專利名稱：：羥喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種羥喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化制備方法。
背景技術(shù)：
：自從1966年美國Wall等人首次從中國特有的珙桐科植物喜樹中提取出喜樹堿(Campothecin，CPT)以來，該類生物堿的抗腫瘤作用就一直受到廣泛關(guān)注。1985年Hsiang闡述了這類藥物抗腫瘤作用的機制，認(rèn)為喜樹堿及其衍生物是以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I為作用靶點，并抑制生物體DNA的合成而發(fā)揮抗腫瘤作用的。'這使得此類藥物成為除紫杉醇類以外的植物類抗腫瘤藥物研究的第二大熱點。其中羥喜樹堿(Hydroxycamptoyhecin，HCPT)及以羥喜樹堿為中間體合成的拓普替康(Topotecan，TPT)和伊立替康(Ca即tothecin-II，CPT-II)在臨床上顯示出廣泛的抗腫瘤活性，并且毒副作用相對較小，國內(nèi)的臨床需求量和出門量逐年增加。為了滿足需求，這類藥物的制備研究也愈來愈多地受到重視，尤其是羥喜樹堿UiCPT)的制備，因為它不僅本身就是臨床效果較好的抗腫瘤藥物，而且還是制備其它喜樹堿類衍生物的重要中間體。羥喜樹堿是植物喜樹中的一種生物堿，長期以來我國企業(yè)一直是從植物中直接提取，但因其含量較低，生產(chǎn)成本較高，難以滿足臨床需要。隨后人們對羥喜樹堿的制備進(jìn)行了大量研究，包括化學(xué)全合成、化學(xué)半合成、生物轉(zhuǎn)化和在近緣植物中尋找新的藥源等，但因種種原因，這些方法仍未用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人在開展懸浮培養(yǎng)喜樹細(xì)胞生產(chǎn)羥喜樹堿的研究中，發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)的喜樹細(xì)胞經(jīng)接種某些微生物后，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中羥喜樹堿的含量得到大幅度的提高。因此，針對提高羥喜樹堿得率的微生物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件，羥喜樹堿的提取、分離、純化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對其進(jìn)行了體外抗腫瘤試驗檢測，為建立羥喜樹堿的制備新方法及產(chǎn)業(yè)化打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明的目在于提供一種羥喜樹堿的制備新方法，利用微生物對懸浮培養(yǎng)的喜樹細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化從而提高羥喜樹堿得率。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明制備的羥喜樹堿結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>羥喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化制備方法，是以喜樹的幼莖為外植體，將在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)、并繼代的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，再接種微生物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化;然后經(jīng)提取、析晶、柱層析、結(jié)晶等方法分離純化經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中羥喜樹堿，具體如下-一、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)系的建立A、喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)是在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，光照8-10小時/天，培養(yǎng)溫度為2035"C，培養(yǎng)310天，喜樹愈傷組織每隔315天繼代一次，繼代310次。作為誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的固體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了1.01.5mg/l6-芐基腺嘌呤，260g/l蔗糖，l15g/l尿素，0.60.9mg/l2,4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂6g/1，pH為5.56.5。B、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)懸浮系建立將A歩培養(yǎng)好的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入通氣量為0.10.51/min的氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器中培養(yǎng)，溫度為2035t，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)每隔315天繼代一次。進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加L01.5mg/16-芐基腺嘌呤，260g/l蔗糖，l15g/l尿素，0.60.9mg/12,4-二氯苯氧乙酸，pH為5.56.5。喜樹細(xì)胞培養(yǎng)周期為525天。二、微生物對懸浮培養(yǎng)喜樹細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化A.喜樹細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及微生物的接種-無毒黃曲霉Cr-l菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopussp.)