專利名稱：：促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)天然添加劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物益生菌領(lǐng)域，特別涉及到一種液體培養(yǎng)基中促進(jìn)羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)生長(zhǎng)的天然添加劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是普遍存在于人和動(dòng)物腸道的益生菌之一。研究表明羅伊氏乳桿菌具腸道表皮粘附能力，因此可定植于人體腸道內(nèi)，并代謝產(chǎn)生羅氏菌數(shù)(reuterin)、乳酸、乙酸等物質(zhì)，有抑制腸道腐敗菌的作用(參見(jiàn)美國(guó)專利5339678、5458875、5534253及5837238)，從而起到調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫的作用，在國(guó)外廣泛用于益生菌制品中，我國(guó)衛(wèi)生部公告2003年第3號(hào)公布羅伊氏乳桿菌可作為人類保健食品的益生菌菌種。益生菌(Probiotics)因具有益生功能而廣泛應(yīng)用于乳制品、功能性食品及藥品中，如日本的Yakult、美國(guó)的Futurebiotic、歐盟的Naturebifidusandacidophilus以及國(guó)內(nèi)的昂立一號(hào)、三株口服液等產(chǎn)品。益生菌要實(shí)現(xiàn)其益生功能，需要達(dá)到一定的數(shù)量，一般認(rèn)為不得少于107mL(g)，但由于益生菌的自身生長(zhǎng)特性及周圍環(huán)境因素的影B向，導(dǎo)致進(jìn)入市場(chǎng)的產(chǎn)品中活菌數(shù)不高。因此，國(guó)內(nèi)外都開展了益生菌增菌物質(zhì)的研究。目前報(bào)道的增菌物質(zhì)主要集中在果蔬汁、蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物、益生元、中藥提取物和其它類物質(zhì)(如短鏈脂肪酸類)等五類(舒國(guó)偉，呂嘉櫪，陳合.蛋白質(zhì)與果蔬汁等益生菌增加物質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2006，11:8-10)，WILLIAM等發(fā)現(xiàn)酵母提取物富含保加利亞乳桿菌增菌因子，其增菌能力是酵母提取物150300倍。WIELAND等發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌在添加乳清或者相關(guān)乳產(chǎn)品的復(fù)合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的很好，活性成分被分離和鑒定為乳清酸，還發(fā)現(xiàn)西紅柿汁和酵母提取物可以被乙基草酸鈉、檸檬酸和富馬酸代替。IRWIN等發(fā)現(xiàn)乳清酸可以被等體積濃度的5-磷酸尿苷、含有5-磷酸尿苷的多聚核苷酸或2，3磷酸尿苷代替。Bury等發(fā)現(xiàn)在保加利亞乳桿菌11842和嗜熱鏈球菌ST20發(fā)酵含乳清培養(yǎng)基中添加1%_2%的乳清蛋白濃縮物可以顯著提高菌數(shù)。Gomes等研究發(fā)現(xiàn)牛乳水解物對(duì)BifidobacteriumlactisBoandLactobacillusacidophilusKi的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有明顯的促進(jìn)作用。體外研究顯示a_乳清蛋白和糖巨肽能顯著促進(jìn)短乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和乳酸乳桿菌的生長(zhǎng)。Wolfram等體內(nèi)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)a-乳清蛋白和糖巨肽能促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)。J即er等以2%的糖巨肽添加到牛奶中，371:24h后，同對(duì)照組相比，B.lactis數(shù)量增加1.5個(gè)Log單位。Anatoly研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白通過(guò)傳遞離子予B.breve而促使其生長(zhǎng)。Stefan等研究了以P-2，6-果糖低聚糖(e-2，6-F0S)作為唯一碳源對(duì)青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌(B.pseudocate皿latum)生長(zhǎng)影響。結(jié)果表明雙歧桿菌的生長(zhǎng)，PH的降低，乳酸和醋酸的產(chǎn)生，13-2，6-F0S的降解等方面，不同的菌種表現(xiàn)出顯著差異性，P-2，6-F0S對(duì)嬰兒雙歧桿菌促生作用明顯優(yōu)于其它三種，其能產(chǎn)生最多的有機(jī)酸和利用長(zhǎng)鏈及短鏈P-2，6-F0S。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，每天服用3X5g果糖低聚糖，2周后雙歧桿菌的數(shù)量由6%升到22%，類桿菌中25%降到0.4%，腸內(nèi)腐敗物質(zhì)明顯減少。Kieran等采3用FISH(熒光原位雜交技術(shù))在沒(méi)有培養(yǎng)基的情況下，發(fā)現(xiàn)HP-I皿lin(聚合菊粉)對(duì)雙歧桿菌具有促生作用。Gopal等研究了B.lactisDR10和L.rha咖osusDR20發(fā)酵商品水解奶粉利用GOS以及生長(zhǎng)情況B.lactisDR10選擇利用三糖和四糖，而L.rh靈osusDR20選擇利用聚合程度低的糖(二糖和單糖)。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，奶粉中GOS對(duì)B.lactisDR10R和L.rha咖osusDR20的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用。舒國(guó)偉等研究了蒺藜和嗜酸乳桿菌相互作用，發(fā)現(xiàn)蒺藜對(duì)嗜酸乳桿菌有明顯的增菌作用，曹國(guó)文等研究了黨參、黃芪等6種中藥的煎煮液對(duì)乳桿菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明除枸杞外其余5種對(duì)乳桿菌均有增殖作用，但添加量對(duì)增殖有較大影響。李平蘭等研究了板藍(lán)根、柴胡、連翹等9種常見(jiàn)中藥對(duì)嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影B向，結(jié)果表明補(bǔ)益類中藥(枸杞、地黃、五味子)對(duì)兩種菌均有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。