專利名稱：用于制造1，3-丙二醇的丙三醇氧化途徑中阻隔的突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥基丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活，并且也涉及使用該突變體制造1，3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇能用做合成聚酯、聚醚、聚氨酯等的原料，并用于各種應(yīng)用中，包括纖維如高性能服裝、毯子或汽車織物和塑料膜。特別地，通過1，3-丙二醇與對苯二酸聚合制造的聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，具有優(yōu)良的物理性能和低于聚對苯二甲酸乙二酯 (PET)熔點的的熔點。因此，聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)具有較高的實用性并作為下一代可替代PET的纖維材料而受到關(guān)注。此外，由1，3_丙二醇單體制成的塑料和聚合物，與由丁二醇或乙二醇制成的產(chǎn)品相比，顯示出優(yōu)良的光學(xué)穩(wěn)定性。此外，1，3_丙二醇能夠用作聚乙二醇型潤滑劑和溶劑，因此其商業(yè)價值經(jīng)評估要高于丙三醇的商業(yè)價值。1，3-丙二醇可通過化學(xué)合成或微生物發(fā)酵制成。用于制造1，3-丙二醇的化學(xué)方法包括通過氫甲?；瘜h(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)變成1，3_丙二醇的方法(美國專利號3，687，981)和通過水合將丙烯醛轉(zhuǎn)變成1，3_丙二醇的方法(美國專利號5，015，789)。然而，這種化學(xué)方法存在的問題在于，在1，3_丙二醇的生產(chǎn)中，它們需要高溫或高壓過程，因此導(dǎo)致了高制造成本，且會產(chǎn)生包含環(huán)境污染物的廢油。生物方法包括使用兼性厭氧菌株的微生物如檸檬酸細菌、梭狀芽胞桿菌、腸桿菌、 泥桿菌(ilyobacter)、克雷伯氏桿菌、乳酸桿菌、居泥桿菌(Pelobacter)等由丙三醇來制備1，3_丙二醇的過程(美國專利號5，254，467)。此外，使用這種微生物菌株的遺傳工程技術(shù)包括這種情況，其中將通過從乳酸桿菌中擴增或剔除丙三醇脫氫酶獲得的突變體用于高生產(chǎn)率地制造1，3丙二醇(US2007/0148749)。然而，目前還不存在涉及用于減少副產(chǎn)品的方法的現(xiàn)有技術(shù)，該副產(chǎn)品在使用遺傳工程變異體制造1，3丙二醇時候大量累積。在使用上述微生物將丙三醇轉(zhuǎn)變成1，3丙二醇的代謝過程中，大量產(chǎn)生各種氧化代謝物。特別地，作為丙三醇的氧化代謝物，2，3- 丁二醇的沸點相似于1，3丙二醇的沸點，因此在純化1， 3-丙二醇的過程中作為很大的障礙物。因此，本發(fā)明進行許多努力來研制一種微生物，該微生物通過代謝工程方法在丙三醇新陳代謝中僅產(chǎn)生1，3_丙二醇而不產(chǎn)生包括2，3- 丁二醇的氧化代謝副產(chǎn)物。因此， 本發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)造了一種突變體，其通過使用基因重組技術(shù)僅具有生產(chǎn)1，3_丙二醇的還原代謝途徑，來阻隔在丙三醇代謝途徑中生產(chǎn)副產(chǎn)物的氧化代謝途徑，并且發(fā)現(xiàn)，當將該突變體用來制造1，3-丙二醇時，不會產(chǎn)生包括2，3- 丁二醇的氧化代謝副產(chǎn)物，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種突變體，其中丙三醇的氧化途徑在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3丙二醇的微生物中被阻隔，以便由丙三醇制造1，3-丙二醇而沒有副產(chǎn)物。本發(fā)明的另一目的是提供一種制造1，3丙二醇的方法，該方法包括在包含丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變體。為了達成上述目的，本發(fā)明提供了一種微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3_丙二醇的微生物中被去除或被失活。本發(fā)明也提供了一種制備1，3_丙二醇的方法，該方法包括通過在包含丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物突變體而制造1，3-丙二醇，并回收生產(chǎn)的1，3丙二醇。