專利名稱：手足口病相關病毒平行檢測液相芯片及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種液相芯片及其制備方法與應用，尤其涉及一種手足口病相關 病毒平行檢測液相芯片及其制備方法與應用，屬于分子生物學技術及臨床檢測技 術領域。(二) 背景技術手足口病(hand-foot -mouth disease, HFMD)又名發(fā)疹性口腔炎，是由腸道 病毒感染引起的，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹或皰疹為主要 特征的一種急性常見傳染病。兒童多發(fā)，3歲及3歲以下嬰幼兒更容易得病。HFMD傳染性強，傳播途徑復雜，傳播快，在短時間內(nèi)即可造成大流行。引起HFMD的病原體主要為微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道屬的柯 薩奇病毒(Coxsackie virus) A組的2、 4、 5、 7、 9、 10、 16型，柯薩奇病毒B組的 1、 2、 3、 4、 5型；部分?？刹《?ECHO-viruses)和腸道病毒71型。最常見為柯 薩奇病毒A組16型(CA16)與腸道病毒71型(EV71)。不同型別腸道病毒感染導致 的HFMD病情也各不相同。與CA16和ECH0等腸道病毒相比，EV71型引起的HFMD重癥 感染的比例較大，可引起腦干腦炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、皰疹性 咽峽炎、神經(jīng)源性肺水腫、肺出血、病毒性心肌炎等多種疾病。重癥患兒病死率 可達10%至25%。目前HFMD實驗室診斷常用方法為血清學中和實驗，病原學細胞接種，分子生 物學逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)或real-time RT-PCR (rRT-PCR)等，這些 方法一次只能檢測一種病毒，在實際應用過程中對于病毒譜的檢測既繁瑣又需要 相對大量的試劑和臨床標本，檢測費用高，因此如果能運用新的技術將這些病毒 進行同時檢測，將會對這一類疾病的診療提供極大的方便。目前日益成熟的生物 芯片技術的高通量的特點可以實現(xiàn)多種病毒的一次性的聯(lián)合檢測。液相芯片技術 是生物芯片的一種，它除了具有普通生物芯片(即固相芯片)高通量的特點外， 還具有固相芯片不具有的高穩(wěn)定性、高敏感性等優(yōu)點，因此手足口病相關病毒平行檢測液相芯片的研制和開發(fā)迎合了目前實驗室和臨床診斷的需要。(三) 發(fā)明內(nèi)容根據(jù)引發(fā)手足口病相關病毒多樣化的特點，針對目前手足口病檢測采用的 ELISA、 RT-PCR和real-time RT-PCR等方法一次只能檢測一種病毒技術的不便、繁瑣費時和實驗室及臨床診斷的需要，本發(fā)明要解決的問題是提供一種手足口病 相關病毒平行檢測液相芯片及其制備方法與應用，不僅可以同時檢測引發(fā)手足口 病的多種病毒，而且檢測迅速，準確，省時省力，有利于實現(xiàn)手足口病的早發(fā)現(xiàn)、 早診斷和早治療。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，主要由微球，特異性探針，生物素化的通用引物，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是26、 36和 46號微球；所述特異性探針是針對EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl區(qū)域的氨基化的 特異性探針，通用引物是經(jīng)活化的生物素標記的腸道病毒通用引物。其中所述EV71特異性探針與26號微球形成偶聯(lián)體，CoxA16特異性探針與36 號微球形成偶聯(lián)體，Echo9特異性探針與46號微球形成偶聯(lián)體；所述偶聯(lián)體是一種 球形基質(zhì)。以紅色激光激發(fā)球形基質(zhì)上的紅色分類熒光，依據(jù)球形基質(zhì)的色彩不同確定類 型；所述通用引物的生物素標記與鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻 紅蛋白，測定球形基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球形基質(zhì)上 結(jié)合的手足口病相關病毒核酸的的含量。本發(fā)明共確定了3種用于手足口病診斷的針對VP1區(qū)域的特異性的探針，并利用 所述探針分別檢測其相應的病毒核酸，分別是EV71病毒核酸、CoxA16病毒核酸 和Echo9病毒核酸。本發(fā)明所涉及的3種針對手足口病相關病毒VP1區(qū)域的特異性探 針，是在大量臨床應用的基礎上，證實確與手足口病的發(fā)生有密切關系而選擇的。優(yōu)選的，所述生物素化的通用引物是經(jīng)過活化生物素標記的針對腸道病毒 的通用引物。優(yōu)選的，所述26、 36和46號微球是經(jīng)洗滌、活化的羧基微球。 生物素化的通用引物用于擴增手足口病相關病毒核酸，同時將擴增的RT-PCR 產(chǎn)物標記上生物素，生物素標記可以將與液相芯片微球體結(jié)合的RT-PCR產(chǎn)物與檢 測熒光偶聯(lián)，間接將結(jié)合的RT-PCR產(chǎn)物的濃度與檢測熒光的強度結(jié)合起來，從而 實現(xiàn)對每種病毒的濃度進行定量測定。