專利名稱：：通過調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞水平控制癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及賴氨酰tRNA合成酶的新功能，具體地說，涉及利用所述的新功能調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的方法，以及用于預(yù)防或治療癌癥的具有抑制KRS表達(dá)的結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體的用途，用于預(yù)防或治療癌癥的KRS活性抑制劑的用途，癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)調(diào)節(jié)制劑的篩選方法，及阻礙KRS與67LR相互作用的制劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
：癌(或腫瘤)是非正常不可控且無序的細(xì)胞繁殖產(chǎn)物。尤其是在具有破壞性的生長性、滲透性及轉(zhuǎn)移性時(shí)，則被歸類為惡性。滲透性是指滲透或破壞周圍組織的性質(zhì)，通常意味著破壞形成組織邊界的底層而使腫瘤局部傳播，并經(jīng)常流入到體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中。轉(zhuǎn)移通常意味著腫瘤細(xì)胞借助淋巴管(Iymphotic)或血管擴(kuò)散到不同于原發(fā)位置的別處。轉(zhuǎn)移還意味著通過漿膜腔或其它空間直接延伸，使腫瘤細(xì)胞移動(dòng)。目前，癌癥主要通過三種治療方法，S卩外科手術(shù)、放射線照射及化學(xué)療法中的一者或多者的組合進(jìn)行治療。手術(shù)包括了去除大部分疾病組織的方法。盡管上述外科手術(shù)對(duì)去除位于特定部位例如乳腺、結(jié)腸及皮膚的腫瘤有效，但不能應(yīng)用于位于如脊椎的部分區(qū)域的腫瘤，或者如白血病的分散性腫瘤疾病的治療中?；瘜W(xué)療法能夠瓦解細(xì)胞復(fù)制或細(xì)胞代謝，常用于乳腺癌、肺癌及睪丸癌的治療，但對(duì)于接受癌癥治療的患者而言，腫瘤疾病治療中使用的全身性化學(xué)療法產(chǎn)生的副作用成為了最主要的問題。在上述副作用中，惡心和嘔吐時(shí)最常見和最嚴(yán)重的副作用。因化學(xué)療法而產(chǎn)生的副作用對(duì)患者的生活產(chǎn)生很大影響，并且可能使患者迅速改變對(duì)于治療的順應(yīng)性。此外，由于化學(xué)治療劑具有與其相關(guān)的副作用，因此此類藥物存在著在給藥時(shí)需要注意的劑量限制性毒性(DLT，DoseLimitingToxicity).例如，各種抗癌劑例如抗代謝物質(zhì)細(xì)胞毒素制劑5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤及抗腫瘤抗生素(例如，阿霉素)等對(duì)黏膜炎具有劑量限制性毒性。在大部分上述源于化學(xué)療法的副作用嚴(yán)重的情況下，需要住院或者為治療疼痛而使用鎮(zhèn)痛劑。因此，因化學(xué)治療劑和放射線治療引起的副作用，已成為癌癥患者臨床處置時(shí)的主要問題。基因治療是指利用DNA重組方法，將治療基因?qū)氲交颊叩募?xì)胞內(nèi)，使基因缺陷得到校正，或者為細(xì)胞提供新的功能，通過人體細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化，治療或預(yù)防各種遺傳疾病、癌癥、心血管疾病、感染性疾病，以及如自身免疫疾病等疾病的方法。S卩，將治療基因傳遞至體內(nèi)所需的臟器，使治療用或正常蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而治療疾病的方法被稱作基因治療?；蛑委熍c基于普通藥物的治療相比，具有優(yōu)秀的選擇性，并且能夠改善其它治療方法難以調(diào)解的疾病治愈率及治療速度，因此可以長時(shí)間應(yīng)用?；蛑委熓且环N治療并消除疾病原因，而非單純治療疾病癥狀的方式。為使上述基因治療更加有效，需要一種利用治療基因所需的靶細(xì)胞進(jìn)行傳遞，以期得到更高的表達(dá)效率3的基因傳遞技術(shù)?；蜉d體作為用于將所需的治療基因?qū)氲綄?duì)象細(xì)胞中的必要載體，理想的基因載體應(yīng)該對(duì)人體無害、易于大量生產(chǎn)、能夠高效地進(jìn)行基因傳遞、并使基因能夠持續(xù)表達(dá)?；蜉d體技術(shù)作為基因治療技術(shù)中的核心要素，目前在基因治療中廣泛使用的代表性基因載體，包括如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒性載體，及如脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺的非病毒性載體?；蛑委煼桨钢锌刂颇[瘤細(xì)胞的方案，包括了使用腫瘤控制基因的方法、使用腫瘤選擇性殺傷病毒的方法、使用凋亡基因的方法、及導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)基因的方法等。使用腫瘤控制基因的方法，是以相當(dāng)數(shù)目的癌癥患者中存在基因缺損或變形的如P53的腫瘤控制基因?yàn)樵停瑢⑵鋫鬟f到人體中治療癌癥的方法；使用腫瘤選擇性殺傷病毒的方法，是利用癌組織中發(fā)生變形的腫瘤抑制基因的活性，將僅能在腫瘤細(xì)胞中選擇性增殖的病毒基因載體導(dǎo)入人體，獲得治療效果的方法；二者均為直接殺傷腫瘤細(xì)胞的方法。無論是使用凋亡基因的方法，或是導(dǎo)入如HSV-TK的易感基因、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，均屬于同樣的范疇。相反，導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)基因的方法，是將增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素7、干擾素伽馬、腫瘤壞死因子等基因傳遞到人體中，誘導(dǎo)T細(xì)胞識(shí)別腫瘤，或者阻斷腫瘤誘導(dǎo)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，間接治療疾病的方案。類似地，使血管抑素、內(nèi)皮抑素等血管生成抑制因子表達(dá)，阻斷腫瘤的營養(yǎng)供給使其壞死的方法，同樣作為疾病間接治療方案取得廣泛共識(shí)。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥存活率中的決定因素。67kDa層粘連蛋白受體(67LR)作為包埋(embedded)在原生質(zhì)膜中的非整合型受體，與癌的侵襲(浸潤)和轉(zhuǎn)移有關(guān)(Nelson，J.etal.The67kDalamininreceptorstructure,functionandroleindisease.Biosci.Rep.28,33-48(2008))67LR通過其37kDa前體(37LRP)的聚合(dimerization)生成，該變化過程的詳細(xì)的分子機(jī)制不詳。37LRP與多核糖體形成相關(guān)的核糖體亞單位p40相同(Auth,D.&Brawerman,G.A33-kDapolypeptidewithhomologytothelamininreceptor-componentoftranslationmachinery.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,4368-4372(1992))。經(jīng)觀察，67LR在各種不同種類的癌癥中具有高濃度(Nelson,J.etal.The67kDalamininreceptor-structure，functionandroleindisease.Biosci.Rep.28,33-48(2008)；Menard，S.，Castronovo，V.,Tagliabue，E.&Sobel,Μ.Ε.Newinsightsintothemetastasis-associated67kDlamininreceptor.J.Cell.Biochem.67，155-165(1997))。然而，膜內(nèi)存在的67LR的調(diào)節(jié)機(jī)制或分子機(jī)制尚未表明。KRS屬于用于蛋白質(zhì)合成的同族(cognate)氨基酸和使tRNA結(jié)合的賴氨酰tRNA合成酶(ARSs)ο上述原酶除了催化活性之外，還具有多效性(pleiotropic)特征(Park，S.G.，Ewalt,K.L.&Kim,S.Functionalexpansionofaminoacyl-tRNAsynthetasesandtheirinteractingfactors:newperspectivesonhousekeepers.TrendsBiochem.Sci.30，569-574(2005))。同時(shí)，含有KRS的少數(shù)哺乳類動(dòng)物的ARS為了對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的多種功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，形成起分子容器(molecularreservoir)作用的(Ray，P.S.，Arif,A.&Fox,P.Macromo1ecu1arcomplexesasdepotsforreleasableregulatoryproteins.TrendsBiochem.Sci.32，158-164(2007))大分子復(fù)合體(Lee,S.W.，Cho,B.H.，Park,S.G.&Kim,S.Aminoacyl-tRNAsynthetasecomplexes:beyondtranslation.J.Cell.Sci.117,3725-3734(2004)；Han,J.M.，Kim,J.Y.&Kim，S.MolecularnetworkandfunctionalimplicationsofmacromoIecuIartRNAsynthetasecomplex.Biochem.Biophys.Res.Commun.303，985-993(2003))。人類KRS中含有與RNA及其它蛋白質(zhì)之間相互作用相關(guān)的固有的N末端延長部位(Rho,S.B.etal.Geneticdissectionofprotein-proteininteractionsinmulti—tRNAsynthetasecomplex.Proc.Natl.Sci.Acad.USA96,4488-4493(1999)；Francin,Μ.，Kaminska,Μ.，Kerjan,P.&Mirande.Μ.TheN-terminaldomainofmammalianLysyl-tRNAsynthetaseisafunctionaltRNA-bindingdomain.J.Biol.Chem.277，1762—1769(2002))。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題為了確認(rèn)肽與人類KRS的功能多樣性的相關(guān)意義，本發(fā)明中的發(fā)明者們分離出人類KRS的N末端的116個(gè)氨基酸肽，作為利用酵母雙雜交系統(tǒng)從HeLa細(xì)胞株cDNA文庫中篩選出于人類KRS結(jié)合蛋白的探針(bait)。通過所述的篩選，發(fā)明者們確認(rèn)了本發(fā)明中具有結(jié)合可能性的蛋白質(zhì)之一37LRP/p40，并且探明了基于KRS與層粘連蛋白受體之間的相互作用的功能相關(guān)性。其結(jié)果，本發(fā)明揭示了賴氨酰tRNA合成酶(lysyl-t-RNAsynthetase,KRS)通過穩(wěn)定原生質(zhì)膜中的67LR促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)及癌癥轉(zhuǎn)移等，從而揭示其通過原生質(zhì)膜的層粘連蛋白受體對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)產(chǎn)生影響。本發(fā)明的目的在于提供與癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)相關(guān)的賴氨酰tRNA合成酶(lysyltRNAsynthetase,KRS)的新用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶(LysyltRNAsynthetase,KRS)的細(xì)胞內(nèi)順序以調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移(cancermetastasis)的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)順序以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞移動(dòng)(cancercellmigration)的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了含有表達(dá)載體作為作為有效成分的癌癥預(yù)防及治療用組合物，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了將表達(dá)載體以有效量給予需要它的個(gè)體的癌癥預(yù)防及治療方法，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了用于制造癌癥治療劑的表達(dá)載體的用途，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了癌癥預(yù)防及治療用組合物，該組合物中含有KRS活性抑制劑作為有效成分。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了將KRS活性抑制劑以有效量給予需要它的個(gè)體的癌癥預(yù)防及治療方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了用于制造癌癥治療劑的KRS活性抑制劑的用途。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)調(diào)節(jié)制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑存在下使KRS與試驗(yàn)制劑接觸；(b)測(cè)定KRS的活性，篩選使KRS的活性發(fā)生變化的試驗(yàn)制劑；(c)測(cè)試篩選出的制劑是否調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了阻礙KRS與67LR之間的相互作用的制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑存在下，使KRS、層粘連蛋白受體(67LR)及試驗(yàn)制劑接觸；(b)測(cè)試所述的試驗(yàn)制劑是否對(duì)KRS與層粘連蛋白受體的相互作用(interaction)進(jìn)行調(diào)節(jié)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的又一目的，本發(fā)明提供了診斷肺癌或乳腺癌的方法，該方法包括以下步驟(a)在樣品中分析67LR是否過表達(dá)；(b)在67LR過表達(dá)的樣品中，分析KRS是否過表達(dá)。技術(shù)方案以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明初次闡明了KRS對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)產(chǎn)生的影響。S卩，本發(fā)明闡明了KRS通過原生質(zhì)膜的層粘連蛋白受體對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)產(chǎn)生影響的事實(shí)。^JL在無其它定義的情況下，本發(fā)明說明書中使用的所有技術(shù)性及科學(xué)性術(shù)語，代表普通技術(shù)人員在通常情況下所理解的意義。以下參考文獻(xiàn)提供了本發(fā)明說明書中所使用的、具有各種術(shù)語在通常情況下的定義的技術(shù)(skill)中的一種。Singletonetal.,DICT10NARY0FMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOTY(2ded.1994)；THECAMBRIDGEDICTIONARY0FSCIENCEANDTECHNOLOGY(Walkered.,1988)；及Hale&Marham，THEHARPERC0LLINSDICTI0NARYOFBIOLOGY.此外，以下定義為讀者(reader)提供本發(fā)明實(shí)施方面的幫助。本發(fā)明中的“表達(dá)(expression)”代表在細(xì)胞中生成蛋白質(zhì)或核酸。本發(fā)明中的“宿主細(xì)胞(hostcell)”代表含有借助任意方式(例如點(diǎn)沖擊法、磷酸鈣沉淀法、顯微注射法、轉(zhuǎn)化法、病毒感染等)向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的雜交DNA的原核或真核細(xì)胞。本發(fā)明中的“分離得到(isolated)”代表由其原始環(huán)境(例如如果是自然生成的則為自然環(huán)境)去除的物質(zhì)。例如，自然生成的核酸、多肽，此外雖然活體動(dòng)物體內(nèi)存在的細(xì)胞并非分離得到，但由相同的多核苷酸、多肽或共存物質(zhì)的一部分或全部分離出的(separated)細(xì)胞，無論在此后是否重新導(dǎo)入自然系統(tǒng)，均為分離得到(isolated)。所述的核酸可以是載體的一部分，并且/但是所述的核酸或多肽可以是組合物的一部分，并且所述的載體或組合物不是自然環(huán)境的一部分，而是分離得到的。本發(fā)明中的“調(diào)節(jié)(modulate)"KRS的生物活性代表KRS的細(xì)胞內(nèi)水平的變化。KRS活性的調(diào)節(jié)可以是上調(diào)(up-regulation)(即，激活或促進(jìn))或下調(diào)(down-regulation)(即，阻礙或抑制)。