專利名稱：懸滴板的制作方法
技術領域：
根據(jù)獨立權利要求1的一般部分，本發(fā)明涉及懸滴板。該懸滴板包括具有第一表面和與第一表面基本共平面的第二表面的體部。第二表面包括粘附地接收液體量的至少一個液滴接觸區(qū)域。在該液體量內，可培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體。該液滴接觸區(qū)域借助凸出結構與周圍區(qū)域進行區(qū)分，該凸出結構防止液體量在懸滴板體部的第二表面上擴散。
背景技術：
通常認為以3D構造培養(yǎng)的細胞比典型的單層細胞培養(yǎng)中的細胞(參見，例如 Yamada and Cukiermann, Cell, 2007 ；Pamploni et al. Nature ReviewsMolecular Cell Biology, 2007)在生理方面更適合。將細胞誘導(coaxing)成第三維是精密設計問題。目前的技術大部分基于支架(scaffold)材料的使用或用于使細胞定形的單層的疊層。可是， 盡管有生物利益，但由于細胞培養(yǎng)過程更復雜，耗時以及需要附加生物材料，因而目前技術發(fā)展水平的工藝不是實驗室例行程序或已適于應用，如藥物研發(fā)或毒性分析的工業(yè)規(guī)模進行使用。細胞的再聚集是將細胞誘導(coax)成第三維的一個可選擇的方法。但是，當前的再聚集技術已經主要利用瘤細胞線被證實，并且缺少受控的共培養(yǎng)的可能性。懸滴(HD-) 技術已經表現(xiàn)為能夠利用瘤細胞以及原細胞進行3D細胞培養(yǎng)的普遍方法(參見Kelm and Fussenegger,2004, Trends inBiotechnology Vol. 22，No. 4 :195-202)。具有懸浮細胞的細胞培養(yǎng)介質的液滴被放在細胞培養(yǎng)表面上，并且翻轉板。因為不存在其上能夠粘附細胞的可獲得的基質，細胞在液滴的底部聚集并形成微組織。在懸垂于表面上的液滴中培養(yǎng)細胞對于本領域技術人員是公知的。例如根據(jù) DE10362002 B4，知曉營養(yǎng)介質中細胞懸浮物滴借助吸液管沉積在陪替氏培養(yǎng)皿蓋內表面上的常規(guī)方法。陪替氏培養(yǎng)皿蓋隨后必須被翻轉并放置在適當?shù)呐闾媸吓囵B(yǎng)皿基板上。在如此閉合的陪替氏培養(yǎng)皿內，液滴從蓋表面懸垂。陪替氏培養(yǎng)皿通常包含用于為懸滴提供防止懸滴變干的濕氣的濾紙。該常規(guī)懸滴技術的最關鍵步驟之一是使附著有液滴的板翻轉；由此，該關鍵步驟通常由具有經驗的科學家手動實行。根據(jù)W003/078700 Al，知曉懸滴技術的應用用于培養(yǎng)干細胞和蛋白質晶體的產生。懸滴技術的優(yōu)點包括這樣的事實在調查研究中，基質完全由營養(yǎng)介質所圍繞，營養(yǎng)介質提供需要的所有因子，如離子，分化因子，有毒基質等。另外，細胞(例如干細胞)的聚集被促進的原因在于細胞落到了液滴頂點，在此細胞相遇并形成群(例如，胚體)而沒有接觸固體表面。液滴的表面張力防止細胞以及細胞聚集體穿過小滴表面?？墒牵梦汗苁┘拥囊旱慰蓛H包括少量，只要液滴在翻轉表面過程中可在表面上移動用以提供適當?shù)奈恢靡员憬业?。為了提供相同尺寸的較大液滴并由此能夠實現(xiàn)相同培培養(yǎng)或反應環(huán)境，提出在特殊表面上限定液滴接觸區(qū)域的尖緣的凸出結構。更近地(參見，例如 Kelm et al. 2004 or Khademhosseini et al. 2006， PNASMo 1. 103，No. 8 :2480-對87)，懸滴中細胞培養(yǎng)已經被稱作使用重力細胞結集的微尺寸組織工程。由此，Khademhosseini等人支持在聚乙烯乙二醇(PEG)微井(microwell)中使用重力細胞結集的微尺寸組織工程；Kelm和Fussenegger在微井的井中或Terasaki板中應用懸滴技術。

發(fā)明內容
所有這些文獻報道了翻轉液滴粘附的基板以便將其適當?shù)靥峁閼业蔚谋匾浴Ｔ诜D之后，基板被報道以水平放置或包括關于水平方向的最多90°角(參見 W003/078700 Al)。上述翻轉對于手動處理是困難的并且甚至對于機器人執(zhí)行也是困難的。 因此，板的所需手動翻轉阻止了大量生產和自動操作的兼容性。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種懸滴板，其提供液滴粘附的基板的任何非必要翻轉。本發(fā)明的另一目的是在吸取和/或釋放微組織的最小危險情況下能夠以可反復的方式實行介質交換。這些目的能夠借助根據(jù)獨立權利要求1特征的懸滴板實現(xiàn)。在開始介紹并根據(jù)本發(fā)明的該懸滴板的特征在于體部進一步包括至少一個管道，其從體部的第一表面方向進入至少一個液滴接觸區(qū)域。