專利名稱：一種重組超氧化物岐化酶基因的桿狀病毒及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD, Superoxide dismutase )是一種在生物體內(nèi)廣泛存 在的抗氧化酶。1938年Mann和Keilin在進(jìn)行牛血紅細(xì)胞分級分離時，發(fā)現(xiàn)一 種淡藍(lán)色的含銅蛋白，但對其生理功能尚不清楚。1968年，F(xiàn)ricovich發(fā)現(xiàn)"02-使細(xì)胞色素C的還原受到一種蛋白因子抵制。1969年McCord和Fridouich證 實(shí)該抑制因子與血銅蛋白相同。并發(fā)現(xiàn)血銅蛋白、肝銅蛋白、腦銅蛋白皆有 超氧陰離子自由基(02-)歧化活性，故命名為超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)。近十年來SOD —直是國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。SOD是 體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的氧自由基，從而避免當(dāng)體內(nèi) 超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應(yīng)，具有預(yù)防器官損傷、護(hù)膚、延 緩衰老等生理功能。同時SOD是一種很有用途的藥用酶。
有關(guān)SOD的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，涉及到化學(xué)、生物、醫(yī)藥、 日用化工、食品諸領(lǐng)域。SOD臨床應(yīng)用主要集中在抗炎癥方面(以類風(fēng)濕以及 放射治療后引起的炎癥病人為主)，此外對某些自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡、 皮肌炎)、肺氣腫、抗癌和氧中毒等都有一定療效；在食品工業(yè)主要用作食品添 加劑和重要的功能性基料;在其它方面也有相關(guān)應(yīng)用。國內(nèi)外已用SOD治療氧 中毒、老年性白內(nèi)障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾病，還可作為 輻射防護(hù)劑，用于輔助放療與化療以及腎、肝、心臟等器官的保護(hù)和移植，以 降低大劑量輻射所引起的副作用。世界各國都研制開發(fā)出許多富含SOD的食 品、飲料、化妝品、護(hù)膚品，以及具有增白、恢復(fù)青春、延緩衰老作用的保健目前國內(nèi)SOD的生產(chǎn)工藝基本上以動物血或植物為原料，以Mccord和 Fridovich法提取SOD,包括以下三個步驟乙醇-氯仿除去血紅蛋白；有機(jī)溶 劑和硫酸銨分級沉淀；離子交換柱層析純化。這些方法安全性不高，易導(dǎo)致動 物病毒交叉感染，歐盟已于1999年頒布法令，禁止從動物血液中提取的SOD 用于人類。另外，這些方法獲得最終產(chǎn)物量少， 一般情況下，1公斤血液只可 提取SOD 0.08克左右。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)這一生物反應(yīng)器是八十年代建立起來的。自從1983年首 次利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了人的oc-干擾素以來(smith, Mol Cell Biol. 3: 2156. 2165, 1983 )，已有數(shù)十個外源基因得到了高效表達(dá)，僅我國 就有cc-干擾素(楊冠珍等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，22: 355-361， 1990)、 慈菇蛋白酶抑制劑(季平等，蠶業(yè)科學(xué)，21: 223-227, 1995)、馬立克氏病毒 糖蛋白B(肖慶利等，蠶業(yè)科學(xué)，23: 104-108， 1997)等多種。桿狀病毒包括 BmNPV、 Ac畫PV、 ApNPV、 BssNPV、 EOSNPV、 HaNPV、 HzNPV、 Ld函PV、 MbMNPV、 UpMNPV、 S1MNPV、 SeMNPV、 TnNPV等，昆蟲宿主包括家蠶、 野蠶等。目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，尤其是其中的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是世 界上最具有商業(yè)開發(fā)價值的真核生物個體表達(dá)系統(tǒng)之一。
本發(fā)明利用家蠶生物反應(yīng)器高效表達(dá)嗜高溫菌中穩(wěn)定存在的SOD，在70。C 熱處理后便可除去大部分雜蛋白，獲得高活力SOD,簡化了SOD生產(chǎn)的工藝 流程，降低其生產(chǎn)成本，SOD在一條蠶蛹中的表達(dá)量最多可達(dá)到lmg,遠(yuǎn)高于 傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式，具有重要的科研和產(chǎn)業(yè)化價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供 一 種重組桿狀病毒及其制備方法。
本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的重組桿狀病毒在制備嗜高溫菌SOD蛋白中的 應(yīng)用。
一方面，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒，該病毒含有嗜高溫菌SOD基因，重組病毒可接種家蠶，表達(dá)嗜 高溫菌SOD蛋白，當(dāng)然，本發(fā)明的重組桿狀病毒不僅可以接種家蠶，還可接種 其它昆蟲。
