專利名稱：一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及牙胚的基因轉(zhuǎn)染及成釉細(xì)胞的基因功能 研究，特別涉及一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法。
背景技術(shù)：
基因轉(zhuǎn)染是將外源性基因片段轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞表達(dá)，是研究基因功能的 重要方法之一，以單層培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染來(lái)研究其基因功能 已得到廣泛應(yīng)用。腺病毒載體是目前表達(dá)載體較為常用的一種，通常重組的
腺病毒載體包括復(fù)制缺陷型和增殖型兩種；而且通過(guò)腺病毒載體的介導(dǎo)能夠 將一些外源性的基因?qū)胍话惚磉_(dá)載體較難導(dǎo)入的組織或細(xì)胞，如視網(wǎng)膜、 呼吸上皮、胎盤和粘膜下腺等(EhrengruberMU， HennouS， BuelerH， Nairn HY， Deglon N， Lundstrom K. Gene Transfer into Neurons from Hippocampal Slices: Comparison of Recombinant Semliki Forest Virus, ， Adenovirus ， Adeno-Associated Virus, Lentivirus, and Measles Virus. Mo/ecw/ar otwd CW/wAar A^wmsc/e"ce 2001 May;17(5):855-71; Takahashi M， Delivery of genes to the eye using lentiviral vectors, AfeAo<* Afo/ 5/o/ 2004， 46:439-49.)。同時(shí)月泉病毒 (AAV)在基因治療方面也體現(xiàn)出了安全、長(zhǎng)效等特征。
AAV-GFP表達(dá)載體是一種包含綠色熒光標(biāo)記GFP基因的常用腺病毒 表達(dá)載體(McCarty,D.M.，Christensen，M.,Muzyczka,N.，1991 .Sequences required for coordinate induction of adeno-associated virus pi 9 and p40 promoters by Rep protein. J. Virol.65，:2936 2945; Zolotukhin， S., Potter,M.， Hauswirth,W.W., Guy,J., Muzyczka，N.， 1996. A " humanized "green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells丄Virol.70,4646 C4654 )， 禾U用AAV-GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人胚腎AAV-293細(xì)胞，得到具有傳染性的病毒顆粒。 牙胚是一個(gè)特殊的器官，可以發(fā)育最終形成未來(lái)的牙齒。牙胚的發(fā)生和 發(fā)育包括牙板、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等，既有一定的獨(dú)立性，又于周圍 組織存在一定的互動(dòng)，牙胚內(nèi)上皮和間充質(zhì)來(lái)源的兩種組織相互影響彼此的 發(fā)生。成釉細(xì)胞是分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)的一種上皮細(xì)胞，出現(xiàn)于鐘狀期牙胚，位 于成釉器之中，表現(xiàn)為一均勻分布的細(xì)胞層，當(dāng)其分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白結(jié)束 后，細(xì)胞會(huì)逐步退化消失。成釉細(xì)胞與周圍的組織和細(xì)胞接觸緊密，無(wú)法徹 底分離。
