專利名稱：大白菜核不育復(fù)等位基因Ms的SCAR標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與大白菜核不育復(fù)等位基因Afe緊密連鎖的特征序列擴(kuò)增(Sequence Characterized Amplified Region, SCAR )標(biāo)記及其獲得方法。
背景技術(shù)：
1991年，本課題組獲得了4份具有100%不育株率的雄性不育材料，研究發(fā)現(xiàn)該不育材 料的不育性屬于復(fù)等位基因遺傳，隨后提出了"大白菜核基因雄性不育復(fù)等位基因遺傳假 說"，并為后來的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。研究表明，此不育性由一個(gè)位點(diǎn)3個(gè)基因控制"M^"為顯 性不育基因；"ms"為"Ms"的等位隱性可育基因；"M/"為"My"的等位顯性恢復(fù)基因，三者 之間的顯隱關(guān)系為M/〉M^m^。配成不育系的"兩用系"不育株基因型為"MsM "，可育株 為"M/M^"。"臨時(shí)保持系"基因型為"船ms"。用"兩用系"不育株(MyMy)與臨時(shí)保持系 (wwto )交配，可以獲得具有100%不育株率的雄性不育系(il^Msxmsws—Mww)。
由于該類不育材料特殊的遺傳機(jī)制，在不育系轉(zhuǎn)育過程中，每代都需要采用測(cè)交的方 法鑒定中間材料的基因型，等到下一代開花后，才能獲知上一代選定材料的基因型，這樣 勢(shì)必影響轉(zhuǎn)育進(jìn)程，因此新不育系轉(zhuǎn)育難的問題還沒有徹底解決。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù) (MAS)可能是最終解決這一問題的有效途徑。
目前，只有國(guó)內(nèi)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)馮輝等(2009)獲得了兩個(gè)與大白菜核不育復(fù)等位基因 My連鎖的SSR標(biāo)記。但這兩個(gè)標(biāo)記位于目標(biāo)基因的同一側(cè)，遺傳距離較遠(yuǎn)，且檢測(cè)方法復(fù) 雜，因此無法應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種當(dāng)中。而SCAR標(biāo)記具有穩(wěn)定、廉價(jià)、方法簡(jiǎn)便等 優(yōu)點(diǎn)。目前已有大量SCAR標(biāo)記應(yīng)用在輔助選擇當(dāng)中。因此，我們有必要開發(fā)與大白菜核 不育復(fù)等位基因Ms緊密連鎖的SCAR標(biāo)記，從而簡(jiǎn)化具有100%雄性不育株率的大白菜雄 性不育系的轉(zhuǎn)育程序。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是(1)提供大白菜核不育復(fù)等位基因V^的兩個(gè)SCAR標(biāo)記；
(2) 提供由所述SCAR標(biāo)記的PCR引物序列；
(3) 提供在對(duì)大白菜核不育復(fù)等位基因進(jìn)行輔助選擇的過程中對(duì)上述SCAR標(biāo)記進(jìn)行應(yīng)用的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
1.位于大白菜核不育復(fù)等位基因Afe兩側(cè)，并與其緊密連鎖的SCAR標(biāo)記SCR(H-378與 SCRo2-208分別具有如下核苷酸序列 (1) SCR。i-378:
TGAGGTTCTCCCTCCAGCTTTGGGAAGTAATGTGGTGGAA-3' (2) SCRq2-208
TGTGGTTGGAGACTCAGACATACGCCACTATTGATG-3，
2. 上述SCAR標(biāo)記SCRor378與SCRo2-208的特異性擴(kuò)增引物分別具有如下序列
(1) SCRo廣378:
FSCRm: 5'-GCAAATTTGTCAAACTTCACC -3， SSCRoi: 5' -TCCACCACATTACTTCCCAA-3'
(2) SCRo2-208
FSCR02: 5，-AGGATATATCTTGGCTCACGAG-3' RSCRo2: 5 ，-CATCAATAGTGGCGTATGTCTG-3'
3. 上述SCAR標(biāo)記SCRoi-378與SCRo2-208在輔助選擇中的應(yīng)用方法為
(1) 用CTAB法對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行基因組DNA的提取
(2) PCR擴(kuò)增
a.反應(yīng)體系25uL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為20ng template; 2.5uL 10xBuffer;1.6mM MgCl2; 0.15mmol/L dNTP; 5pmo1 primer; 1.25U Tag DNA polymerase; ddH20補(bǔ)齊 25uL，混勻，離心；
b.擴(kuò)增程序預(yù)變性94。C/4min， 94°C/60s、 59°C/60s、 72°C/90s， 30個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸10min;