本發(fā)明的設計思路是選擇針對手足口病相關病毒VP1區(qū)域的特異性探針， 分別與不同色號的微球偶聯(lián)，根據(jù)檢測需要混合，初步制備出可對上述手足口病 相關病毒進行一次性平行檢測的液相芯片。在應用時，加入待檢病毒核酸RT-PCR 產(chǎn)物，目的PCR產(chǎn)物被微球上的特異性探針捕獲，再加入鏈霉親和素-藻紅蛋白 (SA-PE)，病毒核酸RT-PCR產(chǎn)物上的生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE) 結(jié)合，最后通過液相芯片檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)對上述手足口病相關病毒的一次性定性 定量檢測。本發(fā)明所述手足口病相關病毒平行檢測液相芯片的制備方法，其步驟是 (1)特異性探針與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體 分別選取26、 36和46號羧基微球，洗滌；活化羧基微球；以上述順序分別對 應地加入針對EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl區(qū)域的特異性探針；加入EDC混勻；室溫下，以200 250 rpm的轉(zhuǎn)速放在搖床上孵育120分鐘；重復1 2次；用PBS-TBN 洗滌2 3次；得EV71特異性探針與26號微球形成偶聯(lián)體，CoxA16特異性探針與36 號微球形成偶聯(lián)體，Echo9特異性探針與46號微球形成偶聯(lián)體；計數(shù)單位體積每種 微球偶聯(lián)體的數(shù)，分別于4 'C條件下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合；
(2) 手足口病液相芯片的制備
將標記有不同探針的球形基質(zhì)即特異性探針與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體混合，初步 得到本發(fā)明的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片。
(3) 生物素化通用引物的選擇 優(yōu)選生物素化的通用引物是用于擴增手足口病相關病毒核酸。 通用引物的生物素標記，用于將鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合到微球上。 本發(fā)明所述手足口相關病毒平行檢測液相芯片在制備實驗室和臨床檢測試劑
中的應用。
利用本發(fā)明的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，可以實現(xiàn)對多種手足口 病相關病毒的平行檢測，即可同時檢測3種腸道病毒，也可以根據(jù)實驗室和臨床需 要選擇性的測量其中的幾種病毒，方便不同的疾病的實驗室和臨床檢測需要。
本發(fā)明的方法由于將多種手足口病相關病毒的檢測在一個反應體系中進行，
不同的探針可以和不同的目的分子進行結(jié)合，反應后通過激光檢測球形基質(zhì)的色 彩編號可以對不同的檢測反應加以區(qū)分，既具有RT-PCR或real-time RT-PCR檢 測的定性或定量的特點，又具有高通量的優(yōu)點，因而可更加省時省力，同時節(jié)約 了檢測成本。 具體實施例方式
實施例h探針與已知編號的微球的偶聯(lián)
1. 分別選取26， 36和46號羧基微球(Lurainex公司)，用漩渦震蕩器振蕩微 球懸液，時間20s，使微球混合均勻。
2. 分別取上述各號羧基微球大約2乂103個，分別轉(zhuǎn)移到離心管中，》8000Xg 離心2 min，沉淀羧基微球。
3. 移走上清，加入IOO u 1 dH20，用漩渦震蕩器振蕩20 s重懸微球，》8000 Xg離心2 min，沉淀羧基微球。
4. 移走上清，加入80 ixl 、 100 mM、 pH = 6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液，用漩渦 震蕩器振蕩20 s重懸洗滌的羧基微球。
5. 加入10 !il、 50mg/ml的Sulfo —NHS (用^20稀釋)，用漩渦震蕩器輕輕的 振蕩。
6. 加入IO ul、 50 mg/ml的EDC (用昍20稀釋)，用漩渦震蕩器輕輕的振蕩。 室溫孵育20 min，每隔IO min用漩渦震蕩器輕振一次。》8000Xg離心2 min，沉 淀活化的羧基微球。
7. 移走上清，加入250 ul、 50 mM、 PH = 5.0的MES，漩渦震蕩器振蕩20 s， 重懸活化的羧基微球。》8000Xg離心2 min，沉淀洗滌后的羧基微球。8. 重復步驟7兩次，用50 mM、 pH = 5. 0的MES洗滌2次。
9. 加入IOO ul、 50 mM、 pH二5.0的MES，用漩渦震蕩器振蕩20 s。在混勻的 微球中分別加入l nmol針對EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl區(qū)域的特異性探針，用 50 mM、 pH-5.0的MES定容至500 ul,用漩渦震蕩器混勻。
10. 在室溫下放在搖床上(200 rpm)孵育2 h?！?000Xg離心2 min，沉淀偶聯(lián) 好的微球。
