專利名稱：：建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型特異pcr標(biāo)記以及快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及油菜細(xì)胞質(zhì)類型的鑒定，尤其涉及建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，以及利用建立的標(biāo)記快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的方法。
背景技術(shù)：
：油菜細(xì)胞質(zhì)具有高度異質(zhì)性，是由細(xì)胞質(zhì)基因組載體-線粒體基因組DNA序列決定的，不受油菜細(xì)胞核基因以及環(huán)境因素的影響。目前，國內(nèi)外己報道的油菜細(xì)胞質(zhì)類型較多，常見的細(xì)胞質(zhì)類型主要有Nap細(xì)胞質(zhì)類型(Nap)、波里瑪系統(tǒng)細(xì)胞質(zhì)(Pol)/陜2A細(xì)胞質(zhì)類型、Cam細(xì)胞質(zhì)類型、蘿卜質(zhì)細(xì)胞質(zhì)類型(0gu)等。目前，油菜細(xì)胞質(zhì)類型主要通過普通遺傳學(xué)方法研究、線粒體基因組DNA的限制性酶切片段長度多態(tài)性(即mtDNA-RFLP)標(biāo)記2種進(jìn)行鑒定。用普通遺傳學(xué)方法對正常油菜品種的細(xì)胞質(zhì)類型鑒定，一般用待測油菜品種做母本(人工去雄)，與某種已知細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的保持系雜交，根據(jù)該組合F2群體中是否出現(xiàn)不育株，來確定待測品種的細(xì)胞質(zhì)類型。如果F2群體出現(xiàn)不育株，則說明待測品種具有該種不育胞質(zhì)；如果全可育，則說明待測品種具有相對于該種不育胞質(zhì)來說，稱為正?？捎陌|(zhì)。該方法需要進(jìn)行油菜雜交試驗(yàn)，一般需要3個時代(23年)時間；費(fèi)時費(fèi)力，且每種雜交組合只能確定待鑒定油菜和某種已知胞質(zhì)類型的油菜是否為相同的細(xì)胞質(zhì)；如果不是相同的細(xì)胞質(zhì)類型，則仍不能確定待鑒定油菜的細(xì)胞質(zhì)到底是那種類型。利用上述遺傳學(xué)方法，Shiga(1976，1977，1978)對來自日本和歐洲的162個油菜品種，胡瓊等(1992)對來自8個國家的43個油菜品種的細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行了鑒定。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，有些研究者已通過分離提取油菜線粒體基因組(mtDNA)，利用mtDNA-RFLP標(biāo)記(楊光圣等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31(1):27-31)或基因組重復(fù)序列的PCR技術(shù)(rep-PCR)(程計華等，作物學(xué)報，2008，34(11):1946-1952)區(qū)別和鑒定油菜各種細(xì)胞質(zhì)類型。利用這兩種分子標(biāo)記方法鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型，與普通遺傳學(xué)方法比較，實(shí)驗(yàn)周期大大縮短，但是都需分離純化油菜線粒體和提取線粒體DNA，且mtDNA-RFLP方法需要進(jìn)行mtDNA的限制性酶切和酶切片段的分離檢測，操作程序繁瑣、復(fù)雜、技術(shù)難度大而且成本高。目前，甘藍(lán)型油菜Nap細(xì)胞質(zhì)類型的線粒體全基因組已被測序。國內(nèi)外研究已表明，不同油菜細(xì)胞質(zhì)類型的mtDNA組織結(jié)構(gòu)差異較大；油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的線粒體基因組中具有與其細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的特異基因片段。研究已揭示出Ogu、Nap和Pol等不育系的不育性狀相關(guān)的線粒體基因序列分別為其mtDNA的特異讀碼框Orfl38、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6。危文亮等(2005，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，38(10):1965-1972)根據(jù)油菜線粒體基因Orfl38、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6序列和已發(fā)表的擬南芥線粒體基因組序列設(shè)計PCR引物，可特異擴(kuò)增出目標(biāo)片段。程計華等(作物學(xué)報，2008，34(11):1946-1952)也得到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。mtDNA這些特異基因序列是受細(xì)胞質(zhì)遺傳的，不受油菜細(xì)胞核基因以及環(huán)境因素的影響。因此，依據(jù)不同細(xì)胞質(zhì)類型油菜線粒體DNA特異序列開發(fā)的分子標(biāo)記可作為鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的可靠分子標(biāo)記。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異標(biāo)記的方法，以及利用建立的該油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記，用于快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的用途。