的接種于喜樹細(xì)胞培養(yǎng)期的第525天接種1%2%的無毒黃曲霉Cr-l菌株(Aspergillus.flavus),相距1100小時后接種1%2%的根霉T-34菌株(Rhizopussp.);B.微生物的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件初始PH值為5.56.5，溫度為2535°C，在接種根霉T-34菌株(Rhiz叩ussp.)后再培養(yǎng)轉(zhuǎn)化1240小時。C、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，5(卜-8(f(::烘干至恒重，磨成粗粉，備用。三、羥喜樹堿的分離與純化A.經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中羥喜樹堿的提取-以乙醇為提取液，采用連續(xù)回流提取，在8095'C水浴中，提取喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物粉末內(nèi)的羥喜樹堿，得到含有羥喜樹堿的提取液；B.濃縮、析品-提取液經(jīng)減壓濃縮至1/15體積，趁熱過濾，靜置放冷，析晶后過濾，品體備用；濾液真空揮干溶劑，以少量熱乙醇溶解，靜置放冷，析晶；合并晶體以熱乙醇重結(jié)晶，結(jié)晶體用甲醇:三氯甲烷=1:5(V/V)的溶劑溶解，得到含有羥喜樹堿的溶液；C.硅膠柱對結(jié)晶溶液的再分離硅膠柱分別以三氯甲垸、甲醇:三氯甲烷-0.3:100(V/V)、甲醇:三氯甲垸二1.3:100(V/V)依次梯度洗脫，收集甲醇:三氯甲垸-l.3:100(V/V)洗脫液，得到含有羥喜樹堿的洗脫液；D.對洗脫液的再結(jié)晶減壓回收溶劑至干，分別以無水乙醇和甲醇:三氯甲垸-O.1:100(V/V)兩種溶液結(jié)品，其中甲醇:三氯甲垸-O.1:100(V/V)溶液結(jié)晶得到含量在98%以上羥喜樹堿純品。本發(fā)明的有益效果是用喜樹的幼莖為外植體，不影響原植株的繼續(xù)生長，所用的培養(yǎng)基和所接種的微生物菌株廉價易得，操作過程簡便明了，分離歩驟少，分離方法簡單，節(jié)省大量時間和溶劑，能夠得到含量在98%以上羥喜樹堿純品，其抑制腫瘤細(xì)胞效果與天然羥喜樹堿相同。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一歩說明，可以使本專業(yè)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的保護范圍。一、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)系的建立A、喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的配制用蒸餾水配制MS培養(yǎng)基一升。附加1.1mg/L6-芐基腺嘌呤，2g/l蔗糖，3g/l尿素，0.7mg/l2，4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂6g/l，pH為6.0。平均分裝于25個100mL三角培養(yǎng)瓶，加塞后，置于高壓鍋中，121°C、15個大氣壓下，滅菌20分鐘。選取喜樹幼莖為外植體，先用清水清洗干凈，浸入70%乙醇漂洗35min，取出后用清水沖洗三次，再在滴加了二滴吐溫一80的0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡5min，無菌水沖洗三至四次(直至無泡沫時為止)。將幼莖在無菌條件下剪成約0.8cmx0.8cm大小的小塊，接入配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照10小時/天，培養(yǎng)溫度為28"C，培養(yǎng)7天，就會看到有愈傷組織產(chǎn)生。每隔15天繼代一次(所用繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)。經(jīng)過6次繼代培養(yǎng)，就可以得到疏松易碎，生長狀態(tài)良好，適于懸浮培養(yǎng)的喜樹愈傷組織。B、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)懸浮系建立液體培養(yǎng)基的配制液體培養(yǎng)基的組成用蒸餾水配制MS培養(yǎng)基1升。附加.lmg/16-芐基腺嘌呤，2g/1蔗糖，3g/1尿素，0.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸，pH為6.0。與固體培養(yǎng)基組成基本一致，只去除掉瓊脂，將2，4-D濃度改為0.5mg/l。高壓滅菌后分裝于11氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器中，每個反應(yīng)裝置500ml培養(yǎng)液，。將6次繼代培養(yǎng)的以上疏松易碎、生長旺盛的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，每個反應(yīng)裝置的接種量(鮮重)50克，為培養(yǎng)液重量的10%。在通氣量為0.351/min的氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器中培養(yǎng)，溫度為28"C。經(jīng)7天培養(yǎng)，用新鮮的液體培養(yǎng)基更換瓶中1/3體積的培養(yǎng)液。以后每隔7天，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)瓶中2/3體積的培養(yǎng)液。更換兩次培養(yǎng)液后，愈傷組織已離散到培養(yǎng)液中分散成單細(xì)胞或小顆粒，并快速生長。經(jīng)過28天左右即可建成淡黃色、生長旺盛、單細(xì)胞與小細(xì)胞團均勻混合的喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系。二、微生物對懸浮培養(yǎng)喜樹細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化A、喜樹細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及微生物的接種稱取50g繼代培養(yǎng)10天的喜樹細(xì)胞為"種子"，分裝于內(nèi)裝500ml培養(yǎng)液的11氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器中，上述(l.B項)條件下喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)20天，接種1%的無毒黃曲霉Cr-l菌株(Aspergillus.flavus)，相距48小時后接種1.2°/。