其它的本發(fā)明和優(yōu)選特征從從屬權利要求中獲得。根據(jù)本發(fā)明的懸滴板和懸滴技術的優(yōu)點包括-不存在所需的支架；-可應用于小的液體量和細胞數(shù)量；-提供細胞聚集體的尺寸控制；-可適用于寬范圍的細胞/組織類型，如肝的微組織(例如IfepG2)，心肌扁球體， 和微軟骨；-能夠提供限定的多細胞類型系統(tǒng)，諸如例如包圍纖維原細胞的芯的外層內皮細胞層；-能夠以短的生產時間產生所需的細胞聚集體；-提供使3D細胞培養(yǎng)技術和目前2D細胞培養(yǎng)技術一樣方便的平臺技術；-系統(tǒng)包括HD-板形式，其為多井板裝配例如96或384個井；-通過頂加載利用例如自動多通道吸液的機器人產生懸滴；-細胞播種和/或介質交換可借助自動吸液管實行。


現(xiàn)基于在示意性附圖中描述的選定的、示例性實施例更詳細地描述本發(fā)明的懸滴板，所述附圖將說明優(yōu)選實施例而不劃定本發(fā)明的范圍。其中圖1是根據(jù)第一實施例的具有呈圓柱形/截頭圓錐形的管道的懸滴板的單位單元的前視圖和頂視圖以及3D展示；圖2是根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元的前視圖和頂視圖以及3D展示；圖3是根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元的線性陣列的前視圖和頂視圖；圖4是根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元的二維陣列的前視圖、側視圖和頂視圖以及3D展示；圖5是根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道、結合頂和底蓋板的懸滴板的單位單元的二維陣列的前視圖和側視圖；圖6是圖5的蓋板的前視圖、側視圖和頂視圖以及3D展示；圖7是根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的液滴接觸區(qū)域處懸垂的培養(yǎng)介質液滴的攝影影像；管道基本被填充以培養(yǎng)介質；圖8是圖7中攝影影像的示意性截面圖；圖9是懸滴板的第一和第二實施例的可選擇變型，其中圖9A示出了防止液體量在體部的第二表面上擴散的兩種可選擇凸出結構；圖9B示出了防止液體量在體部的第二表面上擴散的兩種不同表面處理；圖9C示出了另外提供最小和最大化液滴容量的兩種可選擇凸出結構；圖10是具有體部的懸滴板的示意性截面圖，體部包括彼此連在一起的上部分和下部分，其中圖IOA示出了用于將液體線固定到管道的側入口的變型；圖IOB示出了具有流體地與兩個或多個管道相連用以維384個液滴陣列提供從96 個頂分配器頭分配的液體的敞開的頂入口隔間的變型；圖11是利用根據(jù)圖7的懸滴板產生的新生鼠心肌細胞的微觀圖像；圖12是人類肝癌細胞的微觀圖像，其中圖12A示出了 100細胞/滴，和圖12B示出了 250細胞/滴；圖13是鼠胰島細胞在播種之后不同時間點的微觀圖像，其中圖13A示出了 3小時潛伏期之后的細胞；圖13B示出了 M小時潛伏期之后的細胞；和圖13C示出了 96小時潛伏期之后的微組織。
具體實施例方式圖1示出了根據(jù)第一實施例的具有呈圓柱形/截頭圓錐形(包括第一截圓錐，圓柱體，和第二截圓錐)的管道的懸滴板的單位單元的前視圖和頂視圖以及3D展示。懸滴板 1包括具有第一表面3和基本與第一表面3共平面的第二表面4的體部2。第二表面4包括用于粘附地接收液體量6的至少一個液滴接觸區(qū)域5 (參見圖7和8)以便在其中培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體。至少一個液滴接觸區(qū)域5借助防止液體量6在體部2的第二表面4 上擴散的凸出結構8與周圍區(qū)域7進行區(qū)分。體部2進一步包括至少一個管道9，其根據(jù)體部2的第一表面3的方向開口入至少一個液滴接觸區(qū)域5內。這種情況中的凸出結構8被實現(xiàn)為圓環(huán)邊緣(circular rim)，管道9從第一表面 3到第二表面4沿基本垂直的方向穿過整個體部2。管道9包括入口隔間12，其定位為靠近體部2的第一表面3。在此，入口隔間12被實現(xiàn)為體部2內部的管道9的加寬部分13，其被實現(xiàn)為一個整體元件。管道9包括培養(yǎng)隔間17，其定位為靠近體部2的第二表面4并包括至少一部分的液滴接觸區(qū)域5。在該實施例中，培養(yǎng)隔間17被實現(xiàn)為具有直壁的漏斗形凹陷。管道9包括毛細管部分1，其直徑為至少10 μ m，優(yōu)選在10 μ m和500 μ m之間，最優(yōu)選在50μπι和200 μ m之間。管道9的圓柱形毛細管部分18的長度為在0. Imm和30mm之間，優(yōu)選在0.5mm和2mm之間。