專利名稱：一種野生型酯酶b3基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白表達技術(shù)，具體地說是一種野生型酯酶B3基因工程 菌及其構(gòu)建方法和應用。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，噴灑化學農(nóng)藥防治病蟲害仍為不可不用的措施。嚴重超量的 農(nóng)藥殘留常造成人的急性中毒，而少量的殘留農(nóng)藥在人體中長期蓄積滯留也會引起許多慢 性疾病。據(jù)統(tǒng)計，75. 4%的農(nóng)藥中毒系由有機磷農(nóng)藥引起。引起農(nóng)藥超標準殘留的原因有 將甲胺磷、對硫磷等高毒農(nóng)藥用于農(nóng)作物，超濃度使用農(nóng)藥，在收獲期噴灑農(nóng)藥等。對農(nóng)藥 殘留量過高的農(nóng)產(chǎn)品，僅簡單地用清水洗滌，不可能消除農(nóng)藥殘留。消除機磷農(nóng)藥污染殘留 已經(jīng)成為人們非常關(guān)心的問題。另外，長期的農(nóng)藥施用還造成土壤、地下水、地表水甚至大 氣受到有機磷的嚴重污染，已經(jīng)成為嚴重的社會問題、近年來研究證實，非特異性酯酶活性增高是蚊蟲對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要 機制，酯酶在昆蟲體內(nèi)使有機磷酸酯類農(nóng)藥降解，保護昆蟲免受農(nóng)藥毒害。酯酶B3是與蚊 蟲抗藥性有關(guān)的10種解毒酶中的一種，是有機磷抗性環(huán)跗庫蚊體內(nèi)產(chǎn)生的水解酶，它能有 效的水解有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等四大類農(nóng)藥。由于農(nóng)藥污染的日益加 劇，土著微生物已很難清除環(huán)境中大量的農(nóng)藥殘余，因此利用轉(zhuǎn)基因微生物降解農(nóng)藥及其 它有機物方向已成為一個研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種野生型酯酶B3基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為野生型酯酶B3基因工程菌野生型酯酶B3基因工程菌中的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO. 1 中所示。所述野生型酯酶B3基因工程菌所表達的氨基酸序列如序列表SEQ IDN0. 2中所
7J\ o野生型酯酶B3基因工程菌的構(gòu)建方法以環(huán)跗庫蚊cDNA文庫中的全序列為模板， 以分別帶有Ncol和Xhol酶切位點及5’端保護堿基為引物，進行PCR擴增所得產(chǎn)物經(jīng)Ncol 和Xhol限制性內(nèi)切酶消化，而后克隆至原核表達載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達宿主，所得 表達產(chǎn)物為具有如序列表SEQ ID NO. 1中所示核苷酸序列的野生型酯酶B3基因工程菌；所述引物為wB3-F:5，-CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3，，wB3-R 5’ -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3。所述原核表達載體是指適合外源蛋白高效可溶性表達的載體；所述大腸桿菌表達 宿主菌是指適合適合外源蛋白高效可溶性表達的載體質(zhì)粒表達的大腸桿菌表達宿主。所述外源蛋白高效可溶性表達的載體為pet28a ；大腸桿菌表達宿主為大腸桿菌 BL21(DE3)。
野生型酯酶B3基因工程菌的應用所述野生型酯酶B3基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后可降 解有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯四大類化合物。所述經(jīng)發(fā)酵后的野生型酯酶B3基因工程菌為將野生型酯酶B3基因工程菌于含卡 那霉素的液體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后以體積百分比的接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖 床培養(yǎng)至0D_為0.6，而后加入終濃度1. Ommol/L的IPTG，30°C誘導表達6小時，收集發(fā)酵 菌液，直至細胞破碎完全離心待用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明利用相對簡單的大腸桿菌為基因工程菌，產(chǎn)生大量具有生物學活性的酯 酶B3蛋白，獲得可以降解有機磷類化合物的微生物培養(yǎng)物，并且所得微生物的培養(yǎng)物致病 性較低，對環(huán)境不具有潛在威脅。2.本發(fā)明所得野生型酯酶B3基因工程菌培養(yǎng)物可用于受有機磷污染區(qū)域的生物 修復。3.本發(fā)明所得野生型酯酶B3基因工程菌培養(yǎng)物可有效的對有機磷類化合物進行 降解。


圖1為本發(fā)明野生型酯酶B3基因工程菌BL21(DE3)/pet28a-b3的發(fā)酵液的酯酶 活性檢測圖(其中以BL21(DE3)/pet 28a作為陰性對照。)。
