專利名稱：一種組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和脫上皮層羊膜重建組織工程人 角膜內(nèi)皮的方法。
背景技術(shù)：
高等動物的角膜內(nèi)皮在維持角膜透明、角膜厚度以及為角膜提供營養(yǎng) 等方面具有不可替代的作用。角膜受到感染或手術(shù)等創(chuàng)傷后，將引起角膜 內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的減少， 一旦角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度低于維持角膜內(nèi)皮 生理功能的臨界密度，角膜內(nèi)皮將出現(xiàn)不可逆之病變，形成角膜內(nèi)皮盲。
目前，我國約有角膜內(nèi)皮盲患者80萬人，盡管他們可以通過角膜移植來治 愈，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏致使絕大多數(shù)患者因得不到移植角膜而無 法重見光明。近年來，角膜組織工程的興起為組織工程角膜內(nèi)皮的體外重 建及其應(yīng)用于角膜內(nèi)皮盲的臨床治療帶來了新的希望，但如何利用角膜內(nèi) 皮細(xì)胞和適宜的載體支架在體外重建出組織工程人角膜內(nèi)皮已經(jīng)成為研究 熱點(diǎn)。
利用對人角膜內(nèi)皮的體外重建研究開始于1992年。此后，May Griffith 等(1999)利用癌基因轉(zhuǎn)染的永生化人角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞與醛交聯(lián)膠原蛋白在體外成功重建出形態(tài)、透明度和組織結(jié)構(gòu)與正常角 膜大體相近的功能性人角膜組織類似物，為人角膜組織的體外重建開辟了 道路，但由于所用角膜細(xì)胞均為轉(zhuǎn)染了癌基因、具有潛在致瘤性的永生化 細(xì)胞，從而限制了其在人角膜內(nèi)皮重建和臨床中的應(yīng)用。2004年，日本學(xué) 者Yutaka Ishino等和Tatsuya Mimura等利用體外培養(yǎng)至第4-5代的人角膜 內(nèi)皮細(xì)胞分別與去上皮層羊膜和膠原膜片分別重建出與正常功能接近的人 角膜內(nèi)皮細(xì)胞薄片。2007年，Jui-Yang Lai等將取自眼庫成人角膜的人角 膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)在修飾后的N-(l-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物載體支 架上獲得了近似于正常功能的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞薄片。2008年，日本東京大 學(xué)醫(yī)學(xué)院Kouichiro Hitani等又利用薄膜培養(yǎng)法獲得了近似于正常功能的 人角膜內(nèi)皮細(xì)胞薄片。這些研究結(jié)果為利用非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮細(xì)胞重建人 組織工程角膜內(nèi)皮開辟了道路，但由于所用種子細(xì)胞均為來源于眼庫角膜 或在24孔培養(yǎng)板中原代培養(yǎng)或僅傳4-5代的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，故細(xì)胞數(shù)量 非常有限，所能重建出的組織工程人角膜內(nèi)皮的數(shù)量極少，即使成功后能 用于臨床角膜移植的數(shù)量也極其有限，故仍只限于實(shí)驗(yàn)研究，更無法滿足 我國約80萬、全世界1000余萬角膜內(nèi)皮盲患者臨床治療的大量需要。2005年，樊廷俊等在國際上首次成功建立了沒有任何致瘤性的非轉(zhuǎn)染 人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系，成功解決了人組織工程角膜內(nèi)皮規(guī)?；亟ㄋ璐罅?種子細(xì)胞的來源問題。因此，盡早建立理想載體支架的制備技術(shù)，進(jìn)而建 立一種利用非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和理想載體支架重建組織工程角膜內(nèi)皮 的方法，已成為全世界眼科專家們的主攻目標(biāo)，也是組織工程角膜內(nèi)皮臨 床應(yīng)用以及造福全世界角膜盲患者的關(guān)鍵之所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是利用人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和脫上皮層羊膜載體支架，提 供一種組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法。
本發(fā)明的方法；取人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液在底面積25平方厘米培養(yǎng)瓶中置37"C擴(kuò)增培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用 0.25%胰蛋白酶溶液消化和滴管吹打法懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，用5 毫升組織工程人角膜內(nèi)皮重建專用培養(yǎng)液懸浮所得細(xì)胞沉淀制成人角膜內(nèi) 皮細(xì)胞懸液，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)后，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 4.2xl()6 4.2xl07個細(xì)胞/毫升。
然后，利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化， 以得到完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將 脫上皮層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑相同的羊膜圓片，使其上皮面朝上平鋪 于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放置于5% C02培養(yǎng)箱中在37"C條件下牢固干貼 后制成羊膜載體支架備用。
最后，在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中，輕輕加入上述準(zhǔn) 備好的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液0.1~0.2毫升，使細(xì)胞懸液均勻分散于培養(yǎng)孔 中，置5% C02培養(yǎng)箱中37 'C培養(yǎng)20~24小時待細(xì)胞完全貼附到羊膜載體 支架上后，補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液使其液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角 膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體支架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內(nèi) 皮。
本發(fā)明所用組織工程人角膜內(nèi)皮重建專用培養(yǎng)液的配方為 DMEM/F12培養(yǎng)液，20%小牛血清，0.05% 0.1% IV型膠原蛋白；
為了提高人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在脫上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本 發(fā)明又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
本發(fā)明的方法所重建出的組織工程人角膜內(nèi)皮在形態(tài)結(jié)構(gòu)和透明度上 與正常角膜內(nèi)皮相似并具有正常角膜內(nèi)皮的功能，本發(fā)明所重建的組織工 程人角膜內(nèi)皮移植到撕除角膜內(nèi)皮和后彈力層的新西蘭兔眼中可使兔眼角 膜透明長達(dá)39天以上。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是利用無致瘤性、非轉(zhuǎn)染的人 角膜內(nèi)皮細(xì)胞，能通過連續(xù)傳代為組織工程人角膜內(nèi)皮的批量重建提供出大量的種子細(xì)胞；利用商品化凍干羊膜所制備的脫上皮層羊膜，從而滿足 組織工程人角膜內(nèi)皮批量重建所需要的大量載體支架材料；而且可直接應(yīng) 用于批量生產(chǎn)和臨床角膜移植；且其生產(chǎn)和臨床治療的成本低。