從圖1中可以看出，管道9實現(xiàn)為無支路的通道，其基本垂直地延伸到第一和第二表面3、4，并且管道9的所有部分都是同軸對齊的。圖2示出了根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元的前視圖和頂視圖以及3D展示。已經關于第一實施例說明的大部分部件也在此應用?？墒?， 在該實施例中，培養(yǎng)隔間17被實現(xiàn)為具有彎曲壁的漏斗形凹陷。管道9包括毛細管部分18， 其直徑為至少10 μ m，優(yōu)選在10 μ m和500 μ m之間，最優(yōu)選在50 μ m和200 μ m之間。管道 9的圓柱形毛細管部分18的長度在此為0mm，管道9再次被實現(xiàn)為無支路的通道，其基本垂直地延伸到第一和第二表面3、4，并且管道9的所有部分都是同軸對齊的。從圖2的展示可以得出，管道9的圓柱形毛細管部分18也可增至30mm。圖3示出了根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元(參見圖幻的線性陣列的前視圖和頂視圖。單位單元的軸被分開以重復的軸距23，其優(yōu)選是根據(jù)具有對、96或384個壁的已知標準微板的軸距18mm、9mm或4. 5mm(參見published standard dimensions of mi crop IatesAmerican National Standards Institute/ Society for BiomolecularSciences :ANSI/SBS 1-2004， ANSI/SBS 2-2004， ANSI/SBS 3-2004，ANSI/SBS4-2004)。圖4示出了根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道的懸滴板的單位單元的二維陣列的兩個前視圖和頂視圖以及3D展示。優(yōu)選尺寸被指出并且非常接近標準微板的尺寸。實際上，在此描繪了 384個液滴接觸區(qū)域5和管道9的二維陣列。因此，軸距優(yōu)選是 4. 5mm以便滿足ANSI/SBS標準并能夠合并懸滴板1中384個液滴接觸區(qū)域5和管道9的陣列，所述懸滴板具有至少大約是標準微板的尺寸。然而，懸滴板1的單位單元優(yōu)選彼此緊密接觸(類似還在圖3中所示)，這些單位單元的陣列優(yōu)選地由水平板M圍繞。水平板對本身優(yōu)選地由垂直邊緣25圍繞，垂直邊緣表現(xiàn)出下網沈和上凹陷27。網沈和凹陷27具有這樣尺寸它們用作適于緊密地疊置懸滴板1和將疊置的板保持在適當位置的疊置裝置。 從圖4中可以看出，網沈和凹陷27的高度在所有情況下是大約2mm。脫離圖4的顯示，網沈和凹陷27的位置在不失去用作疊置裝置的功能的情況下可互換。同樣，水平板M和垂直邊緣25的尺寸在不脫離本發(fā)明的精神的情況下可改變。可是，優(yōu)選地，在任意情況中，垂直邊緣25凸出超過第一邊緣3以及懸滴板1的第二表面4的下方。特別優(yōu)選地(參見圖4)，垂直邊緣25還凸出于懸滴板1的第二表面4的凸出結構8 的下方。上述凸出的垂直邊緣25另外地確保懸滴板1的第一和第二表面3、4不被損害或接觸。這兩個表面的污染危險同樣通過垂直邊緣25被大大降低。圖5示出了根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道、結合頂和底蓋板的懸滴板的單位單元的二維陣列的前視圖和側視圖。如圖4中所示，在此描繪了 384個液滴接觸區(qū)域5和管道9的二維陣列。再次地，這些單位單元的陣列優(yōu)選地由水平板M圍繞，水平板優(yōu)選由表現(xiàn)出下網26和上凹陷27的垂直邊緣25圍繞。網沈和凹陷27具有這樣尺寸它們用作適于緊密地疊置懸滴板1和將疊置的板保持在適當位置的疊置裝置。特別優(yōu)選地， 蓋板22還表現(xiàn)出與懸滴板1相對應的下網沈和上凹陷27。特別優(yōu)選的是蓋板22被實現(xiàn)用以根據(jù)情況用作底和/或頂蓋板。這是有利的，相同的蓋板22能夠用作懸滴板1下方的殼或其頂部上的罩。特別是在培養(yǎng)或在至少一個液體量6中培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的過程中的孵育過程中，液體量粘附于懸滴板1的液滴接觸區(qū)域5，優(yōu)選地在頂側和底側上覆蓋懸滴板1以便避免液體量6或管道9中液體的不可接受的蒸發(fā)。優(yōu)選地，在第一懸滴板1的底部， 蓋板22被放置作為底部殼板。該第一懸滴板1可由現(xiàn)在用作罩的第二蓋板22覆蓋。兩個蓋板22和位于之間的一個懸滴板1的上述夾層結構是優(yōu)選形成為適于存儲，培養(yǎng)或孵育以及懸滴板的安全運輸?shù)淖钚挝?，無論其是否裝載有液體量和細胞和/或分子(參見圖5)。對于利用溫度控制進行的裝置內的孵育或培養(yǎng)，幾個懸滴板1可直接疊置在彼此的頂部上并僅在最上和最下的懸滴板1的頂端和底部覆蓋蓋板22。