專利名稱：紅曲米液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法
紅曲米液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅曲米液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法，屬于生物工程和酶制劑制備技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一種從未斷奶的小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學(xué)功能是有限剪切酪蛋白的k-酪蛋白中Phel05-Met106連接的肽鍵，導(dǎo)致牛奶凝結(jié)，因此被廣泛用于干酪制造業(yè)，成為食品領(lǐng)域中重要的酶制劑，其產(chǎn)值占全世界酶制劑的15%。
凝乳酶的傳統(tǒng)制備方法是將出生10 30天的小牛屠宰，從其第四胃中用鹽將凝乳酶浸提出來。由于凝乳酶是干酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵性酶，隨著世界干酪產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，每年宰殺5000萬頭犢牛以獲得凝乳酶的方法，仍不能滿足生產(chǎn)的需要，也與現(xiàn)代化工業(yè)發(fā)展極不協(xié)調(diào)。因此，研究者都在不斷尋找新的凝乳酶的來源，主要包括動物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物源凝乳酶，但是這幾種來源的凝乳酶又都具有一定的局限性。動物性凝乳酶受到來源限制，而且利用動物性凝乳酶生產(chǎn)的干酪不能滿足素食主義者的需求。植物性凝乳酶雖然來源廣泛，但是受到時間、地域、生長周期長，蛋白水解活性高等條件限制，很難發(fā)展。利用微生物生產(chǎn)凝乳酶是目前最有前途的發(fā)展方向，微生物生長周期短、產(chǎn)量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶的成本較低、酶提取方便、經(jīng)濟效益高，但是同時也存在著微生物產(chǎn)生其它非酶類代謝產(chǎn)物的問題。 一般微生物酶在成為商業(yè)用酶時，都要進行毒性、致癌性以及皮膚過敏性測試，因而真正用于工業(yè)化生產(chǎn)凝乳酶的菌株非常稀少。
紅曲米是利用紅曲霉生產(chǎn)，古稱丹曲，是我國古代的偉大發(fā)明。多少年來，紅曲不但用于釀酒，而且還應(yīng)用于發(fā)酵食品、食品色素等方面。紅曲一直用于我國傳統(tǒng)食品豆腐乳的制作，它的安全性是確切有保證的。己經(jīng)有研究證明紅曲米發(fā)酵液作為凝乳劑是發(fā)酵液中的凝乳酶在發(fā)揮作用，紅曲米發(fā)酵液中的凝乳酶是紅曲米發(fā)酵液中微生物代謝產(chǎn)物，屬于微生物源凝乳酶，由于紅曲是我國傳統(tǒng)的食品添加劑，所以從紅曲米發(fā)酵液中提取的凝乳酶無需考慮微生物所產(chǎn)的非酶類代謝產(chǎn)物。利用液態(tài)發(fā)酵擴大生產(chǎn)，提高凝乳酶的活性具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)高活性凝乳酶且可大批量生產(chǎn)的方法。主要工藝路線利用紅曲米，通過液態(tài)發(fā)酵改變培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件控制其代謝生產(chǎn)出凝乳活性較高的凝乳酶。
本發(fā)明技術(shù)方案如下
紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下
l)紅曲米粉碎成粉狀，細度200—400目，將紅曲米粉接種到PDA液態(tài)培養(yǎng)基中，28-30。C恒溫培養(yǎng)90-96h，獲得紫紅色的紅曲霉；紅曲霉為紫紅色，生長于紅曲米的四周。2) 將紅色的紅曲霉接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，28-3(TC恒溫培養(yǎng)12h進行擴大培養(yǎng)；
3) 將步驟2)擴大培養(yǎng)后的紅曲霉按5% (體積比)接種量加入到液體培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，28-30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)70 72h，得到紅曲霉活化液；
