專利名稱：一種同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種寡核苷酸芯片及其應用，尤其涉及基于下游引物Tamara標記和多 重PCR擴增的可同時檢測五種海洋環(huán)境常見腸道病毒的寡核苷酸芯片及其在檢測海洋環(huán) 境中人致病性腸道病原體病毒中的應用，屬生物芯片和環(huán)境微生物監(jiān)測技術領域。
背景技術：
隨著我國沿海城市人口的增長，城市生活污水的排海量逐年增加，導致越來越多的 人類致病性病毒進入海洋環(huán)境。許多病毒顆粒在海洋環(huán)境中具有很強的耐受能力，可通 過污染海產品、娛樂用水等途徑使人受到感染，進而引發(fā)傳染病的爆發(fā)流行。因此，進 行海洋環(huán)境人致病性病毒快速檢測系統(tǒng)研發(fā)，是目前我國海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和公共安全 健康工作所迫切需要的。
生物芯片/微陣列技術是上個世紀末期產生的高通量平行檢測技術，不僅能夠同時檢 測多種病毒，而且在一張基片上能夠同時檢測多個樣本，已經在基因表達譜分析和病原 體的平行檢測方面得到應用。
在芯片雜交檢測過程中，樣品的熒光標記是極其關鍵的一個步驟，特別是對于RNA 樣品由于其易于降解造成的引物區(qū)的缺失也會增加檢測的假陰性率，探索更快速和有效 的標記技術將對基因芯片技術的應用和推廣具有重要的實用價值。與其他的摻入標記方 法相比，下游引物Tamara標記的方法標記效率較高，可以顯著提高雜交后芯片的信號 穩(wěn)定性，相對的降低了檢測的成本。然而，在現有技術的檢索中還未發(fā)現用多重引物PCR 的方法對海洋環(huán)境中存在的能引起人類腹瀉的多種病毒的靶基因進行同時擴增，采用 Tamara標記下游引物，以實現對多種海洋環(huán)境人致病性腸道病毒的平行檢測的應用。

發(fā)明內容
針對現有技術的不足和實際檢測的需要，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能同時擴 增多種能引起人類腹瀉的腸道病原體的靶序列并提高標記效率的寡核苷酸芯片及其在 海洋環(huán)境及海貝樣本病原體檢測中的應用。
本發(fā)明的技術構思是用多重引物PCR的方法對海洋環(huán)境中存在的能引起人類腹瀉的 的多種病毒的靶基因進行同時擴增，采用Tamara標記下游引物，因此使得擴增出來的 所有PCR產物的下游5，端均被Tamara標記，以增加標記效率來提高病原體檢測的敏感 性，實現對多種海洋環(huán)境人致病性腸道病毒的平行檢測的目的。
本發(fā)明所述的同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片，由表面醛基化修飾的載玻片 基片和陣列涂布于其上的五種腸道病毒病原體探針以及陰性對照、陽性對照、空白對照
制成，其中所述陰性對照為點樣濃度為IOlxM的JEV探針，其序列為NH2- (GH2)
ATTGAC;所述陽性對照為點樣濃度為10pM的合成標記探針，探針的序列為,(OE) 64bly(dl) 15"Tarara4所述空白對照為雙蒸水；
其特征在于所述五種腸道病毒病原體探針是5條54 70mer的、點樣濃度均為10 uM的HAV(甲型肝炎病毒)、ROV (輪狀病毒)、NOV (諾如病毒)、ASV (星狀病毒)和 ADV (腸道腺病毒)病原體探針；其中
3所述HAV病原體探針序列為HAV-P: NH2- (CH2)6~Pol (dT) lMTMAGATOCACAGTATOCAGnTGGGAArrMCAATCAGAGTTTGGTCAGAGCrGAACATTGGAAaG;
所述ROV病原體探針序列為ROV-P: NH2- (CH2)6~Pol (off) 15"TTATGTCTGTATTATOCMCTGMGCMGTACOMTCMTGATGGTG/OGG;
所述NOV病原體探針序列為NOV-P: NH2- (CH2)6"Po1 (dT) 15""GGTAGCAGMGACCTTCnTCTCCTAG0GTGGTGGATGTGGGTGACTTCACMTATCMTCM0GAG;
所述ASV病原體探針序列為ASV-P: NH2- (CH2)6"Po1 (dT) 15""GMTTCGTTGTCAT艦0CAGGTGCATrATGTGrrATAGACA000CTGAAGGAAAAGGGACAGGTT;
所述ADV病原體探針序列為ADV-P: NH2- (CH2)6~Pol (dT) 15"CrACrT0GTATAnurGGATCTATT0OCrAOCTGGATGGCACCrTCTAOCTTMOCACACrTTCMG;
所述芯片的陣列布局如圖1所示。
本發(fā)明所述的同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片在檢測海洋環(huán)境中人致病性腸道病原體病毒中的應用。