目前有一些適合于牙胚體外培養(yǎng)的模型，這些模型采用立體培養(yǎng)牙胚的 方法，包括采用瓊脂基質(zhì)、濾膜、Trowe11系統(tǒng)等(Onishi T, Shintani S, Wakisaka S ， Ooshima T. Relationship of vitamin D with calbindin D9k and D28k expression in ameloblasts, 爿rc/z Ora/ 5/o/ 2008 February, 53(2):117-23; Torres誦Quintana MA， Lecolle S ， Goldberg M. Effects of inositol hexasulphate, a casein kinase inhibitor, on dentine phosphorylated proteins in organ culture of mouse tooth germs. Ac/2 Ora/所o/1998 August, 43(8):597-610)。
相對(duì)于其他細(xì)胞，成釉細(xì)胞數(shù)量少，與周圍的組織和細(xì)胞接觸緊密難以
分離，采用常規(guī)的機(jī)械分離或酶消化等原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，很難獲取足夠數(shù) 量成釉細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，其體外基因轉(zhuǎn)染效率就更低，使得目前國(guó)際研究 成釉細(xì)胞的基因功能采用的是一些細(xì)胞系如LS8 (Zhou YL， Snead ML. Identification of CAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. Journal of Biological Chemistry 2000 April 21 ， 275(16):12273-80)和PABSo國(guó)E (DenBesten PK, Gao C， Li W, Mathews CHE， Gruenert DC， Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast國(guó)like cell line, European Journal of Oral Sciences 1999
4August;107(4):276-81.)等。LS8和PABSo-E細(xì)胞系不能完全反應(yīng)體內(nèi)成釉 細(xì)胞立體生長(zhǎng)的狀態(tài)，不能滿足對(duì)于其基因功能研究的需要，尤其是從三維 的角度研究牙胚中成釉細(xì)胞的基因功能；成釉細(xì)胞在分化過(guò)程中，存在一個(gè) 高度、生長(zhǎng)極性的系列變化，這些特征體現(xiàn)了細(xì)胞的不同分化階段，在細(xì)胞 單層培養(yǎng)體系，這些三維或極性特征較難維持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì) 胞基因轉(zhuǎn)染方法，通過(guò)腺病毒載體將外源性基因?qū)氲絋mnswell系統(tǒng)體外培 養(yǎng)的牙胚，有利于從三維的角度研究牙胚中成釉細(xì)胞的基因功能。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在 于，包括以下步驟
1) 將分離到的初生牙胚牙尖向上置于Tmnswdl內(nèi)置小室的微孔濾膜 上，Transwell內(nèi)置小室位于含有牙胚培養(yǎng)液的孔板內(nèi)；所述牙胚培養(yǎng)液為 BGJb培養(yǎng)液，還包含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的胎牛血清、100 IU/ml的青霉素、 80pg/ml鏈霉素和5 mg/L肝素；每孔中加入lml牙胚培養(yǎng)液，在37 °C、體 積分?jǐn)?shù)為5%的C02孵育箱飽和濕度下培養(yǎng)；
2) 以包含GFP基因的腺病毒載體AAV-GFP感染人胚腎AAV-293細(xì)胞， 產(chǎn)生具有傳染性的病毒顆粒，將病毒顆粒與牙胚培養(yǎng)液混和制備成病毒濃度 為500 5000 MOI的感染液；
3) 將感染液加入培養(yǎng)有牙胚的Tmnswell內(nèi)置小室，感染后48小時(shí)，移 去感染液，牙胚繼續(xù)用牙胚培養(yǎng)液培養(yǎng)，并每天更新牙胚培養(yǎng)液；
4) 當(dāng)牙胚的表層出現(xiàn)綠色熒光時(shí)，結(jié)合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚定 位GFP和釉原蛋白共表達(dá)的牙胚成釉細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益的技術(shù)效果如下
