGen，SanDiego,CA,USA)中的HSVtk基因。重組桿狀病毒在已預(yù)先適應(yīng)Sf-900II無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生和增殖。Sf9細(xì)胞在27.5°C下在旋轉(zhuǎn)式燒瓶中培養(yǎng)。采集在所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的出芽病毒并通過0.45-μm孔徑過濾器(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾以除去任何污染物，并通過以28，OOOg超離心60分鐘濃縮。將病毒沉淀物重懸浮于合適體積的0.IM磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中，其感染效價(jià)(空斑形成單位，Pfu)通過對(duì)Sf9細(xì)胞的空斑試驗(yàn)確定。體外轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析將細(xì)胞以20，000/孔的密度分開接種在48孔板中，一天后轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine2000(Invitrogen)進(jìn)行不同構(gòu)建體和無任何miRNA靶序列的對(duì)照質(zhì)粒(pFB-CMVE/GFAP-Luc)的轉(zhuǎn)染。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，將稀釋在OPTI-MEMIReducedSerumMedium中的0·2μg的質(zhì)粒DNA禾口0·5μL·Lipofectamine加入細(xì)胞并在37°C,5%CO2下孵育4小時(shí)。孵育后，將含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的OPTI-MEMI替換為普通生長培養(yǎng)基并在37°C下再培養(yǎng)一天。對(duì)于桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將細(xì)胞與桿狀病毒孵育1小時(shí)，然后除去病毒并加入普通生長培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C下再孵育1天，然后用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析。對(duì)于螢光素酶活性測(cè)定，將所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后用100μL報(bào)告細(xì)胞裂解緩沖液(ftOmega，WI,USA)凍融。將10μL所述細(xì)胞提取物用!Iomega的測(cè)定試劑盒進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。測(cè)量在單管型光度計(jì)(BertholdLumatLB9507,Badffildbad,Germany)中進(jìn)行。將相對(duì)光單位(RLU)標(biāo)準(zhǔn)化為用Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量的蛋白濃度。HSVtk基因表達(dá)使用蛋白質(zhì)印跡分析檢查。在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)M小時(shí)后采集并裂解細(xì)胞。將含有5μg總蛋白的裂解物裝入4-12%NuPAGE梯度凝膠(Invitrogen)中進(jìn)行蛋白分離。在將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后，使用化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ,USA)進(jìn)行蛋白檢測(cè)。所用一抗為以11000的稀釋度使用的HSVtk(YaleUniversity,NewHaven,Connecticut白勺DrWilliamSummers饋贈(zèng))。兔IgG二抗(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0,USA)以1:3000的稀釋度使用。微管蛋白用作上樣對(duì)照并使用15000稀釋的抗β-微管蛋白的小鼠單克隆抗體(Sigma)檢測(cè)。細(xì)胞毒性測(cè)定將細(xì)胞以10，000/孔的密度接種在48孔板中。在使細(xì)胞生長過夜后，將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度更昔洛韋(GCV)anvivoGen)的新鮮生長培養(yǎng)基。在37°C下孵育一天后，將細(xì)胞用感染復(fù)數(shù)(MOI)為50的桿狀病毒載體(BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F)感染。在初次接種后每兩天將培養(yǎng)基更換為含有適量更昔洛韋(GCV)(InvivoGen)的新鮮生長培養(yǎng)基。病毒感染6天后，將每孔替換以不含GCV的新鮮生長培養(yǎng)基，并將50μ1增殖測(cè)定溶液(CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay,Promega)加入每孔，然后在含有5%C02的濕潤培養(yǎng)箱中于37°C孵育4小時(shí)。將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移微板讀數(shù)儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)以測(cè)量在490nm的波長下的吸光度。