例如，調(diào)節(jié)可以引起KRS的細(xì)胞內(nèi)水平、KRS蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、KRS的酶6修飾(例如磷酸化)、結(jié)合特性(例如與靶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合)，或KRS的其它生物學(xué)、功能學(xué)及免疫學(xué)特性的變化。KRS的生物活性變化能夠由翻譯效率引起，例如，KRS基因表達(dá)的增加或減少，編碼KRS蛋白的mRNA的穩(wěn)定性。KRS調(diào)節(jié)因子(modulator)的作用方式(mode)，例如，也可以通過KRS蛋白或與其編碼基因的結(jié)合直接進(jìn)行。此外，所述的變化也可以通過與調(diào)節(jié)KRS的其它物質(zhì)(例如使KRS特異性磷酸化的激酶)結(jié)合和/或修飾(例如通過酶學(xué)方式)間接進(jìn)行。本發(fā)明中的“多肽(polyp印tide)”可以與“多個(gè)多肽(polyp印tides)”或“(多個(gè))蛋白質(zhì)”互換使用，例如，與在自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)到的一樣，代表氨基酸殘基的聚合體。本發(fā)明中的“KRS多肽”代表作為賴氨酰tRNA合成酶已知的多肽。所述的KRS多肽可以是具有如序號(hào)1所示的氨基酸序列的多肽(GenbankAccessionNo.NP_005539.1)。此外本發(fā)明中的KRS包括其功能性等同物。所述的功能性等同物代表與序號(hào)1所示氨基酸序列具有至少70%以上，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上序列相同性(S卩，同一性)的多肽。例如，包括具有70^71^721^73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列相同性的多肽，代表與序號(hào)1所示多肽表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的生理活性的多肽。其中，“實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的生理活性”，代表與原生質(zhì)膜的層粘連蛋白受體相互作用，并且調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。所述的功能性等同物，可以產(chǎn)生序號(hào)1中的氨基酸序列中的一部分附加、置換或缺失的結(jié)果。上述氨基酸的置換優(yōu)選為保存性置換。自然存在的氨基酸的保存性置換例如脂肪族氨基酸(Gly,Ala,Pro)、疏水性氨基酸(lie,Leu,Val)、芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp)、酸性氨基酸(Asp,Glu)、堿性氨基酸(His,Lys,Arg,Gin,Asn)及含硫氨基酸(Cys,Met)。此外，所述的功能性等同物中，在本發(fā)明中的KRS多肽的氨基酸序列上，還包括氨基酸的部分缺失的變形體。所述的氨基酸的缺失或置換，優(yōu)選地位于與本發(fā)明中的多肽的生理活性非直接相關(guān)的區(qū)域。此外，氨基酸的缺失優(yōu)選地位于與KRS多肽的生理活性非直接相關(guān)的部分。同時(shí)，在所述的KRS多肽的氨基酸序列的兩末端或序列內(nèi)，還包括附加少數(shù)氨基酸的變形體。此外，在本發(fā)明中的功能性等同物的范圍內(nèi)，在保持本發(fā)明中的多肽的基本骨架及其生理活性的同時(shí)，還包括了多肽的部分化學(xué)結(jié)構(gòu)變形產(chǎn)生的多肽衍生物。例如，使本發(fā)明中的多肽的穩(wěn)定性、保存性、揮發(fā)性或溶解度等發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)改變也包括在內(nèi)。本說明書中的序列相同性及等同性，在對(duì)KRS的氨基酸序列(序號(hào)1)和互補(bǔ)序列進(jìn)行排列后導(dǎo)入空白(gaps)后，依照KRS的氨基酸序列的互補(bǔ)序列的氨基酸殘基的百分比定義。在必要的情況下，為獲得最大百分比序列等同性，作為序列等同性的部分，不考慮保存性置換。此外，KRS的氨基酸序列的N-末端、C-末端或內(nèi)部延伸、缺失或插入，并不能解釋為對(duì)序列等同性或相同性產(chǎn)生影響的序列。此外，所述的序列等同性可由為比較兩個(gè)多肽的氨基酸序列的相似部分而使用的普通的標(biāo)準(zhǔn)方法決定。如BLAST或FASTA的計(jì)算機(jī)程序，能夠使兩個(gè)多肽分別以氨基酸的最佳配對(duì)進(jìn)行排列(根據(jù)一個(gè)或兩個(gè)序列的全部序列，或一個(gè)或兩個(gè)序列的預(yù)測(cè)部分)。所述的程序提供了默認(rèn)開啟罰分(defaultopeningpenalty)及默認(rèn)空白罰分(defaultgappenalty)，并且提供了能夠與計(jì)算機(jī)程序關(guān)聯(lián)使用的如PAM250(標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分矩陣；Dayhoffetal.，inAtlasofProteinSequenceandStructure，vol5，supp3，1978)的計(jì)分矩陣。例如，百分比等同性可通過如下方式計(jì)算。將一致序列(identicalmatches)的總數(shù)乘以100，之后除以對(duì)應(yīng)跨度(matchedspan)內(nèi)的較長序列的長度與為排列兩序列而導(dǎo)入到較長序列內(nèi)的空白(gaps)數(shù)目之和。本發(fā)明中的KRS多肽可通過自然提取或遺傳工程學(xué)方法制作而成。例如，利用普通方法制作所述的KRS或編碼其功能性等同物的核酸(例如序號(hào)2(GenbankAccessionNo.D32053))o所述的核酸可通過使用合適的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制作而成。還可以利用業(yè)界公知的標(biāo)準(zhǔn)方法作為其它方法，例如，使用DNA自動(dòng)合成機(jī)(Biosearch或AppliedBiosystems公司銷售)合成DNA序列。制備的核酸插入到載體中，利用由此形成的重組表達(dá)載體使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化；該載體包括可啟動(dòng)地連接(operativelylinked)于所述核酸，并且調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)的一個(gè)以上的表達(dá)調(diào)節(jié)序列(expressioncontrolsequence)(例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子等)。在適合所述的核酸表達(dá)的合適的培養(yǎng)基及條件下，對(duì)生成的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中回收通過所述的核酸表達(dá)的、實(shí)質(zhì)上純凈的多肽。所述的回收可使用業(yè)界公知的方法(例如色譜)進(jìn)行。上述“實(shí)質(zhì)上純凈的多肽(substantiallypurepolyp印tide)”代表本發(fā)明中的多肽實(shí)質(zhì)上不包括任何來自宿主細(xì)胞的其它蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明中的多肽合成的遺傳工程方法，可以參照以下文獻(xiàn)=Maniatisetal.,MolecularCloning；AlaboratoryManual，ColdSpringHarborlaboratory,1982；Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress，N.Y.，Second(1998)andThird(2000)Editions；GeneExpressionTechnology,MethodinEnzymology,GeneticsandMolecularBiology,MethodinEnzymology,Guthrie&Fink(eds.),AcademicPress，SanDiego,Calif，1991；及Hitzemanetal.，J.Biol.Chem.，255:12073-12080，1990.此外，本發(fā)明中的多肽可容易地通過業(yè)界公知的化學(xué)合成(CreightonJroteins；StructuresandMolecularPrinciples,W.H.FreemanandCo.，NY，1983)制備得到。作為代表性的方法且不限定于此，包括了液相或固相合成、片段縮合、F-MOC或T-BOC化學(xué)法(ChemicalApproachestotheSynthesisofPeptidesandProteins,Williamsetal.,Eds.,CRCPress,BocaRatonFlorida,1997；APracticalApproach,Atherton&Sheppard,Eds.，IRLPress,Oxford,England,1989)。本發(fā)明中的67kDa層粘連蛋白受體(67LR)，作為包埋(embedded)在原生質(zhì)膜中的非整合型受體，可以具有例如GenbankAccessionNo.NM_002295,S37431,AF284768,S37431,AF284768,J03799,XP370865，XP001083023.中記錄的堿基序列或氨基酸序列。本發(fā)明中的“核酸”、“DNA序列”或“多核苷酸”代表單鏈或多鏈形態(tài)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。除非有不同的限制，通過與自然生成的核苷酸類似的方法混合在核酸中的天然核苷酸的公知的類似物也包括在內(nèi)。本發(fā)明中“編碼所述的KRS的多核苷酸”，可以具有由序號(hào)1表示的氨基酸序列或與其具有至少70%以上的序列相同性的氨基酸序列的編碼堿基序列。所述的核酸包括全部DNA、cDNA及RNA。即，所述的多核苷酸，可以具有由序號(hào)1表示的氨基酸序列或與其具有至少70%以上的序列相同性的氨基酸序列的編碼堿基序列，或者與所述的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，具有由序號(hào)2表示的堿基序列。所述的核酸可通過自然分離得到，或者如上所述，通過遺傳工程學(xué)方法制備得到。盡管本發(fā)明中的“類似物(analog)”與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(referencemolecule)結(jié)構(gòu)類似，但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特異性取代基通過置換被代替，因此代表目標(biāo)或調(diào)節(jié)方法變型得到的物質(zhì)。在與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較時(shí)，類似物如從業(yè)者所預(yù)想的，具有相同或類似的、或得到提高的有用性(utility)。為闡明具有得到提高的性質(zhì)(例如，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)具有更高的親和力)的公知的化合物變異體的類似物的合成及篩選，使用藥理化學(xué)領(lǐng)域公知的方法。本發(fā)明中的“同源體(homologues)”在提及蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列的情況下，在同族蛋白(commonancestralprotein)或蛋白質(zhì)序列中表現(xiàn)為自然來源或人工來源。類似地，核酸和/或核酸序列在它們通過自然方式或人工方式來源于同族核酸或核酸序列時(shí)相同源。本發(fā)明中的“有效量(effectiveamount)”代表在細(xì)胞或組織內(nèi)，改變KRS的生物活性(例如，細(xì)胞內(nèi)水平等)，使其不同于正常細(xì)胞或組織的作用，或者癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)形態(tài)與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出有義變化的量。本發(fā)明中的“接觸(contacting)”代表其通常的意義(normalmeaning)，S卩，使兩種以上的制劑(例如兩個(gè)多肽)結(jié)合(combine)，或者使制劑與細(xì)胞(例如蛋白質(zhì)與細(xì)胞)結(jié)合。接觸可以在試管內(nèi)(invitro)發(fā)生。例如，在試管(testtube)或其它容器(container)內(nèi)使兩者以上的制劑結(jié)合，或者使試驗(yàn)制劑與細(xì)胞、或細(xì)胞溶解物與試驗(yàn)制劑結(jié)合。此外接觸也可以在細(xì)胞或體內(nèi)(insitu)發(fā)生。例如，使編碼兩個(gè)多肽的重組多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)(coexpression)，從而在細(xì)胞或細(xì)胞溶解物中使兩個(gè)多肽接觸。本發(fā)明中的“制劑(agent)”或“試驗(yàn)制劑(testagent)”，包括了任意的物質(zhì)(substance)、分子(molecule)、兀素(element)、化合物(compound)、實(shí)體(entity)或它們的組合物。例如，雖然不限于此，包括了蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)小分子(smallorganicmolecule)、多糖類(polysaccharide)、多核苷酸等。此外還可以是天然產(chǎn)物(naturalproduct)、合成化合物或化學(xué)化合物或兩種以上物質(zhì)的組合。在未特別指定的情況下，制劑、物質(zhì)及化合物可以互換地(interchangeably)使用。具體地說，可通過本發(fā)明中的篩選方法篩選的試驗(yàn)制劑，包括多肽、β-轉(zhuǎn)類似物(beta-turnmimetics)多糖類、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯二氮卓類(benzodiazepines)、低聚N-取代甘氨酸(oligomericN—substitutedglycines)、寡氛基甲酸酉旨(oligocarbamates)、糖類(saccharides)、月旨肪酸、嘌呤、嘧啶，或它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。一些試驗(yàn)制劑可以是合成物質(zhì)，另一些試驗(yàn)制劑可以是天然物質(zhì)。所述的試驗(yàn)制劑可通過包括合成或天然化合物庫在內(nèi)的較大范圍和多種來源得到。組合(combinatorial)庫可由能夠通過分步方式合成的多個(gè)種類的化合物生成。多數(shù)組合庫中的化合物可通過ESL(encodedsyntheticlibraries)方法(TO95/12608,WO93/06121、WO94/08051、WO95/395503及WO95/30642)制得。肽庫可通過噬菌體展示法(W091/18980)制得。細(xì)菌、霉菌、植物及動(dòng)物提取物形態(tài)的自然化合物庫可通過商業(yè)來源獲得，或者在曠野(field)中收集得到。公知的藥理學(xué)(pharmacological)制劑，為制造結(jié)構(gòu)類似物，可應(yīng)用如?；?、烷基化、酯化反應(yīng)(esterification)、酰胺化反應(yīng)(amidification)的定向(direct)或隨機(jī)的化學(xué)修飾。所述的試驗(yàn)制劑可以是自然生成的蛋白質(zhì)或其片段。上述試驗(yàn)制劑可通過自然來源(naturalsource)，例如細(xì)胞或組織溶解物獲得。舉例說明，多肽制劑庫可通過普通方法生成，或通過商業(yè)方式的cDNA庫購入。所述的試驗(yàn)制劑可以是肽，例如具有約5-30個(gè)氨基酸的肽，約5-20個(gè)更加，約7-15個(gè)尤佳。所述的肽可以是自然生成的蛋白質(zhì)、隨機(jī)肽、或“偏向的(biased)”隨機(jī)肽的切割物。此外，所述的制劑可以是“核酸”。核酸試驗(yàn)制劑可以是自然生成的核酸、隨機(jī)核酸、或“偏向的(biased)”隨機(jī)核酸。例如，類似地，如上述所記錄的，可使用在原核或真核基因組的切割物。此外，所述的試驗(yàn)制劑可以是小分子(例如，分子量約1，000以下的分子)。在用于小分子調(diào)節(jié)制劑篩選的方法中，優(yōu)選地，可以應(yīng)用高通量鑒別(highthroughputassay)0大量的鑒別可用于所述的篩選中(Shultz,Bioorg.Med.Chem.Lett.，8:2409-2414,1998；Weller,Mol.Drivers.,3:61-70,1997；Fernandes,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:597-603,1998；andSittampalam,Curr.Opin.Chem.Biol.，1:384-91,1997)。通過本發(fā)明中的方法篩選的試驗(yàn)制劑庫，可根據(jù)KRS或其片段或類似物的結(jié)構(gòu)研究制得。上述結(jié)構(gòu)研究能夠闡明具有與KRS結(jié)合的功能性的試驗(yàn)制劑。KRS的三維結(jié)構(gòu)可通過多種方法，例如，通過晶體結(jié)構(gòu)及分子模型(crystalstructureandmolecularmodeling)進(jìn)行研究。使用X-射線晶體學(xué)(X_raycrystallography)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法可通過文獻(xiàn)得知PhysicalBio-Chemistry,VanHolde,K.Ε.(Prentice-Hall,NewJersey1971),pp.221-239,andPhysicalChemistrywithApplicationstotheLifeSciences,D.Eisengerg&D.C.Crothers(BenjaminCummings,MenloPark1979)。