專(zhuān)利名稱(chēng)：抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸dna適配子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物感染免疫和檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種能抑制感染人的結(jié)核桿 菌(Mj;co6a"en'w附71^ercw/os/^〃J7AV) [ATCC 93009(4)]的DNA適配子(Aptamer)， 具有 SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3, SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7, SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO所示的核苷酸 序列。同時(shí)還涉及制備一種能與感染人的結(jié)核桿菌特異結(jié)合，抑制結(jié)核桿菌感染 的高親和DNA適配子的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(Mycokzcfen'wM rw&ra^w")感染人體導(dǎo)致的結(jié)核病是一種 嚴(yán)重危害人民身體健康的慢性傳染病。結(jié)核病是歷史上患病率及死亡率最高的疾 病之一。上世紀(jì)50年代以來(lái)，結(jié)核病的流行在一定程度上得到了控制。80年 代中期以來(lái)，由于耐藥結(jié)核菌的流行和艾滋病的傳播蔓延等因素，使一些己經(jīng)控 制了結(jié)核病疫情的國(guó)家出現(xiàn)了疫情進(jìn)一步加重或擴(kuò)散流行的局面，結(jié)核病疫情又 有進(jìn)一步抬頭的趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)資料顯示，全球目前有近三分 之一的人感染結(jié)核桿菌，活動(dòng)性肺結(jié)核病人達(dá)2000萬(wàn)，每年有300萬(wàn)人死于結(jié) 核病，新增患者880萬(wàn)人。1993年，世界衛(wèi)生組織宣布"全球結(jié)核病處于緊急 狀態(tài)"，把結(jié)核病列為重點(diǎn)控制的傳染病之一。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，國(guó)務(wù) 院已確定結(jié)核病為我國(guó)三大重點(diǎn)防治傳染病之一。因此，加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病的研發(fā)力
3度，急待研制新型抗結(jié)核新藥，以便對(duì)該病進(jìn)行有效的治療和預(yù)防，具有很大的 研究?jī)r(jià)值和社會(huì)效益。
SELEX技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系 統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，基本 原理是運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集 與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)多輪篩選，獲得高親和力、特異性強(qiáng)的寡核 苷酸適配子(aptamers)，具有庫(kù)容量大、靶分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng) 用范圍十分廣泛。己成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、 蛋白質(zhì)、藥物、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。這種方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等 特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫(kù)如隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)和噬菌體表面展示文庫(kù)相比，從寡 核苷酸文庫(kù)中篩選出的適配子具有更高的親和性和特異性，具有良好的應(yīng)用前 景。適配子與傳統(tǒng)意義上抗體相比，具有分子量小，能更快地滲入細(xì)胞，更迅速 在血液中清除，能夠穩(wěn)定合成，便于修飾等特點(diǎn)。是極有潛力的作為預(yù)防、診斷 和治療疾病的新型試劑。本研究中，我們采用SELEX技術(shù)對(duì)H37Rv進(jìn)行篩選， 并用BCG進(jìn)行反篩，以獲得能拮抗結(jié)核分枝桿菌表面毒力成分的生物活性小分子 核苷酸Aptamers分子。為結(jié)核桿菌感染機(jī)制的研究，結(jié)核病治療性新型藥物和 新型診斷試劑的開(kāi)發(fā)而奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，該DNA適 配子為預(yù)防和治療結(jié)核病提供了新型的拮抗劑，可以克服臨床常用藥物利福平 (rifampin)、鏈霉素(str印tomycin)等治療周期長(zhǎng)，副作用大的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子的方 法，該方法通過(guò)隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物的構(gòu)建、合成雙鏈DNA文庫(kù)、PCR擴(kuò)增、 SELEX篩選、體外抑制細(xì)菌侵襲實(shí)驗(yàn)，得到能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA適 配子，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)效果好，準(zhǔn)確率高。