專利名稱：有機-無機雜化整體材料及其在固定化酶反應器中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及整體材料固定化酶反應器，具體地說是一種可再生型的有機-無機雜 化整體材料固定化酶反應器，具有較好的可再生性及較高的酶活性。
背景技術：
酶的固定化是指通過吸附、包埋、交聯(lián)、共價接合等方法使目標酶分子固定于特定 的載體上而發(fā)揮酶的生物催化作用。與自由溶液中的酶催化反應相比，固定化酶具有更高 的酶/底物比、更快的酶解速率等優(yōu)點。所以，固定化酶反應器技術近年來得到了許多研究 人員的廣泛關注(Svec, F. Electrophoresis 2006，27，947-961 & Ma, J. F. ；Zhang, L. H.； et al.，Anal. Chem. Acta. 2009，632，1-8)。固定化酶的性能與載體材料和固定化方法密切相關。目前已有多種載體材料用于 酶的固定化，主要有毛細管內壁(Stigter，E. C. A. ；de Jong, G. J. ；et al.，Anal. Chim. acta 2008，619，231-238)、顆粒材料(Li，Y. ；Zhang, X. M. ；et al. , Proteomics 2007,7, 2330-2339)和整體材料(Duan, J. C. ；Zhang, L. H. ；et al.，J. Chromatogr.，A 2006，1106， 65-174 & Ma, J. F. ；Zhang, L. H. ；et al.，Anal. Chem. 2008，80，2948-2956)等。多孔整體材 料是近年發(fā)展起來的一種新型的色譜分離介質。通過優(yōu)化合成條件，可以制備得到同時具 有大的通孔和小的擴散孔的多孔結構整體材料載體，因此具有較好的通透性、較低的反壓。 對于基于整體材料的固定化酶反應器而言，傳質速率得以顯著提高，可以大大加快酶反應 的速率。除了載體材料外，固定化方法也對固定化酶的性質有較大影響。酶固定化主要采用 的方法有共價鍵合法(Ma, J. F. ；Zhang, L. H. ；et al.，Anal. Chem. 2008，80，2948-2956)和 金屬離子螯合法(Guo，Z. ；Xu，S.Y. ；et al. , Electrophoresis, 2003, 24, 3633-3639 & Li, Y. ；Zhang X. M. ；et al. , J. Proteome Res. 2007，6，2367-2375)。共價鍵合型酶反應器經過 多次使用后，固定化酶的活性可能顯著下降。然而由于共價鍵的穩(wěn)定性，故很難對這類酶反 應器進行再生。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種有機_無機雜化多孔整體材料及其在固定化酶反應 器中的應用，制備的酶反應器是基于金屬離子螯合作用的可再生型整體材料固定化酶反應 器，其具有較好的可再生性，且通透性好、反壓小、酶活性高。為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種有機_無機雜化硅膠整體材料，可按如下過程制備獲得1)將2-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GLYM0)與含有N、S或0原子的金屬離子 螯合基團的試劑在水浴中進行反應，制備得到溶液A ；其特征在于所述GLYM0與帶有螯合 官能團的試劑的摩爾比為1/1-1/6 ；反應溫度為20 100°C ；反應時間為6 48小時；所 述帶有螯合官能團的試劑為亞氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝腦三乙酸或羧甲基天冬氨 酸；
2)將四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷、甲醇或乙醇、鹽酸和H20混合物于水浴中反 應，形成溶液B ；其特征在于TE0S或TM0S和水的體積比為8/1—1/1 ；TE0S或TM0S與水的 體積之和與HC1的體積比為30/1—150/1 ；所用HC1的摩爾濃度l—2000mM ；TE0S或TM0S 與水的體積之和與甲醇或乙醇的體積比為10/1-1/1 ；反應溫度為20 80°C ；反應時間為 0. 5 8小時；3)將溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨及催化劑辛胺，經 由溶膠凝膠法制備得到一種表面帶有金屬離子螯合基團的整體材料載體；其具體過程為 所述溶液A與溶液B的體積之比為3/1-1/3 ；模板分子的質量mg與溶液A和溶液B的體 積之和P L之比為1/50-1/20 ；催化劑的體積P L與溶液A和溶液B的體積之和y L之比 為1/200-1/40 ；溶膠-凝膠法聚合反應溫度為20°C 80°C，聚合時間為12 48小時。