王成濤等研究了五味中藥對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)及保存活力的影響，結(jié)果表明1%和2%的金銀花、青蒿對(duì)植物乳桿菌及嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)和保存活性表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，魚腥草的作用受其濃度的影響，而黃連和板藍(lán)根對(duì)它們的生長(zhǎng)和保存有一定抑制作用，五味中藥對(duì)嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)都表現(xiàn)出明顯抑制作用，其中以魚腥草最為突出。魏林等研究了茯苓、甘草、五味子等21種不同濃度的中藥合劑對(duì)雙歧桿菌增殖的影響，發(fā)現(xiàn)萊菔子、椏葫蘆、豬苓等11種中藥對(duì)對(duì)雙歧桿菌具有不同程度的促增殖作用，朱戰(zhàn)波等采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)羅伊乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基各組分比例為大豆蛋白胨5%，葡萄糖1%，酵母浸粉1.7%，低聚糖0.3%。Kaneko等在Propionibacteriumfreudenreichii7025細(xì)胞濾出物和其甲醇提取物發(fā)現(xiàn)了一種新的雙歧生長(zhǎng)剌激因子(BGS)，Mori等[19]確定了這種BGS的結(jié)構(gòu)，即2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(2-amino-3-carboxy-l，4-n即hthoquinone)。該BGS在極低濃度(0.5nM)下，就對(duì)雙歧桿菌具有特別強(qiáng)的促生作用，這表明它不是作為基質(zhì)存在的。Shin-ichi等研究也發(fā)現(xiàn)2-氨基-3-羧基-l，4-萘醌對(duì)B.longum具有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用，且對(duì)其增菌機(jī)理做了研究。上述關(guān)于益生菌增菌研究涉及的菌種主要為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱乳鏈球菌，涉及羅伊氏乳桿菌的僅有一篇文獻(xiàn)，僅對(duì)大豆蛋白胨、酵母浸膏及低聚糖組成進(jìn)行了優(yōu)化，因此對(duì)羅伊氏乳桿菌增菌物質(zhì)的研究很有必要。現(xiàn)有對(duì)益生菌增菌的技術(shù)主要針對(duì)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，而且所用增菌物質(zhì)多為果蔬汁、蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物、益生元、中草藥提取物及其它類物質(zhì)，對(duì)羅伊氏乳桿菌增菌方面的文獻(xiàn)僅有一篇，培養(yǎng)基組成為大豆蛋白胨、酵母浸膏和低聚糖，因此對(duì)羅伊氏乳桿菌增菌物質(zhì)方面的研究有待加強(qiáng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種液體培養(yǎng)基中促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)的天然添加劑的制備方法，該方法提高培養(yǎng)基中羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)，為開發(fā)高菌數(shù)羅伊氏乳桿菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的1)制備蒺藜提取液稱取蒺藜10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到蒺藜濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸4騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到蒺藜提取液；2)制備槐花提取液稱取槐花10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到槐花濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到槐花提取液；3)制備牛蒡根提取液稱取牛蒡根10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到牛蒡根濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到牛蒡根提取液；4)將上述得到的蒺藜提取液、槐花提取液或牛蒡根提取液兩種混合或三種混合，兩種混合時(shí)，重量配比為i:i;若三種混合，重量配比為i:i:i。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(組成為蛋白胨8.Og、牛肉膏4.Og、酵母膏3.2g、葡萄糖16.0g、吐溫801.0mL、磷酸氫二鉀1.6g、乙酸鈉4.Og、檸檬酸三銨1.6g、硫酸鎂0.16g、硫酸錳0.04g、蒸餾水1000mL)中添加本發(fā)明的添加劑，對(duì)羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)提高有很好的促進(jìn)作用，在厭氧管中培養(yǎng)2d，添加添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的活菌數(shù)均能達(dá)到5.67X109cfu/mL以上，是沒(méi)有添加添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的4.3倍。