本發(fā)明也提供了一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除了丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、 1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AK 菌株)的染色體中。本發(fā)明也提供了一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除了丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1， 3-丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中。本發(fā)明也提供了一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除了有轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AR菌株) 中，或者將其中基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AR菌株)的染色體中。本發(fā)明也提供了一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1， 3-丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除了轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因 (DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AR菌株)中，或者將其中基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中。本發(fā)明也提供了一種制備1，3_丙二醇的方法，該方法包括通過在包含丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述突變體而制造1，3-丙二醇，并回收生產(chǎn)的1，3丙二醇。本發(fā)明的其他特征和方面將通過以下詳述和附加的權(quán)利要求而更加明顯。


圖1是顯示丙三醇代謝過程中制造1，3-丙二醇的還原途徑和制造副產(chǎn)物的氧化途徑的示意圖。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明制造突變體的方法，使用dha調(diào)節(jié)子的結(jié)構(gòu)進行顯示。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的用于制備突變體的質(zhì)粒DNAs的方法。圖3a顯示了用于構(gòu)造質(zhì)粒DNA的方法，該質(zhì)粒DNA用于制造AK菌株并包括DhaB基因氨基端(dhaB，)-LacZ啟動子(PlacZ)-抗阿普拉霉素基因-DhaK基因氨基端(dhaK，)的連鎖，圖北顯示了用于構(gòu)造質(zhì)粒DNA的方法，該質(zhì)粒DNA用于制備AR菌株并包括DhaB基因氨基端(dhaB，)-LacZ 啟動子(PlacZ)-抗阿普拉霉素基因-DhaR基因氨基端(dhaR’)的連鎖。圖4是顯示克雷白氏桿菌AK和AR菌株的丙三醇代謝物的分析結(jié)果的圖示。圖5顯示了用于構(gòu)造包含IacZ啟動子下游的克雷白氏桿菌的DhaT基因和DhaB 再活化酶基因的質(zhì)粒DNA的方法或者用于構(gòu)造僅包含IacZ啟動子下游的DhaT基因的質(zhì)粒 DNA的方法。圖6是說明用于構(gòu)造包含IacZ啟動子下游的1，3_丙二醇氧化還原酶活性 YqhD(E)基因(源自大腸桿菌)和DhaB再活化酶基因的質(zhì)粒DNA或者用于構(gòu)造僅包含IacZ 啟動子下游的YqhD(E)基因的質(zhì)粒DNA的過程示意圖。圖7顯示了用于構(gòu)造包含IacZ啟動子下游的1，3_丙二醇氧化還原酶活性 YqhD (K)基因(源自克雷白氏桿菌)和DhaB再活化酶基因的質(zhì)粒DNA或者用于構(gòu)造僅包含 IacZ啟動子下游的YqhD(K)基因的質(zhì)粒DNA的方法。圖8是顯示根據(jù)本發(fā)明的源自克雷白氏桿菌Cu，AK和AR的重組菌株的丙三醇代謝物的分析結(jié)果的圖示。