其中所述同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片應用于同時檢測甲型肝炎病毒、輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒。
上述芯片應用方法是采用Tamara熒光染料分別標記五種病毒下游引物的5'末端，然后對待檢樣本中設定的HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因進行多重PCR擴增將Tamara摻入到靶序列，實現對待檢樣本中病原體特異基因的同時擴增標記，然后與經37'C水合、3600raJ條件下紫外交聯(lián)、2. 6g/L的NaBH4還原過程處理后的權利要求l所述寡核苷酸芯片在雜交盒中65。C雜交6 8h，然后將芯片洗脫甩干后用Scanarray 4000掃描儀掃描，用Quantarray 3, 0定量分析軟件分析掃描圖像的熒光強度值以確定標本中是否具有病原體。
其中所述HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因是HAV的VPS基因(AF396408)、R0V的VP7基因(AB118022)、N0V的NSP基因(EU703722)、 ASV的NSP區(qū)基因(AB308374)和ADV的六鄰體基因(AY027809)。
上述雜交中使用的雜交液成分是50%甲酰胺、5XSSC、 0,5%SDS、 0, P/。鮭魚精DNA。上述洗脫中使用的洗脫液成分是2XSSC、 0.2冗SDS和2XSSC。
本發(fā)明的長片斷寡核苷酸芯片能同時檢測引起人類腹瀉的多種腸道病毒，極適用于海水及海貝樣本的檢測。應用本發(fā)明所述的下游引物Tamara標記和多重PCR擴增寡核苷酸芯片技術體系能進一步研究開發(fā)包括檢測其他水質環(huán)境中腸道病毒的寡核苷酸芯片及相應的應用。
試驗結果顯示本發(fā)明的寡核苷酸芯片檢測結果與PCR法檢測結果無顯著性差異，兩者具有較高的符合率。
本發(fā)明建立的基于下游引物Tamara標記和多重PCR擴增的長片段寡核苷酸芯片技術體系與現有的單個病毒的檢測技術相比，具有靈敏度與PCR相當、但是特異性高的特點，是一種具有廣泛應用前景的技術體系，能廣泛適用于海洋環(huán)境檢測，衛(wèi)生監(jiān)督，海關檢
疫及科研等領域。


圖l為本發(fā)明的寡核苷酸芯片陣列分布其中@:陽性對照；@:陰性對照；(g):空白對照；①,⑥為HAV探針；②，⑦:ROV探針；③，⑧NOV探針；④,⑨ASV探針；⑤,⑩ADV探針。
圖2不同探針濃度對雜交熒光強度的影響；
其中每個濃度點4為四個平行重復點， 一張芯片點兩個陣列，從左往右依次為50uM 、 30uM 、 lOuM 、 5uM四個不同濃度。圖3不同濃度的熒光標記產物的雜交結果；
其中A E依次為核酸濃度依次為100pg/u 1、 10pg/ii 1、 lpg/u 1 、 0. lpg/ti 1、0.01p官/u;左上角四個點為陽性對照。圖4五種病原體探針特異性檢驗結果；
其中A為HAV兩條探針雜交結果；B為ROV兩條探針雜交結果；C為NOV兩條探針雜交結果；D為ASV兩條探針雜交結果；E為ADV兩條探針雜交結果，左上角四個點位陽性對照。
圖5以ASV探針為對象同批次寡核苷酸芯片重復性檢測結果。其中A、 B、 C為標記產物在同一批次的雜交結果；左上角四個點為陽性對照。圖6以ASV探針為對象不同批次寡合苷酸芯片重復性檢測結果。其中A為標記產物第一次的雜交結果；B第二次的標記產物與芯片的雜交結果；C第三次的標記產物與芯片的雜交結果。陣列分布同圖5。圖7 Tamra標記的海洋貝類樣本PCR的雜交結果；
其中A E依次為單一感染HAV、 R0V、 NOV、 ASV和ADV其中一種病毒的海貝陽性樣本多重PCR擴增結果的雜交結果。F 1為感染兩種病毒海貝樣本多重PCR擴增產物的雜交結果。
具體實施例方式
實施例1下游引物Tamara標記多重PCR擴增標記方法的寡核苷酸芯片制備及雜交方
法
1.探針的設計合成
利用探針設計軟件ArrayDesigner4.2，設計五種病毒特異探針，同時設計陽性對照
探針(pc)、陰性對照探針(m:)各一條，序列如下所示
HAV-P: NH2-咖)6"Pol(dT)15"TTAAAGAT0CACAGTAT0CAGnTGGGMTTMCMTCAGAGnTGGTCAGAGCTGAACATTGGMCAG;
R0V-P: (NH2-咖)6~Pol (dT) 15~TTATGTCTGTATTAT0CAACTGAAGCAAGTACTCAMTCMTGATGGTGACTGG;
NOV-P: NH2-咖)6~Pol (dT) 15~GGTAGCAGAAGA0CTIUrrTCnrrAGCGTGGTGGATCTGGGTGACTTCACAATATCAATCAAOGAG;
ASV卡NH2-咖)6"Po1 (dT) 15"GMrT0GTTGTCAT農0CAGGTGCATTATGTGTTATAGACAC00CTGMGGAAAAGGGACAGGTT;