這在疊層的所有懸滴板都裝載相同的樣品以便不必擔心交叉污染時尤其是優(yōu)選的?？墒?，如果裝載不同的樣品 (在疊層的相同或不同懸滴板1內)，優(yōu)選在每個懸滴板1之間用中間放置的蓋板22分開懸滴板1。當然，能夠生產單獨的懸滴板1(參見圖4)和分開的蓋板22 (參見圖6)；優(yōu)選地在所有情況下具有相同尺寸的下網沈和上凹陷27?？墒?，對于培養(yǎng)細胞或生產分子聚集體的最優(yōu)選組合優(yōu)選地包括一個懸滴板1和兩個蓋板22。圖7示出了根據(jù)第二實施例的具有呈雙曲線形狀的管道9的懸滴板1的液滴接觸區(qū)域5處懸垂的培養(yǎng)介質液滴的攝影影像。明顯地，管道9基本被填充以培養(yǎng)介質。這將液滴(例如液體量6)保持在液滴接觸區(qū)域5是由于不同元件的組合作用a)管道9的毛細管力抵抗重力和管道9中吸引液滴的靜水壓力起作用。b)液滴接觸區(qū)域5中最終存在的選擇的親水涂層支持液體量6的液體量6的粘附并抵抗靜水壓力和重力起作用。c)凸出結構8 (在此實現(xiàn)為邊緣)穩(wěn)定液體量6并支持液體量6的實際容量的確定。d)液滴的表面張力另外地穩(wěn)定液體量6。e)施加到懸滴板1的周圍區(qū)域7的選擇的親水涂層21另外地可穩(wěn)定液體量6。實際上，從根據(jù)第二實施例的懸滴板1 (參見圖2和3)的單位單元的線性陣列的原型獲取圖像，懸滴板具有呈雙曲線形狀的管道。為了將原型放置在用作底殼的陪替氏培養(yǎng)皿，原型已經配有水平板對、垂直邊緣25以及全部圍繞懸滴板1的單位單元的臺板觀。 因此，在單位單元之間，原型懸滴板1的水平板對和垂直邊緣25以及陪替氏培養(yǎng)皿(在此看不到)下方，形成實際封閉的空間，這允許飽和的濕潤大氣被保持圍繞位于各個液滴接觸區(qū)域5的液體量6。為了支持圖像的理解，圖8示出了圖7中攝影圖像的示意性截面圖。如所有圖中所示，相同參考標記指示相同或相似特征，即使在各種情況中未被詳細討論。圖9示出了懸滴板的第一和第二實施例的可選擇變型。懸滴板1的設計是根據(jù)圖 7和8中所示的原型?？墒牵哂信c標準微板相似的形狀和尺寸的單一單位單元或整個懸滴板1也能示出根據(jù)在此所示變型的單位單元。圖9A示出了防止根據(jù)本發(fā)明的懸滴板1的體部2的第二表面4上液體量6擴散的兩個可選擇的凸出結構8。凸出結構8(取代于邊緣)可實現(xiàn)為環(huán)狀凹陷(參見左側)或環(huán)狀隆起(參見右側)。無論如何，凸出結構8外形上方向的重大改變安全地限定了液體量 6或液滴的邊界。圖9B示出了防止根據(jù)本發(fā)明的懸滴板1的體部2的第二表面4上液體量6擴散的兩種不同表面處理。在左側，液滴接觸區(qū)域5選擇地覆蓋有生物活性化合物，其從包括多肽(抗體，增長因子，酶)和多聚核苷酸(RNA，DNA單或雙鏈)。在右側，周圍區(qū)域7選擇地覆蓋有親水涂層21。這兩種處理的組合也是特別優(yōu)選的。親水涂層21的使用甚至可免除合并第二表面4上附加邊緣或凹陷形式的凸出結構的必要性。因此，在此所示的邊緣四足以用作凸出結構8。圖9C示出了另外提供最小化和最大化液體量的兩種可選擇凸出結構。在左側，形成具有邊緣四的凹陷。在此，液體量是最大的。在右側，形成具有邊緣四的隆起；因此，最小化液滴容量。另外，在此示出了懸滴板1，其管道9包括定位為與體部2的第一表面3接近的入口隔間12。優(yōu)選地，入口隔間12被實現(xiàn)為體部2內部管道9的加寬部分13 (參見例如圖9A和9B)或在此描述的體部2的第一表面3上的杯部14。上述加寬部分13和杯部 14的組合也是可行的(未示出)。在此請注意，很重要地是，附圖示出和/或說明書中描述的特征的任意組合能夠被使用以及由本發(fā)明的精神所包含。圖10示出了具有體部2的懸滴板1的示意性截面圖，體部包括彼此連在一起的上部分15和下部分16。該兩部分結構極大地促進了可選擇懸滴板1的生產，懸滴板所具有的管道9沿基本垂直方向部分地在至少一個液滴接觸面積5內穿過體部2，并且部分地基本平行于懸滴板1的第二表面4延伸。圖IOA示出了具有用于將液體線固定于于管道的側入口的變型。在此，管道9包括位于體部2的側前部11的入口連接部10。不同于圖1至8中所示的實施例，其中液體借助一個或多個吸液管或吸液機器人被分配到懸滴板1的管道9，線30可直接與懸滴板1 相連。通過上述線30，液體以及細胞或分子能夠在任何時間被分配給懸滴板1的液體量6。 因此，促進了液體的交換，如液體量6中緩沖劑或洗液。圖IOB示出了具有敞開的頂部入口隔間的變型，隔間與兩個或多個管道流體相連以便為384個液滴陣列提供從96個頂部分配頭分配的液體。在此，管道9另外地沿基本垂直的方向穿過體部2的第一表面3并且管道9被實現(xiàn)為有支路的通道，其包括基本垂直于第一和第二表面3、4的通道部分19以及基本平行于第二表面4延伸的支路部分20。