具體實施例方式一種情況下，本發(fā)明涉及一種微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活。在根據(jù)本發(fā)明的突變體中，優(yōu)選地，基因編碼的丙三醇脫氫酶額外被去除或失活。丙三醇代謝途徑由兩個代謝途徑組成，也就是氧化代謝途徑和還原代謝途徑(圖 1)。在氧化代謝過程中，丙三醇被NAD+依賴的丙三醇脫氫酶氧化成二羥基丙酮(DHA)同時生成NADH，然后通過DHA激酶轉(zhuǎn)變成二羥基丙酮磷酸酯(DHAP)。上述二羥基丙酮磷酸酯 (DHAP)通過各種途徑進行新陳代謝，同時被用作生長需要的碳源和能量源。在氧化代謝過程中，產(chǎn)生包括 2，3_ 丁二醇、乙酸(acetic acid)、乙醇(ethanol)、乳酸(lactic acid)和琥珀酸(succinic acid)的副產(chǎn)物。同時，在還原代謝過程中，丙三醇在脫水酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基丙醛，然后在 NADH依賴的氧化還原酶的作用下還原為1，3-丙二醇，同時形成NAD+。丙三醇的氧化途徑和還原途徑彼此緊密聯(lián)系以在細胞中保持NAD+-NADH的平衡， 基因編碼的四個酶，也就是丙三醇脫水酶(ofe^)，1,3-丙二醇還原酶(i&aH，丙三醇脫氫酶(《fe^)和二羥基丙酮激酶WAaO在染色體上成簇排列并通過共存的轉(zhuǎn)錄因子DhaR以相同的調(diào)節(jié)子加以調(diào)節(jié)。本發(fā)明的突變體是微生物菌株，其中參與丙三醇代謝過程的氧化途徑中的基因編碼蛋白質(zhì)被去除或失活，且其通過還原途徑僅產(chǎn)生1，3丙二醇而不產(chǎn)生包含2，3-丁二醇、 乙醇、乳酸和琥珀酸的副產(chǎn)物。在本發(fā)明中，包含在突變體的丙三醇氧化途徑中的蛋白質(zhì)優(yōu)選是丙三醇脫氫酶， 轉(zhuǎn)錄活化劑和二羥丙酮激酶。
在本發(fā)明中，所述微生物優(yōu)選選由自檸檬細菌、梭狀芽胞桿菌、腸桿菌、泥桿菌(ilyobacter)、克雷伯氏桿菌、乳酸桿菌和居泥桿菌(Pelobacter)所組成的組。在本發(fā)明中，所述微生物優(yōu)選是克雷白氏桿菌，并且參與丙三醇的氧化途徑中的基因編碼酶是丙三醇脫氫酶基因(DhaD)，轉(zhuǎn)錄活化劑基因(dhaR)和二羥丙酮激酶基因 (DhaK, DhaL，DhaM 和 DhaK，)。在本發(fā)明的一實施方式中，克雷白氏桿菌突變體(AK菌株)通過從克雷白氏桿菌菌株的染色體中去除丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)，1,3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)加以構(gòu)成。所述突變體用包含1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的重組載體加以轉(zhuǎn)換，這些基因是參與丙三醇的還原途徑的基因，因而修復(fù)所述還原途徑。因此，構(gòu)造了僅去除丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)的突變體(圖2)。因此，本發(fā)明的突變體的特征在于，所述丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)被去除或被失活。在該過程中，hcZ啟動子(PlacZ)插入到參與還原途徑中的基因的上游，使得基因不再受DhaR調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)，由此基因的表達可以使用誘導(dǎo)劑進行人工控制。在本發(fā)明的另一實施方式中，克雷白氏桿菌突變體(AR菌株)通過從克雷白氏桿菌菌株的染色體中去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)，1,3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)加以構(gòu)成。所述突變體用包含1，3_丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的重組載體加以轉(zhuǎn)換，這些基因是參與丙三醇的還原途徑的基因，因而修復(fù)了還原途徑。因此，構(gòu)造了僅去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)的突變體(圖2)。因此，本發(fā)明的突變體的特征在于，轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)被去除或被失活。另一種情況下，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，該方法包括在包含丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3_丙二醇的微生物中被去除或被失活。