專利名稱：一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法及裝置，屬于發(fā)酵工程及設(shè)備技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
粘細(xì)菌、絲狀真菌等微生物在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)時，菌體極易粘附于發(fā)酵液面以上的發(fā)酵 罐內(nèi)壁上，而且隨著發(fā)酵時間的增長，菌體逐步沿發(fā)酵罐內(nèi)壁向上蔓延，貼壁粘附的菌體 越積越多，這是微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)上常見的一種現(xiàn)象。
這種現(xiàn)象至少有兩方面的弊端 一是貼壁粘附的這些菌體不能回到液體中，造成了發(fā) 酵液中菌體細(xì)胞數(shù)量減少，生物量的降低造成發(fā)酵效率低下；二是貼壁菌體汲取不到液體 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，傳質(zhì)和供氧均受到較大影響，無法滿足目標(biāo)產(chǎn)物的生成條件，造成嚴(yán)重 的浪費(fèi)。發(fā)酵罐規(guī)模越大，此問題造成的弊端也越為嚴(yán)重。
通過提高發(fā)酵液攪拌強(qiáng)度，依靠液面的晃動把貼壁菌體重新融入發(fā)酵液中，可以部分 緩解菌體貼壁積累問題。但是，隨著發(fā)酵液面達(dá)到新的高度，有些菌體依然從這一高度上 繼續(xù)向上貼壁蔓延，而且在新的高度上越積越多，因此，此方法不能徹底解決這些微生物 貼壁粘附和蔓延的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對粘細(xì)菌、絲狀真菌等工業(yè)微生物生產(chǎn)中存在的貼壁粘附問題以及背景技術(shù) 中存在的不足，提供一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法及裝置。
本發(fā)明的一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法是使用無菌氣體或無菌液體，逆著菌 體貼壁蔓延的方向?qū)⒕w吹送或淋洗回發(fā)酵液中。該方法是通過在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液面之上 的特定距離內(nèi)設(shè)置一套環(huán)形多孔裝置而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法，是使用無菌氣體或無菌液體，逆著菌體貼壁 蔓延的方向?qū)⒕w吹送或噴淋回發(fā)酵液中，所述無菌氣體或無菌液體噴射點(diǎn)距離發(fā)酵液面
為l-10cm，噴射方向與所述發(fā)酵罐內(nèi)壁夾角為1-60度，噴射速度為l-10m/s，無菌氣體或
無菌液體輸送壓力與發(fā)酵罐內(nèi)壓力之差大于0. lMPa。
前述方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，在進(jìn)行吹送或噴淋時調(diào)節(jié)所述發(fā)酵罐罐壓p《0. 05MPa。 前述方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，在進(jìn)行噴淋之前，所述無菌液體先經(jīng)0.45um孔徑過濾。
前述方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述無菌氣體或無菌液體噴射點(diǎn)距離發(fā)酵液面為
5-8cm。
前述方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述無菌氣體或無菌液體噴射方向與所述發(fā)酵罐內(nèi)壁
夾角為25-45度。
前述方法，尤其適合于阻止發(fā)酵罐內(nèi)粘細(xì)菌(Myxobacteria)和絲狀真菌(Filamentous Fungi)的貼壁粘附現(xiàn)象。