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟1)以已知細(xì)胞質(zhì)類型的甘藍(lán)型油菜包括Nap類型、Pol類型、Ogu類型和Cam類型的gDNA為模板，用以下3對擴(kuò)增引物對目標(biāo)基因Orf138、orf222/nad5c、orf224進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增，其中第一對引物的序列為GAMCGGGMGTGACAATGCATTATTTTCTCGGTCCAT;第二對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGMTCGCGGTCTCACGCACTAATC;第三對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGMTCACGACATCMGGAGGAAC;第一對引物擴(kuò)增目標(biāo)基因是0rfl38;第二對引物擴(kuò)增目標(biāo)基因是orf222/nad5c;第三對引物的擴(kuò)增目標(biāo)基因是orf224;2)—步多重PCR擴(kuò)增采用20ul的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行35個PCR循環(huán)反應(yīng)，得到片段大小分別為465bp、500bp、747bp、800bp、1102bp的特異PCR標(biāo)記，其中，465bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示0gu細(xì)胞質(zhì)類型，1102bp和800bp的標(biāo)記標(biāo)示nap細(xì)胞質(zhì)類型，747bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示pol細(xì)胞質(zhì)類型，800bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示Cam細(xì)胞質(zhì)類型，1102bp和465bp的標(biāo)記標(biāo)示改良OgU細(xì)胞質(zhì)類型。本發(fā)明以油菜基因組DNA(gDNA)為模板，用已報道的線粒體基因OrfB8、orf222/nad5c、orf224/atp6區(qū)域的特異引物，提供了一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，并提供利用建立的特異PCR標(biāo)記快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的方法。采用本發(fā)明的方法，只需要3-5天就可以實(shí)現(xiàn)對多個待測油菜材料的細(xì)胞質(zhì)類型鑒定和區(qū)分。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、與普通遺傳學(xué)研究鑒定細(xì)胞質(zhì)類型的方法相比，本發(fā)明無需進(jìn)行油菜種植和雜交試驗(yàn)，建立基于油菜mtDNA序列結(jié)構(gòu)差異的特異PCR標(biāo)記，利用特異分子標(biāo)記鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型，省時、省力、準(zhǔn)確、快速。2、與利用mtDNA-RFLP和rep-PCR標(biāo)記鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)的技術(shù)相比，本發(fā)明無需分離純化油菜線粒體和提取線粒體DNA;且與利用mtDNA-RFLP標(biāo)記比較，無需進(jìn)行mtDNA的限制性酶切和酶切片段的分離檢測，只需提取待測油菜基因組DNA，直接以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可鑒定待測油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。本發(fā)明操作簡單，省時省力，且大大降低了鑒定成本。3、本發(fā)明首次利用3對序列特異PCR引物，對已知Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細(xì)胞質(zhì)類型油菜基因組DNA進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增，以及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，建立了Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記，根據(jù)這些特異分子標(biāo);i己，可以快速鑒定出待測甘藍(lán)型油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。用本發(fā)明方法鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型，快速、簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉。圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型特異PCR標(biāo)記方法得到的Nap、Pol、Cam、0gu和改良0gu細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR產(chǎn)物電泳圖譜和標(biāo)示上述細(xì)胞質(zhì)類型的特異標(biāo)記。圖2是顯示部分油菜材料一步多重PCR產(chǎn)物電泳圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)的說明。具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過一步多重PCR技術(shù)，建立了標(biāo)示油菜Nap、Pol、Cam、Ogu等細(xì)胞質(zhì)類型的特異PCR標(biāo)記，通過利用這些特異PCR標(biāo)記可以快速鑒定待測油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。本發(fā)明以油菜基因組DNA(gDNA)為模板，用已報道的線粒體基因Orfl38、orf222/nad5c、orf224/atp6區(qū)域的特異引物，提供了一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，并提供利用建立的特異PCR標(biāo)記快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的方法。