對(duì)每種處理進(jìn)行一式三份的測(cè)量。相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞(未經(jīng)GCV處理的感染細(xì)胞)的相對(duì)細(xì)胞生長(％)計(jì)算如下(樣品吸光度-空白吸光度)/(對(duì)照吸光度-空白吸光度)X100%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用成年雌性Balb/c無胸腺無免疫活性裸鼠(重20g，6_8周齡)。將動(dòng)物用150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪麻醉并置于壓尺(nosebar)在0處的立體定位裝置中。使用與30G針頭連接的10μ1Hamilton注射器以0.6μ1/分鐘的速度將3μ1在PBS中的桿狀病毒(107pfu)注射到小鼠腦的紋狀體的任一側(cè)(前囟點(diǎn)和硬腦膜的前后向0.0mm,中側(cè)向+2.0mm，和背腹向-3.Omrn)。在5分鐘的注射完成后緩慢抽出針頭。對(duì)于研究對(duì)正常腦的HSV-TK/GCV處理的效果的實(shí)驗(yàn)，在桿狀病毒載體的腦注射后每天進(jìn)行劑量為50mg/kg的GCV或PBS的腹膜內(nèi)注射，持續(xù)7天。用過量的氯胺酮和/甲苯噻嗪使小鼠安樂死，用PBS進(jìn)行心臟灌注并采集腦組織用抗GFAP的一抗(Chemicon)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)染色，在PBS的心臟灌注后用新鮮制備的冷多聚甲醛的PBS溶液)灌注。將腦樣本留在冷的4%多聚甲醛中4小時(shí)至過夜，通過在30%蔗糖中孵育進(jìn)行冷凍保護(hù)直至樣本下沉，在包埋介質(zhì)(Jung組織冷凍介質(zhì)，LeicaInstruments,Germany)中冷凍后在_20°C下切成25μm切片。將切片用漂片(free-floating)法染色。在4°C下，將切片在含有1100稀釋的抗GFAP的一抗以及0.3%Triton-X和3%兔血清的PBS中孵育過夜。之后是三次PBS洗滌步驟，隨后在室溫下用1100稀釋度的FITC綴合的抗小鼠免疫球蛋白的二抗(Sigma)孵育2小時(shí)。在PBS洗滌后，將腦切片用封片介質(zhì)(Vectashield)封片。在Olympus顯微鏡下觀察并保存圖像。對(duì)于研究治療效果的實(shí)驗(yàn)，首先將0.5XIO6的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-螢光素酶(U87-luc)細(xì)胞接種到小鼠的紋狀體的兩側(cè)。一周后，將桿狀病毒載體注射到腫瘤內(nèi)，然后每天進(jìn)行GCV的腹膜內(nèi)注射。通過對(duì)異氟烷氣體麻醉的動(dòng)物中的U87-1UC細(xì)胞的生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)小鼠腦中的腫瘤生長。用D-螢光素(!Iomega)以100mg/kg(溶于PBS)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，然后立即成像。然后在螢光素注射后10分鐘和20分鐘時(shí)用與冷CCD照相機(jī)(Xenogen，Alameda,CA,USA)連接的IVIS成像系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)光成像。通過從ROI信號(hào)中減去背景信號(hào)采集圖像并測(cè)量生物發(fā)光信號(hào)，并用Xenogen活體成像軟件v2.5分析光子強(qiáng)度。在對(duì)動(dòng)物的處理和護(hù)理中，遵守由NationalAdvisoryCommitteeforLaboratoryAnimalResearch,Singapore發(fā)布的theGuidelinesontheCareandUseofAnimalsforScientificPurposes。本石if究的實(shí)驗(yàn)方案由InstitutionalAnimalCareandUseCommittee(IACUC),NationalUniversityofSingaporeandBiologicalResourceCenter,theAgencyforScience,TechnologyandResearch(A*STAR),Singapore批準(zhǔn)。結(jié)果對(duì)內(nèi)源性miRNA表達(dá)作譜對(duì)于預(yù)測(cè)miRNA活性以及實(shí)現(xiàn)受miRNA調(diào)節(jié)的載體的合理設(shè)計(jì)是重要的。使用能夠同時(shí)檢測(cè)553個(gè)人miRNA的miRNA微陣列芯片，在10種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中評(píng)價(jià)了相對(duì)于正常人星形細(xì)胞的miRNA總表達(dá)變化。在所有樣品中表達(dá)的腫瘤樣品/正常樣品比值彡2的miRNA均被認(rèn)為是上調(diào)的miRNA，而在該比值<0.5的miRNA被認(rèn)為是下調(diào)的miRNA。鑒定出57個(gè)上調(diào)的miRNA和1個(gè)下調(diào)的miRNA?；?0個(gè)微陣列測(cè)定的平均信號(hào)強(qiáng)度和實(shí)時(shí)PCR定量的miR-31的絕對(duì)拷貝數(shù)估計(jì)了正常星形細(xì)胞中不同miRNA的拷貝數(shù)。