11. 移走上清，加入300 ul PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30 s。在室溫下放在 搖床(200 rpm)上孵育30 min。》8000Xg離心2 min，沉淀偶聯(lián)好的微球。
12. 移走上清，加入l ml PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30 s。》8000X g離心2 min，
沉淀偶聯(lián)好的微球。13. 重復步驟12—次，用PBS-TBN洗漆2次。
14. 加入500 ul PBS-TBN，重懸偶聯(lián)好和洗滌好的微球，即得EV71特異性探 針與26號微球形成偶聯(lián)體，CoxA16特異性探針與36號微球形成偶聯(lián)體，Echo9特異 性探針與46號微球形成偶聯(lián)體。
15. 用細胞計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的濃度。
16. 把偶聯(lián)好的微球放在4 'C避光保存， 一般每種探針偶聯(lián)的微球單獨保存， 使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合。
實施例2:本發(fā)明所述手足口病相關病毒平行檢測液相芯片在臨床檢測中的應
用
利用本發(fā)明所述手足口病相關病毒平行檢測液相芯片檢測手足口病相關病毒 的技術流程
l.病毒核酸的提取可使用商業(yè)化的試劑盒提取RNA,如使用QIGEN Viral RNA mini Extraction Kit( CAT:52904)從臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病 毒RNA;
(1) 向一支l. 5 ml離心管中加入560 ul的AVL緩沖液；
(2) 再向這支離心管中加入140 y l臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物；
(3) 室溫下放置IO min，然后瞬時離心；
(4) 加入560 ul無水乙醇，充分混勻至少15 s，瞬時離心；
(5) 小心加入約630 n l的混合溶液至QIAamp柱中，將QIAamp柱套在收集管 上，然后8000 rpm離心5 s,使液體通過濾膜；
(6) 棄去收集管中的液體，重復第6步驟；
(7) 棄去收集管中的液體小心加入750 ul的AWl緩沖液，8000 rpm離心5s， 使液體通過濾膜；
(8) 棄去收集管中的液體小心加入750 ul的AW2緩沖液，8000 rpm離心5s， 使液體通過濾膜；
(9) 棄去收集管中的液體，13000 rpm再次離心l min;
(10) 將QIAamp柱放入一支干凈的l. 5 ml的離心管中；
(11) 向膜上加入30 P1的EB緩沖液，然后室溫下靜置2-5 min;(12) 在離心機中以8000 rpm的速度離心l min，離心下來的液體即為所需 的核酸溶液。 2. RT-PCR擴增
(1)在冰面上融化病毒RNA樣本和各種PCR試劑；
(2)配下列試劑主溶液
2XRT-PCR Buffer.............................................25. 0 P 1
dNTPs(2. 5mM each)..........................................2. 0 n 1
通用引物(正義、反義引物)各l.O Pi
RNA酶抑制劑...................................................0. 5 u 1
TaqDNA聚合酶(5u/ul) .................................0.5 ul
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(10u/ul) .................................1.0 ul
模板RNA.........................................................3. 0 u 1
RNase Free d H20.............................................16. 0 u 1
50. 0 u 1
(3)在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下
42°C...........................45 min
94°C...........................2 min
l個循環(huán)
94°C..............................15 s
58°C..............................30 s
72°C..............................1 min
35個循環(huán)
72°C..............................5 min
l個循環(huán)
所得RT-PCR產(chǎn)物置于4'C保存，待檢。 3.液相芯片檢測
(1) 分別取出上述制備的針對每種病毒的偶聯(lián)微球各500個，按等比例混 合，分裝在96孔板中，每一個孔中含有各種特異性探針的偶聯(lián)微球 各500個，加入待檢RT-PCR產(chǎn)物2 ul;
