專利名稱：蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病原體檢測技術(shù)，特別是用于檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的LAMP檢 測方法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lyme disease)又稱萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是一種蜱傳性的自 然疫源性人獸共患螺旋體病，因首次在美國康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)而得名。病原體為伯 氏疏螺旋體，可分為10個基因型或組，我國已發(fā)現(xiàn)報道的萊姆病螺旋體有狹義伯氏疏螺旋 # (Borrelia burgdorferi sensus stricto)、偽卩氏疏il旋體(B. garinii)禾口KI氏疏il旋 體(B. afzelii)三個基因型。目前已在全球30多個國家和地區(qū)報告有本病和自然疫源地 存在，年發(fā)病人數(shù)在30萬左右，仍有不斷增多的趨勢，在美國有“第二愛滋病”之稱(Gratz N. Emerging and resurgingvector-borne disease. Ann Rev Entomol,1999,44 :51)。1992 年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將此病列為重點(diǎn)防治研究對象。我國于1986年首次在黑龍江省海 林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)了該病，到目前，我國29個省(區(qū)、市)均已發(fā)現(xiàn)有萊姆病分布，每年新發(fā)病 例高達(dá)萬余例，某些省份林區(qū)的發(fā)病率在1_40%。人感染后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性炎癥性多系統(tǒng)損傷，除皮膚慢性游走性紅 斑、關(guān)節(jié)炎和慢性萎縮性肢皮炎外，常常會伴有心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從而引起腦膜炎、 路神經(jīng)炎、運(yùn)動及感覺神經(jīng)根炎、神經(jīng)叢炎、多發(fā)單神經(jīng)炎小腦共濟(jì)失調(diào)等等癥狀。嚴(yán)重影 響人類健康。由于本病是一類蜱傳性疾病，所以探明媒介蜱的種類，為切斷傳播途徑，控制本病 的流行是十分重要的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在北美主要的媒介蜱是肩突硬蜱、新節(jié)硬蜱和太平洋硬 蜱，其中肩突硬蜱是主要的傳播媒介，帶菌率在12-100% ；歐洲的傳播媒介是篦子硬蜱和全 溝硬蜱，篦子硬蜱的帶菌率可達(dá)到40% ；在我國，在全溝硬蜱、粒形硬蜱、銳跗硬蜱、長角血 蜱、二棘血蜱、嗜群血蜱、臺灣血蜱、微小牛蜱和森林革蜱等9種硬蜱體內(nèi)分離到病原，其中 全溝硬蜱、二棘血蜱和粒形硬蜱的帶菌率最高，分別達(dá)到20-45%、16-40%和24%。研究證 實(shí)在我國北方林區(qū)主要是全溝硬蜱，南方林區(qū)為二棘血蜱和粒形硬蜱傳播本病。到目前為止，在蜱體內(nèi)檢測本病病原的方法主要以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和反向 線狀印跡(RLB)方法為主，但是PCR在檢測本病原時常常表現(xiàn)為敏感性較低，同時需要復(fù) 雜的操作系統(tǒng)——PCR儀；RLB雖然具有較好的敏感性，但是其操作復(fù)雜，對操作實(shí)驗(yàn)室的 要求高。難以滿足進(jìn)行本病原的大規(guī)模調(diào)查的需要，參見Rauter C，Meuller M，Diterich I，et al. Critical evaluation ofurine-based PCR assay for diagnosis of Lyme borreliosis. Clin Diag Lab Immunol,2005,12 910-917 ；Moran-Cadenas F, Schneider H, et al. , A comparison of two DNAextraction approaches in the detection of Borrelia burgdorferi sensu Iato from IiveIxodes ricinus ticks by PCR and reverse line blotting. Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ；7(4) :555_561)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原伯氏疏螺旋體時需要復(fù)雜的儀器和 敏感性低的缺點(diǎn)，提供一種只需要常規(guī)的水浴鍋就可以具有高敏感性的分子檢測方法，這 種方法的檢測敏感性高于PCR方法，同時不需要復(fù)雜的操作系統(tǒng)，可以在普通實(shí)驗(yàn)室條件 下實(shí)施檢測，并具有操作簡單、敏感性高、快速等特點(diǎn)。