具體實施例方式實施例11)對有機磷殺蟲劑有抗性的環(huán)跗庫蚊cDNA文庫質(zhì)粒DNA的提取將質(zhì)粒 pUC_b3(購自加拿大Queen，s University大學)轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a，將該單菌落接種于 含有l(wèi)OOii g/ml氨芐青霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)，取1. 5ml的培養(yǎng) 物離心收集菌體。提取質(zhì)粒DNA作為PCR反應模板(質(zhì)粒DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布 倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學實 驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社2005年第四版P20)。2)設(shè)計編碼野生型酯酶B3全基因序列b3的引物設(shè)計一對分別帶有Ncol和Xhol 酶切位點及5’端保護堿基的引物如下wB3-F 5' -CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3’wB3-R 5' -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3，3)編碼野生型酯酶B3全基因序列b3的PCR擴增反應體系為dOXPyrobest buffer 5iil、dNTP 250umol,0. 02% BSA 2 ii 1、上下游引物各 25pmol、模板基因組 DNA 0. 1 u g、Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)2U，無菌超純水補齊體積至50 yl。PCR反應條件為第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，45秒；55°C，45秒；72°C，2分鐘；共30個循環(huán)；第三階段72 °C，10分鐘4)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，切下目的帶，其大小約為1600bp， 按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收。
5)野生型酯酶B3原核異源表達載體pet28a_b3的構(gòu)建將純化后的PCR產(chǎn)物片段 經(jīng)Ncol和Xhol限制性內(nèi)切酶消化，以T4 DNA連接酶連接，將其連接入經(jīng)同樣雙酶切的pet 28a表達載體，構(gòu)建成表達載體pet28a-b3，轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化操作 按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾 《精編分子生物學實驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社2005年第四版P25)，提 取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Ncol和Xhol雙酶切鑒定正確重組克隆，并以Smger雙脫氧末端終止法測定 DNA序列(參見序列表1)。所述序列表SEQ ID NO 1中的堿基序列atgagtttggaaaacttgaccatccagaccaaatacggtccggttcggggcaaacggaatgtgtccctg ctgggacaggagtacgtcagctttcaaggaattccgtacgcccgggcacccgagggagagctgagattcaagccccc agttccgccaccaaagtggaccgaaacgttggactgcacgcaacaatgtgaaccctgctatcatttcgaccgccgca tccagaagatcgttggaagtgaggatagtctgaagatcaacgtgtttgcaaaagagatcaacccgtcaaatccgctt ccggtattgctatacatctacggcggtggtttcacggaaggaactagcggaaccgagttgtacgggccggatttcct gatccagaaagacatcgtgctggtaacgttcaactatcgcatcggagcgttgggctttctttgctgccagtcggagg aggatggcgtgcccggtaatgccggactcaaagatcagaacttggccattcggtgggtgctggagaacattgcggcc tttggaggagatcccaaacgtgtgaccttggctggtcatagcgcgggagctgcttccgttcagtatcatctgatatc ggatgcttccaaggacttgtttcaacgggctatcgttatgtccgggagtacgtattccagttggtcgctgactaggc aacgcaactgggttgaaaagttggcgaaaactatcggttgggatggagaaggtggtgagtccggtgcgttgagattc ttaagggctgccaagccggaggacattgtagctaaccaagagaagctattgactgccgaggacatgcaggaagatat cttcacaccttttggacctaccgttgaaccgtacttgacggagcagtgcataatccctaaggaacctttcgagatgg ctcggaatgcttggggagacacgattgatgtcatgattgggggaacgtccgaggaaggactgctgctgctacaaaag