針對(duì)KRS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行的計(jì)算機(jī)模擬，為了試驗(yàn)制劑篩選設(shè)計(jì)提供了多種手段。分子模擬方法可通過文獻(xiàn)得知U.S.Pat.No.5，612，894andU.S.Pat.No.5，583，973。此外蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可通過中子衍身寸(neutrondiffraction)禾口NMR(nuclearmagneticresonance)結(jié)晶PhysicalChemistry,4thEd.Moore,W.J.(Prentice-Hall,NewJersey1972)andNMRofProteinsandNucleicAcids,K.Wuthrich(ffiley-Interscience,NewYork1986)。以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的發(fā)明人揭示了，通過將KRS轉(zhuǎn)座(translocation)在原生質(zhì)膜上使其與67LR相互作用，促進(jìn)腫瘤(或癌)細(xì)胞的移動(dòng)，并對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移(metastasis)產(chǎn)生影響。同時(shí)，通過小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)，揭示出KRS的過表達(dá)或表達(dá)抑制能夠調(diào)節(jié)腫瘤(或癌)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明提供了對(duì)賴氨酰tRNA合成酶(LysyltRNAsynthetase,KRS)的細(xì)胞內(nèi)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)(modulating)，調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移(cancermetastasis)的方法。更具體地，在使本發(fā)明中的賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平降低的情況下，能夠抑制癌癥轉(zhuǎn)移，并且在賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平升高的情況下，能夠促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。細(xì)胞內(nèi)水平的降低或升高，如上述記錄所示，可由技術(shù)人員通過公知的各種方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，盡管不限于此，可在轉(zhuǎn)錄階段的調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)錄后階段中的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄階段中的調(diào)節(jié)，可通過技術(shù)人員公知的促進(jìn)基因表達(dá)的方法，例如，可通過制造與KRS或編碼其功能性等同物的多核苷酸的重組表達(dá)載體促進(jìn)所述的基因表達(dá)的方法，或者在KRS或編碼其功能性等同物的基因周圍插入促進(jìn)所述的基因表達(dá)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列的方法，或者用于抑制基因表達(dá)的方法，例如誘導(dǎo)啟動(dòng)子或基因部位的突變，抑制啟動(dòng)子活性或蛋白質(zhì)功能的方法，使反義(antisense)基因表達(dá)的方法，siRNA或微小RNA(microRNA)方法等實(shí)施。轉(zhuǎn)錄后階段中的調(diào)節(jié)，可通過技術(shù)人員公知的促進(jìn)或抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，例如，以KRS或編碼其功能性等同物的基因?yàn)槟０宕龠M(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄mRNA的穩(wěn)定性的方法，促進(jìn)蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定性的方法，或者促進(jìn)或阻礙蛋白質(zhì)或多肽的活性的方法實(shí)施。所述方法的更具體的例子，可通過作用于如1組內(nèi)含子型、MlRNA型、錘頭(hammerhead)型、發(fā)卡(hairpin)型或微小RNA型等轉(zhuǎn)錄mRNA的RNA的編碼DNA序列轉(zhuǎn)化，或者通過具有與靶基因序列相同或類似的序列的DNA的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)共抑制(cosuppression)產(chǎn)生。優(yōu)選地，本發(fā)明中KRS或其功能性等同物的細(xì)胞內(nèi)水平的調(diào)節(jié)，可通過增加或減少編碼所述多肽的多核苷酸的表達(dá)的方法實(shí)施。上述增加或減少的方法，盡管可使用技術(shù)人員公知的方法，例如，制造連接KRS或編碼其功能性等同物的多核苷酸的重組表達(dá)載體促進(jìn)其表達(dá)，或者制造將所述的多核苷酸的反義或siRNA多核苷酸連接于啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，以減少其表達(dá)。此時(shí)，所述的KRS或編碼其功能性等同物的多核苷酸，可優(yōu)選序號(hào)2表示的堿基序列。同時(shí)，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞移動(dòng)(cancercellmigration)的方法，對(duì)細(xì)胞內(nèi)水平的調(diào)節(jié)等，如上述記錄所示。此外，本發(fā)明中的KRS在抑制其表達(dá)的情況下，抑制了腫瘤(或癌)的轉(zhuǎn)移，因此本發(fā)明提供了含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的抑制KRS的表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)載體，或KRS的抗體作為有效成分的，癌癥預(yù)防及治療用組合物。上述KRS表達(dá)抑制結(jié)構(gòu)基因，可以是編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA。本發(fā)明中的組合物可應(yīng)用的疾病可以是癌癥。所述的癌包括但不限于，大腸癌，肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，膽囊癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，睪丸癌，宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，絨毛癌，卵巢癌，乳腺癌，甲狀腺癌，腦癌，頭頸部癌，惡性黑色素瘤，淋巴瘤，再生障礙性貧血等。所述的“啟動(dòng)子”代表在特定的宿主細(xì)胞內(nèi)可啟動(dòng)地連接的調(diào)節(jié)核酸序列的表達(dá)的DNA序列，“可啟動(dòng)地連接(operablylinked)”代表一個(gè)核酸片段與另一核酸片段結(jié)合，并且其功能或表達(dá)受另一核酸片段的影響。同時(shí)，還可以包括用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)操作序列，編碼合適的mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止序列。所述的啟動(dòng)子可使用在全部時(shí)間段內(nèi)始終誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)的啟動(dòng)子(constitutivepromoter)，或者在某個(gè)時(shí)刻誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)的啟動(dòng)子(induciblepromoter)。例如:SV40啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子，CAG啟動(dòng)子(HitoshiNiwaetal.，Gene,108193-199，1991；Monahanetal.，GeneTherapy,7:24-30,2000),CaMV35S啟動(dòng)子(Odelletal.，Nature313:810-812,1985)，Rsyn7啟動(dòng)子(美國專利申請(qǐng)08/991，601)，水稻(riceactin)啟動(dòng)子(McElroyetal.,PlantCell2:163_171，1990)，泛素啟動(dòng)子(Christensenetal.，PlantMol.Biol.12:619_632，1989)，ALS啟動(dòng)子(美國專利申請(qǐng)08/409，297)等。此外還可以使用美國專利5，608，149,5,608，144,5,604，121,5,569，597,5,466，785、5，399，680,5,268，463、及5，608，142等中公開的啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明提供了癌癥預(yù)防及治療方法，它包括了含有啟動(dòng)子及可啟動(dòng)地與其連接的抑制KRS的表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)載體或者KRS的抗體，并給予所需個(gè)體有效的量。此時(shí)，結(jié)構(gòu)基因與上述記錄相同，因此本發(fā)明提供了癌癥預(yù)防及治療方法，它包括了含有啟動(dòng)子及可啟動(dòng)地與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNAfentisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸的表達(dá)載體或者KRS的抗體，并給予所需個(gè)體有效的量。本發(fā)明中的“有效的量”是指本發(fā)明的表達(dá)載體在給藥對(duì)象的個(gè)體體內(nèi)，表現(xiàn)出癌癥預(yù)防或治療的作用的量，所述的“個(gè)體(subject)”可以是動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，特別是人類，也可以是來源于動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官等。所述的個(gè)體可以是需要治療的患者(patient)0此外，本發(fā)明提供了用于制造癌癥治療劑的，含有啟動(dòng)子及可啟動(dòng)地與其連接的抑制KRS的表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)載體或者KRS的抗體的用途。更具體地，本發(fā)明提供了用于制造癌癥治療劑的，含有啟動(dòng)子及可啟動(dòng)地與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸的表達(dá)載體或者KRS的抗體的用途。上述啟動(dòng)子、KRS、表達(dá)載體、適用的癌癥如上述記載。上述KRS的抗體代表指示KRS的抗原性部位的特異性蛋白分子。從本發(fā)明的目的來說，所述的抗體代表與KRS蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體。如上所述，KRS抗體的生產(chǎn)，可使用業(yè)界公知的技術(shù)容易地進(jìn)行制造。多克隆抗體的制造，可使用業(yè)界公知的，將所述的KRS蛋白抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)，并由動(dòng)物采血，得到含有抗體的血清的方法進(jìn)行生產(chǎn)。這些多克隆抗體可通過山羊、兔、羊、猴、馬、豬、牛、狗等任意動(dòng)物宿主進(jìn)行制造。單克隆抗體可使用業(yè)界公知的雜交瘤法(hybridomamethod)(參考Kohler及Milstein(1976)EuropeanJounralofImmunology6:511_519)，或者抗體庫(Clacksonetal,Nature,352:624-628,1991；Marksetal，J.Mol.Biol.，222:58，1—597，1991)技術(shù)進(jìn)行制造。在雜交瘤細(xì)胞方法中，使用注射過肺癌診斷標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的如小鼠的免疫學(xué)適宜的宿主動(dòng)物來源的細(xì)胞，其余作為一個(gè)組，使用癌癥或骨髓瘤細(xì)胞株。這兩組細(xì)胞，通過如聚乙二醇的業(yè)界公知的方法融合，融合后的抗體-分泌細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)方法增殖。通過基于有限稀釋法(limiteddilutiontechnique)的克隆，獲得均勻的細(xì)胞組，之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，生產(chǎn)處KRS蛋白的特異性抗體，從而利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在試管內(nèi)或生物體內(nèi)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。上述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，可以不經(jīng)凈化使用，但要獲得最佳效果，需要通過業(yè)界公知的方法精致使用，使其具有高純度。噬菌體抗體庫的方法，是獲取存在于細(xì)胞內(nèi)的多種肺癌標(biāo)記的抗體基因(Singlechainfragmentvariable，scFv形態(tài))并以融合蛋白形態(tài)表達(dá)，可在試管內(nèi)制作抗體庫，并由該庫中分離制作出單克隆抗體的方法。通過所述的方法制造的抗體，可通過凝膠電泳，透析，鹽沉淀，離子交換層析，親和層析等方法分離。此外，本發(fā)明中的抗體，是具有2個(gè)整個(gè)長度的輕鏈，及具有2個(gè)整個(gè)長度的重鏈的完整形態(tài)。不僅如此，還包括了抗體分子的功能性片段。抗體分子的功能性片段是指，能夠保持抗原結(jié)合功能的片段，包括Fab，F(xiàn)(ab，)，F(xiàn)(ab，)2及Fv等。同時(shí)，本發(fā)明中揭示了在使KRS的細(xì)胞內(nèi)水平減小的情況下抑制癌癥轉(zhuǎn)移，并將其應(yīng)用在癌癥預(yù)防及治療中的觀點(diǎn)，因此本發(fā)明提供了含有抑制KRS的活性的制劑作為有效成分的癌癥預(yù)防及治療用組合物。同時(shí)，本發(fā)明提供了癌癥預(yù)防及治療方法，該方法將抑制KRS的活性的制劑作為其必需成分，以有效量給予個(gè)體。并且提供了用于治療癌癥治療12劑的，抑制KRS的活性的制劑的用途。癌癥、個(gè)體、有效的量與上述記錄相同。KRS的活性抑制制劑能夠抑制KRS的表達(dá)，即，抑制mRNA或蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，例如，可以是KRS的antisenseRNA或siRNA，并且可以是抑制表達(dá)出的KRS的活性的競爭性抑制劑(competitiveinhibitor)或非競爭性抑制劑，例如KRS的抗體，但不限于此。在減少KRS的細(xì)胞內(nèi)水平的情況下，能夠抑制癌癥轉(zhuǎn)移并將其應(yīng)用在癌癥的預(yù)防和治療中，因此組合物、方法及用途不僅可以自身單獨(dú)使用，而且能夠與傳統(tǒng)公知的多種癌癥預(yù)防及治療方法或抗癌劑結(jié)合使用。即，本發(fā)明中的組合物、方法等能夠抑制癌癥轉(zhuǎn)移，因此與傳統(tǒng)抗癌劑或癌癥預(yù)防及治療方法結(jié)合用于治療，則能夠抑制癌癥的轉(zhuǎn)移，從而能夠通過腫瘤部位的治療，有效緩解癌癥。本發(fā)明中可連接于多肽的抗癌劑或癌癥預(yù)防及治療方法，如果是治療傳統(tǒng)癌癥，則可不受限制地使用。例如，抗癌劑包括紫杉醇，阿霉素，長春新堿，柔紅霉素(daunorubicin),長春堿(vinblastine),方文線菌素_D(actinomycin-D)、多西他賽(docetaxel),依托泊昔(etoposide),替尼泊試(teniposide),比生群(bisantrene),高三尖杉酯(homoharringtonine)，格列衛(wèi)(Gleevec;STI_571)，順鉬(cisplain)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil),可霄素(adriamycin),甲氛蝶吟(methotrexate),馬禾U蘭(busulfan),苯丁酸氮芥(chlorambucil)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，馬法蘭(melphalan)，氮芥(nitrogenmustard)，亞硝基脲(nitrosourea)等。所述的制劑與本發(fā)明中的組合物或預(yù)防及治療方法的結(jié)合，可根據(jù)抗癌劑的種類和量，合適地使用業(yè)界公知的技術(shù)實(shí)施。本發(fā)明的表達(dá)載體、KRS抗體或KRS的活性抑制制劑，可以口服或非口服給藥?？诜o藥還包括舌下給藥。非口服給藥包括皮下注射、肌肉注射和靜脈注射。上述表達(dá)載體，KRS抗體或抑制KRS活性的制劑，與藥學(xué)上容許的載體混合，可制備成各種藥學(xué)劑型的形態(tài)。所述的“藥學(xué)上容許”意味著生理上容許，在應(yīng)用于人時(shí)，通常不產(chǎn)生如胃腸功能紊亂、頭暈等過敏反應(yīng)或與其類似的反應(yīng)。