ADV"P: NH2-咖)6"Pol(dT)15"CrAaT0GTATATrCrGGATCrArr00CTA0CrGGATGG
CAOCnUTAOCTTMOCACAaTTCMG;
PC:隆(CH2) frPoly(dT) 15"T腿。IC: NH2- (CH2) 6~Poly(dT)152.芯片的制備
選擇上述設計的5條探針用3XSSC分別稀釋成20raM/L，采用Cartisan5500點樣儀將探針點至到醛基化修飾的玻片表面上，每個探針點四個重復，以Tamara修飾的探針(PC)為陽性對照，以乙腦探針(tC)為陰性對照，雙蒸水為空白對照。每個對照也點四個重復，陣列上探針的分布如圖1所示.在濕盒中進行水合溫育,水和溫度為37°C。過夜干燥。UV交聯(lián)，紫外能量為3600 mj，將芯片放于2。6g/L的NaBH4還原10min,洗脫后4 'C避光保存?zhèn)溆谩?.耙基因的標記
下游引物Tamara標記方法多重PCR選擇HAV的VPS基因(AF396408) , ROV的VP7 gene基因(AB118022) ， NOV的NSP基因(EU703722) ， ASV的5，端NSP區(qū)基因(AB308374)， ADV的Hexon(六鄰體)基因(AY027809)擴增標記。擴增體系10Xbuffer5ul ， 25 mmol/L MgCl23p 1, 0. 25畫1 / L d,l u 1 ， 20 u mo1/1上下游引物各1。 5ul (其中下游引物5，末端為Tamara熒光標記)，DNA模板5p1. rTaq DNA聚合酶0, 5Ul， ddH2035nl,短暫離心。擴增程序94。C5min， 94。C45s， 42。C45s, 72。C延伸lmin。擴增35個循環(huán)，72'C延伸10min。
將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，余下進行芯片雜交。
4. 樣品檢測
將熒光標記的靶DNA PCR擴增產物溶于雜交液中(5XSSC 、 0. 5%SDS、 50%甲酰胺、0.W鮭魚精DNA),取標記的DNA溶液加到芯片的表面，加蓋玻片(小心不要有氣泡)放入雜交盒中，65。C雜交8h;取出后，先用2XSSC(0,2 MSDS)沖洗，然后用2XSSC洗滌，再離心甩干。將芯片用Scanarray 4000掃描儀掃描，掃描參數為激光強度100%， PMT100 %。用Quantarray 3, 0定量分析軟件分析掃描圖像的熒光強度值。計算出每個陣列中陰性對照點4個重復點的平均值(mean)和標準差(s)，得出95%的參考范圍(均數土2s)然后計算出每種探針的4個重復點熒光值的平均值，若此平均值高于均數+2為陽性，低于均數-2s則為陰性，對結果進行判讀。
5. 芯片的穩(wěn)定性及重復性檢測以ASV病毒為例，對同一批芯片進行三次平行雜交，對不同批次進行雜交，測定芯片的穩(wěn)定性和重復性。結果顯示同一批次的變異系數為1.42，不同批次的變異系數為1.5%。，
實施例2芯片制備條件的優(yōu)化
1.1探針點樣濃度的優(yōu)化選用ASV標準株進行DNA擴增標記,采用醛基化玻片為基片，采用Pixy5500點樣儀用SMP2點樣針以不同濃度點樣，點樣濃度分別為50umol/L、30umol/L、 10umol/L、 5wmol/L，共4個梯度，選擇雜交效果最好的點樣濃度。
經過3次重復試驗表明，探針濃度在10umol/L時，熒光強度已經達到肉眼可見清晰的雜交信號。
1. 2紫外交聯(lián)的優(yōu)化選用ASV標準株進行DNA擴增標記，采用醛基化玻片為基片，紫外交聯(lián)的能量分別選擇1200mJ、 2400mJ和3600mJ，選擇雜交效果最好的交聯(lián)能量。
經過3次重復試驗表明紫外交聯(lián)的能量選擇3600mJ雜交效果最好。
61.3雜交溫度和雜交時間的優(yōu)化實驗中通過對雜交液(50%甲酰胺、5XSSC、0.5%SDS、 0. 1%鮭魚精DNA)在不同溫度(溫度分別為50 °C、 55 。C、 65 。C)、不同雜交時間(雜交時間分別為2 h、 4 h 、 6 h、 9 h)的條件下雜交信號的比較，來選擇長片段探針最優(yōu)化的雜交條件。
經過3次重復試驗表明雜交時間為6h以上，雜交溫度為65 'C可以獲得最高的熒光強度。
結果確定
1. 探針濃度的確定
芯片雜交洗脫后，經過掃描得到不同濃度的探針雜交后的掃描熒光強度。掃描結果如圖3所示，可以看出探針濃度在10 ii mol/L時就可以得到滿意的效果，因此實驗中采用10 ixmol/L作為最終探針點樣濃度。
2. 寡核苷酸微陣列對靶基因檢測敏感性的確定
以ASV為實驗菌株，提取其基因組DNA，各取2 u 1作為模版進行熒光標記擴增，標記產物用核酸定量儀進行DNA定量，然后用雙蒸水l: IO定量稀釋為濃度為100pg/ul、10pg/yl、 lpg/ul、 0. lpg/ix、 0.01pg/yl五個濃度，與芯片雜交，結果顯示在濃度為lpg/P 1時，熒光強度值高于陽性點熒光值的均數+2s，顯示其敏感性為1pg。