本發(fā)明同時提供這種應(yīng)用檢測方法 的檢測試劑盒。本發(fā)明的蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原檢測方法是以16S rRNA基因?yàn)榘谢?，用專?軟件設(shè)計出用環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)用于蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原伯氏疏螺旋體的引物，再 從中選出萊姆病病原特異性區(qū)段的引物，將侍檢蜱刺破后提取DNA，將所得DNA與反應(yīng)緩沖 液、所選出的特異性區(qū)段的引物反應(yīng)混合物及DNA聚合酶混勻，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物滅活后 加入上樣緩沖液，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)電泳后是否出現(xiàn) 特定條帶后即可得出被檢蜱是否帶有萊姆病病原。在本發(fā)明的檢測方法中所用的上樣緩沖液為質(zhì)量/體積比為0. 25%的溴酚藍(lán)， 質(zhì)量/體積比為0. 25%的二甲苯青，質(zhì)量/體積比為40%的蔗糖水溶液，所用的含溴化乙 錠的瓊脂糖凝膠為由0. 04M Tris-乙酸和0. OOlM EDTA組成的TAE緩沖液配制的其中含 0. 5ug/mL的溴化乙錠質(zhì)量/體積比為2%瓊脂糖。本發(fā)明的檢測方法中所用的萊姆病病原特異性引物為正向外部上游引物F3 :5，-ttccccgtttggggtcta-3，反向外部下游引物B3 :5，-gggccatgatgatttgacgt-3，正向內(nèi)部弓I物 FIP :5，-cgttgcgggacttaacccaacattttatacaggtgctgcatggttg-3，反向內(nèi)部弓I物 BIP :5，-accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3，本發(fā)明的試劑盒內(nèi)有a.標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陽性基因組DNA ；b.標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陰性蜱基因組DNA ；c. LAMP反應(yīng)緩沖液；d. DNA 聚合酶；e.特異引物混合物。本發(fā)明實(shí)際上是一種采用環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法，這種方法是日本科 學(xué)家Notomi T.等于2000年發(fā)明的敏感性很高的DNA擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isotheral amplification method, LAMP) (Notomi, Τ. , Okayama, H. , Masubuchi, H. , Yonekawa, Τ., Watanabe, K. , Amino, N. , Hase, Τ. ,2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28，E63.)。采用本發(fā)明的方法檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原伯氏疏螺旋體時不需要復(fù)雜的儀器設(shè) 備，只需要常規(guī)的水浴鍋就可以完成檢測，可在普通的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蜱體內(nèi)萊姆病病原的檢 測和萊姆病的流行病學(xué)調(diào)查，而且可得到具有高敏感性的檢測結(jié)果。


圖1為采用本發(fā)明方法經(jīng)擴(kuò)增后電泳檢測的結(jié)果，其中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2000, Bb為狹義伯氏疏螺旋體，Ba為阿氏疏螺旋體，Bg為嘎氏疏螺旋體，W為滅菌超純水。圖2為田間樣品的檢測結(jié)果，其中M為IOObp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；Ba為阿氏疏螺旋體基 因組DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性；Bb為狹義伯氏疏螺旋體基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性；Bg為嘎氏疏螺旋體基因 組DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性；1-5為田間樣品的檢測結(jié)果；6為伯氏疏螺旋體陰性的蜱基因組DNA ；7為 超純水的空白對照。