藥學(xué)上容許的載體在口服給藥時(shí)，可使用粘合劑，潤滑劑，崩解劑，賦形劑，增溶劑，分散劑，穩(wěn)定劑，懸浮劑，色素及香料，在注射劑的情況下，可與緩沖劑，防腐劑，止痛劑，增溶劑，等張劑，及穩(wěn)定劑混合使用，并且在局部給藥用制劑的情況下，可使用基質(zhì)，賦形劑，潤滑劑和保存劑。本發(fā)明中的表達(dá)載體，KRS的抗體或抑制KRS活性的制劑的藥學(xué)組合物劑型，如上所述，可以通過混合不同的藥物配方組成。例如，口服給藥時(shí)可制成片劑，袋劑，膠囊，藥劑，懸浮液，糖漿，薄片(wafer)等形態(tài)，制成注射劑時(shí)可制成單位給藥安瓿或多次給藥制劑形態(tài)。本發(fā)明表達(dá)載體，KRS的抗體或抑制KRS活性的制劑的總有效量，可通過單一劑量(singledose)給藥，也可以通過多劑量(multipledose)長期使用的分次治療方法(fractionatedtreatmentprotocol)給藥。含有本發(fā)明表達(dá)載體，KRS的抗體或抑制KRS活性的制劑的組合物，可根據(jù)疾病的程度和/或目的改變有效成分的含量，通常在一次給藥0.1μg或lOOmg，以1μg至IOmg的有效容量一日多次給藥更佳。然而，表達(dá)載體或抑制KRS活性的制劑的濃度，不僅要考慮患者的年齡，體重，健康狀況，性別，疾病嚴(yán)重程度，飲食及代謝率等多種因素確定患者的有效給藥量，并且在考慮上述問題時(shí)，具有該領(lǐng)域普通知識(shí)的技術(shù)人員能夠確定合適的有效給藥量。含有本發(fā)明表達(dá)載體，KRS的抗體或抑制KRS活性的制劑的藥學(xué)組合物，并不特別限制其劑型、給藥途徑及給藥方法。另一方面，所述的表達(dá)載體可通過感染(infection)、轉(zhuǎn)染(transfection)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)等業(yè)界公知的方法通過表現(xiàn)型導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)。利用質(zhì)粒表達(dá)載體的基因傳遞方法，是將質(zhì)粒DNA直接傳遞至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法，也是美國FDA批準(zhǔn)用于人類使用的一種方式(Nabel，E.G.，etal.，Science,2491285-1288,1990).質(zhì)粒DNA與病毒載體不同，具有可均勻精制的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明中可使用的質(zhì)粒表達(dá)載體，可以使用業(yè)界公知的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒。舉例來說，且不限于此，以pRK5(歐洲專利第307，247號(hào))，pSV16B(國際專利公開第91/08291號(hào))及pVL1392(PharMingen)為代表。所述的質(zhì)粒表達(dá)載體(plasmidexpressionvector)作為業(yè)界公知的方法，例如，且不限于此，可通過暫時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)，顯微注射，轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)，細(xì)胞融合，磷酸鈣沉淀法，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(liposome-mediatedtransfection)，DEAE右旋糖酐介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(DEAEDextran-mediatedtransfection)，聚凝胺介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(polybrene-mediatedtransfection)，電穿孑L法(electroporation)，基因槍(genegun)及用于使DNA流入細(xì)胞內(nèi)的其它公知的方法，將其導(dǎo)入到靶細(xì)胞內(nèi)(Wuetal.,J.Bio.Chem.，267:963-967,1992；Wuandffu,J.Bio.Chem.，26314621-14624，1988)。此外，作為含有所述的核酸的病毒表達(dá)載體不限于此，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)，腺病毒(adenovirus),皰疫病毒(herpesvirus),及禽痘病毒(avipoxvirus),慢病毒(Lentivirus)等。所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，是病毒基因全部被去除或改變，在非病毒蛋白質(zhì)通過病毒載體感染的細(xì)胞內(nèi)制作而成的。用于基因療法的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)在于，將大量的基因傳遞到復(fù)制細(xì)胞內(nèi)，將傳遞至細(xì)胞DNA內(nèi)的基因精確整合，在基因轉(zhuǎn)染后不會(huì)發(fā)生連續(xù)性的感染(Miller，A.D.，Nature,357=455-460,1992)。受到FDA認(rèn)證的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，是利用PA317amphotropi逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞制成的(Miller，A.D.andButtimore,C.，Molec.CellBiol.，6:2895-2902,1986)ο非逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括如上面提到的腺病毒(Rosenfeldetal.,Cell,68:143-155,1992Jaffeetal.,NatureGenetics,1:372-378,1992；Lemarchandetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6482-6486,1992)。腺病毒的主要優(yōu)點(diǎn)在于可運(yùn)送大量的DNA片段(361Λ基因組)，具有能夠以非常高的效率使被復(fù)制細(xì)胞感染的能力。此外，皰疹病毒也可以應(yīng)用在人類基因療法中(Wolfe，J.H.，etal.，NatureGenetics,1:379-384,1992)。此外，本發(fā)明中還可以使用公知的適宜病毒載體。此外，抑制所述的KRS表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的其它方法，例如，可通過局部的非口服，口服，鼻腔，鼻腔，靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，或其它適宜的方式進(jìn)行給藥。特別是，所述的載體為目標(biāo)的癌癥組織的腫瘤細(xì)胞治療有效量的目標(biāo)，也可以直接注入腫瘤細(xì)胞。特別是，在如眼睛，胃腸，泌尿生殖器官，肺及支氣管系統(tǒng)的體腔(bodycavity)內(nèi)產(chǎn)生癌癥或腫瘤的情況下，將含有本發(fā)明的結(jié)構(gòu)基因(或含有本發(fā)明結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)載體)的藥學(xué)組合物，利用針，導(dǎo)管(catheter)或其它種類的輸送管直接注入到空腔器官(holloworgan)內(nèi)。此時(shí)，X射線，超音波(sonogram)或光纖維系統(tǒng)(fiberopticvisualizationsystem)等影像裝置，可用于靶組織的位置確認(rèn)和針或?qū)Ч艿淖⑷胫?。此外，在不能直接到達(dá)或不同通過分析學(xué)分離的腫瘤或癌癥，可將本發(fā)明的組合物給入血液循環(huán)系統(tǒng)中。此外，本發(fā)明提供了癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)調(diào)節(jié)制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑的存在下，使KRS與試驗(yàn)制劑接觸，(b)測(cè)定KRS的活性，篩選使KRS的活性發(fā)生改變的試驗(yàn)制劑，(c)測(cè)試篩選出的制劑是否能夠調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。所述的篩選方法可用于業(yè)界公知的多種生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，可用于實(shí)施所述的發(fā)明。所述的技術(shù)記錄在以下文獻(xiàn)中Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.,Second(1998)andThird(2000)Editions；andAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Johnffiley&Sons,Inc.，NewYork(1987-1999).優(yōu)選地，首先檢測(cè)所述的試驗(yàn)制劑是否具有調(diào)節(jié)KRS的生物學(xué)活性的能力(第一檢測(cè)階段)。具體地說，在第一階段，在試驗(yàn)制劑存在的條件下，對(duì)分離出的KRS的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)，確定(identify)對(duì)所述多肽的生物學(xué)活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)制劑(modulatingagent)0具體地，可以包括以下階段(a)在試驗(yàn)制劑存在下，使KRS與試驗(yàn)制劑接觸；(b)測(cè)定KRS的活性，鑒別出使KRS的活性發(fā)生改變的試驗(yàn)制劑；在第一檢測(cè)階段，能夠檢測(cè)出KRS對(duì)各種生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)。例如，檢測(cè)出試驗(yàn)制劑是否具有KRS表達(dá)水平，例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯的活性。此外，能夠檢測(cè)出所述的試驗(yàn)制劑是否具有KRS的細(xì)胞內(nèi)水平或穩(wěn)定性，例如調(diào)節(jié)翻譯后修飾(post-translationalmodification)^τΚ角牟舌t生。之后，通過所述的第一檢測(cè)階段，明確使KRS的生物學(xué)活性增加的調(diào)節(jié)制劑，之后進(jìn)一步測(cè)試所述的試驗(yàn)制劑是否具有層粘連蛋白受體(67LR)，并在KRS的存在下，進(jìn)一步測(cè)試(第二檢測(cè)階段)調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的能力。例如，進(jìn)一步測(cè)試所述的試驗(yàn)制劑是否具有調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的活性。如上所述，本發(fā)明確定的KRS-調(diào)節(jié)制劑能夠調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。如果所述的第一檢測(cè)階段確定的試驗(yàn)制劑能夠調(diào)節(jié)KRS-調(diào)節(jié)制劑的細(xì)胞內(nèi)水平(例如，轉(zhuǎn)錄活性的變化)，則它能夠調(diào)節(jié)癌癥或癌細(xì)胞的移動(dòng)。另一方面，如果對(duì)非KRS受試制劑細(xì)胞內(nèi)水平的其它活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，則需要確認(rèn)KRS所述的所述的細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，是否能夠?qū)嶋H調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。例如，為了確定KRS的磷酸化活性調(diào)節(jié)是否能夠調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)，需要進(jìn)一步測(cè)試調(diào)節(jié)KRS的磷酸化活性的試驗(yàn)制劑，所述的第一及第二階段中，均可以使用不變的(intact)KRS及其片段，模擬或功能性等同物。這些可用于檢測(cè)生物活性的片段，通常具有KRS的生物學(xué)活性中的一個(gè)或多個(gè)。優(yōu)選地，KRS序列號(hào)的片段中含有序號(hào)1中的1-72個(gè)氨基酸殘基。此外，含有片段或模擬物的融合蛋白，可用于試驗(yàn)制劑的篩選。KRS的功能性等同物，是氨基酸的缺失和/或插入和/或置換，具有與KRS相同的生物活性，因此可用于本發(fā)明中的篩選方法。業(yè)界通常使用的多種檢測(cè)方法，均可用于探明KRS的調(diào)節(jié)制劑。優(yōu)選地，所述的制劑可通過基于細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)(cellbasedassaysystem)進(jìn)行篩選。例如，用于篩選的典型的基于細(xì)胞的檢測(cè)中(即第二階段)，在試驗(yàn)制劑的存在下，測(cè)定報(bào)告基因活性(例如酶活性)，將其余試驗(yàn)制劑的負(fù)載下的報(bào)告基因的活性進(jìn)行比較。所述的報(bào)告15基因，是業(yè)界公知的可檢測(cè)的任意的多肽(反應(yīng)或報(bào)告多肽)，例如，可通過熒光或磷光(phosphorescence)檢測(cè)的多肽或具有它的通過酶活性，編碼檢測(cè)出的多肽?？蓹z測(cè)的反應(yīng)多肽(detectablereponsepolyp印tide)，例如，可以是熒光素酶，α-葡糖苷酸酶(glucuronidase)，α-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)和人體分泌堿性磷酸酶。在基于細(xì)胞的檢測(cè)中，試驗(yàn)制劑(例如肽或多肽)，可通過宿主細(xì)胞內(nèi)存在的多種載體進(jìn)行表達(dá)。在某些方法中，試驗(yàn)制劑庫克通過所述的載體庫(例如cDNA庫)編碼。所述的庫可通過業(yè)界公知的方法制得(Sambrooketal.andAusubeletal.，supra)，或者通過多種商業(yè)性的來源獲得。除了所述記載的基于細(xì)胞的檢測(cè)之外，也可以通過非基于細(xì)胞的方法進(jìn)行篩選。所述的方法包括，例如，遷移的DNA-結(jié)合試驗(yàn)(mobilityshiftDNA-binding88885^8),^-4^^0^1^11^0)1+^^1^(11161:115^181::1011anduracilinterferenceassays),DNA_禾口胃自由—Ι(DNaseandhydroxylradicalfootprintinganalysis),焚光極化(fluorescencepolarization),及UV交聯(lián)(crosslinking)或化學(xué)交聯(lián)(cross-linkers)。一般的概述由Ausubel等的文獻(xiàn)揭露(Ausubeletal.，supra,chapter12，DNA-ProteirHnteraction)。將含有核酸和DNA/RNA結(jié)合蛋白的共結(jié)合蛋白(co-associatingprotein)的分離技術(shù)包括，含有可切割的交聯(lián)劑二巰基琥珀丙酸(dithiobissuccinimidylpropionate)和3，3，-二硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯)(3,3’-dithiobissulfosuccinimidylpropionate)的UV交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)劑(McLaughlin,Am.J.Hum.Genet.，59:561-569,1996；Tang,Biochemistry,35:8216-8225,1996；Lingner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,93:10712,1996；andChodosh,Mol.Cell.Biol.,64723-4733，1986)。第一檢測(cè)階段KRS調(diào)節(jié)制劑的篩選許多檢測(cè)系統(tǒng)可以應(yīng)用在用于KRS調(diào)節(jié)因子的試驗(yàn)制劑的篩選中。如上所述，所述的篩選可以使用試管內(nèi)檢測(cè)系統(tǒng)或基于細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)。在該篩選階段中，可對(duì)試驗(yàn)制劑與KRS的結(jié)合，KRS的細(xì)胞內(nèi)水平改變，或KRS的其它生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)進(jìn)行篩選。1)KRS結(jié)合制劑的篩選在第一篩選階段中，可以測(cè)定KRS與試驗(yàn)制劑的結(jié)合。試驗(yàn)制劑與KRS的結(jié)合，例如，可以通過如標(biāo)記的試管內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)，EMS(electrophoreticmobilityshiftassays)，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫檢測(cè)，功能性檢測(cè)(磷酸化檢測(cè)等)的多種方法進(jìn)行檢測(cè)(U.S.Pat.Nos.4，366，241:4，376，110；4，517，288and4,837,168；andBevanetal.,TrendsinBiotechnology,13:115-122,1995；Eckeretal.,Bio/Technology,13:351-360,1995；andHodgson,Bio/Technology,10；973-980,1992)。