使用在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)和在正常星形細(xì)胞中的高拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，并且考慮公開的在原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中和在正常腦中的miRNA表達(dá)水平(Ciafreetal.,2005；Landgrafetal.，2007)，選擇了三種miRNA—has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143(圖la)—來設(shè)計(jì)含有雙重控制系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移載體。定量實(shí)時(shí)PCR分析確認(rèn)了3種miRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的下調(diào)及其在正常星形細(xì)胞中的相對(duì)較高水平(圖lb)。為構(gòu)建雙重控制載體，使用基因工程的GFAP啟動(dòng)子(Wangetal，2006)將轉(zhuǎn)基因表達(dá)局限于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，并將與miR-31、miR-127或miR-143完美互補(bǔ)的miRNA靶序列引入轉(zhuǎn)基因的3’非翻譯區(qū)，以將轉(zhuǎn)基因表達(dá)局限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(圖加)。將每種miRNA靶序列的三個(gè)連續(xù)重復(fù)序列(形成3個(gè)拷貝的具體miRNA靶序列)，或所述三種miRNA靶序列的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)套系連續(xù)序列(形成混雜的3、6和9個(gè)拷貝的所述不同類型靶序列)插入每種載體中，并通過一個(gè)4核苷酸接頭將這些靶序列的拷貝物隔開(表1)。因?yàn)閮H使用一個(gè)限制酶位點(diǎn)(HindIII)進(jìn)行插入，因此選擇正向或反向的構(gòu)建體。在將上述調(diào)節(jié)元件納入帶有螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒表達(dá)載體中后，測(cè)試了在轉(zhuǎn)染到正常人星形細(xì)胞和U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中后miRNA靶序列抑制螢光素酶基因表達(dá)的能力(圖2b)。在腫瘤細(xì)胞中，抑制水平通常低于20%，但具有混雜的3種靶序列并且插入方向?yàn)檎虻臉?gòu)建體的抑制水平為40%。在正常星形細(xì)胞中，對(duì)于含有3個(gè)串聯(lián)拷貝的一種類型的靶序列的構(gòu)建體，抑制水平也較低。然而，通過使用攜帶混雜組合的三種miRNA結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)建體，特別是當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目增加至總計(jì)6或9個(gè)靶序列時(shí)，實(shí)現(xiàn)了高得多的抑制水平。因此，pFBmix-6F和pFBmix-9F—其分別具有2個(gè)和3個(gè)拷貝的所選3種miRNA的靶序列的每一種一在正常人星形細(xì)胞中出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的80%抑制。以前已證明了昆蟲桿狀病毒是有效載體，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)星形細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞并且能夠通過毒性自殺基因的過表達(dá)抑制體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(Wangetal.,2006)。在此研究中，測(cè)試了桿狀病毒載體中的miRNA調(diào)控的功能性。由于具有共計(jì)9個(gè)拷貝的三種類型miRNA靶序列的組合(mix9F)是抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)最有效的構(gòu)建體，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將其用于桿狀病毒載體中來抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。含有螢光素酶基因和miRNA靶序列的桿狀病毒載體命名為BV-luc-mix9F，對(duì)照桿狀病毒載體命名為BV-luc-ctrl(圖加)。當(dāng)比較所述兩種載體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率時(shí)，通過miRNA靶序列的整合，觀察到輕微至中度的降低，從在U87細(xì)胞中降低7%，在H4細(xì)胞中降低14%至在T98G細(xì)胞中降低40%(圖2c)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的不同抑制水平與所述三種miRNA在所述三種神經(jīng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的相對(duì)豐度有關(guān)(圖lb)，表達(dá)最低水平的所述三種miRNA的U87細(xì)胞受影響較小。然而，在表達(dá)高水平的所述三種miRNA的正常人星形細(xì)胞中，觀察到了91%的基因表達(dá)水平的降低(圖2c)。