具體實(shí)施例方式以下提供本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的檢測方法在1. 5mL的離心管中進(jìn)行， 所使用的引物及試劑如下1)特異引物正向外部上游引物F3 :5，-ttccccgtttggggtcta-3，反向外部下游引物B3 :5，-gggccatgatgatttgacgt-3，正向內(nèi)部弓I物 FIP :5，-cgttgcgggacttaacccaacattttatacaggtgctgcatggttg-3，反向內(nèi)部弓I物 BIP :5，-accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3，2)特異性引物反應(yīng)混合物(40pmol的FIP和BIP, 5pmol的F3和B3)。3) 2 X LAMP 反應(yīng)緩沖液(40mM Tris-HCl (pH 8. 8)，20mM KCl，169 16mMMgS04, 20mM(NH4)2S04,0. 2% Tween 20，1· 6M betaine 和 2. 5mM dNTP)。4) Bst DNA 聚合酶(M0275L，BioLabs)。5)標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陽性基因組DNA。6)標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陰性蜱基因組DNA。7)6X上樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液)。8) IXTAE 緩沖液(0. 04M Tris-乙酸，0. OOlM EDTA)。9) 2 %瓊脂糖(用1 X TAE緩沖液配制)其具體的操作方法如下一、標(biāo)準(zhǔn)試樣的檢測(一 )陽性基因組DNA的制備過程伯氏疏螺旋體的體外培養(yǎng)接種標(biāo)準(zhǔn)的狹義伯氏、阿氏和嘎氏疏螺旋體菌株于含 有5mL SKII (Sigma)培養(yǎng)基的密封的6mL玻璃試管中，置33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1_3周，每周用 暗視野顯微鏡檢測一次。當(dāng)菌液達(dá)到較高濃度時，收集菌液，4000rpm離心20分鐘，丟棄上 清，沉淀用TBS(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)懸浮，同上離心洗滌3次，_20°C保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA的提取應(yīng)用基因組提取試劑盒(Gentra)，根據(jù)說明書進(jìn)行三種疏螺 旋體基因組DNA的提取。測定所制備的基因組DNA的濃度，并應(yīng)用稀釋液稀釋成IOOng/ mL，-20°C保存?zhèn)溆谩? 二 )標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陰性蜱基因組DNA的制備篩選伯氏疏螺旋體陰性蜱，應(yīng)用基因組提取試劑盒(Gentra)根據(jù)說明書進(jìn)行基 因組DNA的提取。測定所制備的基因組DNA的濃度，并應(yīng)用稀釋液稀釋成lOOng/mL，-20°C 保存?zhèn)溆谩?三)2X LAMP反應(yīng)緩沖液的準(zhǔn)備首先應(yīng)用滅菌的超純水按照如下表比例配制無dNTP的2X反應(yīng)緩沖液儲存液，可 在4°C保存3個月，-20°C長期保存。
使用前每900uL的2X反應(yīng)緩沖液儲存液中加入IOOuL 25mM dNTP,混勻，制備成 2X反應(yīng)緩沖液工作液，-20°C保存?zhèn)溆谩?三)檢測過程在1. 5mL的離心管中按如下述比例加入待檢樣品，同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性基因 組DNA和超純水的空白的對照2 X反應(yīng)緩沖液工作液12.5uL引物反應(yīng)混合物0.9uL滅菌的超純水8. 6uLDNA 樣品2. OuLBst DNA 聚合酶LOuL_總體積25uL輕輕混勻，瞬間離心。在60°C水浴鍋中擴(kuò)增50分鐘，立刻轉(zhuǎn)入80°C水浴鍋中滅活 2分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物5uL，以TAE為緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠(含0. 5ug/mL溴化乙錠) 中，在75電泳中進(jìn)行檢測。在4個1. 5mL的離心管中按如前述比例加入樣品，DNA樣品分別應(yīng)用狹義伯氏、阿 氏、嘎氏疏螺旋體和滅菌超純水。輕輕混勻，瞬間離心。在水浴鍋中60C擴(kuò)增50分鐘，立刻 轉(zhuǎn)入80C水浴鍋中滅活2分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物5uL，以TAE為緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠(含 0.5ug/mL溴化乙錠)中，在75電泳中進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見圖1，結(jié)果表明狹義伯氏疏螺 旋體、阿氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體基因組DNA都能被特異性的擴(kuò)增，而滅菌超純水的反應(yīng) 管中沒有擴(kuò)增。