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其具有SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3, SEQIDN0.4, SEQIDN0.5, SEQIDN0.6, SEQIDN0.7, SEQIDN0.8,SEQIDN0.9, SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子的制備方法，按下列步驟順序進(jìn)行:
1、 構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)和引物。構(gòu)建長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的單鏈 DNA(ssDNA)文庫(kù) 5'_GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N3。-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表堿基A， G， T, C中的任意一個(gè)，該文庫(kù)的 容量約為1014 1015;構(gòu)建上游引物5，-GCGGAATTCTMTACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中畫(huà)線部分為T(mén)7啟動(dòng)子的序列，該引物含有DNA限制性 內(nèi)切酶ficoRI的酶切位點(diǎn)；構(gòu)建下游引物5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，， 該引物中含有DNA限制性?xún)?nèi)切酶A7mHI的酶切位點(diǎn)。隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物 可由引物合成公司合成。
2、 雙鏈DNA (dsDNA)及單鏈DNA (ssDNA)文庫(kù)的PCR擴(kuò)增，保存每輪篩 選前先將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增成dsDNA文庫(kù)，保存，并以dsDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增出下 一輪篩選的ssDNA文庫(kù)。為了穩(wěn)定條件，不改變反應(yīng)程序94°C 4min， 94°C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18~25個(gè)循環(huán)，72°C 7min。調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)以獲得最 佳擴(kuò)增效果(18~25個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試劑盒 回收純化。
3、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化。用含0.5ug/ml溴化乙錠的2y。瓊脂糖凝膠，對(duì)步驟 2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條 帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切下，用德國(guó)Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；
4、 SELEX篩選。每輪篩選所用的ssDNA量均為8 ug，使用前置于85。C水浴 15min后，迅速冰浴5min,取等量于篩選緩沖液(1Xbuffer)中與細(xì)菌作用，37 。C輕振15 min, 12000 rpm 5 min,棄上清,再加入篩選洗脫液(1Xbuffer)反 復(fù)洗滌4~6次。所得細(xì)菌用50 ul滅菌ddH20吹勻，煮沸5 min，冰浴，用酚/氯 仿(25: 24)抽提，取上清，PCR擴(kuò)增dsDNA庫(kù)，即為下一輪篩選的模板。
上述SELEX篩選緩沖液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl), 5Ommol/L氯化鉀(KC1) , 200mmol/L氯化鈉(NaCl) ， 0. 2mmol/L乙二胺四乙 酸(EDTA), 5%甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl), 50i咖ol/L氯化鉀(KCl)， lmol/L氯化鈉(NaCl)，0.2mraol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5%甘油(Glycerol), 0. 5誦ol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
5、 為了獲得特異性篩選，選用梯度篩選以增加選擇壓力。前三輪用108CFU (菌落形成單位)H37RV (購(gòu)自北京藥物制品研究所)篩選；