為研究桿狀病毒載體的體內(nèi)抑制，比較了上述兩種病毒載體在小鼠腦中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，由于miRNA序列在人和小鼠之間的保守性，小鼠的腦表達(dá)了在體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的三種人miRNA的準(zhǔn)確同源物(exacthomolog)。在將所述病毒載體注射到裸鼠紋狀體中后兩天，觀察到了低水平的來自BV-luc-miX9F的螢光素酶表達(dá)。盡管miRNA靶序列的體內(nèi)抑制作用比在體外更加溫和，然而抑制仍為大約4倍(圖2d)。為檢測(cè)mix9FmiRNA靶序列是否能夠抑制功能基因的表達(dá)，構(gòu)建了兩種含有在基因工程GFAP啟動(dòng)子控制下的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自殺基因的桿狀病毒載體，一種具有mix9F靶序列(BV-HSVtk-mix9F)，另一種不含所述靶序列(BV-HSVtk-ctrl)。使用蛋白質(zhì)印跡分析，在人U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中檢測(cè)了HSVtk表達(dá)，在使用BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)水平無差異(圖3a)。在正常人星形細(xì)胞和小鼠紋狀體中，在BV-HSVtk-ctrl轉(zhuǎn)導(dǎo)后觀察到了HSVtk表達(dá)，但在BV-HSVtk_mix9F轉(zhuǎn)導(dǎo)后未觀察到(圖3a)。在源于人胚胎干細(xì)胞的HSVtk-ctrl或BV-HSVtk-mix9F轉(zhuǎn)導(dǎo)后的神經(jīng)元中，均未檢測(cè)到HSVtk表達(dá)(圖3a)。進(jìn)一步研究了HSVtk表達(dá)后進(jìn)行更昔洛韋(GCV)處理的體外作用，在人正常星形細(xì)胞和U87細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了GCV劑量依賴的細(xì)胞活力的降低，但在人神經(jīng)元中不明顯(圖3b)。在U87細(xì)胞中，在BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F之間沒有明顯的細(xì)胞毒效差異，表明mix9FmiRNA靶序列的整合不影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HSVtk有關(guān)的細(xì)胞殺死作用。在正常人星形細(xì)胞中，兩種桿狀病毒載體的殺死曲線非常不同，在ΙΟμΜ及以上的GCV濃度下，BV-HSVtk-ctrl誘導(dǎo)比BV-HSVtk_mix9F顯著更多的細(xì)胞死亡。在所測(cè)試的最高劑量(300μΜ)下，BV-HSVtk-ctrl誘導(dǎo)了多于90%的細(xì)胞的死亡，而BV-HSVtk-mix9F誘導(dǎo)了約55%的細(xì)胞的死亡。在用BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F分別轉(zhuǎn)導(dǎo)后，GCV處理得到的IC5tl值(將細(xì)胞存活抑制了50%的GCV濃度)在U87成纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞中為0.8μM和1μM，在正常星形細(xì)胞中為7μM和30μΜ，說明在非靶正常星形細(xì)胞中對(duì)HSVtk/GCV介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的耐受的4倍提高。BV-HSVtk-ctrl在U87細(xì)胞和正常星形細(xì)胞中不同的細(xì)胞殺死效力說明GCV對(duì)DNA合成的抑制對(duì)于活躍增殖的腫瘤細(xì)胞的毒性更強(qiáng)。在U87腫瘤細(xì)胞和正常星形細(xì)胞之間由BV-HSVtk-mix9F引起的不同至少部分地歸因于mix9F靶序列的存在以及所述兩種類型的細(xì)胞對(duì)GCV的不同敏感度。綜上所述，這些結(jié)果說明神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形細(xì)胞對(duì)HSVtk/GCV介導(dǎo)的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)不同的易損性，尤其包括在使用BV-HSVtk-mix9F時(shí)。為檢查mix9FmiRNA靶序列是否可在腦中提供抵抗HSVtk/GCV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體內(nèi)保護(hù)，將BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk-mix9F注射到裸鼠的紋狀體中，之后7天每天進(jìn)行GCV的腹膜內(nèi)注射。腦切片的免疫染色說明在以BV-HSVtk-ctrl注射的紋狀體中的GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，但在以BV-HSVtk-mix9F注射的同一腦的對(duì)側(cè)上眾多細(xì)胞被抗GFAP的抗體強(qiáng)染色(圖3c)。類似地，紋狀體組織的蛋白質(zhì)印跡分析顯示在以BV-HSVtk-ctr1/GCV注射的動(dòng)物中GFAP帶的染色強(qiáng)度明顯降低，但在以BV-HSVtk_mix9F/GCV注射的動(dòng)物中GFAP帶無明顯變化。這些結(jié)果說明mix9F介導(dǎo)的抑制可有效保護(hù)腦中正常星形細(xì)胞。