同樣，利用別的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，如AcMNPv、 ApNPv、等也可按同樣 的方法表達(dá)生產(chǎn)。用基因重組技術(shù)，將SOD基因在多角體啟動子或別的病毒和 真核生物的強(qiáng)啟動子的控制之下，通過體內(nèi)或體外重組，將SOD基因整合到桿 狀病毒的基因組上，得到重組病毒。
在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明將嗜高溫菌超氧化物歧化酶SOD基因的與 家蠶桿狀病毒BmBacPAK6進(jìn)行重組，獲得重組家蠶桿狀病毒BmBacPAK-SOD, 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏曰期為2008年 11月28日，保藏編號為CGMCC No.2769，分類命名為家蠶核型多角體病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus )。 禾!j用本發(fā)明的重組家蠶桿狀病毒 BmBacPAK-SOD接種家蠶，可獲得家蠶生物反應(yīng)器。該反應(yīng)器可大規(guī)模生產(chǎn)，
具有資源優(yōu)勢和成本優(yōu)勢。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備重組桿狀病毒的方法，該方法包括制備 嗜高溫菌超氧化物歧化酶SOD基因，其基因序列如SEQ ID NO.l所示；將制 備的SOD基因?qū)霔U狀病毒中，形成重組桿狀病毒。
在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供制備重組家蠶桿狀病毒的方法，是通 過PCR擴(kuò)增嗜高溫菌SOD基因，經(jīng)酶切后與轉(zhuǎn)移載體PVL1393質(zhì)粒(如圖1 所示)連接獲得重組轉(zhuǎn)移載體。然后使該重組轉(zhuǎn)移載體與線性化桿狀病毒 BacBAK6重組，將外源基因SOD插入桿狀病毒中BacBAK6，得到含有嗜高溫 菌SOD基因的重組桿狀病毒，構(gòu)建原理如圖2所示。
另一方面，本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明所述的重組桿狀病毒制備重組SOD 蛋白的方法。該方法包括將本發(fā)明所述的重組桿狀病毒感染家蠶，大量表達(dá)后， 經(jīng)高溫純化。
在一個具體實(shí)施方式
中，將本發(fā)明所述的重組桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞，培 養(yǎng)120小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心后，收集沉淀，用PBS懸浮破膜，離心再收集上清即為嗜高溫菌SOD基因表達(dá)產(chǎn)物。該蛋白具有極高的耐熱性并且在70 。C處理2h后還具有80%的酶活力。
本發(fā)明中最優(yōu)化的方案是從嗜高溫菌(Geobacillus kaustophilus HT八426 ) 基因組中分離得到的SOD基因，將擴(kuò)增后的SOD基因經(jīng)BamHl ,EcoRI雙酶 切后，通過粘性末端相連的方法，將目的基因與經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的 轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-SOD。經(jīng)酶切和PCR鑒 定基因正確。將重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-SOD DNA與已線性化的病毒 Bm-BacPAK6DNA由脂質(zhì)體包埋后共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)4-6天，待能觀 察到細(xì)胞出現(xiàn)感染癥狀后，通過噬斑篩選技術(shù)，獲得攜帶嗜高溫菌SOD基因的 大量重組家蠶桿狀病毒BmBacPAK-SOD。本發(fā)明對嗜高溫菌SOD基因表達(dá)產(chǎn) 物的活性鑒定。測得其酶活力3505 ±32 U/2x 106細(xì)胞。嗜高溫菌SOD基因表 達(dá)產(chǎn)物經(jīng)高溫(70°C)純化后可保持80%活性。
本發(fā)明提供一種藥物，其活性成分為利用重組桿狀病毒按照上述方法制備的 嗜高溫菌SOD蛋白。
利用此方法生產(chǎn)SOD的優(yōu)點(diǎn)在于
1、 家蠶缺失互補(bǔ)型線性化桿狀病毒使篩選重組病毒高效省時。
2、 這一表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效率高，重組SOD蛋白活性可達(dá)3505 ±32U/2x 106細(xì)胞水平， 一條蠶蛹中的表達(dá)量最多可達(dá)到lmg,而常規(guī)的原核表達(dá)，其表 達(dá)量是0.05-0.3mg/ml菌液。因而可大大降低生產(chǎn)成本，并使大規(guī)模生產(chǎn)成為可 能。
3、 桿狀病毒僅是昆蟲或節(jié)肢動物的病毒，對人畜無毒無害，而且經(jīng)重組后 的病毒基因失去多角體的保護(hù)在自然界的生存能力很弱，不會造成公害。利用 家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)SOD與從動物血提取SOD的方法相比，能夠避免動物病 毒的交叉感染，更為安全可靠。