4) 將步驟3)制得的紅曲霉活化液按5% (體積比)接種量接種至發(fā)酵罐，通風(fēng)量20~40L/min，培養(yǎng)溫度28 32。C，轉(zhuǎn)速200 350r/min,培養(yǎng)時間72~120h，發(fā)酵18h開始流加滅菌的液體培養(yǎng)基，流加速度為0.03L/h，制得紅曲霉發(fā)酵液；
5) 將步驟4)發(fā)酵的制得的紅曲霉發(fā)酵液在4°C、 4000r/min條件下離心10min，取上清液備用；
6) 向步驟5)得到的上清液中分兩次滴加2—3倍體積的乙醇進行醇沉，第一次4。C靜置2h后，以7000r/min離心15min，保留沉淀；取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后進行二次醇沉，條件為4'C靜置24h，以8000r/min離心15min，取沉淀；合并兩次沉淀物，溶于pH 6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液；
7) 使用SephadexG-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；
8) 利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCl梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。
上述步驟2)中的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
葡萄糖為1~1. 5 %;蛋白胨為0.1 0.5 %; KH2P04為0. 1 ~0.5%; K2HP04為0. 1 ~0.5%;酵母粉為0.1~ 0. 2 % ; MgS04.7 H20為0.02~ 0.08 %; ZnS(V7 H20為0.02~0. 05 %;余量為蒸餾水，pH為5.0-7.0 。
上述步驟3)中的液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
小麥麩皮水解液為4~8%;硫酸銨為0.2~0.6%; KH2P04為0. 1 ~0.5%; K:jHP04為0. 1 0.5%; MgS04'7H20為0.02~0.08%; ZnS04'7 H20為0.02~0. 05 %;余量為蒸餾水，pH為5.0-7.0 。
上述步驟6)中，第一次醇沉中使用的乙醇濃度為72。/。wt，第二次醇沉中使用的乙醇濃度為95%wt。
上述步驟8)中，所述利用NaCl梯度洗脫優(yōu)選0.15mol/L、 0.25mol/L 、 0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L NaCl濃度的緩沖液進行梯度洗脫。
上述試劑和培養(yǎng)基配方，如無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑和培養(yǎng)基。上述制得的凝乳酶活性測定方法為利用Arima法，取5 mL質(zhì)量濃度為100 g/ L的脫脂乳溶液，45。C保溫5 min，備用。將供試菌株培養(yǎng)液濾去菌絲后，其濾液于7 000 r/min， 4'C離心8min，取0. 5mL上清夜加入保溫的脫脂乳液，旋渦混合器上混合，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時間。凝乳酶酶單位定義為40 min將lmL質(zhì)量濃度為100g/L的脫脂乳凝固的酶量即為1個索氏單位(U)。
計算公式為U- (供試乳體積/酶的數(shù)量)X(2400/T)XD式中:T為凝乳時間；D為稀釋倍數(shù)。本發(fā)明的有益效果-
1. 采用液態(tài)發(fā)酵紅曲米產(chǎn)凝乳酶，原料易得；
2. 以PDA培養(yǎng)基作為發(fā)酵紅曲米的培養(yǎng)基，操作簡單，成本低廉；
3. 通過對搖床發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了紅曲米發(fā)酵液產(chǎn)凝乳酶的活力；
4. 通過對提取純化工藝的控制得到了高純度，高活性的凝乳酶。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法作進一步說明，但不限于此。實施例中使用的紅曲米為 濱州市鑫路商貿(mào)有限公司銷售，色價1000—3000u / g，水分小于8%，細度160—200目， 其他指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB4926—1985的要求。S印hadex G-75凝膠柱上海貝基生物科技 有限公司有售、DEAE-纖維素52北京華美生科生物技術(shù)有限公司有售。
實施例1
培養(yǎng)基的優(yōu)化
1) 碳源對凝乳酶活性的影響