試驗(yàn)制劑可通過與KRS的直接結(jié)合，例如，與基于KRS抗體的KRS多肽的共沉淀(co-immunoprecipitation)的檢測(cè)得到確認(rèn)。此外，試驗(yàn)制劑可通過代表KRS與試驗(yàn)制劑的結(jié)合的信號(hào)，例如熒光淬滅(quenching)的檢測(cè)得到確認(rèn)。競爭檢測(cè)(competitionassays)為闡明KRS的特異性結(jié)合試驗(yàn)制劑提供了合適的形式(format)。在所述的形式中，試驗(yàn)制劑與KRS相結(jié)合，通過已經(jīng)公知的化合物的競爭得到篩選。公知的結(jié)合化合物可以是合成化合物。此外，它可以是KRS特異性識(shí)別抗體，例如，KRS的單克隆抗體。如果試驗(yàn)制劑阻礙了公知的KRS與公知的化合物之間的結(jié)合，則所述的試驗(yàn)制劑也能夠與KRS結(jié)合。多種不同的競爭檢測(cè)為業(yè)界所公知。例如，固相直接或間接酶放射免疫測(cè)定法(solidphasedirectorindirectradioimmunoassay,RIA),固相直接或間接酶免疫測(cè)定法(EIA)，三明治競爭檢測(cè)(Stahlietal.，MethodsinEnzymology，9:242_2453，1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirklandetal.,J.Immunol.,137:3614-3619,1986)；固相直接標(biāo)記檢測(cè)，固相直接標(biāo)記三明治檢測(cè)(HarlowandLane,Antibodies,AlaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1988)；使用125I的固相直接標(biāo)記RIA(Moreletal.,Mol.Immuno.,25(1):7_15，1988；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheungetal.，Virology，176:546_552，1990)；及直接標(biāo)記RIA(Moldenhaueretal.，Sacnd.J.Immunol.,32:77-82,1990).在一般情況下，所述的檢測(cè)包括了精制多肽的使用，該多肽結(jié)合在包括了非標(biāo)記化的試驗(yàn)制劑及標(biāo)記化的對(duì)照化合物的細(xì)胞或固體表面。競爭性抑制通過在試驗(yàn)制劑的存在下，確定結(jié)合在固體表面或細(xì)胞上的標(biāo)記的量得到測(cè)定。通過競爭檢測(cè)闡明的調(diào)節(jié)制劑，包括了與對(duì)照化合物結(jié)合在同一抗原表位上的制劑，及為了引起立體阻礙(sterichindrance)而與相鄰抗原表位結(jié)合的制劑。通常情況下，在競爭阻礙過度存在時(shí)，普通的標(biāo)記多肽的對(duì)照化合物的特異性結(jié)合被抑制至少50或75%。所述的篩選檢測(cè)可以是不溶性或溶解性形式。作為不溶性檢測(cè)的一例，是將KRS或其片段固定在固相矩陣上。之后，在用于試驗(yàn)制劑結(jié)合的充分長時(shí)間期間，使固相矩陣與試驗(yàn)制劑接觸。之后，將未結(jié)合于固相矩陣的物質(zhì)洗去，之后確認(rèn)結(jié)合于固相的制劑的存在。所述的方法還包括了將結(jié)合的制劑由固相矩陣溶解分離，將制劑分離的階段。二選一地，使KRS固定的另一方法，是將試驗(yàn)制劑結(jié)合在固相矩陣上之后，添加KRS。溶解性檢測(cè)包括了上述記錄的少數(shù)結(jié)合庫的篩選方法。在溶解性檢測(cè)形式下，試驗(yàn)制劑或KRS均不能結(jié)合于固體支架。KRS或其片段與試驗(yàn)制劑的結(jié)合，例如可通過KRS和/或試驗(yàn)制劑的熒光測(cè)得。熒光可通過內(nèi)部(intrinsic)或帶有熒光物質(zhì)(fluorophor)的成分的標(biāo)記賦予。在少數(shù)結(jié)合檢測(cè)中，KRS、試驗(yàn)制劑或第三物質(zhì)(例如KRS結(jié)合抗體)為了在給定的條件下容易地對(duì)所述的多肽進(jìn)行確認(rèn)、檢測(cè)及定量，可提供為標(biāo)記狀態(tài)。即，可提供共價(jià)結(jié)合或可檢測(cè)的標(biāo)記或組，或者連接的可交聯(lián)的組。上述可檢測(cè)的組，包括了可檢測(cè)的多肽組，例如可檢測(cè)的(assayable)酶或抗體抗原表位。二選一地，所述的可檢測(cè)的組，可選自放射性同位素(例如125I，32P，35Q，或者如化學(xué)發(fā)光性或熒光性組的其它可檢測(cè)的組或標(biāo)簽。類似地，所述的可檢測(cè)的組可以是基質(zhì)(substrate)，輔因子(cofactor)，抑制劑或親和配體。2)調(diào)節(jié)KRS的其它生物活性的制劑的篩選KRS與試驗(yàn)制劑的結(jié)合表明，試驗(yàn)制劑是KRS的調(diào)節(jié)因子。這也提示所述的制劑為調(diào)節(jié)癌轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)，能夠調(diào)節(jié)層粘連蛋白受體的生物活性。因此，需要進(jìn)一步測(cè)試，與KRS結(jié)合的試驗(yàn)試劑是否具有調(diào)節(jié)層粘連蛋白受體活性的能力。另外，需要對(duì)與KRS結(jié)合的試驗(yàn)制劑進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查，以查明其對(duì)于KRS的活性。這種活性的存在、性質(zhì)或范圍可通過活性檢測(cè)測(cè)得。所述的活性檢測(cè)，可以確認(rèn)試驗(yàn)試劑與KRS的結(jié)合，實(shí)質(zhì)上對(duì)KRS具有調(diào)節(jié)活性。很多時(shí)候，所述的調(diào)節(jié)檢測(cè)控制可以獨(dú)立使用，用于闡明調(diào)節(jié)KRS的活性的試驗(yàn)制劑(即，不經(jīng)過第一階段直接檢測(cè)KRS的結(jié)合能力)。一般情況下，在所述的方法中，存在或不存在用于測(cè)試KRS的生物活性所需的其它物質(zhì)或試劑的情況下，在包括KRS的樣品中添加樣品試驗(yàn)制劑，以測(cè)定KRS的生物學(xué)活性的變化。在篩選KRS的酶或調(diào)節(jié)其他生物學(xué)活性的制劑的篩選檢測(cè)的基礎(chǔ)上，所述的活性檢測(cè)包括了用于KRS表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)水平變化的試管內(nèi)篩選機(jī)生物體內(nèi)篩選。m二i式·介胃赫·翩胞如果闡明了調(diào)節(jié)制劑與KRS結(jié)合并且/或者能夠調(diào)節(jié)KRS的生物學(xué)活性(包括細(xì)胞內(nèi)水平)，則可以進(jìn)一步測(cè)試所述的制劑是否具有調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的能力?；谒龅恼{(diào)劑制劑的癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)的調(diào)節(jié)，通常需要在KRS的存在下進(jìn)行測(cè)試。若使用基于細(xì)胞的篩選系統(tǒng)，則KRS能夠由導(dǎo)入宿主細(xì)胞的表達(dá)載體表達(dá)。二選一地，KRS也可以在篩選系統(tǒng)中借助宿主細(xì)胞通過內(nèi)生方式供給。此外，本發(fā)明提供了阻礙KRS與67LR的相互作用的制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑的存在下，使KRS，層粘連蛋白受體(67LR)及試驗(yàn)制劑接觸；及(b)測(cè)試所述的試驗(yàn)制劑是否調(diào)節(jié)KRS與層粘連蛋白受體之間的相互作用(interaction)0所述的制劑能夠促進(jìn)或增強(qiáng)KRS與層粘連蛋白受體(67LR)的相互作用，相反地，能夠抑制或弱化所述的相互作用。所述的步驟(b)中的測(cè)試，包括了測(cè)定未接觸于所述的調(diào)節(jié)制劑的細(xì)胞或其溶解物中的67LR與KRS的相互作用水平的，所述的調(diào)節(jié)制劑在接觸的細(xì)胞或其溶解物中的67LR與KRS之間的相互作用水平的相對(duì)變化的測(cè)定(detecting)階段。所述的篩選方法如上所述，可通過試管內(nèi)蛋白-蛋白結(jié)合檢測(cè)(試管內(nèi)下拉檢測(cè))，EMSA(electrophoreticmobilityshiftassays)，用于蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫檢測(cè)，功能性檢測(cè)(磷酸化檢測(cè)等)，酵母-2雜交檢測(cè)，非免疫沉淀檢測(cè)，免疫印跡檢測(cè)，免疫共定位檢測(cè)(immuno-co-localization)等業(yè)界公知的多種方法實(shí)施。例如，利用分別融合于抑菌體LexA或酵母GAL4的DNA結(jié)合區(qū)域及酵母GAL4蛋白的轉(zhuǎn)錄(transactivation)區(qū)域的，表達(dá)KRS和67LR、或它們的蛋白質(zhì)的一部分或同源體(homologues)的酵母，進(jìn)行酵母雙雜交檢測(cè)(KIM，M.J.etal.,Nat.Gent.,34:330-336,2003)。KRS與67LR的相互作用，在結(jié)合于LexA蛋白或GAL4的DNA結(jié)合區(qū)域的調(diào)節(jié)序列的啟動(dòng)子的控制下，進(jìn)行誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄重組。所述的報(bào)告基因如上所述，可使用(例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase)，熒光素酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶(glucuronidase)，堿性磷酸酶及綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein)等。如果通過試驗(yàn)制劑促進(jìn)或強(qiáng)化了KRS和67LR，或上述蛋白質(zhì)的部分或同源體的相互作用，則所述的報(bào)告基因的表達(dá)與正常條件相比增加。相反，如果所述的相互作用因試驗(yàn)制劑而阻礙或弱化，則所述的報(bào)告基因未表達(dá)或與正常條件相比表達(dá)減少。此外，作為報(bào)告基因，選擇能夠使酵母生長的蛋白質(zhì)(即，在所述的報(bào)告基因未表達(dá)時(shí)，酵母的生長受到抑制)進(jìn)行編碼。例如，可以是編碼用于氨基酸或含氮堿基的生物合成過程相關(guān)的酶的營養(yǎng)缺陷(auxotrophic)基因(例如ADE3，HIS3等的酵母基因或源自其它種的等位基因)。該系統(tǒng)中表達(dá)的KRS和67LR，或它們的蛋白質(zhì)的部分或同源體的相互作用，在試驗(yàn)制劑的作用下抑制或弱化的情況下，報(bào)告基因未表達(dá)或表達(dá)減少。因此，在所述的條件下，酵母的生長停滯或減慢。上述報(bào)告基因的表達(dá)所產(chǎn)生的作用，可通過肉眼或裝置(例如顯微鏡)觀察到。同時(shí)，本發(fā)明中以肺癌或乳腺癌患者為對(duì)象，確認(rèn)67LR及KRS的過表達(dá)與否的結(jié)果，在67LR過表達(dá)的情況下，可知KRS的過表達(dá)與肺癌或乳腺癌的相關(guān)性得到提高(參照表1)。因此，本發(fā)明提供了診斷肺癌或乳腺癌的方法，該方法包括以下步驟(a)分析試劑中67LR是否過表達(dá)；(b)在67LR過表達(dá)的試劑中，分析KRS是否過表達(dá)。用于診斷的樣品的采集及處理，和67LR及KRS的過表達(dá)與否的分析，通常可使用分子生物學(xué)方法，并且如下所述。以下對(duì)本發(fā)明中記錄的附圖進(jìn)行說明。圖1至圖6確認(rèn)了人類KRS與層粘連蛋白受體的特異性相互作用。圖1中，全部長度的人類KRS與37LRP/p40之間的相互作用可通過酵母雙雜交分析進(jìn)行。多重-ARS復(fù)合體的兩個(gè)組成要素AIMPl及AIMP2分別用作陽性及陰性對(duì)照組。陽性相互作用在含有x-gal的酵母培養(yǎng)基中，通過藍(lán)色群體的形成標(biāo)記。圖2中，37LRP為35S蛋氨酸存在下通過invitro翻譯生成，將其與GST-KRS或GST反應(yīng)(pull-down)。與GST-KRS共沉淀的(co-precipitated)37LRP利用自放射拍攝法測(cè)定。圖3中，KRS及37LRP的相互作用相關(guān)的肽部位通過酵母雙雜交分析測(cè)得。具有N末端的細(xì)胞內(nèi)部位(第M至第113位氨基酸)及具有C末端的細(xì)胞外部位(第137至210位氨基酸)的第296位氨基酸的37LRP，通過膜間區(qū)域(第113至137位氨基酸)區(qū)分。在人類KRS(597個(gè)氨基酸)的N末端特異性擴(kuò)展(約70個(gè)氨基酸)部位之后，具有OB-fold反密碼子結(jié)合區(qū)域(約70至214個(gè)氨基酸)和催化區(qū)域(約220至574個(gè)氨基酸)。圖4中，將Myc-KRS感染的A549細(xì)胞溶解，以抗Myc及抗層粘連蛋白受體抗體實(shí)施免疫印跡法。使Myc-KRS與抗Myc抗體免疫沉淀，通過67LR及37LRP共沉淀，實(shí)施免疫印跡法。為實(shí)現(xiàn)37LRP及67LR的特異性印跡，分別使用多抗體H-141及F-18(Santacruz)(WCL:wholecelllysate)。圖5中，利用所示抗體對(duì)Myc-KRS感染的A549細(xì)胞的溶解物實(shí)施免疫印跡法。細(xì)胞分離成細(xì)胞質(zhì)(C)及膜部分(M)，利用抗Myc抗體實(shí)施免疫沉淀，通過免疫印跡法探明37LRP及67LR共沉淀。在對(duì)照組中使用IgG。圖6中在進(jìn)行層粘連蛋白(10ug/ml，lh)處理的情況下，確認(rèn)了67LR與KRS之間的結(jié)合擴(kuò)展。為對(duì)其進(jìn)行觀察，利用識(shí)別67LR的抗體(abcam，cat#ab2508)進(jìn)行免疫沉淀(immunoprecipitation)，左側(cè)的IgG標(biāo)簽為源自兔的總IgG(totalIgG)，并用作陰性對(duì)照組。實(shí)施10%SDSPAGE之后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，之后利用識(shí)別KRS和67LR的抗體分別進(jìn)行免疫印跡。圖7至圖12中確認(rèn)了層粘連蛋白-誘導(dǎo)性膜轉(zhuǎn)位(translocation)及KRS的磷酸化。圖7中，通過層粘連蛋白(10ug/ml)處理A549細(xì)胞，利用免疫印跡法分時(shí)段觀察67LR，37LRP及KRS的量(level)。分別使用Hsp90及鈣粘蛋白(Cad)作為細(xì)胞質(zhì)及膜的標(biāo)記。圖8中，利用層粘連蛋白處理A549細(xì)胞1小時(shí)，或者不進(jìn)行處理，使用抗67LR(MLuC5，Santacruz,sc-59732)(紅色)及KRS抗體(綠色)實(shí)施免疫熒光染色。圖9中，利用分別抑制PLC-Y，PKC及PI3K的U73122(U)，星形孢菌素(staurosporin,ST)及LY294002(LY)，處理A549細(xì)胞3小時(shí)，利用層粘連蛋白處理1小時(shí)，之后確認(rèn)該磷酸化酶抑制劑對(duì)67LR及KRS的細(xì)胞質(zhì)及膜產(chǎn)生何種影響。圖10中，利用Myc-KRS感染A549細(xì)胞，培養(yǎng)M小時(shí)。之后利用所示(indicated)藥物進(jìn)行處理，并利用如上所述的層粘連蛋白進(jìn)行處理。利用Myc-KRS進(jìn)行免疫沉淀，利用抗-p-Thr，-kr，及-Tyr抗體實(shí)施免疫印跡法。圖11中，利用Myc-KRS感染A549細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)。感染的細(xì)胞利用LY^4002前處理3小時(shí)，利用層粘連蛋白處理1小時(shí)。Myc-KRS經(jīng)過免疫沉淀，67LR經(jīng)過免疫印跡法實(shí)現(xiàn)共沉淀。作為免疫沉淀法的對(duì)照組，使用IgG。圖12中，如上所述，在層粘連蛋白及LY^4002的存在或不存在下培養(yǎng)A549細(xì)胞。EPRS(glutamyl-prolyl-tRNAsynthetase)與其特異性抗體(AbCam)免疫沉淀，KRS的共沉淀通過免疫印跡法確認(rèn)(上)。利用免疫耗盡上清液(immime-d印Ietedsupernatant:ID)，與抗-KRS及EPRS抗體實(shí)施免疫印跡法。圖13至圖17中確認(rèn)了KRS使膜-結(jié)合性67LR穩(wěn)定化的這一點(diǎn)。圖13中，A549細(xì)胞通過si-對(duì)照組(si-cont)或si-KRS感染，在層粘連蛋白的存在或不存在下進(jìn)行培養(yǎng)。之后將細(xì)胞分離成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在各自部分中的67LR及KRS的量通過免疫印跡法確認(rèn)。鈣粘蛋白(紅色)及hsp90分別用作細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記。圖14中，A549細(xì)胞中膜結(jié)合性67LR的量使用抗-LR抗體(MluC5)，利用流式細(xì)胞儀觀察得到。共載體或KRS質(zhì)粒感染的細(xì)胞經(jīng)過對(duì)小時(shí)培養(yǎng)(上)。67LR的量，為表現(xiàn)KRS的抑制作用，利用si-KRS或si-對(duì)照組感染細(xì)胞，并培養(yǎng)48小時(shí)(下)。圖15中，EV(共載體)或KRS感染的A549細(xì)胞，利用G418鑒別一周，使用抗-LR抗體(Mlua)進(jìn)行免疫熒光染色，確認(rèn)了67LR的細(xì)胞內(nèi)分布。膜中分布的LR用白色箭頭指出。