3本發(fā)明提供的實(shí)現(xiàn)阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附方法的裝置，包括管路、流量調(diào)節(jié)閥門 和環(huán)形裝置，所述環(huán)形裝置通過定位支架固定于發(fā)酵罐內(nèi)，所述環(huán)形裝置上設(shè)有噴射孔。 前述裝置，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述環(huán)形裝置的直徑D為4-15ram。 前述裝置，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述噴射孔的數(shù)量為40-120個。 前述裝置，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述噴射孔的直徑d為0.2-1.2mm。 本發(fā)明阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法，是使用無菌氣體或無菌液體，逆著菌體貼 壁蔓延的方向?qū)⒕w吹送或噴淋回發(fā)酵液中。無菌氣體可以是發(fā)酵液中供氧所用的通用無 菌空氣，是空氣經(jīng)過多級粗過濾和精過濾，除塵、除水、除油、除菌制備而成的。無菌液 體有兩種制備方法， 一是以發(fā)酵罐中培養(yǎng)基配方而配制的新鮮液體培養(yǎng)基；二是發(fā)酵罐中 的培養(yǎng)液過濾后循環(huán)使用。以上無菌氣體和無菌液體來源非常方便，制備方法為本專業(yè)人 員熟知。具體采用無菌氣體還是無菌液體方式，要根據(jù)菌種培養(yǎng)要求而確定。如果加入新 鮮培養(yǎng)液對目標(biāo)產(chǎn)物的生成沒有影響，可以采用無菌液體噴淋的方法。如果加入新鮮培養(yǎng) 液對目標(biāo)產(chǎn)物的生成有影響，則可采用無菌氣體吹送或發(fā)酵液循環(huán)噴淋的方法。當(dāng)采用兩 種來源的無菌液體時，無菌液體進(jìn)入環(huán)形多孔裝置之前先經(jīng)0. 45 ii m孔徑過濾效果較好。
無菌氣體吹送和無菌液體噴淋的方法均可采用脈沖方式，脈沖時間間隔視菌體貼壁粘 附的輕重程度而定，可在間隔l-24小時內(nèi)手動調(diào)整。阻止菌體貼壁粘附的效果受流體的壓 力、流量、噴射距離、噴射方向與罐內(nèi)壁的夾角、噴射孔的開孔數(shù)目與開孔面積、脈沖頻 率等因素的影響?？梢愿鶕?jù)此原理制作不同規(guī)格的環(huán)形裝置用于不同菌體的發(fā)酵。 本發(fā)明方法及裝置具有以下優(yōu)點(diǎn)
入裝置簡單只需在通用發(fā)酵罐設(shè)備中加裝該環(huán)形裝置，輔以無菌空氣和無菌液體的
輸送管路閥門，便可以解決困擾發(fā)酵行業(yè)多年的菌體貼壁這一難題，將貼壁菌體回送到發(fā)
酵醪液當(dāng)中，提高發(fā)酵效率。可以通過不同規(guī)格的環(huán)形裝置(開孔數(shù)目和開孔方式不同)
以適宜于不同菌種的發(fā)酵。
么操作方便只需調(diào)整流體輸送壓力、流量既可以達(dá)到較好的噴射效果，脈沖頻率可 以根據(jù)具體菌體貼壁情況手工調(diào)整。
J、不易染菌因?yàn)檠b置簡單，而且主體裝置在發(fā)酵罐內(nèi)，可以隨發(fā)酵罐實(shí)消，滅菌效 果較好。其它輔助管路閥門較少，且與無菌空氣管路相連，保持無菌正壓狀態(tài)，幾乎沒有 染菌機(jī)會，所以整套裝置不易染菌。


圖l為環(huán)形裝置正視剖面圖2為環(huán)形裝置俯視圖3為環(huán)形裝置局部放大其中l(wèi).管路；2.流量調(diào)節(jié)閥門；3.環(huán)形裝置；4.粘附菌體；5.罐內(nèi)發(fā)酵醪液面；6. 發(fā)酵罐內(nèi)壁；7.定位支架；8.噴射孔；9.發(fā)酵罐；R.發(fā)酵罐內(nèi)半徑；r.環(huán)形裝置彎曲半徑; D.環(huán)形裝置直徑；d.噴射孔直徑。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但保護(hù)范圍不限于此。 實(shí)施例1
4根據(jù)圖1-3所示，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法的裝置包括管路1、 流量調(diào)節(jié)閥門2和環(huán)形裝置3，所述環(huán)形裝置3通過定位支架7固定于發(fā)酵罐9內(nèi)，所述 環(huán)形裝置3上設(shè)有噴射孔8。
在用發(fā)酵罐進(jìn)行纖維堆囊菌(5bra/^7'"/z7ceWi/7os^ATCC 15384)發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素 (印othilone)的過程中，菌體貼壁粘附現(xiàn)象嚴(yán)重，采用本發(fā)明的方法及裝置，解除了菌體 貼壁粘附問題，發(fā)明裝置相關(guān)參數(shù)如下