具體實(shí)施例方式
1、 組織工程人角膜內(nèi)皮重建專用培養(yǎng)液的配制取常規(guī)配制的 DMEM/F12培養(yǎng)液70毫升，加入IV型膠原蛋白40 80毫克，完全溶解后 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制 的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的組織工程人角膜內(nèi)皮重建 專用培養(yǎng)液。
為了提高人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在脫上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本 發(fā)明又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
2、 人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系種子細(xì)胞的制備取人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，用含20% 小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在底面積25平方厘米培養(yǎng)瓶中置37'C進(jìn)行 擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞繁殖60-84小時至對數(shù)生長期后，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液， 加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1 2分鐘，加入此前吸出的培養(yǎng)液終止消化， 1000 1500轉(zhuǎn)/分離心10~15分鐘，細(xì)胞沉淀用5毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮 均勻制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用上述專 用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至4.2xl()S 4.2xlO"個細(xì)胞/毫升。
3、 脫上皮層羊膜載體支架制備的倒置消化利用0.25%胰蛋白酶溶液 對凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以得到完全脫去上皮層的羊膜，用 D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將脫上皮層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑 相同的羊膜圓片。
4、 組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建脫上皮層羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放置于37"C培養(yǎng)箱中牢固干貼后 制成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中，輕輕加 入上述準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，注意接種時使滴管口盡量接近但不要碰到膜， 從膜的中央開始緩慢滴加細(xì)胞懸液，接種量為0.1-0.2毫升，用滴管輕輕 吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于培養(yǎng)孔中，置5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37'C條 件下培養(yǎng)20~24小時待細(xì)胞完全貼附到羊膜載體支架上后，補(bǔ)加上述專用 培養(yǎng)液使其液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體支 架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內(nèi)皮。
實(shí)施例1
取人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，利用含20°/。小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在底面 積25平方厘米培養(yǎng)瓶中置37'C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)84小時。取常規(guī)配制的 DMEM/F12培養(yǎng)液70毫升，加入IV型膠原蛋白40 80毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制 的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的組織工程人角膜內(nèi)皮重建 專用培養(yǎng)液。對擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化1.5分鐘，加入此前吸出的培養(yǎng)液終止消化，1500轉(zhuǎn)/ 分離心10分鐘，獲得細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀用5毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均 勻制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用上述專用 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至4.7xl()S個細(xì)胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍千羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放置于37t:培養(yǎng)箱中牢固千貼后 制成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中，輕輕加 入上述準(zhǔn)備好的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，注意接種時使滴管口盡量接近但不 要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細(xì)胞懸液，接種量為0.2毫升，用滴 管輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于培養(yǎng)孔中，置5°/。 C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中在 37'C條件下培養(yǎng)24小時待細(xì)胞完全貼附到羊膜載體支架上后，補(bǔ)加上述專 用培養(yǎng)液使其液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體 支架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內(nèi)皮。 實(shí)施例2