在本發(fā)明的一實施方式中，可以證實，去除了丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)的克雷白氏桿菌菌株和去除了轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)的克雷白氏桿菌菌株在包含丙三醇的培養(yǎng)基中產(chǎn)生了 1，3-丙二醇，而不產(chǎn)生除少量乙酸外的氧化途徑的副產(chǎn)物。又一種情況下，本發(fā)明涉及一種能夠生成1，3丙二醇的突變體，其中包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除了丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因 (DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將該基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AK菌株)的染色體中。為了制備上述突變體，dha調(diào)節(jié)子的DhaB酶再活化因子，DhaT基因，DhaR調(diào)節(jié)劑和DhaD基因，通過使用質(zhì)粒DNA處理的克雷白氏桿菌MGH78578菌株(下簡稱為“Cu”)為親株的同源重組方法被替換為抗阿普拉霉素基因，從而制備出去除了氧化途徑和還原途徑的重組菌株(下面簡稱為“AK”菌株)。為了制備上述突變體，DhaB酶再活化因子、DhaT基因以及dha調(diào)節(jié)子的DhaR調(diào)節(jié)劑，通過使用質(zhì)粒DNA處理的克雷白氏桿菌MGH78578菌株(下簡稱為“Cu”)為親株的同源重組方法被替換為抗阿普拉霉素基因，從而制造出去除了氧化途徑和還原途徑的重組菌株 (下面簡稱為“AR”菌株)。此外，分析了去除丙三醇的厭氧代謝途徑中的克雷白氏桿菌重組菌株(AK和AR菌株)的增殖和丙三醇代謝特性。為此目的，將AK和AR菌株培養(yǎng)在補充有丙三醇的培養(yǎng)基中， 并考察了微生物細胞的增殖度。此外，培養(yǎng)液中存在的丙三醇含量以及包含1，3-丙二醇的代謝物的產(chǎn)生通過色譜法進行分析。因此，顯示出的是，除了乙酸外沒有產(chǎn)生包括2，3- 丁二醇在內(nèi)的氧化代謝物，并且該結(jié)果與遺傳背景相一致，其中AK和AR菌株中的丙三醇的厭氧代謝途徑被阻隔了。為了修復(fù)其中氧化途徑和還原途徑已阻隔的AK和AR菌株中每一個的丙三醇還原途徑，制備了用于修復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒。該質(zhì)粒的制備包括擴增具有1，3-丙二醇氧化還原酶活性的DhaB再活化酶基因(Orfw) -orfx DNA片斷，dhaT, yqhD (源自大腸桿菌) 或yqhD同源基因(源自克雷白氏桿菌)并將擴增產(chǎn)物插入到PGEM TEasy載體的LacZ啟動子下游。為了分析用修復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)換的AK和AR菌株的特性，將每種重組菌株培養(yǎng)在補充有丙三醇、四環(huán)素和IPTG的培養(yǎng)基中，同時分析培養(yǎng)液中的代謝物。 源自克雷白氏桿菌Cu的重組菌株，在特定時間的培養(yǎng)后，完全消耗了添加的丙三醇，而源自AK或AR的重組菌株顯示出比源自Cu的重組菌株那些稍微慢的丙三醇消耗率。但是它們產(chǎn)生1，3丙二醇的性能被發(fā)現(xiàn)為修復(fù)(圖8)。顯示了源自大腸桿菌或克雷白氏桿菌的兩個yqhD基因與dhaT基因相同的方式修復(fù)丙三醇的還原途徑，同時經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其中丙三醇的氧化途徑已被阻隔的源自AK或源自AR的重組菌株除了少量乙酸外不會產(chǎn)生氧化途徑的代謝物(圖8)。又一種情況下，本發(fā)明涉及一種能夠制備1，3_丙二醇的突變體，其中包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA》的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AK菌株) 的染色體中。又一種情況下，本發(fā)明涉及一種能夠制備1，3_丙二醇的突變體，其中包含基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AR菌株)的染色體中。又一種情況下，本發(fā)明涉及一種能夠制備1，3_丙二醇的突變體，其中包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因 (DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AR菌株)中，或者將其中基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中。