選擇葡萄糖、蔗糖、小麥麩皮、可溶性淀粉、麥芽糖為碳源進行實驗。碳源的濃度為 50g/L，培養(yǎng)基的其他配比見基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。在以小麥麩皮作為發(fā)酵的碳源時，凝乳酶的 凝乳活性遠遠高于采用其他碳源時的，說明小麥麩皮很可能不僅僅對發(fā)酵微生物的生長做貢 獻，更重要的是對凝乳酶這一次級代謝產(chǎn)物的合成起到積極的作用，小麥麩皮的這種影響可 能是小麥麩皮的成分復(fù)雜，而所產(chǎn)生的有機或無機的成分也較多，對紅曲米發(fā)酵而言營養(yǎng)成 分更加齊全，而且更有利于高活性凝乳酶這一次級代謝產(chǎn)物的生成。由此確定，小麥麩皮為 最佳產(chǎn)凝乳酶達到碳源。其他碳源培養(yǎng)基中生成的凝乳酶的蛋白水解活性較高，可能于其組 成有關(guān)。
培養(yǎng)基中不同濃度的小麥麩皮對紅曲米液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響，分別選取了20， 40， 60， 80g/L五個濃度水平，另外嘗試小麥麩皮與葡萄糖的不同配比。通過考慮凝乳酶凝乳活 性與其蛋白水解活性比之的高低，最終選擇濃度為4%~8%添加量的小麥麩皮作為培養(yǎng)基的碳源。
2) 氮源對產(chǎn)凝乳酶的影響
實驗結(jié)果表明，不同氮源對凝乳酶的產(chǎn)量的影響因氮源的種類不同而有不同，凝乳酶活 也有很大差異。在實驗室的8種氮源中，四種有機氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粕、玉米漿) 產(chǎn)凝乳酶的凝乳活性幾乎都低于用四種無機氮源(硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，硝酸鈉)時產(chǎn) 凝乳酶活性，且凝乳酶的蛋白水解活性也都較高,不適合干酪的生產(chǎn)。
硫酸銨作為氮源，凝乳酶活性高的原因主要是銨離子被利用后，硫酸根離子存在于發(fā)酵 液中，可使發(fā)酵液保持在酸性。這種酸性可以使紅曲米發(fā)酵處于更佳的狀態(tài)。
3) 培養(yǎng)基初始pH對凝乳酶活性的影響
紅曲米的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液大多數(shù)時間是處于酸性范圍內(nèi)，因此在弱酸性的培養(yǎng)基初 始條件下，比較易于紅曲米發(fā)酵，凝乳酶活性相對較高，隨著pH值升高，凝乳酶活性逐漸 降低。凝乳酶活性隨著pH值升高而一直下降趨勢。根據(jù)試驗結(jié)果確定培養(yǎng)基的初始pH為 6.0~7.0。
4) 不同取樣時間對凝乳酶活性的影響在以上試驗的基礎(chǔ)上測定紅曲米發(fā)酵液的凝乳酶活性，并作曲線，我們可以看出前三天 發(fā)酵液凝乳酶活性隨時間增長而快速增長，在3~5天左右處于平穩(wěn)生產(chǎn)期。在5天后就急劇
下降，由此可以看出凝乳酶屬于紅曲米發(fā)酵的一個次級代謝中間產(chǎn)物，因此我們?nèi)訒r間取
3~4天。
5)發(fā)酵條件的三水平四因素正交試驗
選擇碳源、氮源、起始pH、發(fā)酵時間為考察因素，其余成分同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。 實驗結(jié)果表明培養(yǎng)基起始pH對紅曲米發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活性影響最大，其次是添加氮源濃 度及發(fā)酵時間，而添加碳源的濃度在實驗中的變化范圍內(nèi)的影響不明顯。根據(jù)實驗結(jié)果最佳 因素水平為起始pH值為6.0，硫酸銨2%，發(fā)酵時間為3.5天，小麥麩皮4%，以此作為本 發(fā)明的最佳培養(yǎng)基配方。 發(fā)酵條件的優(yōu)化
(1) 發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
采用正交實驗所得的最佳培養(yǎng)基配方，進行了 IOL發(fā)酵灌深層培養(yǎng)操作條件的優(yōu)化。紅 曲米發(fā)酵是好氧發(fā)酵，因此溶氧量是一個重要的參數(shù)，它直接影響發(fā)酵產(chǎn)物尤其是次級代謝 產(chǎn)物凝乳酶的產(chǎn)量。通過改變通風(fēng)量與攪拌轉(zhuǎn)速形成高、低兩種不同水平的溶氧條件，考察 紅曲米發(fā)酵在這兩種不同的溶氧條件下產(chǎn)凝乳酶的活性的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溶氧情況下， 產(chǎn)凝乳酶活性最高峰時間明顯滯后于高溶氧情況下，凝乳酶的而最終產(chǎn)量也明顯低?？梢娙?氧量對紅曲米發(fā)酵產(chǎn)生凝乳酶的影響是較大的。在實驗的基礎(chǔ)上最終確定出紅曲米液態(tài)發(fā)酵 產(chǎn)凝乳酶的最佳操作工藝條件為通風(fēng)量20~40L/min，培養(yǎng)溫度28~32°C ，轉(zhuǎn)速200 350r/min， 接種紅曲米發(fā)酵液5%，培養(yǎng)時間72~120h。