發(fā)酵罐總?cè)莘eV: 500升； 發(fā)酵罐內(nèi)半徑R: 290mm;
噴射孔開孔數(shù)目N: 100個;
環(huán)形管開孔面積A: 19.6mm2; 流體類型無菌空氣； 無菌空氣壓力P: 0.2MPa;
環(huán)形裝置距發(fā)酵液面距離T :
操作方法步驟如下-(1)
50rariu
裝液系數(shù)入75%
環(huán)形管彎曲半徑r: 270mm
噴射孔直徑d: 0. 5rara
環(huán)形管直徑D: 10ram
無菌空氣輸送管直徑①20mm 發(fā)酵罐內(nèi)壓力p: 0.05MPa 噴射方向與罐內(nèi)壁夾角S: 30度
將發(fā)酵培養(yǎng)基裝至發(fā)酵罐內(nèi)相應(yīng)液面高度，并在實(shí)消過程中控制最后液面高度 符合要求，距環(huán)形裝置50mm。
(2) 無菌空氣相應(yīng)管路蒸汽殺菌30min，可以通過該環(huán)形裝置進(jìn)行發(fā)酵罐保壓滅菌。
(3) 待滅菌結(jié)束后關(guān)閉無菌氣體流量調(diào)節(jié)閥，備用。
(4) 接種培養(yǎng)24小時，發(fā)酵罐內(nèi)壁有纖維堆囊菌向上蔓延跡象，調(diào)節(jié)罐壓為0.05 MPa，開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)閥30秒鐘，關(guān)閉流量閥，記為一次脈沖。再 調(diào)節(jié)罐壓為0.05 MPa，再開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)閥30秒鐘，關(guān)閉。脈沖 3次后，從視鏡觀察，纖維堆囊菌向上貼壁蔓延跡象消失。
(5) 每隔12小時，重復(fù)(4)中的脈沖操作，至貼壁粘附的菌體全部回到發(fā)酵醪液 中為止。
(6) 發(fā)酵7天時，檢測發(fā)酵生物量和埃博霉素產(chǎn)量，與不安裝本發(fā)明裝置的發(fā)酵罐 相比，生物量提高52. 1%,埃博霉素A產(chǎn)量提高37.6y。。實(shí)施例2
在用發(fā)酵罐進(jìn)行土曲霉菌(力卬e/^7^s ^rrews ATCC 20542)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他丁 (lovastatin)的過程中，菌體貼壁粘附現(xiàn)象嚴(yán)重，采用本發(fā)明的方法及裝置，解除了菌體 貼壁粘附問題，發(fā)明裝置相關(guān)參數(shù)如下
發(fā)酵罐總?cè)莘eV: 50升； 發(fā)酵罐內(nèi)半徑R: 150mm;
噴射孔開孔數(shù)目N: 60個；
環(huán)形管開孔面積A: 47. lmra2 流體類型無菌液體； 無菌空氣壓力P: 0.2MPa; 環(huán)形裝置距發(fā)酵液面距離T
操作方法步驟如下
30mm;
裝液系數(shù)入70% 環(huán)形管彎曲半徑r: 130mm
噴射孔直徑d: Iran
環(huán)形管直徑D: 8mra
無菌空氣輸送管直徑①15mm 發(fā)酵罐內(nèi)壓力p: 0.03MPa
噴射方向與罐內(nèi)壁夾角S: 45度(1) 將發(fā)酵培養(yǎng)基裝至發(fā)酵罐內(nèi)相應(yīng)液面高度，并在實(shí)消過程中控制最后液面高度符 合要求，距環(huán)形裝置30ram。
(2) 無菌空氣相應(yīng)管路蒸汽殺菌20min,可以通過該環(huán)形裝置進(jìn)行發(fā)酵罐保壓滅菌。
(3) 待滅菌結(jié)束后關(guān)閉無菌氣體流量調(diào)節(jié)閥，備用。
(4) 接種培養(yǎng)12小時，發(fā)酵罐內(nèi)壁有土曲霉菌體貼壁粘附跡象，調(diào)節(jié)罐壓為0. 03MPa, 將過濾滅菌配制好的培養(yǎng)基營養(yǎng)液補(bǔ)料瓶同流量調(diào)節(jié)閥相連，開啟本發(fā)明裝置中的流量調(diào) 節(jié)閥30秒鐘，用氣壓將新鮮營養(yǎng)液壓入環(huán)形裝置中進(jìn)行噴射，關(guān)閉流量閥，記為一次脈沖。 再調(diào)節(jié)罐壓為0. 03MPa，開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)閥30秒鐘，關(guān)閉。脈沖3次后，從視 鏡觀察，土曲霉菌貼壁粘附跡象消失。