本文使用的術(shù)語基因的“去除”指代基因從染色體或質(zhì)粒中去除的狀態(tài)，以便不能制備出基因編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語基因的“失活”指代以下狀態(tài)，其中基因被插入、移位或部分去除，以便不能制備出基因編碼的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的突變體可根據(jù)普遍已知的方法進行培養(yǎng)，并可適當控制包括培養(yǎng)溫度和時間，培養(yǎng)基的PH等條件。從突變體的培養(yǎng)液中收集1，3-丙二醇可使用常規(guī)的分離技術(shù)，例如蒸餾、電滲析、蒸發(fā)、色譜法、溶劑萃取和反應(yīng)萃取，并且通常使用這些技術(shù)的組合以便分離極純的物質(zhì)。
實施例以下參照實施例對本發(fā)明進行進一步說明。然而，可以理解的是，這些實施例僅為示例的目的，并不能解釋為對本發(fā)明的保護范圍的限制。在下面的實施例中，克雷白氏桿菌菌株中丙三醇的氧化途徑和還原途徑全都阻隔的突變體，并且重新修復(fù)丙三醇的還原途徑，從而制備出能夠制備1，3-丙二醇的突變株， 而不產(chǎn)生副產(chǎn)物。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，能夠制備1，3_丙二醇而不產(chǎn)生副產(chǎn)物的突變體，可通過在能由丙三醇制備1，3-丙二醇的微生物中僅阻隔丙三醇的氧化途徑來制備。實施例1 制備丙三醇的氧化-還原代謝途徑被阻隔的重組菌株
對于丙三醇代謝途徑的重新設(shè)計，其中制備克雷白氏桿菌MGH78578(ATCC 700721)中的丙三醇代謝途徑被完全阻隔的重組菌株作為基本菌株。為了固定可用于基因重組過程中使用的篩選標記，分析了克雷白氏桿菌MGH 78578菌株的抗生素抗性特征。因此，經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 阿普拉霉素(50 /ml)可作為抗生素標記用于重組菌株的篩選。此外，菌株中起始存在的質(zhì)粒通過處理方法去除，并且添加四環(huán)素為可用的篩選標記。使用質(zhì)粒DNA處理的克雷白氏桿菌MGH 78578菌株(命名為“Cu”)作為親株，DhaB酶再活化因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)劑和dha調(diào)節(jié)子的DhaD基因(圖2)通過同源重組方法用抗阿普拉霉素的基因取代，從而制備出去除了氧化途徑和還原途徑的重組菌株AK。同時，重組菌株AR通過用抗阿普拉霉素的基因取代DhaB酶再活化因子、DhaT基因和DhaR調(diào)節(jié)劑來制備。本文中，DhaB基因上游的 DhaR依賴性啟動子用可人工控制的LacZ啟動子替代。(1)從克雷白氏桿菌中處理質(zhì)粒DNA
克雷白氏桿菌MGH78578培養(yǎng)在包含1%的胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物和0. 5% NaCl 的液態(tài)培養(yǎng)基(LB)中，并在37°C以ISOrpm培養(yǎng)12小時。然后將培養(yǎng)的菌株亞接種 (subinoculate)到包含1%胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、0. 5%NaCl、2mM Tris-Cl緩沖液和 0. 1% EtBr的液態(tài)培養(yǎng)基中，并在37°C以ISOrpm培養(yǎng)12小時。以與上述相同的方式重復(fù)培養(yǎng)三次。然后將培養(yǎng)液覆蓋到不包含抗生素的固態(tài)LB培養(yǎng)基上，并在37°C培養(yǎng)12小時， 從培養(yǎng)液中分離出單個的菌落。分離的菌落接種到補充或不補充四環(huán)素的培養(yǎng)基中，并且選擇在補充有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不再增殖的菌落。從選定的菌落中分離質(zhì)粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，最終選擇了缺少質(zhì)粒DNA的菌株。該選定的菌株稱為“克雷白氏桿菌 MGH78578 Cu”，并用作制備重組菌株的親株，之后證實，其細胞增殖和丙三醇代謝特征不會與MGH78578菌株有顯著的不同。(2)制備丙三醇代謝途徑被阻隔的重組菌株