C.電^C:
① SCRoi-378:取10uL擴(kuò)增產(chǎn)物與2uL的6xLoadingbuffer混勻，點(diǎn)入含有0.5ug/ml EB 的1.5%瓊脂糖凝膠中，在110V電壓下電泳lh，經(jīng)EB染色后在凝膠成像儀中觀察拍照。
② SCRo2-208:將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合(98% formamide, 10 mM EDTA, 0.001% xylene cyanol禾口bromphenol blue)。 94。C變性5min，之后在DNA測(cè)序電 泳儀上進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(6%)電泳，85W條件下電泳3小時(shí)。電泳結(jié)束后，使用 由Bioneer公司生產(chǎn)的銀染試劑盒進(jìn)行銀染。
d.判斷
① 在使用SCR(u-378的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)到378bp條帶，則該材料帶有大白菜核 不育復(fù)等位基因My的概率為98.8n/o;
② 在使用SCRo2-208的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)到兩條帶(208bp和204bp)，則該材料 帶有大白菜核不育復(fù)等位基因Ms的概率為97.5M。
◎如果①、②兩項(xiàng)中的擴(kuò)增結(jié)果均可獲得，則待測(cè)材料具有大白菜核不育復(fù)等位基 因My的概率為100。/。。 三、有益效果
上述SCAR標(biāo)記SCR(u-378與SCRo2-208距離大白菜核不育復(fù)等位基因Ms的遺傳距離 分別為L(zhǎng)2cM和2.5cM，可廣泛應(yīng)用于大白菜核不育復(fù)等位基因Ms的分子標(biāo)記輔助選擇育 種。本發(fā)明通過特異引物PCR擴(kuò)增可對(duì)待測(cè)植株進(jìn)行苗期鑒定，大大提高了育種效率，縮 短了育種進(jìn)程。


圖l: SCRor378在親本及部分Bd代個(gè)體上的擴(kuò)增結(jié)果 圖2: SCRo2-208在親本及部分Bd代個(gè)體上的擴(kuò)增結(jié)果 圖l、 2中符號(hào)分別表示為 Pf:可育親本S02;Ps:不育親本AB01-1;
Bf: Bd代群體中可育單株； Bs: Bd代群體中不育單株；
*: Bd代群體中在大白菜核不育復(fù)等位基因位點(diǎn)和SCAR標(biāo)記間發(fā)生交換的單株；
M: DL2000 DNA ladder
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、與大白菜核不育復(fù)等位基因M5連鎖的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)(AFLP)標(biāo)記的
獲得
一、 分離群體的構(gòu)建
以AB01-1 (MsMs)作為母本與S02 (msms)雜交，所獲Fi代植株全部表現(xiàn)為不育。 之后以S02為輪回親本，構(gòu)建Bd代分離群體。在播種的全部244株Bd代個(gè)體中，130株為 可育，114株表現(xiàn)為不育。育性分離比例符合復(fù)等位基因遺傳的1:1(5C^0.922;A.。5，產(chǎn)3.84)。
二、 DNA的提取
a. 在1.5ml離心管中加入500uL 1XCTAB提取液(2% CTAB, 10Ommol/L Tris-HCl， 20mmol/LEDTA， 1.4mol/LNaCl，)以及6uL P-巰基乙醇，搖勻；
b. 取0.2g幼嫩葉片，在液氮條件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和e-巰基乙醇 的離心管中，搖勻；
c. 隨后將離心管放入65'C水浴中，每隔5分鐘搖一次，水浴30min;
d. 取出離心管，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇混合物(25:24:1)，搖晃10min后，常溫下 12000r/min離心10min;
e. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1),搖晃10min后，常 溫下12000r/min離心1 Omin;
f. 將上清液移至另一離心管當(dāng)中，加入2倍體積事先預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，將抱團(tuán)的 DNA挑入到裝有400uLTE緩沖液的離心管中溶解；
g. 加入1.5uLRNaseA (10ug/uL)，混勻后37。C保存30min;
h. 重復(fù)步驟e;
i. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，向離心管中加入50uL3mol/LNaAC溶液和預(yù)冷的等體 積的異丙醇，-2(TC沉淀20min;j. 4。C條件下12000r/m離心10min，棄掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次； k.將DNA晾干后，用TE緩沖液溶解保存。