6、 第四輪開(kāi)始加入BCG進(jìn)行反篩，收集第三輪中所得ssDNA適配子8 ug， 使用前置于85。C水浴15min后，冰浴5min,取篩選緩沖液/1 X與106 CFU BCG (購(gòu) 自北京生物制品研究所)作用，37。C振15 min， 12000 rpm 5 min，棄上清，再 加入篩選洗脫液/lX洗滌，12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，將上清液與107CFU H37Rv作用，方法同上，離心后所得細(xì)菌用50 ul滅菌ddH20吹勻，煮沸5 min, 冰浴，用酚/氯仿/25: 24抽提，取上清，PCR擴(kuò)增dsDNA庫(kù)，為下一輪篩選的模 板，以此模板擴(kuò)增出下一輪篩選的ssDNA適配子。
7、 重復(fù)上述步驟八次。第四至第六輪用107CFU H37RV篩選，用106CFU BCG 開(kāi)始反篩；第七至第九輪用106CFU H37RV篩選，并用107CFU BCG反篩；第十至 十二輪用105CFU H37RV篩選，并用108CFU BCG反篩，完成十二輪篩選。
8、 比較各輪篩選后所得適配子庫(kù)與結(jié)核桿菌的親合力，方法同步驟5，分別 取各輪適配子8ug，與108CFU的H37RV作用，紫外分光光度計(jì)260nm檢測(cè)作用 后剩余的單鏈DNA量。通過(guò)檢測(cè)，可知第十輪適配子庫(kù)與結(jié)核桿菌的親合力最大。 將第十輪得到的單鏈DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制性?xún)?nèi)切 酶5coRI和3awHI消化，連于質(zhì)粒pUC19 (Yanisch-Perron, C., et a1.,1985)上，轉(zhuǎn)化
到大腸桿菌DH5 oc(Hanahan, D.,1983; Tartof, K. D.,et a1.，1987)，氨節(jié)抗性篩選，
挑取單個(gè)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行測(cè)序，得到上述SEQIDNO.l, SEQIDN0.2， SEQIDN0.3, SEQIDN0.4, SEQIDN0.5, SEQ腿0.6, SEQIDN0.7, SEQIDN0.8, SEQIDN0.9, SEQIDNO.10所p的核苷酸序列。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果-
一能特異性的結(jié)合在結(jié)核桿菌致病過(guò)程中發(fā)揮作用的毒力因子，可降低結(jié) 核桿菌侵入巨噬細(xì)胞的能力，抑制結(jié)核桿菌感染小鼠。DNA適配子可直接作為結(jié)
核桿菌的拮抗劑使用，可預(yù)防和治療結(jié)核病。因?yàn)椴捎昧诵碌慕M合化學(xué)技術(shù)一
SELEX技術(shù)進(jìn)行結(jié)核桿菌全菌的DNA適配子的篩選，確保了獲得的DNA適配子可 特異性結(jié)合在結(jié)核桿菌菌體毒力因子上，從而封閉了結(jié)核桿菌的致病位點(diǎn)，使其
6不能進(jìn)入巨噬細(xì)胞，從而不能在機(jī)體內(nèi)持留和增殖，有利于免疫系統(tǒng)對(duì)其清除。 二為克服臨床上結(jié)核治療出現(xiàn)的日益嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題和副作用大的情況， 提供了新的解決途徑。目前治療傷寒感染多釆用廣譜抗菌素，如異燕肼 (isoniazid)、利福平(rifampin)、鏈霉素(str印tomycin)、吡嗪酰胺 (pyrazinamide)、乙胺丁醇(etambutol)和氨硫脲(bethiozone)，這些藥物不僅 殺傷結(jié)核桿菌也殺傷寄生在人體內(nèi)的多種有益菌群，并且副作用大，周期長(zhǎng)；同 時(shí)結(jié)核桿菌的對(duì)這些藥物產(chǎn)生的耐藥問(wèn)題也日益嚴(yán)重。本發(fā)明制備的DNA適配 子為小分子核酸，其分子結(jié)構(gòu)不同與任何廣譜抗生素，因而無(wú)耐藥性之憂(yōu)；同時(shí) DNA適配子只針對(duì)結(jié)核桿菌發(fā)揮作用，對(duì)人體內(nèi)的多種有益菌群并無(wú)危害。DNA 適配子也別于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)抗體，其分子量小，可快速滲入細(xì)胞，無(wú)抗原性， 不引起副作用。
三由下表可知，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，小鼠攻毒后19天取肺臟和脾臟進(jìn)行細(xì)菌計(jì) 數(shù)，可發(fā)現(xiàn)用DNA適配子處理結(jié)核桿菌H37Rv后，結(jié)核桿菌的數(shù)目明顯要少于未 加DNA適配子處理組。說(shuō)明本發(fā)明的適配子能有效地抑制結(jié)核桿菌侵入巨噬細(xì) 胞，促進(jìn)了結(jié)核桿菌在機(jī)體內(nèi)的清除，可以直接作為結(jié)核桿菌的拮抗劑使用。此 外，該DNA適配子及適配子庫(kù)已克隆到pucl9質(zhì)粒上，并且該質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化到大腸
桿菌DH5a中，可直接用該菌株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)制備。
GroupLung(CFU)Spleen (CFU)
H37Rv1.3><1071參106
H37Rv+NK21.19xl077.0M05
H37Rv+aptamers pool2.9，<1061.5xl0

圖1. SELEX技術(shù)篩選特異性抑制結(jié)核感染適配子示意圖。
用合成的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)與結(jié)核桿菌有毒株H37Rv作用，去掉不能 結(jié)合的部分，篩選三輪后加入BCG進(jìn)行反篩，共篩選十二輪。
圖2.單鏈DNA和雙鏈DNA的擴(kuò)增示意圖。