有機-無機雜化硅膠整體材料在固定化酶反應器中的應用，其具體過程為 1)用過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+對有機-無機雜化整體材料進行活化，活 化過程為采用含有20-200mM過渡金屬離子溶液沖洗整體材料，在室溫下沖洗0. 1-6小 時。2)再將酶溶液通過活化后的整體材料載體，即可制備得到固定化酶反應器；酶的 固定化過程為將含有l(wèi)-10mg/mL酶的磷水溶液連續(xù)通過整體材料，在4-25°C下反應 0. 1—12 小時。3.所述的固定化酶反應器進行使用或放置，酶反應器的活性降低后，采用乙二胺 四乙酸二鈉(EDTA)溶液沖洗酶反應器，而后按所述步驟2進行重新操作處理，即可實現酶 反應器的再生。本發(fā)明的優(yōu)點為本發(fā)明先制備得到一種表面帶有金屬離子螯合基團的硅膠整體 材料載體，對載體表面用金屬離子進行活化后即可用于酶的固定。其制備方法簡便，成本 低；制備獲得的酶反應器具有較好的再生性，且通透性好，反壓小，有較高的酶活性。


圖1為按表1的實例序號5、表2的序號4、表3的序號9和表4的序號5，酶解產 物進行P HPLC-MS/MS分析得到的基峰色譜圖；圖2為將0. 1 i! g/ i! L的牛血清白蛋白以恒定的流速0. 3 u L/min通過再生前后酶 反應器，酶解產物進行P HPLC-MS/MS分析得到的基峰色譜圖。
具體實施例方式按照如下步驟制備可再生型的整體材料固定化酶反應器。1.整體材料載體的制備，具體過程為1)將2-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GLYM0)與含有N、S或0原子的金屬離子 螯合基團的試劑在水浴中進行反應，制備得到溶液A。合成實例具體參數如下表1所示。2)將四乙氧基硅烷(TE0S)或四甲氧基硅烷(TM0S)、甲醇或乙醇、鹽酸和H20混合 物于水浴中反應，形成溶液B。合成實例具體參數如下表2所示。3)將溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)及催化劑 辛胺，經由溶膠凝膠法制備得到一種表面帶有金屬離子螯合基團的整體材料載體。合成實例具體參數如下表3所示。
表1.溶液A的制備實例。 表2.溶液B的制備實例。
表3.有機_無機雜化硅膠整體材料載體的合成實例。 按照上表所示比例制備得到有機_無機雜化硅膠整體材料載體后，先后用無水乙 醇和水沖洗掉模板分子，再經活化后即可用于酶的固定化。2.載體的活化及酶的固定化，具體過程為1)用過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+對有機-無機雜化整體材料進行活化； 具體參數如下表4所示。2)將酶溶液通過活化后的整體材料載體，即可制備得到固定化酶反應器；具體參 數如下表4所示。表4.整體材料的活化及酶的固定化參數。 具體應用將0. 1 ii g/ ii L的肌紅蛋白以恒定的流速0. 3 u L/min通過酶反應器(按表1的實 例序號5、表2的序號4、表3的序號9和表4的序號5)，收集酶解產物而后進行P HPLC-MS/ MS分析，得到的基峰色譜圖如圖1所示。實驗條件為酶反應器100-iimi.d. X3cm;流速0. 3iiL/min ；溫度37°C ； HPLC-MS/MS 條件分離柱300 ii m i. d. X 5cm,填料0DS，5 u , 300 A；流動相(A) 2 % ACN(含 0. formic acid)，(B) 98% ACN(含 0. 1 % formic acid)；流速5 ii L/min ；梯度: 0min,2% B ； 10min,2% B ；85min,40% B ；95min,80% B ； 100min,80% B ；進樣量2y L ；MS conditions 電壓3kV，加熱毛細管溫度150°C，碰撞能35% .)由圖1可以看出，當200ng肌紅蛋白經酶反應器50秒后即得以完全酶解，這說明 本發(fā)明所制備的酶反應器可以對蛋白進行高效、快速的酶解。3.固定化酶反應器的再生，用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液沖洗固定化酶反應 器(具體參數如下表5所示)，而后按所述步驟2 (表4的序號5)進行整體材料載體的活化 和蛋白酶的固定化。表5.酶反應器再生過程中EDTA處理參數。
具體應用將0. 1 ii g/ ii L的牛血清白蛋白以恒定的流速0. 3 u L/min通過再生前后酶反應器，收集酶解產物而后進行PHPLC-MS/MS分析，得到的基峰色譜圖如圖2(a)和(b)所示。實驗條件為酶反應器100-iimi.d. X3cm;流速0. 3iiL/min ；溫度37°C ； HPLC-MS/MS 條件分離柱300 u m i. d. X 5cm,填料0DS，5 u , 300 A；流動相(A) 2 % ACN(含 0. formic acid)，(B) 98% ACN(含 0. 1 % formic acid)；流速5 ii L/min ；梯度: 0min,2% B ； 10min,2% B ；85min,40% B ；95min,80% B ； 100min,80% B ；進樣量2y L ；MS conditions 電壓3kV，加熱毛細管溫度150°C，碰撞能35% .)由圖2可以看出，當200ng牛血清白蛋白經酶反應器50秒后酶解后產物的峰形較 為相似且蛋白質都得以完全酶解，說明本發(fā)明所制備的酶反應器有較好的可再生性。