三、 優(yōu)化后的AFLP體系
a. 在25uL體系(0.25U尸Wl，0.25UAfee1,500ngDNA， 2.5uL10X酶切緩沖液，ddH20補(bǔ)齊 至25uL)中對(duì)大白菜基因組DNA進(jìn)行尸WI/Mwl限制性內(nèi)切酶雙酶切，37°C 8小時(shí)；
b. 在75。C條件下將兩種內(nèi)切酶失活后，在50uL體系(Mse-接頭luL 50pmoD , PW-接頭 luL (50pmol), T4 DNA Ligase 1U, Buffer (10X) 5uL,酶切反應(yīng)液25uL, ddH20補(bǔ)齊 50uL進(jìn)行接頭的連接，37r反應(yīng)3小時(shí)；
c. 取5uL酶切/連接混合液稀釋10倍后，作為模版進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系/M和MwI 預(yù)擴(kuò)增引物各0.9uL, 2.5 mM dNTP 5uL; 10XBuffer (MgCl2) 5uL, Taq酶1U，酶切/連 接混合稀釋液5uL， ddH2O補(bǔ)齊50uL;反應(yīng)程序94°C 5min; 94°C 30 sec, 56°C 60 sec, 72 °C 60 sec, 29個(gè)循環(huán)；72。C 5min; 4。C保存；
d. 將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后，作為模版進(jìn)行選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)UOxPCR Buffer
(MgCl2) 2uL, 2.5 mM dNTP 1.6 uL， 30 ng Msel+C麗，15 ng M+G麗，0.4UTag DNA聚合酶，ddH20補(bǔ)齊25uL〉;反應(yīng)程序94。C 5min; 94°C 30sec, 65°C 30 sec (每 個(gè)循環(huán)降0.8。C), 72°C 60sec， 13個(gè)循環(huán)；94°C 30sec, 56°C 30sec，72。C 60sec, 33個(gè)循 環(huán)72'C 5min; 4'C保存；
e. 電泳將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合(98%formamide, lOmMEDTA, 0.001% xylene cyanol禾口bromphenol bue)。 94。C變性5min，之后在DNA測(cè)序電泳儀上 進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(6%)電泳，85W條件下電泳3小時(shí)。電泳結(jié)束后，使用由 Bioneer公司生產(chǎn)的銀染試劑盒進(jìn)行銀染。
四、 多態(tài)性AFLP引物組合的篩選
使用BSA法，對(duì)256對(duì)AFLP引物組合(16尸M+GNNx16 Msd+CNN)進(jìn)行多態(tài)性篩選。 除尸WI+GTA和尸M+GGG所涉及的32個(gè)引物組合未擴(kuò)增出任何條帶以夕卜，其余224個(gè)引物組 合每個(gè)組合平均擴(kuò)增出42個(gè)片段。在雙親間可擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的組合占總數(shù)的15%。在 雙親間探測(cè)到的2288個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，有18個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與兩個(gè)基因池間一致。在Bd 個(gè)體驗(yàn)證中，P01與P04表現(xiàn)出與目標(biāo)基因具有穩(wěn)定的連鎖關(guān)系。
實(shí)施例2、與大白菜核不育復(fù)等位基因連鎖的SCAR標(biāo)記的獲得和鑒定一、SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化
將P01與P04的DNA片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖純化，純化后的DNA片段與PGEM-T easy Vector (Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得的陽性克隆子 送Sangon測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果與GenBank國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源分析，沒有査詢到 相關(guān)的基因序列與該片段高度同源。兩個(gè)SCAR標(biāo)記的序列分別為
(1) SCRoi-378:
TGAGGTTCTCCCTCCAGCTTTGGGAAGTAATGTGGTGGAA-3， (2) SCRo2-208
TGTGGTTGGAGACTCAGACATACGCCACTATTGATG-3'
根據(jù)上述兩段序列分別設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物，并命名為FSCRm/RSCRo與 FSCRQ2/RSCRo2，序列如下