3. 優(yōu)化芯片的雜交條件
采用70mer寡核苷酸探針，探針點樣后37'C水合，然后在3600mJ條件下進行紫外交聯(lián)固定效果最好。雜交液成分為50%甲酰胺、5XSSC、 0.5%SDS、 0. 1%鮭魚精DNA，雜交時間為6-8h，雜交溫度為65°C。
實施例3.五種病毒的長片段寡核苷酸芯片對海洋環(huán)境標本的檢測結果
應用本發(fā)明的以下游引物Tamara標記和多重PCR擴增的寡核苷酸芯片進行海洋貝類樣本五種腸道病原體標本檢測，方法如實施例l，結果見表l。
表l:海洋貝類樣本五種腸道病原體標本檢測結果
HAVROVNOVASVADV
+ -+ -+ .+ -+ -
Per detection11 1498 15229 13111 14918 142
Chip detection7 15310 15024 1369 15116 144
Chi-square test =119.891義2 =59.173,2=96.718,2=135.73義2 =127.5
p =0.250j3 =0.687p =0.227p =0.500p =0.625
Kappa values0.8830.6480.7540.8940.869
sensitivity72.73%75%72.41%81.80%83，33*M>
specificity100%97.50%97.84%100%99.30%
a) Kappa〉0。75，consistency is satisfactory :b)p>0. 05，no significance
結果顯示本發(fā)明的寡合苷酸芯片檢測結果與PCR檢測法相比，結果無顯著性差異，
7兩者具有較高的符合率。但是與PCR相比有更高的檢測特異性，適合海洋環(huán)境及海產品檢測。
綜上所述，本發(fā)明的基于下游引物Tamara標記和多重PCR擴增的寡核苷酸芯片與海洋環(huán)境中存在的五種腸道病毒的常規(guī)檢測的PCR方法相比符合率較高，建立的70mer長片段寡核苷酸芯片技術體系與現有的PCR單個檢測方法相比，敏感性相當、特異性高的特點，是一種具有廣泛應用前景的技術體系。序列表
〈110〉山東省醫(yī)藥生物技術研究中心
<120>—種同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片及其應用
<141>2009-7-8
<160>6
<210〉1
<211>69
<212>DNA
<213>AX)W!J <221>HAV~P DNA序列 〈222〉(1)…(69) <400>1
ttaaagatcc acagtatcca gtttgggaat taacaatcag agtttggtca gagctgaaca 60 ttggaaceig 69
<210〉2
<211>54
<212〉DNA
〈213〉AX)^U
〈221>R0V-P DNA序列
〈222〉(1)…(54)
<400>2
ttatgtctgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca atgatggtga ctgg 54
〈210〉3
<211〉67
<212>薩
〈213>AX/^iJ
〈221>N0V-P DNA序列
〈222〉(1)…(67)
<400>3
ggtagcagaa gaccttcttt ctcctagcgt ggtggatgtg ggtgacttca caatatcaat 60 caacgag 67<210>4
<211〉67
<212〉DNA
〈213〉AI^U <221>ASV-P DNA序列 〈222〉(1)…(67) 〈400>4
gaattcgttg tcataaaacc aggtgcatta tgtgttatag acacccctga aggaaaaggg 60 acaggtt 67
<210〉5
<211>67
〈212>腿
〈213〉AX)WJ
〈221>ADV-P DNA序列
〈222〉(1)…(67)
〈400>5
ctacttcgta tattctggat ctattcccta cctggatggc accttctacc ttaaccacac 60 tttcaag 67
〈210>6
〈211〉70
<212>DNA
〈213〉AX)WlJ 〈221>JEV DNA序列 〈222〉(1)…(70) <400〉6
gtgcaaacaa ggtttcactg atcgtgggtg gggcaacgga tgtggacttt tcgggaaggg 60 aagcattgac 70
權利要求