圖16中，A549細(xì)胞經(jīng)過放線菌酮處理，抑制了新的(denovo)蛋白質(zhì)合成，并且在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的67LR量中，KRS量的作用通過免疫印跡法查明。圖17中，67LR的細(xì)胞穩(wěn)定性中，KRS的重要性通過脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)查明。293個(gè)細(xì)胞經(jīng)過si-KRS或si-對(duì)照組感染，與蛋氨酸反應(yīng)1小時(shí)。67LR與67LR特異性反應(yīng)抗體(F-18，Santacruz)發(fā)生免疫沉淀，經(jīng)過SDS-PAGE分離后，實(shí)施自放射拍攝法?；谔禺愋詓iRNA的KRS的抑制，通過免疫印跡法實(shí)施，并且使用微管蛋白作為對(duì)照組。圖18至圖22中，KRS通過67LR確認(rèn)了促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)(cellmigration)及癌癥轉(zhuǎn)移的這一點(diǎn)。圖18中，利用所示(indicated)質(zhì)粒感染A549細(xì)胞，在層粘連蛋白不存在或存在下進(jìn)行培養(yǎng)，它們對(duì)細(xì)胞移動(dòng)的作用，在transwell室中通過移動(dòng)細(xì)胞的測(cè)定得到確認(rèn)。計(jì)算通過膜的細(xì)胞的數(shù)目，并將其標(biāo)記在各個(gè)板上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖19中，如上法處理的細(xì)胞，為測(cè)定MMP-2的活性和量，分別用于實(shí)施酶譜及免疫印跡法。圖20中，乳腺癌細(xì)胞株4T-1細(xì)胞通過所示(indicated)siRNA感染，并且注射到Balb/C小鼠背部。經(jīng)過21日后，摘除小鼠的肺，對(duì)直徑Imm以上的腫瘤結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。圖21中，表達(dá)外源性KRS(KRS-1，及KRS-2)的兩種不同的4T-1細(xì)胞，如上所述進(jìn)行接種，經(jīng)過30日后計(jì)數(shù)。感染共載體的細(xì)胞作為對(duì)照組使用。圖22中，肺癌(上)及乳腺癌(下)組織中的KRS及67LR的表達(dá)量，以使用它們各自的抗體的免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行比較。利用39個(gè)肺癌及40個(gè)乳腺癌的組織，通過抗-KRS及抗-67LR抗體實(shí)施免疫組織化學(xué)染色，它們的表達(dá)量與正常組織進(jìn)行比較(每一組織9個(gè)樣品)。其中可見同一患者的代表性的對(duì)，是KRS和67LR的過表達(dá)。KRS與67LR的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)關(guān)系如表1所示。圖23中示意67LR的膜中的量依賴于KRS表達(dá)。圖23中，所示(indicated)質(zhì)粒感染的293個(gè)細(xì)胞分離為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜部分，在各個(gè)部分中，確認(rèn)了使用67LR，37LRP及20KRS的量，利用對(duì)應(yīng)的抗體實(shí)施免疫印跡法。圖M至圖27在細(xì)胞移動(dòng)，蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞周期中，確認(rèn)了細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外KRS的作用。圖M中，層粘連蛋白不存在的情況下培養(yǎng)的A549細(xì)胞的移動(dòng)，在transwell室中通過移動(dòng)細(xì)胞的測(cè)定得到確認(rèn)。圖25中示意KRS的化學(xué)周期性(chemotactic)活性，以所示濃度將含有KRS的無血清培養(yǎng)基至于transwell室的下室，將A549細(xì)胞置于上室進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6小時(shí)候，對(duì)移動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖沈中，A549細(xì)胞中KRS的量，通過siRNA和外因性KRS的導(dǎo)入，得到下調(diào)或上調(diào)(圖沈及圖27的下板)。感染的細(xì)胞分別培養(yǎng)48小時(shí)和M小時(shí)，之后在無蛋氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，形成營養(yǎng)饑餓狀態(tài)，之后利用放射線標(biāo)記的蛋氨酸標(biāo)記2小時(shí)。洗滌后，將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)，利用0.5%TritonX_100溶解液溶解，利用液態(tài)閃光計(jì)數(shù)器(liquidscintillationcounting)測(cè)定放射線活性。圖27中，A549細(xì)胞如標(biāo)記感染后固定，利用碘化丙啶(Propidiumiodide)染色，通過流式細(xì)胞分析儀分析。圖觀至圖30確認(rèn)了癌轉(zhuǎn)移中的KRS的抑制作用。圖觀中，目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)中，si-KRS及si-DRS的作用通過免疫印跡法查明。對(duì)照組使用微管蛋白。圖四中，感染siRNA的細(xì)胞(IxlO6)如上述方法注射，經(jīng)過21日后測(cè)定腫瘤的大小及體積，在原發(fā)腫瘤增殖中，查明了KRS及DRS的抑制作用。各組使用5只小鼠。圖30中，所述的小鼠中摘除的肺，在10%福爾馬林溶液中固定。轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)及數(shù)目如圖所示。圖31至圖33確認(rèn)了癌轉(zhuǎn)移中KRS的過表達(dá)作用。圖31中，通過免疫印跡法觀察到KRS-I及KRS-2細(xì)胞株的過表達(dá)。圖32中，對(duì)原發(fā)腫瘤增殖中的KRS過表達(dá)作用進(jìn)行了相互比較。圖33中，查明了接種后30日的腫瘤轉(zhuǎn)移引起的KRS的作用。各組使用4只小鼠°圖1所示為通過酵母雙雜交分析確認(rèn)人類KRS與37LRP/p40之間的相互作用。圖2所示為通過下拉分析確認(rèn)人類KRS與37LRP之間的相互作用。圖3所示為確認(rèn)人類KRS與37LRP之間的相互作用。圖4所示為為了確認(rèn)KRS與67LR及37LRP之間的結(jié)合，利用抗Myc及抗層粘連蛋白受體抗體，對(duì)Myc-KRS感染的A549細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析的結(jié)果。圖5所示為為了確認(rèn)KRS與67LR及37LRP之間的結(jié)合，對(duì)Myc-KRS感染的A549細(xì)胞的溶解物進(jìn)行免疫印跡分析的結(jié)果。圖6所示為通過免疫沉淀確認(rèn)基于層粘連蛋白處理的KRS與67LR的結(jié)合。圖7所示為對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行層粘連蛋白處理時(shí)，通過免疫印跡確認(rèn)67LR，37LRP及KRS的量(level)。圖8所示為A549細(xì)胞經(jīng)過層粘連蛋白處理或未經(jīng)過處理時(shí)，通過免疫熒光染色確認(rèn)67LR及KRS的表達(dá)。圖9所示為確認(rèn)磷酸化酶抑制劑對(duì)67LR及KRS的細(xì)胞質(zhì)及膜中的表達(dá)產(chǎn)生的影響。圖10所示為在表達(dá)KRS的A549細(xì)胞中實(shí)施層粘連蛋白及磷酸化酶抑制劑處理時(shí)，通過P-Thr，-Ser，及-Tyr抗體實(shí)施免疫印跡，以確認(rèn)磷酸化程度。圖11所示為在表達(dá)KRS的A549細(xì)胞中，通過免疫印跡確認(rèn)磷酸化的KRS是否與67LR結(jié)合。圖12所示為通過免疫印跡確認(rèn)層粘連蛋白對(duì)KRS與EPRS的結(jié)合產(chǎn)生的影響。圖13所示為通過免疫印跡確認(rèn)si-對(duì)照組或si-KRS轉(zhuǎn)染時(shí)的67L及KRS的量。圖14所示為利用流式細(xì)胞分析儀確認(rèn)A549細(xì)胞中的膜結(jié)合性67LR的量。圖15所示為通過免疫熒光染色確認(rèn)對(duì)于EV(共載體)或KRS感染的A549細(xì)胞的67LR的細(xì)胞內(nèi)分布。圖16所示為通過免疫印跡確認(rèn)新蛋白質(zhì)合成受到抑制的A549細(xì)胞中細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的67LR量對(duì)KRS量的作用。圖17所示為通過脈沖追蹤試驗(yàn)確認(rèn)KRS對(duì)67LR的細(xì)胞穩(wěn)定性產(chǎn)生的影響。圖18所示為確認(rèn)KRS和/或67LR表達(dá)抑制時(shí)對(duì)細(xì)胞移動(dòng)產(chǎn)生的影響。圖19所示為通過酶譜及免疫印跡確認(rèn)KRS和/或67LR表達(dá)抑制時(shí)MMP-2的活性及量。圖20所示為4T-1細(xì)胞株移植小鼠中KRS表達(dá)抑制時(shí)腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目。圖21所示為4T-1細(xì)胞株移植小鼠中KRS表達(dá)抑制時(shí)腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目。圖22所示為通過免疫組織化學(xué)法確認(rèn)肺癌及乳腺癌組織中的KRS及67LR的表達(dá)量。圖23所示為通過免疫印跡確認(rèn)KRS表達(dá)對(duì)67LR膜中的量產(chǎn)生的影響。圖M所示為測(cè)定不存在層粘連蛋白的情況下培養(yǎng)的A549細(xì)胞的移動(dòng)。圖25所示為測(cè)定細(xì)胞移動(dòng)的KRS的趨化性(chemotactic)活性。圖沈所示為在A549細(xì)胞中確認(rèn)基于siRNA與外源性KRS的導(dǎo)入的KRS的量及細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的合成量。圖27所示為在A549細(xì)胞中確認(rèn)基于siRNA與外源性KRS的導(dǎo)入的KRS的量及細(xì)胞周期。圖28所示為在靶蛋白表達(dá)中通過免疫印跡確認(rèn)si-KRS及si_DRS的作用。圖四所示為在基于腫瘤細(xì)胞抑制的第一次腫瘤增殖中確認(rèn)KRS及DRS抑制的作用。圖30所示為確認(rèn)基于腫瘤細(xì)胞移植的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)及數(shù)目。圖31所示為通過免疫印跡確認(rèn)KRS-I及KRS-2細(xì)胞株中的KRS的表達(dá)量。圖32所示為確認(rèn)基于腫瘤細(xì)胞移植的第一次腫瘤增殖中的KRS過表達(dá)的作用。圖33所示為確認(rèn)基于腫瘤細(xì)胞移植的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)及數(shù)目。發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。但，以下實(shí)施例僅用于提示本發(fā)明，本發(fā)明中的內(nèi)容不限于此?！磳?shí)驗(yàn)方法〉1.細(xì)胞培養(yǎng)及材料A549及HEK293細(xì)胞購自ATCC。小鼠乳腺癌(mammarycarcinoma)4T-1細(xì)胞株由Kim,SungJin博士(Gachon醫(yī)科大學(xué))提供。含有10%小牛血清(Fetalbovineserum,FBS)及抗體的RPMI(相對(duì)于AM9細(xì)胞及4T-1細(xì)胞)及DMEM(Dulbecco，sModifiedfegleMedium，相對(duì)于其它細(xì)胞)培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。編碼37LRP的pcDNA3.1載體由tachibanahirofumi博士(九州大學(xué))提供。附著有Myc的(Myc-tagged)人類KRS及DRS由pcDNA3載體的EcoRlAhoI限制酶部位克隆得到。嚙齒類KRScDNA通過RT-PCR保存，在pcDNA3.1載體的HindIIIAhoI限制酶部位克隆。標(biāo)靶(targeting)嚙齒類及人類KRS及DRS的siRNA由hvitrogen公司購入。siRNA的序列可獲得。Geneporter(GTS)及脂質(zhì)體2000(invitrogen)作為轉(zhuǎn)染試劑使用。LY^4002，U73122及星形孢菌素(staurosporin)購自Calbiochem,環(huán)己酉先亞胺(cycloheximide)及層粘連蛋白(laminin,Engelbreth-Holm-Swarmmurinesarcoma)購自Sigma。2.免疫沉降及免疫印跡利用含有150mMNaCl,0.5%TritonX-100,0.1%SDS及蛋白質(zhì)分解酶抑制劑的20mMTris-HCl緩沖液(ρΗ7.4，溶解緩沖)將細(xì)胞溶解。將蛋白質(zhì)提取物與正常IgG及蛋白質(zhì)G瓊脂糖凝膠孵化(incubation)2小時(shí)，之后進(jìn)行離心分離，非特異性地去除IgG中結(jié)合的蛋白質(zhì)。將上清液與精制的67LR抗體(F-18，Santacruz)混合，之后在振搖的同時(shí)，在4°C下培養(yǎng)2小時(shí)，與蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠混合。利用經(jīng)過冰冷卻的溶解緩沖液洗滌3次，之后將沉淀物溶解在SDS-樣品緩沖液中，利用SDS-PAGE分離。為了在相互不同的細(xì)胞部分中，確認(rèn)KRS及LR的結(jié)合，利用pcDNA3.I-Myc-KRS轉(zhuǎn)染，利用proteoextract試劑盒(Calbiochem)，依照制造商的說明，將質(zhì)膜與細(xì)胞質(zhì)分離，之后實(shí)施如上所述的共免疫沉降。為分析蛋白質(zhì)水平，從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，之后利用10%SDS-PAGE進(jìn)行分離。在未特殊提及的情況下，將抗-LR抗體(Abcam，ab2508)用于37LRP及67LR的共免疫印跡。hsp90及廣譜鈣粘附素(Pan-cadherin)抗體購自Santacruz。3.流式細(xì)胞分析(flowcytometry)為確定(address)細(xì)胞周期，利用標(biāo)記的載體或化合物對(duì)經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染或處理，利用70%乙醇在4°C下固定1小時(shí)，之后利用經(jīng)過冰冷卻的PBS洗滌2次。之后利Mpropidiumiodide(50μg/ml),0.1%sodiumcitrate,0.3%NP40RRNaseA(50μg/ml)將細(xì)胞染色40分鐘，之后實(shí)施流式細(xì)胞分析(FACSCalibur,Beckton-Dickinson)。對(duì)于各個(gè)樣品，使用CellQuestPro軟件對(duì)20000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。為分析細(xì)胞表面的67kDLR的量，將IxlO6個(gè)細(xì)胞與識(shí)別IgG或67LR的細(xì)胞外區(qū)域的抗-LR抗體(MLuC5，lug)進(jìn)行培養(yǎng)，之后與FITC第二抗體進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過PBS洗滌后，利用FACS對(duì)樣品進(jìn)行掃描。4.免疫熒光染色或免疫組織化學(xué)染色利用70%甲醇固定9mm蓋玻片(coverslip)上的A549細(xì)胞，之后利用冰冷的PBS沖洗。利用含有CAS，3%BSA及0.5%TritonX-100的封閉緩沖溶液孵化(incubation)30分鐘，之后利用KRS抗體(Abeam)和MLuC-5抗體(Santacruz)培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。添加Alexa488及568(invitrogen)之后，在室溫下處理30分鐘。利用冰冷的PBS洗滌30分鐘，之后在激光掃描顯微鏡下觀察標(biāo)本。乳腺癌及肺癌的組織排列切片(tissuearrayslide)購自Super-Biochip(韓國)，為確認(rèn)67LR及KRS的表達(dá)水平，實(shí)施文獻(xiàn)(Park,S.G.etal.Humanlysyl-tRNAsynthetaseissecretedtotriggerpro-inflammatoryresponse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102,6356-6361(2005))中提及的對(duì)應(yīng)抗體和免疫組織化學(xué)染色。為了計(jì)算67LR與KRS的表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系，使用皮爾生χ2檢驗(yàn)及學(xué)生t檢驗(yàn)實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析。若P值<0.05，則確定為相關(guān)。全部統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSSvll.5軟件(SPSS,Chicago,111)實(shí)施。5.脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)(Pulse-chaseexperiment)使用IipofectAMINE2000,通過si-KRS或si-對(duì)照組(invitrogen)轉(zhuǎn)染293個(gè)細(xì)胞。