(2) 液態(tài)流加發(fā)酵，流加糊化的小麥麩皮對凝乳酶活性的影響 流加技術(shù)可以消除底物和產(chǎn)物的抑制作用。因此我們嘗試了流加糊化的培養(yǎng)基的方法，
以期提高凝乳酶的活性和產(chǎn)量。在以上實驗基礎(chǔ)上，采用有效裝液量為7L的發(fā)酵罐，底液 量為5L，發(fā)酵18h時開始進行流加操作，流加速度為0.03L/h,在此操作條件下，最終凝乳 酶產(chǎn)量比間歇發(fā)酵時提高了 18%,可見利用流加發(fā)酵液可以克服初始營養(yǎng)濃度過高而引起的 對凝乳酶生長的抑制，有效地提高了凝乳酶的活性及原料利用率。最終發(fā)酵液的凝乳酶活性 三灌平均穩(wěn)定達到56U/mL. 凝乳酶的粗制
以上實驗所得紅曲米發(fā)酵液經(jīng)4t:, 3500 r/min離心10min，取上清液。向其中緩緩加 入3倍體積的72Mwt的乙醇，4。C靜置2h后4。C， 7000 r/min離心15min ，保留沉淀；取 上清液，真空濃縮后加3倍95%wt乙醇4'C靜置8h, 4'C， 8000 r/min離心15min，兩次沉 淀物合并溶解于？116.25的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液。該粗液中蛋白含量為625.3mg， 凝乳活力為151.6U/mg。進行真空冷凍干燥獲得晶體凝乳酶產(chǎn)品，凝乳活力為2405.16 U/mg。
首先利用使用Sephadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為 洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；利用DEAE-纖維素52進一 步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液,以含0.15mol/L、0.25 mol/L 、0.35 mol/L 0.45 mol/L及0.55 mol/L NaCl濃度的緩沖液進行梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合并有活性 洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。純化后凍干得到201.8mg凝乳酶，凝乳活力達4562.1 U/mg，得到蛋白回收率為17.5%,酶活提高31倍。實施例2
一種紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下
1) 紅曲米粉碎成粉狀，細度400目，將紅曲米粉接種到PDA斜面培養(yǎng)基，28。C恒溫培養(yǎng) 90h，獲得紫紅色的紅曲霉；紅曲霉為紫紅色，生長于紅曲米的四周。
2) 將紅色的紅曲霉接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，28'C恒溫培養(yǎng)12h進行擴大培養(yǎng)； 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
葡萄糖為1.5%;蛋白胨為0.5%; KH2PO4為0.3。/。； K2HPO4為0.3。/。；酵母粉為0.2 % ; MgS04 7H20為0.04%; ZnS(V7H2O為0.03 0/0,余量為蒸餾水，pH為5.6 。
3) 將步驟2)擴大培養(yǎng)后的紅曲霉按5% (體積比)接種量加入滅菌后的液體培養(yǎng)基進 行搖床培養(yǎng)，3(TC， 150r/min搖床培養(yǎng)72小時，裝液量100mL/500mL三角瓶，得到的紅曲 霉活化液；
液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
小麥麩皮水解液為6%;硫酸銨為0.3%; KH2P04為0.5%; K2HP04為0.2%; MgS04 -7 1120為0.05%; ZnSCV7 H20為0.03 %，余量為蒸餾水，pH為5.5 。
4) 將步驟3)制得的紅曲霉活化液按照體積百分比比5%的接種量接種至發(fā)酵罐，發(fā)酵 罐有效裝液量7L，底液量為5L,通風(fēng)量40L/min，培養(yǎng)溫度28'C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時 間90h，發(fā)酵18h開始流加滅菌的液體培養(yǎng)基，流加速度為0.03L/h，制得紅曲霉發(fā)酵液
5) 將步驟4)發(fā)酵的得到的紅曲霉發(fā)酵液在4°C、 4000r/min條件下離心10min,取上 清液備用；