(1) SCRoi-378:
FSCR(m: 5'-GCAAATTTGTCAAACTTCACC -3' SSCRoi: 5， -TCCACCACATTACTTCCCAA-3'
(2) SCRo2-208
FSCR02: 5 ， -AGGATATATCTTGGCTCACGAG-3' RSCRo2: 5，-CATCAATAGTGGCGTATGTCTG隱3' 二、 SCAR標(biāo)記的鑒定
為了驗(yàn)證該SCAR標(biāo)記的可靠性，我們對(duì)雙親及其Bd代個(gè)體進(jìn)行了擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明，使用SCRm-378的引物FSCR(n/RSCR(n進(jìn)行擴(kuò)增，在不育親本AB01-l和不育Bd代 個(gè)體上均能擴(kuò)增出一條378bp的條帶，而在可育親本S02和BQ代個(gè)體上卻沒有擴(kuò)增產(chǎn)物； 使用SCRo2-208的引物FSCRo2/RSCR()2進(jìn)行擴(kuò)增，在可育親本S02和可育Bd代個(gè)體上只能 擴(kuò)增出208bp的條帶，而在不育親本和不育Bd代個(gè)體上則可以同時(shí)擴(kuò)增出兩條帶，成度 分別為204bp和208bp。
實(shí)施例3、兩個(gè)SCAR標(biāo)記在對(duì)帶有大白菜核不育復(fù)等位基因^^的輔助選擇中的應(yīng)用
(1) 按實(shí)施例l中的方法對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行基因組DNA的提取
(2) PCR擴(kuò)增
a. 反應(yīng)體系25uL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為20ng template; 2.5uL 10xBuffer; 1.6mM MgCl2; 0.15mmol/L dNTP; 5pmo1 primer; 1.25U Tag DNA polymerase; ddH20補(bǔ)齊 25uL，混勻，離心；
b. 擴(kuò)增程序預(yù)變性94。C/4min， 94°C/60s、 59°C/60s、 72°C/90s， 30個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸10min;
C.電泳
① SCRoi-378:取10uL擴(kuò)增產(chǎn)物與2uL的6xLoadingbuffer混勻，點(diǎn)入含有0.5ug/ml EB 的1.5%瓊脂糖凝膠中，在110V電壓下電泳lh,經(jīng)EB染色后在凝膠成像儀中觀察拍照。
② SCRo2-208:將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合(98% formamide, 10 mMEDTA, 0.001% xylene cyanol和bromphenol blue)。 94。C變性5min，之后在DNA測(cè)序電 泳儀上進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(6%)電泳，85W條件下電泳3小時(shí)。電泳結(jié)束后，使用 由Bioneer公司生產(chǎn)的銀染試劑盒進(jìn)行銀染。
d.結(jié)果分析
① 在使用SCR(H-378的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)到378bp條帶，則該材料帶有大白菜核 不育復(fù)等位基因Ms的概率為98.8M;
② 在使用SCR。2-208的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)到兩條帶(208bp和204bp)，則該材料 帶有大白菜核不育復(fù)等位基因^9的概率為97.5%。如同時(shí)使用兩個(gè)標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增，
③ 如果①、②兩項(xiàng)中的擴(kuò)增結(jié)果均可獲得，則待測(cè)材料具有大白菜核不育復(fù)等位基 因My的概率為100n/。。
權(quán)利要求
1.位于大白菜核不育復(fù)等位基因Ms兩側(cè)，并與其緊密連鎖的SCAR標(biāo)記SCR01-378與SCR02-208，其特征在于，這兩個(gè)SCAR標(biāo)記分別具有如下核苷酸序列(1)SCR01-3785’-GCAAATTTGTCAAACTTCACCCTTGTACGGAAAAATGTTTGCGGCTTGACGTGGCTCGAGTTTCTCCAGAAGCCACTGGTGGAGAGGATCAGCTTCGCGGATAAGGATGGTGTGCAAGTGGTGATTGATGTATGCTACCCCTGGTTGCCTCCGAGATGCAATATTTGCAATGCTTGGGGCCACAAGGGAGAGGCATGTAATTCGAGGAAGATTAAGGTTCTGCAAAAGGACAAGGAGATAGTAGTAGTGGCCCCGGAAGTTGAGATTAACGGTGATGGGCAGGTGAGGTATGCGATCACCCCAAACCGAAATGTTGTTAGTGATTTGCTCCACGAGCTTGAGGTTCTCCCTCCAGCTTTGGGAAGTAATGTGGTGGAA-3’(2)SCR02-2085’-AGGATATATCTTGGCTCACGAGATGATGCATGCTTATCTTAGACTCAATGGTACGTATTGGATTATTTGATCATCACTCTGAGGGAGAGGTCTCTCAAGTGTGTTTTGGTTACAGGATGTAGGAATCTGAACACCGTTATGGAAGAAGGAATATGCCAAGTGCTAGGCCACATGTGGTTGGAGACTCAGACATACGCCACTATTGATG-3’