在不含蛋氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，之后添加[35S]蛋氨酸(50yCi/ml)培養(yǎng)1小時(shí)。利用新鮮培養(yǎng)基洗滌放射線蛋氨酸，之后利用67LR的特異性抗體(Santacruz)使其免疫沉降，利用12%SDS-PAGE分離，之后利用BAS(FLA-3000，F(xiàn)ujifilm)使其曝光(autoradiography)。67LR的量利用Multi-gauge程序(V3.0，F(xiàn)ujifilm)測(cè)得。6.酵母雙雜交(yeasttwohybrid)分析編碼人類KRS的多個(gè)片段的cDNA，利用相應(yīng)的引物通過PCR得到。利用EcoRI及XhoI切割KRS的PCR產(chǎn)物，使pEG202載體(用于LexA-融合蛋白的制備)及pJG4_5載體(用于B42-融合蛋白的制備)的相應(yīng)位置連接。編碼37LRP片段的cDNA由BarbaraJ.BalIermann博士(阿爾伯特大學(xué))提供，并且插入到pJG4_5載體的EcoRI及BioI部位。兩種融合蛋白之間的相互作用，通過含X-gal酵母培養(yǎng)基上是否形成藍(lán)色菌落判斷。7.Invitro結(jié)合分析使GST-KRS或GST在大腸桿菌Rosetta(DEIB)菌株中表達(dá)，在含有1%iTritonX-100及0.5%N-月桂酰肌氨酸的PBS緩沖液中，在4°C下將所述的蛋白質(zhì)提取物與谷胱甘肽-頭孢菌素混合2小時(shí)。人類37LRP使用TNTQuickcoupledTranscription/Translationsystem(Promega)，使用pcDNA3_37LRP為模板，在[35S]蛋氨酸的存在下，通過invitrotranslation合成。合成的37LRP添加在所述的GST蛋白質(zhì)混合物中，在含有1%TritonX-100，0.5%N-月桂酰肌氨酸，ImMDTT,2mMEDTA及300μM苯甲磺酰氟的PBS緩沖液中進(jìn)行攪拌，同時(shí)在4°C下培養(yǎng)4小時(shí)，之后以含有0.5%TritonX-100的相同緩沖液洗滌6次。之后利用SDS樣品緩沖液將結(jié)合于瓊脂糖珠的蛋白質(zhì)溶出，利用SDS-PAGE分離，測(cè)定放射線(autoradiograph).8.細(xì)胞移動(dòng)(cellmigration)分析細(xì)胞移動(dòng)如參考文獻(xiàn)(Park，S.G.etal.Humanlysyl-tRNAsynthetaseissecretedtotriggerpro-inflammatoryresponse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102,6356-6361(2005))中所記錄的，利用帶有聚碳酸酯膜(8.0μπι孔徑，Costar)的Mielltranswell室測(cè)定。使A549細(xì)胞懸浮在無血清(serum-free)RPMI培養(yǎng)基中，之后以各個(gè)well中IxlO5個(gè)細(xì)胞的濃度加入到上室中。將所示濃度的精制人類KRS，層粘連蛋白(10yg/ml)或凝膠(10yg/ml)加入下室well中，使細(xì)胞在CO2培養(yǎng)儀中，在37°C下移動(dòng)6小時(shí)。細(xì)胞通過含有70%甲醇的PBS固定30分鐘，之后利用PBS洗滌3次。利用蘇木素(Sigma)將細(xì)胞染色10分鐘，之后利用蒸餾水洗滌。利用棉棒去除膜上部未移動(dòng)的細(xì)胞。將膜由室中分離，之后放置(mount)在GelMount(Biomeda，美國)上。通過在顯微鏡(x20)下四處任意選擇測(cè)定的方法，測(cè)定移動(dòng)的細(xì)胞(附著在膜的下位面上)。9.酶譜法(zymography)利用對(duì)標(biāo)記的siRNA及重組KRS(或DRS)進(jìn)行編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，分別培養(yǎng)48小時(shí)及M小時(shí)，之后接種在含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基中(IxlO5細(xì)胞/well)。在無血清RPMI培養(yǎng)基中將細(xì)胞饑餓處理(starving)2小時(shí)，之后添加層粘連蛋白，以10μg/ml培養(yǎng)M小時(shí)。將20μ1的培養(yǎng)基與切FOD緩沖液(含有4%SDS,20%甘油24及0.01%溴酚藍(lán)的0.125MTris-HCl,pH6.8)混合，之后實(shí)施含有l(wèi)mg/ml凝膠的10%SDS-PAG。利用2.5%TritonX-100將凝膠分別洗滌2次，每次20分鐘，之后與反應(yīng)緩沖液(含有IOmMCaCl2,150mMNaCl,ΙμΜZnCl2,1%TritonX-100，0·002%疊氮化鈉的50mMTris-HCl,pH7.5)在37°C下培養(yǎng)M小時(shí)。利用蒸餾水洗滌凝膠，利用庫馬西藍(lán)R250染色，之后利用35%甲醇脫鹽(destain)。10.生物體內(nèi)癌癥轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)用si-KRS，si-DRS或si_對(duì)照組轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T_1細(xì)胞，之后培養(yǎng)M小時(shí)。通過皮下注射的方法將細(xì)胞(IxlO6)注入6周齡雌性Balb/c小鼠等。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后測(cè)定剩余細(xì)胞中的目標(biāo)siRNA的作用。此外，在注入后的3日至10日，以2日為間隔通過免疫印跡分析法測(cè)定原發(fā)腫瘤(primarytumor)中與目標(biāo)siRNA的作用相應(yīng)的抗體。腫瘤生長以每周3次測(cè)定腫瘤大小的方式進(jìn)行監(jiān)控。與此同時(shí)測(cè)定全身體重。注入后21日處死小鼠，切除原生腫瘤及肺。利用10%福爾馬林將肺固定M小時(shí)。測(cè)定轉(zhuǎn)移到肺部的腫瘤結(jié)節(jié)(nodule)的數(shù)目和尺寸，直徑大于Imm的大型腫瘤結(jié)節(jié)單獨(dú)記錄。同時(shí)測(cè)定原生腫瘤的質(zhì)量。為確認(rèn)KRS過表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響的作用，利用嚙齒類KRS載體及空白載體(emptyvector)轉(zhuǎn)染4T-1細(xì)胞，之后在G418存在下將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體培養(yǎng)3周進(jìn)行篩選。選取若干個(gè)群體，通過免疫印跡法比較KRS表達(dá)水平。選取KRS表達(dá)水平高于對(duì)照組細(xì)胞的兩個(gè)不同的群體(KRS-l，KRS-2)用于注入。注入后第30日處死小鼠，此外與所述的方法相同地進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！磳?shí)驗(yàn)結(jié)果及考察〉總長度的KRS與37LRP之間的特異性相互作用通過酵母雙雜交分析得到確認(rèn)。LexA-KRS作為KRS的伴侶。(Kim，J.Y.etal.p38isessentialfortheassemblyandstabilityofmacromoleculartRNAsynthetasecomplexImplicationsforitsphysiologicalsignificance,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,7912-7916(2002))不僅與AIMP2結(jié)合，還與B42-37LRP結(jié)合(paired)，形成藍(lán)色群落，而在AIMPl中并非如此(圖1)。體外結(jié)合檢測(cè)，利用[35S]蛋氨酸標(biāo)記的37LRP，與GST-KRS或GST混合，利用谷胱甘肽-頭孢菌素沉淀后，實(shí)施自放射線拍攝。37LRP與GST-KRS共沉淀，而與GST并非如此(圖2)。利用酵母雙雜交分析，確認(rèn)通過缺失地圖(deletionmapping)確認(rèn)，人類KRS的N末端延長部位與LR的C-末端細(xì)胞外區(qū)域，與它們的結(jié)合不相關(guān)(圖3)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)37LRP轉(zhuǎn)換為膜包埋性67LR，因此本發(fā)明者確認(rèn)KRS在37LRP及67LR中相互不同地結(jié)合。將Myc-KRS導(dǎo)入肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，使其與抗-Myc抗體發(fā)生免疫沉淀。細(xì)胞溶解物的免疫印跡法結(jié)果，67LR以少于37LRP的量存在(圖4右側(cè))。然而，Myc-KRS優(yōu)先于37LRP與67LR結(jié)合(圖4左側(cè)).本發(fā)明者之后將A549細(xì)胞分離成細(xì)胞質(zhì)和原生質(zhì)膜部分，確認(rèn)了Myc-KRS與37LRP及67LR的相互作用。37LRP在細(xì)胞質(zhì)中，67LR在原生質(zhì)膜中，分別得到觀察(圖5右側(cè))，KRS在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有更多的量，但在兩部分中都存在。兩部分均與抗-Myc抗體發(fā)生免疫沉淀時(shí)，盡管細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在少量的37LRP沉淀，但膜中存在的67LR主要與KRS發(fā)生共沉淀(圖5左側(cè))，其示意了膜中存在的67LR及KRS之間的先后性相互作用。本發(fā)明者此后通過細(xì)胞分離和免疫熒光染色法，查明了KRS的細(xì)胞內(nèi)分布是否因A549細(xì)胞的層粘連蛋白處理而發(fā)生變化。層粘連蛋白處理后，KRS和67LR的膜內(nèi)存在量，與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的KRS及37LRP量或它們的表達(dá)幾乎無關(guān)，而逐漸增加(圖7及結(jié)果未圖示).免疫熒光染色中，67LR及KRS通過層粘連蛋白處理，說明了向膜一側(cè)移動(dòng)。(圖8，分別為紅色和綠色).發(fā)明者此后查明KRS的膜轉(zhuǎn)座(trmslocation)與翻譯后變形(post-trmscriptionalmodification)無關(guān).磷酸肌醇3-0H激酶(phosphoinositide3_0Hkinase，PI3K)(Shaw,L.Μ.，Rabinovitz,I.，Wang,H.H.，Toker，A.&Mericurio.Α.Μ.Activationofphosphoinositide3—0Hkinasebythealpha6beta4integrinpromotescareinomainvasion.Cell91，949-960(1997))，蛋白質(zhì)磷酸化酶C(ProteinkinaseC，PKC)(Li，Y.Q.etal.ProteinkinaseCmediatesthesignalforinterferon-gammamRNAexpressionincytotoxicTcellsaftertheiradhesiontolaminin.Immunology93,455—461(1998))，及磷月旨C-伽馬(phospholipaseC-gamma，PLC-gamma)(Vossmeyer,D.，Hofmann，W.，Loster，K.，Reutter，W.&Danker，K.PhospholipaseC-gammabindsalphalbetalintegrinandmodulatesalphalbetalintegrin-specificadhesion.J.Biol.Chem.277，4636-4643(2002)；Kanner,S.B.，Grosmaire，L.S.，Ledbetter,J.A.&Damle，N.K.Beta2—integrinLFA-IsignalingthroughphospholipaseC-gamma1activation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,7099-7103(1993))等少數(shù)相互不同的磷酸化酶，已知通過層粘連蛋白激活。為探明上述磷酸激酶中的哪些與KRS的層粘連蛋白的存在膜轉(zhuǎn)座相關(guān)，本發(fā)明者利用特異性抑制劑分別對(duì)各個(gè)激酶進(jìn)行了磷酸化酶阻斷，確認(rèn)了該處理如何對(duì)KRS的層粘連蛋白依存性膜轉(zhuǎn)座產(chǎn)生影響。膜分離中，KRS與67LR的層粘連蛋白的依存性增加，伴隨著PUK抑制劑LY^4002的存在受到抑制。U73122或星形孢菌素處理的細(xì)胞，與對(duì)照組相同地，顯示出67LRS的層粘連蛋白的依存性增加(圖9上及結(jié)果未圖示).上述磷酸化酶中，在任何細(xì)胞內(nèi)都不對(duì)KRS的量產(chǎn)生影響(圖9下).其結(jié)果，提示PII與KPS的層粘連蛋白誘導(dǎo)性磷酸化相關(guān)。事實(shí)上，磷酸化的KRS通過層粘連蛋白處理增加，另一方面，在LY^4002的存在下受到抑制，并且星形孢菌素不能產(chǎn)生任何影響(圖10).本發(fā)明者之后查明了KRS的層粘連蛋白與67LR之間的相互作用不需要誘導(dǎo)磷酸化。LY^4002處理能夠抑制KRS與67LR的層粘連蛋白誘導(dǎo)性結(jié)合(圖11)。細(xì)胞質(zhì)KRS在多重-ARS復(fù)合體中得到固定，因此本發(fā)明者探明KRS的層粘連蛋白依存性磷酸化與KRS復(fù)合體的其它酶組成成分谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶(glutamyl-prolyl-tRNAsynthetase,EPRS)發(fā)生共免疫沉淀，因此對(duì)多重-ARS復(fù)合體之間的結(jié)合不產(chǎn)生影響。在LY化合物缺失的情況下，層粘連蛋白處理能夠減少KRS與EPRS的結(jié)合，同時(shí)增加免疫缺失的溶解性成分(immuno-d印letedsolublefraction)的KRS(圖12上，下板的左側(cè)線).因此，結(jié)合于EPRS的KRS，在細(xì)胞經(jīng)過LY^4002前處理時(shí)，不受層粘連蛋白處理的影響(圖12上，下板的右側(cè)線)，這說明KRS的磷酸化不需要磷酸化而使KRS與復(fù)合體的層粘連蛋白依存性結(jié)合。本發(fā)明者此后確認(rèn)了KRS在A549細(xì)胞中，是否對(duì)67LR的膜內(nèi)存在量產(chǎn)生影響。67LR的量因?qū)诱尺B蛋白而增加，但層粘連蛋白效應(yīng)因KRS的特異性siRNA受到抑制時(shí)而消失(圖13左側(cè)).它在67LR的層粘連蛋白的存在促進(jìn)下，示意KRS的重要性本發(fā)明者通過流式細(xì)胞分析儀探明了膜內(nèi)存在的67LR。膜內(nèi)存在的67LR的量，通過細(xì)胞的KRS轉(zhuǎn)染，或者利用si-KRS轉(zhuǎn)染時(shí)，分別增加及減少(圖14).層粘連蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)分布，通過共載體(EV)或KRS轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞間免疫熒光染色進(jìn)行比較。層粘連蛋白受體與對(duì)照組比較，在KRS過表達(dá)細(xì)胞的膜部位強(qiáng)烈染色(圖15).之后，KRS與67LR之間的正性相關(guān)(positivecorrelation)，是通過基于多種KRS的量的膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的67LR存在量得到測(cè)定(圖2。本發(fā)明者探明了KRS如何使67LR的膜內(nèi)存在量得到增加。KRS通過由37LRP轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)換(conversion)，促進(jìn)67LR。但是，KRS的感染除了LR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的潛在性作用之外，不能使LR轉(zhuǎn)錄增加(結(jié)果未圖示).KRS在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不能很好地與37LRP結(jié)合(圖4，圖5)，因此等同于促進(jìn)了KRS使37LRP轉(zhuǎn)化為67LR的過程。37LRP的變形，在37LRP轉(zhuǎn)換為67LRWilfMΦ,^(Landowski,Τ.H.，Dratz,Ε.，Α.&Starkey，J.R.Studiesofthestructureofthemetastasis-associated67kDalamininbindingprotein:fattyacidacylationandevidencesupportingdimerizationofthe32kDageneproducttoformthematureprotein.Biochemistry34,11276-11287(1995)；Buto,S.etal.Formationofthe67-kDalamininreceptorbyacylationoftheprecursor.J.Cell.Biochem.69,244-251(1998))，KRS介導(dǎo)37LRP的脂肪族?；?fattyacylation)。本發(fā)明中，KRS對(duì)37LRP的脂肪族?；耆划a(chǎn)生影響(結(jié)果未圖示)。KRS可促進(jìn)存在于膜中的67LR的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性，因此本發(fā)明者探明KRS是否抑制膜中存在的67LR的細(xì)胞內(nèi)吞作用(endocytosis)。