1、 本發(fā)明對(duì)Transwdl體系的培養(yǎng)條件進(jìn)行改進(jìn)，首次實(shí)現(xiàn)了利用 Tmnswdl系統(tǒng)體外培養(yǎng)牙胚，牙胚在此環(huán)境下可以很好的生長(zhǎng)，保持良好的 組織形態(tài)，牙釉質(zhì)成釉細(xì)胞細(xì)胞保持著立體狀態(tài)，可以持續(xù)生長(zhǎng)；出生一天
(Pl)的小鼠磨牙牙胚可以在Transwell系統(tǒng)持續(xù)生長(zhǎng)，組織外形完好，在 培養(yǎng)期間，可以觀察到牙尖變得銳利，釉質(zhì)增厚，可以在2周內(nèi)維持較佳的 生長(zhǎng)狀態(tài)。
2、 將外源性的標(biāo)志基因GFP通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到Transwdl系統(tǒng) 體外培養(yǎng)的小鼠磨牙牙胚，腺病毒-GFP載體(AAV-GFP)感染后24小時(shí)， 即在牙胚的表層出現(xiàn)綠色熒光，感染后2天GFP的表達(dá)增強(qiáng)，到第3和第4 天后熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定，腺病毒載體介導(dǎo)外源性基因轉(zhuǎn)染牙胚成功。
3、 GFP的表達(dá)定位與組織塊法免疫熒光染色對(duì)釉原蛋白的染色結(jié)果對(duì) 比得到GFP的表達(dá)與釉原蛋白的染色有一定的交叉，GFP和釉原蛋白共表 達(dá)細(xì)胞的比例占總釉原蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的50%,成釉細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率相當(dāng) 高。
4、 在Transwell系統(tǒng)體外培養(yǎng)牙胚的成釉細(xì)胞保持著立體狀態(tài)，即體內(nèi) 三維生長(zhǎng)狀態(tài)，成釉細(xì)胞與周圍的基質(zhì)和相關(guān)細(xì)胞存在互動(dòng)，而這種模式下 基因轉(zhuǎn)染成釉細(xì)胞成功，其基因轉(zhuǎn)染效果更能反應(yīng)體內(nèi)的生命活動(dòng)，有利于 從三維的角度研究牙胚中成釉細(xì)胞的基因功能。


圖1為Transwell系統(tǒng)體外培養(yǎng)牙胚的培養(yǎng)模式圖，牙胚從動(dòng)物體內(nèi)分離 后，將其牙尖向上正置于Transwell內(nèi)置小室的微孔濾膜上；其中，1為 Tmnswell內(nèi)置小室，2為微孔濾膜，3為下層腔室，4為上層腔室，5為牙胚；
圖2是采集新生小鼠牙胚中AAV-GFP基因轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá) 圖，圖中較亮的點(diǎn)為綠色熒光，熒光顯微鏡4倍顯示；圖3是新生小鼠牙胚中AAV-GFP基因轉(zhuǎn)染后組織塊法免疫熒光染色釉 原蛋白，激光共聚焦顯微鏡40倍顯示，由于采用Hoechst 33342作為熒光染 料，釉原蛋白陽(yáng)性呈紅色熒光，綠色熒光的GFP與紅色熒光標(biāo)記的成釉細(xì)胞 存在共定位，GFP陽(yáng)性細(xì)胞占成釉細(xì)胞的50%;其中，圖3a表示細(xì)胞核， 圖3b表示細(xì)胞表面的綠色、紅色熒光共顯示。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
如圖1所示，Transwell是一種細(xì)胞培養(yǎng)的支架系統(tǒng)，Transwell內(nèi)置小室
1的底層為微孔濾膜2，微孔濾膜2的下層為下層腔室3，上層為上層腔室4，
外周為環(huán)形支架。
將Transwell系統(tǒng)置于24孔板的孔內(nèi)，由于底層的微孔濾膜2具有通透 性，下層腔室3的培養(yǎng)液能夠及時(shí)的供應(yīng)微孔濾膜2上的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，適 合于上皮細(xì)胞的立體極性生長(zhǎng)。
本發(fā)明將Transwell系統(tǒng)置于包含牙胚培養(yǎng)液的24孔板的孔內(nèi)，培養(yǎng)的 牙胚置于微孔濾膜2上。
1、利用Transwell系統(tǒng)體外培養(yǎng)牙胚
a、 在解剖顯微鏡下，從出生第一天的C57BL6小鼠相應(yīng)的上下頜位置 分離磨牙牙胚，分離過(guò)程中保證組織處于4°C，用冰浴的pH7.2的磷酸鹽緩 沖液(PBS， phosphate-buffered saline)清洗分離的磨牙牙胚兩次，每次5分 鐘；