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的位于大白菜核不育復(fù)等位基因Ms兩側(cè)，并與其緊密連鎖的 SCAR標(biāo)記SCRoi-378與SCRo2-208的PCR特異性擴(kuò)增引物，其特征在于，兩對(duì)特異性擴(kuò)增 引物分別具有如下序列(1) SCRoi-378:FSCR。i: 5'-GCAAATTTGTCAAACTTCACC -3' SSCRoi: 5' -TCCACCACATTACTTCCCAA -3'(2) SCRo2-208FSCRo2: 5 ，-AGGATATATCTTGGCTCACGAG-3' RSCR。2: 5，-CATCAATAGTGGCGTATGTCTG-3'
3. 權(quán)利要求l所述的位于大白菜核不育復(fù)等位基因My兩側(cè)，并與其緊密連鎖的SCAR 標(biāo)記SCRm-378與SCRo2-208在輔助選擇中的應(yīng)用方法是(1 )用CTAB法對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行基因組DNA的提取 (2) PCR擴(kuò)增a. 反應(yīng)體系25uL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為20ng template; 2.5uL 10xBuffer; 1.6mM MgCl2; 0.15mmol/L dNTP; 5pmo1 primer; 1.25U Tag DNA polymerase; ddH20補(bǔ)齊 25uL，混勻，離心；b. 擴(kuò)增程序預(yù)變性94。C/4min， 94°C/60s、 59°C/60s、 72°C/90s， 30個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸10min;C.電泳① SCR(n-378:取10uL擴(kuò)增產(chǎn)物與2uL的6xLoadingbuffer混勻，點(diǎn)入含有0.5ug/ml EB 的1.5%瓊脂糖凝膠中，在110V電壓下電泳lh，經(jīng)EB染色后在凝膠成像儀中觀察拍照。② SCRo2-208:將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合(98% formamide, 10 mMEDTA， 0.001% xylene cyanol禾口bromphenol blue)。 94。C變性5min,之后在DNA測(cè)序電 泳儀上進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(6%)電泳，85W條件下電泳3小時(shí)。電泳結(jié)束后，使用 由Bioneer公司生產(chǎn)的銀染試劑盒進(jìn)行銀染。d.判斷① 在使用SCR01-378的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)至ij378bp條帶，則該材料帶有大白菜核 不育復(fù)等位基因Ms的概率為98.8n/o;② 在使用SCR02-208的引物的擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)到兩條帶(208bp和204bp)，則該材料 帶有大白菜核不育復(fù)等位基因Ms的概率為97.58/。。③ 如果①、②兩項(xiàng)中的擴(kuò)增結(jié)果均可獲得，則待測(cè)材料具有大白菜核不育復(fù)等位基 因Ms的概率為100Q/0。
全文摘要
本發(fā)明提供了位于大白菜核不育復(fù)等位基因Ms兩側(cè)，并與其緊密連鎖的兩個(gè)SCAR標(biāo)記，SCR₀₁-378和SCR₀₂-208。這兩個(gè)標(biāo)記與Ms基因之間的遺傳距離分別為1.2cM和2.5cM。根據(jù)二者的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異擴(kuò)增引物，用于大白菜核不育復(fù)等位基因的分子輔助選擇。在輔助選擇過程中同時(shí)使用這兩個(gè)標(biāo)記，選擇準(zhǔn)確度為97.5％以上。這兩個(gè)標(biāo)記重復(fù)性好，可靠性高，檢測(cè)成本低，省時(shí)省力。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101575603SQ20091001093
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者冀瑞琴, 輝 馮, 劉志勇, 樸鐘云, 李承彧, 王玉剛, 紀(jì)淑娟, 鵬 魏 申請(qǐng)人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)