6) 向步驟5)得到的上清液中滴加3倍體積的72%wt乙醇進行醇沉，4'C靜置2h后， 以7000r/min離心15min，保留沉淀；取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后滴加3倍體積的 95。/。wt乙醇進行醇沉，4。C靜置24h后，以8000 r/min離心15min，取沉淀，合并兩次沉淀 物且溶于pH6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液；
7) 使用Sephadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液， 分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；
8) 利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始 緩沖液，采用0.15mol/L、 0.25mol/L 、 0.35mol/L、 0.45mol/L和0.55mol/LNaCl梯度洗脫， 分布收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。經(jīng)檢測凝乳酶活 力達4562.1U/mg。
實施例3:
一種紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下
1) 紅曲米粉碎成粉狀，細度200目，將紅曲米粉接種到PDA斜面培養(yǎng)基，30'C恒溫培 養(yǎng)96h，獲得紫紅色的紅曲霉；紅曲霉為紫紅色，生長于紅曲米的四周。
2) 將紅色的紅曲霉接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，3(TC恒溫培養(yǎng)12h進行擴大培養(yǎng)； 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
葡萄糖為1. 5 %;蛋白胨為0.4n/。;KH2P04為0. 3。/。;K2HP04為0. 4%;酵母粉為0.15% ;MgS04'7H20為0.05 %; ZnS04'7H20為0.02%，余量為蒸餾水，pH為6.0 。
3) 將步驟2)擴大培養(yǎng)后的紅曲霉按5% (體積比)接種量加入滅菌后的液體培養(yǎng)基進 行搖床培養(yǎng)，30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)70小時，裝液量100mL/500mL三角瓶，得到的紅曲
霉活化液；
液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比
小麥麩皮水解液為8%;硫酸銨為0.5%; KH2P04為0. 4%; K2HP04為0. 4%; MgS04 -7 1120為0.02%; ZnS04'7 H20為0.02 %，余量為蒸餾水，pH為6.5。
4) 將步驟3)制得的紅曲霉活化液按照體積百分比為6%的接種量接種至發(fā)酵罐，發(fā)酵 罐有效裝液量7L，底液量為5L，通風(fēng)量20L/min，培養(yǎng)溫度30。C，轉(zhuǎn)速350r/min，培養(yǎng)時 間120h，發(fā)酵18h開始流加滅菌的液體培養(yǎng)基，流加速度為0.03L/h,制得紅曲霉發(fā)酵液
5) 將步驟4)發(fā)酵的得到的紅曲霉發(fā)酵液在4'C、 4000r/min條件下離心10min，取上 清液備用；
6) 向步驟5)得到的上清液中滴加3倍體積的72%wt乙醇進行醇沉，4'C靜置2h后， 以7000r/min離心15min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后滴加3倍體積的95%wt乙醇 進行醇沉，fC靜置24h后，以8000 r/min離心15min，取沉淀，溶于pH 6.2的磷酸緩沖液 中，即為凝乳酶粗液；
7) 使用Sephadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液， 分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；
8) 利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始 緩沖液，采用0.15mol/L、 0.25mol/L 、 0.35mol/L、 0.45mol/L和0.55mol/L NaCl梯度洗脫， 分布收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。經(jīng)檢測凝乳酶活 力達4572. 9U/mg。
權(quán)利要求