具體實(shí)施例方式先分別稱取來(lái)自于咸陽(yáng)民生大藥房的蒺藜、槐花和牛蒡根30g，按重量體積比(w/v)為1:8加入去離子水，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，然后用200目的濾布過(guò)濾，將藥渣按l:6加入去離子水再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，合并兩次的濾液并將提取液分別定容至300mL，得到蒺藜提取液、槐花提取液及牛蒡根提取液，然后將提取液中的兩種或三種等量配成添加劑，1)制備蒺藜提取液稱取蒺藜10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到蒺藜濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到蒺藜提取液；2)制備槐花提取液稱取槐花10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到槐花濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到槐花提取液；53)制備牛蒡根提取液稱取牛蒡根10g，加入去離子水，與去離子水重量體積比為l:8，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到牛蒡根濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1:6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到牛蒡根提取液；4)將上述得到的蒺藜提取液、槐花提取液或牛蒡根提取液兩種混合或三種混合配成添加劑，兩種混合時(shí)，重量配比為i:i;若三種混合，重量配比為i:i:i。將得到的添加劑添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為蛋白胨8.0g、牛肉膏4.Og、酵母膏3.2g、葡萄糖16.Og、吐溫801.OmL、磷酸氫二鉀1.6g、乙酸鈉4.Og、檸檬酸三銨1.6g、硫酸鎂0.16g、硫酸錳0.04g、蒸餾水1000mL)中，用于促進(jìn)羅伊氏乳桿菌的生長(zhǎng)，在與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同的條件下對(duì)羅伊氏乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。其培養(yǎng)過(guò)程為將槐花、蒺藜和牛蒡根提取液分別按表1中所示比例的添加劑加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加適當(dāng)?shù)娜ルx子水后用25mL厭氧管分裝，每管裝20mL，塞上膠塞和擰好橡膠螺帽，在高壓滅菌鍋中12rC滅菌20min，冷卻，用lmL無(wú)菌注射器接入0.4mL已活化好的羅伊氏乳桿菌菌液，搖勻，置于37°C隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后采用厭氧管高層瓊脂計(jì)數(shù)法對(duì)羅伊氏乳桿菌進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定(三個(gè)平行樣取平均值)，結(jié)果如表1所示。表1添加不同浸出液添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌48h后的菌數(shù)比較培養(yǎng)基名稱基礎(chǔ)培養(yǎng)槐花提取蒺藜提取牛蒡根提活菌數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由活菌數(shù)比較可以看出，將三種提取液等量混合成的添加劑加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)最高，達(dá)到5.67X109cfu/mL，將兩種提取液等量混合成的添加劑加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)平均為3.36X109cfu/mL，添加單一提取液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)平均為4.34X109cfu/mL，這一結(jié)果表明，比較復(fù)雜的有機(jī)成分有利于羅伊氏乳桿菌的生長(zhǎng)，這與羅伊氏乳桿菌營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的特性是一致的。本發(fā)明的添加劑成分按等量混合的三種提取液的效果最好，而采用成分較為簡(jiǎn)單或人工合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)羅伊氏乳桿菌的生長(zhǎng)有一定的限制。權(quán)利要求促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)的天然添加劑的制備方法，其特征在于，1)制備蒺藜提取液稱取蒺藜，向其中加入去離子水，蒺藜與去離子水重量體積比為1∶8，在電爐上用煮沸，然后保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到蒺藜濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1∶6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到蒺藜提取液；2)制備槐花提取液稱取槐花，向其中加入去離子水，槐花與去離子水重量體積比為1∶8，在電爐上用煮沸，然后保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到槐花濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1∶6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到槐花提取液；3)制備牛蒡根提取液稱取牛蒡根，向其中加入去離子水，牛蒡根與去離子水重量體積比為1∶8，在電爐上用煮沸，然后保持沸騰30min，再用200目的濾布過(guò)濾，得到牛蒡根濾液以及藥渣；將所得的藥渣與去離子水按重量體積比1∶6加入去離子水，再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，得到濾液；將兩種濾液混合，分別定容至300mL，得到牛蒡根提取液；4)將上述得到的蒺藜提取液、槐花提取液或牛蒡根提取液兩種混合或三種混合配成添加劑；兩種混合時(shí)，重量配比為1∶1；若三種混合，重量配比為1∶1∶1。全文摘要本發(fā)明公開了一種促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)的天然添加劑的制備方法，該方法首先取蒺藜、槐花和牛蒡根各10g，分別按重量體積比(w/v)1∶8加入去離子水，在電爐上用武火煮沸，然后文火保持沸騰30min，然后用200目的濾布過(guò)濾，將藥渣按1∶6加入去離子水再次煮沸并保持沸騰30min，過(guò)濾，合并兩次的濾液并將提取液分別定容至300ml，得到蒺藜提取液、槐花提取液及牛蒡根提取液。將蒺藜提取液、槐花提取液及牛蒡根提取液的兩種配成添加劑，其各種添加劑重量的1/2，若將三種配成添加劑，其各種添加劑重量的1/3。文檔編號(hào)C12R1/225GK101709287SQ200910023918公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年9月14日優(yōu)先權(quán)日2009年9月14日發(fā)明者呂嘉櫪,王勇,舒國(guó)偉,陳合申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)