然而，液滴接觸區(qū)域5可分開以4. 5mm的軸距23，敞開的頂部入口隔間12隨后優(yōu)選地分開以 9mm或雙倍軸距23。在線性陣列的懸滴板1 (相比于圖3)中，兩個支路部分20連接共同通道部分19。在2D陣列懸滴板1(相比于圖4)，四個支路部分20連接公共通道部分19。因此，借助包括96個頂部分配頭的機器人，具有384個液滴陣列的懸滴板1可被立刻施加以液體和/或細胞或分子。液滴形狀和位置的補充控制可通過培養(yǎng)隔間17、脊18和周圍板7的內表面的選擇涂層予以獲得以實現(xiàn)親水和疏水區(qū)域。同樣，隔間12、17和管道9的內表面都被涂敷有防止細胞粘附在表面上的表面薄膜?？蛇x擇地，表面可利用微米和納米機械加工技術直接進行構圖以便防止粘附。懸滴板1優(yōu)選是與高生產量系統(tǒng)兼容的標準外尺寸(ANSI/SBS 1-2004)的組織培養(yǎng)板。如圖所示，懸滴板1組優(yōu)選由兩個元件構成a)包含懸滴壁或液滴接觸區(qū)域5的懸滴板1 ；和b)支撐懸滴板1的蓋22。兩個元件(懸滴板1和蓋22)由生物塑料材料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯)制造或在其各個表面至少包括該生物塑料材料。兩個元件(懸滴板1和蓋 22)都與光度讀取器(從頂部和底部讀取，優(yōu)選是底部讀取)相兼容。懸滴板1優(yōu)選包含 96或384個單位的懸滴井。懸滴板1優(yōu)選配有用于獨立蓋自動處理的垂直邊緣25。蓋22 為懸滴板1的每個單獨單元內液滴形成提供足夠的空間。懸滴板1被設計成疊置在彼此上方。蓋22配有允許填充以水/鹽水的窄通道系統(tǒng)或沿著基底內側的槽以便最小化液滴蒸發(fā)。蓋22可用于懸滴板1的下和上殼，以便最小化蒸發(fā)并保護防止污染。懸滴可借助通過標準單通道或多通道吸液管進入入口隔間12的液體的頂加載以手動或自動方式予以產生。懸滴井的設計允許通過入口隔間12的重復液體交換。本發(fā)明提供用于誘導和培養(yǎng)細胞成為第三維而沒有人造基質細胞交互作用。裝置包括具有兩個隔間(入口隔間12和培養(yǎng)隔間17)的微流體系統(tǒng)。入口隔間12的容積優(yōu)選在5 μ 1禾口 50 μ 1之間，最優(yōu)選在10 μ 1禾口 30 μ 1之間。培養(yǎng)隔間17的容積優(yōu)選在10 μ 1禾口 100 μ 1之間，最優(yōu)選在10μ 1和50μ 1之間。入口隔間12和培養(yǎng)隔間17的形狀可以是圓柱形、圓錐形或雙曲線形。單個單位的每個培養(yǎng)容積優(yōu)選與從培養(yǎng)隔間底部凸出的環(huán)8相連，以便穩(wěn)定和分開單獨的液滴。脊形式的液滴分離環(huán)或凸出結構8的高度優(yōu)選在0. Imm 和5mm之間，最優(yōu)選在1和2mm之間。根據(jù)本發(fā)明的懸滴板1可通過注入模制直接或復制模制橫向制成?？蛇x擇的生產方法包括微研磨技術和/或將懸滴板1的各部分粘合或焊接到一起。以下，簡要描述在使用根據(jù)本發(fā)明的懸滴板1的原型時的材料和方法以及獲得的結果。適于懸滴培養(yǎng)的生產的典型方案如下a)借助標準胰蛋白酶作用由常規(guī)2D培養(yǎng)獲得的收獲細胞。b)利用常規(guī)細胞培養(yǎng)介質洗滌細胞。c)拿取具有對應100至10000細胞/3D μ 1液滴的3333至333333細胞/ml密度的常規(guī)細胞培養(yǎng)介質的適當容量或分別根據(jù)實驗需求的液體量6的細胞。d)柔和渦旋包含細胞的燒瓶，并借助頂加載將細胞懸浮液的30 μ 1液滴分配到懸滴板1的入口隔間12。e)將懸滴板1放入常規(guī)細胞培養(yǎng)恒溫箱內濕潤相內。f)根據(jù)細胞的類型，細胞將聚集并在1-3天內形成微組織。g)長期氟化或實驗方案最終需要介質的改變。這通過簡單地從懸滴板1頂側的入口隔間12吸取至25 μ 1的陳舊介質以及通過替換被吸入至入口隔間12的相似容量的新鮮介質予以實行。h)通過用傳遞到懸滴板1頂側上的入口隔間12的50至100 μ 1介質沖洗液滴接觸區(qū)域5，以及從而通過將微組織沖洗到收集裝置(即有蓋培養(yǎng)皿或具有96或384井的微板)，收獲微組織。例 I從新生鼠中新鮮分離的心肌細胞根據(jù)上述方案產生，該方案不包括從2D培養(yǎng)收獲的細胞(來自方案的點a)。從10000細胞/每滴產生的所得到的微組織相應于直徑大約 250 μ m的微組織尺寸。這在圖11中得到證明，圖11示出了利用根據(jù)圖7的懸滴板產生的鼠心肌細胞組成的微組織的顯微鏡像。