取人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，利用含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在底面 積25平方厘米培養(yǎng)瓶中置37'C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)72小時。取常規(guī)配制的 DMEM/F12培養(yǎng)液70毫升，加入IV型膠原蛋白40~80毫克，完全溶解后 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制 的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的組織工程人角膜內(nèi)皮重建 專用培養(yǎng)液。對擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化1分鐘，加入此前吸出的培養(yǎng)液終止消化，1000轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘，細(xì)胞沉淀用5毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜內(nèi)皮 細(xì)胞懸液；利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃 度至4.2><107個細(xì)胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放置于37-C培養(yǎng)箱中牢固干貼后 制成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中，輕輕加 入上述準(zhǔn)備好的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，注意接種時使滴管口盡量接近但不要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細(xì)胞懸液，接種量為0.1毫升，用滴 管輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于培養(yǎng)孔中，置5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中在 37'C條件下培養(yǎng)22小時待細(xì)胞完全貼附到羊膜載體支架上后，補(bǔ)加上述專 用培養(yǎng)液使其液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體 支架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內(nèi)皮。 實(shí)施例3
取人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，利用含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在底面 積25平方厘米培養(yǎng)瓶中置37"進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)60小時。取常規(guī)配制的 DMEM/F12培養(yǎng)液70毫升，加入IV型膠原蛋白40-80毫克，完全溶解后 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制 的DMEM/F12培養(yǎng)液至100亳升，即為本發(fā)明的組織工程人角膜內(nèi)皮重建 專用培養(yǎng)液。對擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化2分鐘，加入此前吸出的培養(yǎng)液終止消化，1500轉(zhuǎn)/分 離心12分鐘，細(xì)胞沉淀用5毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜內(nèi)皮 細(xì)胞懸液；利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃 度至4.4xl(^個細(xì)胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放置于37"C培養(yǎng)箱中牢固干貼后 制成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中，輕輕加 入上述準(zhǔn)備好的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，注意接種時使滴管口盡量接近但不 要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細(xì)胞懸液，接種量為0.2毫升，用滴 管輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于培養(yǎng)孔中，置5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中在 37。C條件下培養(yǎng)20小時待細(xì)胞完全貼附到羊膜載體支架上后，補(bǔ)加上述專 用培養(yǎng)液使其液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體 支架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內(nèi)皮。
權(quán)利要求
1、一種組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法，首先利用含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對人角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘獲得人角膜內(nèi)皮細(xì)胞沉淀，用DMEM/F12培養(yǎng)液、20％小牛血清和0.05％～0.1％IV型膠原蛋白組成的組織工程人角膜內(nèi)皮重建專用培養(yǎng)液將該細(xì)胞沉淀懸浮成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；然后，利用0.25％胰蛋白酶對凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化以制備完全脫去上皮層的羊膜，并用打孔器將該脫上皮層羊膜打成與培養(yǎng)板孔直徑相同的羊膜圓片；最后，按上皮面朝上將脫上皮層羊膜圓片平鋪于48孔培養(yǎng)板孔的底部，放在37℃培養(yǎng)箱中干貼牢固后制成羊膜載體支架，將上述人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液0.1～0.2毫升接種在平鋪有上述羊膜載體支架的培養(yǎng)板中，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞全部貼附在上述羊膜載體支架上后，再補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液并使液面達(dá)到培養(yǎng)孔高度的3/4，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜載體支架上長成單層即為重建的組織工程人角膜內(nèi)皮。
2、 如權(quán)利要求1所述的組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法，其特征是所述 組織工程人角膜內(nèi)皮重建專用培養(yǎng)液中又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
3、 如權(quán)利要求1所述的組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法，其特征在于上 述擴(kuò)增培養(yǎng)方法是將人角膜內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
4、 如權(quán)利要求3所述的組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法，其特征是上述 已達(dá)到對數(shù)生長期的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的濃度為4.2xl0、4.2x107個細(xì)胞/毫 升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程人角膜內(nèi)皮的重建方法，是利用20％小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液將角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用胰蛋白酶消化獲得完全脫上皮層的羊膜載體支架，平鋪在培養(yǎng)板孔中牢固干貼后，將懸浮于含有IV型膠原蛋白和20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的對數(shù)生長期人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，接種至在平鋪有羊膜載體支架的培養(yǎng)板孔中啟動體外培養(yǎng)，進(jìn)行組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建。本發(fā)明工藝科學(xué)合理，所重建的組織工程人角膜內(nèi)皮可用于批量生產(chǎn)，滿足角膜內(nèi)皮盲臨床角膜移植治療對組織工程人角膜內(nèi)皮的大量需求，且組織工程人角膜內(nèi)皮體外重建和臨床治療的成本低。
文檔編號C12N5/08GK101508971SQ20091002003
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者叢日山, 于昊澤, 楊洪收, 樊廷俊, 晶 王, 君 趙 申請人:中國海洋大學(xué)