為了分離克雷白氏桿菌MGH78578菌株的染色體DNA，培養(yǎng)該菌株在LB液態(tài)培養(yǎng)基 (50ml)中12小時，然后在10°C，以14，000Xg通過離心分離收集細胞10分鐘。用50mM的 Tris-Cl CpH 8.0)清洗收集的細胞，重新懸浮在包含3 的25%蔗糖，175 的TES緩沖液，20% SDS和100 的0. 5mM EDTA的溶液中，然后在37°C靜置30分鐘。40 的核糖核酸酶(10 mg/ 的TE緩沖液)加入到該細胞中，然后使其在37°C保持20分鐘。為了去除蛋白質(zhì)，250 的蛋白酶K(10mg/ 的TE緩沖液)加入到該細胞中，然后將其在50°C培養(yǎng)1 小時。900 的5M NaCl加入到該細胞中，然后以14，000Xg對其離心分離10分鐘收集上清液。雙倍體積的無水酒精加入到收集的該上清液中，以誘導(dǎo)染色體DNA的沉淀。然后，在 4°C，以14，OOOXg離心分離細胞溶液15分鐘以沉淀染色體DNA，用70%的乙醇清洗沉淀的 DNA，然后干燥。通過在0. 7% (W/V)瓊脂糖凝膠上的電泳分析分離的染色體DNA。用于同源重組的質(zhì)粒制備用的DNA片斷通過使用萃取的染色體DNA作為模板和以下的引子組(primer sets)(圖2)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行擴增。對于一個變性周期， 聚合酶鏈反應(yīng)在94°C下使用了 50 最后的反應(yīng)溶液進行了 30秒，該反應(yīng)溶液包含有2 模板DNA，2 的每種引物(primer)DNA，0. 2mM dNTP混合液，2mM的MgCl2, 5 的10 X緩沖液(無Mg2+)，0. 05U/ 的Taq聚合酶和30. 5 三重蒸餾水，并在52°C下退火處理30秒， 并在72°C延伸1分鐘。用于擴增dhaBI基因片斷的引物
序列號 1: 5，-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3，(dhaBI XbaI_480bpF) 序列號 2: 5，-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3，(dhaBI BamHI-480bpR) 用于擴增dhaK基因片斷的引物
序列號 3: 5，-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3，(dhaK HindIII-200-700 bpF) 序列號 4: 5，-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3，(dhaK BglII-200_700bpR) 用于擴增dhaR基因片斷的引物
序列號 5: 5，-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3，(dhaR bglII-200-700bpF) 序列號 6: 5，-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3，(dhaR HindIII-200_700bpR) 用于擴增Apr基因片斷的引物
序列號 7: 5，-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3’ Apr HpaI F 序列號 8: 5，-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3’ Apr HindIII-BglIIR 使用PGEM TCasy載體對擴增的DNA片斷進行克隆，并且分析了其基本序列。然后如圖 3中所示，構(gòu)造了質(zhì)粒DNAs。在圖3a中所示的方法中，構(gòu)造了用于制備AK菌株的質(zhì)粒DNA，其包括
DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動子(PlacZ)-抗阿普拉酶素基因-DhaK基因氨基端 (dhaK')的連鎖(linkage)。在圖北中所示的方法中，構(gòu)造了用于制備AR菌株的質(zhì)粒DNA， 其包括DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動子(PlacZ)-抗阿普拉酶素基因-DhaR基因氨基端(dhaR’)的連鎖。每種質(zhì)粒用BamHI-BglII進行處理，并且收集的DNA片斷通過電穿孔引入到克雷白氏桿菌Cu菌株中。然后分離在補充有阿普拉霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的重組菌株。可以推定的是，在獲得的菌落中，包含抗阿普拉霉素基因的BamHI-BglII DNA片斷插入到染色體中。最終通過南印跡法可以證實，在調(diào)節(jié)子中發(fā)生了同源重組。結(jié)果，獲得了去除DhaB 酶再活化因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)劑和dha調(diào)節(jié)子的DhaD基因與插入hcZ啟動子和抗阿普拉霉素基因的重組菌株AK，以及獲得了去除DhaB酶再活化因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)劑與插入hcZ啟動子和抗阿普拉霉素基因的重組菌株AR。