例 II人肝瘤細胞0fepG2)根據(jù)上述方案處理。圖12示出了在每滴播種100個細胞(圖 12A)和每滴播種250個細胞(圖12B)的多個小時后，人肝瘤微組織48的顯微鏡像。例III鼠胰島細胞(每滴250個細胞)根據(jù)上述方案處理，如在圖13中證明，圖13示出了播種后在不同時間點處的鼠胰島細胞的顯微鏡像。鼠胰島微組織的形成可以如下形成 在潛伏的3個小時后，特別地，僅單個細胞存在(見圖13A)。在潛伏的對個小時后，特別地，所有細胞聚集(見圖13B)。在潛伏的96個小時后，直徑大約100 μ m的球形鼠胰島微組織已經形成(見圖13C)。因此，本發(fā)明包括一種在粘附到基于圖1至10所述的懸滴板1的液滴接觸區(qū)域5 的至少一個液體量6中培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法。懸滴板1包括體部2，其具有第一表面3和基本上與第一表面3共平面的第二表面4，該第二表面包括在其中粘附地接收至少一個液體量6的至少一個液滴接觸區(qū)域5。至少一個液滴接觸區(qū)域5通過凸出結構8區(qū)別于周圍區(qū)域7，該凸出結構防止液體量6在體部2的第二表面4上擴散。根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于液體量6通過管道9施加于液滴接觸區(qū)域5，該管道從體部2的第一表面3 的方向開口入液滴接觸區(qū)域5。當進行培養(yǎng)細胞的方法時，優(yōu)選地，許多細胞或至少一種細胞類型的細胞微聚集體是-在液體中懸浮，-與液體量6—起移動通過懸滴板1的管道9，-在液體量6中培養(yǎng)；和微組織在液體量6中從所培養(yǎng)的細胞形成?？商鎿Q地，當進行培養(yǎng)細胞的方法時，許多細胞或至少一種細胞類型的細胞微聚集體是-通過懸滴板1的管道9移動入液體量6，-在液體量6中培養(yǎng)；和微組織在液體量6中從所培養(yǎng)的細胞形成。當進行產生分子聚集體的方法時，優(yōu)選地，許多分子或分子微聚集體是-在液體中懸浮，-與液體量6—起移動通過懸滴板1的管道9，-在液體量6中孵育；禾口分子聚集體在液體量6中從所孵育的分子或分子微聚集體形成。優(yōu)選地，當進行培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法時，液體量6中的一部分液體通過專用于液滴接觸區(qū)域5的懸滴板1的相應管道9撤回。在隨后，優(yōu)選用通過專用于液滴接觸區(qū)域5的懸滴板1的相應管道9傳遞的液體替換至少一部分撤回的液體。具有特別興趣的是根據(jù)本發(fā)明的懸滴板1在下面領域中的使用a)藥物篩選和開發(fā)懸滴板提供用于具有改進的組織特殊功能的仿生3D細胞聚集體即微組織的手動(低容量)或自動(高容量)產生的平臺。對于自動液體處理系統(tǒng)的完全兼容性將使得對于繼再次聚集過程之后的引導識別和引導最佳化的高生產量化合物篩選能夠實現(xiàn)，而不要求另外的細胞傳代培養(yǎng)?；谖⒔M織的分析可以與具有端點確定的常規(guī)基于2D細胞的分析一樣以常規(guī)方式，通過顯微鏡、光度計、熒光計和/或發(fā)光測量(底部讀取)和/或另外的下游組織處理(組織學分析)來進行。b)基于細胞的毒性測試(ADME/毒藥)懸滴板提供用于具有改進的組織特殊功能的3D細胞聚集體即微組織的手動或自動產生的平臺。對于自動液體處理系統(tǒng)的完全兼容性將使得包含吸附、新陳代謝、分泌和毒理方面的潛在藥物候選的高生產量測試能夠實現(xiàn)。 基于微組織的分析可以與具有端點確定的常規(guī)基于2D細胞的分析一樣以常規(guī)方式，通過顯微鏡、光度計、熒光計和/或發(fā)光測量(底部讀取)和/或另外的下游組織處理(組織學分析)來進行。c)基于細胞的治療與單細胞處理相比，微組織對于基于細胞的治療顯示多個優(yōu)點，包括(i)更高的功能性；(ii)預成型的細胞外基質，(iii)促進血管新生因子例如血管內皮生長因子的分泌和作為單細胞的低運動性。因此，微組織對于組織再生/修復具有更高的潛力以處理多種器質性障礙，例如心肌梗塞或心肌糖尿病。大量生產是它們用于基于細胞的治療的必不可少的前提。通過如之前概述的下述特征，懸滴板提供大量生產兼容性1.要求低培養(yǎng)量；2.通過具有多至384通道的分配器同時頂加載或撤回；3.流體連接到兩個或多個管道的入口隔間，為每個分配器通道供應兩個或多個液滴；4.懸滴板的可堆疊性。懸滴板進一步有助于復雜步驟的應用，該復雜步驟例如膨脹和隨后的時間相關分化方案，包含對于多能前體細胞轉換為具有組織特殊功能的高分化細胞聚集體的重復介質改變。d)蛋白質結晶化為了研究蛋白質功能，理解3維結構是強制的。蛋白質晶體通過在經由蒸發(fā)過程的特定液體的懸滴中緩慢增加蛋白質濃度而產生。懸滴板使得蛋白質/ 分子晶體的自動兼容播種，生長和收獲能夠實現(xiàn)。參考標記1 懸滴板2 體部3 第一表面4 第二表面5 液滴接觸區(qū)域6 液體量7 周圍區(qū)域8 凸出結構9 管道10 入口連接部11 2的側前部12 入口隔間
13加寬部分
14罩