b、 然后將分離的磨牙牙胚其牙尖向上置于Transwell內(nèi)置小室的微孔濾 膜上(如圖l所示)，Tmnswell內(nèi)置小室位于含有牙胚培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)， 在37 °C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02孵育箱飽和濕度下培養(yǎng)2周；所述牙胚培 養(yǎng)液以BGJb培養(yǎng)液(Fitton-. Jackson modification, Gibco， Grand Island, NY， 目錄號(hào)12591038)為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所配制的牙胚培養(yǎng)液還包含體積分?jǐn)?shù)為
70.1%的胎牛血清、100IU/ml的青霉素、80pg/ml鏈霉素、5 mg/L肝素；每 孔中加入lml培養(yǎng)液。
2、 基因轉(zhuǎn)染
a、 感染性腺病毒病毒顆粒的制備
使用含GFP (綠色熒光蛋白)基因的腺病毒載體AAV-GFP，感染人胚腎 AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生具有傳染性的病毒顆粒，用斑點(diǎn)雜交法測(cè)定重組病毒顆 粒的滴度，并按lxl(^感染復(fù)數(shù)(multiple ofinfection， MOD病毒顆粒濃度 制備濃縮的病毒感染儲(chǔ)存液，至于-80。C冰箱儲(chǔ)存。
b、 腺病毒顆粒感染體外培養(yǎng)的牙胚
用牙胚培養(yǎng)液將濃縮的病毒感染儲(chǔ)存液稀釋至500 5000 MOI，然后將 稀釋后的病毒感染液加入培養(yǎng)有牙胚的Transwell內(nèi)置小室，病毒感染牙胚后 48小時(shí)，移去病毒感染液，牙胚繼續(xù)用牙胚培養(yǎng)液培養(yǎng)，并每天更新牙胚培 養(yǎng)液。
采用Olympus IX 71熒光倒置顯微鏡每日固定時(shí)間點(diǎn)觀察GFP的表達(dá)情 況，并在相同的圖像采集條件下拍攝(1/45sec)。
3、 組織塊法免疫熒光染色標(biāo)記釉原細(xì)胞
腺病毒顆粒感染牙胚后每天時(shí)間點(diǎn)取樣，用冰浴的4%多聚甲醛4。C固 定20分鐘，傾去固定液并用PBS洗滌后，封閉液(含有5%山羊血清和0.3% TritonX-100的0.01MPBS)室溫封閉1小時(shí)；
然后進(jìn)行常規(guī)免疫熒光染色用兔抗小鼠釉原蛋白抗體4°C孵育過(guò)夜，
通過(guò)Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG (H+L， Jackson ImmunoResearch)禾口 1 jug/ml Hoechst33342 (購(gòu)自Molecular Probe公司)37°C孵育1小時(shí)，PBS洗滌后， 將其置于一個(gè)有中心凹陷的載玻片，采用防熒光淬滅劑(ProlongAntifade ， 購(gòu)自Molecular Probe公司)封片。
采用激光共聚焦顯微鏡拍攝照片，通過(guò)與采集的GFP表達(dá)的圖像做比
8較，集中觀察牙尖部位的熒光特征。
4、 GFP表達(dá)和釉原蛋白表達(dá)的定位比較
AAV-GFP感染牙胚24小時(shí)后，即在牙胚的表層出現(xiàn)綠色熒光，GFP表 達(dá)于磨牙的邊緣，釉質(zhì)區(qū)存在更多的GFP表達(dá)，特別是牙尖部位，在牙胚的 根部也有一些散在的GFP熒光斑點(diǎn)，如圖2所示，其中較亮的部分為GFP 熒光斑點(diǎn)。感染后2天，GFP的表達(dá)增強(qiáng)，到第3和第4天后，熒光強(qiáng)度基 本穩(wěn)定；與1000MOI相比，同一時(shí)間點(diǎn)5000MOI組表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度 (如圖2所示)。結(jié)果表明，采用腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染在小鼠磨牙牙胚 獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分比大于50%，并且GFP的表達(dá) 可持續(xù)在7天以上，該種方法簡(jiǎn)單易行，所使用的AAV病毒顆粒濃度相對(duì) 較低。