權利要求
一種有機-無機雜化硅膠整體材料，其特征在于其為一種表面帶有金屬離子螯合基團的整體材料載體，可按如下過程制備獲得1)將2-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷與含有N、S或O原子的金屬離子螯合基團的試劑在水浴中進行反應，制備得到溶液A；其特征在于所述GLYMO與帶有螯合官能團的試劑的摩爾比為1/1--1/6；反應溫度為20～100℃；反應時間為6～48小時；所述帶有螯合官能團的試劑為亞氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝腦三乙酸或羧甲基天冬氨酸；2)將四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷、甲醇或乙醇、鹽酸和H2O混合物于水浴中反應，形成溶液B；其特征在于TEOS或TMOS和水的體積比為8/1--1/1；TEOS或TMOS與水的體積之和與HCl的體積比為30/1--150/1；所用HCl的摩爾濃度1--2000mM；TEOS或TMOS與水的體積之和與甲醇或乙醇的體積比為10/1-1/1；反應溫度為20～80℃；反應時間為0.5～8小時；3)將所述溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨及催化劑辛胺，經由溶膠凝膠法制備得到一種表面帶有金屬離子螯合基團的整體材料載體；其特征在于所述溶液A與溶液B的體積之比為3/1--1/3；模板分子的質量mg與溶液A和溶液B的體積之和μL之比為1/50-1/20；催化劑的體積μL與溶液A和溶液B的體積之和μL之比為1/200-1/40；溶膠-凝膠法聚合反應溫度為20℃～80℃，聚合時間為12～48小時。
2.—種權利要求1所述有機-無機雜化硅膠整體材料在固定化酶反應器中的應用，其 特征在于所述有機_無機雜化整體材料用于制備可再生型的整體材料固定化酶反應器， 其具體過程為1)用過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+對有機-無機雜化整體材料進行活化，活化過 程為采用含有20-200mM過渡金屬離子溶液沖洗整體材料，在室溫下沖洗0. 1-6小時；2)再將酶溶液通過活化后的整體材料載體，即可制備得到固定化酶反應器；酶的固定 化過程為將含有1—lOmg/mL酶的磷水溶液連續(xù)通過整體材料，在4—25°C下反應0. 1—12 小時；固定化的酶為蛋白質水解酶。
3.按照權利要求2所述的應用，其特征在于所述蛋白質水解酶為胰蛋白酶、V8蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶。
4.按照權利要求2所述的應用，其特征在于所述固定化酶反應器進行使用或放置，酶 反應器的活性降低后，采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液沖洗酶反應器，而后按所述步驟 2)進行重新操作處理，即可實現酶反應器的再生。
5.按照權利要求4所述的應用，其特征在于采用乙二胺四乙酸二鈉溶液沖洗酶反應 器的過程為用20-200mM乙二胺四乙酸二鈉溶液連續(xù)通過酶反應器，在4-25°C下沖洗 0. 1—6小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及整體材料固定化酶反應器，具體地說是一種有機-無機雜化整體材料及其在固定化酶反應器中的應用，以四甲氧或四乙氧基硅烷、2-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷為前體分子，以亞氨基二乙酸為金屬離子螯合劑，以十六烷基三甲基溴化氨為模板分子，以辛胺為催化劑，經由溶膠凝膠法制備得到一種表面帶有金屬離子螯合基團的整體材料載體，再先后連續(xù)通過過渡金屬離子溶液及酶溶液，即可制備得到可再生型的整體材料固定化酶反應器。本發(fā)明的優(yōu)點為具有較好的可再生性，可反復使用，且制備方法簡便，酶反應器的活性高、通透性好、反壓小、機械強度好。
文檔編號C12N11/00GK101845430SQ20091001087
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權日2009年3月25日
發(fā)明者張麗華, 張玉奎, 張維冰, 梁振, 馬俊鋒 申請人:中國科學院大連化學物理研究所