152的上部分
162的下部分
17培養(yǎng)隔間
18毛細管部分
19通道部分
20支路部分
21親水涂層
22蓋板
23軸距
24水平板
25垂直邊緣
26下網
27上凹陷
28臺板
29邊緣
30線
權利要求
1.一種懸滴板(1)，包括具有第一表面C3)和與第一表面C3)基本共平面的第二表面(4)的體部O)，第二表面(4)包括用于粘附地接收用于在其中培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的液體量(6)的至少一個液滴接觸區(qū)域(5)，該至少一個液滴接觸區(qū)域(5)借助凸出結構 ⑶與周圍區(qū)域(7)進行區(qū)分，該凸出結構防止液體量(6)在體部⑵的第二表面⑷上的擴散，其特征在于體部( 進一步包括至少一個管道(9)，所述管道從體部O)的第一表面(3)的方向開口入所述至少一個液滴接觸區(qū)域(5)。
2.根據(jù)權利要求1的懸滴板(1)，其特征在于所述凸出結構(8)選自包括邊緣、凸起、 凹陷、高地和其任何組合的組中，并定位在第二表面中或其上。
3.根據(jù)權利要求1或2的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)從第一表面(3)至第二表面以基本上垂直的方向穿過整個體部O)。
4.根據(jù)權利要求1或2的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)在所述至少一個液滴接觸區(qū)域( 的區(qū)域中以基本上垂直的方向部分地穿過體部( 并基本上平行于第二表面 ⑷部分地延伸。
5.根據(jù)權利要求4的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)包括入口連接部(10)，該入口連接部位于體部O)的側前部(11)。
6.根據(jù)權利要求4的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)另外以基本上垂直的方向穿過體部O)的第一表面(3)。
7.根據(jù)權利要求1-3和6中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)包括入口隔間(12)，該入口隔間定位為靠近所述體部O)的第一表面(3)。
8.根據(jù)權利要求7的懸滴板(1)，其特征在于所述入口隔間(12)實現(xiàn)為所述體部(2) 內部的所述管道(9)的加寬部分(13)，所述體部O)的第一表面C3)上的杯部(14)，或上述加寬部分(1 和上述杯部(14)的組合。
9.根據(jù)權利要求4至6中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述體部( 包括彼此連接的上部分(15)和下部分(16)。
10.根據(jù)在前權利要求中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)包括培養(yǎng)隔間(13)，該培養(yǎng)隔間定位為靠近所述體部O)的第一表面(3)并包括所述液滴接觸區(qū)域(5)的至少一部分。
11.根據(jù)權利要求8的懸滴板(1)，其特征在于所述培養(yǎng)隔間(17)是具有筆直或彎曲壁的漏斗狀凹陷。
12.根據(jù)在前權利要求中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)具有圓柱/ 截頭圓錐或雙曲線形狀。
13.根據(jù)權利要求12的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)包括毛細管部分(18)， 該毛細管部分的直徑為至少10 μ m，優(yōu)選在10 μ m和500 μ m之間，更優(yōu)選在50 μ m和200 μ m 之間。
14.根據(jù)權利要求13的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)的圓柱或雙曲線毛細管部分(18)的長度為在Omm和30mm之間，優(yōu)選在0.5mm和2mm之間。
15.根據(jù)權利要求10-14中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)實現(xiàn)為無支路通道，該無支路通道基本上垂直于第一和第二表面(3、4)延伸，其中無支路通道管道 (9)的所有部分同軸對齊。
16.根據(jù)權利要求10-14中任一項的的懸滴板(1)，其特征在于所述管道(9)實現(xiàn)為支路通道，該支路通道包括基本上垂直于第一和第二表面(3、4)延伸的通道部分(19)和基本上平行于第二表面(4)延伸的支路部分00)。
17.根據(jù)在前權利要求中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述液滴接觸區(qū)域(5)選擇性涂敷有親水涂層。