gtcaagttgcaaccggaacttttgtcccatcctcatttgttcctgggaaatgttccgccgcatttgaagatcagcat ggaacagcgagttgcgttcgctgtcaagctgaaacaacgttactaccccgacagcgatccttcgatggagaacaaca gcggatacgttcatatgatgaccgaccgggtcttctggcatggcctccaccgaaccatcctggcccgagctgctcga tcgcaggcccgcacgttcgtgtatcggatctgtctggactcggagttctacaaccactaccgcatcatgatgatcga cccgaagctgcgcggaacggtccacgccgacgagttgtcctacctcttttccaactttacccagcaggtccccggga aggaaaccttcgagttccgtggactgcaaaccctggtggatgtgttcacctcgttcgtcatcaatggcgatccaaac tgtgagatgacgtcgaacagcggagtggtctttgaaccgaacgggcagacgaagcccacgttcaagtgtttgaacgt gtccaacgagggggtggctttcatagattatccggatcccgaccggttggacatgtgggacgcaatgtacgtgaacg
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(a)序列特征
*長度1623堿基對
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來源環(huán)跗庫蚊
所述提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切鑒定正確重組克隆，并以Sanger雙脫氧 末端終止法測定DNA序列，所編碼的蛋白具有序列表2中所示的氨基酸；所述序列表SEQ ID NO 2中的氨基酸序列MSLENLTIQTKYGPVRGKRNVSLLGQEYVSFQGIPYARAPEGELRFKPPVPPPKWTETLDCTQQCEPCY HFDRRIQKIVGSEDSLKINVFAKEINPSNPLPVLLYIYGGGFTEGTSGTELYGPDFLIQKDIVLVTFNYRIGALGFL CCQSEEDGVPGNAGLKDQNLAIRWVLENIAAFG⑶PKRVTLAGHSAGAASVQYHLISDASKDLFQRAIVMSGSTYSS WSLTRQRNWVEKLAKTIGWDGEGGESGALRFLRAAKPEDIVANQEKLLTAEDMQEDIFTPFGPTVEPYLTEQCIIPK EPFEMARNAWGDTIDVMIGGTSEEGLLLLQKVKLQPELLSHPHLFLGNVPPHLKISMEQRVAFAVKLKQRYYPDSDP SMENNSGYVHMMTDRVFffHGLHRTILARAARSQARTFVYRICLDSEFYNHYRIMMIDPKLRGTVHADELSYLFSNFT QQVPGKETFEFRGLQTLVDVFTSFVINGDPNCEMTSNSGVVFEPNGQTKPTFKCLNVSNEGVAFIDYPDPDRLDMWD AMYVNDELF(a)序列特征*長度540殘基*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源環(huán)跗庫蚊實施例2野生型酯酶B3基因工程菌發(fā)酵液酯酶活性的測定1) α -乙酸萘酯(α -ΝΑ)、β -乙酸萘酯(β -ΝΑ)為酯酶Bl的特異性底物。由于 酶促反應的產(chǎn)物量與OD值成正比，如果工程菌的酯酶活性越強，則OD值越大。2)所述野生型酯酶Β3蛋白在大腸桿菌BL21(DE 3)中的異源表達將實施例1 中所得的野生型酯酶B3工程菌單菌落于含40ug/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活 化培養(yǎng)，以接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖床培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入終濃度1. Ommol/L的 IPTG，30°C誘導表達6小時，收集發(fā)酵菌液。3)將上述誘導表達后的工程菌液按表1加樣，于37°C反應不同時間，然后向各試 管加0. 5mL DBLS (固藍十二烷酸溶液)，室溫靜置15min，測定0D550吸收值，從而確定酯酶 的活性。每個反應做三個重復平行對照，結(jié)果參見圖1。表1.酶活測定溶液組成 β -NA ( μ 1 ) 40 404040404040 工程菌培養(yǎng)液(ml) 0.8 0.80.80.80.80. 80.8 反應時間(h)_O_0. 51. O1. 52. Q2. 53. O其中，DBLS溶液將質(zhì)量百分比的固藍B溶液與質(zhì)量百分比5%的SDS溶液 按2 5的比例混勻。PBS磷酸緩沖液(F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D. D.穆爾， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學實驗指南》美國紐約John Wiley& Sons 出版社 2005 年第四版 P887)。0 -NA 0. 02mg/ml 溶于 PBS 中。