專利名稱：一種多種性傳播病原體同步檢測的pcr方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測五種性傳播疾病病原體的PCR方法及試劑盒，適用于性 傳播疾病的快速臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
背景技術(shù)：
性傳播疾病(Sexually Transmitted disease，STD)是目前的常見病多發(fā)病。傳統(tǒng) 的性傳播疾病檢測方法主要包括病原體的分離和生物學(xué)試驗、電鏡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、 熒光定量PCR技術(shù)等，這些方法在疾病診斷中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸 如周期長，操作繁瑣，每次只能檢測出一種或兩種病原體。目前，多重混合性傳播疾病感染 率明顯上升(申建維，孫秀琴，程冬娥.女性生殖道性傳播疾病病原體混合感染調(diào)查.中華 醫(yī)院感染學(xué)雜志[j]，2007，(05).)，應(yīng)用較廣泛的熒光定量PCR技術(shù)一次只能檢測出一種 病原體，如果有一份標(biāo)本，要檢測是否含有上述病原體的一種或多種，則需要分別進行多次 PCR反應(yīng)，檢測成本高，給性傳播疾病的檢測和診斷帶來困難，實驗診斷技術(shù)已經(jīng)明顯滯后。目前，正在發(fā)展的單管多重PCR技術(shù)，即在一個反應(yīng)管中、在同一反應(yīng)條件下對兩 個或兩個以上的不同靶基因進行同步擴增，這樣能大大提高PCR的效率。我們利用單管多重PCR技術(shù)，摸索其PCR反應(yīng)及抗污染的最佳條件，成功地用同一 份處理標(biāo)本和一次PCR擴增同時檢測U. urealyticum(解脲支原體，UU)、M. homins (人型支 原體，MH)、M. genitalium(生殖支原體，MG)、Chlamydia trachomatis (沙眼衣原體，CT)和 Neisseria gonorrhoeae (淋病奈瑟菌，NG)五種STD病原體，通過盲法分析評價認為這是一 種高效率高特異的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種多種性傳播病原體同步檢測的方法，該方法通過設(shè)計 專用擴增引物，給出五種病原體的同步檢測的多重PCR條件，該方法易行，能快速、簡便地 同步檢測標(biāo)本中五種病原體。為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施設(shè)計合適的引物，使引物之間不發(fā)生 干擾，并具有相似的擴增條件。其步驟是A.設(shè)計一套用于同步擴增五種病原體UU、MH、MG、CT, NG的引物，各引物針對相應(yīng) 病原體高度保守基因，不同引物的退火溫度近似，引物兩兩之間無三堿基以上之互補，PCR 產(chǎn)物兩兩長度之差大于40-50bp，以利于瓊脂糖凝膠分離，五種病原體NG、UU、CT、MG和MH 的引物序列見表1:表1 五種病原體NG、UU、CT、MG和MH的引物序列
權(quán)利要求
一種多種性傳播疾病病原體同步檢測的PCR方法及試劑盒，該方法包括以下試劑及步驟A.設(shè)計用于同步擴增五種病原體NG、UU、CT、MG和MH的引物，各引物為針對相應(yīng)病原體的高度保守基因，引物的退火溫度為56℃～64℃，引物兩兩之間無三堿基以上之互補，PCR擴增產(chǎn)物兩兩長度之差大于40～50bp；B.五種病原體NG、UU、CT、MG和MH的引物序列為C.五種病原體NG、UU、CT、MG和MH基因同步檢測的PCR，反應(yīng)體積25ul，Taq酶1.0U，緩沖液lx GC，Mg2+3.0mmol/L，dNTPs400umol/L，引物微摩爾濃度(umol/L)組合為 NG MH MG CT UU NP1/NP2 MHP1/MHP2 MP1/MP2 CP1/CP2 UP1/UP2 0.5 0.4 0.4 0.4 1.5 反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進行，熱循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，然后94℃1min、60℃1min、72℃2min 35個循環(huán)，最后72℃延伸5minD.擴增后，取10μl PCR產(chǎn)物和0.8μl Generuler(深圳晶美)在1×TEB緩沖液、5 6V/cm條件下跑2％瓊脂糖凝膠電泳40min，EB染色后于UVP凝膠成像儀(UVP Inc，美國)下觀察結(jié)果。 dest_path_FA20177452200910003800801C00011.tif
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步快速檢測五種性傳播疾病病原體(淋球菌(NG)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU))的單管多重PCR的方法及試劑盒，其特點是通過合理設(shè)計引物，優(yōu)化引物濃度組合及PCR條件，在同一個反應(yīng)管中和同一個熱循環(huán)條件下，對五種病原體同時進行擴增，并通過凝膠電泳分離和檢側(cè)。該發(fā)明除具有經(jīng)典PCR的靈敏度、快速、簡便等特點以外，主要是實現(xiàn)了五種病原體的同步檢測，成本更低，能用于開發(fā)相關(guān)試劑盒，用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查和控制。
文檔編號C12Q1/04GK101935686SQ200910003800
公開日2011年1月5日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者劉偉, 周玉球, 唐文志, 張永良, 戴小波, 蔡桂豐, 譚星蓉 申請人:唐文志