1、一種紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下1)紅曲米粉碎成粉狀，細度200—400目，將紅曲米粉接種到PDA斜面培養(yǎng)基，28-30℃恒溫培養(yǎng)90-96h，獲得紫紅色的紅曲霉；紅曲霉為紫紅色，生長于紅曲米的四周；2)將紅色的紅曲霉接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，28-30℃恒溫培養(yǎng)12h進行擴大培養(yǎng)；3)將步驟2)擴大培養(yǎng)后的紅曲霉按5％(體積比)接種量加入液體培養(yǎng)基進行搖床培養(yǎng)，28-30℃，150r/min搖床培養(yǎng)70—72小時，得到的紅曲霉活化液；4)將步驟3)制得的紅曲霉活化液按照體積百分比5％的接種量接種至發(fā)酵罐，通風(fēng)量20—40L/min，培養(yǎng)溫度28—32℃，轉(zhuǎn)速200—350r/min，培養(yǎng)時間72—120h，發(fā)酵18h開始流加滅菌的液體培養(yǎng)基，流加速度為0.03L/h，制得紅曲霉發(fā)酵液；5)將步驟4)發(fā)酵的得到的紅曲霉發(fā)酵液在4℃、4000r/min條件下離心10min，取上清液備用；6)向步驟5)得到的上清液中分兩次滴加2—3倍體積的乙醇進行醇沉，第一次4℃靜置2h后，以7000r/min離心15min，保留沉淀；取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，第二次4℃靜置24h后，以8000r/min離心15min，取沉淀，合并兩次沉淀且溶于pH6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液；7)使用Sephadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；8)利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCl梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。
2、 如權(quán)利要求l所述的紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于，上述步驟2) 中的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比葡萄糖為1 — 1. 5%;蛋白胨為O. 1— 0.5%, KH2P04為0. 1 — 0.5%， 1(2冊04為0. 1 — 0. 5%，酵母粉為0, l— 0. 2 % ， MgS04 7 H20為0. 02—0. 08 %， ZnS04 7 H20為0. 02— 0. 05 %，余量為蒸餾水，p H為5. 0—7.0 。
3、 如權(quán)利要求l所述的紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于，上述步驟3) 中的液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比小麥麩皮水解液為4—8%;硫酸銨為0. 2—0. 6%,附04為0. 1 —0.5%， K2HP0，. 1 一O. 5%， MgS(X 7 H20為0. 02— 0. 08 %， ZnS04 7 H20為0. 02—0. 05 %，余量為蒸餾水， p H為5. 0—7.0 。
4、 如權(quán)利要求l所述的紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于，上述步驟6) 中，第一次醇沉中使用的乙醇濃度為72 Wt，第二次醇沉中使用的乙醇濃度為95y。wt。
5、 如權(quán)利要求l所述的紅曲米液態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于，上述步驟8) 中，所述利用NaCl梯度洗脫為0. 15mol/L、0. 25mol/L 、0. 35mol/L、0. 45mol/L和0. 55mol/L 濃度的NaCl緩沖液進行梯度洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及紅曲米液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法，屬于生物工程和酶制劑制備技術(shù)領(lǐng)域。它采用紅曲米的液態(tài)發(fā)酵，有機溶劑沉淀，低溫離心方法，真空冷凍干燥，Sephadex G-75凝膠柱層析，DEAE-纖維素52層析的步驟。本發(fā)明通過低廉原材料制備出高活性的凝乳酶，可以極大地解決凝乳酶來源不足的問題。
文檔編號C12R1/66GK101508984SQ200910020239
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者于功明, 杜愛蓮, 王成忠, 范素琴 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院