為研究包含miRNA靶序列的桿狀病毒載體在體內(nèi)是否保持抗腫瘤效力，將一種穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的改造人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87-1UC細(xì)胞接種到裸鼠的紋狀體中，然后在7天后將桿狀病毒載體單次注射到U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物中，并在隨后5天每天進(jìn)行GCV的腹膜內(nèi)注射。使用非侵入性生物發(fā)光成像方法監(jiān)測(cè)活小鼠腦內(nèi)的腫瘤生長。圖4a示出了從在病毒注射前接種的U87-1UC細(xì)胞容易檢測(cè)出發(fā)光活性，并且在腫瘤異種移植物中以BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F注射、但未進(jìn)行GCV注射的動(dòng)物的5天觀察期中持續(xù)增加。在腫瘤內(nèi)注射桿狀病毒載體后接受GCV注射的動(dòng)物中，在病毒載體注射后第5天幾乎檢測(cè)不到螢光素酶活性。對(duì)于每種處理，來自4只小鼠的一組的定量結(jié)果匯總于圖4b，表明在單次注射BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F然后進(jìn)行5天的GCV注射可明顯消除腫瘤，在這兩種病毒載體之間的腫瘤抑制作用無顯著差異。在對(duì)照動(dòng)物中的腫瘤生長和在接受病毒和GCV注射的動(dòng)物中的抑制通過組織學(xué)檢查得以確證(圖如)。參考文獻(xiàn)IAbrahanteJEetal.TheCaenorhabditiseleganshunchback-likegenelin-57/hbl-lcontrolsdevelopmentaltimeandisregulatedbymicroRNAs.DevCell2003；4:625-637.2BabakTetal.ProbirngmicroRNAswithmicroarrays:tissuespecificityandfunctionalinference.Rna2004；10:1813-1819.3Barte1DP,ChenCZ.Micromanagersofgeneexpression:thepotentiallywidespreadinfluenceofmetazoanmicroRNAs.NatRevGenet2004；5396-400.4BimeyEetal.Identificationandanalysisoffunctionalelementsin1%ofthehumangenomebytheENCODEpilotproject.Nature2007；447:799-816.5BrownBDetal.EndogenousmicroRNAcanbebroadlyexploitedtoregulatetransgeneexpressionaccordingtotissue,lineageanddifferentiationstate.NatBiotechnol2007；25:1457-1467.6BrownBDetal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.NatMed2006；12:585-591.7BushatiN,CohenSM.microRNAfunctions.AnnuRevCellDevBiol2007；23175-205.8ChenJetal.Aglial-specific，repressible，adenovirusvectorforbraintumourgenetherapy.CancerRes1998；58:3504-3507.9CiafreSAetal.ExtensivemodulationofasetofmicroRNAsinprimaryglioblastoma.BiochemBiophysResCommun2005；334:1351-1358.IOCondorelliDFetal.Tissue-speciffcDNAmethylationpatternsoftheratglialfibrillaryacidicproteingene.JNeurosciRes1994；39:694-707.IlCowsillCetal.Centralnervoussystemtoxicityoftwoadenoviralvectorsencodingvariantsoftheherpessimplexvirustype1thymidinekinasereducedcytotoxicityofatruncatedHSVl-TK.GeneTher2000；7:679-685.12DoenchJG,PetersenCP，SharpPA.siRNAscanfunctionasmiRNAs.GenesDev2003；17:438-442.13EngLF.Glialfibrillaryacidicprotein(GFAP):themajorproteinofglialintermediatefilamentsindifferentiatedastrocytes.JNeuroimmunol1985；8:203-214.14EsqueIa-KerscherA，SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatRevCancer2006；6:259-269.15Fi1ipowiczW,BhattacharyyaSN,SonenbergN.Mechanismsofpost-transcriptionalregulationbymicroRNAs:aretheanswersinsight？