4、 嗜高溫菌SOD全長411個氨基酸，該蛋白具有極高的耐熱性并且在常 溫下具有較高的酶活力，因此用此方法生產(chǎn)的嗜高溫菌SOD無需經(jīng)過繁復(fù)的純 化步驟，只需將嗜高溫菌SOD基因表達(dá)產(chǎn)物高溫處理， 可得高活力的重組嗜高溫菌SOD蛋白，簡化了 SOD生產(chǎn)的工藝流程，降低其生產(chǎn)成本。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用家蠶生物反應(yīng)器高效表達(dá)嗜高溫菌中穩(wěn)定存在的 SOD蛋白，原料易得，生產(chǎn)成本低，具有重要的科研和產(chǎn)業(yè)化價值。


圖1為轉(zhuǎn)移載體PVL1393質(zhì)粒環(huán)狀圖譜； 圖2為重組家蠶桿狀病毒構(gòu)建原理圖。
具體實(shí)施例方式
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的
1、 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的片段SOD基因。
2、 構(gòu)建重組載體。經(jīng)EcoRI與BamHI雙酶切的SOD基因片段通過粘性 末端連接至經(jīng)EcoRI與BamHI雙酶切的轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
3、 制備含SOD基因的重組桿狀病毒。取重組轉(zhuǎn)移載體、線性化病毒DNA、 脂質(zhì)體，用HBS混勻。加入已貼壁細(xì)胞的BmN細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞破裂 后，收集上清，對其進(jìn)行空斑篩選，即得含SOD基因的重組病毒。
4、 SOD基因的表達(dá)與純化。重組病毒感染家蠶細(xì)胞后，培養(yǎng)120小時， 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收集沉淀，用PBS懸浮破膜，離心再收集上清即為SOD 基因表達(dá)產(chǎn)物。
實(shí)施例l.SOD基因的制備
根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)同源基因全序列，設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，分 別含BamHI酶切位點(diǎn)、起始密碼子ATG和EcoR I酶切位點(diǎn)、終止密碼TAA, cDNA為模板，引物P1和P2設(shè)計(jì)如下
Pl: 5'-CGGATCCATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3'(如SEQNO.2所示) P2: 5'- ATTTGCGGCCGCTTTAAAACGGCTGCCAAC -3 (如SEQ N0.3所示) 從嗜高溫菌(Geobacillus kaustophilus HTA426 )基因組中擴(kuò)增目的片段S0D基因。
實(shí)施例2.重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-SOD的構(gòu)建。
將擴(kuò)增后的目的基因SOD經(jīng)BamH I , EcoR I雙酶切后，通過粘性末端相連 的方法，與經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pVL1393 (購自Introvigen 公司)連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-SOD。
實(shí)施例3.制備含嗜高溫菌SOD基因的重組桿狀病毒
取5 |u 1重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒和20 )u 1經(jīng)Bsu36 I酶切線性化病毒DNA用HBS 將總體積補(bǔ)至50jul,混勻。取脂質(zhì)體10jaL,用HBS將總體積補(bǔ)至50jal,混 勻，并將兩者混勻。吸去培養(yǎng)瓶中已貼壁細(xì)胞的上清，將事先培養(yǎng)的BmN細(xì) 胞(購自上海生化細(xì)胞所)用無血清培養(yǎng)基TC-100洗兩次，加入lOOul混合 物。27。C繼續(xù)培養(yǎng)4-6天后，將共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接另一瓶生長狀態(tài)良好 的細(xì)胞。待感染細(xì)胞破裂后，收集上清，對其進(jìn)行空斑篩選，有重組斑的即得 重組病毒BacPAK-SOD。以親本病毒Bm-BacPAK6 DNA和家蠶細(xì)胞總DNA為 陰性對照，以pVL1393-SOD為陽性對照，選取一個重組病毒BacPAK-SOD DNA 作為鑒定樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳檢測。結(jié)果顯示，重組病毒斑能擴(kuò)增 出與陽性對照大小相同的片段，但陰性對照卻不能，說明SOD已經(jīng)重組于病毒 BacPAK-SOD之中。
實(shí)施例4.嗜高溫菌SOD在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)
重組病毒BacPAK-SOD和Bm-BacPAK6病毒以MOI=10的劑量感染家蠶細(xì) 胞，在27。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12000rpm離心5分鐘 后，收集沉淀，用PBS (0.02mol/L， pH7.4)懸浮，經(jīng)冰洛超聲波破膜，離心 再收集上清即為嗜高溫菌SOD表達(dá)產(chǎn)物，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例5、嗜高溫菌SOD基因表達(dá)產(chǎn)物的活性鑒定取實(shí)施例4中所得嗜高溫菌SOD表達(dá)產(chǎn)物為樣品。吸取4.5ml Tris'HCl-EDTA 緩沖液(pH8.2)于10ml比色管；置25。C水浴20 min;加入已恒溫至25。C樣 品溶液50|al,立即混勻；加入25。C預(yù)熱的45 mmol/L鄰苯三酚40 jal (10 mmol/LHCl溶液配置)，立即混勻；迅速倒入lcm石英比色杯325nm波長測光 密度值；每隔30s測一次光密度值，共測4min，求出鄰苯三酚自氧化速 率,ODB/min。結(jié)果顯示野生病毒Bm-BacPAK6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物SOD活 性為263 ±3 U/2 x 106細(xì)胞；重組病毒BacPAK-SOD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物SOD 活性達(dá)3505 ± 32 U/2 x 106細(xì)胞。