實施例2 分析克雷白氏桿菌菌株AK和AR的特性
分析了克雷白氏桿菌重組菌株AK和AR的增殖和丙三醇代謝特性，其中去除了丙三醇的厭氧性代謝途徑。AK和AR每種菌株培養(yǎng)到補充有丙三醇的培養(yǎng)基中，并在37°C以ISOrpm 培養(yǎng)12小時。然后，研究了細胞的增殖度，并通過色譜法分析了培養(yǎng)上清液中存在的丙三醇含量和產(chǎn)生的包括1，3_丙二醇的代謝物(使用的裝置=Agilent 1200 (折光率檢測器， RID);使用的柱Aminex HPX-87H(Bio-I ad) 30(toimX 78謹；使用的溶劑65 ；35 去離子水-乙腈(0.005M H2SO4)；和流速0. 5ml/分鐘。AK和AR菌株示出了細胞增殖率，其約比用作對照的親株Cu慢兩倍，并且其丙三醇消耗率和1，3-丙二醇的產(chǎn)生率分別顯示為約40%和 20%(圖5)?？梢钥闯?，并沒有產(chǎn)生除乙酸外的包括2，3 丁二醇的氧化代謝物，該結(jié)果與遺傳背景相一致，其中在每個AK和AR重組菌株中的丙三醇厭氧性代謝途徑被阻隔。實施例3 制備丙三醇的還原途徑被修復(fù)的菌株 (1)制備用于修復(fù)丙三醇的還原途徑的質(zhì)粒DNA
DhaB再活化酶基因(orW-orfX DNA片斷和具有1，3-丙二醇氧化還原酶活性的dhaT， yqhD (源自大腸桿菌)或yqhD同源基因(源自克雷白氏桿菌)使用以下的引物序列擴增。 擴增的基因克隆到PGEM TCasy載體，并分析了其基本序列。然后，如圖5中所示，制備了質(zhì)粒 DNAs。序列號9:5，-AGATCTATGAGCTATCGTATGTTTGA-3，(dhaT-Bglll F) 序列號 10:5，-CTCGAGAAGCTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3， (dhaT-Hindlll/XhoI R)
序列號 11:5，-AGATCTATGAACAACTTTAATCTGCAC-3，(yqhD-Bglll F) 序列號 12:5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3，(yqhD-Hindlll/ XhoI R)
序列號 13:5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3，(yqhD Kle BglII F) 序列號 14:5，-CTCGAGAAGCTTAGCGTGCAGCCTCGTAAAT-3，(yqhD Kle HindIII, XhoI R) 圖5顯示了用于構(gòu)造在hcZ啟動子下游包含有克雷白氏桿菌的DhaT基因和DhaB再活化酶基因的質(zhì)粒DNA和用于構(gòu)造在IacZ啟動子下游僅包含有DhaT基因的質(zhì)粒DNA的過程，圖6顯示了用于構(gòu)造在IacZ啟動子下游包含有1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD(E) 基因(源自大腸桿菌)和DhaB再活化酶基因的質(zhì)粒DNA和用于構(gòu)造在IacZ啟動子下游僅包含有YqhD(E)基因的質(zhì)粒DNA的過程。圖7顯示了用于構(gòu)造在IacZ啟動子下游包含有1， 3-丙二醇氧化還原酶活性YqhD(E)基因(源自克雷白氏桿菌)和DhaB再活化酶基因的質(zhì)粒 DNA和用于構(gòu)造在IacZ啟動子下游僅包含有YqhD(K)基因的質(zhì)粒DNA的過程。(2)制備其中丙三醇的還原途徑被修復(fù)的重組菌株
上述構(gòu)造的六種質(zhì)粒DNAs包含基因編碼1，3_丙二醇的氧化還原酶活性酶的每一種， 以及包含PBR322和DhaB再活化酶基因的對照質(zhì)粒DNAs，通過電穿孔引入到丙三醇的厭氧性代謝途徑被阻隔的AK和AR每個菌株中，從而制備出丙三醇的還原途徑被修復(fù)的重組菌株(表1)。將每個質(zhì)粒引入到親株Cu中的重組菌株用作對照。韓國生命工學(xué)研究院的生物資源中心保藏了該實施例中構(gòu)造的重組菌株(表2 )。表1 本發(fā)明中使用或構(gòu)造的重組菌株和質(zhì)粒DNAs
權(quán)利要求