采用本發(fā)明的方法，只需要3-5天就可以實(shí)現(xiàn)對多個待測油菜材料的細(xì)胞質(zhì)類型鑒定和區(qū)分。首先，用本領(lǐng)域共知的CTAB方法分別提取已知Nap、Pol、Cam和0gu細(xì)胞質(zhì)類型油菜和待鑒定油菜的基因組DNA;其次，分別以提取的已知細(xì)胞質(zhì)類型油菜和待鑒定油菜基因組DNA為模板，利用本發(fā)明所述的3對PCR引物和一步多重PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增；按照本發(fā)明所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法進(jìn)行檢測、照相；最后，比較待鑒定油菜和已知細(xì)胞質(zhì)類型油菜PCR產(chǎn)物電泳圖譜，確定待鑒定油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例實(shí)施例l:利用一步多重PCR技術(shù)建立油菜Nap、Pol、Cam、Ogu細(xì)胞質(zhì)類型的特異PCR標(biāo)記本實(shí)施例所利用的PCR引物序列、所擴(kuò)增的目標(biāo)基因、擴(kuò)增片段的大小以及所標(biāo)示的細(xì)胞質(zhì)類型如下列表1所示表l:PCR引物序列、擴(kuò)增目標(biāo)基因、擴(kuò)增片段大小以及所標(biāo)示的細(xì)胞質(zhì)類型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以已知細(xì)胞質(zhì)類型的甘藍(lán)型油菜包括Nap、Pol、Ogu和Cam細(xì)胞質(zhì)類型甘藍(lán)型油菜的gDNA為模板，用表1所示3對引物進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增，建立上述細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因的特異PCR標(biāo)記。上述一步多重PCR擴(kuò)增采用20ul反應(yīng)體系，其中包括10mMTris-HCl、50mMKCl、1.5mMMgCb、250四種dNTP、0.5nM各條引物、0.5UTaqDNA酶(Tiangenbiotech.Co.,Beijing,China)和50ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)程序?yàn)樽冃?4°C2min94。C30s54。C50s72。C70s延伸72°C7min對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，取5ulPCR產(chǎn)物用2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下電泳35min左右，電泳緩沖液為TAEbuffer(含40mMTris-HAc、2mMEDTA);溴化乙錠染色；用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，得到PCR產(chǎn)物35cycles-電泳圖譜，以及Nap、Pol、Cam、Ogu等細(xì)胞質(zhì)類型油菜的一步多重PCR特異標(biāo)記。其中，附圖1中的1泳道和2泳道的帶型分別為改良0gu和Ogu細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記；3泳道和5泳道的帶型為Pol細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記；4泳道和7泳道的帶型為cam細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記；6泳道和8泳道的帶型為Nap細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記；M泳道為標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker。發(fā)明人利用本發(fā)明的上述方法，鑒定了國內(nèi)外141份油菜材料的細(xì)胞質(zhì)類型。以待測油菜基因組DNA為模板，同時用上述3對引物，采用上述20ulPCR反應(yīng)體系和循環(huán)反應(yīng)條件，進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物電泳圖譜與上述建立的各細(xì)胞質(zhì)類型油菜標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比，即可快速確定待測油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。部分待測油菜材料一步多重PCR產(chǎn)物電泳圖譜見說明書附圖2，其中圖中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker;其它泳道為待檢油菜材料。141份油菜材料的名稱及鑒定結(jié)果見下列表2。表2:國內(nèi)外141份油菜品種(系)細(xì)胞質(zhì)類型鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注0p，開放授粉品種；Line,自交系;核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120>建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型特異PCR標(biāo)記以及快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的方法<140><141><160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1GAAACGGGAAGTGACAAT<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2GCATTATTTTCTCGGTCCAT<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3agctgtctggagggaatc<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