18.根據(jù)權利要求1-16中任一項的懸滴板(1)，其特征在于所述液滴接觸區(qū)域(5)選擇性涂敷有生物活性化合物，所述生物活性化合物選自包括多肽和多核苷酸的組中。
19.根據(jù)權利要求17或18的懸滴板(1)，其特征在于所述周圍區(qū)域(7)選擇性涂敷有疏水涂層。
20.根據(jù)在前權利要求中任一項的懸滴板(1)，其特征在于該懸滴板至少基本上具有標準微板的形狀，液滴接觸區(qū)域( 以陣列布置，優(yōu)選為4X6,8X12，或16XM液滴接觸區(qū)域⑶。
21.一種培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的裝置，該裝置包括根據(jù)在前權利要求中任一項的一個懸滴板(1)和兩個蓋板(22)，這兩個蓋板實現(xiàn)為用作底部和/或頂部蓋板。
22.一種在至少一個液體量(6)內培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法，該液體量附在根據(jù)權利要求1的懸滴板(1)的液滴接觸區(qū)域(5)，其特征在于液體量(6)通過管道(9)施加于液滴接觸區(qū)域(5)，該管道從體部O)的第一表面(3)的方向開口入液滴接觸區(qū)域 ⑶。
23.根據(jù)權利要求22的培養(yǎng)細胞的方法，其特征在于許多細胞或至少一種細胞類型的細胞微聚集體是-在液體中懸浮，-與液體量(6) —起移動通過懸滴板(1)的管道(9)， -在液體量(6)中培養(yǎng)；和微組織在液體量(6)中從所培養(yǎng)的細胞形成。
24.根據(jù)權利要求22的培養(yǎng)細胞的方法，其特征在于許多細胞或至少一種細胞類型的細胞微聚集體是-通過懸滴板(1)的管道(9)移動入液體量(6)， -在液體量(6)中培養(yǎng)；和微組織在液體量(6)中從所培養(yǎng)的細胞形成。
25.根據(jù)權利要求22的產生分子聚集體的方法，其特征在于許多分子或分子微聚集體是-在液體中懸浮，-與液體量(6) —起移動通過懸滴板(1)的管道(9)， -在液體量(6)中孵育；和分子聚集體在液體量(6)中從所孵育的分子或分子微聚集體形成。
26.根據(jù)權利要求22至25中任一項的培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法，其特征在于液體量(6)中的一部分液體通過專用于液滴接觸區(qū)域( 的懸滴板(1)的相應管道(9) 撤回。
27.根據(jù)權利要求沈的培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法，其特征在于所撤回液體的至少一部分用通過專用于液滴接觸區(qū)域(5)的懸滴板(1)的相應管道(9)傳遞的液體替換。
28.根據(jù)權利要求1至20中任一項的懸滴板(1)在藥物系統(tǒng)的篩選中的應用。
29.根據(jù)權利要求1至20中任一項的懸滴板(1)在基于細胞的毒性測試中的應用。
30.根據(jù)權利要求1至20中任一項的懸滴板(1)在細胞再聚焦體或蛋白質晶體的大量生產中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及懸滴板(1)及在至少一個液體量(6)內培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的方法，液體量附于懸滴板(1)的液滴接觸區(qū)域(5)。懸滴板(1)包括具有第一表面(3)和與第一表面基本共平面的第二表面(4)的體部(2)。第二表面(4)包括粘附地接受用于培養(yǎng)細胞或產生分子聚集體的液體量(6)的至少一個液滴接觸區(qū)域(5)。至少一個液滴接觸區(qū)域(5)借助凸出結構(8)與周圍區(qū)域(7)進行區(qū)分，凸出結構防止液體量(6)在體部(2)的第二表面(4)上的擴散。其特征在于體部(2)還包括至少一個管道(9)，其從體部(2)的第一表面(3)的方向開口入至少一個液滴接觸區(qū)域(5)。在本發(fā)明的方法中，液體量(6)通過管道(9)施加于液滴接觸區(qū)域(5)，管道從體部(2)的第一表面(3)的方向開口入至少一個液滴接觸區(qū)域(5)。細胞和/或分子可被引入到該液體量(6)內，且部分的液體量(6)可經由懸滴板(1)的用于液滴接觸區(qū)域(5)的相應管道(9)替換。
文檔編號C12M3/00GK102257123SQ200880132067
公開日2011年11月23日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權日2008年9月22日
發(fā)明者沃爾夫岡.莫里茨, 皮埃爾-阿蘭.克拉維恩, 西蒙.P.霍爾斯特魯普, 詹斯.凱爾姆 申請人:蘇黎世大學研究學部