每輪篩選前先將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增成dsDNA文庫(kù)，保存，并以dsDNA文庫(kù)為模
7板擴(kuò)增出下一輪篩選的ssDNA文庫(kù)。此圖選用第3， 5， 7， 9， ll輪的ssDNA和 dsDNA作為示例。
圖3.有毒株結(jié)核桿菌吸附各輪(3~12)篩選后所得到的ssDNA適配子的能力比 較示意圖。
全部篩選完后，分別取8ug每輪篩選后得到的ssDNA與108CFU H37Rv作用， 發(fā)現(xiàn)第十輪適配子庫(kù)于結(jié)核桿菌有最強(qiáng)的結(jié)合能力。
圖4A、 4B.等溫滴定量熱法檢測(cè)核苷酸SEQIDNO.l與H37Rv和BCG親合力示 意圖。
以Microcal公司提供的Origin 5.0軟件對(duì)SEQIDNO.l適配子和細(xì)菌反應(yīng)的 稀釋熱進(jìn)行雙位點(diǎn)模型非線性最小方差擬和，可以得到SEQIDNO.l適配子和細(xì) 菌作用的本征結(jié)合常數(shù)Ka。其中SEQIDNO.l適配子與BCG的結(jié)合常數(shù)分別為 Kla: 7.20xl04(土3.6xl()3)Lmor1， AG尸3.124xl05(±3.674xl04)J; K2a: 1.52xl()5(土9.8xl03)Lmor1， AG2= 7.247xl04(±2.94xl03)K圖4A)。而SEQIDNO.l 適配子與H37Rv的結(jié)合常數(shù)分別為Kla: 1.84xl04(±1.5xl03) Lmol", AG產(chǎn) 6.248xl05(±4.517xl04)J; K2a: 7.65xl05(±6.0xl04) Lmol-1, AG2= -3.739xl05(±8.968xl04)J (圖4B)。從數(shù)據(jù)可知，SEQIDNO.l適配子與結(jié)核桿菌 有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與BCG結(jié)合時(shí)，都為吸熱反應(yīng)，而與H37RV結(jié)合時(shí)，其中一 個(gè)位點(diǎn)為放熱反應(yīng)，且親合力較高，說(shuō)明反篩是有效的，因而篩選所得到的適配 子特異性的。
圖5.抑制結(jié)核桿菌侵襲巨噬細(xì)胞的能力示意圖。
由圖可知，結(jié)核桿菌和適配子作用后侵入巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少， SEQIDNO.1-10混合適配子的作用比單個(gè)SEQIDNO.l適配子的作用更為明顯。
圖6.適配子延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間和提高生存率示意圖。
適配子在與結(jié)合桿菌作用后，可以明顯延長(zhǎng)小鼠感染結(jié)核桿菌后的生存時(shí) 間，并且生存率也得到提高。其中A為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠組，B為結(jié)核桿菌H37Rv和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠組，C為結(jié)核桿菌H37Rv和 SEQIDNO.l-10混合適配子作用后感染小鼠組。從圖中可以看出，結(jié)核桿菌與適 配子作用后，半數(shù)死亡率可推遲3天，生存率可提高l倍。
圖7.適配子對(duì)結(jié)核桿菌損害小鼠肺臟的病理改變示意圖。,
由圖可知，結(jié)合桿菌在與適配子作用后，對(duì)小鼠肺臟病理?yè)p害明顯減輕。其 中A為正常小鼠肺臟,B為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠肺臟，C為結(jié)核桿菌H37Rv 和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠肺臟，D結(jié)核桿菌H37Rv和SEQIDNO.1-10
混合適配子作用后感染小鼠肺臟。
圖8.適配子減少結(jié)核桿菌感染小鼠后肺臟帶菌量示意圖。
抗酸染色證實(shí)，結(jié)核桿菌H37Rv與適配子作用后感染小鼠，與未與適配子 作用相比，小鼠肺臟的帶菌量明顯減少。其中A為為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠 肺臟，B為結(jié)核桿菌H37Rv和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠肺臟，C結(jié)核 桿菌H37Rv和SEQIDNO.I-10混合適配子作用后感染小鼠肺臟，D為鏈霉素治 療后小鼠肺臟，箭頭所指為結(jié)核桿菌。
具體實(shí)施例方式
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其具有SEQIDNO. (1-10)所示的
核苷酸序列。
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子的制備方法按下列步驟順序進(jìn)行 K構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)和引物。構(gòu)建長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的單鏈 DNA(ssDNA)文庫(kù) 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N3。-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表堿基A， G， T, C中的任意一個(gè)，該文庫(kù)的 容量約為1014 1015;構(gòu)建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中畫(huà)線部分為T(mén)7啟動(dòng)子的序列，該引物含有DNA限制性 內(nèi)切酶￡coRI的酶切位點(diǎn)；構(gòu)建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3'， 該引物中含有DNA限制性?xún)?nèi)切酶S"mHI的酶切位點(diǎn)。隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物可由上海生物工程公司合成。