(2) 52'C雜交30 min;
(3) 加入鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)IOO u 1，混勻，52。C孵育30min;
(4) 加入IOO ul PBS-TBN重懸微球，用于液相芯片進行檢測；
(5) 液相芯片檢測中，紅色熒光定義微球的種類，確定待測樣品的病毒 類型，即定性；綠色熒光測定微球結(jié)合的SA-PE的平均熒光強度， 根據(jù)熒光值，確定病毒含量，即定量。
權(quán)利要求
1.一種手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，主要由微球，探針，生物素化的隨機引物，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是所述微球是26、36和46號微球；所述探針是針對EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1區(qū)域的氨基化的特異性探針；所述生物素化的隨機引物是經(jīng)活化的生物素標記的針對腸道病毒的通用引物；所述探針能EV71、CoxA16和Echo9病毒核酸的VP1區(qū)域特異性的結(jié)合，所述生物素化的隨機引物能對腸道病毒進行特異性的擴增；其中所述EV71氨基化的特異性探針與26號微球形成偶聯(lián)體，CoxA16氨基化的特異性探針與36號微球形成偶聯(lián)體，Echo9氨基化的特異性探針與46號微球形成偶聯(lián)體；所述偶聯(lián)體是一種球形基質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，其特征是所 述生物素化的隨機引物是針對腸道病毒的生物素化隨機引物。
3. 如權(quán)利要求1所述的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，其特征是所 述26、 36和46號微球是經(jīng)洗滌、活化的羧基微球。
4. 權(quán)利要求l所述手足口病相關病毒平行檢測液相芯片的制備方法，其特征 是步驟如下(1) 微球與氨基化的探針偶聯(lián)形成偶聯(lián)體分別選取26、 36和46號羧基微球，洗滌；活化羧基微球；以上述順序分別對 應地加入針對EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl區(qū)域的特異性探針；加入EDC混勻；室 溫下，以200 250rpm的轉(zhuǎn)速放在搖床上孵育120分鐘；重復1 2次；用PBS-TBN洗 滌2 3次；得EV71特異性探針與26號微球形成偶聯(lián)體，CoxA16特異性探針與36號 微球形成偶聯(lián)體，Echo9特異性探針與46號微球形成偶聯(lián)體；計數(shù)單位體積每種微 球偶聯(lián)體的數(shù)，分別于4'C條件下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合；(2) 將特異性探針與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體、活化的生物素標記的隨機引物、鏈霉 親和素-藻紅蛋白按比例配制，得到本發(fā)明的手足口病相關病毒平行檢測液相芯 片。
5. 權(quán)利要求l所述手足口相關病毒平行檢測液相芯片在制備手足口病臨床診 斷和檢測試劑中的應用。
6. 如權(quán)利要求5所述手足口相關病毒平行檢測液相芯片的應用，其特征是將標記有探針的微球偶聯(lián)體、作為報告分子的活化的生物素標記的隨機引物、鏈 霉親和素-藻紅蛋白按比例配置，探針與相應的目的核酸特異性的結(jié)合，帶有綠色 報告熒光的報告分子也與鏈霉親和素-藻紅蛋白特異性的結(jié)合，將混合物上樣到 Luminex 200，采用液相技術將微球偶聯(lián)體分為單個細胞流，利用紅、綠兩束激光 檢測，獲得光信號、處理數(shù)據(jù)就可完成對生物反應的實時、定量分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種手足口病相關病毒平行檢測液相芯片及其制備方法與應用。本發(fā)明的手足口病相關病毒平行檢測液相芯片，主要由微球，特異性探針，生物素化的通用引物，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是26、36和46號微球；所述特異性探針是針對EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1區(qū)域的氨基化的特異性探針，通用引物是經(jīng)活化的生物素標記的腸道病毒通用引物。本發(fā)明不同的探針可以和不同的目的分子進行結(jié)合，反應后通過激光檢測球形基質(zhì)的色彩編號可以對不同的檢測反應加以區(qū)分，既具有定性或定量的特點，又具有高通量的優(yōu)點，因而可更加省時省力，同時節(jié)約了檢測成本。
文檔編號C12Q1/70GK101629214SQ20091002072
公開日2010年1月20日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者慧 呂, 張凱寧, 張華寧, 張國寧, 忠 李, 李艷艷, 畢振強, 汪朝暉, 王顯軍 申請人:山東省疾病預防控制中心;山東艾克韋生物技術有限公司