NatRevGenet2008；9:102-114.16FukuyamaKetal.Analysisofglialfibrillaryacidicproteingenemethylationinhumanmalignantgliomas.AnticancerRes1996；16:1251-1257.17HarringtonKJ,LinardakisE，VileRG.Transcriptionalcontrol:anessentialcomponentofcancergenetherapystrategies？AdvDrugDelivRev2000；44:167-184.18HorstMetal.Targetingmalignantgliomaswithaglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)-selectiveoncolyticadenovirus.JGeneMed2007；91071-1079.19JohnBetal.HumanMicroRNAtargets.PLoSBiol2004；2:e363.20KloostermanWP,PlasterkRH.ThediversefunctionsofmicroRNAsihanimaldevelopmentanddisease.DevCell2006；11:441-450.2IKrichevskyAMetal.AmicroRNAarrayrevealsextensiveregulationofmicroRNAsduringbraindevelopment.Rna2003；9:1274-1281.22LandgrafPetal.AmammalianmicroRNAexpressionatlasbasedonsmallRNAlibrarysequencing.Cell2007；129:1401-1414.23LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines,indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets.Cell2005；120:15-20.24LinSYetal·TheCeleganshunchbackhomolog，hbl_l，controlstemporalpatterningandisaprobablemicroRNAtarget.DevCell2003；4:639-650.25LuJetal·MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature2005；435:834-838.26MaronAetal.Differentialtoxicityofganciclovirforratneuronsandastrocytesinprimaryculturefollowingadenovirus-mediatedtransferoftheHSVtkgene.GeneTher1997；4:25-31.27McKieEA,GrahamDI,BrownSM.SelectiveastrocytictransgeneexpressioninvitroandinvivofromtheGFAPpromoterinaHSVRLlnullmutantvector—potentialglioblastomatargeting.GeneTher1998；5:440-450.28PulkkanenKJ,Yla-HerttualaS.Genetherapyformalignantgliomacurrentclinicalstatus.MolTher2005；12:585-598.29ReinhartBJetal.The21-nucleotidelet_7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature2000；403:901-906.30ReubinoffBEetal.Neuralprogenitorsfromhumanembryonicstemcells.NatBiotcchnol2001；19:1134-1140.31RobsonT，HirstDG.TranscriptionalTargetinginCancerGeneTherapy.JBiomedBiotechnol2003；2003:110-137.32RosenfeldNetal.MicroRNAsaccuratelyidentifycancertissueorigin.NatBiotechnol2008；26:462-469.33RutkaJTetal.Roleofglialfilamentsincellsandtumoursofglialorigin:areview.JNeurosurg1997；87:420-430.34SaukkonenK，HemminkiA.Tissue-specificpromotersforcancergenetherapy.ExperrOpinBiolTher2004；4:683-696.35SempereLFetal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsurncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.GenomeBiol2004；5:R13.36ShiR，ChiangVL.FacilemeansforquantifyingmicroRNAexpressionbyreal-timePCR.Biotechniques2005；39:519-525.37Stoff-KhaliliMAetal.Cancer-specifictargetingofaconditionallyreplicativeadenovirususingmRNAtranslationalcontrol.BreastCancerResTreat2008；108:43-55.38WangCYetal.RecombinantbaculoviruscontainingthediphtheriatoxinAgeneformalignantgliomatherapy.CancerRes2006；66:5798-5806.39YangJ，SuAl，LiWH.Geneexpressionevolvesfasterinnarrowlythaninbroadlyexpressedmammaliangenes.MolBiolEvol2005；22:2113-2118.