組織塊免疫熒光顯示在牙尖部位有釉原蛋白的陽(yáng)性紅色熒光染色，這些 熒光代表了釉原蛋白在成釉細(xì)胞內(nèi)外的分布，而GFP同樣在牙尖有表達(dá)。與 采集的GFP表達(dá)圖像比較，有GFP綠色熒光和釉原蛋白的陽(yáng)性紅色熒光染 色處于同樣的位置，GFP和釉原蛋白共表達(dá)細(xì)胞的比例占總釉原蛋白陽(yáng)性細(xì) 胞的50%，如圖3所示。
上述比較發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)定位與成釉細(xì)胞的釉原蛋白的染色有一定的 交叉，表面成釉細(xì)胞是主要的被感染細(xì)胞，成釉細(xì)胞表達(dá)GFP占其總數(shù)的 50%，說(shuō)明成釉細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染成功率相當(dāng)高。同時(shí)在Transwell系統(tǒng)體外培 養(yǎng)牙胚模型下，成釉細(xì)胞保持著體內(nèi)三維生長(zhǎng)狀態(tài)，與周圍的基質(zhì)和相關(guān)細(xì) 胞存在互動(dòng)，成釉細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染成功可以作為研究成釉細(xì)胞某些基因功能 的一個(gè)很好模型，這種模式下的基因轉(zhuǎn)染效果可持續(xù)在7天以上，能夠較長(zhǎng) 時(shí)間的反應(yīng)成釉細(xì)胞分化的過(guò)程，更能反應(yīng)體內(nèi)的生命活動(dòng)。
權(quán)利要求
1、一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，包括以下步驟1)將分離到的初生牙胚牙尖向上置于Transwell內(nèi)置小室的微孔濾膜上，Transwell內(nèi)置小室位于含有牙胚培養(yǎng)液的孔板內(nèi)；所述牙胚培養(yǎng)液為BGJb培養(yǎng)液，還包含體積分?jǐn)?shù)為0.1％的胎牛血清、100IU/ml的青霉素、80μg/ml鏈霉素和5mg/L肝素；每孔中加入1ml牙胚培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2孵育箱飽和濕度下培養(yǎng)；2)以包含GFP基因的腺病毒載體AAV-GFP感染人胚腎AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生具有傳染性的病毒顆粒，將病毒顆粒與牙胚培養(yǎng)液混和制備成病毒濃度為500～5000MOI的感染液；3)將感染液加入培養(yǎng)有牙胚的Transwell內(nèi)置小室，感染后48小時(shí)，移去感染液，牙胚繼續(xù)用牙胚培養(yǎng)液培養(yǎng)，并每天更新牙胚培養(yǎng)液；4)當(dāng)牙胚的表層出現(xiàn)綠色熒光時(shí)，結(jié)合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚上定位GFP和釉原蛋白共表達(dá)的牙胚成釉細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腺病毒載體介導(dǎo)的立體狀態(tài)牙胚成釉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法，包括以下步驟將分離到的初生牙胚牙尖向上置于Transwell內(nèi)置小室的微孔濾膜上，在包含牙胚培養(yǎng)液下培養(yǎng)；使用含AAV-GFP基因的傳染性病毒顆粒，感染培養(yǎng)的牙胚；感染24小時(shí)后在牙胚的表層出現(xiàn)綠色熒光，結(jié)合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚定位GFP和釉原蛋白共表達(dá)的重組牙胚成釉細(xì)胞。在Transwell系統(tǒng)體外培養(yǎng)牙胚的成釉細(xì)胞保持著立體狀態(tài)，成釉細(xì)胞與周圍的基質(zhì)和相關(guān)細(xì)胞存在互動(dòng)，而這種模式下基因轉(zhuǎn)染成釉細(xì)胞成功，有利于從三維的角度研究牙胚中成釉細(xì)胞的基因功能。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101586121SQ20091002299
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者段小紅, 勇 毛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)