2、 雙鏈DNA (dsDNA)及單鏈DNA (ssDNA)文庫(kù)的PCR擴(kuò)增每輪篩選前先 將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增成dsDNA文庫(kù)，保存，并以dsDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增出下一輪篩 選的ssDNA文庫(kù)。為了穩(wěn)定條件，不改變反應(yīng)程序94°C 4min， 94°C 30s， 56 °C 45s， "72。C lmin30s， 18~25個(gè)循環(huán)，72 °C 7min。調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)以獲得最佳 擴(kuò)增效果(18~25個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢領(lǐng)||，試劑盒回 收純化。
3、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化。用含0.5ug/ml溴化乙錠的2y。瓊脂糖凝膠，對(duì)步驟 2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條 帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切下，用德國(guó)Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；
4、 SELEX篩選。為了獲得特異性篩選，采用梯度篩選以增加選擇壓力。前三 輪用1(TCFUH37RV篩選；第四輪至第六輪用106CFUH37RV篩選，并用106CFUBCG 開(kāi)始反篩；第七至第九輪用106CFU H37RV篩選，并用107CFU BCG反篩；第十至 十二輪用105CFU H37RV篩選，并用108CFU BCG反篩。每輪篩選所用的ssDNA量
均為8 ug,使用前置于85。C水浴15min后，迅速冰浴(0°C) 5min，取適量于篩
選緩沖液(lXbuffer)中與細(xì)菌感作，37t輕振15 min， 12000 rpm 5 min， 棄上清，再加入篩選洗脫液(1Xbuffer)反復(fù)洗滌4~6次。所得細(xì)菌用50 ul 滅菌ddH20吹勻，煮沸(100°C) 5min,冰浴((TC)，用酚/氯仿(25: 24)抽提，
取上清，PCR擴(kuò)增dsDNA庫(kù)，即為下一輪篩選的模板。
上述SELEX篩選緩沖液(2X)為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)， 50mmol/L氯化鉀(KC1) , 200mmol/L氯化鈉(NaCl) , 0. 2腿ol/L乙二胺四乙 酸(EDTA)' 5%甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)， 5Ommol/L氯化鉀(KC1), lmol/L氯化鈉(NaCl)，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 50/o甘油(Glycero1)， 0. 5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
5、 完成十二輪篩選后，比較各輪篩選后所得適配子庫(kù)與結(jié)核桿菌的結(jié)合能力， 方法同步驟5，分別取各輪適配子8ug，與K)8CFU的H37RV作用，紫外分光光度 計(jì)260nm檢測(cè)作用后剩余的單鏈DNA量。通過(guò)檢測(cè)，可知第十輪適配子庫(kù)與結(jié)核
106、將第十輪得到的單鏈DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制
性?xún)?nèi)切酶五coRI和SamHI消化，連于質(zhì)粒pUC19上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 oc ，
氨芐抗性篩選，挑取單個(gè)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行測(cè)序；
7、將出現(xiàn)頻率最多克隆的單個(gè)生長(zhǎng)菌落所對(duì)應(yīng)的DNA適配子和第10輪適
配子庫(kù)各8ug分別加入含有107CFU的結(jié)核桿菌[ATCC93009(4)]菌液中感作，作
用方法同步驟5，感作后的細(xì)菌做小鼠(C57BL/6)攻毒實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以沒(méi)有處理 的結(jié)核桿菌做攻毒對(duì)照。將小鼠分為四組，每組8只。第一組為攻毒組，注射
107CFU H37RV/只；第二組將107CFU H37RV與第10輪ssDNA庫(kù)8ug， 37。C感作30min
后再注射；第三組為第10輪出現(xiàn)頻率最大適配子NK2與107CFU H37RV作用后注 射，方法同第二組；第四組為鏈霉素治療組，注射l(/CFUH37RV后24h，再用鏈 霉素治療(lmg/0.5ml.只/天)，共六天。同時(shí)取4只小鼠只注射篩選緩沖液(1>0 和0.05%Tween-80的生理鹽水作為空白對(duì)照，所有小鼠均為尾靜脈注射400ul。 實(shí)驗(yàn)前H37RV都經(jīng)小鼠體內(nèi)傳代，以增強(qiáng)毒力，以便于結(jié)果穩(wěn)定。