實施例3野生型酯酶B3工程菌菌體破碎蛋白液對蔬菜葉片有機磷農(nóng)藥的降解活性測定1)所述野生型酯酶B3蛋白在大腸桿菌BL21(DE 3)中的異源表達將實施例1 中所得的野生型酯酶B3工程菌單菌落于含40ug/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活 化培養(yǎng)，以接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖床培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入終濃度1. Ommol/L的 IPTG，30°C誘導表達6小時，收集發(fā)酵菌液。2)將上述所得的發(fā)酵菌液，4°C下以6，000g離心lOmin收集菌體，每100ml發(fā)酵液 收集的菌體以50ml的PBS溶液重懸，于4°C超聲波破碎菌體，直至細胞破碎完全。4°C下以 12，000g離心30min收集上清液作為農(nóng)藥降解粗劑備用。取無施用任何農(nóng)藥小白菜100g葉片洗凈晾干，用含馬拉硫磷的農(nóng)藥均勻噴灑，晾 干后分成兩份，一份50g噴灑農(nóng)藥降解粗劑50ml，另一份50g噴灑PBS溶液50ml，靜置lh。 每份葉片放入100ml去離子水中，勻漿機中勻漿處理，抽濾分離固液相，濾液用50ml石油醚 萃取三次，收集有機相；固相殘渣用50ml石油醚洗滌三次，收集濾液。合并萃取有機相和濾 液，用無水硫酸鈉干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮有機相至約5ml，定容至10ml。用氣相色譜法分 析濃縮液中的農(nóng)藥含量，并計算降解率。降解率=(降解粗劑作用的樣品-PBS作用的樣品)+PBS作用的樣品X 100%同樣，用辛硫磷、甲基異硫磷農(nóng)藥分別重復進行如上實驗，計算降解率，實驗結(jié)果 見表2.表2.基因工程菌菌體破碎蛋白液對蔬菜葉片有機磷農(nóng)藥的降解活性 由表2降解率可知所述野生型酯酶B3基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后可降解多種有機磷類 農(nóng)藥。序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>石元亮張惠文盧宗云<120> 一種野生型酯酶B3基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1623<212>DNA<213>環(huán)跗庫蚊<220><221>CDS
<222>(1). . (1623)<223><400>1atg agt ttg gaa aac ttg acc ate cag acc aaa tac ggt ccg gtt egg 48Met Ser LeuGlu Asn Leu Thr lie Gln Thr Lys Tyr Gly Pro Val Arg151015ggc aaa egg aat gtg tcc ctg ctg gga cag gag tac gtc age ttt caa 96Gly Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Gly Gln Glu Tyr Val Ser Phe Gln202530gga att ccgtac gcc egg gca ccc gag gga gag ctg aga ttc aag ccc 144Gly lie ProTyr Ala Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Arg Phe Lys Pro354045cca gtt ccgcca cca aag tgg acc gaa acg ttg gac tgc acg caa caa 192Pro Val ProPro Pro Lys Trp Thr Glu Thr Leu Asp Cys Thr Gln Gln505560tgt gaa ccctgc tat cat ttc gac cgc cgc ate cag aag ate gtt gga 240Cys Glu ProCys Tyr His Phe Asp Arg Arg lie Gln Lys lie Val Gly65707580agt gag gatagt ctg aag ate aac gtg ttt gca aaa gag ate aac ccg 288Ser Glu AspSer Leu Lys lie Asn Val Phe Ala Lys Glu lie Asn Pro859095tea aat ccgctt ccg gta ttg cta tac ate tac ggc ggt ggt ttc acg 336Ser Asn ProLeu Pro Val Leu Leu Tyr lie Tyr Gly Gly Gly Phe Thr100105110gaa gga actage gga acc gag ttg tac ggg ccg gat ttc ctg ate cag 384Glu Gly ThrSer Gly Thr Glu Leu Tyr Gly Pro Asp Phe Leu lie Gln115120125aaa gac ategtg ctg gta acg ttc aac tat cgc ate gga gcg ttg ggc 432Lys Asp lieVal Leu Val Thr Phe Asn Tyr Arg lie Gly Ala Leu Gly130135140ttt ctt tgctgc cag tcg gag gag gat ggc gtg ccc ggt aat gcc gga 480Phe Leu CysCys Gln Ser Glu Glu Asp Gly Val Pro Gly Asn Ala Gly145150155160ctc aaa gatcag aac ttg gcc att egg tgg gtg ctg gag aac att gcg 528Leu Lys AspGln Asn Leu Ala lie Arg Trp Val Leu Glu Asn lie Ala165170175gcc ttt ggagga gat ccc aaa cgt gtg acc ttg get ggt cat age gcg 576Ala Phe GlyGly Asp Pro Lys Arg Val Thr Leu Ala Gly His Ser Ala