4gcggtctcacgcactaaTc<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5AGCTGTCTGGAGGGAATC<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6ACGACATCAAGGAGGAAC權(quán)利要求1、一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟1)以已知細(xì)胞質(zhì)類型的甘藍(lán)型油菜包括Nap、Pol、Ogu和Cam類型的甘藍(lán)型油菜的gDNA為模板，用以下3對擴(kuò)增引物對目標(biāo)基因Orf138、orf222/nad5c、orf224進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增，其中第一對引物的序列為GAAACGGGAAGTGACAATGCATTATTTTCTCGGTCCAT；第二對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGAATCGCGGTCTCACGCACTAATC；第三對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGAATCACGACATCAAGGAGGAAC；第一對引物擴(kuò)增目標(biāo)基因是Orf138；第二對引物擴(kuò)增目標(biāo)基因是orf222/nad5c；第三對引物的擴(kuò)增目標(biāo)基因是orf224；2)一步多重PCR擴(kuò)增采用20ul的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行35個PCR循環(huán)反應(yīng)，得到片段大小分別為465bp、500bp、747bp、800bp、1102bp的特異PCR標(biāo)記，其中，465bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示ogu細(xì)胞質(zhì)類型，1102bp和800bp的標(biāo)記標(biāo)示nap細(xì)胞質(zhì)類型，747bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示pol細(xì)胞質(zhì)類型，800bp和500bp的標(biāo)記標(biāo)示Cam細(xì)胞質(zhì)類型，1102bp和465bp的標(biāo)記標(biāo)示改良o(jì)gu細(xì)胞質(zhì)類型。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述20ulPCR反應(yīng)體系和PCR循環(huán)反應(yīng)如下20ulPCR反應(yīng)體系包括lOmMTris-HCl、50mMKCl、1.5mMMgCl2、250mM四種dNTP、0.5pM各條引物、0.5UTaqDNA酶和50ng基因組DNA;PCR循環(huán)反應(yīng)程序?yàn)樽冃?4°C，2min;循環(huán)反應(yīng)94°C，30s，54°C，50s，72°C，70s,共35個循環(huán)；最后延伸72°C，7min。3、權(quán)利要求1所述的建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異pcr標(biāo)記的方法在鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型中的應(yīng)用。4、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型按以下步驟進(jìn)行(a)以待測油菜基因組DNA為模板，重復(fù)權(quán)利要求1中所述的一步多重PCR擴(kuò)增；(b)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取步驟(a)中的5ulPCR產(chǎn)物用2。/。的瓊脂糖電泳，100V電壓下電泳35min左右，電泳緩沖液為TAE;溴化乙錠染色；用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相；(c)將步驟(b)中得到的電泳結(jié)果與權(quán)利要求1建立的特異PCR標(biāo)記進(jìn)行比對，從而得出待測油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。全文摘要本發(fā)明公開了一種建立油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記的方法，以及利用建立的該油菜細(xì)胞質(zhì)類型目標(biāo)基因特異PCR標(biāo)記，用于快速鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型的用途。本發(fā)明主要通過以已知細(xì)胞質(zhì)類型油菜和待鑒定的油菜基因組DNA為模板，用3對特異PCR引物，對已知Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細(xì)胞質(zhì)類型油菜基因組DNA進(jìn)行一步多重PCR擴(kuò)增，以及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，建立了Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細(xì)胞質(zhì)類型油菜一步多重PCR特異標(biāo)記，根據(jù)這些特異分子標(biāo)記，可以快速鑒定出待測甘藍(lán)型油菜的細(xì)胞質(zhì)類型。用本發(fā)明方法鑒定油菜細(xì)胞質(zhì)類型，具有快速、簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉、可重復(fù)性好的特點(diǎn)。文檔編號C12P19/00GK101608198SQ20091002229公開日2009年12月23日申請日期2009年4月30日優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日發(fā)明者李占杰,胡勝武,趙惠賢申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)