二、野外試樣的檢測取野外田間捕捉的5個蜱樣本，將蜱刺破后提取DNA，在10個1. 5mL的離心管中按 如前述比例分別加入下列樣品，DNA樣品分別應(yīng)用阿氏、狹義伯氏、嘎氏疏螺旋體、1-5號田 間樣品、伯氏疏螺旋體陰性的蜱基因組DNA和滅菌超純水。輕輕混勻，瞬間離心。在水浴鍋 中60°C擴(kuò)增50分鐘，立刻轉(zhuǎn)入80°C水浴鍋中滅活2分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物5uL，以TAE為緩沖液，在2% (質(zhì)量/體積比)的瓊脂糖凝膠(含0. 5ug/mL溴化乙錠)中，在75電泳中進(jìn)行 檢測。部分檢測結(jié)果見圖2。結(jié)果表明野外采集的5號樣品為陽性。經(jīng)序列測定結(jié)果顯示 其為嘎氏疏螺旋體。檢測的結(jié)果表明應(yīng)用本方法能夠從田間蜱體內(nèi)檢測出萊姆病病原的基 因組DNA。
權(quán)利要求
蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原的檢測方法，其特征是以16S rRNA基因?yàn)榘谢?，用專用軟件設(shè)計出用環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)用于蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原伯氏疏螺旋體的引物，再從中選出萊姆病病原特異性區(qū)段的引物，將侍檢蜱刺破后提取DNA，將所得DNA與反應(yīng)緩沖液、所選出的特異性區(qū)段的引物反應(yīng)混合物及DNA聚合酶混勻，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物滅活后加入上樣緩沖液，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)電泳后是否出現(xiàn)特定條帶后即可得出被檢蜱是否帶有萊姆病病原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原的檢測方法，其特征是所用的上樣緩 沖液為質(zhì)量/體積比為0. 25%的溴酚藍(lán)，質(zhì)量/體積比為0. 25%的二甲苯青，質(zhì)量/體積 比為40%的蔗糖水溶液，所用的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠為由0. 04M Tris-乙酸和0. OOlM EDTA組成的TAE緩沖液配制的其中含0. 5ug/mL的溴化乙錠質(zhì)量/體積比為2%瓊脂糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原的檢測方法，其特征是所用的萊 姆病病原特異性引物為正向外部上游引物 F3 :5，-ttccccgtttggggtcta-3，反向外部下游引物 B3 :5，-gggccatgatgatttgacgt-3，正向內(nèi)部弓I物 FIP :5，-cgttgcgggacttaacccaacattttatacaggtgctgcatggttg-3，反向內(nèi)部弓I物 BIP 5' -accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3'
4.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1或2或3所述的檢測方法的試劑盒，其特征是試劑盒內(nèi)有a.標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陽性基因組DNA;b.標(biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體陰性蜱基因組DNA;c.LAMP反應(yīng)緩沖液；d.DNA聚合酶；e.特異引物混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的LAMP檢測方法。本發(fā)明的方法是以16S rRNA基因?yàn)榘谢?，用專用軟件設(shè)計出用環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)用于蜱體內(nèi)檢測萊姆病病原伯氏疏螺旋體的引物，再從中選出萊姆病病原特異性區(qū)段的引物，將侍檢蜱刺破后提取DNA，將所得DNA與反應(yīng)緩沖液、所選出的特異性區(qū)段的引物反應(yīng)混合物及DNA聚合酶混勻，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物滅活后加入上樣緩沖液，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)電泳后是否出現(xiàn)特定條帶后即可得出被檢蜱是否帶有萊姆病病原。
文檔編號C12Q1/04GK101886113SQ20091000501
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者任巧云, 關(guān)貴全, 劉軍龍, 劉志杰, 李有全, 楊吉飛, 殷宏, 牛慶麗, 羅建勛, 馬米玲, 高金亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所