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權(quán)利要求
一種野生型酯酶B3基因工程菌，其特征在于野生型酯酶B3基因工程菌中的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示。
2.一種按權(quán)利要求1所述的野生型酯酶B 3基因工程菌，其特征在于所述野生型酯 酶B3基因工程菌所表達的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2中所示。
3.一種按權(quán)利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于以環(huán) 跗庫蚊cDNA文庫中的全序列為模板，以分別帶有Ncol和Xhol酶切位點及5’端保護堿基 為引物，進行PCR擴增所得產(chǎn)物經(jīng)Ncol和Xhol限制性內(nèi)切酶消化，而后克隆至原核表達載 體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達宿主，所得表達產(chǎn)物為具有如序列表SEQ ID NO. 1中所示核苷酸 序列的野生型酯酶B3基因工程菌；所述引物為wB3-F :5，-CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3，，wB3-R :5’ -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3，。
4.按權(quán)利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述原核 表達載體是指適合外源蛋白高效可溶性表達的載體；所述大腸桿菌表達宿主菌是指適合適 合外源蛋白高效可溶性表達的載體質(zhì)粒表達的大腸桿菌表達宿主。
5.按權(quán)利要求4所述的野生型酯酶B3基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述外源 蛋白高效可溶性表達的載體為pet28a ；大腸桿菌表達宿主為大腸桿菌BL21 (DE3)。
6.一種按權(quán)利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的應用，其特征在于所述野生 型酯酶B3基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后可降解有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯四大類化 合物。
7.按權(quán)利要求6所述的野生型酯酶B3基因工程菌的應用，其特征在于所述經(jīng)發(fā)酵后 的野生型酯酶B3基因工程菌為將野生型酯酶B3基因工程菌于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng) 基中過夜培養(yǎng)，然后以體積百分比的接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖床培養(yǎng)至0D■為0.6， 而后加入終濃度1. Ommol/L的IPTG，30°C誘導表達6小時，收集發(fā)酵菌液，直至細胞破碎完 全離心待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白表達技術(shù)，具體地說是一種野生型酯酶B 3基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。具體野生型酯酶B3基因工程菌中的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。構(gòu)建以環(huán)跗庫蚊cDNA文庫中的全序列為模板，以分別帶有NcoI和XhoI酶切位點及5’端保護堿基為引物，進行PCR擴增所得產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后克隆至原核表達載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達宿主，表達產(chǎn)物即為所得；所述基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后可降解有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯四大類化合物。本發(fā)明利用簡單的大腸桿菌為基因工程菌，產(chǎn)生大量具有生物學活性的酯酶B3蛋白，獲得降解有機磷類化合物的微生物培養(yǎng)物，并且所得微生物的培養(yǎng)物致病性較低，可用于受有機磷污染區(qū)域的生物修復。
文檔編號C12N1/00GK101857838SQ20091001107
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者盧宗云, 張惠文, 石元亮 申請人:石元亮;張惠文;盧宗云