的根霉T-34菌株(Rhizopussp.)。B.微生物的轉(zhuǎn)化條件初始PH值為6.0，溫度為28°C，在接種根霉T-34菌株(Rhizopussp.)后再轉(zhuǎn)化72小時。C、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲-喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，60°C烘干至恒重，磨成粗粉，備用。三、羥喜樹堿的分離與純化A.羥喜樹堿的提取稱取80g喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物粗粉，裝入濾紙筒中，封好，將其放入500ml索氏提取器中，用200ml92。/。乙醇、在90。C水浴下回流提取6小時，收集提取液，備用。B.濃縮、析晶提取液經(jīng)減壓濃縮至1/15體積，趁熱過濾，靜置過夜，析晶后過濾，取晶體備用；濾液再真空揮干溶劑，以少量熱乙醇溶解，靜置過夜，析晶；合并晶體以適量熱乙醇溶解，靜置過夜，重結(jié)品。結(jié)晶體用20ml甲醇:三氯甲烷二1:5(V/V)的溶劑溶解，得到含有羥喜樹堿的溶液，C.硅膠柱對結(jié)晶溶液的再分離將產(chǎn)于青島海洋化工廠的硅膠G800g裝入4)40X800的玻璃柱中，用三氯甲烷浸透硅膠柱。將所得結(jié)晶體溶液加硅膠柱中，分別以三氯甲烷、甲醇三氯甲烷二O.3:100(V/V)、甲醇三氯甲垸-l.3:100(V/V)依次梯度洗脫，流速5ml/min，收集甲醇三氯甲烷二l.3:100(V/V)洗脫液。D.對洗脫液的再結(jié)晶洗脫液減壓濃縮回收溶劑至干，分別以適量無水乙醇和甲醇三氯甲烷二O.1:100(V/V)兩種溶液結(jié)晶，其中甲醇:三氯甲烷-O.1:100(V/V)溶液的結(jié)晶為羥喜樹堿純品，經(jīng)干燥稱重后避光保存?zhèn)溆?。羥喜樹堿收率為細(xì)胞干重的0.42%(g/g)。四、羥喜樹堿的含量檢測用高效液相色譜法檢測羥喜樹堿的含量。液相色譜分析采用WATERS高效液相色譜儀，色譜柱YWM-C18(10)200X4.6mm(大連化物所出品)，用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(60:40)為流動相；檢測波長為266nra。理論板數(shù)按羥喜l^堿峰計算應(yīng)不少于3000。測定時避光操作。取本品約20mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為溶液(l)，精密量取2ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液。另取在105'C干燥至恒重的羥喜樹堿對照品約20nig，精密稱定，同法操作，作為對照品溶液。分別精密量取供試品溶液與對照品溶液各20nl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。羥喜樹堿的含量為98.6°/。(g/g)。五、羥喜樹堿的體外抗腫瘤活性檢測；采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法試驗。收集生長良好的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基配制成1X104/ml細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔lOOy1(含1000個腫瘤細(xì)胞)，置于37'C，5%(302溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時后加入受試的化合物，試驗以轉(zhuǎn)化羥喜樹堿為試驗組，天然羥喜樹堿和羥喜樹堿注射液為對照品(均按純化合物計算給藥量)，受試樣品均設(shè)4個濃度，每個濃度3個平行孔，置37r，5%(202溫箱內(nèi)培養(yǎng)2天。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/mL，PRMI1640配制)IOOtt1，37。C孵育4小時，棄去上清液，每孔加入二甲基亞礬(DMSO)25uI，溶解甲攢顆粒，輕度振蕩后，用550型酶標(biāo)儀在檢測波長540nm，參考波長405nm下測定光吸收值，計算出化合物對細(xì)胞的抑制率。以藥物的不同濃度及對細(xì)胞的抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(ICso)。試驗結(jié)果顯示各組對所有的癌細(xì)胞都有較強的細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)化羥喜樹堿與天然羥喜樹堿的細(xì)胞毒性作用相當(dāng)，對六種癌細(xì)胞的ICs。值達(dá)到了nmol丄—1(10—9mol'L—^級，二者均優(yōu)于羥喜樹堿注射液，可能是因為羥喜樹堿注射液中的羥喜樹堿開環(huán)后形成鈉鹽所致。結(jié)果見表l:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>IC5。半數(shù)抑制濃度；KB:人口腔癌細(xì)胞；A549:人肺腺癌細(xì)胞；HCT-8:人結(jié)腸癌細(xì)胞；KB/VCR:人耐藥口腔癌細(xì)胞；Bel7402:人肝癌細(xì)胞；A2780:人卵巢癌細(xì)胞。權(quán)利要求1.羥喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，以喜樹的幼莖為外植體，將在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)、并繼代的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，再接種微生物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化；然后經(jīng)提取、析晶、柱層析、結(jié)晶等方法分離純化經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中羥喜樹堿，步驟如下一、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)系的建立A、喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)是在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，光照8-10小時/天，培養(yǎng)溫度為20～35℃，培養(yǎng)3～10天，喜樹愈傷組織每隔3～15天繼代一次，繼代3～10次。