1.一種同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片，由表面醛基化修飾的載玻片基片和陣列涂布于其上的五種腸道病毒病原體探針以及陰性對照、陽性對照、空白對照制成，其中所述陰性對照為點樣濃度為10μM的JEV探針，其序列為NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC；所述陽性對照為點樣濃度為10μM的合成標記探針，探針的序列為NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamara；所述空白對照為雙蒸水；其特征在于所述五種腸道病毒病原體探針是5條54～70mer的、點樣濃度均為10μM的HAV、ROV、NOV、ASV和ADV病原體探針；其中所述HAV病原體探針序列為HAV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-TTAAAGATCCACAGTATCCAGTTTGGGAATTAACAATCAGAGTTTGGTCAGAGCTGAACTTTGGAACAG；所述ROV病原體探針序列為ROV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-TTATGTCTGTATTATOCAACTGAAGCAAGTACTCAAATCAATGATGGTGACTGG；所述NOV病原體探針序列為NOV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-GGTAGCAGAAGACCTTCTTTCTCCTAGCGTGGTGGATGTGGGTGACTTCACAATATCAATCAACGAG；所述ASV病原體探針序列為ASV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-GAATTCGTTGTCATAAAACCAGGTGCATTATGTGTTATAGTCACCCCTGAAGGAAAAGGGACAGGTT；所述ADV病原體探針序列為ADV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-CTACTTCGTATATTCTGGATCTATTCCCTACCTGGATGGCACCTTCTACCTTAACCACACTTTCAAG；所述芯片的陣列布局如圖1所示。
2. 權利要求1所述同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片在檢測海洋環(huán)境中人致病 性腸道病原體病毒中的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸 芯片應用于同時檢測甲型肝炎病毒、輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述芯片應用方法是采用Tamara熒光 染料分別標記五種病毒下游引物的5'末端，然后對待檢樣本中設定的HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因進行多重PCR擴增將Tamara摻入到靶序列，實現對待檢樣本中病 原體特異基因的同時擴增標記，然后與經37X:水合、3600mJ條件下紫外交聯(lián)、2. 6g/L的 NaBH4還原過程處理后的權利要求1所述寡核苷酸芯片在雜交盒中65'C雜交6 8h，然 后將芯片洗脫甩干后用Scanarray 4000掃描儀掃描，用Quantarray 3. 0定量分析軟件 分析掃描圖像的熒光強度值以確定標本中是否具有病原體。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒耙 基因是HAV的VPS基因(AF396408)、 ROV的VP7基因(AB118022)、 NOV的NSP基因(E訓3722)、 ASV的NSP區(qū)基因(AB308374)和ADV的六鄰體基因(AY027809)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時檢測五種腸道病毒的寡核苷酸芯片及其應用，所述芯片由基片和涂布于其上的五種腸道病毒病原體探針以及陰性對照、陽性對照、空白對照制成，其中所述病原體探針是5條54-70mer的HAV-P、ROV-P、NOV-P、ASV-P、ADV-PV1探針；本發(fā)明采用多重PCR對多種病原體靶序列進行同時擴增，采用下游引物Tamara標記的方法對PCR產物進行熒光標記，標記的PCR產物與芯片進行雜交實現對病原體準確檢測，檢測靈敏度與PCR相當，特異度高。檢測效率和準確性明顯縮短。本發(fā)明的技術體系適用于海水及海洋生物標本監(jiān)測，食品衛(wèi)生監(jiān)督，海關檢疫及相關的臨床檢測等領域。
文檔編號C12Q1/70GK101654713SQ20091001773
公開日2010年2月24日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者岳龍濤, 樊景鳳, 韓金祥, 高雪芹 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術研究中心;國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心