(5) 每隔24小時，重復(fù)(4)中的脈沖操作，至貼壁粘附的菌體全部回到發(fā)酵醪液中 為止。
(6) 發(fā)酵10天時，檢測發(fā)酵生物量和洛伐他丁產(chǎn)量，與不安裝本發(fā)明裝置的發(fā)酵罐相 比，生物量提高35.6%，洛伐他丁產(chǎn)量提高29. 7%。
在用發(fā)酵罐進(jìn)行纖維堆囊菌(5br朋gi鵬ceWuJo幼/77ATCC 15384)發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素 (印othilone)的過程中，菌體貼壁粘附現(xiàn)象嚴(yán)重，采用本發(fā)明的方法及裝置，解除了菌體 貼壁粘附問題，發(fā)明裝置相關(guān)參數(shù)如下
操作方法步驟如下
(1) 將發(fā)酵培養(yǎng)基裝至發(fā)酵罐內(nèi)相應(yīng)液面高度，并在實(shí)消過程中控制最后液面高度 符合要求，距環(huán)形裝置55mm。
(2) 無菌空氣相應(yīng)管路蒸汽殺菌30min，可以通過該環(huán)形裝置進(jìn)行發(fā)酵罐保壓滅菌。
(3) 待滅菌結(jié)束后關(guān)閉無菌氣體流量調(diào)節(jié)閥，備用。
(4) 接種培養(yǎng)24小時，發(fā)酵罐內(nèi)壁有纖維堆囊菌向上蔓延跡象，調(diào)節(jié)罐壓為0.03 MPa，開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)闊30秒鐘，關(guān)閉流量閥，記為一次脈沖。再調(diào)節(jié)罐 壓為0.03 MPa,再開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)閥30秒鐘，關(guān)閉。脈沖3次后，從視 鏡觀察，纖維堆囊菌向上貼壁蔓延跡象消失。
(5) 每隔12小時，重復(fù)(4)中的脈沖操作，至貼壁粘附的菌體全部回到發(fā)酵醪液 中為止。
(6) 發(fā)酵7天時，檢測發(fā)酵生物量和埃博霉素產(chǎn)量，與不安裝本發(fā)明裝置的發(fā)酵罐 相比，生物量提高45.3%，埃博霉素A產(chǎn)量提高33.6y。。
實(shí)施例3無菌空氣壓力P: 0. 15MPa; 環(huán)形裝置距發(fā)酵液面距離T: 55 ram
發(fā)酵罐總?cè)莘eV: 500升； 發(fā)酵罐內(nèi)半徑R: 290咖； 噴射孔開孔數(shù)目N: 40個； 環(huán)形管開孔面積A: 1.26咖2; 流體類型無菌空氣；
裝液系數(shù)入75%
環(huán)形管彎曲半徑r: 270mm
噴射孔直徑d: 0. 2mm
環(huán)形管直徑D: 6mm
無菌空氣輸送管直徑①20mm 發(fā)酵罐內(nèi)壓力p: 0.03MPa 噴射方向與罐內(nèi)壁夾角S.: 25度
實(shí)施例4在用發(fā)酵罐進(jìn)行土曲霉菌"卬e2^7hs terre"s ATCC 20542)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他丁 (lovastatin)的過程中，菌體貼壁粘附現(xiàn)象嚴(yán)重，采用本發(fā)明的方法及裝置，解除了菌體 貼壁粘附問題，發(fā)明裝置相關(guān)參數(shù)如下-
操作方法步驟如下
(1) 將發(fā)酵培養(yǎng)基裝至發(fā)酵罐內(nèi)相應(yīng)液面高度，并在實(shí)消過程中控制最后液面高度符 合要求，距環(huán)形裝置50誦。
(2) 無菌空氣相應(yīng)管路蒸汽殺菌20min，可以通過該環(huán)形裝置進(jìn)行發(fā)酵罐保壓滅菌。
(3) 待滅菌結(jié)束后關(guān)閉無菌氣體流量調(diào)節(jié)閥，備用。
(4) 接種培養(yǎng)12小時，發(fā)酵罐內(nèi)壁有土曲霉菌體貼壁粘附跡象，調(diào)節(jié)罐壓為0. 03MPa， 將過濾滅菌配制好的培養(yǎng)基營養(yǎng)液補(bǔ)料瓶同流量調(diào)節(jié)閥相連，開啟本發(fā)明裝置中的流量調(diào) 節(jié)閥30秒鐘，用氣壓將新鮮營養(yǎng)液壓入環(huán)形裝置中進(jìn)行噴射，關(guān)閉流量閥，記為一次脈沖。 再調(diào)節(jié)罐壓為0. 03MPa，開啟發(fā)明裝置中的流量調(diào)節(jié)閥30秒鐘，關(guān)閉。脈沖3次后，從視 鏡觀察，土曲霉菌貼壁粘附跡象消失。