作為誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的固體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了1.0～1.5mg/l6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l2，4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂6g/l，pH為5.5～6.5；B、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)懸浮系建立將A步培養(yǎng)好的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入通氣量為0.1～0.5l/min的氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器中培養(yǎng)，溫度為20～35℃，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)每隔3～15天繼代一次；進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加1.0～1.5mg/l6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l2，4-二氯苯氧乙酸，pH為5.5～6.5；喜樹細(xì)胞培養(yǎng)周期為5～25天；二、微生物對懸浮培養(yǎng)喜樹細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化A.喜樹細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及微生物的接種無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopussp.)的接種于喜樹細(xì)胞培養(yǎng)期的第5～25天接種1％～2％的無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距1～100小時后接種1％～2％的根霉T-34菌株(Rhizopussp.)；B.微生物的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件初始PH值為5.5～6.5，溫度為25～35℃，在接種根霉T-34菌株(Rhizopussp.)后再培養(yǎng)轉(zhuǎn)化1～240小時；C、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，備用；三、羥喜樹堿的分離與純化A.經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中羥喜樹堿的提取以乙醇為提取液，采用連續(xù)回流提取，在80～95℃水浴中，提取喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物粉末內(nèi)的羥喜樹堿，得到含有羥喜樹堿的提取液；B.濃縮、析晶提取液經(jīng)減壓濃縮至1/15體積，趁熱過濾，靜置放冷，析晶后過濾，晶體備用；濾液真空揮干溶劑，以少量熱乙醇溶解，靜置放冷，析晶；合并晶體以熱乙醇重結(jié)晶，結(jié)晶體用甲醇∶三氯甲烷＝1∶5(V/V)的溶劑溶解，得到含有羥喜樹堿的溶液；C.硅膠柱對結(jié)晶溶液的再分離硅膠柱分別以三氯甲烷、甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100(V/V)、甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)依次梯度洗脫，收集甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)洗脫液，得到含有羥喜樹堿的洗脫液；D.對洗脫液的再結(jié)晶減壓回收溶劑至干，分別以無水乙醇和甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)兩種溶液結(jié)晶，其中甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)溶液結(jié)晶得到羥喜樹堿純品。全文摘要本發(fā)明屬于生物
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，具體涉及一種羥喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化制備方法，本發(fā)明利用無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopussp.)對懸浮培養(yǎng)的喜樹細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化后的喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過原料粉碎、回流提取、析晶、硅膠柱層析、結(jié)晶等分離和精制，從而得到羥喜樹堿純品。本發(fā)明是利用微生物對懸浮培養(yǎng)的喜樹細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲取具有抗腫瘤活性的植物次生代謝產(chǎn)物羥喜樹堿，其含量達(dá)到了細(xì)胞干重的0.4％(g/g)；建立了獲得羥喜樹堿高產(chǎn)的新途徑，符合可持續(xù)發(fā)展的要求；分離羥喜樹堿的方法簡便易行，產(chǎn)品的純度高，有很好的發(fā)展前景。文檔編號C12R1/67GK101509023SQ20091001074公開日2009年8月19日申請日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者波姜,張涓涓,靜畢,王賀雙,爽郝,華高申請人:大連理工大學(xué)