實(shí)驗(yàn)證明，適配子庫(kù)和單適配子均能延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，并能明顯減少活 體肺組織的帶菌量。因此，第十輪適配子庫(kù)即為能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA 適配子庫(kù)，其中出現(xiàn)頻率最大的單適配子即為能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA 適配子。
上述SELEX篩選緩沖液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl), 50mmol/L KC1, 200mmol/LNaCl， 0. 2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 5%甘油 (Glycerol), O.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
11SEQUENCE LISTING
<110〉武漢大學(xué)
<120〉抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸DNA適配子及其制備方法 <130〉抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸DNA適配子及其制備方法
<160〉 10
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 30
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 1
tttaatcaca caacaccgtg cttc犯gctt 30
<210〉 2
<211> 30
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400〉 2
tttaatcaca caacaccgtg tttc幼gctt 30
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<211〉 30
<212> 讓 <213>人工序列
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tttaatcaca caacaccgtg cttctagctt 30
〈210〉 4
〈211〉 30〈212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4
tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt
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tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt
〈210〉 6 <211〉 30 <212〉 DNA
〈213〉人工序列 . 〈400〉 6
cgacaggggt ctgaatcacg tacattcgta
<210> 7 〈211〉 30 〈212> DNA <213>人工序列 <400> 7
cgacaggggt ctgaaccacg tacattcgta
<210> 8 <211〉 30 <212〉 腿
〈213〉人工序列〈400〉 8
ataactggat ccgtccacac cttc犯actg 30
<210〉 9 <211> 30 〈212〉 腿 <213〉人工序列 <400> 9
acccacttcg aatccagatt catgaaccaa 30
<210〉 10 〈211〉 30 <212> 腿 <213>人工序列 <400> 10
cccatactac attcatcccg gaacacgtgg 30
權(quán)利要求
1、一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其序列為SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2、權(quán)利要求1所述的一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子在結(jié)核感染藥 物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子及制備方法，DNA適配子具有SEQIDNO.1-10所示的核苷酸序列，其制備方法包括以下步驟首先是構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的；其次是合成雙鏈DNA文庫(kù)；第三是SELEX篩選；第四是PCR擴(kuò)增、第五是克隆和測(cè)序，第六是通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA適配子的效果。該DNA適配子可直接作為結(jié)核桿菌拮抗劑使用，可用于預(yù)防和治療結(jié)核病，克服臨床常用藥物利福平(rifampin)、鏈霉素(streptomycin)等治療周期長(zhǎng)，副作用大的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101497882SQ20091000399
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者章曉聯(lián), 凡 陳 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)