1.一種微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物突變體，其特征在于，基因編碼的丙三醇脫氫酶額外被去除或失活。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物突變體，其特征在于，所述微生物選自檸檬細菌、梭狀芽胞桿菌、腸桿菌、泥桿菌(ilyobacter)、克雷伯氏桿菌、乳酸桿菌和居泥桿菌 (Pelobacter)所組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物突變體，其特征在于，所述微生物為克雷伯氏桿菌， 并且所述基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑是DhaR，所述基因編碼的二羥丙酮激酶選自DhaK、DhaL, DhaM 禾口 DhaK0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物突變體，其中丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)被去除或失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物突變體，其中轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)被去除或失活，因此，本發(fā)明的突變體的特征在于其中轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)被去除或失活。
7.一種用于制備1，3丙二醇的方法，該方法包括通過將權(quán)利要求1至6中任何一項權(quán)利要求的微生物突變體培養(yǎng)在含丙三醇的培養(yǎng)基中來生產(chǎn)1，3丙二醇并回收生產(chǎn)的1，3丙
8.—種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因G)haR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AK菌株)的染色體中。
9.一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因 (DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AK菌株)中，或者將其中基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中。
10.一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體引入到去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA》的克雷白氏桿菌菌株(AR菌株)中，或者將其中基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶插入到突變體(AR菌株)的染色體中。
11.一種能夠制造1，3_丙二醇的突變體，其中，包含基因編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的載體和基因編碼丙三醇脫水酶再活化因子引入到去除轉(zhuǎn)錄活化劑基因(DhaR)、1，3_丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏桿菌菌株(AR菌株)中，或者將其中基因編碼1，3-丙二醇氧化還原酶和基因編碼丙三醇脫水酶再活化基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中。
12.—種制備1，3_丙二醇的方法，所述方法包括通過在包含丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述權(quán)利要求8至11中任一項所述的突變體來制造1，3-丙二醇，并回收制造的所述1，3-丙
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物突變體，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄活化劑或基因編碼的二羥丙酮激酶在能夠使用丙三醇作為碳源來制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活，并且本發(fā)明還涉及使用該突變體制造1，3-丙二醇的方法。當使用本發(fā)明的突變體時，能夠最小化使用現(xiàn)有菌株由丙三醇制備1，3-丙二醇時不可避免產(chǎn)生的副產(chǎn)物，從而能夠降低純化1，3-丙二醇的費用。
文檔編號C12P41/00GK102395671SQ200880132762
公開日2012年3月28日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者吳白祿, 崔珉鎬, 徐必守, 徐正又, 徐美渶, 白珍晤, 許仙宴, 金哲鎬 申請人:韓國生命工學(xué)研究院