(5) 每隔24小時，重復(fù)(4)中的脈沖操作，至貼壁粘附的菌體全部回到發(fā)酵醪液中 為止。
(6) 發(fā)酵10天時，檢測發(fā)酵生物量和洛伐他丁產(chǎn)量，與不安裝本發(fā)明裝置的發(fā)酵罐相 比，生物量提高38.6%，洛伐他丁產(chǎn)量提高30. 7%。
發(fā)酵罐總?cè)莘eV: 50升； 發(fā)酵罐內(nèi)半徑R: 150mm;
噴射孔開孔數(shù)目N: 120個；
環(huán)形管開孔面積A: 33.9mm2;
流體類型無菌液體；
無菌空氣壓力P: 0. 2MPa; 環(huán)形裝置距發(fā)酵液面距離T: 50mm
裝液系數(shù)入70% 環(huán)形管彎曲半徑r: 130mm
噴射孔直徑d: 0. 6ram
環(huán)形管直徑D: 15mm .
無菌空氣輸送管直徑①15mm 發(fā)酵罐內(nèi)壓力p: 0.03MPa
噴射方向與罐內(nèi)壁夾角S: 25度
權(quán)利要求
1、一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法，其特征在于，使用無菌氣體或無菌液體，逆著菌體貼壁蔓延的方向?qū)⒕w吹送或噴淋回發(fā)酵液中，所述無菌氣體或無菌液體噴射點(diǎn)距離發(fā)酵液面為1-10cm，噴射方向與所述發(fā)酵罐內(nèi)壁夾角為1-60度，噴射速度為1-10m/s，無菌氣體或無菌液體輸送壓力與發(fā)酵罐內(nèi)壓力之差大于0.1MPa。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行吹送或噴淋時調(diào)節(jié)所述發(fā)酵罐罐 壓p《0. 05MPa。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行噴淋之前，所述無菌液體先經(jīng) 0. 45um孑L徑過濾。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述無菌氣體或無菌液體噴射點(diǎn) 距離發(fā)酵液面為5-8cm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述無菌氣體或無菌液體噴射方 向與所述發(fā)酵罐內(nèi)壁夾角為25-45度。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述菌體為粘細(xì)菌或絲狀真菌。
7、 一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求l-3任一所述方法的裝置，其特征在于，包括管路(1)、流量 調(diào)節(jié)閥門(2)和環(huán)形裝置(3)，所述環(huán)形裝置(3)通過定位支架(7)固定于發(fā)酵罐(9) 內(nèi)，所述環(huán)形裝置(3)上設(shè)有噴射孔(8)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于，所述環(huán)形裝置(3)的直徑D為4-15mm。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于，所述噴射孔(8)的數(shù)量為40-120個。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7或9所述的裝置，其特征在于，所述噴射孔(8)的直徑d為 0. 2—1. 2mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種阻止發(fā)酵罐內(nèi)菌體貼壁粘附的方法和裝置，是使用無菌氣體或無菌液體，逆著菌體貼壁蔓延的方向?qū)⒕w吹送或淋洗回發(fā)酵液中。該方法是通過在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液面之上的特定距離內(nèi)設(shè)置一套環(huán)形多孔裝置而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明具有裝置簡單、操作方便、不易染菌的技術(shù)優(yōu)勢。
文檔編號C12N1/14GK101586085SQ20091001626
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者劉新利, 崔靈芝, 瑋 胡 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院