權(quán)利要求1.一種核酸分子，包含一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子；一段轉(zhuǎn)基因編碼序列；和多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)；其中每個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均結(jié)合一個(gè)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)的miRNA，并且其中所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均可操作地連接于所述轉(zhuǎn)基因編碼序列。2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子是星形細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。3.權(quán)利要求2的核酸分子，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子是膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白啟動(dòng)子。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)包含至少一個(gè)has-miR-31、has-miR-127或has-miR-143靶位點(diǎn)。5.權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)包含至少一個(gè)has-miR-31靶位點(diǎn)、至少一個(gè)has-miR-127靶位點(diǎn)和至少一個(gè)has-miR-143靶位點(diǎn)。6.權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)包含至少兩個(gè)has-miR-31靶位點(diǎn)、至少兩個(gè)has-miR-127靶位點(diǎn)和至少兩個(gè)has-miR-143靶位點(diǎn)。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼一種使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞被直接殺死的基因產(chǎn)物、一種免疫調(diào)節(jié)蛋白、一種細(xì)胞毒素、一種血管生成抑制蛋白、一種腫瘤抑制蛋白、一種自殺蛋白、一種凋亡蛋白、一種抗血管生成蛋白或一種抗體。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼HSV-tk或DT-A。9.一種表達(dá)載體，包含如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所定義的核酸分子。10.權(quán)利要求9的表達(dá)載體，其是桿狀病毒載體。11.一種在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法，包括用如權(quán)利要求9或10所定義的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是體外細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是從受試者體內(nèi)移出到體外的離體細(xì)胞。14.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是受試者的體內(nèi)細(xì)胞。15.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，包含如權(quán)利要求9或10所定義的表達(dá)載體。16.一種藥物組合物，包含如權(quán)利要求9或10所定義的表達(dá)載體。17.—種試劑盒，包含如權(quán)利要求9或10所定義的表達(dá)載體以及用于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的說明書。全文摘要本發(fā)明提供一種核酸分子，其包含一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)特異性的啟動(dòng)子；一段轉(zhuǎn)基因編碼序列；和多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)。每個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均結(jié)合一個(gè)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相比于在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)的miRNA，并且所述神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和所述多個(gè)miRNA靶位點(diǎn)均可操作地連接于所述轉(zhuǎn)基因編碼序列。文檔編號(hào)C12N15/11GK102099472SQ200880130432公開日2011年6月15日申請(qǐng)日期2008年11月4日優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日發(fā)明者C·吳,S·王申請(qǐng)人:新加坡科技研究局