實(shí)施例6、基因表達(dá)產(chǎn)物的高溫純化
將實(shí)例4中所得嗜高溫菌SOD表達(dá)產(chǎn)物于7(TC模塊洛2h后，不耐高溫的 蛋白在7(TC變性沉淀，噬高溫菌SOD蛋白仍為溶解狀態(tài)，12000rpm離心3分 鐘，所得上清即為SOD基因表達(dá)產(chǎn)物。按照實(shí)施例5所示方法對所得SOD基 因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性測定，結(jié)果顯示，野生病毒Bm-BacPAK6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá) 產(chǎn)物高溫處理后不再表現(xiàn)出SOD活性，而重組病毒BacPAK-SOD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 表達(dá)產(chǎn)物可保持80%的SOD活性，證實(shí)了高溫純化獲得高活力SOD的可行性。 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCE LISTING
<110>浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司
<120〉 一種重組超氧'
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<211〉 1236
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<213〉 超氧'
'酶基因
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權(quán)利要求
1.一種重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒含有超氧化物歧化酶SOD基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述SOD基因?yàn)槭?高溫菌超氧化物歧化酶SOD基因，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒為家蠶 扦狀病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒為 BmBacPAK6，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編 號為CGMCCNo.2769。
5. —種制備權(quán)利要求1所述重組桿狀病毒的方法，該方法包括(1) 制備超氧化物歧化酶SOD基因；(2) 將所制備的SOD基因?qū)氲睫D(zhuǎn)移載體中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體；(3) 將步驟(2)獲得的重組轉(zhuǎn)移載體DNA與桿狀病毒DNA重組，獲得 重組桿狀病毒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移載體為pVL1393。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述桿狀病毒為家蠶桿 狀病毒BmBacPAK6。
8. —種制備嗜高溫菌SOD蛋白的方法，該方法包括用權(quán)利要求1 4任一項(xiàng) 所述重組桿狀病毒接種家蠶，經(jīng)高效表達(dá)后，高溫純化，獲得嗜高溫菌SOD蛋 白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述高溫純化溫度為7(TC。
10. —種藥物，其特征在于，其活性成分為按照權(quán)利要求8或9所述方法 制備的重組嗜高溫菌SOD蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建含有嗜高溫菌超氧化物歧化酶SOD基因的重組桿狀病毒，可在家蠶中高效表達(dá)超氧化物歧化酶SOD，所述蛋白經(jīng)高溫純化保持較高的SOD活性。本發(fā)明將所述嗜高溫菌超氧化物歧化酶SOD基因與家蠶桿狀病毒BmBacPAK6進(jìn)行重組，獲得重組家蠶桿狀病毒BmBacPAK-SOD，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2769。本發(fā)明還公開一種用所述重組桿狀病毒表達(dá)和純化嗜高溫菌超氧化物歧化酶的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，具有重要的產(chǎn)業(yè)化價值。
文檔編號C12N7/01GK101613679SQ20091000045
公開日2009年12月30日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者威 于, 呂正兵, 吳祥甫, 張?zhí)斐? 張志芳, 張耀洲, 陽 曹, 朱柏林, 健 陳 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司