為了確認(rèn)所述的可能性，本發(fā)明者利用環(huán)十二碳三烯(cyclohexamide)，從根本上(denovo)抑制了蛋白質(zhì)合成，測(cè)試KRS在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中是否對(duì)67LR的存在量產(chǎn)生影響。在KRS的表達(dá)因其特異性siRNA而受到抑制時(shí)，67LR的膜內(nèi)存在量減少，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分的量增加(圖16左側(cè))。與此相反，KRS的過表達(dá)如上所述，使膜內(nèi)67LR的存在量增加(圖16右側(cè))。以此結(jié)果為基礎(chǔ)，KRS抑制67LR再次進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此如同使膜內(nèi)67LR的存在量增加。此外，本發(fā)明者通過脈沖追蹤(pulse-chase)試驗(yàn)探明了67LR的代謝轉(zhuǎn)換(turnover)中KRS的作用。初始蛋白質(zhì)合成通過放射性蛋氨酸標(biāo)記，此后受放線菌酮抑制，此后觀察到67LR的消失(disappearance)。67LR在KRS因siRNA受到抑制時(shí)急劇減少，其數(shù)值在si-對(duì)照組中隨時(shí)間間隔保持。(圖17)。本研究者此后探明，對(duì)照組細(xì)胞的移動(dòng)因?qū)诱尺B蛋白處理而平均增加了6倍(圖M及圖18)。然而層粘連蛋白依存性細(xì)胞移動(dòng)，在KRS受到si-RNA抑制時(shí)減少(圖18，si-對(duì)照組及si-KRS)。此外，KRS的過表達(dá)因?qū)诱尺B蛋白處理而促進(jìn)的細(xì)胞移動(dòng)而增加(圖18，EV及KRS)。然而在細(xì)胞移動(dòng)中，KRS的作用因?qū)诱尺B蛋白受體因si-RNA抑制而消失(圖18，si-LR，下板).KRS在少數(shù)癌細(xì)胞中作為蛋白激酶分泌(Park，S.G.etal.Humanlysyl-tRNAsynthetaseissecretedtotriggerpro-inflammatoryresponse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，6356-6361(2005))。當(dāng)A549細(xì)胞以不同濃度精制的KRS進(jìn)行處理時(shí)，該分析中KRS的細(xì)胞外因性作用除外，細(xì)胞移動(dòng)幾乎不受影響(圖25)。相反，細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞周期，不由所述的過程的作用引起(圖沈及圖27)。層粘連蛋白處理引起MMP-2(matrixmetllo-proteinase-2)的活化(Givant-Horwitz,V.，Davidson,B.&Reich,R.Laminin—inducedsignalingintumorcellstheroleoftheM(r)67,OOOlamininreceptor.CancerRes.64,3572-3579(2004)),因此MMP-2的活性因?qū)诱尺B蛋白活化，且在si-KRS的存在下受到抑制(圖19右側(cè)).MMP-2的表達(dá)量不受KRS的影響(圖19下)。由于KRS能夠促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，因此通過特異性siRNA抑制了DRS(aspartyl-tRNAsynthetase)的表達(dá)。si_KRS及si_DRS的抑制作用可通過免疫印跡確認(rèn)(圖觀)。注入的三種產(chǎn)生具有類似質(zhì)量和體積的腫瘤(圖四)。注入后21日將肺部分離，轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)(直徑大于Imm)的數(shù)目在三組之間進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)目在對(duì)照組及DRS抑制的細(xì)胞中在KRS的抑制方面顯著減少(圖20及圖30)。相反，所述的方法中，KRS的過表達(dá)促進(jìn)了癌癥轉(zhuǎn)移。與共載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，篩選出表達(dá)KRS的2個(gè)其它不同的細(xì)胞(KRS-1及KRS-2)(圖31)。上述細(xì)胞能夠生成質(zhì)量和尺寸類似的原發(fā)腫瘤(圖32)。注入細(xì)胞后30日對(duì)肺進(jìn)行檢查時(shí)，KRS-過表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，生成較多的結(jié)節(jié)(圖21及圖33)。該結(jié)果暗示KRS在生物內(nèi)誘導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移。由于觀察到層粘連蛋白受體的癌癥特異性過表達(dá)(Rmtanini，G.etal.67-Kilodaltonlamininreceptorexpressioncorrelateswithworseprognosticindicatersinnon-smallcelllungcarcinomas.Clin.CancerRes.3,227-231(1997)；Viacava,P.etal.Thespectrumof67~kDlamininreceptorexpressioninbreastcarcinomaprogression.J.Pathol.182,36-44(1997)),67LR的過表達(dá)可以肺癌和乳腺癌為例通過67LR及KRS的免疫組織化檢索進(jìn)行分析。39個(gè)被檢查的肺癌組織中，67LR過表達(dá)觀察到21例(%)，其中KRS水平在19例(約90%)中增加(表1及圖22上方)。同樣地，40個(gè)檢查出乳腺癌的患者中，21例觀察到67LR過表達(dá)。其中21例均為KRS水平增加(表1及圖22下方)。在他們的共表達(dá)轉(zhuǎn)移中，需要通過實(shí)際觀察進(jìn)行確認(rèn)，兩種情況均在兩蛋白質(zhì)的表達(dá)中表現(xiàn)出緊密相關(guān)。表1肺癌67LR正常67LR過表達(dá)合計(jì)KRS正常10212KRS過表達(dá)81927合計(jì)182139*fisher精確T檢驗(yàn)ρ=0·001乳腺癌67LR67LR合計(jì)正常過表達(dá)KRS正常505KRS過表達(dá)142135合計(jì)191140*fisher精確T檢驗(yàn)p=0.018此時(shí)，可參考上述表1作出以下說明表1在腫瘤組織中的67LR和KRS表現(xiàn)出相28關(guān)關(guān)系。表1中，67LR的表達(dá)量與KRS表達(dá)量相關(guān)，利用肺癌和乳腺癌組織微陣列使用各自的抗體，對(duì)免疫組織化學(xué)染色，對(duì)上述兩種蛋白的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。為標(biāo)記67LR使用了MluC5抗體。表達(dá)量通過樣品的染色濃度進(jìn)行測(cè)定，隨機(jī)分為4組(0，1，2和3分)。在最后的評(píng)價(jià)，分成樣品正常組(0分或1分)和過表達(dá)組O分或3分)。為評(píng)估67LR與KRS表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，通過皮爾遜χ2檢驗(yàn)和學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)施。此時(shí)，若P值小于0.05(P<0.05)，則作為一個(gè)有效的數(shù)值考慮。所有的統(tǒng)計(jì)分析通過SPSSvll.5軟件(SPSS，Chicago,111)實(shí)施。含有核糖體組成因子的許過翻譯因子具有多面性(Wool，I.G.ExtraribosomalfunctionsofribosomalproteinsTrendsBiochem.Sci.21,164-165(1996))，并且與多種腫瘤生成過程相關(guān)(Lee，S.W.，Kang,Y.S.&Kim，S.Multi-functionalproteinsintumorigenesis:Aminoacyl_tRNAsynthetasesandtranslationalcomponents.Curr.Proteomics3,233-247(2006)).其中，兩個(gè)翻譯因子KRS及p40/37LRP在生物體內(nèi)表現(xiàn)出細(xì)胞移動(dòng)及癌轉(zhuǎn)移的共同作用(圖18至圖22).在多重ARS-復(fù)合體的組成要素中，KRS是最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其它組成要素則需要一定的穩(wěn)定性(Han,J.Μ.etal.HierarchicalNetworkbetweenthecomponentsofthemulti-tRNAsynthetasecomplex:Implicationsforcomplexformation.J.Biol.Chem.281，38663-38667(2006))，該事實(shí)提示了使其它相關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的KRS的潛在能力。其中，KRS的作用也能夠使67LR中的細(xì)胞穩(wěn)定增加(圖17).KRS與67LR之間的相互關(guān)系，提示其具有其它相關(guān)的功能。癌細(xì)胞中，過表達(dá)或如PII的過激活上位磷酸化酶引起的結(jié)果，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性的(constitutive)膜轉(zhuǎn)移，因此使KRS的膜水平非正常增加。此外，PI3K的活性減少，也經(jīng)常與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)(Wymann,M.P.&Marone,R.Phosphoinositide3-kinaseindisease:timing，location，andscaffolding.Curr.Opin.CellBiol.17,141-149(2005)),并且層粘連蛋白通過PI3K±曾力口了癌癥浸潤(Baba,Y.etal.Laminin—332promotestheinvasionofoesophagealsquamouscellcarcinomaviaPI3Kactivation.Br.J.Cancer98，974-980(2008))。PII的結(jié)構(gòu)性活化，能夠引起向膜移動(dòng)的KRS的磷酸化。上述條件的一部分或全部，有望在原生質(zhì)膜中引起67LR的增加，并且使癌轉(zhuǎn)移的層粘連蛋白信號(hào)傳遞得到放大。癌轉(zhuǎn)移性擴(kuò)張調(diào)節(jié)方面正在進(jìn)行很多研究。其中，在癌癥轉(zhuǎn)移中的KRS通過67LR的活性，為癌癥診斷及治療提供了創(chuàng)新。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用綜上所述，本發(fā)明者通過使KRS轉(zhuǎn)座(translocation)在原生質(zhì)膜中，使其與67LR相互作用，從而促進(jìn)了腫瘤(或癌)細(xì)胞的移動(dòng)，并闡明了它對(duì)癌的轉(zhuǎn)移(metastasis)產(chǎn)生的影響。因此，本發(fā)明能夠利用KRS調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)，并且進(jìn)一步地實(shí)現(xiàn)了與原生質(zhì)膜的層粘連蛋白受體(67LR)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)代謝。本發(fā)明中闡明的KRS與層粘連蛋白受體之間的相互關(guān)系，可用于與其相關(guān)的多種疾病或頑癥的治療，可用于預(yù)防和/或診斷。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶(LysyltRNAsynthetase,KRS)的細(xì)胞內(nèi)水平，從而調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移(cancermetastasis)的方法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，降低賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而抑制癌癥轉(zhuǎn)移。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，提高賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的賴氨酰tRNA合成酶由序號(hào)1所示的氨基酸序列組成。5.一種調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的移動(dòng)(cancercellmigration)的方法。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的移動(dòng)的方法，其特征在于，降低賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而抑制癌細(xì)胞的移動(dòng)。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的移動(dòng)的方法，其特征在于，提高賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的移動(dòng)。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的賴氨酰tRNA合成酶由序號(hào)1所示的氨基酸序列組成。9.一種含有表達(dá)載體或KRS的抗體作為有效成分的癌癥預(yù)防及治療用組合物，其特征在于，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，所述的癌癥選自由大腸癌，肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，膽囊癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，睪丸癌，宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，絨毛癌，卵巢癌，乳腺癌，甲狀腺癌，腦癌，頭頸部癌，惡性黑色素瘤，淋巴瘤，再生障礙性貧血組成的組。11.一種將表達(dá)載體或KRS的抗體以有效量給予需要它的個(gè)體的癌癥預(yù)防及治療方法，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。12.一種用于制造癌癥治療劑的抗體對(duì)于表達(dá)載體或KRS的用途，該表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子及可被啟動(dòng)并與其連接的編碼KRS的多核苷酸的反義RNA(antisenseRNA)或siRNA的編碼多核苷酸。13.—種癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)調(diào)節(jié)制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑存在下使KRS與試驗(yàn)制劑接觸；(b)測(cè)定KRS的活性，篩選使KRS的活性發(fā)生變化的試驗(yàn)制劑；(c)測(cè)試篩選出的制劑是否調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)。14.一種阻礙KRS與67LR之間的相互作用的制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)制劑存在下，使KRS、層粘連蛋白受體(67LR)及試驗(yàn)制劑接觸；(b)測(cè)試所述的試驗(yàn)制劑是否對(duì)KRS與層粘連蛋白受體的相互作用(interaction)進(jìn)行調(diào)節(jié)。15.一種診斷肺癌或乳腺癌的方法，該方法包括以下步驟(a)在樣品中分析67LR是否過表達(dá)；(b)在67LR過表達(dá)的樣品中，分析KRS是否過表達(dá)。全文摘要本發(fā)明涉及通過使賴氨酰tRNA合成酶轉(zhuǎn)座(translocation)在原生質(zhì)膜中，使其與67LR相互作用，從而促進(jìn)腫瘤(或癌)細(xì)胞的移動(dòng)，使對(duì)癌的轉(zhuǎn)移(metastasis)產(chǎn)生影響的，賴氨酰tRNA合成酶的新功能，具體地說，利用所述的新功能，調(diào)節(jié)賴氨酰tRNA合成酶的細(xì)胞內(nèi)水平，從而調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞的移動(dòng)的方法，為預(yù)防或治療癌癥，具有抑制KRS表達(dá)的組成的表達(dá)載體的用途，為預(yù)防或治療癌癥，抑制KRS活性的制劑的用途，篩選癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)調(diào)節(jié)制劑的方法，及篩選抑制KRS與67LR的相互作用的制劑的方法。因此，本發(fā)明能夠利用KRS調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移或癌細(xì)胞移動(dòng)，從而調(diào)節(jié)原生質(zhì)膜的層粘連蛋白受體(67LR)的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)代謝。本發(fā)明中闡明的KRS與層粘連蛋白受體之間的關(guān)系，可用于與其相關(guān)的多種已經(jīng)或頑癥的治療、預(yù)防和/或診斷。文檔編號(hào)C12N15/113GK102124104SQ200880130752公開日2011年7月13日申請(qǐng)日期2008年8月18日優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日發(fā)明者崔鎮(zhèn)宇,金圣勛申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)